CN114606224A - 一种提取动物组织中病毒核酸的方法 - Google Patents

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闫鹤
李小英
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Abstract

本发明公开了一种提取动物组织中病毒核酸的方法。该方法包括以下步骤：(1)用灭菌组织剪将动物组织剪碎，然后移入到装有PBS缓冲液或生理盐水和小钢珠的离心管中，接着使用研磨机对组织进行反复研磨得到组织匀浆；(2)将组织匀浆于‑80℃和室温间反复冻融3次，使病毒粒子完全释放，接着离心后使用注射器抽取上清液，然后将上清液先后用不同孔径的过滤器过滤，得到病毒浓缩液；(3)将得到的病毒浓缩液分成两份，一份用于提取动物组织中DNA病毒，另一份用于提取动物组织中RNA病毒。根据本发明的提取动物组织中病毒核酸的方法，能够高效提取动物组织中的病毒核酸，并有效地运用到生命科学领域。

Description

一种提取动物组织中病毒核酸的方法
技术领域
本发明属于病毒核酸提取技术领域，具体涉及一种提取动物组织中病毒核酸的方法。
背景技术
病毒是由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质构成的非细胞形态，靠寄生生活的介于生命体及非生命体之间的有机物种。病毒一旦进入宿主细胞可以利用细胞中的物质和能量以及复制、转录和转译的能力，按照它自己的核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。病毒可以感染几乎所有具有细胞结构的生命体。由病毒引起的人类疾病种类繁多且危害重大。目前现有的核酸提取方法主要是将生物材料与裂解液接触从而释放核酸，未对样本前处理采取过多的操作，导致病毒粒子并未完全从组织中释放出来，影响了核酸的提取效率。
经检索，中国专利公开了一种病毒核酸的提取方法，包括以下步骤：样品准备，准备被病毒感染的动物组织；组织提取，取适当的动物组织至于烧杯中，加入生理盐水进行匀浆，匀浆后离心去除残余组织；裂解病毒，取适当的上清液至新的洁净离心管中，加入适当的 DNA提取液至上清液中。该发明通过DNA提取液和上清液的混合使细胞裂解，再通过洗涤液和洗脱液多吸附柱进行清洗，最后得到DNA溶液，这种方法的相比于现有的提取方法操作简单、时间短和效率高。但是，该方法只是将动物组织进行简单的匀浆处理，并不能使病毒粒子完全从组织中释放出来。此外，该方法提取的是DNA病毒的核酸，未对RNA病毒的核酸进行提取。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种提取动物组织中病毒核酸的方法，本发明提供的核酸提取方法先对样本进行细致的前处理，使病毒粒子更完全的释放出来，再使用化学裂解液及蛋白酶K处理样本，有效提高裂解效率。
本发明提出的一种提取动物组织中病毒核酸的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：
1)在无菌清洁环境下，将被病毒感染的动物组织剪碎，然后加入无菌PBS缓冲液或生理盐水，加入钢珠；
2)使用研磨机研磨动物组织，得到组织匀浆；注意使用研磨机前，上下晃动以保证钢珠顺畅移动；
3)将研磨好的组织匀浆反复冻融，使病毒粒子完全释放，得到冻融过的组织匀浆；
4)将冻融过的组织匀浆离心，然后取上清液，平行样本上清液需混合在一起以保证样品成分均匀，使用混合好的上清液提取病毒核酸；
5)上清液先用不同孔径的过滤器过滤，得到病毒浓缩液。
(2)病毒DNA提取；
(3)病毒RNA提取。
进一步地，步骤(1)中的1)所述动物组织为心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏或淋巴结。
进一步地，步骤(1)中的1)所述动物组织的体积与无菌PBS缓冲液或生理盐水的体积之比为1：1～1：3。
进一步地，步骤(1)中的2)所述使用研磨机研磨动物组织的条件为：频率为30～40次/s，一次5～10min，打磨1～3次。
进一步地，步骤(1)中的3)所述反复冻融的条件为：在-20～-80℃和23～27℃间反复冻融2-4次。
进一步地，步骤(1)中的4)所述离心的条件为：在2～6℃、10000～12000rpm条件下离心10～15min。
进一步地，步骤(1)中的5)所述用不同孔径的过滤器的孔径为0.22-0.45μm。
进一步地，步骤(1)中的5)所述用不同孔径的过滤器的孔径为0.45μm和0.22μm，先使用孔径为0.45μm的过滤器过滤，再使用孔径为0.22μm的过滤器过滤；使用0.22μm 的过滤器过滤重复过滤的次数为1-3次。
进一步地，步骤(2)所述病毒DNA提取的具体步骤为：
1)取病毒浓缩液于离心管中，接着向其中加入消化游离DNA的酶和缓冲液，震荡混匀 5～10s，23～27℃静置25～35min；
2)加入蛋白酶K和裂解液至离心管中，涡旋混匀15～20s，23～27℃静置10-15min，得到裂解后的液体；
3)把吸附柱装在收集管中，将裂解后的液体全部转移至吸附柱中。10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
4)加入清洗液1至吸附柱中，10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
5)加入清洗液2至吸附柱中，10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
6)10000～12000rpm离心1～3min以甩干吸附柱，然后丢弃收集管将柱子转移至新的离心管中；
7)加入洗脱液至吸附柱的膜中央，23～27℃静置1～3min，然后10000～12000rpm离心 1～3min，弃去吸附柱，把提取的病毒DNA溶液保存于-20～-80℃待用。
进一步地，步骤(3)所述病毒RNA提取的具体步骤为：
1)取病毒浓缩液于离心管中，接着向其中加入Trizol溶液，用移液枪吹打5～10次，使病毒浓缩液和Trizol溶液均匀混合，所述加入Trizol溶液的体积是病毒浓缩液体积的5-10倍；
2)对于组织没有消化完全的样品，10000～12000rpm离心3～5min后取上清液移入新的离心管，再进行第1)步；
3)23～27℃放置3～5min，使核蛋白复合物完全解离；
4)添加氯仿，通风橱操作，添加完成后盖好盖子，23～27℃静置2-3min，所述添加氯仿的体积与加入Trizol溶液的体积比为1：4～1：6；
5)2～6℃、10000～12000rpm离心10～15min，离心后溶液将分层，将含有RNA的无色上层水相移入新离心管。
6)加入体积百分浓度为70％～75％的乙醇溶液，所述加入乙醇溶液的体积为加入Trizol 溶液体积的1～1.5倍，涡旋震荡混匀，将管子上下颠倒以分散添加乙醇后出现的沉淀物，得到混合液；
7)把吸附柱装在收集管中，将混合液移入吸附柱，2～6℃、10000～12000rpm离心过滤 1～3min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管，这样操作直到处理完全部的混合液；
8)吸附柱内加入清洗液3，2～6℃、10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管；
9)吸附柱内加入的清洗液4，2～6℃、10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管，再重复一次该操作；
10)2～6℃、10000～12000rpm离心1～3min甩干吸附柱后，丢弃收集管将吸附柱转移至新的离心管中；
11)在吸附柱中心加入无RNA酶的水，重复1～3次该过程；采用连续洗脱方法，所有的溶液要装在同一个管中；
12)23～27℃下静置1～3min，接着2～6℃、10000～12000rpm离心1～3min，弃去吸附柱，把提取的病毒RNA溶液保存于-20～-80℃待用。
进一步地，所述消化游离DNA的酶和缓冲液、蛋白酶K、裂解液、清洗液1、清洗液2、洗脱液、Trizol溶液、氯仿、清洗液3、清洗液4、吸附柱均来源于核酸提取试剂盒。
进一步地，
(1)样品前处理：
1)在无菌清洁环境下，使用小号组织剪(灭菌后)将动物组织剪碎，移入2mL无菌RNAfree离心管中(动物组织约占离心管体积的1/3)，再向管中加入1mL无菌PBS缓冲液，加入3～4颗小钢珠(直径为2mm)。盖好盖子后，上下大力晃动离心管，保证小钢珠在离心管中可顺畅移动。
2)使用研磨机研磨动物组织，频率为30次/s，一次5min，反复打磨3次。使用研磨机前，上下晃动离心管以保证小钢珠顺畅移动。
3)将研磨好的组织匀浆于-80℃和室温间反复冻融3次，使病毒粒子完全释放。
4)将冻融过的组织匀浆于4℃、12000rpm条件下离心10min，然后用注射器抽取上清液。平行样本上清液需混合在一起以保证样品成分均匀，使用混合好的上清液提取病毒核酸。
5)上清液先使用0.45μm一次性针头式过滤器过滤，若分生堵塞，及时更换过滤器，不要使用蛮力过滤以免破坏滤膜，然后再使用0.22μm一次性针头式过滤器过滤，重复过滤2次，每次更换过滤器，进一步去除细菌和细胞碎片等杂质，收集滤液备用。
(2)病毒DNA提取：
1)取200μL病毒浓缩液于2mL离心管中，接着向其中加入消化游离DNA的酶和缓冲液，震荡混匀5s，室温静置30min。
2)加入20μL的蛋白酶K和500μL的裂解液至离心管中，涡旋混匀20s，室温静置10min。
3)把吸附柱装在2mL收集管中，将裂解后的液体全部转移至吸附柱中。12000 rpm离心1min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管。
4)加入500μL清洗液1至吸附柱中，12000rpm离心1min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管。
5)加入650μL清洗液2至吸附柱中，12000rpm离心1min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管。
6)12000rpm离心2min以甩干吸附柱，然后丢弃收集管将柱子转移至新的1.5mL 离心管中。
7)加入30～50μL洗脱液至吸附柱的膜中央，室温静置2min，然后12000rpm离心1min。弃去吸附柱，把提取的DNA溶液保存于-80℃待用。
(3)病毒RNA提取：
1)取100μL病毒浓缩液于2mL离心管中，接着向其中加入1mL Trizol溶液，用移液枪吹打十次左右，使病毒浓缩液和Trizol溶液均匀混合。
2)对于脂肪含量高的样品，12000rpm离心5min后取上清液移入新的2mL离心管，再进行第一步。
3)室温放置5min，使核蛋白复合物完全解离。
4)添加0.2mL氯仿。通风橱操作，添加完成后盖好盖子，室温静置2-3min。
5)4℃、12000rpm离心15min。离心后溶液将分层，将含有RNA的无色上层水相移入新离心管，体积约为600μL。
6)加入等体积的70％乙醇，涡旋震荡混匀。将管子上下颠倒以分散添加乙醇后可能出现的沉淀物。
7)700μL的混合液移入收集柱，4℃、12000rpm离心1min，弃掉离心后的废液，收集管不丢弃，收集柱重新插入原管，这样操作直到处理完全部的混合液。
8)收集柱内加入700μL的清洗液3，4℃、12000rpm离心1min，弃掉离心后的废液，收集管不丢弃，收集柱重新插入原管。
9)收集柱内加入500μL的清洗液4，4℃、12000rpm离心1min，弃掉离心后的废液，收集管不丢弃，收集柱重新插入原管，再重复一次该操作。
10)4℃、12000rpm离心2min以甩干吸附柱，然后丢弃收集管将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中。
11)在吸附柱中心加入100μL无RNA酶的水，重复3次该过程。如果采用连续洗脱方法，所有的溶液要装在同一个管中。
12)室温下静置1min，接着4℃、12000rpm离心2min，弃去吸附柱，把提取的 RNA溶液保存于-80℃待用。
优选地，步骤(1)中的1)所述动物组织为心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏等器官。
优选地，步骤(1)中的1)尽量将动物组织剪得十分细碎，以免影响研磨效果。
优选地，步骤(1)中的3)所述反复冻融可以使组织中的病毒粒子更完全地释放在溶液中。
优选地，步骤(1)中的5)用不同孔径的过滤器过滤可以进一步去除细菌和细胞碎片等杂质，使溶液中病毒粒子浓度更高，达到富集病毒的作用。
优选地，步骤(2)中的3)和步骤(3)中的7)释放出来的核酸会吸附在吸附柱中的硅胶薄膜上，这种薄膜对核酸有较强的亲和力和吸附力，其它成分如蛋白质、多糖和脂类则基本不吸附，因此容易被清洗液洗掉。
优选地，步骤(3)中的1)加入Trizol溶液的量是病毒浓缩液体积的5-10倍。
优选地，步骤(3)中的4)加入氯仿的量是Trizol溶液体积的五分之一。这一步骤一定要在通风橱中操作，因为氯仿易挥发，同时会损害人的健康。
优选地，步骤(2)中所述消化游离DNA的酶和缓冲液、蛋白酶K、裂解液、清洗液 1、清洗液2和洗脱液，步骤(3)中所述Trizol溶液、清洗液3和清洗液4，步骤(2)和 (3)中所述吸附柱均来源于核酸提取试剂盒。
优选地，步骤(3)中所述氯仿来源于成都市科隆化学品有限公司。
优选地，所述核酸提取试剂盒为动物组织病毒DNA提取试剂盒(吸附柱法)和TRIzolTM Plus RNA Purification Kit。
优选地，所述核酸提取试剂盒为盘古基因的动物组织病毒DNA提取试剂盒(吸附柱法)和赛默飞的TRIzolTM Plus RNA Purification Kit。
优选地，步骤(2)中，所述消化游离DNA的酶为盘古基因的动物组织病毒DNA提取试剂盒(吸附柱法)中的DNase；所述缓冲液为盘古基因的动物组织病毒DNA提取试剂盒(吸附柱法)中的DNase buffer；所述蛋白酶K为盘古基因的动物组织病毒DNA提取试剂盒(吸附柱法)中的Proteinase K；所述吸附柱为盘古基因的动物组织病毒DNA提取试剂盒(吸附柱法)中的吸附柱；所述裂解液为盘古基因的动物组织病毒DNA提取试剂盒(吸附柱法)中的裂解液；所述清洗液1为盘古基因的动物组织病毒DNA提取试剂盒 (吸附柱法)中的清洗液1；所述清洗液2为盘古基因的动物组织病毒DNA提取试剂盒 (吸附柱法)中的清洗液2；所述洗脱液为盘古基因的动物组织病毒DNA提取试剂盒(吸附柱法)中洗脱液；。
优选地，步骤(3)中，所述清洗液3为TRIzolTM Plus RNA Purification Kit中的Wash Buffer I；所述清洗液4为TRIzolTM Plus RNA Purification Kit中的Wash BufferII；所述 Trizol溶液为TRIzolTM Plus RNA Purification Kit中的TRIzolTM Reagent；所述吸附柱为 TRIzolTM Plus RNA Purification Kit中的Spin cartridges。
本发明通过研磨动物组织和反复冻融组织匀浆使病毒粒子充分的释放，可提高病毒核酸提取的效率，而且本方法还同时提出了DNA病毒和RNA病毒核酸的提取方法，可适应更多的科研需求。
本发明的有益效果为：(1)本发明提出的一种对动物组织中病毒核酸进行的方法，采用了物理研磨和化学试剂提取相结合的办法，使动物组织中的病毒粒子释放的更完全，提高了动物组织中提取病毒核酸的效率。(2)本发明提出的反复冻融的过程可以使动物组织中的病毒粒子更完全地释放在溶液中。(3)本发明提出的用不同孔径的过滤器过滤可以使溶液中病毒粒子浓度更高，达到富集病毒的作用。
附图说明
图1为本发明提出的一种提取动物组织中病毒核酸方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的，实施例使用的核酸提取试剂盒为盘古基因的动物组织病毒DNA 提取试剂盒(吸附柱法)和赛默飞的TRIzolTM Plus RNA Purification Kit。
图1为本发明提出的一种提取动物组织中病毒核酸方法的流程图。
实施例1
参照图1，一种提取动物组织中病毒核酸的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：
1)在无菌清洁环境下，使用组织剪(灭菌后)将被病毒感染的心脏组织剪碎，移入5mL无菌RNAfree离心管中(心脏组织占离心管体积的1/5)，再向管中加入1mL无菌PBS 缓冲液(pH为7.4)，加入4颗小钢珠(直径为2mm)。盖好盖子后，上下大力晃动离心管，保证小钢珠在离心管中可顺畅移动；
2)使用研磨机研磨心脏组织，频率为30次/s，一次5min，打磨1次。使用研磨机前，上下晃动离心管以保证小钢珠顺畅移动；
3)将研磨好的组织匀浆于-20℃和23℃间反复冻融2次，使病毒粒子完全释放；
4)将冻融过的组织匀浆于2℃、10000rpm条件下离心10min，然后用注射器抽取上清液。再重复步骤1)-4)制备3个平行样本，将平行样本上清液需混合在一起以保证样品成分均匀，使用混合好的上清液提取病毒核酸；
5)上清液先使用0.45μm一次性针头式过滤器过滤，然后再使用0.22μm一次性针头式过滤器重复过滤1次，进一步去除细菌和细胞碎片等杂质，收集滤液备用。
(2)病毒DNA提取：
1)取200μL病毒浓缩液于2mL离心管中，接着向其中加入10μL消化游离DNA的酶(DNase)和60μL缓冲液(DNase buffer)，震荡混匀5s，23℃静置25min；
2)加入20μL的蛋白酶K和500μL的裂解液至离心管中，涡旋混匀15s，23℃静置10min；
3)把吸附柱装在2mL收集管中，将裂解后的液体全部转移至吸附柱中。10000rpm离心1min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
4)加入500μL清洗液1至吸附柱中，10000rpm离心过滤1min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
5)加入650μL清洗液2至吸附柱中，10000rpm离心过滤1min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
6)10000rpm离心过滤1min以甩干吸附柱，然后丢弃收集管将柱子转移至新的1.5mL离心管中；
7)加入30μL洗脱液至吸附柱的膜中央，23℃静置1min，然后10000rpm离心1min。弃去吸附柱，把提取的DNA溶液保存于-20℃待用。
(3)病毒RNA提取：
1)取100μL病毒浓缩液于2mL离心管中，接着向其中加入500μL Trizol溶液，用移液枪吹打5次，使病毒浓缩液和Trizol溶液均匀混合；
2)23℃放置3min，使核蛋白复合物完全解离；
3)添加125μL氯仿。通风橱操作，添加完成后盖好盖子，23℃静置2min；
4)2℃、10000rpm离心10min。离心后溶液将分层，将含有RNA的无色上层水相移入新离心管，体积约为600μL；
5)加入500μL的70％(体积百分数)乙醇溶液，涡旋震荡混匀，得到混合液；
6)把吸附柱装在收集管中，将700μL混合液移入吸附柱，2℃、10000rpm离心过滤1min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管，这样操作直到处理完全部的混合液；
7)吸附柱内加入700μL的清洗液3(TRIzolTM Plus RNA Purification Kit中的Wash Buffer I)，2℃、10000rpm离心过滤1min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管；
8)吸附柱内加入500μL的清洗液4(TRIzolTM Plus RNA Purification Kit中的Wash Buffer II)，2℃、10000rpm离心过滤1min，弃滤液后把吸附柱装回收集管，再重复一次该操作；
9)2℃、10000rpm离心1min以甩干吸附柱，然后丢弃收集管将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中；
10)在吸附柱中心加入100μL无RNA酶的水，重复1次该过程，所有的溶液要装在同一个管中；
11)23℃静置1min，接着2℃、10000rpm离心1min，弃去吸附柱，把提取的RNA 溶液保存于-20℃待用。
实施例2
参照图1，一种提取动物组织中病毒核酸的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：
1)在无菌清洁环境下，使用组织剪(灭菌后)将被病毒感染的肝脏组织剪碎，移入5mL无菌RNAfree离心管中(肝脏组织占离心管体积的1/5)，再向管中加入2mL质量百分浓度为0.85％的生理盐水，加入4颗小钢珠(直径为2mm)。盖好盖子后，上下大力晃动离心管，保证小钢珠在离心管中可顺畅移动；
2)使用研磨机研磨肝脏组织，频率为35次/s，一次8min，反复打磨2次。使用研磨机前，上下晃动离心管以保证小钢珠顺畅移动；
3)将研磨好的组织匀浆于-50℃和25℃反复冻融3次，使病毒粒子完全释放；
4)将冻融过的组织匀浆于4℃、11000rpm条件下离心12min，然后用注射器抽取上清液。再重复步骤1)-4)制备3个平行样本，将平行样本上清液需混合在一起以保证样品成分均匀，使用混合好的上清液提取病毒核酸；
5)上清液先使用0.45μm一次性针头式过滤器过滤，然后再使用0.22μm一次性针头式过滤器重复过滤2次，进一步去除细菌和细胞碎片等杂质，收集滤液备用。
(2)病毒DNA提取：
1)取200μL病毒浓缩液于2mL离心管中，接着向其中加入10μL消化游离DNA的酶(DNase)和60μL缓冲液(DNase buffer)；
2)加入20μL的蛋白酶K和500μL的裂解液至离心管中，涡旋混匀18s，25℃静置12min；
3)把吸附柱装在2mL收集管中，将裂解后的液体全部转移至吸附柱中。11000rpm离心过滤2min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
4)加入500μL清洗液1至吸附柱中，11000rpm离心过滤2min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
5)加入650μL清洗液2至吸附柱中，11000rpm离心过滤2min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
6)11000rpm离心过滤2min以甩干吸附柱，然后丢弃收集管将柱子转移至新的1.5mL离心管中；
7)加入30μL洗脱液至吸附柱的膜中央，25℃静置2min，然后10000rpm离心2min。弃去吸附柱，把提取的DNA溶液保存于-50℃待用。
(3)病毒RNA提取：
1)取100μL病毒浓缩液于2mL离心管中，接着向其中加入800μL Trizol溶液，用移液枪吹打8次，使病毒浓缩液和Trizol溶液均匀混合；
2)25℃放置4min，使核蛋白复合物完全解离；
3)添加0.2mL氯仿。通风橱操作，添加完成后盖好盖子，25℃静置2min；
4)4℃、11000rpm离心12min。离心后溶液将分层，将含有RNA的无色上层水相移入新离心管，体积约为600μL；
5)加入1000μL的72％(体积百分数)乙醇，涡旋震荡混匀，得到混合液；
6)把吸附柱装在收集管中，将700μL混合液移入吸附柱，4℃、11000rpm离心过滤2min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管，这样操作直到处理完全部的混合液；
7)吸附柱内加入700μL的清洗液3(TRIzolTM Plus RNA Purification Kit中的Wash Buffer I)，4℃、11000rpm离心过滤2min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管；
8)吸附柱内加入500μL的清洗液4(TRIzolTM Plus RNA Purification Kit中的Wash Buffer II)，4℃、11000rpm离心过滤2min，弃滤液后把吸附柱装回收集管，再重复一次该操作；
9)4℃、11000rpm离心过滤2min以甩干吸附柱，然后丢弃收集管将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中；
10)在吸附柱中心加入100μL无RNA酶的水，重复2次该过程，所有的溶液要装在同一个管中；
11)25℃静置2min，接着4℃、11000rpm离心2min，弃去吸附柱，把提取的RNA 溶液保存于-50℃待用。
实施例3
参照图1，一种提取动物组织中病毒核酸的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：
1)在无菌清洁环境下，使用组织剪(灭菌后)将被病毒感染的肺脏组织剪碎，移入5mL无菌RNAfree离心管中(肺脏组织占离心管体积的1/5)，再向管中加入3mL无菌PBS 缓冲液(pH为7.4)，加入4颗小钢珠(直径为2mm)。盖好盖子后，上下大力晃动离心管，保证小钢珠在离心管中可顺畅移动；
2)使用研磨机研磨肺脏组织，频率为40次/s，一次10min，反复打磨3次。使用研磨机前，上下晃动离心管以保证小钢珠顺畅移动；
3)将研磨好的组织匀浆于-80℃和27℃反复冻融4次，使病毒粒子完全释放；
4)将冻融过的组织匀浆于6℃、12000rpm条件下离心15min，然后用注射器抽取上清液。再重复步骤1)-4)制备3个平行样本，将平行样本上清液需混合在一起以保证样品成分均匀，使用混合好的上清液提取病毒核酸；
5)上清液先使用0.45μm一次性针头式过滤器过滤，然后再使用0.22μm一次性针头式过滤器重复过滤3次，进一步去除细菌和细胞碎片等杂质，收集滤液备用。
(2)病毒DNA提取：
1)取200μL病毒浓缩液于2mL离心管中，接着向其中加入10μL消化游离DNA的酶(DNase)和60μL缓冲液(DNase buffer)；
2)加入20μL的蛋白酶K和500μL的裂解液至离心管中，涡旋混匀20s，27℃静置15min；
3)把吸附柱装在2mL收集管中，将裂解后的液体全部转移至吸附柱中。12000rpm离心过滤3min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
4)加入500μL清洗液1至吸附柱中，12000rpm离心过滤3min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
5)加入650μL清洗液2至吸附柱中，12000rpm离心过滤3min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
6)12000rpm离心3min以甩干吸附柱，然后丢弃收集管将柱子转移至新的1.5mL离心管中；
7)加入30洗脱液至吸附柱的膜中央，27℃静置3min，然后12000rpm离心3min。弃去吸附柱，把提取的DNA溶液保存于-80℃待用。
(3)病毒RNA提取：
1)取100μL病毒浓缩液于2mL离心管中，接着向其中加入1000μLTrizol溶液，用移液枪吹打10次，使病毒浓缩液和Trizol溶液均匀混合；
2)27℃放置5min，使核蛋白复合物完全解离；
3)添加0.17mL氯仿。通风橱操作，添加完成后盖好盖子，27℃静置3min；
4)6℃、12000rpm离心15min。离心后溶液将分层，将含有RNA的无色上层水相移入新离心管，体积约为600μL；
5)加入1500μL的75％(体积百分数)乙醇溶液，涡旋震荡混匀，得到混合液；
6)把吸附柱装在收集管中，将700μL混合液移入吸附柱，6℃、12000rpm离心过滤3min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管，这样操作直到处理完全部的混合液；
7)吸附柱内加入700μL的清洗液3(TRIzolTM Plus RNA Purification Kit中的Wash Buffer I)，6℃、12000rpm离心过滤3min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管；
8)吸附柱内加入500μL的清洗液4(TRIzolTM Plus RNA Purification Kit中的Wash Buffer II)，6℃、12000rpm离心过滤3min，弃滤液后把吸附柱装回收集管，再重复一次该操作；
9)6℃、12000rpm离心3min以甩干吸附柱，然后丢弃收集管将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中；
10)在吸附柱中心加入100μL无RNA酶的水，重复3次该过程，所有的溶液要装在同一个管中；
11)27℃静置1min，接着6℃、12000rpm离心3min，弃去吸附柱，把提取的RNA 溶液保存于-80℃待用。
本发明中，采用了物理研磨和化学试剂提取相结合的办法，使动物组织中的病毒粒子释放的更完全，提高了动物组织中提取病毒核酸的效率。在步骤(1)中的3)中反复冻融可以使组织中的病毒粒子更完全地释放在溶液中。步骤(1)中的5)中用不同孔径的过滤器过滤可以进一步去除细菌和细胞碎片等杂质，使溶液中病毒粒子浓度更高，达到富集病毒的作用。步骤(2)中的3)和步骤(3)中的7)中释放出来的核酸会吸附在吸附柱中的硅胶薄膜上。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提取动物组织中病毒核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品前处理：
1)在无菌清洁环境下，将被病毒感染的动物组织剪碎，然后加入无菌PBS缓冲液或生理盐水，加入钢珠；
2)使用研磨机研磨动物组织，得到组织匀浆；注意使用研磨机前，上下晃动以保证钢珠顺畅移动；
3)将研磨好的组织匀浆反复冻融，使病毒粒子完全释放，得到冻融过的组织匀浆；
4)将冻融过的组织匀浆离心，然后取上清液，平行样本上清液需混合在一起以保证样品成分均匀，使用混合好的上清液提取病毒核酸；
5)上清液先用不同孔径的过滤器过滤，得到病毒浓缩液；
(2)病毒DNA提取；
(3)病毒RNA提取。
2.根据权利要求1所述一种提取动物组织中病毒核酸的方法，其特征在于，步骤(1)中的1)所述动物组织为心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏或淋巴结。
3.根据权利要求1所述一种提取动物组织中病毒核酸的方法，其特征在于，步骤(1)中的1)所述动物组织的体积与无菌PBS缓冲液或生理盐水的体积之比为1：1～1：3。
4.根据权利要求1所述一种提取动物组织中病毒核酸的方法，其特征在于，步骤(1)中的2)所述使用研磨机研磨动物组织的条件为：频率为30～40次/s，一次5～10min，打磨1～3次。
5.根据权利要求1所述一种提取动物组织中病毒核酸的方法，其特征在于，步骤(1)中的3)所述反复冻融的条件为：在-20～-80℃和23～27℃间反复冻融2-4次。
6.根据权利要求1所述一种提取动物组织中病毒核酸的方法，其特征在于，步骤(1)中的4)所述离心的条件为：在2～6℃、10000～12000rpm条件下离心10～15min。
7.根据权利要求1所述一种提取动物组织中病毒核酸的方法，其特征在于，步骤(1)中的5)所述用不同孔径的过滤器的孔径为0.22-0.45μm。
8.根据权利要求1所述一种提取动物组织中病毒核酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述病毒DNA提取的具体步骤为：
1)取病毒浓缩液于离心管中，接着向其中加入消化游离DNA的酶和缓冲液，震荡混匀5～10s，23～27℃静置25～35min；
2)加入蛋白酶K和裂解液至离心管中，涡旋混匀15～20s，23～27℃静置10-15min，得到裂解后的液体；
3)把吸附柱装在收集管中，将裂解后的液体全部转移至吸附柱中，10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
4)加入清洗液1至吸附柱中，10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
5)加入清洗液2至吸附柱中，10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液把吸附柱装回收集管；
6)10000～12000rpm离心过滤1～3min以甩干吸附柱，然后丢弃收集管将柱子转移至新的离心管中；
7)加入洗脱液至吸附柱的膜中央，23～27℃静置1～3min，然后10000～12000rpm离心1～3min，弃去吸附柱，把提取的病毒DNA溶液保存于-20～-80℃待用。
9.根据权利要求1所述一种提取动物组织中病毒核酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述病毒RNA提取的具体步骤为：
1)取病毒浓缩液于离心管中，接着向其中加入Trizol溶液，用移液枪吹打5～10次，使病毒浓缩液和Trizol溶液均匀混合，所述加入Trizol溶液的体积是病毒浓缩液体积的5-10倍；
2)对于组织没有消化完全的样品，10000～12000rpm离心3～5min后取上清液移入新的离心管，再进行第1)步；
3)23～27℃放置3～5min，使核蛋白复合物完全解离；
4)添加氯仿，通风橱操作，添加完成后盖好盖子，23～27℃静置2-3min，所述添加氯仿的体积与加入Trizol溶液的体积比为1：4～1：6；
5)2～6℃、10000～12000rpm离心10～15min，离心后溶液将分层，将含有RNA的无色上层水相移入新离心管；
6)加入体积百分浓度为70％～75％的乙醇溶液，所述加入乙醇溶液的体积为加入Trizol溶液体积的1～1.5倍，涡旋震荡混匀，将管子上下颠倒以分散添加乙醇后出现的沉淀物，得到混合液；
7)把吸附柱装在收集管中，将混合液移入吸附柱，2～6℃、10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管，这样操作直到处理完全部的混合液；
8)吸附柱内加入清洗液3，2～6℃、10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管；
9)吸附柱内加入的清洗液4，2～6℃、10000～12000rpm离心过滤1～3min，倒弃滤液后把吸附柱装回收集管，再重复一次该操作；
10)2～6℃、10000～12000rpm离心1～3min甩干吸附柱后，丢弃收集管将吸附柱转移至新的离心管中；
11)在吸附柱中心加入无RNA酶的水，重复1～3次该过程；采用连续洗脱方法，所有的溶液要装在同一个管中；
12)23～27℃下静置1～3min，接着2～6℃、10000～12000rpm离心1～3min，弃去吸附柱，把提取的病毒RNA溶液保存于-20～-80℃待用。
10.根据权利要求1-9任一项所述一种提取动物组织中病毒核酸的方法，其特征在于，所述消化游离DNA的酶、缓冲液、蛋白酶K、裂解液、清洗液1、清洗液2、洗脱液、Trizol溶液、氯仿、清洗液3、清洗液4、吸附柱均来源于核酸提取试剂盒。
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