CN117363610A - 一种用于去除总RNA中rRNA的DNA探针、方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于去除总RNA中rRNA的DNA探针、方法及其应用。所述DNA探针的核酸序列包括SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.9所示的序列。本发明设计的DNA探针能够特异性针对唾液中总RNA中的原核生物rRNA进行有效去除，去除率80％以上，相同测序深度下，基因组比对率明显提高，此外采用液氮研磨的方式提取唾液中总RNA，能够极大提高RNA的得率和质量。
Description
技术领域
本发明属于生物应用技术领域，涉及一种用于去除总RNA中rRNA的DNA探针、方法及其应用。
背景技术
唾液作为机体重要的体液之一，可反映机体的生理和病理状态。对比血液诊断，唾液检测的优势在于无创性、可反复多次收集。因此，利用唾液生物标志物进行早期癌症检测和健康监测成为了研究热点。由于唾液RNA样本中不仅包含人类的rRNA，还存在极为丰富的原核生物rRNA。rRNA作为一种含量最丰富的非编码RNA分子，几乎不能提供转录本信息，且会掩盖基因的表达丰度、增加测序的深度和降低数据分析的效率。因此，通常会在在转录组测序之前从RNA样本中去除rRNA，rRNA的去除效率也被是为最大化读取到转录物的关键因素。现存的试剂盒仅考虑去除宿主的rRNA，忽略了唾液RNA样本中占比更高的原核生物rRNA的去除。
因此，亟需一种能够高效便捷地去除唾液样本中总RNA中原核生物rRNA的DNA探针及方法，提高rRNA的去除率，提高数据的有效利用率。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种去除总RNA中rRNA的DNA探针、方法及其应用，利用设计的DNA探针，与待测样本中的原核生物rRNA进行反向互补配对形成DNA探针-rRNA杂交双链，并使用酶消化法去除DNA探针-rRNA杂交双链，以达到去除唾液RNA样本中原核生物rRNA的目的，去除率可达到80％以上，操作简单高效，相同测序深度下，基因组比对率明显提高。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于去除总RNA中原核生物rRNA的DNA探针，所述DNA探针的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9所示的序列中的任意一种或至少两种的组合。
本发明创造性地设计了用于去除唾液样本总RNA中原核生物rRNA的DNA探针，有效去除转录产物中80％以上的核糖体RNA序列，相同测序深度下，基因组比对率明显提高，此外采用液氮研磨的方式提取唾液中总RNA，能够极大提高RNA的得率和质量。
SEQ ID NO.1：TAC CGC GGCTGCTGG CA。
SEQ ID NO.2：GCC CTG GACTTC CAG GGTATC。
SEQ ID NO.3：GGTTAC CTT GTTACGACT。
SEQ ID NO.4：CACTTACCC CGA CAAGGAA。
SEQ ID NO.5：GAC CAC CCG CGCTAC GGC。
SEQ ID NO.6：TCGGTCCTAGTTTGAGAGGTT。
SEQ ID NO.7：ACTCGGTMCTAGTTTGAGA。
SEQ ID NO.8：ATGGCGCCGMCGACCGTG。
SEQ ID NO.9：AAGATTCGGTTTTAGGACCA。
优选地，所述rRNA包括5S rRNA、16S rRNA或23S rRNA中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于去除总RNA中原核生物rRNA的DNA探针在制备用于去除总RNA中原核生物rRNA的产品中的应用。
第三方面，本发明提供了一种用于去除总RNA中原核生物rRNA的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于去除总RNA中原核生物rRNA的DNA探针。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的用于去除总RNA中原核生物rRNA的DNA探针在去除rRNA中的应用。
第五方面，本发明提供了一种非疾病诊断和/或治疗为目的的去除总RNA中原核生物rRNA的方法，所述方法包括：
从待测样本中提取总RNA，混合总RNA与第一方面所述的DNA探针得到DNA探针-rRNA杂交双链，将所述DNA探针-rRNA杂交双链与RNase H混合，再使用DNase I酶去除DNA和剩余DNA探针，得到rRNA-free的样本。
优选地，所述DNA探针的长度为15-30bp。
上述15-30bp中的点值具体可以选择15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、22bp、24bp、26bp、28bp、30bp。
优选地，所述待测样本包括唾液、细胞或组织中任意一种。
优选地，所述待测样本经过液氮研磨处理。
优选地，所述总RNA包括人类和原核生物的rRNA分子和非rRNA分子。
优选地，所述rRNA分子包括5S rRNA、16S rRNA或23S rRNA中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述提取总RNA的方法包括trizol法。
优选地，所述DNA探针浓度为0.1-1μM。
上述0.1-1μM中的具体点值可以选择0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明设计的DNA探针能够特异性针对唾液中总RNA中的原核生物rRNA进行有效去除，去除率80％以上，相同测序深度下，基因组比对率明显提高，此外采用液氮研磨的方式提取唾液中总RNA，能够极大提高RNA的得率和质量。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本发明提供一种去除原核生物rRNA的具体方法，包括以下步骤：
1.针对唾液中原核生物rRNA，对5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA的中的保守序列设计探针，选择不同组合的探针并混合。
2.在唾液样本总RNA中加入一定组合的探针混合物(Probe-mix)，在合适的温度下缓慢退火，DNA探针特异性的与原核生物靶rRNA结合，形成DNA探针-rRNA杂交双链。
3.RNaseH消化：加入RNaseH酶特异性消化DNA探针-rRNA杂交双链。
4.DNase I消化：加入DNase I酶去出样本中剩余的DNA和DNA探针，终止反应。
5.纯化去除原核生物rRNA后的RNA样本。
实施例2
提取唾液总RNA的方法的优化。
于清晨漱口后，使用吐取法获得新鲜人类唾液，迅速置于液氮中研磨或不研磨，使用trizol纯化提取人类唾液中总RNA，作为初始样本。具体如下，液氮冷冻后，充分研磨，加入1mL trizol，冰上静置10min；加入1/5体积的氯仿，上下颠倒混匀后，冰上静置5min；4℃/12000rpm离心20min；取上层后加入等体积的异丙醇，混匀后，冰上静置10min；4℃/12000rpm离心20min；弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇，混匀后4℃/12000rpm离心10min；弃上清，开盖晾干后加入一定体积的DEPC水溶解RNA。
对4名不同受试者的唾液进行RNA提取，对同一受试者的样本分别使用液氮研磨(T1-4)和不研磨(C1-4)进行前处理后，使用trizol提取RNA，唾液RNA质检结果的影响结果如表1所示。
表1
| 样品编号 | 前处理方式 | RNA浓度(ng/μL) | A260/280 | A260/230 | 体积(μL) |
| C1 | 未研磨 | 33.4 | 2.03 | 1.13 | 20 |
| C2 | 未研磨 | 26.9 | 2.25 | 0.52 | 20 |
| C3 | 未研磨 | 26.3 | 2.22 | 0.64 | 20 |
| C4 | 未研磨 | 31.7 | 1.80 | 1.59 | 20 |
| T1 | 液氮研磨 | 125.5 | 1.96 | 2.09 | 20 |
| T2 | 液氮研磨 | 92.0 | 1.98 | 2.03 | 20 |
| T3 | 液氮研磨 | 85.6 | 2.00 | 1.98 | 20 |
| T4 | 液氮研磨 | 109.1 | 1.98 | 2.5 | 20 |
由表1可知，液氮研磨后唾液总RNA样本的浓度均有所提高，最高提高了约3.5倍，RNA的质量也更佳，A260/280和A260/230显示，使用液氮研磨，可降低蛋白质和胍盐的污染，得到更纯净的RNA。同时，使用液氮研磨提取唾液RNA的结果稳定性和一致性较高。
实施例3
DNA探针设计和获取。
针对原核生物5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA的保守序列设计引物。设计结果如表2，但不限于表2所示序列。
表2
| SEQ ID NO.1 | TACCGCGGCTGCTGGCA |
| SEQ ID NO.2 | GCCCTGGACTTCCAGGGTATC |
| SEQ ID NO.3 | GGTTACCTTGTTACGACT |
| SEQ ID NO.4 | CACTTACCCCGACAAGGAA |
| SEQ ID NO.5 | GACCACCCGCGCTACGGC |
| SEQ ID NO.6 | TCGGTCCTAGTTTGAGAGGTT |
| SEQ ID NO.7 | ACTCGGTMCTAGTTTGAGA |
| SEQ ID NO.8 | ATGGCGCCGMCGACCGTG |
| SEQ ID NO.9 | AAGATTCGGTTTTAGGACCA |
制备表2所示的单链DNA探针。所有探针等比混合，组成Probe-mix，使其终浓度为0.1-1μM。
实施例4
去除唾液RNA样本中原核生物rRNA。
制备探针杂交反应体系：
取500ng RNA，5×reaction buffer(Tris-HCL和KCL混合物)；0.3μMProbe-mix，使用DEPC水定容至15μL。移液枪混匀后，瞬离至管底。将上述体系置于PCR仪中，按照95℃，3min；95℃-22℃，0.1℃/s；22℃，5min进行反应。
将实施例3获得的DNA探针与提取的总RNA混合得到DNA探针-rRNA杂交双链。
RNaseH特异性消化DNA探针-rRNA杂交双链：
在上述产物中加入3μL RNaseH buffer，2μL RNaseH，混匀后置于PCR仪中反应，条件为：37℃，30min。
DNase I消化去除剩余的DNA和DNA探针：
在上述产物中加入27.5μL DNase I buffer，2.5μL DNase I，混匀后置于PCR仪中反应，条件为：37℃，30min。
纯化去除原核生物rRNA后的RNA样本：
选择trizol法纯化RNA样本，步骤同实施例1。
实施例5
去除唾液RNA样本中原核生物rRNA。
制备探针杂交反应体系:
取500ng RNA，5×reaction buffer(Tris-HCL和KCL混合物)；0.1μMProbe-mix，使用DEPC水定容至15μL。移液枪混匀后，瞬离至管底。将上述体系置于PCR仪中，按照95℃，3min；95℃-22℃，0.1℃/s；22℃，5min进行反应。
将实施例3获得的DNA探针与提取的总RNA混合得到DNA探针-rRNA杂交双链。
RNaseH特异性消化DNA探针-rRNA杂交双链:
在上述产物中加入3μL RNaseH buffer，2μL RNaseH，混匀后置于PCR仪中反应，条件为：37℃，30min。
DNase I消化去除剩余的DNA和DNA探针:
在上述产物中加入27.5μL DNase I buffer，2.5μL DNase I，混匀后置于PCR仪中反应，条件为：37℃，30min。
纯化去除原核生物rRNA后的RNA样本:
选择trizol法纯化RNA样本，步骤同实施例1。
实施例6
去除唾液RNA样本中原核生物rRNA。
制备探针杂交反应体系：
取500ng RNA，5×reaction buffer(Tris-HCL和KCL混合物)；0.5μM Probe-mix，使用DEPC水定容至15μL。移液枪混匀后，瞬离至管底。将上述体系置于PCR仪中，按照95℃，3min；95℃-22℃，0.1℃/s；22℃，5min进行反应。
将实施例3获得的DNA探针与提取的总RNA混合得到DNA探针-rRNA杂交双链。
RNaseH特异性消化DNA探针-rRNA杂交双链：
在上述产物中加入3μL RNaseH buffer，2μL RNaseH，混匀后置于PCR仪中反应，条件为：37℃，30min。
DNase I消化去除剩余的DNA和DNA探针：
在上述产物中加入27.5μL DNase I buffer，2.5μL DNase I，混匀后置于PCR仪中反应，条件为：37℃，30min。
纯化去除原核生物rRNA后的RNA样本：
选择trizol法纯化RNA样本，步骤同实施例1。
实施例7
本实施例与实施例4区别仅在于DNA探针替换为表3所示的序列。
表3
| SEQ ID NO.1 | TACCGCGGCTGCTGGCA |
| SEQ ID NO.3 | GGTTACCTTGTTACGACT |
| SEQ ID NO.4 | CACTTACCCCGACAAGGAA |
| SEQ ID NO.6 | TCGGTCCTAGTTTGAGAGGTT |
| SEQ ID NO.7 | ACTCGGTMCTAGTTTGAGA |
| SEQ ID NO.9 | AAGATTCGGTTTTAGGACCA |
实施例8
本实施例与实施例4区别仅在于DNA探针探针的浓度为0.05μM。
实施例9
本实施例与实施例4区别仅在于DNA探针的浓度为1.5μM。
实施例10
本实施例与实施例4区别仅在于未进行唾液样本研磨。
测试例1
rRNA去除率测试。
以未去除原核生物rRNA的样本为对照组，通过荧光实时定量PCR比较去除前后原核5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA的含量，去除效果如表4所示。
表4
结果：由实施例4-6rRNA去除率可达到，说明本发明设计的DNA探针能够特异性对唾液总RNA中的原核生物rRNA进行有效去除，去除率80％以上，实施例7使用部分probe mix组合，结果发现rRNA去除率效果较差，说明本发明的引物能够相互配合，共同作用，促进对原核生物rRNA的去除，实施例8和9没有精准控制DNA探针的浓度，结果发现rRNA去除率效果欠佳，说明本发明精准控制DNA探针的浓度能够有效去除多种原核生物rRNA。实施例10未进行液氮研磨，结果发现GAPDH的Ct值显著高于液氮研磨(实施例4-9)，说明使用液氮研磨能显著提高RNA的浓度。
测试例2
基因组比对率测试。
测试步骤：通过常规转录组测序，建库时选择200-300bp大小片段，采用125PE/150PE测序，得到下机数据后进行测序质量评估及预处理，得到基因组比对率以及质控结果。
结果如表5所示。
表5
| 组别 | GC(％) | 基因组比对率(％) | 核糖体含量(％) |
| 对照 | 44.3 | 50.88 | 93.02 |
| 实施例4 | 45.5 | 80.29 | 70.39 |
| 实施例5 | 47.98 | 81.78 | 72.34 |
| 实施例6 | 50.23 | 83.01 | 77.56 |
| 实施例7 | 51.00 | 70.99 | 80.56 |
| 实施例8 | 50.34 | 75.98 | 82.46 |
| 实施例9 | 48.09 | 74.34 | 89.03 |
| 实施例10 | 42.02 | 44.05 | 94.23 |
结果：在相同测序深度，实施例4-6rRNA基因组比对率可达到80％以上，说明本发明设计的DNA探针能够有效去除原核生物rRNA，降低测序中核糖体的含量。实施例7选用部分设计的DNA探针组合，结果显示其基因组比对率在约为70％。以上结果说明更多的DNA探针组合对去除原核生物rRNA的效果更佳，显著提高了测序效率，降低测序成本。实施例8和9没有精准控制DNA探针的浓度，结果显示基因组比对率约为75％，说明本发明精准控制DNA探针的浓度能够更加有效的去除原核生物rRNA。实施例10未进行液氮研磨，结果发现与液氮研磨组相比(实施例4-9)，基于组比对率显著低于液氮研磨组(实施例4-9)，说明液氮研磨不仅能提高RNA的浓度，也提高了RNA的质量。
综上所述，本发明设计的DNA探针能够特异性针对唾液中总RNA中的原核生物rRNA进行有效去除，去除率80％以上，相同测序深度下，基因组比对率明显提高，此外采用液氮研磨的方式提取唾液中总RNA，能够极大提高RNA的得率和质量。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种用于去除总RNA中原核生物rRNA的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9所示的序列中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述rRNA包括5S rRNA、16S rRNA或23SrRNA中的任意一种或至少两种的组合。
3.权利要求1所述的用于去除总RNA中原核生物rRNA的DNA探针在制备用于去除总RNA中原核生物rRNA的产品中的应用。
4.一种用于去除总RNA中原核生物rRNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于去除总RNA中原核生物rRNA的DNA探针。
5.权利要求1所述的用于去除原核生物rRNA的DNA探针在去除rRNA中的应用。
6.一种非疾病诊断和/或治疗为目的的去除总RNA中原核生物rRNA的方法，其特征在于，所述方法包括：
从待测样本中提取总RNA，混合总RNA与权利要求1或2所述的DNA探针得到DNA探针-rRNA杂交双链，将所述DNA探针-rRNA杂交双链与RNase H混合，再使用DNase I酶去除DNA和剩余DNA探针，得到rRNA-free的样本。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括唾液、细胞或组织中任意一种；
优选地，所述待测样本经过液氮研磨处理。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述总RNA包括人类和原核生物的rRNA分子和非rRNA分子；
优选地，所述rRNA分子包括5S rRNA、16S rRNA或23S rRNA中的任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述提取总RNA的方法包括trizol法。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA探针浓度为0.1-1μM。
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| CN202311317981.8A CN117363610A (zh) | 2023-10-12 | 2023-10-12 | 一种用于去除总RNA中rRNA的DNA探针、方法及其应用 |
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