CN103966198B - 一种植物dna的快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物DNA的提取方法。该植物DNA提取方法(冰浴法)，包括下述步骤1)和2)：1)破碎植物器官和/或组织，得到植物粉末；2)向所述植物粉末中加入细胞裂解液和溶液S在冰浴中反应15‑40分钟，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液1，除去所述提取液1的杂质，得到DNA。该方法与现有的植物DNA提取方法(水浴提取法)相比，不但缩短时间还简化了提取工艺。本发明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)在需大量提取DNA或做棉花品种的纯度检测时，具有较强的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种植物DNA的快速提取方法。
背景技术
通常棉花的DNA提取方法为水浴提取法，步骤基本是这样：粉碎样品；加恒温65℃裂解液在65℃下水浴30-40分钟，充分裂解细胞膜和核膜，使DNA从细胞中释放出来；然后加苯酚或氯仿去蛋白、酚类物质和多糖等，离心；取上清，用异丙醇沉淀DNA。
子叶DNA提取的主要步骤如下：1)取发芽1周的子叶一片装于2ml的离心管中，同时装入一粒钢珠，保存于-70℃低温冰箱中备用。提取时用研磨仪进行冷冻研磨，一般磨2次，每次20秒。2)研磨后取出钢珠，加入提取液700μl，摇匀，放入65℃水浴40分钟，中间每10分钟缓慢颠倒离心管(提取液的组成：0.1M Tris-HCl、0.025M EDTA钠盐、2％CTAB、2％pvp、1.5M NaCl、2％β-巯基乙醇)。3)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，缓慢颠倒8-10分钟，4℃条件下12000rpm离心10分钟。4)取上清液，加入0.6倍的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结，静止2分钟，用移液器枪头把絮状物挑到离心管中。5)用70％的酒精洗2次，100％酒精洗1次，倒干酒精，在真空干燥机中干燥DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用(付小琼等.棉花总DNA快速提取技术及其在国家棉花区试中的应用.中国棉花学会2011年年会论文汇编.中国棉花学会2011年年会.中国棉花学会.2011-08-07)。
种子DNA提取的主要步骤如下：1)用电动种子粉碎机将去壳棉仁充分粉碎后转入2ml的离心管中。2)加入提取液700μl，摇匀，放入65℃水浴40分钟，中间每10分钟缓慢颠倒离心管(提取液的组成：0.1M Tris-HCl、0.025M EDTA钠盐、2％CTAB、2％pvp、1.5M NaCl、2％β-巯基乙醇、0.1g/L蛋白酶K)。3)水浴结束后，加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀至不分层，4℃条件下12000rpm离心10分钟。4)取上清加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀至不分层，4℃条件下12000rpm离心通过10分钟。5)取上清液，加入0.6倍的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结，静止2分钟，用移液器枪头把絮状物挑到离心管中。6)用70％的酒精洗1次，100％酒精洗一次，倒干酒精，在真空干燥机中干燥DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用(付小琼等.棉花总DNA快速提取技术及其在国家棉花区试中的应用.中国棉花学会2011年年会论文汇编.中国棉花学会2011年年会.中国棉花学会.2011-08-07)。
目前，在棉花DNA的提取过程中，耗时长，且需要65或60℃的水浴，经常影响到大量棉花品种纯度检测时的速度。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物DNA的快速提取方法，该方法与现有的植物DNA提取方法(水浴提取法)相比，不但缩短时间还简化了提取工艺。
本发明所提供的植物DNA的快速提取方法，简称冰浴法，包括下述步骤1)和2)：
1)破碎植物器官和/或组织，得到植物粉末；
2)向所述植物粉末中加入细胞裂解液和溶液S，在冰浴中反应15-40分钟，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液1，除去所述提取液1的杂质，得到DNA；
上述植物DNA的快速提取方法中，所述细胞裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为0.1M Tris-HCl、0.02M EDTA钠盐、2％(质量百分含量)十六烷基三甲基溴化铵、2％(质量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和1％(体积百分含量)β-巯基乙醇；
上述DNA的快速提取方法中，所述溶液S为溶液A或溶液B；
上述DNA的快速提取方法中，所述溶液A由苯酚、氯仿和异戊醇组成，所述溶液A中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；
上述DNA的快速提取方法中，所述溶液B由氯仿和异戊醇组成，所述溶液B中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
上述DNA的快速提取方法中，所述植物器官为种子，所述除去所述提取液1的杂质包括以下步骤：将所述提取液1进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液A1，向所述上清液A1中加入所述溶液B反应3-5分钟，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液A2，除去所述提取液2的杂质，得到DNA。
上述DNA的快速提取方法中，所述植物器官为种子，所述除去所述提取液A2的杂质包括以下步骤：将所述提取液A2进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液A2，向所述上清液A2中加入所述异丙醇反应10秒，得到DNA絮状沉淀，用移液器枪头把絮状沉淀挑到离心管中。将该沉淀称为沉淀A1，用乙醇水溶液或乙醇洗涤所述沉淀A1得到DNA。其中用乙醇水溶液或乙醇洗涤所述沉淀A1的方法具体可为用70％的酒精水溶液洗所述沉淀A12次，100％酒精洗1次，倒干酒精，在真空干燥机中干燥DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用。
上述异丙醇的体积可为0.6-1.0倍的所述上清液A2的体积。
上述DNA的快速提取方法中，所述植物器官为叶(如真叶或子叶)，所述除去所述提取液1的杂质包括以下步骤：将所述提取液1进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液B1，向所述上清液B1中加入所述异丙醇反应10秒，得到DNA絮状沉淀，用移液器枪头把絮状沉淀挑到离心管中。将该沉淀称为沉淀B1，用乙醇水溶液或乙醇洗涤所述沉淀B1得到DNA。其中用乙醇水溶液或乙醇洗涤所述沉淀B1的方法具体可为用70％的酒精水溶液洗所述沉淀B12次，100％酒精洗一次，倒干酒精，在真空干燥机中干燥DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用。
上述异丙醇的体积可为0.6-1.0倍所述上清液B1的体积。
上述DNA的快速提取方法中，所述离心的温度为4℃，时间为10分钟。
上述DNA的快速提取方法中，所述15-40分钟可为15-30分钟或15-20分钟或15分钟。
上述DNA的快速提取方法中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物，如棉花。
上述DNA的快速提取方法在分子标记辅助育种中的应用也属于本发明的保护范围。上述分子标记辅助育种为通过在分子水平上分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型来判别目标基因是否存在和对其进行间接选择的一种育种方法。在本发明的一个实施例中，所述分子标记具体可为SSR(简单序列重复)。
上述DNA的快速提取方法在品种纯度检测或品种的真实性鉴定中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)中，通过向所述植物粉末中加入细胞裂解液和溶液S在冰浴中反应15分钟即可，将现有的植物DNA提取方法(水浴提取法)中的裂解膜和去蛋白质等杂质两步改为一步，且不用水浴锅，水浴加热需要等待30分钟，直接用常温裂解液，将现有的裂解膜和去蛋白质等杂质所需要的30-40分钟缩短了1倍以上，大大地节约了时间，提高效率，且本发明的植物DNA的快速提取方法中采用的裂解液既适用于种子也适用于叶，而现有的植物DNA提取方法中种子和叶需要分别采用不同的裂解液。本发明的植物DNA的快速提取方法提取的种子DNA的OD260/OD280为1.96，提取的叶DNA的OD260/OD280为1.84，现有的水浴提取法提取的种子DNA的OD260/OD280为2.04，提取的叶DNA的OD260/OD280为1.96，可见本发明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)提取的种子DNA纯度好于现有的植物DNA提取方法(水浴提取法)，本发明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)提取的叶DNA纯度与现有的水浴提取法提取的叶DNA相当。本发明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)在需大量提取DNA或做棉花品种的纯度检测时，具有较强的实用性。
附图说明
图1为引物NAU1255鉴定冰浴法提取中植棉2号种子DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图2为引物NAU1102鉴定冰浴法提取中植棉2号种子DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图3为引物NAU1233鉴定冰浴法提取欣试71143种子DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图4为引物NAU1102鉴定冰浴法提取欣试71143种子DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图5为引物NAU1255鉴定水浴法提取中植棉2号种子DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图6为引物NAU1102鉴定水浴法提取中植棉2号种子DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图7为引物NAU1369鉴定水浴法提取中棉所63种子DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图8为引物CS62鉴定水浴法提取中棉所63种子DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图9为引物NAU1255鉴定冰浴法提取中植棉2号子叶DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图10为引物NAU1102鉴定冰浴法提取中植棉2号子叶DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图11为引物NAU1102鉴定冰浴法提取银兴棉4号真叶DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图12为引物NAU1255鉴定冰浴法提取银兴棉4号真叶DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图13为引物NAU1255鉴定水浴法提取中植棉2号真叶DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图14为引物NAU1102鉴定水浴法提取中植棉2号真叶DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图15为引物NAU1102鉴定水浴法提取中棉所63子叶DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图16为引物NAU1186鉴定水浴法提取中棉所63子叶DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图17为引物NAU1255鉴定冰浴法用酚、氯仿和异戊醇抽提一次提取中植棉2号种子DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
图18为引物NAU2026鉴定冰浴法用氯仿和异戊醇抽提一次提取中棉所63种子DNA质量聚丙烯酰胺凝胶电泳图。每个泳道为一次重复实验的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的棉花如下：中植棉2号(中国农科院植物保护研究所，2006年通过国家审定的常规棉品种，多年作为黄河流域的对照品种)；中棉所63(中国农业科学院棉花研究所，2007年通过国家审定的杂交棉品种)；银兴棉4号(山东银兴种业有限公司，2010年通过山东省审定的常规棉品种)；欣试71143(国欣农村技术服务总会，2014年通过河北省审定的常规棉品种)。
下述实施例中所用的引物NAU1102、引物NAU1255、引物NAU1233、引物NAU1369、引物CS62、引物NAU1186、引物NAU2026均由正引物和反引物组成，其序列如下：
NAU1102的正引物(序列表中序列1)：ATCTCTCTGTCTCCCCCTTC；NAU1102的反引物(序列表中序列2)：GCATATCTGGCGGGTATAAT；
NAU1255的正引物(序列表中序列3)：CATGCAAATCCATGCTAGAG；NAU1255的反引物(序列表中序列4)：GGTTTCTTTGGTGGTGAAAC；
NAU1233的正引物(序列表中序列5)：TTCGGGAAAGTTAGAGGAGA；NAU1233的反引物(序列表中序列6)：TCCTCAGAGCTCGGAATAGT；
NAU1369的正引物(序列表中序列7)：TGGCAGAGATGAATGTAAGC；NAU1369的反引物(序列表中序列8)：GGTAACGGATGGAAAATCAC；
CS62的正引物(序列表中序列9)：GATGGCTACCTCCCTTTGTA；CS62的反引物(序列表中序列10)：CGTAAGGAAGCCTAGCAAAA；
NAU1186的正引物(序列表中序列11)：AATGGTCCTGCTCCAGATT；NAU1186的反引物(序列表中序列12)：AATCGTCGTCGTCGAATTAT；
NAU2026的正引物(序列表中序列13)：GAATCTCGAAAACCCCATCT；NAU2026的反引物(序列表中序列14)：ATTTGGAAGCGAAGTACCAG。
实施例1、棉花DNA的提取
1、冰浴法提取中植棉2号种子DNA
实验设重复，每次重复的实验方法如下：
1.1剥去干燥的中植棉2号种子的种皮得到棉仁，1粒棉仁装于1个2ml的离心管中，再装1粒5mm的钢珠，用MM301混合型研磨仪研磨，得到中植棉2号种子粉末。
1.2向离心管中加入850μl细胞裂解液用力摇匀，再加入850μl溶液A摇匀，冰浴15分钟，中间上下颠倒离心管3次，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液1，除去提取液1的杂质，得到中植棉2号种子DNA。其中，按照下述方法除去提取液1的杂质：4℃条件下12000rpm离心10分钟，收集上清液，将该上清液称为上清液A1，再向上清液A1中加入是上清液A1等体积的溶液B，缓慢颠倒30-50下(共需3-5分钟)，4℃条件下12000rpm离心10分钟，收集上清液，将该上清液称为上清液A2；再向上清液A2中加入是上清液A20.6倍体积的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结(共需10秒)，静置2分钟，用枪头把絮状物沉淀挑至离心管中，将该沉淀称为沉淀A1；用70％(体积百分含量)的乙醇洗所述沉淀A12次，再用100％乙醇洗1次，倒干乙醇，在真空干燥机中干燥DNA，得到中植棉2号种子DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用。
其中，细胞裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为0.1M Tris-HCl、0.02MEDTA钠盐、2％(质量百分含量)十六烷基三甲基溴化铵、2％(质量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和1％(体积百分含量)β-巯基乙醇，所述细胞裂解液的pH为8.0。
溶液A由苯酚、氯仿和异戊醇组成，溶液A中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1。
上述除去提取液1的杂质中，溶液B由氯仿和异戊醇组成，溶液B中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
2、冰浴法提取欣试71143种子DNA
除将步骤1中的中植棉2号种子替换为欣试71143种子外，其它方法与步骤1完全相同。
3、水浴法提取中植棉2号种子DNA
参考下述文献中描述的水浴法提取中植棉2号种子DNA：付小琼等.棉花总DNA快速提取技术及其在国家棉花区试中的应用.中国棉花学会2011年年会论文汇编.中国棉花学会2011年年会.中国棉花学会.2011-08-07。实验设重复，每次重复的实验方法如下：
3.1中植棉2号种子去壳，得到棉仁，用电动种子粉碎机将棉仁充分粉碎后转入2ml的离心管中。
3.2向离心管中加入提取液700μl，摇匀，放入65℃水浴40分钟，中间每10分钟缓慢颠倒离心管,得到含有DNA的提取液。
3.3向含有DNA的提取液中加入等体积溶液A，混匀，4℃条件下12000rpm离心10分钟。
3.4取上清液，加入等体积的溶液B，混匀，4℃条件下12000rpm离心10分钟。
3.5取上清液，加入是上清液0.6倍的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结，静置2分钟，用移液器枪头把絮状沉淀挑到离心管中。
3.6用70％的乙醇洗2次，100％乙醇洗1次，倒干乙醇，在真空干燥机中干燥DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用。
其中，提取液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为0.1M Tris-HCl、0.025M EDTA钠盐、2％CTAB、2％pvp、1.5M NaCl、1％β-巯基乙醇。
溶液A由苯酚、氯仿和异戊醇组成，溶液A中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1。
溶液B由氯仿和异戊醇组成，溶液B中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
4、水浴法提取中棉所63种子DNA
除将步骤3中的中植棉2号种子替换为中棉所63种子外，其它方法与步骤3完全相同。
5、冰浴法提取中植棉2号叶DNA
实验设重复，每次重复的实验方法如下：
5.1从田间或室内取棉花幼叶1片，直接装于2ml的离心管中，再装1粒5mm的钢珠，保存于-70℃低温冰箱中备用。提取时用MM301混合型研磨仪进行冷冻研磨，得到中植棉2号叶粉末。
5.2向中植棉2号叶粉末中迅速加入细胞裂解液800μl，摇匀，加入800μl溶液B摇匀，冰浴15分钟，中间上下颠倒离心管3次，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液1，除去提取液1的杂质，得到中植棉2号叶DNA。其中，按照下述方法除去提取液1的杂质：4℃条件下12000rpm离心10分钟，收集上清液，将该上清液称为上清液B1，向上清液B1中加入是上清液B10.6倍体积的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结(共需10秒)，静置2分钟，用枪头把絮状沉淀挑至离心管中，将该沉淀称为沉淀B1；用70％(体积百分含量)的乙醇洗所述沉淀B12次，再用100％乙醇洗1次，倒干乙醇，在真空干燥机中干燥DNA，得到中植棉2号叶DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用。
其中，细胞裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为0.1M Tris-HCl、0.02MEDTA钠盐、2％(质量百分含量)十六烷基三甲基溴化铵、2％(质量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和1％(体积百分含量)β-巯基乙醇，所述细胞裂解液的pH为8.0。
溶液B由氯仿和异戊醇组成，溶液B中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
6、冰浴法提取银兴棉4号叶DNA
除将步骤5中的中植棉2号叶替换为银兴棉4号叶外，其它方法与步骤5完全相同。
7、水浴法提取中植棉2号叶DNA
参考下述文献中描述的水浴法提取中植棉2号叶DNA：付小琼等.棉花总DNA快速提取技术及其在国家棉花区试中的应用.中国棉花学会2011年年会论文汇编.中国棉花学会2011年年会.中国棉花学会.2011-08-07。实验设重复，每次重复的实验方法如下：
7.1取中植棉2号叶装于2ml的离心管中，同时装入一粒钢珠，保存于-70℃低温冰箱中备用。提取时用研磨仪进行冷冻研磨，一般磨2次，每次20秒。
7.2研磨后取出钢珠，向中植棉2号叶粉末中加入提取液700μl，摇匀，放入65℃水浴40分钟，中间每10分钟缓慢颠倒离心管,得到含有DNA的提取液。
7.3向含有DNA的提取液中加入等体积的溶液B，缓慢颠倒8-10分钟，4℃条件下12000rpm离心10分钟。
7.4取上清液，加入0.6倍的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结，静置2分钟，用移液器枪头把絮状沉淀挑到离心管中。
7.5用70％的乙醇洗2次，100％乙醇洗1次，倒干乙醇，在真空干燥机中干燥DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用。
其中，提取液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为0.1M Tris-HCl、0.025M EDTA钠盐、2％CTAB、2％pvp、1.5M NaCl、1％β-巯基乙醇。
溶液B由氯仿和异戊醇组成，溶液B中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
8、水浴法提取中棉所63叶DNA
除将步骤7中的中植棉2号叶替换为中棉所63叶外，其它方法与步骤7完全相同。
检测上述步骤1至8得到的DNA溶液的纯度，结果如表1所示，冰浴法提取的种子与叶的DNA经紫外分光光度计检测，OD260/OD280的比值均在1.84-1.96之间，均符合SSR(简单序列重复)分析模板的要求，表明本发明的DNA的快速提取方法提取棉花种子与叶的DNA是可行的。其中，中植棉2号种子冰浴法得到的DNA溶于500μl灭菌超纯水得到的溶液OD260/OD280为1.97；中植棉2号种子水浴法得到的DNA溶于500μl灭菌超纯水得到的溶液OD260/OD280为2.04。说明本发明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)提取的种子DNA纯度好于现有的植物DNA提取方法(水浴提取法)，叶片提取时两种方法所得的DNA纯度均好。本发明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)中，通过向植物粉末中加入细胞裂解液和溶液S在冰浴中反应15分钟即可，将现有的植物DNA提取方法(水浴提取法)中的裂解膜和去蛋白质等杂质两步改为一步，且不用水浴锅，直接用常温裂解液，将现有的裂解膜和去蛋白质等杂质所需要的30-40分钟缩短了1倍以上，大大地节约了时间，提高效率。
表1、步骤1至8得到的DNA溶液的OD260/OD280
| 步骤 | 提取方法 | OD260/OD280 |
| 1 | 中植棉2号种子冰浴法 | 1.97 |
| 2 | 欣试71143种子冰浴法 | 1.96 |
| 3 | 中植棉2号种子水浴法 | 2.04 |
| 4 | 中棉所63种子水浴法 | 2.04 |
| 5 | 中植棉2号叶冰浴法 | 1.89 |
| 6 | 银兴棉4号叶冰浴法 | 1.84 |
| 7 | 中植棉2号叶水浴法 | 1.96 |
| 8 | 中棉所63叶水浴法 | 1.96 |
注：表1中的数值为三次重复实验的平均值。
实施例2、DNA质量检测(SSR-PCR)
1、SSR-PCR
1.1反应体系10μl：DNA模板1μl，10×Buffer(含MgCl2)1μl，10mM dNTPs0.3μl，2.5U/μl Taq酶0.2μl，10μM正引物0.5μl，10μM反引物0.5μl，6.5μl ddH2O。
当DNA模板为步骤1的冰浴法提取的中植棉2号种子DNA，引物为NAU1102和NAU1255；当DNA模板为步骤2的冰浴法提取的欣试71143种子DNA，引物为NAU1233和NAU1102；当DNA模板为步骤3的水浴法提取的中植棉2号种子DNA，引物为NAU1102和NAU1255；当DNA模板为步骤4的水浴法提取的中棉所63种子DNA，引物为NAU1369和CS62；当DNA模板为步骤5的冰浴法提取的中植棉2号叶DNA，引物为NAU1102和NAU1255；当DNA模板为步骤6的冰浴法提取的银兴棉4号叶DNA，引物为NAU1102和NAU1255；当DNA模板为步骤7的水浴法提取的中植棉2号叶DNA，引物为NAU1102和NAU1255；当DNA模板为步骤8的水浴法提取的中棉所63叶DNA，引物为NAU1102和NAU1186。
1.2扩增条件
反应程序：95℃预变性1分钟；94℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；94℃变性1分钟，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，4℃保存。
2电泳检测
2.1配胶：8％聚丙烯酰胺凝胶的组成(总量：50.73ml)：ddH2O26.5ml，5×TBE，PAGE母液13.5ml，10％AP(10％过硫酸铵)700μl，TEMED(四甲基乙二胺)30μl。
2.2电泳：将组装好的玻璃板平放在塑料盒上，将配好的胶灌入玻璃板内，待胶完全凝固后将玻璃板放入电泳槽内，加入1×TBE电泳液。每个孔点样品2μl，220v电压下跑1h20分钟。
2.3固定：用固定液固定8分钟。
2.4渗透：用渗透液渗透12分钟。蒸馏水快速洗两遍。
2.5显色：用显色液显色5分钟。蒸馏水洗两遍。
2.6终止：倒入终止液，终止反应。
2.7照相并记录结果，结果如图1-图16所示。
实验结果显示，用不同器官不同提取方法所得到的DNA作为PCR模板，均能扩增出清晰的谱带，说明DNA均能符合SSR-PCR的反应要求。其中图1、5、9和13均为中植棉2号在引物NAU1255扩增下的图谱，图2、6、10和14均为中植棉2号在引物NAU1102扩增下的图谱，谱带一致，重复性好，且比对棉花品种指纹图谱库，中植棉2号的指纹图谱比对相同。图3、4为欣试71143在引物NAU1233和NAU1102下扩增的图谱，比对棉花品种指纹图谱库，结果一致。图11、12为银兴棉4号在引物NAU1102和NAU1255下扩增的图谱，比对棉花品种指纹图谱库，结果一致。图7、15分别为中棉所63在引物NAU1369和引物NAU1102扩增下的图谱，图8、16分别为中棉所63在引物CS62和引物NAU1186扩增下的图谱，比对棉花品种指纹图谱库，结果一致。以上各个品种不同植株间谱带一致性好，表明各品种的纯度均好。
对比例1、冰浴法抽提一次提取中植棉2号种子DNA(加酚、氯仿和异戊醇抽提)及质量检测
1、提取步骤如下：
实验设重复，每次重复的实验方法如下：
1.1中植棉2号干燥种子剥去种皮得到棉仁，1粒棉仁装于1个2ml的离心管中，再装1粒5mm的钢珠,用MM301混合型研磨仪研磨得到中植棉2号种子粉末。
1.2向中植棉2号种子粉末中加入细胞裂解液850μl，用力摇匀，加入850μl溶液A摇匀，冰浴15分钟，中间缓慢颠倒离心管3次，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液1，除去提取液1的杂质，得到中植棉2号种子DNA。其中，按照下述方法除去提取液1的杂质：4℃条件下12000rpm离心10分钟，收集上清液，将该上清液称为上清液C1，向上清液C1中加入是上清液C10.6倍体积的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结，静置2分钟，用枪头把所述絮状沉淀挑至离心管中，按照如下方法除去所述沉淀的杂质，得到中植棉2号种子DNA：用70％(体积百分含量)的乙醇洗沉淀2次，再用100％乙醇洗1次，倒干乙醇，在真空干燥机中干燥DNA，得到中植棉2号种子DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用。
其中，细胞裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为0.1M Tris-HCl、0.02MEDTA钠盐、2％(质量百分含量)十六烷基三甲基溴化铵、2％(质量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和1％(体积百分含量)β-巯基乙醇，所述细胞裂解液的pH为8.0。
溶液A由苯酚、氯仿和异戊醇组成，溶液A中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1。
2、DNA质量检测(SSR-PCR)
具体操作步骤同实施例2，引物为NAU1255，结果如图17。在中植棉2号种子DNA提取时，若只加酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)抽提一次，用引物NAU1255检测DNA质量，发现有4个DNA未扩增出谱带，如图17中第1、2、6和7泳道，DNA的质量并未达到SSR(简单序列重复)模板分析的要求。主要原因是种子中含有的蛋白质成分高，一次抽提去杂质不够彻底，剩余杂质影响PCR反应。
对比例2、冰浴法抽提一次提取中棉所63种子DNA(加氯仿和异戊醇抽提)及质量检测
1、提取步骤如下：
实验设重复，每次重复的实验方法如下：
1.1中棉所63干燥种子剥去种皮得到棉仁，1粒棉仁装于1个2ml的离心管中，再装1粒5mm的钢珠,用MM301混合型研磨仪研磨得到中棉所63种子粉末。
1.2向中棉所63种子粉末中加入细胞裂解液850μl，用力摇匀，加入850μl溶液B摇匀，冰浴15分钟，中间缓慢颠倒离心管3次，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液1，除去提取液1的杂质，得到中棉所63种子DNA。其中，按照下述方法除去提取液1的杂质：4℃条件下12000rpm离心10分钟，收集上清液，将该上清液称为上清液D1，向上清液D1中加入是上清液D10.6倍体积的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结，静置2分钟，用枪头把絮状沉淀挑至离心管中，按照如下方法除去所述沉淀的杂质，得到中棉所63种子DNA：用70％(体积百分含量)的乙醇洗所述沉淀2次，再用100％乙醇洗1次，倒干乙醇，在真空干燥机中干燥DNA，得到中棉所63种子DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用。
其中，细胞裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为0.1M Tris-HCl、0.02MEDTA钠盐、2％(质量百分含量)十六烷基三甲基溴化铵、2％(质量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和1％(体积百分含量)β-巯基乙醇，所述细胞裂解液的pH为8.0。溶液B由氯仿和异戊醇组成，溶液B中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
2、DNA质量检测(SSR-PCR)
具体操作步骤同实施例2，引物为NAU2026，结果如图18所示。实验结果显示，在提取中棉所63种子DNA时，若只加只加氯仿：异戊醇(体积比为24：1)抽提一次，用引物NAU2026检测DNA质量，发现图18中第1和4泳道为空白，DNA的质量并未达到SSR(简单序列重复)分析模板的要求。主要原因是种子中含有的蛋白质成分高，一次抽提去杂质不够彻底，剩余杂质影响PCR反应。
对比例1和对比例2的结果表明种子提取DNA时加入酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)抽提和加入氯仿：异戊醇(体积比为24：1)抽提的步骤是不可减少的。
Claims (6)
1.棉花DNA提取方法，包括下述步骤1)和2)：
1)破碎棉花叶，得到植物粉末；
2)向所述植物粉末中加入细胞裂解液和溶液B在冰浴中反应15分钟，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液1，除去所述提取液1的杂质，得到DNA；
所述细胞裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为0.1M Tris-HCl、0.02M EDTA钠盐、质量百分含量为2％的十六烷基三甲基溴化铵、质量百分含量为2％的聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和体积百分含量为1％的β-巯基乙醇；
所述溶液B由氯仿和异戊醇组成，所述溶液B中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；所述除去所述提取液1的杂质包括以下步骤：将所述提取液1进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液B1，向所述上清液B1中加入异丙醇反应10秒，得到含有DNA的沉淀，将该沉淀称为沉淀B1，除去所述沉淀B1的杂质，得到DNA；所述除去所述沉淀B1的杂质包括以下步骤：用乙醇水溶液或乙醇洗涤所述沉淀B1得到DNA；所述离心的温度为4℃，时间为10分钟。
2.棉花DNA提取方法，包括下述步骤1)和2)：
1)破碎棉花种子，得到植物粉末；
2)向所述植物粉末中加入细胞裂解液和溶液A在冰浴中反应15分钟，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液1，除去所述提取液1的杂质，得到DNA；
所述细胞裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为0.1M Tris-HCl、0.02M EDTA钠盐、质量百分含量为2％的十六烷基三甲基溴化铵、质量百分含量为2％的聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和体积百分含量为1％的β-巯基乙醇；
所述溶液A由苯酚、氯仿和异戊醇组成，所述溶液A中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；
所述除去所述提取液1的杂质包括以下步骤：将所述提取液1进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液A1，向所述上清液A1中加入溶液B反应3-5分钟，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液A2，除去所述提取液A2的杂质，得到DNA；所述溶液B由氯仿和异戊醇组成，所述溶液B中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；所述除去所述提取液A2的杂质包括以下步骤：将所述提取液A2进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液A2，向所述上清液A2中加入异丙醇反应10秒，得到含有DNA的沉淀，将该沉淀称为沉淀A1，除去所述沉淀A1的杂质，得到DNA；所述除去所述沉淀A1的杂质包括以下步骤：用乙醇水溶液或乙醇洗涤所述沉淀A1得到DNA；
所述离心的温度为4℃，时间为10分钟。
3.权利要求1所述DNA提取方法在棉花分子标记辅助育种中的应用。
4.权利要求1所述DNA提取方法在品种纯度检测或品种的真实性鉴定中的应用。
5.权利要求2所述DNA提取方法在棉花分子标记辅助育种中的应用。
6.权利要求2所述DNA提取方法在品种纯度检测或品种的真实性鉴定中的应用。
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