CN101914523B - 从人血清/血浆样本中分离rna方法及其pcr验证法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从人血清/血浆中分离RNA的方法，依次包括以下步骤：1)、预处理；2)、在预处理后的样本中加入Trizol试剂于一无RNase的离心管中，混匀，室温静置；3)、氯仿抽提；4)、向步骤3)所得的离心管中加入异丙醇，混匀，室温静置，离心，得白色沉淀；对白色沉淀中进行洗涤、离心后，弃上清；5)、将步骤4)所得的沉淀晾干，加入焦碳酸二乙酯处理水使沉淀溶解，得到纯化后的血清/血浆RNA样本。本发明还同时公开了一种利用上述方法所得的RNA进行RT-荧光定量PCR验证的方法。采用本发明的方法能有效获得高质量且含量高的RNA。

Description

从人血清/血浆样本中分离RNA方法及其PCR验证法

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种从人血清样本中快速、经济、高效地获得RNA并验证的方法，为血清疾病相关microRNA的研究提供便利，具有广泛的科研价值和临床应用前景。

背景技术

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)广泛存在于生物体中，不编码蛋白质，能以RNA的形式在许多生命过程中发挥着重要的作用。随着越来越多ncRNA生物学功能的揭示，检测ncRNA在不同生理和病理状态下表达谱的变化迅速成为研究的热点。作为典型的ncRNA，microRNAs(miRNAs)是一类长度为17～25nt的小RNA分子。它具有高度保守性、时序性和组织特异性，在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。

目前，常用的血液中RNA分离方法有Trizol试剂提取法、酸性酚-氯仿抽提法、过滤柱-磁珠分离法等。所有这些方法因RNA获得困难且含量少、质量不高而使血液中核酸的研究遇到瓶颈。因此，建立一种快速、经济、高效分离血清中RNA且通过荧光定量技术验证的方法，数据可靠，具有广泛的科研价值和临床应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从人血清/血浆中分离RNA的方法，采用该方法能有效获得高质量且含量高的RNA。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种从人血清/血浆中分离RNA的方法，依次包括以下步骤：

1)、预处理：

以血清或血浆作为样本；

①、加热预处理：250μL样本75℃加热5min，42℃温育1h；

②、蛋白酶预处理：250μL样本与10μg蛋白酶K42℃消化1h；

③、SDS预处理：250μL样本与等体积的质量浓度10％的十二烷基硫酸钠溶液(SDS)混合，4℃条件下孵育1h；

④、超声波预处理：250μL样本置于冰上以破碎10s间歇10s的方式，于35KHz的工作频率超声处理5min；

选用以上任意一种预处理方法，得预处理后的样本；

2)、在上述预处理后的样本中加入等体积的Trizol试剂于一无RNase的离心管中，混匀，室温静置5min；

3)、氯仿抽提：向步骤2)所得物中加入1/5体积的氯仿(即氯仿的体积是步骤2)所得物体积的1/5)，振荡15s，静置2min；然后12000×g、4℃离心15min，取上清至另一个无RNase的离心管；

4)、向步骤3)所得的离心管中加入异丙醇，混匀，室温静置10min，异丙醇与离心管内上清的体积比为2∶1；然后12000×g、4℃离心10min，弃上清，得白色沉淀；再向上述白色沉淀中加入1mL体积浓度75％的乙醇溶液对沉淀进行洗涤；最后12000×g、4℃离心15min后，弃上清；

5)、将步骤4)所得的沉淀晾干，加入15～25μL焦碳酸二乙酯处理水使沉淀溶解，得到纯化后的血清/血浆RNA样本。

本发明还同时提供了利用上述所得的RNA进行RT-荧光定量PCR验证的方法，包括以下内容：

以纯化后的血清/血浆RNA样本为反转录模板，以基因miR-21、miR-25、miR-221和miR-222中的任意一个为目的基因，在20μL反应体系中转录得到cDNA，再以此为模板进行实时荧光定量PCR，反应结束后在60-95℃之间做熔解曲线检测反应特异性(即以熔解曲线中峰的单一性表征产物的单一性、特异性)。

作为本发明的利用RNA进行RT-荧光定量PCR验证的方法的改进，该方法包括以下步骤：

1)、cDNA合成

将8μL纯化后的血清/血浆RNA样本和DEPC水至总体积13μL，70℃变性8min后迅速置于冰上3min，再依次加入0.5μL RNase抑制剂(40U/μL)，1μL dNTP混合物(各10mM，RNase-free)，4μL 5×M-MuLV缓冲液，1μL特异茎环引物(2μM)和0.5μLM-MuLV反转录酶(200U/μL)，混匀后离心，在PCR仪中进行cDNA第一链合成，反应参数设置为16℃15min，42℃60min和85℃5min；

特异茎环引物序列选用以下任意一种：

miR-21茎环引物：5-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAACATC-3(SEQ ID NO：1)

miR-25茎环引物：5-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAGACCG-3(SEQ ID NO：2)

miR-221茎环引物：5-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAAACCCA-3(SEQ ID NO：3)

miR-222茎环引物：5-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACACCCAG-3；(SEQ ID NO：4)

2)、将cDNA进行荧光定量PCR

将10μL real-time PCR Master Mix，0.4μL 50×ROX reference，与茎环引物相对应的PCR正向和反向引物(10μM)各0.4μL，2μL模板cDNA和6.8μL去离子水；混匀后进行PCR反应，反应条件为：95℃1min，循环条件为95℃15s和60℃1min，共40个循环；

与茎环引物相对应的PCR正向和反向引物的序列如下：

miR-21 PCR正向引物：5-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG-3(SEQ ID NO：5)

miR-21 PCR反向引物：5-CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT-3(SEQ ID NO：6)

miR-25 PCR正向引物：5-GGCGGCATTGCACTTGTCTCG-3(SEQ ID NO：7)

miR-25 PCR反向引物：5-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3(SEQ ID NO：8)

miR-221 PCR正向引物：5-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT-3(SEQ ID NO：9)

miR-221 PCR反向引物：5-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3(SEQ ID NO：10)

miR-222 PCR正向引物：5-GACGCAGCTACATCTGGCTACTGG-3(SEQ ID NO：11)

miR-222 PCR反向引物：5-AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3(SEQ ID NO：12)；

3)、数据处理

荧光定量PCR定量检测miRNA所得C_T值。

作为本发明的利用RNA进行RT-荧光定量PCR验证的方法的改进：实时荧光定量PCR为茎环引物法或TaqMan探针法。

采用本发明的从人血清/血浆中分离RNA的方法，通过加热、蛋白酶、SDS和超声波等预处理方法，从而从人血清/血浆样本中快速、经济、高效地获得RNA并进行验证。

本发明通过实验方法得出以下结论，证明了采用加热预处理/SDS预处理-Trizol提取血清RNA可有效获得RNA，经实时荧光定量PCR检测，C_T值较不做预处理直接提取RNA至少降低5个循环，大大提高了血清RNA提取效率；采用蛋白酶预处理/超声波预处理-Trizol分离血清RNA，经实时荧光定量PCR检测，C_T值较不做预处理直接提取RNA至少降低1个循环，一定程度上提高了血清RNA分离效率。

本发明的有益效果：(1)本发明优化得到一系列高效的血清RNA提取方法，解决了血清中获得RNA量少、质量差的问题；(2)通过实时荧光定量PCR技术对RNA分离效率检测，该方法具有定量准确的特点，相对于芯片技术或者分子杂交(NorthernBlot)技术，该方法操作简便快速且经济实用；(3)采用加热预处理/SDS预处理-Trizol提取血清RNA法，经实时荧光定量PCR检测，C_T值较不做预处理直接提取RNA降低近5个循环，大大提高了血清RNA提取效率；采用蛋白酶预处理/超声波预处理-Trizol分离血清RNA，经实时荧光定量PCR检测，C_T值较不做预处理直接提取RNA降低1个循环，一定程度上提高了血清RNA分离效率。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是加热预处理对血清RNA提取效率的影响图；

图2是蛋白酶预处理对血清RNA提取效率的影响图；

图3是SDS预处理对血清RNA提取效率的影响图；

图4超声波预处理对血清RNA提取效率的影响图。

具体实施方式

以下实施例中使用的均为离体的临床血清样本。

实验试剂均为常用的分子生物学试剂，主要有：Trizol试剂，氯仿，异丙醇，乙醇等常规生化试剂均购于上海生工公司。M-MuLV反转录酶与RNase抑制剂、反转录用dNTP混合物(各10mM，RNase-free)均购自TaKaRa公司。蛋白酶K、十二烷基硫酸钠(SDS)购自德国Merck公司。荧光定量PCR试剂盒为TOYOBO产品。

实施例1、一种从人血清中分离RNA的方法，依次进行以下步骤：

1)、血清样本的获取：

①、将脱离人体的外周血(清晨空腹所取)3mL注入清洁干燥的离心管，立即置于37℃恒温培养箱斜置2h，再在4℃冰箱中斜置4h；

②、将凝血块以4℃，4000rpm，离心10min，小心吸取上清至1.5mL离心管中；

③、将步骤1)②所分离得到的临床血清样本混合，于-80℃冰箱保存，待用。

2)、加热预处理：

选用步骤1)所得的250μL血清作为样本，先于75℃加热5min，然后于42℃温育1h，得预处理后的血清样本；

3)、在上述预处理后的血清样本中加入等体积的Trizol试剂于一无RNase的1.5mL离心管中，混匀，室温静置5min；

4)、氯仿抽提：向步骤3)所得物中加入1/5体积的氯仿，振荡15s，静置2min；然后12000×g、4℃离心15min，取上清至另一个新的无RNase的离心管；

5)、向步骤4)所得的离心管中加入异丙醇，混匀，室温静置10min，该异丙醇与离心管内上清的体积比为2∶1；然后12000×g、4℃离心10min，弃上清，得白色沉淀；再向上述白色沉淀中加入1mL 75％(体积浓度)乙醇溶液，洗涤沉淀；最后12000×g、4℃离心15min后，弃上清；

6)、将步骤5)所得的沉淀晾干，加入适量的(约20μL)焦碳酸二乙酯处理水(DEPC处理水)使沉淀溶解，得到纯化后的血清RNA样本。

实施例2、一种从人血清中分离RNA的方法，将步骤2)的预处理改成以下内容：蛋白酶预处理：250μL血清样本与10μg蛋白酶K于42℃消化1h，得预处理后的血清样本；其余同实施例1。

实施例3、一种从人血清中分离RNA的方法，将步骤2)的预处理改成以下内容：SDS预处理：250μL血清样本与等体积10％SDS(质量浓度)溶液混合，4℃条件下孵育1h，得预处理后的血清样本；其余同实施例1。

实施例4、一种从人血清中分离RNA的方法，将步骤2)的预处理改成以下内容：超声波预处理：250μL血清样本置于冰上以破碎10s间歇10s的方式，于35KHz的工作频率超声处理5min，得预处理后的血清样本；其余同实施例1。

实验：茎环引物荧光定量PCR法检测并验证实施例1～实施例4所得的血清RNA样本的RNA分离效率：

1、cDNA合成

在无RNase的0.2mL PCR管中依次加入8μL纯化后的血清RNA样本和DEPC水至总体积13μL，70℃变性8min后迅速置于冰上3min，再依次加入0.5μL RNase抑制剂(40U/μL)，1μL dNTP混合物(各10mM，RNase-free)，4μL 5×M-MuLV缓冲液，1μL特异茎环引物(2μM)和0.5μL M-MuLV反转录酶(200U/μL)，混匀后稍离心，在PCR仪中进行cDNA第一链合成，反应参数设置为16℃ 15min，42℃ 60min和85℃ 5min。

特异茎环引物序列如下：

miR-21茎环引物：5-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAACATC-3

miR-25茎环引物：5-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAGACCG-3

miR-221茎环引物：5-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAAACCCA-3

miR-222茎环引物：5-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACACCCAG-3

2、将cDNA进行荧光定量PCR

在新的0.2mL PCR反应管中依次加入10μL real-time PCR Master Mix，0.4μL 50×ROXreference，与茎环引物相对应的PCR正向和反向引物(10μM)各0.4μL，2μL模板cDNA(步骤1所得)和6.8μL去离子水。混匀后进行PCR反应，反应条件为：95℃1min，循环条件为95℃15s和60℃1min，共40个循环。

与茎环引物相对应的PCR正向和反向引物的序列分别如下：

miR-21 PCR正向引物：5-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG-3

miR-21 PCR反向引物：5-CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT-3

miR-25 PCR正向引物：5-GGCGGCATTGCACTTGTCTCG-3

miR-25 PCR反向引物：5-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3

miR-221 PCR正向引物：5-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT-3

miR-221 PCR反向引物：5-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3

miR-222 PCR正向引物：5-GACGCAGCTACATCTGGCTACTGG-3

miR-222 PCR反向引物：5-AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3。

即，miR-21PCR正向引物和miR-21PCR反向引物为miR-21茎环引物所对应的PCR正向和反向引物；其余类同。

3、数据处理

荧光定量PCR定量检测miRNA所得C_T值借助Excel 2003进行统计学分析，计算相对标准误，其值Stdev≤0.5时，认为结果在统计学上可靠。数据见表1，根据表1作图1～4，分析内容包括血清RNA提取时加热、蛋白酶、SDS和超声波等预处理对RNA分离效率的影响。RNA分离效率的高低直接反映在C_T值的降低程度，C_T值降低越多说明用于RT反应的RNA量越多，该预处理对于RNA分离效果越好。具体结果如表1、图1：

1)、加热预处理可有效分离血清RNA：

如图1所示，以合成的基因miR-21、miR-25、miR-221和miR-222为例，图中左侧柱状图反映的是血清样本未经预处理(即实施例1中步骤2)的预处理)Trizol法直接分离血清所得RNA经RT-qPCR检测的C_T值；图中右侧柱状图反映经加热预处理后各基因的情况。可见，miR-21的C_T值较未经预处理组降低近7个循环，miR-25的C_T值较未经预处理组降低近6个循环，miR-221的C_T值较未经预处理组降低近5个循环，miR-222的C_T值较未经预处理组降低5个循环，该预处理方法大大提高了血清RNA提取效率。

2)、蛋白酶预处理可有效分离血清RNA：

如图2所示，以合成的基因miR-21、miR-25、miR-221和miR-222为例，图中左侧柱状图反映的是血清样本未经预处理(即实施例2中步骤2的预处理)Trizol法直接分离血清所得RNA经RT-qPCR检测的C_T值；图中右侧柱状图反映经蛋白酶预处理后各基因的情况。可见，经加蛋白酶处理后所得的RNA经RT-qPCR检测，miR-21的C_T值较未经预处理组降低近2个循环，miR-25的C_T值较未经预处理组降低近2个循环，miR-221的C_T值较未经预处理组降低近4个循环，miR-222的C_T值较未经预处理组降低3个循环，提高了血清RNA分离效率。

3)、SDS预处理可有效分离血清RNA：

如图3所示，以合成的基因miR-21、miR-25、miR-221和miR-222为例，图中左侧柱状图反映的是血清样本未经预处理(即实施例3中步骤2的预处理)Trizol法直接分离血清所得RNA经RT-qPCR检测的C_T值；图中右侧柱状图反映经SDS预处理后各基因的情况。可见，经SDS预处理后所得的RNA经RT-qPCR检测，miR-21的C_T值较未经预处理组降低近8个循环，miR-25的C_T值较未经预处理组降低6个循环，miR-221的C_T值较未经预处理组降低近8个循环，miR-222的C_T值较未经预处理组降低近7个循环，该预处理方法大大提高了血清RNA提取效率。

4)、超声波预处理可有效分离血清RNA：

如图4所示，以合成的基因miR-21、miR-25、miR-221和miR-222为例，图中左侧柱状图反映的是血清样本未经预处理(即实施例4中步骤2的预处理)Trizol法直接分离血清所得RNA经RT-qPCR检测的C_T值；图中右侧柱状图反映经超声波预处理后各基因的情况。可见，经超声波预处理后所得的RNA经RT-qPCR检测，miR-21的C_T值较未经预处理组降低近1个循环，miR-25的C_T值较未经预处理组降低1个循环，miR-221的C_T值较未经预处理组降低2个循环，miR-222的C_T值较未经预处理组降低2个循环，提高了血清RNA提取效率。

表1荧光定量PCR法对血清RNA分离效率分析所得平均C_T值及其标准误(STDEV)

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种对RNA进行RT-荧光定量PCR验证的方法，其特征是：

以纯化后的血清/血浆RNA样本为反转录模板，以基因miR-221为目的基因，在20μL反应体系中转录得到cDNA，再以此为模板进行实时荧光定量PCR，反应结束后在60-95℃之间做熔解曲线检测反应特异性；包括以下步骤：

1)、cDNA合成

将8μL纯化后的血清/血浆RNA样本和DEPC水至总体积13μL，70℃变性8min后迅速置于冰上3min，再依次加入0.5μL RNase抑制剂，1μL dNTP混合物，4μL 5×M-MuLV缓冲液，1μL特异茎环引物和0.5μL M-MuLV反转录酶，混匀后离心，在PCR仪中进行cDNA第一链合成，反应参数设置为16℃ 15min，42℃ 60min和85℃ 5min；

特异茎环引物序列为：

miR-221茎环引物：5-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAAACCCA-3；

2)、将cDNA进行荧光定量PCR

将10μL real-time PCR Master Mix，0.4μL 50×ROX reference，与茎环引物相对应的PCR正向和反向引物各0.4μL，2μL模板cDNA和6.8μL去离子水；混匀后进行PCR反应，反应条件为：95℃ 1min，循环条件为95℃15s和60℃ 1min，共40个循环；

与茎环引物相对应的PCR正向和反向引物的序列如下：

miR-221 PCR正向引物：5-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT-3

miR-221 PCR反向引物：5-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3；

3)、数据处理

荧光定量PCR定量检测miRNA所得C_T值。

2.根据权利要求1所述的对RNA进行RT-荧光定量PCR验证的方法，其特征是：实时荧光定量PCR为茎环引物法或TaqMan探针法。

Images