CN111172152A - Rna纯化液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种RNA纯化液及其制备方法和应用，RNA纯化液中，所述纯化液至少含有以下组分，其中，以纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：十二烷基硫酸钠5g/100ml‑50g/100ml；硫氰酸胍10g/100ml‑30g/100ml；柠檬酸钠0.01g/100ml‑2g/100ml；N‑烷酰肌氨酸0.01g/100ml‑2g/100ml；巯基乙醇体积百分比为0.01%‑2%；聚乙二醇辛基苯基醚体积百分比为0.01%‑2%；乙二胺四乙酸二钠0.01g/100ml‑0.5g/100ml；溶剂为水。本发明所述RNA纯化液成本低，纯化效果好，纯化方法简单迅速，可在40分钟内完成，可在室温条件下进行。

Description

RNA纯化液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种RNA纯化液及其制备方法和应用。
背景技术
信息RNA(mRNA)是细胞合成蛋白质的模板。各种细胞都有其特异的mRNA表达，表达量的高低，反映了细胞在生理和病理状态下的代谢状态。与DNA不同，RNA，尤其是mRNA，在纯化提取过程中非常容易被降解，给研究工作带来很大的麻烦。当前在分子生物学研究领域里，纯化提取RNA通常有两类方法：酚(Trizol)/氯仿提取法和膜吸附纯化法。这两种方法都适用于RNA含量较高的样本，对于RNA微含量的样本，这两种方法效果都有缺陷。酚(Trizol)/氯仿提取法耗时长，mRNA在过程中容易被降解，提取后样品中的酚残留对后续的分子生物学实验(如反向转录酶)有抑制作用；膜吸附纯化法因来源于商业药盒，价格较高，更大的缺点是吸附于膜上的RNA时常不能完全洗脱下来，这对RNA微含量的样本影响尤其大。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种RNA纯化液及其制备方法和应用，用于解决现有技术中微量RNA纯化效果差的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种RNA纯化液，所述纯化液至少含有以下组分，其中，以纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0001862619980000011
具体的，所述RNA纯化液中，十二烷基硫酸钠的含量为5g/100ml-50g/100ml。例如，十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为50g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-20g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-15g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-10g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-20g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-15g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-20g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-25g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-30g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-35g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml-40g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为40g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为40g/100ml-45g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为45g/100ml-50g/100ml。
在一种实施方式中，所述RNA纯化液至少含有以下组分，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0001862619980000031
在一种实施方式中，所述RNA纯化液至少含有以下组分，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0001862619980000032
在一种实施方式中，所述RNA纯化液至少含有以下组分，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0001862619980000033
Figure BDA0001862619980000041
在一种实施方式中，所述RNA纯化液至少含有以下组分，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0001862619980000042
在一种实施方式中，所述RNA纯化液至少含有以下组分，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0001862619980000043
在一种实施方式中，所述RNA纯化液中，乙二胺四乙酸二钠的终浓度为0.04g/100ml。
在一种实施方式中，所述RNA纯化液中，十二烷基硫酸钠的终浓度为40g/100ml，乙二胺四乙酸二钠的终浓度为0.04g/100ml。
本发明第二方面提供一种RNA纯化液的制备方法，至少包含以下步骤：
将RNA的纯化液的各组分混合，获得所述RNA纯化液。
进一步的，将所述RNA纯化液进行高温高压处理后保存。
本发明第三方面提供如本发明第一方面所述的RNA纯化液在纯化样本RNA上的应用。
进一步的，所述样本为体液样本。
进一步的，所述体液样本选自唾液和尿液。
进一步的，纯化样本RNA时，所需样本用量为50-100微升。
本发明第四方面提供一种样本RNA纯化方法，至少包括以下步骤：
将样本的离心上清采用本发明第一方面所述的RNA纯化液混合处理，沉淀RNA，洗涤得纯化的RNA。
进一步的，所述样本RNA纯化方法中，离心条件为：1000-4000g/min，离心10-15min。
优选的，所述沉淀RNA的方法为：加入异丙醇，混合，离心，弃上清液，得RNA沉淀1。进一步的，离心条件为：10000-20000g/min，离心10-15min。
优选的，所述洗涤RNA的方法为采用乙醇水溶液进行洗涤。具体的，将RNA沉淀1与乙醇水溶液混合，离心，弃去上清液，得到纯化的RNA。进一步的，离心条件为：10000-20000g/min，离心10-15min。
优选的，所述乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为75-80％。
优选的，所述纯化方法还包括以下步骤：将得到的纯化的RNA溶解保存。
进一步的，用于溶解所述纯化的RNA的试剂中不含RNA酶。
优选地，用于溶解所述纯化的RNA的试剂为水。
如上所述，本发明的RNA纯化液及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
本发明所述的RNA纯化液成本低，纯化效果好，纯化方法简单迅速，可在40分钟内完成，可在室温条件下进行。用本方法纯化后的RNA，在后续的分子生物学实验(RT-PCR)中显示了更好的实验结果，样本重复性检测的结果更趋于一致性。
附图说明
图1：采用本发明所述纯化液得到的RNA样本进行RT-PCR扩增电泳图。
(图中1与2是含有克雷伯菌的样本的RT-PCR结果，3与4是含有沙门氏菌样本的RT-PCR结果，5与6是含有大肠杆菌的样本的RT-PCR的结果，其中下侧为阴性对照，上侧为RNA样本组结果。)
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
各种原料和试剂均购自商业供应商，未经进一步纯化，除非另有说明。易受潮的原料和试剂均存放于全密封瓶中，并直接使用，均未经过特殊处理。
实施例1 RNA纯化液的制备
按如下配方配制RNA纯化液，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：
Figure BDA0001862619980000061
Figure BDA0001862619980000071
实施例2 RNA纯化液的制备
按如下配方配制RNA纯化液，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0001862619980000072
实施例3 RNA纯化液的制备
按如下配方配制RNA纯化液，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：
Figure BDA0001862619980000073
实施例4 RNA纯化液的制备
按如下配方配制RNA纯化液，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：
Figure BDA0001862619980000074
Figure BDA0001862619980000081
实施例5 RNA纯化液的制备
按如下配方配制RNA纯化液，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：
Figure BDA0001862619980000082
实施例6 RNA纯化液的制备
按如下配方配制RNA纯化液，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：
Figure BDA0001862619980000083
实施例7 RNA纯化液的制备
按如下配方配制RNA纯化液，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：
Figure BDA0001862619980000091
实施例8 RNA纯化液的制备
按如下配方配制RNA纯化液，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：
Figure BDA0001862619980000093
实施例9 RNA纯化液的制备
按如下配方配制RNA纯化液，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：
Figure BDA0001862619980000092
实施例10 RNA纯化液的制备
按如下配方配制RNA纯化液，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：
Figure BDA0001862619980000101
实施例11唾液中微量RNA的纯化
采用以下步骤进行唾液中微量RNA的纯化：
1)空腹3小时，清水漱口3-4遍，去除口腔食物残渣和黏液；
2)取50-100微升唾液至高温高压处理过的有盖实验管，加入104个克雷伯菌(Klebsiella)。
3)将样本转置于1.5毫升的高温高压处理过的离心管，2000g/分，离心10-15分钟；
4)取上清液50微升，置于高温高压处理过的1.5毫升离心管；
5)加入200微升实施例8所述的RNA纯化液，充分混合10分钟；
6)加入200微升异丙醇，充分混合5分钟；
7)11000g/分离心15分钟，弃去上清液；
8)加入500微升75-80％乙醇清洗RNA沉淀；
9)11000g/分离心5分钟，弃去上清液；
10)室温空气干燥RNA沉淀；
11)溶解RNA沉淀于10微升不含RNA酶的蒸馏水，得到RNA样本1，保存备用。
RNA样本2：采用步骤1)-11)的方法制备RNA样本2，与步骤1)-11)的方法唯一的区别是，步骤2)中，取等量唾液加入104个沙门氏菌(Salmonella)。
RNA样本3：采用步骤1)-11)的方法制备RNA样本3，与步骤1)-11)的方法唯一的区别是，步骤2)中，取等量唾液加入104个大肠杆菌(Escherichia coli)。
实施例12纯化结果分析
用克雷伯菌的特异性扩增引物对实施例11中得到的RNA样本1、RNA样本2、RNA样本3进行逆转录PCR的扩增(RT-PCR)，用克雷伯菌的特异性扩增引物的序列为：
正向引物：CTTGTCATGGCAAAGCAAGTG(SEQ ID NO.1),
反向引物：GTTGTCGATTCCGACAACATC(SEQ ID NO.2)。
进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，结果证明：
RNA纯化液是有效的，使用本发明所述的纯化液进行实验能够得到良好的实验结果；克雷伯菌的引物有很高的特异性，即只扩增含有克雷伯菌的样本，不扩增另两种细菌。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 上海力拜生物科技有限公司
<120> RNA纯化液及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttgtcatgg caaagcaagt g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgtcgatt ccgacaacat c 21

Claims (10)

1.一种RNA纯化液，所述纯化液至少含有以下组分，其中，以纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure FDA0001862619970000011
2.如权利要求1所述的RNA纯化液，其特征在于，所述RNA纯化液至少含有以下组分，其中，以RNA纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure FDA0001862619970000012
3.如权利要求1所述的RNA纯化液，其特征在于，所述RNA纯化液中，十二烷基硫酸钠的终浓度为40g/100ml，和/或，所述RNA纯化液中，乙二胺四乙酸二钠的终浓度为0.04g/100ml。
4.根据权利要求1-3任一所述的RNA纯化液的制备方法，至少包含以下步骤：
将RNA的纯化液的各组分混合，获得所述RNA纯化液。
5.如权利要求1-3任一所述的RNA纯化液在纯化样本RNA上的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用还包括以下特征中的一项或多项：
a.所述样本为体液样本；
b.纯化样本RNA时，所需样本用量为50-100微升。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，特征a中，所述体液样本选自唾液和尿液。
8.一种样本RNA纯化方法，至少包括以下步骤：将样本的离心上清采用权利要求1-3任一所述的RNA纯化液混合处理，沉淀RNA，洗涤得纯化的RNA。
9.如权利要求8所述的样本RNA纯化方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：
1)所述沉淀RNA的方法为：加入异丙醇，混合，离心，弃上清液，得RNA沉淀；
2)所述洗涤RNA的方法为采用乙醇水溶液进行洗涤。
3)所述纯化方法还包括以下步骤：将得到的纯化的RNA溶解保存。
10.如权利要求9所述的样本RNA的纯化方法，其特征在于，特征3)中，所述RNA溶解用试剂中不含RNA酶。
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张均田、杜冠华: "现代药理试验方法 上", 中国协和医科大学出版社，, pages: 34 - 32 *

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