CN105602941A - 一种真菌菌丝总dna提取液及提取真菌菌丝总dna的方法 - Google Patents

一种真菌菌丝总dna提取液及提取真菌菌丝总dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于真菌菌丝总DNA提取的技术领域，特别涉及一种真菌菌丝总DNA提取液及提取真菌菌丝总DNA的方法。所述真菌菌丝总DNA提取液包括提取液I和提取液II，其中所述提取液I包括缓冲盐、非离子表面活性剂、以及中性盐的水溶液，其pH值为7.5-8.5；所述提取液II包括缓冲盐和阳离子表面活性剂，其pH值为7.5-8.5。使用本发明的真菌菌丝总DNA提取液可以取得如下的有益效果：1）简化了总DNA提取步骤；2）适用于总DNA微量提取，为难于稀缺的实验材料提供了有效的实验手段；3）避免了有毒有机溶剂的使用；4）可以简化操作步骤和时间；5）还避免了液氮研磨过程中容易造成冻伤皮肤的可能性。

Description

一种真菌菌丝总DNA提取液及提取真菌菌丝总DNA的方法
技术领域
本发明属于真菌菌丝总DNA提取的技术领域，特别涉及一种真菌菌丝总DNA提取液及提取真菌菌丝总DNA的方法。
背景技术
在真菌的分子生物学研究中，真菌总DNA的提取至关重要。目前常用的提取方法主要有CTAB法、SDS提取法、尿素提取法及酶解法等。提取的步骤大体相似，关键在于如何有效地破碎细胞壁，有的是通过机械来进行破碎细胞壁，有的是通过酶等物质来消化去壁。由于真菌细胞壁上富含多糖等物质，因此即使是液氮冷冻干燥研磨后也很难被普通抽提液打破，而直接用酶去消化又常常得不到好的去壁效果。事实上，目前大部分实验室所采用的破壁方法均是液氮冷冻干燥研磨，但是这些方法大多会用到有毒有机溶剂、酚等，而且操作时间较长，步骤较多。另外，使用液氮研磨容易冻伤皮肤，需要强力研磨，费时费力，受研钵数量的限制容易产生交叉污染，在研磨过程中真菌菌丝也容易损失，效率也不高，特别是一些单位和机构由于液氮及干冰不易获取而使其受到严重限制。
因此急需一种操作简便且适于DNA微量提取以用于直接进行PCR扩增的技术。
发明内容
针对上述问题，本发明开发了一种真菌菌丝总DNA提取液，其包括提取液I和提取液II；其中所述提取液I包括缓冲盐、非离子表面活性剂、以及中性盐的水溶液，其pH值为7.5-8.5，特别是其pH值可以为7.8-8.2；所述提取液II包括缓冲盐和阳离子表面活性剂，其pH值为7.5-8.5，特别是其pH值可以为7.8-8.2。
使用本发明的真菌菌丝总DNA提取液，可以取得如下的有益效果：
1）实现简化真菌菌丝总DNA提取步骤的目的；
2）适用于真菌菌丝总DNA微量提取，这为难于获得或仅能获得小量的实验材料提供了有效的实验手段；
3）避免了有毒有机溶剂、酚等的使用；
4）可以简化操作步骤，减少操作时间；
5）还避免了液氮研磨过程中容易造成冻伤皮肤的可能性。
在一个具体实施例中，所述阳离子表面活性剂为阳离子聚丙烯酰胺。其浓度可以为0.1-5ppm，特别是1-3ppm。
在一个具体实施例中，所述非离子表面活性剂为醇醚硫酸盐；优选地为脂肪醇醚硫酸铵和/或脂肪醇醚硫酸钠；更优选地为C12～C18的脂肪醇醚硫酸铵和/或脂肪醇醚硫酸钠；最优选地为C12～C15的脂肪醇醚硫酸铵和/或脂肪醇醚硫酸钠。
在一个具体实施例中，所述缓冲盐选自Tris-HCl、磷酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的至少一种。
在一个具体实施例中，所述缓冲盐的浓度为100-200mM，优选为150-200mM。
在一个具体实施例中，所述中性盐为氯化盐；优选地，所述氯化盐为氯化钠和/或氯化钾。
在一个具体实施例中，所述中性盐的浓度为100-200mM，优选为150-200mM。
在一个具体实施例中，所述真菌为白粉病菌（Cicinnoboluscesatii）。
本发明还提供了一种提取真菌菌丝总DNA的方法，包括如下步骤：
（1）收集真菌菌丝体；
（2）将真菌菌丝体置于如上所述的提取液I；
（3）冻融至少1次，优选冻融至少2次，更优选冻融至少3次；
（4）加入如上所述的提取液II；
（5）去除不溶物，获得含有真菌DNA的上清液。
在一个具体实施例中，以体积计，所述提取液I与所述提取液II的比例为10:(1-5)，优选10:(1.5-2.5)。
在一个具体实施例中，在步骤（3）中，冷冻的温度为零下196°C至零下20°C，融化的温度为40°C至70°C；优选所述冷冻的温度为零下196°C，融化的温度为50°C至60°C。至于冻融的时间，可长可短，一般来讲以能够冻住或解冻即可。
在一个具体实施例中，以离心的方式去除所述不溶物，优选离心速度为10000-15000rpm，离心时间为1-5分钟。在通过离心去除不溶物后，可以直接使用获得的上清液用于下一步实验操作，例如普通的PCR扩增、RT-PCR扩增等实验。
在一个具体实施例中，还包括步骤（6）将所述上清液中的所述真菌DNA沉淀后溶于TE缓冲液中或去离子水中。经过该处理后，将将提取的DNA长期的冷冻保存，以备后续实验使用。
附图说明
图1为实施例1-6以及对比例1提取的白粉病菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增后的1%琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，M为DNA分子量参照物，1为以实施例1的方法获得的DNA样品作为PCR模板，2为以实施例2的方法获得的DNA样品作为PCR模板，3为以实施例3的方法获得的DNA样品作为PCR模板，4为以实施例4的方法获得的DNA样品作为PCR模板，5为以实施例5的方法获得的DNA样品作为PCR模板，6为以实施例6的方法获得的DNA样品作为PCR模板，7为以对比例1的方法获得的DNA样品作为PCR模板。
具体实施方式
以下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。
在以下实施例或对比例中保证在相同用量的DNA提取的材料（即白粉菌病原体）下最后获得可直接用于后续实验的DNA提取液的体积相同。
实施例1
所述提取液I：包括200mMTris-HCl、10mMC12脂肪醇醚硫酸铵、以及200mM氯化钠的水溶液，其pH值为8.0；
所述提取液II：包括200mMTris-HCl和1ppm阳离子聚丙烯酰胺，其pH值为8.0。
（1）收集白粉病菌的真菌菌丝体；
（2）将1mg的真菌菌丝体置于500微升的提取液I中，颠倒混匀；
（3）分别在零下196°C和60°C冻融2次，即在零下196°C下冷冻，在60°C下融化；
（4）加入50微升的提取液II，颠倒混匀，放置2分钟；
（5）10000rpm离心5分钟去除不溶物，获得含有真菌DNA的上清液。
实施例2
提取液I：包括150mM磷酸钠、5mMC15脂肪醇醚硫酸铵、以及100mM氯化钠的水溶液，其pH值为7.8；
提取液II：包括150mM磷酸钠和3ppm阳离子聚丙烯酰胺，其pH值为7.8。
（1）收集白粉病菌的真菌菌丝体；
（2）将1mg的真菌菌丝体置于500微升的提取液I中，颠倒混匀；
（3）分别在零下80°C和50°C冻融3次，即在零下80°C下冷冻，在50°C下融化；
（4）加入75微升的提取液II，颠倒混匀，放置2分钟；
（5）12000rpm离心3分钟去除不溶物，获得含有真菌DNA的上清液。
（6）加入适量异丙醇，放置于零下30°C30分钟后，12000rpm离心10分钟，然后溶于适量的pH8.0的TE缓冲液中。
实施例3
提取液I：包括100mM磷酸氢二钠、5mMC15脂肪醇醚硫酸铵、以及100mM氯化钠的水溶液，其pH值为8.2；
提取液II：包括100mM磷酸氢二钠和3ppm阳离子聚丙烯酰胺，其pH值为8.2。
（1）收集白粉病菌的真菌菌丝体；
（2）将1mg的真菌菌丝体置于500微升的提取液I中，颠倒混匀；
（3）分别在零下50°C和50°C冻融2次，即在零下50°C下冷冻，在50°C下融化；
（4）加入125微升的提取液II，颠倒混匀，放置2分钟；
（5）12000rpm离心5分钟去除不溶物，获得含有真菌DNA的上清液。
实施例4
提取液I：包括100mM磷酸二氢钠、5mMC13脂肪醇醚硫酸铵、以及100mM氯化钠的水溶液，其pH值为7.8；
提取液II：包括100mM磷酸二氢钠和5ppm阳离子聚丙烯酰胺，其pH值为7.8。
（1）收集白粉病菌的真菌菌丝体；
（2）将1mg的真菌菌丝体置于500微升的提取液I中，颠倒混匀；
（3）分别在零下50°C和50°C冻融2次，即在零下50°C下冷冻，在50°C下融化；
（4）加入50微升的提取液II，颠倒混匀，放置2分钟；
（5）12000rpm离心5分钟去除不溶物，获得含有真菌DNA的上清液。
实施例5
提取液I：包括100mM磷酸二氢钠、5mMC13脂肪醇醚硫酸铵、以及100mM氯化钠的水溶液，其pH值为7.5；
提取液II：包括100mM磷酸二氢钠和0.1ppm阳离子聚丙烯酰胺，其pH值为7.5。
（1）收集白粉病菌的真菌菌丝体；
（2）将1mg的真菌菌丝体置于500微升的提取液I中，颠倒混匀；
（3）分别在零下30°C和55°C冻融2次，即在零下50°C下冷冻，在50°C下融化；
（4）加入50微升的提取液II，颠倒混匀，放置2分钟；
（5）12000rpm离心1分钟去除不溶物，获得含有真菌DNA的上清液。
实施例6
所述提取液I：包括150mMTris-HCl、1mMC18脂肪醇醚硫酸钠、以及200mM氯化钾的水溶液，其pH值为8.5；
所述提取液II：包括150mMTris-HCl和1ppm阳离子聚丙烯酰胺，其pH值为8.5。
（1）收集白粉病菌的真菌菌丝体；
（2）将1mg的真菌菌丝体置于500微升的提取液I中，颠倒混匀；
（3）分别在零下50°C和50°C冻融2次，即在零下50°C下冷冻，在50°C下融化；
（4）加入50微升的提取液II，颠倒混匀，放置2分钟；
（5）12000rpm离心5分钟去除不溶物，获得含有真菌DNA的上清液。
对比例1
采用CTAB方法提取真菌菌丝的总DNA。
（1）取保存于-20°C的真菌菌丝100mg，放于2mL离心管中，加液氮充分研磨；
（2）加入600μLCTAB提取液[2%CTAB，100mMTris-HCl（pH8.0），20mMEDTA（pH8.0），1.4MNaCl，使用前加2%的2-巯基乙醇]，颠倒混匀后，65°C水浴1h；
（3）冰上冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），并充分混匀，4°C，12000rpm离心10min；
（4）吸取上清液转入新的2mL离心管中，加入1/10体积的CTAB/NaCl溶液（10%CTAB，4.1%NaCl），颠倒混匀，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），并充分混匀，4°C，12000rpm离心10min；
（5）吸取上清液，转入新的2ml离心管中，加入等体积CTAB沉淀液[1%CTAB，50mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0）]，充分混匀，65°C水浴30min，4°C，12000rpm离心10min；
（6）吸取上清液，转入新的1.5mL离心管中，加入0.6体积的冰冻异丙醇，充分混匀，4°C，12000rpm离心10min；
（7）弃上清液，加入500μL70%乙醇（预冷）清洗沉淀物，干燥，加入50μL灭菌去离子水，4°C溶解24h。
实施例7
在进行PCR之前，首先利用BioPhotometerplus（光度适应计）核酸蛋白测定仪测定按照实施例1-6以及对比例1的方法提取的DNA的含量，测定之后发出各实施例中的DNA的含量由高到低的顺序依次为：实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6和对比例7。
采用ITS1（SEQIDNO.1）和ITS4（SEQIDNO.2）作为引物，实施例1-6以及对比例1提取的白粉病菌基因组DNA作为模板，进行PCR扩增并检测结果。
50μLPCR反应体系为：模板DNA1μL，Taq酶0.5μL，上、下游引物各1μL，dNTPs1μL，PCR缓冲液（含Mg2+离子）5μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至50μL。
PCR反应程序为：94°C预变性5min；然后94°C30s，55°C30s，72°C40s，共20个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。
扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测（见图1），其中每个样品的上样量为2微升。
其中，所有引物合成均由北京六合华大基因公司完成。
通过图1的结果可以看出，利用本发明的方法提取能够很好扩增出所需的DNA片段，而且利用本发明的方法（实施例1-6）提取的DNA扩增出的PCR产量明显优于对比例1，特别是实施例1-3的方法提取的DNA扩增出的PCR产量尤为量大。可见PCR扩增获得的结果与BioPhotometerplus（光度适应计）核酸蛋白测定仪测定的DNA含量获得的结果基本一致，这进一步说明本发明的方法取得了非常好的效果，其更有利于小量样品，甚至是微量样品的DNA提取。同时该方法还具有操作简单以及费时少等方面的优点。
<110>北京农学院
<120>一种真菌菌丝总DNA提取液及提取真菌菌丝总DNA的方法
<130>P1601BUA
<160>2
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ITS1
<400>1
TCCGTAGGTGAACCTGCGG；
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ITS4
<400>2
TCCTCCGCTTATTGATATGC。

Claims (10)

1.一种真菌菌丝总DNA提取液，其包括提取液I和提取液II，其中所述提取液I包括缓冲盐、非离子表面活性剂、以及中性盐的水溶液，其pH值为7.5-8.5；所述提取液II包括缓冲盐和阳离子表面活性剂，其pH值为7.5-8.5。
2.根据权利要求1所述的提取液，其特征在于，所述阳离子表面活性剂为阳离子聚丙烯酰胺。
3.根据权利要求1或2所述的提取液，其特征在于，所述非离子表面活性剂为醇醚硫酸盐；优选地为脂肪醇醚硫酸铵和/或脂肪醇醚硫酸钠；更优选地为C12～C18的脂肪醇醚硫酸铵和/或脂肪醇醚硫酸钠；最优选地为C12～C15的脂肪醇醚硫酸铵和/或脂肪醇醚硫酸钠。
4.根据权利要求1或2所述的提取液，其特征在于，所述缓冲盐选自Tris-HCl、磷酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的提取液，其特征在于，所述中性盐为氯化盐；优选地，所述氯化盐为氯化钠和/或氯化钾。
6.一种提取真菌菌丝总DNA的方法，包括如下步骤：
（1）收集真菌菌丝体；
（2）将真菌菌丝体置于如权利要求1-5任意一项中的所述提取液I；
（3）冻融至少1次，优选冻融至少2次，更优选冻融至少3次；
（4）加入如权利要求1-5任意一项中的所述提取液II；
（5）去除不溶物，获得含有真菌DNA的上清液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以体积计，所述提取液I与所述提取液II的比例为10:(1-5)，优选10:(1.5-2.5)。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，冷冻的温度为零下196°C至零下20°C，融化的温度为40°C至70°C；优选所述冷冻的温度为零下196°C，融化的温度为50°C至60°C。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，以离心的方式去除所述不溶物，优选离心速度为10000-15000rpm，离心时间为1-5分钟。
10.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，还包括步骤（6）将所述上清液中的所述真菌DNA沉淀后溶于TE缓冲液中或去离子水中。
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