CN108034732A

CN108034732A - 一种预测绵羊繁殖能力的方法及其应用

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Publication number: CN108034732A
Application number: CN201711365571.5A
Authority: CN
Inventors: 苗向阳; 解领丽
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2037-12-18
Also published as: CN108034732B

Abstract

本发明涉及一种预测绵羊繁殖能力的方法及其应用，具体的涉及miRNA‑486在预测绵羊繁殖能力中的应用。本发明通过高通量测序技术，筛选到与绵羊繁殖能力相关的miRNA‑486，并通过QPCR进一步验证了miRNA‑486在不同繁殖力的绵羊中呈现差异表达，提示可以根据miRNA‑486的差异表达进行绵羊优势品种的选育，从而加快绵羊的育种进程。

Description

一种预测绵羊繁殖能力的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种预测绵羊繁殖能力的方法及其应用，具体的涉及miRNA-486在预测绵羊繁殖能力中的应用。

背景技术

家畜繁殖力作为一个对畜牧生产有重要影响的经济性状，对种畜来说，繁殖力就是生产力，它能直接影响生产水平的高低和发展，其遗传机制一直是研究的焦点。但由于其遗传力低(0.03-0.1)，采用传统的育种方法很难实现对该性状进行遗传改良。随着近些年分子生物技术的迅猛发展，通过功能基因组学、群体遗传学、转录组学、蛋白组学及多组学结合来定位动植物重要经济性状分子标记及关键候选基因已得到广泛应用。

绵羊与山羊是最早被驯化的物种，在人类农业生产中，绵羊的肉，奶，皮毛等产品是生活中不可缺少的一部分。但是，我国现代绵羊产业却存在诸多问题，如周转周期长、效率低、生产效益差等，其中最制约我国绵羊生产发展的根本问题还是出栏率低于世界水平。因此，如何改善国内绵羊繁殖性状是其选育过程中亟待解决的难题。

miRNA(microRNA)是广泛存在于真核生物中长约18～25个核苷酸的一类非编码RNA分子，在生物发育的不同阶段、生物体的不同组织以及不同细胞类型中具有不同的表达模式，对动物的生长、发育、生殖以及疾病(癌症和肿瘤等)发生等生命活动有着重要的调控作用，其几乎参与所有的生命过程。

卵巢作为动物体内最重要的生殖器官之一，其排卵及内分泌功能对生殖的实现具有决定性作用，因此研究绵羊卵巢miRNA对于解析繁殖性状形成的遗传本质及提高绵羊繁殖力具有重要意义。然而目前关于绵羊组织特异性miRNA的研究尚处于起步阶段，尤其是绵羊卵巢miRNA的研究还没有出现。因此，迫切需要提高绵羊卵巢miRNA研究水平和完整性，从而为绵羊基因组及非编码RNA研究提供科学的理论依据，以便更好地开发利用绵羊遗传资源，实现可持续发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用羊的基因的差异表达方便、可靠地预测绵羊繁殖力的方法。

本发明提供了一种预测或辅助预测绵羊繁殖能力的方法，通过检测样本中miRNA-486的表达水平来预测或辅助预测绵羊的繁殖能力，当miRNA-486表达水平显著升高时，绵羊具有较低的繁殖力。

在本发明的具体实施方式中，所述miRNA-486的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，通过northern blotting、实时荧光定量PCR、原位杂交、基因芯片、高通量测序技术检测样本中miRNA-486的表达水平。

进一步，通过实时荧光定量PCR检测样本中miRNA-486的表达水平。

进一步，所述通过实时荧光定量PCR检测样本中miRNA-486的表达水平的引物对序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了上面所述的方法在羊繁育中的应用。

本发明提供了上面所述的方法在羊育种中的应用。

本发明提供了一种用于预测或辅助预测绵羊繁殖能力的引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了含有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列的引物对的预测或辅助预测绵羊繁殖能力的试剂或试剂盒。

进一步，所述的试剂盒还包括管家基因引物对、RNA提取试剂、逆转录试剂、PCR反应体系。

进一步，所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。

在本发明中，所述试剂或试剂盒还包括与绵羊繁殖力相关的其他miRNA的检测引物对，通过将多个标志物同时检测，对于选育高繁殖力的绵羊具有重要的意义。

本发明提供了序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对的应用，所述应用为：

1)在预测或辅助预测绵羊繁殖能力中的应用；和/或

2)在选育高繁殖能力绵羊中的应用。

本发明提供了含有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列的引物对的预测或辅助预测绵羊繁殖能力的试剂或试剂盒的用途，所述用途为选育高繁殖能力的绵羊。

术语“繁殖能力”等同于“繁殖力”，可以相互替换，所述繁殖力涉及季节性发情、排卵率、产羔数等。发情周期长、排卵率高、产羔数多的繁殖力高；相反，则繁殖力比较低。本发明通过对具有高繁殖力的小尾寒羊和低繁殖力的道赛特羊的卵巢进行miRNA测序，利用群体遗传学手段来寻找高繁殖力和低繁殖力绵羊miRNA表达谱的差异，挖掘繁殖性状的功能基因，解析其复杂的分子机理奠定理论基础，同时为高繁殖力绵羊的选育以及育种提供重要的手段。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法对miRNA-486进行检测，包括但不限于northern blotting、实时荧光定量PCR、原位杂交、基因芯片、高通量测序技术。

Northern blot是最为经典的核酸杂交技术，被广泛用于miRNA的表达检测，也是唯一能可视化检测miRNA表达的方法。首先提取组织或细胞总RNA，利用高浓度凝胶电泳将RNA大小分级；再将小RNA分子转移到尼龙膜上，用紫外交联或封闭法将小RNA分子固定在膜上；最后利用高灵敏度的特异性探针检测miRNA的表达，特异性探针可用地高辛(DIG)和生物素(BIOTIN)或荧光标记，便于检测的可视化。

实时荧光定量PCR是目前最常用的定量检测特定miRNA表达的方法，此方法是在反应体系中加入荧光基团，利用信号的积累检测PCR进程，通过标准曲线及CT值来计算模板浓度，从而达到定量的目的。

原位杂交是指将核酸探针标记后，与组织或细胞中的核酸杂交，将已知序列的miRNA在组织、细胞或亚细胞定位的一种检测技术。该方法可以更直观地探测miRNA在组织或细胞中的时空表达模式。

本领域技术人员应当理解，检测miRNA的手段或方法不是本发明的重要方面，只要可以确定miRNA-486的表达水平即可。

应当知道，本发明的miRNA-486包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整miRNA-486核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miRNA-486功能的条件下，对miRNA-486进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

本发明的miRNA-486核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的miRNA-486主要呈单链形式，而miRNA-486前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

本发明的miRNA-486可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miRNA-486的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。

病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

可以表达miRNA-486的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中寻找miRNA-486在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-486的初始位置，在miRNA-486初始位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达miRNA-486的DNA片段。

术语“样本”包括可以是血液、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或者组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。在本发明的具体实施方式中，所述样本为卵巢组织。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了miRNA-486与绵羊的繁殖力相关，对于研究绵羊的繁殖性状的遗传本质及提高绵羊繁殖力具有重要的意义。

本发明提供了一种预测或辅助预测绵羊繁殖力的方法，利于实现绵羊的分子标记辅助选择及生殖人为调控。

附图说明

图1是利用QPCR检测miRNA-486在不同繁殖力的绵羊中的差异表达情况图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1与绵羊繁殖力相关的miRNA的筛选

1、样本采集

采集绵羊卵巢组织样品9份，分别来自3只低繁殖力的道赛特母羊，6只小尾寒羊母羊，其中包括3只基因型为FecB⁺FecB⁺(Han++)的小尾寒羊和3只基因型为FecB^B FecB^B(HanBB)的小尾寒羊。所有的绵羊采用阴道海绵栓(Intervet,墨西哥)进行同期发情处理，塞栓后第10天撤栓，并每只羊400单位肌肉注射促孕马血清激素(三生药业有限公司，浙江宁波)，从第11天开始试情，并记录各羊的发情时间，15～18天后经过一个发情周期至第二次自然发情时，采用阴道检查法和试情公羊试情法进行发情鉴定，发情后4～5h将试验羊屠宰，取出卵巢组织，放入RNAlater(Invitrogen，美国)保护试剂，4℃过夜，后转-80℃保存，用于提取组织总RNA。

2、样本总RNA的提取

使用Invitrogen公司的组织RNA提取试剂盒提取卵巢组织总RNA。具体步骤如下：

1)液氮研磨，组织块直接放入研体中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转移入离心管中，室温放置5min，使其充分裂解。

2)12000rpm离心5min，弃沉淀。

3)按200μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀15min，室温放置15min。

4)4℃12000g离心15min。

5)吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

6)4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

7)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

8)4℃8000g离心5min，弃上清，温晾干或真空干燥5-10min。

9)将RNA使用无RNA去离子水溶解，待用。

3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：A260/A280为1.8-2.0，1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

4、卵巢miRNA测序文库的构建和高通量测序

1)小RNA分离

样本总RNA进行15％TBE-Urea聚丙烯酞胺凝胶电泳，分离长度在15～50nt的RNA片段，切割、洗脱、酒精沉淀纯化回收。

2)5’和3’接头连接

使用T4RNA Ligase先将5'接头(Illumina)和连接到小RNA文库中的序列上，然后使用15％TBE-Urea聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，将长度在41～76nt片段区域切割、洗脱、酒精沉淀纯化回收，再用T4RNA Ligase将3’接头和上一步骤中得到的片段连接，然后再使用15％TBE-Urea聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，切割长度在64～99nt片段区域、洗脱、酒精沉淀纯化回收备用。

3)cDNA文库构建

使用miScript Reverse Transcription逆转录酶体系(Qiagen，German)，按照Illumina公司推荐的反转引物合成单链cDNA，接着用Phusion*DNA Polymerase(Finnzymes，Finland)及Illumina公司相应的扩增引物，经20次循环扩增文库。

4)cDNA文库纯化

使用12％TBE聚丙烯酞胺凝胶电泳，选择适合的长度序列，序列再经过洗脱，纯化后，使用Nanodrop ND-1000分光光度计测定cDNA文库的浓度，将测序用样品浓度调整到10nM，用10μL进行序列测定。

miRNA测序文库构建好以后，经纯化和质量检测合格后上机测序，测序使用的是高通量的Illumina Solexa测序平台(Illumina，USA)。本研究测序工作委托华大基因科技公司进行。

5、测序原始数据处理

测序结果使用Illumina测序平台配套的CASAVA软件把原始数据的图像文件经base calling转换成序列文件(raw reads)，然后根据生物信息学分析原则，对:raw reads进行如下几个步骤的处理，最终获得全部有效序列(mappable reads)用于后续比对分析。

1)去接头：去除结果序列中测序前连接的5’和3’接头序列。

2)去poly A：去除结果序列中包含poly A的序列。

3)去除序列中没有插入片段的序列。

4)去除片段长度小于18nt的序列。

5)统计小RNA文库的长度百分比分布情况。

6)将clean reads比对到已知数据库，鉴定并有效去除rRNA，tRNA，snoRNA，snRNA，repeat等其他类型的非miRNA序列。

6、结果：

实验结果显示，与低繁殖力的道赛特羊相比，高繁殖力的小尾寒羊(Han++和HanBB)卵巢组织中的miRNA-486表达下调。

实施例2 QPCR验证差异表达的miRNA-486

1、根据高通量测序结果选择miRNA-486进行QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择10只道赛特羊母羊以及20只小尾寒羊母羊(10只Han++，10只HanBB)的卵巢组织。

2、RNA提取过程同实施例1。

3、逆转录

采用Qiagen公司所生产的反转录试剂盒miScript Reverse Transcript Kit的说明书步骤来获得cDNA。

配置反转录体系：总RNA 10μl，5×RT Buffer 4μl，miRNA接头引物1μl，miRNA RTEnzyme Mix 2μl，加入Rnase free H₂O至总体积20μl。

反应条件：37℃1h，85℃10min。

4、QPCR反应

根据miRNA和U6snRNA的序列设计引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1)引物设计

扩增miRNA-486的引物

正向引物：TACTGAGCTGCCCCGAG(SEQ ID NO.2)

反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.3)

扩增U6snRNA的引物

正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID NO.4)

反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO.5)

2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1 PCR反应体系

	体积
		2×SG Green qPCR Mix	7.5μl
正向引物	0.25μl
		反向引物	0.25μl
cDNA模板	1μl
		ddH₂O	6μl
总体积	15μl

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃15s)×45个循环，95℃15s，60℃30s，95℃15s。

5、数据分析

选用U6为内参基因，每个样品经QPCR扩增后，得到样品的Ct值，用2^-ΔΔCT法计算不同组织间基因的相对表达量，采用SPSS 18.0软件对表达数据进行统计学分析，定义P<0.05为差异显著。

6、结果

如图1所示，与低繁殖力的道赛特羊母羊相比，miRNA-486在高繁殖力的小尾寒羊母羊中的表达水平显著降低，与高通量测序结果一致。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种预测绵羊繁殖能力的方法及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Ovis aries

<400> 1

uccuguacug agcugccccg ag 22

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tactgagctg ccccgag 17

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims

1.预测或辅助预测绵羊繁殖能力的方法，其特征在于，通过检测样本中miRNA-486的表达水平来预测或辅助预测绵羊的繁殖能力。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过northern blotting、实时荧光定量PCR、原位杂交、基因芯片、高通量测序技术检测样本中miRNA-486的表达水平。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过实时荧光定量PCR检测样本中miRNA-486的表达水平。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述通过实时荧光定量PCR检测样本中miRNA-486表达水平的引物对序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

5.权利要求1所述的方法在羊繁育中的应用。

6.权利要求1所述的方法在羊育种中的应用。

7.一种用于预测或辅助预测绵羊繁殖能力的引物对，其特征在于，所述引物对序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

8.含有权利要求7所述的引物对的预测或辅助预测绵羊繁殖能力的试剂或试剂盒。

9.权利要求7所述的引物对的应用，其特征在于，所述应用为：

1)在预测或辅助预测绵羊繁殖能力中的应用；和/或

2)在选育高繁殖能力绵羊中的应用。

10.权利要求8所述的试剂或试剂盒的用途，其特征在于，所述用途为选育高繁殖能力的绵羊。