CN107964548A - 一种水稻OsFLRs基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种水稻OsFLRs基因，由OsFLR1和OsFLR2基因组成。本发明还公开了水稻OsFLRs基因在调控稻米粒形和稻米营养品质上的应用。本发明通过分析了水稻中的FER家族基因，获得了与拟南芥蛋白FER同源性最高的两个基因OsFLR1、OsFLR2，并获得其编码的蛋白质；并构建获得了35S:: FLR1，35S::FLR2的过表达载体，通过农杆菌介导转化，获得了OsFLR1、OsFLR2过表达的水稻株系。通过对野生型、flr1突变体、flr 2突变体及OsFLR1过表达株系、OsFLR2过表达株系的稻米粒形及营养品质的测定，发现OsFLRs基因对稻米的粒形有调控作用，并对稻米的营养品质有正调控作用。

Description

一种水稻OsFLRs基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种水稻种植调控基因，尤其是涉及一种水稻OsFLRs基因及其应用，尤其是在水稻稻米粒形、营养品质上的应用。
背景技术
水稻稻米粒形及营养品质是评价优质水稻的重要指标，粒形主要受到稻米品种遗传基因的调控，它是商品稻米定价、分类的主要依据，且对稻米最终的品质也有重要的影响。
稻米的营养品质对稻米的品质起决定性的作用，稻米中的主要成分淀粉分为直链淀粉和支链淀粉，二者的比例一直被认为是影响蒸煮品质和食味品质的主要因素。有研究发现，直链淀粉高的米饭，米饭硬、饭粒干燥而蓬松、米饭黏度较低、色泽较暗。而反之，米饭软、黏度大、饭粒光泽度也较好。而直链淀粉和支链淀粉的含量也能通过基因水平调节，因此，通过基因改良水稻品质是一种策略。
CrRLK1是一种植物特有的类受体蛋白激酶，其最早发现于长春花属植物，而FERONIA（FER）是其中的一类家族成员，目前在拟南芥中的研究发现，其在双子叶植物中作为RALF（快速碱化因子）的受体，能够调控种子的大小，此外其作为激素的交叉会话节点，起到对促进细胞伸长的油菜素类酯与生长素起促进作用，而对抑制细胞伸长的乙烯和脱落酸起到抑制作用。
目前，并没有关于水稻基因FLRs在水稻调控稻米粒形和营养品质应用的报道。而在单子叶植物水稻中CrRLK1-L家族有20个成员，其中三个成员（Os03g03290，Os05925430，Os04g49690）激酶域缺失。因此，采用生物技术手段改变水稻中CrRLK1-L家族中基因的表达水平，进而改善水稻稻米的粒形和营养品质，具有显著的意义和较广的应用空间。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：寻找与水稻稻米粒形、营养品质调控相关的功能基因，进而提供一种可改善稻米粒形和营养品质的水稻OsFLRs基因，以及该基因编码的水稻OsFLRs功能蛋白，以及该水稻OsFLRs基因在稻米粒形、营养品质上的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明之一种水稻OsFLRs基因，由核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的OsFLR1和OsFLR2基因组成，OsFLR1和OsFLR2基因分别是水稻CrRLK1-L家族中的Os03g21540和Os01g56330。
本发明之一种水稻OsFLRs功能蛋白，由OsFLR1和OsFLR2基因编码获得，其氨基酸酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
本发明之一种水稻OsFLRs基因的过表达载体，所示载体含有35S强启动子。
本发明之一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用可能性分析方法，通过三引物法对flr1及flr2突变体进行鉴定，并获得flr1和flr2纯合的突变体，并对其mRNA水平进行鉴定。
进一步，flr1、flr2 T-DNA鉴定引物名称如下：
FLR1-LP：5’-gcaggtggatgctggttatc-3’
FLR1-RP：5’-atcgaggaggatgtttgtcg-3’
FLR2-LP：5’-gccatgttcttcaattcctgtcc-3’
FLR2-RP：5’-ggagcaagagcacgaatctgg-3’
RB1：5’-ttggggtttctacaggacgtaac-3’
本发明之一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，包括水稻OsFLRs基因在调控稻米粒形和稻米营养品质的应用。
本发明之一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，其具体操作包括：水稻OsFLRs基因（包括OsFLR1和OsFLR2基因）的克隆，构建水稻OsFLRs基因的过表达载体并转化入农杆菌菌株，再将农杆菌侵染水稻愈伤组织后筛选获得35S::FLR1和35S::FLR2过表达株系。
水稻OsFLRs基因（包括OsFLR1和OsFLR2基因）的克隆
1）FLR1及FLR2引物设计：从NCBI中获得水稻FLR1和FLR2基因的编码序列，分别以FLR1及FLR2的全长编码序列为模板进行引物设计，在FLR1、FLR2的上游引物F1的5’端加入KpnI限制性内切酶酶切位点和保护碱基；在FLR1，FLR2的下游引物R1的5’端加入XbalI限制性内切酶酶切位点和保护碱基。
FLR1-F：5'- GGGGTACCATGGTGAGTTCTAGGTTTGTGGCCG - 3'；
FLR1-R：5'- GCTCTAGACCGTCCCTTGGGGTTCATG- 3'；
FLR2-F：5'-GGGGTACCATGGGAAGCTCCAGATTCGTGC- 3'；
FLR2-R: 5'- GCTCTAGACCGTCCCTTGGGGTTCATG-3'；
其中，GGTACC为KpnI酶切位点，TCTAGA为XbalI酶切位点；
2）PCR克隆：PCR 反应扩增OsFLR1和OsFLR2基因片段，PCR反应体系（20μL），PCR反应条件：98℃预变性5min；98℃变性15s，60℃退火15s，68℃延伸140s，32个循环后，72℃继续延伸10min，在72℃延伸10min前加入普通Taq酶，完成后在4℃保存。
3） PCR产物鉴定：将OsFLR1、OsFLR2的PCR产物胶回收，与pMD18-T载体连接，转化感受态大肠杆菌Top10，涂Amp抗生素的平板，采用菌落PCR进行初步筛选后，将阳性克隆送往博尚测序公司进行测序及BLAST分析，
构建水稻OsFLRs基因的过表达载体并转化农杆菌菌株：
4）重组35S::FLR1-pCAMBIA1300、35S::FLR2-pCAMBIA1300载体的构建：将阳性质粒pMD18-T-FLR1和pMD18-T-FLR2经XbalI和KpnI双酶切后回收，与同样经XbalI和KpnI双酶切回收后的pCAMBIA1300混合，加入T4连接酶及连接缓冲液buffer，连接过夜后，转化感受态大肠杆菌Top10，涂LB平板（含有50mg/L Kan），37℃过夜培养后，即可以进行获得单菌落，进行菌落PCR鉴定可以获得35S::FLR1-pCAMBIA1300 和35S::FLR2-pCAMBIA1300。
5) 获得35S::FLR1-pCAMBIA1300及35S::FLR2-pCAMBIA1300的农杆菌菌株：将35S::FLR1-pCAMBIA1300及35S::FLR2-pCAMBIA1300的阳性克隆质粒转化入Ag10感受态细胞，涂布LB平板(含有50mg/L Kan、50mg/L Rif)培养，28℃倒置培养2d，形成单菌落，并利用菌落PCR筛选出携带目的基因的农杆菌。
侵染水稻获得35S::FLR1和35S::FLR2过表达株系及其应用结果检测
6) 35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300转基因植株的获得：将含有35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300重组载体的农杆菌转入水稻愈伤组织，通过筛选、分化、生根后得到阳性的过表达植株，并通过PCR鉴定植株的真实性。
7)过表达植物稻米粒形及营养品质的测定：通过收获过表达植株的种子，将抗生素进一步筛选萌发后得到纯合株系，进一步收获后得到35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S:: FLR2-pCAMBIA1300过表达稻米种子，再参考国家标准测定过表达株系与相应野生型对照的稻米粒形、总淀粉含量、直链淀粉含量等营养指标。
本发明一种水稻OsFLRs基因的有益效果：通过分析了水稻中的FER家族基因，获得了水稻中与拟南芥AtFER基因高度同源的OsFLRs基因，包括碱基长度为2679bp的OsFLR1基因和2691bp的OsFLR2基因，与拟南芥中的AtFER基因的同源性分别高达63.08%和63.25%；并获得了OsFLRs基因编码的功能蛋白，即OsFLR1基因、OsFLR2基因分别编码892个氨基酸和896个氨基酸，为人类对水稻品种的研究提供了新方向。
本发明之一种水稻OsFLRs基因的应用，对基因对水稻稻米粒形和营养品质的调控进行了鉴定分析，同时，提供了一种应用于调节水稻稻米粒形和营养品质的方法，即采用生物学技术手段调控水稻OsFLRs基因的表达水平，获得水稻OsFLRs基因过表达载体并转化入农杆菌菌株，再将农杆菌侵染水稻愈伤组织后筛选获得FLR1和FLR2过表达株系；进而调节稻米的长宽比，以及稻米的总淀粉含量和直链淀粉含量，改善稻米的品质，为水稻稻米品质的改变提供一种新的生物学处理方法。
附图说明
图1——为本发明发现的水稻OsFLRs家族成员与拟南芥AtFER基因的同源性比对图；
图2——为本发明获得的flr1和flr2突变体鉴定结果图；
图3——为本发明获得的flr1和flr2突变体对应的稻米粒形改变的比较分析图；
图4——为本发明获得35S::FLR1和35S::FLR2过表达株系对稻米粒形的影响分析图；
图5——为本发明获得35S::FLR1和35S::FLR2过表达株系对稻米营养品质的影响分析图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
水稻OsFLRs基因在水稻中的应用可能性分析
本发明之一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，通过三引物法对flr1及flr2突变体进行鉴定，并获得flr1和flr2纯合的突变体，并对其mRNA水平进行鉴定。
flr1、flr2 T-DNA鉴定引物设计：引物名称如下：
FLR1-LP：5’-gcaggtggatgctggttatc-3’
FLR1-RP：5’-atcgaggaggatgtttgtcg-3’
FLR2-LP：5’-gccatgttcttcaattcctgtcc-3’
FLR2-RP：5’-ggagcaagagcacgaatctgg-3’
RB1：5’-ttggggtttctacaggacgtaac-3’
flr1、flr2 T-DNA鉴定结果如图2所示。对flr1和flr2突变体的稻米粒形的比较结果如图3所示，其中图3-A为flr1突变体的稻米粒与对照野生型稻米粒的实物比较图，相应地，图3-C为flr1突变体的稻米粒与对照野生型稻米粒的长度、宽度及长宽比的数据分析比较图，图3-B为flr2突变体的稻米粒与对照野生型稻米粒的实物比较图，相应地，图3-D为flr1突 变体的稻米粒与对照野生型稻米粒的长度、宽度及长宽比的数据分析比较图，由上述比较结果可知：flr1突变后，稻米的长宽比变小；flr2突变后，稻米的长宽比变大，说明FLR1和FLR2对稻米粒形均有调控。
而通过比较flr1及flr2中直链淀粉含量的测定结果发现，FLR1及FLR2突变后都会导致稻米中直链淀粉含量的增多以及总淀粉含量的减少，而稻米中直链淀粉与支链淀粉的比例对稻米的营养品质有较大影响，从而看出FLR1及FLR2同时调控稻米的营养品质。
实施例2
本发明之一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，其具体操作包括：水稻OsFLRs基因（包括OsFLR1和OsFLR2基因）的合成，构建水稻OsFLRs基因的过表达载体并转化入农杆菌菌株，再将农杆菌侵染水稻愈伤组织后筛选获得FLR1和FLR2过表达株系。
水稻OsFLRs基因（包括OsFLR1和OsFLR2基因）的克隆
1）FLR1及FLR2引物设计：从NCBI中获得水稻FLR1和FLR2基因的编码序列，分别以FLR1及FLR2的全长编码序列为模板进行引物设计，在FLR1、FLR2的上游引物F1的5’端加入KpnI限制性内切酶酶切位点和保护碱基；在FLR1，FLR2的下游引物R1的5’端加入XbalI限制性内切酶酶切位点和保护碱基。
FLR1-F：5'- GGGGTACCATGGTGAGTTCTAGGTTTGTGGCCG - 3'；
FLR1-R：5'- GCTCTAGACCGTCCCTTGGGGTTCATG- 3'；
FLR2-F：5'-GGGGTACCATGGGAAGCTCCAGATTCGTGC- 3'；
FLR2-R: 5'- GCTCTAGACCGTCCCTTGGGGTTCATG-3'；
其中，GGTACC为KpnI酶切位点，TCTAGA为XbalI酶切位点；
2）PCR克隆：PCR 反应扩增OsFLR1和OsFLR2基因片段，OsFLR1和OsFLR2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
PCR反应体系（20μL），PCR反应条件：98℃预变性5min；98℃变性15s，60℃退火15s，68℃延伸140s，32个循环后，72℃继续延伸10min，在72℃延伸10min前加入普通Taq酶，完成后在4℃保存。
3） PCR产物鉴定：将OsFLR1、OsFLR2的PCR产物胶回收，与pMD18-T载体连接，转化感受态大肠杆菌Top10，涂Amp抗生素的平板，采用菌落PCR进行初步筛选后，将阳性克隆送往博尚测序公司进行测序及BLAST分析，BLAST分析结果如图1所示，由图1可知，水稻OsFLRs家族成员与拟南芥AtFER基因的同源性分别高达63.08%和63.25%。
构建水稻OsFLRs基因的过表达载体并转化农杆菌菌株：
4）重组35S::FLR1-pCAMBIA1300、35S::FLR2-pCAMBIA1300载体的构建：将阳性质粒pMD18-T-FLR1和pMD18-T-FLR2经XbalI和KpnI双酶切后回收，与同样经XbalI和KpnI双酶切回收后的pCAMBIA1300混合，加入T4连接酶及连接缓冲液buffer，连接过夜后，转化感受态大肠杆菌Top10，涂LB平板（含有50mg/L Kan），37℃过夜培养后，即可以进行获得单菌落，进行菌落PCR鉴定可以获得35S::FLR1-pCAMBIA1300 和35S::FLR2-pCAMBIA1300。
5) 获得35S::FLR1-pCAMBIA1300及35S::FLR2-pCAMBIA1300的农杆菌菌株：将35S::FLR1-pCAMBIA1300及35S::FLR2-pCAMBIA1300的阳性克隆质粒转化入Ag10感受态细胞，涂布LB平板(含有50mg/L Kan、50mg/L Rif)培养，28℃倒置培养2d，形成单菌落，并利用菌落PCR筛选出携带目的基因的农杆菌。
侵染水稻获得35S::FLR1和35S::FLR2过表达株系及其应用结果检测
6) 35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300转基因植株的获得：将含有35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300重组载体的农杆菌转入水稻愈伤组织，通过筛选、分化、生根后得到阳性的过表达植株，并通过PCR鉴定植株的真实性。
7)过表达植物稻米粒形及营养品质的测定：通过收获过表达植株的种子，将抗生素进一步筛选萌发后得到纯合株系，进一步收获后得到35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S:: FLR2-pCAMBIA1300过表达稻米种子，再参考国家标准测定过表达株系与相应野生型对照的稻米粒形、总淀粉含量、直链淀粉含量等营养指标。稻米粒形的比较结果如图4所示，稻米中总淀粉含量、直链淀粉含量的检测结构如图5所示。
参照图4和图5可知，通过对35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300中直链淀粉及总淀粉的含量测定发现，在稻米粒形上过表达株系35S::FLR1-pCAMBIA1300的长宽比变大，而35S::FLR2-pCAMBIA1300的长宽比变小。在营养品质上35S::FLR1- pCAMBIA1300过表达株系35S::FLR1-pCAMBIA1300中总淀粉含量升高10%，而35S::FLR2- pCAMBIA1300中总淀粉含量升高8%，在直链淀粉含量上35S::FLR1-pCAMBIA1300过表达中直链淀粉含量下降30%，而35S::FLR2-pCAMBIA1300中直链淀粉含量下降15%。FLR1、FLR2的过表达使得稻米中的淀粉含量升高、而直链淀粉含量下降，最终导致米饭的口感变好。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南林业科技大学，湖南大学
<120> 一种水稻OsFLRs基因及其应用
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2679
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggtgagtt ctaggtttgt ggccgtgctt cttctggtgg cgctggcgcc ggcggcgcgg 60
gggcagggag gaggaggggg caactcgagc gccccggcgg cgtcgccgcc ggggccgttc 120
gtgccgcggg acaacatcct gctcgactgc ggcgcgacgg ggcaggccaa cgacacggac 180
gggcggctct ggaccgggga cacgggctcc aagtacctgc cggcgaacct cgccgccgcg 240
gccgccaccg cgcaggaccc ttctgtgccg caggtgccgt acctcaccgc gcgcttctcc 300
gcggcgccct tcacctactc gttcccggtc ggcgccgggc gcaagttcct caggctccac 360
ttctacccgg cgaactactc caaccgcaac gccgccgacg cgctcttctc cgtctccatc 420
cccgacccca acatcacgct tctctccaac ttcagcgcct accagaccgc cctcgccctc 480
aacttcgact acctcgtccg cgaattctcc gtcaatgtca ctgcctcaac cctcgacctc 540
actttcacac cggagaaggg ccacccaaac gccttcgcct tcgtcaacgg catcgaggtc 600
gtctcctccc ccgacctctt tggcagctcc aacccgatgg aggtcaccgg cgacggcagc 660
ggcacgcctt tcccgatcga cgccggtact gctatgcaga ccatgtaccg gctcaacgtc 720
ggcggcaacg cgatctcccc ctccaaggac acgggcgggt atcggtcatg ggaagatgac 780
acgccataca taccctttgc gtcattcggg gtgagctacg cgaatgacac caatgttccc 840
ataaattacc ctgacagtat tccgcagtat gtggcgccgg cagatgtcta ctctacggcg 900
cggtcgatgg ggcctgacaa caatgtgaat ttgcaataca atctcacctg ggcaatgcag 960
gtggatgctg gttatcagta tctcgtgagg ctccatttct gtgaaataca gtctgggatc 1020
agtaagatca atcaacggac atttgacatc tacatcaaca accagactgc ttttagtggc 1080
gctgatgtga ttgcgtggtc tactgggctt ggcattccag tgtacaagga ttttgtggtg 1140
ttccccatgg gttcagggcc tatggatttg tgggtggatc tacatccaaa tgtcaaaaac 1200
aagccacagt actataatgc tatcctcaat gggatggagg tttttaagtt gcagcttact 1260
aatgggagcc ttgctgggct caaccctgtc cctagtattg taccaacagc gtcgggtgga 1320
aattctggga agaagtcaag tgttggtcca attattggag gagtgattgg aggtctggta 1380
gttcttgcac ttggatgttg ctgcttcttt gtgatctgca agcgtcggca gagagcaggt 1440
aaggattcag gaatgagtga tgggcattct ggttggttgc cgctctcact ttatggcaac 1500
tcacacactt ccagctcagc caagtcacac actactggga gccatgcttc gtctttgcca 1560
tccaacctgt gccgccattt ctcatttgtg gagatcaagg ctgcgacaaa caactttgat 1620
gagtccctcc tccttggcgt gggtggtttt ggtaaagttt accgtggaga gattgacgga 1680
ggagcaacca aggtggctat caagcgtgga aacccattgt ctgagcaggg tgtgcatgag 1740
ttccaaacag agatcgagat gttgtcgaag ctccgccacc gacatcttgt gtcgcttatt 1800
ggttactgcg aggagaagaa tgagatgatc ctggtctatg actatatggc tcacggaact 1860
cttcgtgagc acctgtacaa gacccaaaat gcaccacttt cttggaggca gcgcttggat 1920
atctgcattg gtgcagctcg tgggcttcac tacctacaca ctggtgcaaa gcacaccatc 1980
atccaccgtg atgtgaagac gacaaacatc ctcctcgatg agaagtgggt agccaaggtt 2040
tcagattttg gtttgtccaa gactggtcca acaatggatc atacgcatgt gagcacagtt 2100
gtcaagggca gttttggtta tcttgatcct gagtacttcc gcaggcagca gcttactgac 2160
aaatctgatg tctattcttt tggtgttgta ctgtttgagg tcctatgtgc tcggcctgcc 2220
ttgaatccca ctcttgcaaa ggaagaagtt agcttggctg agtgggcatt acactgccag 2280
aagaagggta ttcttgatca gattgttgat ccccacctga agggaaagat tgctccacaa 2340
tgtttcaaga agtttgcaga aacagctgag aagtgtgttt ctgatcaggg cattgaccgt 2400
ccttcgatgg gagatgtgct gtggaacttg gaatttgccc ttcaaatgca ggaaagtgca 2460
gaggagagcg gaagccttgg atgtgggatg tcagacgaca gcactcccct tgtgatagtt 2520
ggaaagaagg atcccaatga tccatctatc gagtcaagca ccacgacaac gacaactacc 2580
tcgataagca tgggtgagca gagtgttgca agtattgact cggatgggct gacgcctagt 2640
gctgtcttct cgcagatcat gaaccccaag ggacggtga 2679
<210> 2
<211> 2691
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgggaagct ccagattcgt gctcttgctc ctcctcctcc tcgccgtggc ggcttgcgtc 60
gcgcgggggc aaggcggcgg aaactcgagc agcgcggcgg cgccggcgcc ggctgcgggg 120
gcggggccgt tcgtgccgcg ggacgacatc ctgctcgact gcggcgcgac ggggaagggg 180
aacgacacgg acgggcgggt gtggagcggg gacgccgggt ccaagtacgc gccggcgagc 240
ctcggctcgg cgtccgccgc ggggcaggac ccctcggtgc cgcaggtgcc ctacctcacc 300
gcgagggtct ccgcggcgcc cttcacctac tccttcccgc tcggcgccgg ccgcaagttc 360
ctcaggctcc acttctaccc ggccaactac tccagccgcg acgccgccga cgcgcgcttc 420
tccgtctccg tccccgccgc caacgtcacg ctcctctcca acttcagcgc ctaccagacc 480
gccaccgccc tcaacttcgc ctacatcgtc cgcgagttct ccgtcaacgt cacgaccccg 540
acgatggagc tcaccttcac gccggagaag ggccacccca acgcctacgc gttcgtcaac 600
ggcatcgagg ttgtctcctc ccccgatctc ttcgacatct ccaccccgaa tctggtcacc 660
ggggatggca acaatcagcc attcccgatc gacgctggca ctgctctgca gacaatgtac 720
cgacttaatg tcggcggcca ggcgatctcc ccctccaagg acacgggcgg ttaccgttcg 780
tgggacgatg actcgccata cgtttttggt gcggcgttcg gggtgtccta cccaaaagat 840
gacaatgtca ccattgccta ccctagcaat gtgccggagt atgtggcgcc ggtggatgtc 900
tatgctacgg caaggtcgat ggggccggac aagaacgtga acttggcata caacctcact 960
tggataatgc aggtggatgc tgggttcaca taccttgtga ggcttcattt ctgtgagata 1020
caatatccaa tcactatgat caatcagcgg gtgttcaaca tttacatcaa caaccagact 1080
gcttttcagg gcgccgatgt gattgcatgg actaataaca atgggatcgg cagtccagtg 1140
tatcaagact ttgtagtgac aacagttggt tcaggggcta tggatttgtg ggtagctctc 1200
tatccagatg tccaggctaa accacagtac tatgatgcta tcctcaatgg actggaggtg 1260
ttcaagttgc cgcttagtaa tgggagcctt gctgggctca accctgttcc aactgttgag 1320
ccatcgttgg atggtggagc agtgaagaag tcaagtgttg ggcctattgt tggtggagtg 1380
attggaggtc tggtggttct tgcacttgga tattgctgct ttatgatctg caagcgtcgg 1440
agcagagtgg ggaaggacac aggcatgagt gatgggcatt ctggatggtt gccactttca 1500
ctctatggca actcacactc atctggctca gccaaatcac atactactgg gagctacgct 1560
tcatcgctgc catccaacct gtgccgccat ttctcatttg cggagatcaa ggctgcaaca 1620
aacaacttcg atgaatccct cctccttggt gtgggtggtt tcggtaaagt gtatcgtggg 1680
gagattgatg gtggagtgac caaggtggct atcaagcgtg ggaatccact gtctgagcag 1740
ggtgtgcatg agttccaaac cgagattgag atgctgtcga agctccgcca ccgtcatctt 1800
gtgtcactga ttggttactg tgaggagaag aatgagatga tcctggtcta tgactacatg 1860
gctcatggaa ctcttcgtga gcacctgtac aagaccaaga atgcaccact tacatggagg 1920
cagcgcttgg agatctgcat tggtgctgcc cgtgggcttc actaccttca cactggtgcg 1980
aagcacacaa tcatccaccg tgatgtgaag acaacaaata tcctcctgga tgagaagtgg 2040
gtcgcgaagg tttcagattt tggtctgtca aagactgggc catcgatgga tcacacacat 2100
gtgagcacag ttgtcaaggg aagttttggc taccttgacc ctgaatactt ccgcaggcag 2160
cagctcactg agaaatctga tgtctactcc tttggtgttg tgctatttga ggtcctctgt 2220
gctcgccctg ccttgaaccc cactcttgct aaggaagaag ttagcttggc agagtgggcc 2280
ctgcactgcc agaagaaggg tattcttgat cagattgttg atccccacct gaagggaaag 2340
atcgctccac agtgcttcaa gaagtttgcc gagactgctg agaaatgtgt ttcagatgaa 2400
ggcatcgatc gtccttcaat gggagatgtg ctgtggaact tggaatttgc ccttcaaatg 2460
caggaaagtg cagaggatag tggaagcatt ggttgtggga tgtcagatga gggcactccc 2520
cttgtgatgc ctggaaagaa ggatcccaat gatccatcga tcgagtcaag caccactaca 2580
accacaacca cgtccataag catgggcgac caaagtgttg ctagcataga ctccgacggg 2640
cttactccta gcgctgtctt ctcacagatc atgaacccca agggacggtg a 2691
<210> 3
<211> 892
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Val Ser Ser Arg Phe Val Ala Val Leu Leu Leu Val Ala Leu Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Arg Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Ser Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Ser Pro Pro Gly Pro Phe Val Pro Arg Asp Asn Ile Leu Leu
35 40 45
Asp Cys Gly Ala Thr Gly Gln Ala Asn Asp Thr Asp Gly Arg Leu Trp
50 55 60
Thr Gly Asp Thr Gly Ser Lys Tyr Leu Pro Ala Asn Leu Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Thr Ala Gln Asp Pro Ser Val Pro Gln Val Pro Tyr Leu Thr
85 90 95
Ala Arg Phe Ser Ala Ala Pro Phe Thr Tyr Ser Phe Pro Val Gly Ala
100 105 110
Gly Arg Lys Phe Leu Arg Leu His Phe Tyr Pro Ala Asn Tyr Ser Asn
115 120 125
Arg Asn Ala Ala Asp Ala Leu Phe Ser Val Ser Ile Pro Asp Pro Asn
130 135 140
Ile Thr Leu Leu Ser Asn Phe Ser Ala Tyr Gln Thr Ala Leu Ala Leu
145 150 155 160
Asn Phe Asp Tyr Leu Val Arg Glu Phe Ser Val Asn Val Thr Ala Ser
165 170 175
Thr Leu Asp Leu Thr Phe Thr Pro Glu Lys Gly His Pro Asn Ala Phe
180 185 190
Ala Phe Val Asn Gly Ile Glu Val Val Ser Ser Pro Asp Leu Phe Gly
195 200 205
Ser Ser Asn Pro Met Glu Val Thr Gly Asp Gly Ser Gly Thr Pro Phe
210 215 220
Pro Ile Asp Ala Gly Thr Ala Met Gln Thr Met Tyr Arg Leu Asn Val
225 230 235 240
Gly Gly Asn Ala Ile Ser Pro Ser Lys Asp Thr Gly Gly Tyr Arg Ser
245 250 255
Trp Glu Asp Asp Thr Pro Tyr Ile Pro Phe Ala Ser Phe Gly Val Ser
260 265 270
Tyr Ala Asn Asp Thr Asn Val Pro Ile Asn Tyr Pro Asp Ser Ile Pro
275 280 285
Gln Tyr Val Ala Pro Ala Asp Val Tyr Ser Thr Ala Arg Ser Met Gly
290 295 300
Pro Asp Asn Asn Val Asn Leu Gln Tyr Asn Leu Thr Trp Ala Met Gln
305 310 315 320
Val Asp Ala Gly Tyr Gln Tyr Leu Val Arg Leu His Phe Cys Glu Ile
325 330 335
Gln Ser Gly Ile Ser Lys Ile Asn Gln Arg Thr Phe Asp Ile Tyr Ile
340 345 350
Asn Asn Gln Thr Ala Phe Ser Gly Ala Asp Val Ile Ala Trp Ser Thr
355 360 365
Gly Leu Gly Ile Pro Val Tyr Lys Asp Phe Val Val Phe Pro Met Gly
370 375 380
Ser Gly Pro Met Asp Leu Trp Val Asp Leu His Pro Asn Val Lys Asn
385 390 395 400
Lys Pro Gln Tyr Tyr Asn Ala Ile Leu Asn Gly Met Glu Val Phe Lys
405 410 415
Leu Gln Leu Thr Asn Gly Ser Leu Ala Gly Leu Asn Pro Val Pro Ser
420 425 430
Ile Val Pro Thr Ala Ser Gly Gly Asn Ser Gly Lys Lys Ser Ser Val
435 440 445
Gly Pro Ile Ile Gly Gly Val Ile Gly Gly Leu Val Val Leu Ala Leu
450 455 460
Gly Cys Cys Cys Phe Phe Val Ile Cys Lys Arg Arg Gln Arg Ala Gly
465 470 475 480
Lys Asp Ser Gly Met Ser Asp Gly His Ser Gly Trp Leu Pro Leu Ser
485 490 495
Leu Tyr Gly Asn Ser His Thr Ser Ser Ser Ala Lys Ser His Thr Thr
500 505 510
Gly Ser His Ala Ser Ser Leu Pro Ser Asn Leu Cys Arg His Phe Ser
515 520 525
Phe Val Glu Ile Lys Ala Ala Thr Asn Asn Phe Asp Glu Ser Leu Leu
530 535 540
Leu Gly Val Gly Gly Phe Gly Lys Val Tyr Arg Gly Glu Ile Asp Gly
545 550 555 560
Gly Ala Thr Lys Val Ala Ile Lys Arg Gly Asn Pro Leu Ser Glu Gln
565 570 575
Gly Val His Glu Phe Gln Thr Glu Ile Glu Met Leu Ser Lys Leu Arg
580 585 590
His Arg His Leu Val Ser Leu Ile Gly Tyr Cys Glu Glu Lys Asn Glu
595 600 605
Met Ile Leu Val Tyr Asp Tyr Met Ala His Gly Thr Leu Arg Glu His
610 615 620
Leu Tyr Lys Thr Gln Asn Ala Pro Leu Ser Trp Arg Gln Arg Leu Asp
625 630 635 640
Ile Cys Ile Gly Ala Ala Arg Gly Leu His Tyr Leu His Thr Gly Ala
645 650 655
Lys His Thr Ile Ile His Arg Asp Val Lys Thr Thr Asn Ile Leu Leu
660 665 670
Asp Glu Lys Trp Val Ala Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys Thr
675 680 685
Gly Pro Thr Met Asp His Thr His Val Ser Thr Val Val Lys Gly Ser
690 695 700
Phe Gly Tyr Leu Asp Pro Glu Tyr Phe Arg Arg Gln Gln Leu Thr Asp
705 710 715 720
Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Phe Glu Val Leu Cys
725 730 735
Ala Arg Pro Ala Leu Asn Pro Thr Leu Ala Lys Glu Glu Val Ser Leu
740 745 750
Ala Glu Trp Ala Leu His Cys Gln Lys Lys Gly Ile Leu Asp Gln Ile
755 760 765
Val Asp Pro His Leu Lys Gly Lys Ile Ala Pro Gln Cys Phe Lys Lys
770 775 780
Phe Ala Glu Thr Ala Glu Lys Cys Val Ser Asp Gln Gly Ile Asp Arg
785 790 795 800
Pro Ser Met Gly Asp Val Leu Trp Asn Leu Glu Phe Ala Leu Gln Met
805 810 815
Gln Glu Ser Ala Glu Glu Ser Gly Ser Leu Gly Cys Gly Met Ser Asp
820 825 830
Asp Ser Thr Pro Leu Val Ile Val Gly Lys Lys Asp Pro Asn Asp Pro
835 840 845
Ser Ile Glu Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ile Ser Met
850 855 860
Gly Glu Gln Ser Val Ala Ser Ile Asp Ser Asp Gly Leu Thr Pro Ser
865 870 875 880
Ala Val Phe Ser Gln Ile Met Asn Pro Lys Gly Arg
885 890
<210> 4
<211> 896
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Gly Ser Ser Arg Phe Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val
1 5 10 15
Ala Ala Cys Val Ala Arg Gly Gln Gly Gly Gly Asn Ser Ser Ser Ala
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Gly Ala Gly Pro Phe Val Pro Arg Asp
35 40 45
Asp Ile Leu Leu Asp Cys Gly Ala Thr Gly Lys Gly Asn Asp Thr Asp
50 55 60
Gly Arg Val Trp Ser Gly Asp Ala Gly Ser Lys Tyr Ala Pro Ala Ser
65 70 75 80
Leu Gly Ser Ala Ser Ala Ala Gly Gln Asp Pro Ser Val Pro Gln Val
85 90 95
Pro Tyr Leu Thr Ala Arg Val Ser Ala Ala Pro Phe Thr Tyr Ser Phe
100 105 110
Pro Leu Gly Ala Gly Arg Lys Phe Leu Arg Leu His Phe Tyr Pro Ala
115 120 125
Asn Tyr Ser Ser Arg Asp Ala Ala Asp Ala Arg Phe Ser Val Ser Val
130 135 140
Pro Ala Ala Asn Val Thr Leu Leu Ser Asn Phe Ser Ala Tyr Gln Thr
145 150 155 160
Ala Thr Ala Leu Asn Phe Ala Tyr Ile Val Arg Glu Phe Ser Val Asn
165 170 175
Val Thr Thr Pro Thr Met Glu Leu Thr Phe Thr Pro Glu Lys Gly His
180 185 190
Pro Asn Ala Tyr Ala Phe Val Asn Gly Ile Glu Val Val Ser Ser Pro
195 200 205
Asp Leu Phe Asp Ile Ser Thr Pro Asn Leu Val Thr Gly Asp Gly Asn
210 215 220
Asn Gln Pro Phe Pro Ile Asp Ala Gly Thr Ala Leu Gln Thr Met Tyr
225 230 235 240
Arg Leu Asn Val Gly Gly Gln Ala Ile Ser Pro Ser Lys Asp Thr Gly
245 250 255
Gly Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Asp Ser Pro Tyr Val Phe Gly Ala Ala
260 265 270
Phe Gly Val Ser Tyr Pro Lys Asp Asp Asn Val Thr Ile Ala Tyr Pro
275 280 285
Ser Asn Val Pro Glu Tyr Val Ala Pro Val Asp Val Tyr Ala Thr Ala
290 295 300
Arg Ser Met Gly Pro Asp Lys Asn Val Asn Leu Ala Tyr Asn Leu Thr
305 310 315 320
Trp Ile Met Gln Val Asp Ala Gly Phe Thr Tyr Leu Val Arg Leu His
325 330 335
Phe Cys Glu Ile Gln Tyr Pro Ile Thr Met Ile Asn Gln Arg Val Phe
340 345 350
Asn Ile Tyr Ile Asn Asn Gln Thr Ala Phe Gln Gly Ala Asp Val Ile
355 360 365
Ala Trp Thr Asn Asn Asn Gly Ile Gly Ser Pro Val Tyr Gln Asp Phe
370 375 380
Val Val Thr Thr Val Gly Ser Gly Ala Met Asp Leu Trp Val Ala Leu
385 390 395 400
Tyr Pro Asp Val Gln Ala Lys Pro Gln Tyr Tyr Asp Ala Ile Leu Asn
405 410 415
Gly Leu Glu Val Phe Lys Leu Pro Leu Ser Asn Gly Ser Leu Ala Gly
420 425 430
Leu Asn Pro Val Pro Thr Val Glu Pro Ser Leu Asp Gly Gly Ala Val
435 440 445
Lys Lys Ser Ser Val Gly Pro Ile Val Gly Gly Val Ile Gly Gly Leu
450 455 460
Val Val Leu Ala Leu Gly Tyr Cys Cys Phe Met Ile Cys Lys Arg Arg
465 470 475 480
Ser Arg Val Gly Lys Asp Thr Gly Met Ser Asp Gly His Ser Gly Trp
485 490 495
Leu Pro Leu Ser Leu Tyr Gly Asn Ser His Ser Ser Gly Ser Ala Lys
500 505 510
Ser His Thr Thr Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Leu Pro Ser Asn Leu Cys
515 520 525
Arg His Phe Ser Phe Ala Glu Ile Lys Ala Ala Thr Asn Asn Phe Asp
530 535 540
Glu Ser Leu Leu Leu Gly Val Gly Gly Phe Gly Lys Val Tyr Arg Gly
545 550 555 560
Glu Ile Asp Gly Gly Val Thr Lys Val Ala Ile Lys Arg Gly Asn Pro
565 570 575
Leu Ser Glu Gln Gly Val His Glu Phe Gln Thr Glu Ile Glu Met Leu
580 585 590
Ser Lys Leu Arg His Arg His Leu Val Ser Leu Ile Gly Tyr Cys Glu
595 600 605
Glu Lys Asn Glu Met Ile Leu Val Tyr Asp Tyr Met Ala His Gly Thr
610 615 620
Leu Arg Glu His Leu Tyr Lys Thr Lys Asn Ala Pro Leu Thr Trp Arg
625 630 635 640
Gln Arg Leu Glu Ile Cys Ile Gly Ala Ala Arg Gly Leu His Tyr Leu
645 650 655
His Thr Gly Ala Lys His Thr Ile Ile His Arg Asp Val Lys Thr Thr
660 665 670
Asn Ile Leu Leu Asp Glu Lys Trp Val Ala Lys Val Ser Asp Phe Gly
675 680 685
Leu Ser Lys Thr Gly Pro Ser Met Asp His Thr His Val Ser Thr Val
690 695 700
Val Lys Gly Ser Phe Gly Tyr Leu Asp Pro Glu Tyr Phe Arg Arg Gln
705 710 715 720
Gln Leu Thr Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Phe
725 730 735
Glu Val Leu Cys Ala Arg Pro Ala Leu Asn Pro Thr Leu Ala Lys Glu
740 745 750
Glu Val Ser Leu Ala Glu Trp Ala Leu His Cys Gln Lys Lys Gly Ile
755 760 765
Leu Asp Gln Ile Val Asp Pro His Leu Lys Gly Lys Ile Ala Pro Gln
770 775 780
Cys Phe Lys Lys Phe Ala Glu Thr Ala Glu Lys Cys Val Ser Asp Glu
785 790 795 800
Gly Ile Asp Arg Pro Ser Met Gly Asp Val Leu Trp Asn Leu Glu Phe
805 810 815
Ala Leu Gln Met Gln Glu Ser Ala Glu Asp Ser Gly Ser Ile Gly Cys
820 825 830
Gly Met Ser Asp Glu Gly Thr Pro Leu Val Met Pro Gly Lys Lys Asp
835 840 845
Pro Asn Asp Pro Ser Ile Glu Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr
850 855 860
Ser Ile Ser Met Gly Asp Gln Ser Val Ala Ser Ile Asp Ser Asp Gly
865 870 875 880
Leu Thr Pro Ser Ala Val Phe Ser Gln Ile Met Asn Pro Lys Gly Arg
885 890 895

Claims (9)

1.一种水稻OsFLRs基因，其特征在于，由核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的OsFLR1和OsFLR2基因组成。
2.一种水稻OsFLRs功能蛋白，由OsFLR1和OsFLR2基因编码获得，其氨基酸酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
3.一种水稻OsFLRs基因的过表达载体，所示载体含有35S强启动子。
4.一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用可能性分析方法，通过三引物法对flr1及flr2突变体进行鉴定，并获得flr1和flr2纯合的突变体，并对其mRNA水平进行鉴定。
5.如权利要求4所述水稻OsFLRs基因在水稻中的应用可能性分析方法，其特征在于，所述flr1、flr2 T-DNA鉴定引物名称如下：
FLR1-LP：5’-gcaggtggatgctggttatc-3’ ；
FLR1-RP：5’-atcgaggaggatgtttgtcg-3’ ；
FLR2-LP：5’-gccatgttcttcaattcctgtcc-3’ ；
FLR2-RP：5’-ggagcaagagcacgaatctgg-3’ ；
RB1：5’-ttggggtttctacaggacgtaac-3’ 。
6.一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，包括水稻OsFLRs基因在调控稻米粒形和稻米营养品质上的应用。
7.如权利要求6所述一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，其特征在于，其具体操作包括： OsFLR1和OsFLR2基因的克隆；构建水稻OsFLRs基因的过表达载体并转化入农杆菌菌株；再将农杆菌侵染水稻愈伤组织后筛选获得35S::FLR1和35S::FLR2过表达株系。
8.如权利要求7所述一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，其特征在于，构建水稻OsFLRs基因的过表达载体并转化入农杆菌菌株的具体操作为：将阳性质粒pMD18-T-FLR1和pMD18-T-FLR2经XbalI和KpnI双酶切后回收，与同样经XbalI和KpnI双酶切回收后的pCAMBIA1300混合，加入T4连接酶及连接buffer，连接过夜后，转化感受态Top10，涂LB平板，37℃过夜培养后，即可以进行获得单菌落，进行菌落PCR鉴定可以获得35S::FLR1- pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300；将35S::FLR1-pCAMBIA1300及35S::FLR2- pCAMBIA1300的阳性克隆质粒转化入Ag10感受态细胞，涂布LB平板培养，28℃倒置培养2d，形成单菌落，并利用菌落PCR筛选出携带目的基因的农杆菌。
9.如权利要求8所述一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，其特征在于，将农杆菌侵染水稻愈伤组织后筛选获得35S::FLR1和35S::FLR2过表达株系的具体操作为：将含有35S:: FLR1-pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300重组载体的农杆菌转入水稻愈伤组织，通过筛选、分化、生根后得到阳性的过表达植株，并通过PCR鉴定植株的真实性。
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