CN106701989A - 一种海参的dna条形码分子鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海参(象牙参Holothuria fuscopunctata)的DNA条形码分子鉴定方法和其COI序列，使用该方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出CO I基因，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后进行测序，将测序结果通过手工校对、序列拼接，并与公开序列进行比对，如果与基因序列SEQ ID NO.1的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为象牙参来源。本发明采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了象牙参品种，增强了准确性和可靠性，确保其作为药材入药的安全性。

Description

一种海参的DNA条形码分子鉴定方法

技术领域

本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种象牙参DNA条形码分子鉴定方法。

背景技术

象牙参(拉丁名：Holothuria fuscopunctata)属棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothrioider)通常长6～30cm，宽0.8～10cm，全体表面灰白或黄白色，皱缩或具横纹，有的横向皱缩较深成槽沟状，沟处呈黄色或棕褐色。背中部色泽较深，两边较浅，腹面则逐渐变为白色；沿着腹面中央线常有一条明显的纵沟，腹面具有众多灰黑色点状疣足。其骨片多为扣状体，另有少量桌状体、穿孔板和杆状体等。象牙参是传统的海样食物和药物资源，具有抗肿瘤、降血脂、促进造血功能、提高免疫力、抗凝血等多种生物功效。因此，对象牙参的鉴定是入药的基础。在我国的海参市场，多以干海参、水发海参、精深加工海参等形式流通；市场较为混乱，鉴别十分困难。目前，传统的形态学鉴定方法非常容易受到物种本身在生长过程中环境、遗传等诸多因素的影响；且在加工炮制过程中形态被严重破坏，因此，运用传统的形态学方法来鉴定海参品种变得非常困难，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

DNA条形码技术(DNA Barcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。其中线粒体基因细胞色素C氧化酶1号基因(COI)由于具有较高的进化速率已成为区分物种和研究物种进化关系的一种理想基因。因此，利用COI基因对海参进行物种鉴定是一种较好的方法。研究表明DNA条形码可以广泛应用于生物的分类和鉴定，是一种简便、高效、准确的物种鉴定技术，不仅可弥补传统鉴定方法的缺陷，还因其更客观、准确，突破对以往经验的依赖，能够鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种等。运用DNA条形码技术，可以很好的对海参的品种进行快速、有效的鉴定。

本发明提供一种关于象牙参DNA条形码分子鉴定的方法，有利于实现象牙参的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。

发明内容

本发明弥补目前以形态学鉴定海参方法存在的缺陷，提高象牙参鉴定结果的准确度，是一种易于操作、灵敏度高的鉴定方法。本发明的技术方案如下：

首先从采集的各种海参提取总DNA，利用一对引物进行PCR扩增一段COI基因片段，将扩增产物测序，然后在进行序列分析比对，建立各种海参的序列标准数据库，在比较数据库DNA的基础上，通过分析在特定条件下的聚合酶链式反应的产物结果，从而达到快速，准确鉴定象牙参的目的。对需要鉴定的海参样品，提取其总DNA，在给定的条件下，用设计的特异引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物结果，然后测序，根据序列比对可以鉴定出象牙参。本发明设计的用于鉴别象牙参的分子鉴定方法，采用如下步骤：

1.提取海参总DNA按海洋动物DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到50ng/μl。

2.扩增DNA片段，进行聚合酶链式反应，即用特异的引物进行扩增，引物对序列为

COIef1：5’-TATTGATTGGAGGGTTTG-3’；

COIer1：5’-TCACAGTAGGAATGGACG-3’

扩增程序为94℃预变性2分钟94℃预变性30秒，45℃退火35秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟。

3.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用DNA marker检测PCR片段大小。

4.鉴定结果的判断：若出现明显清晰的678bp大小的条带，且无杂带，则可送生物公司测序。

5.将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为象牙参。

其中，所述的海参DNA条形码分子鉴定方法采用的是海洋动物DNA提取试剂盒。

所述引物，正向引物为COIef1：5’-TATTGATTGGAGGGTTTG-3’；

反向引物为COIer1：5’-TCACAGTAGGAATGGACG-3’

所使用的DNA聚合酶为TAKARA Taq酶。

所述的电泳为1％-2％的琼脂糖凝胶电泳。

所述的条带大小需要用DNA maker检测。

所述的DNA序列拼接软件包括CodonCode Aligner、Sequencher、Genious、DNAstar等软件。

与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现象牙参的分子鉴定。

附图说明

图1琼脂糖凝胶电泳图，是用COI引物扩增的电泳检测图谱，其中泳道M为DNAMarker，泳道N1为阴性对照，泳道M1～M2为依次为样品M1，M2。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明：

实施例1：

1、海参标本的采集：M1-象牙参干品；M2-随机市场收集海参样品

2、试验样品的前处理：第一步，先将海参酒精保存样品中的酒精置换和干海参样品浸发，使用溶液均为PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/LKH2PO4，pH 7.2)第二步，取50-80mg经上步处理的样品，在800-1000μl高盐缓冲液(200mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，0.2％β-巯基乙醇，pH 8.0)中剪碎样品，10000-12000g/min离心1-2min，弃上清液；重复操作2次。蛋白酶K 65℃温浴1小时，至组织完全溶解。加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，15,000×g室温离心10分钟，小心吸取上清至新的1.5mL EP管中。

3、DNA模板制备：采用天根生物公司的海洋动物DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到50ng/μl。

4、引物合成：本实施例所用引物如下：

正向引物5′-TATTGATTGGAGGGTTTG-3′；

反向引物5′-TCACAGTAGGAATGGACG-3′

5、PCR扩增本实施例的PCR反应体系如下

PCR反应体系为50μl：

ddH2O 37.6uL，10×PCR Buffer 5uL，dNTP 4uL，Taq酶0.4uL，正向引物/反向引物(10uM)各1uL，DNA模板1uL

扩增程序：为94℃预变性2分钟94℃预变性30秒，48℃退火35秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟。

6、琼脂糖电泳验证PCR结果琼脂糖电泳显示M1，M2，M3样品扩增良好，条带清晰无杂质，可直接送测序公司进行测序。

7、测序结果序列拼接将测序结果用CodonCode Aligner生物软件，将序列导入，将引物剪切后将序列组装，然后跟SEQ ID NO.1进行比对，M1与跟SEQ ID NO.1同源率100％，为象牙参。M2序列与SEQ ID NO.1差异显著，与NCBI网站进行(网址https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)为马刺参。

本发明所阐述的实施例并不是对本发明的限定，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，任何本领域技术人员根据常规手段可以预见或者微调的变化和改进，均落入本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种海参的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于鉴定的参为象牙参Holothuriafuscopunctata。

2.根据权利要求1所述的DNA条形码分子鉴定方法，其步骤主要包括：

(1)从待测的海参组织中分离提取总DNA；

(2)以该DNA为模板用一对引物，通过聚合酶链式反应扩增出海参COI基因；

(3)然后取适量步骤(2)的聚合酶链式反应扩增出的COI基因产物用琼脂糖电泳分离鉴定扩增产物大小，然后进行测序；

(4)根据测序结果，进行分析比对，如果与基因序列SEQ ID NO.1的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为象牙参来源。

3.根据权利要求2所述的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于引物的DNA的序列为：

COIef1：5’-TATTGATTGGAGGGTTTG-3’；

COIer1：5’-TCACAGTAGGAATGGACG-3’。

4.根据权利要求2所述的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于所述聚合酶链式反应的扩增条件为94℃预变性2分钟94℃预变性30秒，45℃退火35秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟。

5.根据权利要求2所述的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于扩增产物的扩增片段为678bp，用1％-2％琼脂糖电泳检测。

6.根据权利要求2所述的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于所述海参的DNA条形码标准检测基因为CO I基因，具有如下所述的基因序列SEQ ID NO.1：

TATTGATTGGAGGGTTTGGCAAATGGCTCATTCCCCTGATGATAGGAGCCCCAGACATGGCCTTCCCCCGGATGAAAAAAATGAGTTTCTGACTAGTTCCCCCTTCATTCATTCTTCTCCTAGCCTCAGCAGGCGTAGAAAGAGGAGCAGGCACAGGATGAACCATATACCCACCATTATCCAGAAACATTGCCCATGCTGGAGGGTCTGTTGACTTAGCTATTTTCTCTCTACACTTAGCCGGAGCCTCATCCATTCTAGCTTCTATAAACTTTATTACCACAATTATAAACATGCGGGCCCCAGGAATAACATTCGACCGTCTTCCTTTATTCGTATGATCAGTTTTCATCACAGCCTTCCTTCTCCTACTTAGGCTACCAGTTCTAGCAGGAGCCATAACAATGCTGCTAACAGACCGGAACATAAAAACAACATTTTTCGACCCCGCAGGAGGAGGAGACCCAATTCTATTCCAACATCTATTCTGATTCTTTGGCCATCCAGAAGTTTACATCCTAATCCTCCCAGGATTCGGAATGATATCACATGTAATAGCTCACTACAGAGGCAAGCAAGAGCCCTTTGGATATCTCGGAATGGTTTACGCAATGGTAGCCATAGGAATCCTAGGATTCCTAGTCTGAGCCCATCATATGTTCACAGTAGGAATGGACG。

7.一种象牙参DNA条形码标准检测序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：1所示：

TATTGATTGGAGGGTTTGGCAAATGGCTCATTCCCCTGATGATAGGAGCCCCAGACATGGCCTTCCCCCGGATGAAAAAAATGAGTTTCTGACTAGTTCCCCCTTCATTCATTCTTCTCCTAGCCTCAGCAGGCGTAGAAAGAGGAGCAGGCACAGGATGAACCATATACCCACCATTATCCAGAAACATTGCCCATGCTGGAGGGTCTGTTGACTTAGCTATTTTCTCTCTACACTTAGCCGGAGCCTCATCCATTCTAGCTTCTATAAACTTTATTACCACAATTATAAACATGCGGGCCCCAGGAATAACATTCGACCGTCTTCCTTTATTCGTATGATCAGTTTTCATCACAGCCTTCCTTCTCCTACTTAGGCTACCAGTTCTAGCAGGAGCCATAACAATGCTGCTAACAGACCGGAACATAAAAACAACATTTTTCGACCCCGCAGGAGGAGGAGACCCAATTCTATTCCAACATCTATTCTGATTCTTTGGCCATCCAGAAGTTTACATCCTAATCCTCCCAGGATTCGGAATGATATCACATGTAATAGCTCACTACAGAGGCAAGCAAGAGCCCTTTGGATATCTCGGAATGGTTTACGCAATGGTAGCCATAGGAATCCTAGGATTCCTAGTCTGAGCCCATCATATGTTCACAGTAGGAATGGACG。

8.根据权利要求7所述的象牙参DNA条形码标准检测序列，其特征在于，其为COI基因。

9.如权利要求7或8所述的象牙参DNA条形码标准检测序列在鉴定象牙参中的应用。