CN109371154A - 鉴别长梗黄精和多花黄精的特征序列、引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鉴别长梗黄精(Polygonatum filipe)和多花黄精(Polygonatum cyrtonema)的特征序列、特异性标记引物，以及快速鉴定的方法。所述特征序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物序列如下：上游引物891F2：5′‑TTCGGTTGTAGTGGTGCTTG‑3′，下游引物891R2：5′‑AGGCTTGTACAATAAATCTAGAAAC‑3′。本发明特征序列和分子特异性标记引物可对长梗黄精和多花黄精进行快速的鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别长梗黄精和多花黄精所不能替代的分子手段。

Description

鉴别长梗黄精和多花黄精的特征序列、引物及方法

(一)技术领域

本发明涉及鉴别长梗黄精(Polygonatum filipe)和多花黄精(Polygonatumcyrtonema)的特征序列、特异性标记引物，以及一种利用该引物对两者进行准确辨别的方法。

(二)背景技术

黄精，始载于《名医别录》，性味甘，平，归脾、肺、肾经。在临床上对治疗体倦乏力、脾胃气虚、肾虚亏损、肺虚燥咳、内热消渴、精血不足、须发早白、口干食少等有一定功效，有“血气双补之王”的美称，同时也可用于治疗肺结核、糖尿病、慢性肝炎等疾病，具有抗肿瘤、抗辐射等作用。黄精地下块茎富含多糖、皂苷、氨基酸、生物碱、微量元素等，具有很高的药用价值和食用价值。此外，黄精还可作为观赏植物开发利用。由此可见，黄精具有巨大的开发潜力和广阔的市场前景。

长梗黄精(P.filipe)和多花黄精(P.cyrtonema)均属于百合科黄精属的多年生草本植物，在形态上具有相似性，通常人们依据黄精叶片的长宽比，叶背有无短毛，花梗长度以及花丝上端是否膨大等形态学特征作为判别依据。由于生长环境、气候条件、土壤养分及生长年限等因素的影响，即使同一种黄精生长在不同地区其形态特征也会存在一定差异，因此形态鉴别往往缺乏准确性。此外，黄精块茎作为其药食同源的主要材料，均为结节状或连珠状膨大，其显微特征也极为相似，更不易直接被鉴别。与此同时，多花黄精被纳入《中国药典》，作为黄精药用的其中一种基源植物，而长梗黄精则未被列入其中，市场上易发生将长梗黄精混淆为多花黄精的现象，给黄精的市场秩序和药用安全性等带来了一定的隐患。因此，为区别两种不同来源的黄精药材，有必要对其鉴别方法进行研究。

目前，RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)和ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat，简单序列重复区间扩增多态性)分子标记技术已被用于黄精属植物的亲缘关系研究、种质资源鉴别和遗传多样性分析。这些分子标记技术均采用通用型引物，需要大量的引物筛选，且PCR扩增图谱的条带多，重复性较差，特异性不高。因此，只有发掘出可靠稳定的种特异性DNA指纹才能更有效地用于不同黄精种间的准确、快速鉴定。

(三)发明内容

本发明目的提供可鉴别长梗黄精和多花黄精的特征序列及分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对这两种不同的黄精进行快速辨别的方法。

本发明采用的技术方案是：

鉴别长梗黄精(Polygonatum filipe)和多花黄精(Polygonatum cyrtonema)的特征序列，其序列如下：

5′-TTCGGTTGTAGTGGTGCTTGTTTGAGTGTGTTGGTTGCCGATGGTGGTACTGGGTTGGTGCTTATATTGTGGAGGTCTTTGTGTTTTGGTGGGGTTATGTGTGTTGGGAACATGGTTGGTGTTACAACGACTCTTGGATTTTGATGATAACAAAGTATTGTATATCTAACATATTCTTGCAGATTTATGTTACATATCTCATTGGCAACAATCAAGATATCAAGGATATATCAAAGACAAGGGTTTCAAGATTAATAGATGAAGTTACACAAGTCACTCCAAGCTTCAAGAAGAATTTATGCTTTGTAAAGTGATGTAATTTTATCTTTG TTTCTAGATT TATTGTACAA GCCT-3′。

鉴别长梗黄精和多花黄精的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：

上游引物891F2：5′-TTCGGTTGTAGTGGTGCTTG-3′

下游引物891R2：5′-AGGCTTGTACAATAAATCTAGAAAC-3′

该引物对是采用ISSR分子标记技术，经过PCR扩增，大量筛选获得长梗黄精的特异性DNA片段(SEQ ID No.1)之后，后将该片段克隆测序，并以DNA序列为基础设计其特异性引物，以该引物对长梗黄精和多花黄精进行PCR扩增，仅长梗黄精可稳定获得354bp大小的特异性片段，而多花黄精不能获得该特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于长梗黄精和多花黄精的鉴定，即待测样品仅限于长梗黄精和多花黄精，本领域普通技术人员可根据黄精植株或块茎形态特征先进行初步的判断，再将判断可能为长梗黄精或多花黄精的样本用本发明方法进行鉴别。

本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对长梗黄精和多花黄精进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测黄精样本的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现354bp的DNA条带，则待测黄精样品为长梗黄精，若电泳结果未出现354bp的DNA条带，则待测黄精样品为多花黄精；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物891F2：5′-TTCGGTTGTAGTGGTGCTTG-3′

下游引物891R2：5′-AGGCTTGTACAATAAATCTAGAAAC-3′

所述PCR扩增条件如下：94℃预变性6min后；94℃变性40s，53.5℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

具体的，所述方法如下：

(1)取待测黄精样品块茎洗净，切片，硅胶干燥(≥7d)，取适量加液氮磨碎，提取待测黄精样本块茎的基因组DNA；

(2)对步骤(1)获得的样品基因组DNA进行核酸纯度及浓度的检测，OD₂₆₀/OD₂₈₀>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增，并稀释至基因组DNA浓度为20ng/uL左右用于后续检测；DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

(3)以步骤(2)稀释的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每20μL组成如下：

2×Power Taq PCR Master Mix 10μL

10μM上、下游引物 各1.5μL

20ng/μL模板DNA 3μL

ddH₂O补足至20μL；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；94℃变性40s，53.5℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

(4)取步骤(3)扩增产物4μL，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中电泳20min，后于自动凝胶图像分析仪上照相；若电泳结果出现354bp的DNA条带，则待测样品为长梗黄精；若电泳结果未出现354bp的DNA条带，则待测样品为多花黄精。

本发明有益效果主要体现在：本发明特征序列和分子特异性标记引物可用于长梗黄精和多花黄精块茎的鉴别，方法简单、快捷、准确。虽然长梗黄精和多花黄精在植物叶片的形态特征上存在一定差异，但是块茎的形态差异并不显著，而黄精又以块茎为重要的药食材料，因而易将长梗黄精块茎错误认定为多花黄精的情况时有发生。采用本发明方法，可对长梗黄精和多花黄精的块茎进行快速的分子鉴定，方法简单、快捷、准确，是形态特征辨别的有效辅助。

(四)附图说明

图1为对长梗黄精(P.filipe)和多花黄精(P.cyrtonema)进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；编号1～10为长梗黄精，扩增出了片段大小为354bp的特异DNA条带；编号11～20为多花黄精，未见有354bp大小的特异DNA条带产生。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(1)两种黄精的基因组DNA的提取：

取待测黄精样品块茎洗净，切片，硅胶干燥(≥7d)，取0.03g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用新型快速植物基因组DNA试剂盒(DP3112，BioTeke，北京百泰克生物技术有限公司)，依据说明书操作来提取获得标本的基因组DNA。

(2)对所获得的基因组DNA通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(Nanodrop Technologies，USA)来检测完整性、纯度及浓度。OD₂₆₀/OD₂₈₀>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增，并根据核酸浓度值进行适量的稀释，使得基因组DNA浓度约为20ng/μL。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

(3)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：

上游引物891F2：5′-TTCGGTTGTAGTGGTGCTTG-3′

下游引物891R2：5′-AGGCTTGTACAATAAATCTAGAAAC-3′

引物由上海生物工程技术有限公司合成。

(4)以步骤(2)经稀释为20ng/μL的基因组DNA为模板，以891F2/R2作为扩增引物对，进行PCR扩增，目标片段大小为354bp。

所述PCR扩增反应体系组成如下(总体积20μL)：

PCR反应条件如下：

94℃预变性5min后；94℃变性40s，53.5℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

(5)取步骤(4)扩增产物4μL，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中电泳20min(200mA，150V)，后于Bio-Rad凝胶成像系统上照相。若电泳结果出现354bp的DNA条带，则待测样品为长梗黄精；若电泳结果未出现354bp的DNA条带，则待测样品为多花黄精。

上述引物由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，扩增反应在杭州博日公司的LifeECO基因扩增仪上进行。

按照上述方法，对来自浙江省衢州市和丽水市地区的各10份长梗黄精和多花黄精样品进行PCR扩增及电泳检测，样品明细如表1所示，结果如图1所示。其中1～10为长梗黄精样品，其PCR扩增产物可见354bp的特异性条带；11～20为多花黄精样品，其PCR扩增产物未见354bp的条带。

表1：样品明细表

由图可见，所有长梗黄精(P.filipe)样本中扩增出了一条清晰明亮、稳定的分子量约为354bp的特异DNA条带，而多花黄精(P.cyrtonema)样本，未见有354bp大小的特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异性标记引物用于多花黄精(P.cyrtonema)的鉴定，其稳定性、特异性非常高。

序列表

<110> 浙江省林业科学研究院

浙江九龙山国家级自然保护区管理局

<120> 鉴别长梗黄精和多花黄精的特征序列、引物及方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 354

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

ttcggttgta gtggtgcttg tttgagtgtg ttggttgccg atggtggtac tgggttggtg 60

cttatattgt ggaggtcttt gtgttttggt ggggttatgt gtgttgggaa catggttggt 120

gttacaacga ctcttggatt ttgatgataa caaagtattg tatatctaac atattcttgc 180

agatttatgt tacatatctc attggcaaca atcaagatat caaggatata tcaaagacaa 240

gggtttcaag attaatagat gaagttacac aagtcactcc aagcttcaag aagaatttat 300

gctttgtaaa gtgatgtaat tttatctttg tttctagatt tattgtacaa gcct 354

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

ttcggttgta gtggtgcttg 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

aggcttgtac aataaatcta gaaac 25

Claims (5)

1.鉴别长梗黄精(Polygonatum filipe)和多花黄精(Polygonatum cyrtonema)的特征序列，其序列如下：

5′-TTCGGTTGTAGTGGTGCTTGTTTGAGTGTGTTGGTTGCCGATGGTGGTACTGGGTTGGTGCTTATATTGTGGAGGTCTTTGTGTTTTGGTGGGGTTATGTGTGTTGGGAACATGGTTGGTGTTACAACGACTCTTGGATTTTGATGATAACAAAGTATTGTATATCTAACATATTCTTGCAGATTTATGTTACATATCTCATTGGCAACAATCAAGATATCAAGGATATATCAAAGACAAGGGTTTCAAGATTAATAGATGAAGTTACACAAGTCACTCCAAGCTTCAAGAAGAATTTATGCTTTGTAAAGTGATGTAATTTTATCTTTG TTTCTAGATT TATTGTACAA GCCT-3′。

2.鉴别长梗黄精和多花黄精的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：

上游引物891F2：5′-TTCGGTTGTAGTGGTGCTTG-3′，

下游引物891R2：5′-AGGCTTGTACAATAAATCTAGAAAC-3′。

3.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对长梗黄精和多花黄精进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测黄精样本的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现354bp的DNA条带，则待测黄精样品为长梗黄精，若电泳结果未出现354bp的DNA条带，则待测黄精样品为多花黄精；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物891F2：5′-TTCGGTTGTAGTGGTGCTTG-3′，

下游引物891R2：5′-AGGCTTGTACAATAAATCTAGAAAC-3′。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：94℃预变性6min后；94℃变性40s，53.5℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)取待测黄精样品块茎洗净，切片，硅胶干燥，取适量加液氮磨碎，提取待测黄精样本块茎的基因组DNA；

(2)对步骤(1)获得的样品基因组DNA进行核酸纯度及浓度的检测，OD₂₆₀/OD₂₈₀>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增，并稀释基因组DNA浓度为20ng/uL用于后续检测；

(3)以步骤(2)稀释的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每20μL组成如下：

2×Power Taq PCR Master Mix 10μL

10μM上、下游引物 各1.5μL

20ng/μL模板DNA 3μL

ddH₂O补足至20μL；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；94℃变性40s，53.5℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

(4)取步骤(3)扩增产物4μL，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中电泳20min，后于自动凝胶图像分析仪上照相；若电泳结果出现354bp的DNA条带，则待测样品为长梗黄精；若电泳结果未出现354bp的DNA条带，则待测样品为多花黄精。