CN103740698A - 一种热带植物多糖多酚小rna提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法，该热带植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步骤：采样热带植物叶片，冻入液氮，-80℃保存；准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNA Northern blotting杂交缓冲液、7%dPAGE、Washing Buffer；按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA；按照17%dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交；miRNA stem-loop RT-PCR扩增；开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析。本发明克服了目前植物小RNA提取方法的不足，具有快速、稳定、操作简便的特点，可以针对miRNA和siRNA进行快速提取和检测分析，具有广泛的应用前景。

Description

一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法

技术领域

本发明属于RNA提取技术领域，尤其涉及一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法。 

背景技术

植物小RNA是一种负调控因子，根据序列的特异性在转录和转录后水平调控基因表达、DNA和组蛋白甲基化以及抵抗外源遗传因子，如病毒、转座子或转基因的入侵。依据小RNA的生物合成特点，植物小RNA主要分为两类：植物小干扰RNA（siRNA，small/short interfering RNA)和微RNA（miRNA，miRNA)。二者长度约为20～25nt，均由类似RNAe III的核酸内切酶Dicer（或Dicer类似蛋白）加工产生，它们的形成既有联系又有区别。微RNA（或miRNA）是一种长度介于20-24nt的单链小分子RNA，由Ⅲ型RNAeDicer从含有茎环结构的内源转录本中切割产生。siRNA途径是由dsRNA引发的，而miRNA途径由内源性hpRNA诱导。siRNA和miRNA都由DCL（或Dicer类似蛋白）剪切形成，其中与mRNA互补的链结合RNA诱导的沉默复合体。 

miRNA基因广泛分布于植物基因组中，在基因组上通常具有独 立的基因座位(1ocus)，转录产物自身折叠成不完全配对的发卡结构(hairpin)。miRNA与靶基因绝大多数情况下以不完全互补的方式起作用。 

小干扰RNA（siRNA）来自长的完全互补的双链RNA，如病毒RNA，反向重复序列或由依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）合成的dsRNA。在拟南芥中siRNA还可以分成反式作用siRNA（trans-acting siRNA，tasiRNA）、内源顺反转录本siRNA（natural cis-antisense siRNA,nat-siRNA）、异染色质siRNA（Heterochomatic siRNA，hcsiRNA），它们的RNA沉默途径各异。其中反式作用siRNA研究比较清楚，tasiRNA是由内源TAS转录本产生，其生物发生途径将miRNA和siRNA生物途径有机融合，产生级联tasiRNA，其中tasiR-ARF3和tasiR-ARF4是两个保守的siRNA序列，参与拟南芥叶片的极性发育，在玉米中ragged seedling2编码AGO7-like蛋白，产生的ta-siARFs参与玉米极性发育。 

获得高质量的小RNA是后续研究其表达和功能的前提条件。目前，模式植物的小RNA提取方法已经非常成熟，采用Trizol或者miRNA kit可以获得很好的结果。然而，对于热带植物而言，体内含有多糖多酚，一般的裂解液既不能去除多糖也不能去除多酚，所以无法很好的提取多糖多酚植物的小RNA，阻碍了其分子生物学方面研究的进展。在RNA提取过程中，细胞破碎后多糖多酚物质与RNA发生作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解。因此，摸索一种适合多糖多酚植物的小RNA提取方法对于后续的研究至关重要。 

Trizol是植物中应用最广泛、最简便的商业化总RNA提取方法，开发Trizol作为植物小RNA提取方法是最简便和适用的技术。但是，热带植物含有高浓度的多糖多酚，还有单宁以及其他次生物质。在植物材料匀浆时，多酚物质氧化成醌类物质后与RNA稳定地结合；多糖理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开，沉淀后与RNA一起产生凝胶状沉淀。而Trizol主要成份是异硫氰酸胍和苯酚，即使添加了如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸之类的防止酚氧化的试剂也很难提取。因此，在前期样品处理的时候去除这些杂质是后续提取高质量小RNA的关键。 

目前，关于植物小RNA提取方法已有报道。Song et al.(2010)利用Trizol和LiCl分级沉淀分离柑桔小RNA（Song et al.,2010）；Cheng et al.(2010）采用低盐CTAB缓冲液提取拟南芥的小RNA（Cheng et al.,2010）；还有多糖植物的CTAB方法（Carra et al.,2007;2009）等都是先分离总RNA，然后再利用LiCl或者PEG8000沉淀大分子RNA，再将上清中的小RNA沉淀从而获得高质量的小RNA。de Fátima et al.(2011)报道利用LiCl缓冲液和PEG8000不仅可以从拟南芥等模式植物，还可以从仙人掌、龙舌兰以及香蕉等植物中提取高质量的小RNA用于northern blotting分析（deFátima et al.,2011）。 

目前，Song et al.(2010)、Carra et al.,（2007;2009）、Cheng et al.(2010）等建立的小RNA提取方法主要针对一些模式植物，而对于多糖多酚的植物小RNA提取方法，只有de Fátima etal.,（2011）有相关的研究。但是de Fátima et al.,（2011）采用LiCl缓冲液提取总RNA，结合LiCl沉淀分离小RNA，并没有将植物中的多糖多酚有效 去除，导致提取的小RNA由于结合不同的杂质，在PAGE电泳过程中出现弥散的电泳谱带，杂交后出现两条杂交条带，这给后续小RNA的检测以及功能分析带来相当的难度。 

因此，改良小RNA提取方法，有效去除植物中的多糖多酚杂质防止其与小RNA结合而出现迁移率的变化，快速提取高质量的miRNA和siRNA并进行后续小RNAnorthern blotting和Stem-loop RT-PCR检测分析是目前急迫需要解决的问题。 

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法，旨在解决去除植物中的多糖多酚杂质与小RNA结合而出现迁移率的变化的问题。 

本发明实施例是这样实现的，本发明实施例的热带植物多糖多酚小RNA提取方法，该热带植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步骤： 

步骤一、采样热带植物叶片，冻入液氮，-80℃保存； 

步骤二、准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNA Northern blotting杂交缓冲液、7%dPAGE、Washing Buffer； 

步骤三、按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA； 

步骤四、按照17%dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交； 

步骤五、miRNA stem-loopRT-PCR扩增； 

步骤六、开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析。 

进一步，在步骤二中，提取小RNA的试剂如下： 

CTAB裂解缓冲液：4M异硫氰酸胍，2%w/vCTAB，100mMTris-HCLpH8.5，25mM EDTA，2M NaCl，2%w/vPVP-40，and2%v/v2-巯基乙醇； 

PEG8000沉淀缓冲液：20%w/vPEG8000，1M NaCl； 

EDC交联缓冲液12ml：122.5μl12.5M1-甲基咪唑pH8.0，0.373g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐； 

miRNA Northern blotting杂交缓冲液：5×SSC，20mM NaHPO4pH7.2，7%SDS，3×Denhardt`s溶液； 

17%dPAGE：尿素12.6g，水1.25ml，10×TBE1.5ml，Acr/Bis30%17ml，在微波炉中溶解尿素，待冷却后加入240μl10%AP，混匀后再加入10μl TEMED； 

Washing Buffer：2×SSC，0.1%SDS。 

进一步，在步骤三中，小RNA提取的具体方法如下： 

第一步，预处理： 

取2g～3g叶片液氮研磨后将粉末转入DEPC处理过的50ml的离心管中，加入20ml的CTAB-PVPP裂解缓冲液，涡旋不少于30s后将裂解产物放在室温3-5分钟，然后12000g4℃离心5min； 

第二步，Trizol抽提： 

离心后的上清转入一干净的50-ml离心管，加入等体积的Trizol试剂，充分涡旋后室温放置5min～10min；加入4ml氯仿:异戊醇，氯仿:异戊醇的比值为24:1，涡旋后静置3min离心，1,2000g4℃离心10min； 

第三步，分级沉淀高分子量RNA： 

离心后上清转入另外50ml离心管，65℃孵育15min，然后加入等体积的PEG8000沉淀缓冲液，涡旋后马上冰浴30min～45min后离心10min沉淀高分子量RNA； 

第四步，沉淀小RNA： 

离心后的上清液加入1/10体积的3M NaAcpH5.2和2.5倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃沉淀过夜，1,2000g4℃离心20min，沉淀用80%的乙醇洗涤1次～2次，DEPC水溶解后放入-80℃备用。 

进一步，小RNA杂交的具体方法如下： 

第一步，17%dPAGE分离: 

将提取的小RNA溶入等体积的小RNA Loading buffer，100℃变性5min后，立即冰浴5min；变性后的小RNA样品在17%dPAGE上样，0.5×TBE电泳缓冲液，300V电泳3h～6h即可； 

第二步，转膜及交联： 

将含有RNA的凝胶切下，先在1×TBE转膜缓冲液中浸润30s，同时准备好NX中性电荷的尼龙膜和转膜滤纸，进行转膜，从上到下的顺序依次是：滤纸-凝胶-NX尼龙膜-滤纸；赶走气泡后用GETE77PWR半干转膜仪进行转膜，用400mA转膜1h；转完膜后将膜放在EDC交联缓冲液浸润的滤纸上，转膜时接触RNA的一面朝上，60℃烘烤2h后，清水冲洗膜上残留的EDC交联缓冲液，-20℃保存备用； 

第三步，miRNA杂交及洗膜： 

将交联后的膜放入杂交管，接触RNA的一面朝内接触杂交缓冲液，加入³²p-ATP标记的探针后37℃杂交过夜；杂交结束后倒掉带有同位素的杂交液，用washing buffer洗膜2次，每次15min～20min；洗完后用monitor检测信号，信号过强时继续洗膜； 

第四步，小RNA杂交及洗膜： 

siRNA杂交，40℃～42℃杂交过夜，探针采用³²P-ATP标记，其他与miRNA杂交方法一致； 

第五步，曝光及保存： 

洗完膜后将膜加载保鲜膜，也可置于拉伸膜上，放在磷屏中曝光30min-3h左右，放入Typoon扫描保存图片。 

进一步，该热带植物多糖多酚小RNA提取方法采用CTAB来沉淀多糖；预处理的CTAB-PVPP缓冲液中包括三种物质，即CTAB沉淀多糖、PVPP结合多酚、异硫氰酸胍防止RNA降解。 

本发明提供的热带植物多糖多酚小RNA提取方法，采用CTAB-PVPP缓冲液进行样品的预处理，结合Trizol试剂建立了热带植物快速、高效的提取方法，获得的高质量小RNA可以作为后续Northern blotting、stem-loopRT-PCR等检测分析。本发明在TRIZOL提取方法前，用CTAB-PVPP缓冲液预处理样品预先去除多糖多酚，结合Trizol试剂快速提取植物的小RNA，提取的小RNA可以满足杂交和PCR检测的需要，为后续进一步研究小RNA在热带植物中的生物学功能提供技术支持。本发明克服了目前植物小RNA提取方法的不足，具有快速、稳定、操作简便的特点，可以针对miRNA和siRNA进行快速提取和检测分析，具有广泛的应用前景。 

附图说明

图1是本发明实施例提供的热带植物多糖多酚小RNA提取方法流程图； 

图2是本发明实施例提供的提取番木瓜(Carica papayaL.)小 RNA的杂交结果示意图； 

图3是本发明实施例提供的提取的小RNA电泳及杂交检测结果示意图； 

图4是本发明实施例提供的番木瓜预测miRNA的实验验证以及tasiRNA相关siRNA的杂交检测示意图； 

图5是本发明实施例提供的其他热带植物提取的小RNA进行杂交以及RT-PCR检测示意图； 

图6是本发明实施例提供的检测分析其他热带亚热带植物中tasiR-ARFs示意图。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。 

如图1所示，本发明实施例的热带植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步骤： 

S101：采样热带植物叶片，冻入液氮，-80℃保存； 

S102：准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNA Northern blotting杂交缓冲液、7%dPAGE、Washing Buffer； 

S103：按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA； 

S104：按照17%dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交； 

S105：miRNA stem-loop RT-PCR扩增； 

S106：开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析。 

结合具体实施例对本发明做进一步的说明： 

1、材料 

1.1植物材料：热带植物采取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所种质资源圃，部分样品采自中国农业大学农学与生物技术学院园艺系温室大棚中种植的热带果树。采样部位为植物叶片，采取后立即冻入液氮，-80℃保存直到使用。 

1.2主要试剂 

CTAB裂解缓冲液：4M异硫氰酸胍,2%(w/v)CTAB,100mM Tris-HCL(pH8.5),25mM EDTA,2M NaCl,2%(w/v)PVP-40,and2%(v/v)2-巯基乙醇。 

PEG8000沉淀缓冲液：20%(w/v)PEG8000，1MNaCl。 

EDC交联缓冲液(12ml)：122.5μl12.5M1-甲基咪唑（pH8.0）,0.373g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)。 

miRNA Northern blotting杂交缓冲液：5×SSC,20mM NaHPO4(pH7.2),7%SDS,3×Denhardt`s溶液。 

17%dPAGE：尿素12.6g，水1.25ml，10×TBE1.5ml，Acr/Bis（30%）17ml，在微波炉或者热水中溶解尿素，待冷却后加入240μl10%AP，混匀后再加入10μlTEMED。 

Washing Buffer：2×SSC,0.1%SDS。 

2、小RNA提取步骤 

2.1预处理 

取2g～3g叶片液氮研磨后将粉末转入DEPC处理过的50-ml的离心管中，加入20ml的CTAB-PVPP裂解缓冲液，涡旋至少30s后将裂解产物放在室温3min～5min，然后12000g4℃离心5min。 

2.2Trizol抽提 

离心后的上清转入一干净的50-ml离心管，加入等体积的Trizol试剂，充分涡旋后室温放置5min～10min。加入4ml氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋后静置3min离心，1,2000g4℃离心10min。 

2.3分级沉淀高分子量RNA 

离心后上清转入另外50-ml离心管，65℃孵育15min，然后加入等体积的PEG8000沉淀缓冲液，涡旋后马上冰浴30min～45min后离心10min沉淀高分子量RNA。 

2.4沉淀小RNA 

离心后的上清液加入1/10体积的3MNaAc(pH5.2)和2.5倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃沉淀过夜，1,2000g4℃离心20min，沉淀用80%的乙醇洗涤1次～2次，DEPC水溶解后放入-80℃备用。 

3、小RNA杂交 

3.117%dPAGE分离 

将提取的小RNA溶入等体积的小RNALoading buffer(ABI,cat.AM8547)，100℃变性5min后，立即冰浴5min使RNA样品完全变性。变性后的小RNA样品在17%dPAGE上样，0.5×TBE电泳缓冲液，300V电泳3h～6h即可。 

3.2转膜及交联 

将含有RNA的凝胶切下，先在1×TBE转膜缓冲液中浸润30s，同时准备好NX中性电荷的尼龙膜（GE)和转膜滤纸，按照说明进行转膜。从上到下的顺序依次是：滤纸-凝胶-NX尼龙膜- 滤纸。赶走气泡后用GETE77PWR半干转膜仪进行转膜，用400mA转膜1h即可。转完膜后将膜放在EDC交联缓冲液浸润的滤纸上，转膜时接触RNA的一面朝上，一定避免交联缓冲液浸到RNA上，60℃烘烤2h后，清水冲洗膜上残留的EDC交联缓冲液，-20℃保存备用(Kim etal.,2007)。 

3.3miRNA杂交及洗膜 

将交联后的膜放入杂交管，接触RNA的一面朝内接触杂交缓冲液，加入³²p-ATP标记的探针后37℃杂交过夜。杂交结束后倒掉带有同位素的杂交液，用washingbuffer洗膜2次，每次15min～20min。洗完后用monitor检测信号，估测阳性区域的信号应该比膜边缘地方的信号强，并且最好将信号控制在5μCi以内，如果信号过强，继续洗膜。 

3.4小RNA杂交及洗膜 

siRNA杂交采用

公司的

-Oligohybridization buffer（Cat^#AM8663），40℃～42℃杂交过夜。探针采用³²P-ATP标记。其他与miRNA杂交方法一致。 

3.5曝光及保存 

洗完膜后将膜加载保鲜膜或者拉伸膜上，放在磷屏中曝光30min-3h左右，放入Typoon扫描保存图片。 

4、miRNAstem-loopRT-PCR扩增 

RT引物的5′末端与miRNA3′末端的后6nt反向互补，引物序列见表1。10μg小RNA65°C5min后立即冰浴变性，按照Promega A3500反转录试剂盒进行试剂配制。16°C30min，随后30°C30s，42°C30s，50°C1s60个循环。PCR采用图4的引物，94°C2min,94°C15s，60°C1min35个循环。PCR产物用4%的琼脂糖电泳，EB染色凝胶成像拍照。 

表1：本发明所使用的miRNA引物以及探针序列 

Table 1:miRNA,primer and probe sequences. 

*序列中小写的字母表示与miRNA序列反向互补的碱基序列。 

按照上述步骤开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析。 

目前，在miRNA数据库(miRBase version19.0)中热带植物注册的小RNA很少，仅有番木瓜的两个miRNA注册（mir162和mir403）。由于这两个miRNA已经报道其表达丰度很低，为此，采用保守而且高丰度表达的miR159a进行评估小RNA的提取、PAGE以及杂交检测情况。以番木瓜的叶片为材料，比较deFátima et al.(2011)报道的LiCl方法与常规的CTAB方法。图2显示采用CTAB、LiCl提取缓冲液提取总RNA后，分别采用LiCl、PEG8000试剂沉淀大分子RNA后从而在上清中回收的小RNAPAGE以及miR159a杂交情况。 

在图2中，（A）不同提取方法提取番木瓜叶片的小RNA17%PAGE电泳结果。上样量为15μg小RNA，20伏（volts）/cm,4h后EB染色观察，各个孔道的小RNA拖尾现象十分严重，小RNA条带弥散分布在整个电泳孔道。de Fátima et al.(2011)采用的LiCl缓冲液结合LiCl沉淀大分子RNA的方法拖尾相对较少。 

（B）以保守的miR159a为探针，对分离的小RNA northern blotting杂交结果。结果显示miR159a探针杂交出现两条清晰可见的杂交条带。 

（C）U6杂交作为杂交对照。M:miRNA marker，PAGE电泳后产生17,21and25nt条带。 

结果显示，LiCl提取buffer、CTAB提取buffer分别结合LiCl和PEG8000均无法提取高质量的小RNA。在PAGE电泳孔道中显色大片的拖尾，杂交结果显示miR159a均显示两条带，推测是提取过程中小RNA结合了多糖多酚物质电泳迁移率变慢而产生的。虽然de Fátimaetal.(2011)报道的方法产生的白色拖尾相对较少（LiCl提取缓冲液/LiCl沉淀缓冲液），但是仍然无法达到理想的效果。 

改良的CTAB-Trizol提取方法 

改良CTAB-Trizol法是首先采用CTAB-PVPP预处理样品，然后Trizol提取总RNA后，随后PEG8000沉淀大分子RNA，最后回收上清中的小RNA。对番木瓜和香蕉的小RNA进行高效提取和杂交。结果显示，PAGE电泳孔道中白色拖带基本没有，杂交结果显示miR159a为单一的清晰条带（图2）。结果说明，建立的改良小RNA提取方法更加适合多糖多酚的植物材料提取高质量的小RNA。 

图3改良CTAB-Trizol提取方法提取的小RNA电泳及杂交检测结果： 

（A）改良的改良CTAB-Trizol法提取番木瓜和香蕉叶片的小RNA电泳图。上样量为15μg小RNA，20伏（volts）/cm电泳4h后EB染色观察，电泳条带清晰可见，各个孔道未见白色拖尾。 

（B）以保守的miR159a为探针，对分离的小RNA northern blotting杂交结果。结果显示miR159a探针杂交出现单一的杂交条带。 

（C）U6杂交作为杂交对照。M:miRNA marker，PAGE电泳后产生17,21and25nt条带。FF，二甲苯青染料条带。BB，溴酚蓝染料电泳条带。 

番木瓜两个预测miRNA的验证 

证明了本章采用的方法可行之后，对miRBase中预测的两个番木瓜miRNA，cpa-mir162a和cpa-mir403进行实验验证。由于文献中报道这两个miRNA的丰度很低，因此，在实验过程中加大了上样量，用100μg的小RNA进行上样。结果显示番木瓜中确实存在预测的两个miRNA，其中mir403的丰度高于mir162a（图:4,A）。 

图4番木瓜预测miRNA的实验验证以及tasiRNA相关siRNA的杂交检测 

（A）提取番木瓜小RNA验证miRBase数据库中两个预测的番木瓜miRNA，miR162a和miR403。U6作为杂交对照。 

（B）根据反式siRNA的生物合成规律，提取番木瓜小RNA杂交tasiRNA中保守的tasiARFs、tasiR2141以及miR390。rRNA作为上样量对照。 

番木瓜内源tasiRNA相关siRNA杂交验证 

反式作用小RNA（trans-actingsiRNA，tasiRNA）是siRNA中研究比较透彻的一类小RNA。在拟南芥中，mir390a切割TAS3转录本 产生在5′D7[+]和5′D8[+]两个位点产生tasiR2141和tasiR2142靶向ARF转录因子（tasiR-ARF），是非常保守的两个TAS3ta-siRNA位点。为此，以番木瓜的叶片为材料，上样量为200μg小RNA对tasiR-ARFs、tasiR2141以及miR390进行杂交，验证建立的小RNA提取方法的可行性。结果显示miR390的丰度非常低，tasiR-ARF、tasiR2141的杂交条带清晰可见，进一步验证了该方法的可行性（图4,B）。 

其他热带植物的小RNA提取及其验证 

为了进一步验证建立方法的可行性，对番石榴，香蕉，柑桔，菠萝，龙眼，荔枝，橡胶和仙人掌的叶片进行了小RNA提取，上样量为30μg，分别进行了miR159a的PAGE电泳，杂交以及RT-PCR检测。结果显示建立的方法完全适合多糖多酚的热带植物，提取的高质量小RNA可以进行后续的杂交和RT-PCR检测（图5）。 

随后，对保守的tasiR-ARF进行了检测分析，采用42-nt反向互补探针对热带植物的内源tasiRNA进行杂交，结果显示杂交条带清晰，进一步证实了TAS3广泛存在高等植物中，并且tasiR2141和tasiR2142是高度保守和特异的（图6）。 

图5其他热带植物提取的小RNA进行杂交以及RT-PCR检测： 

(A)CTAB-Trizol法提取其他热带多糖多酚植物的小RNAPAGE电泳图。 

(B)15μg小RNA miRNA159anorthern blotting杂交结果。 

(C)3%琼脂糖凝胶电泳检测扩增不同植物中的miR159a的End-point stem-loop RT-PCR(30循环)产物。1-8孔道分别是番石榴，香蕉，柑桔，菠萝，龙眼，荔枝，橡胶和仙人掌的小RNA;FF,二甲苯青FF;BB,溴酚蓝条带;M1,50bp DNA ladder;M2,miRNA marker. 

图6检测分析其他热带亚热带植物中tasiR-ARFs： 

(A)不同植物采用CTAB-Trizol法提取过程中PEG8000沉淀的大分子RNA电泳图。 

(B)不同植物小RNA(100μg)17%PAGE电泳图。 

(C)用42-nt长度的保守tasiARFs序列的反式互补序列探针检测不同热带植物中的tasiARFs丰度。 

(D)U6作为杂交对照。1-8孔道分别是番石榴，香蕉，柑桔，菠萝，龙眼，荔枝，橡胶和仙人掌的小RNA。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (5)

1.一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，该热带植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步骤：

步骤一、采样热带植物叶片，冻入液氮，-80℃保存；

步骤二、准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNANorthernblotting杂交缓冲液、7%dPAGE、WashingBuffer；

步骤三、按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA；

步骤四、按照17%dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交；

步骤五、miRNAstem-loopRT-PCR扩增；

步骤六、开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析。

2.如权利要求1所述的热带植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，在步骤二中，提取小RNA的试剂如下：

CTAB裂解缓冲液：4M异硫氰酸胍，2%w/vCTAB，100mMTris-HCLpH8.5，25mMEDTA，2MNaCl，2%w/vPVP-40，and2%v/v2-巯基乙醇；

PEG8000沉淀缓冲液：20%w/vPEG8000，1MNaCl；

EDC交联缓冲液12ml：122.5μl12.5M1-甲基咪唑pH8.0，0.373g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；

miRNANorthernblotting杂交缓冲液：5×SSC，20mMNaHPO4pH7.2，7%SDS，3×Denhardt`s溶液；

17%dPAGE：尿素12.6g，水1.25ml，10×TBE1.5ml，Acr/Bis30%17ml，在微波炉中溶解尿素，待冷却后加入240μl10%AP，混匀后再加入10μlTEMED；

WashingBuffer：2×SSC，0.1%SDS。

3.如权利要求2所述的热带植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，在步骤三中，小RNA提取的具体方法如下：

第一步，预处理：

取2g～3g叶片液氮研磨后将粉末转入DEPC处理过的50ml的离心管中，加入20ml的CTAB-PVPP裂解缓冲液，涡旋不少于30s后将裂解产物放在室温3分钟～5分钟，然后12000g4℃离心5min；

第二步，Trizol抽提：

离心后的上清转入一干净的50-ml离心管，加入等体积的Trizol试剂，充分涡旋后室温放置5min～10min；加入4ml氯仿:异戊醇，氯仿:异戊醇的比值为24:1，涡旋后静置3min离心，1,2000g4℃离心10min；

第三步，分级沉淀高分子量RNA：

离心后上清转入另外50ml离心管，65℃孵育15min，然后加入等体积的PEG8000沉淀缓冲液，涡旋后马上冰浴30min～45min后离心10min沉淀高分子量RNA；

第四步，沉淀小RNA：

离心后的上清液加入1/10体积的3MNaAcpH5.2和2.5倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃沉淀过夜，1,2000g4℃离心20min，沉淀用80%的乙醇洗涤1次～2次，DEPC水溶解后放入-80℃备用。

4.如权利要求1所述的热带植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，小RNA杂交的具体方法如下：

第一步，17%dPAGE分离:

将提取的小RNA溶入等体积的小RNALoadingbuffer，100℃变性5min后，立即冰浴5min；变性后的小RNA样品在17%dPAGE上样，0.5×TBE电泳缓冲液，300V电泳3h～6h即可；

第二步，转膜及交联：

将含有RNA的凝胶切下，先在1×TBE转膜缓冲液中浸润30s，同时准备好NX中性电荷的尼龙膜和转膜滤纸，进行转膜，从上到下的顺序依次是：滤纸-凝胶-NX尼龙膜-滤纸；赶走气泡后用GETE77PWR半干转膜仪进行转膜，用400mA转膜1h；转完膜后将膜放在EDC交联缓冲液浸润的滤纸上，转膜时接触RNA的一面朝上，60℃烘烤2h后，清水冲洗膜上残留的EDC交联缓冲液，-20℃保存备用；

第三步，miRNA杂交及洗膜：

将交联后的膜放入杂交管，接触RNA的一面朝内接触杂交缓冲液，加入³²p-ATP标记的探针后37℃杂交过夜；杂交结束后倒掉带有同位素的杂交液，用washingbuffer洗膜2次，每次15min～20min；洗完后用monitor检测信号，信号过强时继续洗膜；

第四步，小RNA杂交及洗膜：

siRNA杂交，40℃～42℃杂交过夜，探针采用³²P-ATP标记，其他与miRNA杂交方法一致；

第五步，曝光及保存：

洗完膜后将膜加载保鲜膜，也可置于拉伸膜上，放在磷屏中曝光30min-3h左右，放入Typoon扫描保存图片。

5.如权利要求1所述的热带植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，该热带植物多糖多酚小RNA提取方法采用CTAB来沉淀多糖；预处理的CTAB-PVPP缓冲液中包括三种物质，即CTAB沉淀多糖、PVPP结合多酚、异硫氰酸胍防止RNA降解。

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