CN104031908A - 一种植物组织总rna提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物组织总RNA提取方法。采用本发明公开的方法提取的植物组织的总RNA浓度和纯度都很高。本发明公开了一种提取植物组织总RNA的方法，包括如下步骤：将植物组织在液氮中研成粉末，将粉末与溶液A振荡混匀，得到混合液1；在混合液1中加入高盐溶液，振荡混匀，得混合液2，将混合液2放置；在混合液2中加入溶液B和氯仿，振荡混匀，离心，得上清液，在上清液中加入溶液C，得到混合液3。本发明公开的方法特别适用于侧柏古树的总RNA提取。

Description

一种植物组织总RNA提取方法

技术领域

本发明涉及一种植物组织总RNA提取方法；特别涉及一种侧柏古树的总RNA提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

侧柏(Platycladus orientalis)寿命可达几千年，我国各地古刹圣地的古侧柏极多。侧柏适应性强，耐瘠薄、耐干旱和低温并且寿命极长，生长了几千年仍不能确定是否衰老。

古侧柏是一个富含多样化抗性基因资源的宝库。侧柏古树如何响应和适应多种胁迫因子或抗衰老？侧柏古树这种调控机制在分子水平上是如何发生的？侧柏古树分子水平上的研究一直受到科研工作者的重视。而RNA提取是许多分子生物学实验尤其DDRT—PCR、RACE、RNA印迹、cDNA文库构建、进行基因克隆和基因表达分析的重要前提。但是侧柏古树比侧柏幼树细胞壁厚实且成分复杂，侧柏古树叶片细胞内富含单宁、萜烯、色素、酚等次生代谢物及蛋白质、多糖等大分子，尤其是多糖及多酚的化合物会带走溶液中的RNA，这些物质严重影响RNA提取效率和其后实验操作。因此，开展侧柏RNA提取的研究，通过对侧柏生理特征的了解，依据对RNA提取原理的认识，对传统的RNA提取方法进行修饰改造，以获得高质量、高产出的RNA样品，能够为探讨侧柏基因的功能，开展基因组学研究，探索其生长、发育、抗逆机理奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物组织总RNA提取方法，采用本发明提供的方法提取的植物组织总RNA浓度和纯度都很高。

本发明提供一种提取植物组织总RNA的方法，包括如下步骤：将植物组织在液氮中研成粉末，将粉末与溶液A振荡混匀，得到混合液1；在混合液1中加入高盐溶液，振荡混匀，得混合液2，将混合液2放置；在混合液2中加入溶液B和氯仿，振荡混匀，离心，得上清液，在上清液中加入溶液C，得到混合液3；将混合液3进行离心吸附柱吸附，再除去离心吸附柱中残留的乙醇；将RNA洗脱液加入离心吸附柱中，放置，离心，得到RNA溶液；在RNA溶液中加入10×DNase I buffer和DNase I，温育，以除去RNA溶液中的DNA，得到处理后的RNA溶液；在处理后的RNA溶液中加入除糖剂，氯仿抽提，取上层水相，得除糖后的RNA溶液；在除糖后的RNA溶液中加入氯仿，离心，得上清液，在上清液中加无水乙醇和NaAc的水溶液，混匀，放置，离心得沉淀，即得。

所述溶液A、溶液B、溶液C、RNA洗脱液、离心吸附柱为柱式植物RNAOUT试剂盒所带，该试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为71203；

所述高盐溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为DEPC水，溶质为柠檬酸钠和KAc；所述柠檬酸钠在所述高盐溶液中的浓度为0.8M，所述KAc在所述高盐溶液中的浓度为5M，pH为4.8；

所述10×DNase I buffer、DNase I为非酶DNA清除剂试剂盒所带，该试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为90903；

所述除糖剂购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为60204-10。

上述方法中，所述混合液1中，所述粉末与所述溶液A的比例为0.1g：(1ml-1.5ml)，具体为0.1g：1ml。

上述任一所述的方法中，所述混合液2中，所述混合液1与所述高盐溶液的体积比为1：(0.1-0.2)，具体为1：0.2；

所述混合液2放置的条件为2℃-5℃，放置15min-30min，具体为4℃，放置20min；

所述在混合液2中加入溶液B和氯仿之后，离心的条件为14000rpm离心15-30min，具体为20min；

所述在混合液2中加入溶液B和氯仿的目的是沉淀混合液2中的细胞碎片、多糖和大片断DNA，离心后的上清液中含有RNA；

所述在上清液中加入溶液C的目的是沉淀RNA；

所述离心吸附柱吸附的步骤如下：将混合液3一半的溶液进行离心吸附柱吸附，离心，再将剩余的一半溶液加入离心吸附柱吸附，离心，用溶液D洗柱，离心；该步骤的目的是将RNA吸附在柱上；

所述溶液D为柱式植物RNAOUT试剂盒所带，该试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为71203。

上述任一所述的方法中，所述RNA洗脱液加入的体积为30uL-100uL，具体为50uL。

上述任一所述的方法中，所述RNA洗脱液加入离心吸附柱中之后放置的条件为20℃-25℃放置2min-5min，具体为20℃放置5min。

上述任一所述的方法中，所述RNA洗脱液加入离心吸附柱中之后离心的条件为20℃-25℃，12000rpm-14000rpm，1min-3min，具体为20℃，12000rpm，2min。

上述任一所述的方法中，所述RNA溶液与所述DNase I的体积比为1：(0.1-1)，具体为5:3。

上述任一所述的方法中，所述在RNA溶液中加入10×DNase I buffer和DNase I之后温育的条件为20-25℃温育20-30min，具体为20min；

上述任一所述的方法中，所述在处理后的RNA溶液中加入除糖剂之前还包括将4份及以上处理后的RNA溶液进行合并的步骤；

所述处理后的RNA溶液与所述除糖剂的比例为1：(0.5-1.5)，具体为1:1。

所述除糖后的RNA溶液中加入氯仿的目的是沉淀多糖等杂质，上清中含有RNA；

所述上清中加无水乙醇和NaAc的水溶液的目的是沉淀RNA；

所述NaAc的水溶液为pH5.2浓度为3M的NaAc水溶液；

所述离心得沉淀之后还包括用体积百分含量70％的乙醇的水溶液和无水乙醇先后漂洗沉淀RNA，吹干的步骤。

上述任一所述的方法中，所述植物为侧柏；

所述侧柏具体为侧柏古树；

所述组织为叶片。

本发明的方法主要解决的问题如下：

1、侧柏古树叶片总RNA提取过程中的质量得率的问题：本发明在1ml裂解液中加入0.1g侧柏叶片，并且分4管提取，最后合成1管，即可保证RNA提取的浓度和质量，克服试剂盒提取RNA得率低的弊端。

2、侧柏古树叶片中多糖等物质的去除：侧柏古树叶片中含有大量的多糖物质，提取侧柏古树叶片的总RNA，需在植物组织细胞裂解、内容物与抽提缓冲液反应时就去除细胞中的次生代谢物如多糖、多酚等物质，否则这些次生代谢物易与RNA结合形成粘稠难溶的胶状物。由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究，而且此胶状物一旦形成，很难用其他试剂使其与RNA分开，这是因为多糖的许多理化性质与RNA十分相似，去除多糖的同时RNA也被携带走。

传统的CTAB加LiCl沉淀法不适合提取侧柏总RNA，65℃水浴半个小时使多糖释放出来，最后很难分离多糖和RNA。

高温变性的方法不适用于侧柏叶片RNA提取。侧柏叶片RNA提取过程中宜用低温提取方法，本发明采用在RNA提取裂解液中加入1/5体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和5M KAc pH4.8)冰浴20min，高盐溶液防止了多糖与RNA共沉淀，在高浓度Na⁺或K+离子存在条件下，通过后续的苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；以上的冰浴时间提高到20min能使多糖和蛋白更好的沉淀，从而达到了提高RNA质量的目的，并保证了RNA的产量，在后续的实验过程中加入300μL的水饱和酚和300μL氯仿，14000rpm离心20min，用高速离心法，一步法可简单高效的除去RNA溶液中多糖和油脂，再进一步用离心吸附柱富集RNA可以把多糖等杂质离心下去，得到RNA上清液。

3、DNA的去除以及多糖的进一步去除：在RNA溶液中加入两倍的DNA清除剂，可彻底出去RNA溶液中的DNA，在加有DNA清除剂的4管RNA溶液合成1管后加入等量的除糖剂，可除去溶液中剩余的多糖，同时除去DNA清除剂的污染和残留的蛋白质污染，并能保证得到高浓度的RNA进行后续实验。在之后加入2.5倍的无水乙醇，再加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，沉淀提取得到的RNA的浓度为异丙醇沉淀得到RNA的2倍，并可有高效的除去残留的多糖。与其他RNA提取方法相比，用NaAc和无水乙醇在-20℃放置2h或-80℃放置30min条件下沉淀总RNA，NaAc的酸性条件更接近核酸的等电点，而无水乙醇则剥去核酸分子表面的水膜，二者共同作用，使RNA沉淀时间大大缩短，RNA提取更加快速，而且试验结果稳定、重复性强，是一种很好的快速提取植物总RNA的方法。

本发明提供的方法特别适用于侧柏古树的总RNA提取。

附图说明

图1为Agilent2100生物分析仪检测RNA结果。

图2为实施例1提取得到的侧柏叶片的总RNA电泳图。

图3为利用Trizol法、CTAB法和SDS酚法、柱式植物RNAOUT试剂盒及本发明实施例1的方法提取得到的侧柏叶片总RNA的电泳分析图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

柱式植物RNAOUT试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为71203。

除糖剂购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为60204-10。

非酶DNA清除剂试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为90903。

高盐溶液：由溶剂和溶质组成，溶剂为DEPC水，溶质为柠檬酸钠和KAc；所述柠檬酸钠在所述高盐溶液中的浓度为0.8M，所述KAc在所述高盐溶液中的浓度为5M，pH为4.8，用NaOH或HCl调节pH。

实施例1、侧柏古树的总RNA提取

一、RNA样品的制备

取100年、1000年、2000年和3000年的侧柏的叶片分别进行如下操作：

(1)称取侧柏的0.4g叶片，在液氮中研成粉末，将各粉末分别平均分装在4管各装有1ml(1ml-1.5ml均可)裂解液(柱式植物RNAOUT试剂盒中溶液A)的RNase free的2ml离心管中，剧烈振荡混匀。

(2)在步骤(1)得到的溶液中按照1：0.2的体积比(1：0.1-0.2均可)加入灭菌的高盐溶液，剧烈振荡混匀，4℃放置20min(2℃-5℃放置15min-30min均可)。

(3)离心管中加入300μL的柱式植物RNAOUT试剂盒中溶液B和300μL氯仿，剧烈振动混匀，14000rpm离心20min(15-30min均可)，沉淀不溶物(含细胞碎片、多糖，大片断DNA)，上清液中含RNA，吸取上清液加入到新的离心管中。

(4)将上清液(约0.9mL)转移到另一个RNase free的2ml离心管中，避免触及或吸取有机相及其上面的白色膜状物。

(5)加入等体积的柱式植物RNAOUT试剂盒中溶液C，充分颠倒混匀。如果有沉淀产生(对某些植物，属于正常现象)，千万不要去掉沉淀，一定要把所有的混合物上柱。

(6)将步骤(5)得到的一半的溶液(如果有沉淀，则先混匀)转移到离心吸附柱(柱式植物RNAOUT试剂盒自带)中，12000rpm室温离心2min，弃穿透液。

(7)将步骤(5)剩下的一半溶液(如果有沉淀，则先混匀)转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心1min，弃穿透液。

(8)在离心吸附柱中加0.4mL通用洗柱液(柱式植物RNAOUT试剂盒中溶液D)，室温离心1min，弃穿透液。

(9)重复步骤(8)两次。

(10)离心吸附柱室温12000rpm离心2min。(该步骤十分重要，否则残留的乙醇会影响RNA的使用)

(11)打开离心吸附柱管盖室温放置2min，使残留的乙醇挥发。

(12)将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中，加入50uL(30-100μL均可)RNA洗脱液(柱式植物RNAOUT试剂盒自带)，20℃放置5min(室温(20℃-25℃)放置2-5min均可)，然后12000rpm20℃离心2min(12000-14000rpm室温(20℃-25℃)离心1-3min均可)，得到30-100μL RNA溶液。

(13)在每管RNA溶液加入10×DNase I buffer1(非酶DNA清除剂试剂盒自带)，再按照5:3比例(1：0.1-1均可)加入DNase I(非酶DNA清除剂试剂盒自带)，混匀后置于20-25℃温育20-30min，具体温育20min，以除去溶液中的DNA。

(14)将4管上述温育好的RNA溶液放到同一管RNase free的2ml离心管中，再按照1:1的比例(1：0.5-1.5均可)加入除糖剂后混匀，加入氯仿抽提，取上层水相，得混合液。

(15)在步骤(14)的混合液中再加入等体积的氯仿混匀，14000rpm离心5min，取上清。

(16)转移上清到RNase free的2ml离心管后加入2.5倍体积无水乙醇，再加入1/10体积的3M pH5.2的NaAc的水溶液混匀，-20℃放置2h或-80℃放置30min。4℃，14000rpm离心10min，沉淀RNA。

(17)用1mL体积百分含量70％的乙醇的水溶液和1mL无水乙醇先后漂洗沉淀RNA，超静台上吹干即得各RNA。

二、RNA样品的检测

(1)用适量RNase-free ddH₂O溶解步骤一制备的各RNA，得到各RNA溶液。

(2)分别取2μl各RNA溶液在Nanodrop8000仪检测RNA的浓度和纯度，A260/280≈2.0～2.1，A260/230≈2.0，Agilent2100生物分析仪检测RNA结果如图1和表1所示。

表1RNA的浓度及质量

(3)取步骤一制备的各RNA溶液进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为100V，电泳20min，EB染色12min观察RNA的完整性。

结果如图2所示。

图2中，M为DNA marker，a为从100年侧柏的叶片提取得到的总RNA、b为从1000年侧柏的叶片提取得到的总RNA、c为从2000年侧柏的叶片提取得到的总RNA、d为从3000年侧柏的叶片提取得到的总RNA。

图2表明，各RNA的电泳条带清晰，28S与18S条带比值接近2:1，均无DNA和其他杂质污染。

(4)将步骤一制备的各RNA溶液液氮速冻后保存于-80℃超低温冰箱中备用。

对比例1、实施例1的方法与现有总RNA提取方法的比较

利用Trizol法、CTAB法和SDS酚法、柱式植物RNAOUT试剂盒及本发明的实施例1的方法提取侧柏古树叶片总RNA，各RNA的琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。

图3中，M为DNA marker，1为CTAB法提取得到的总RNA、2为SDS酚法提取得到的总RNA、3为Trizol法提取得到的总RNA、4为柱式植物RNAOUT试剂盒提取得到的总RNA、5为实施例1的方法提取得到的总RNA。

各RNA的浓度和纯度如表2所示。

表2各方法提取得到的RNA的浓度和纯度

图3和表2表明，Trizol法无法提取得到侧柏古树叶片的总RNA，此过程中得到的絮状沉淀无RNA，跑胶无条带，CTAB法和SDS酚法提取得到的总RNA含多糖和其他杂质，总RNA得率非常低，柱式植物RNAOUT试剂盒提取的RNA得率低，含多糖，但杂质较少，而实施例1的方法提取得到的总RNA得率高，杂质较少。

Claims (10)

1.一种提取植物组织总RNA的方法，包括如下步骤：将植物组织在液氮中研成粉末，将粉末与溶液A振荡混匀，得到混合液1；在混合液1中加入高盐溶液，振荡混匀，得混合液2，将混合液2放置；在混合液2中加入溶液B和氯仿，振荡混匀，离心，得上清液，在上清液中加入溶液C，得到混合液3；将混合液3进行离心吸附柱吸附，再除去离心吸附柱中残留的乙醇；将RNA洗脱液加入离心吸附柱中，放置，离心，得到RNA溶液；在RNA溶液中加入10×DNase I buffer和DNase I，温育，以除去RNA溶液中的DNA，得到处理后的RNA溶液；在处理后的RNA溶液中加入除糖剂，氯仿抽提，取上层水相，得除糖后的RNA溶液；在除糖后的RNA溶液中加入氯仿，离心，得上清液，在上清液中加无水乙醇和NaAc的水溶液，混匀，放置，离心得沉淀，即得。

所述溶液A、溶液B、溶液C、RNA洗脱液、离心吸附柱为柱式植物RNAOUT试剂盒所带，该试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为71203；

所述高盐溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为DEPC水，溶质为柠檬酸钠和KAc；所述柠檬酸钠在所述高盐溶液中的浓度为0.8M，所述KAc在所述高盐溶液中的浓度为5M，pH为4.8；

所述10×DNase I buffer、DNase I为非酶DNA清除剂试剂盒所带，该试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为90903；

所述除糖剂购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为60204-10。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述混合液1中，所述粉末与所述溶液A的比例为0.1g：(1ml-1.5ml)，具体为0.1g：1ml。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述混合液2中，所述混合液1与所述高盐溶液的体积比为1：(0.1-0.2)，具体为1：0.2；

所述混合液2放置的条件为2℃-5℃，放置15min-30min，具体为4℃，放置20min；

所述在混合液2中加入溶液B和氯仿之后，离心的条件为14000rpm离心15-30min，具体为20min。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述RNA洗脱液加入的体积为30uL-100uL，具体为50uL。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述RNA洗脱液加入离心吸附柱中之后放置的条件为20℃-25℃放置2min-5min，具体为20℃放置5min。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述RNA洗脱液加入离心吸附柱中之后离心的条件为20℃-25℃，12000rpm-14000rpm，1min-3min，具体为20℃，12000rpm，2min。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述RNA溶液与所述DNaseI的体积比为1：(0.1-1)，具体为5:3。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述在RNA溶液中加入10×DNase I buffer和DNase I之后温育的条件为20-25℃温育20-30min，具体为20min。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述在处理后的RNA溶液中加入除糖剂之前还包括将4份及以上处理后的RNA溶液进行合并的步骤；

所述处理后的RNA溶液与所述除糖剂的比例为1：(0.5-1.5)，具体为1:1。

10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为侧柏；

所述组织为叶片。