CN111269933A - 一种基因feronia的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因FERONIA的应用。属于基因调控技术领域。本发明通过在缺氮培养基中添加氨基酸的方法，在其培养基上点种野生型拟南芥Col‑0和FERONIA基因缺失突变体fer‑4，发现能够恢复野生型拟南芥缺氮表型的氨基酸却不能或仅部分恢复拟南芥fer‑4突变体的缺氮表型，说明FERONIA参与了植物对有机氮的利用过程，即拟南芥FERONIA基因参与了植物根系对氨基酸的响应过程。本发明为FERONIA基因的功能研究提供了理论和方法基础。本发明所述的FERONIA可为培育农作物新品种提供理论依据和遗传资源。

Description

一种基因FERONIA的应用

技术领域：

本发明属于基因调控技术领域，具体涉及一种拟南芥基因FERONIA在植物响应氨基酸中的应用。

背景技术：

氮素是植物生长发育最重要的大量元素之一，它不仅是蛋白质、核酸及磷脂等生物大分子的重要组成成分；同时也参与酶、叶绿素及植物激素等重要化合物的构成。植物所利用的氮素主要来自于土壤或水中的可溶性有机氮化合物及无机氮化合物。

近年来，作为亚家族CrRLK1L中最重要的成员，受体蛋白激酶FERONIA(简写为FER，下同)及其信号网络受到了诸多关注。之前的研究表明：细胞膜受体蛋白激酶FERONIA信号通路在植物界是一个“多面手”，曾揭示了FERONIA负调控脱落酸ABA的信号通路(PNAS,2012)；发现了FERONIA调控种子大小(Molecular Plant，2014)；阐明了FERONIA介导RALF多肽激素与ABA交叉会话的机制(PNAS,2016)；解析了FERONIA在细胞膜上感受RALF1多肽的机制(PNAS,2016)等等。然而，对于FER是否参与氨基酸的响应过程，目前尚未可知。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种基因FERONIA的全新应用，具体是指所述的基因FERONIA参与植物响应氨基酸中的应用。该应用方向是首次发现，为FERONIA基因的功能分析，以及为获得农作物新品种提供理论依据和遗传资源。

进一步的，所述的应用是指所述的基因FERONIA在参与利用氨基酸调控植物生长中的应用。本发明确实通过试验验证了基因FERONIA与氨基酸一起起到调控植物生长的作用。

进一步的，所述的应用是指所述的基因FERONIA在植物缺无机氮状态下，参与利用氨基酸调控植物生长中的应用。

上述调控作用可能的形式包括：氨基酸作为氮源能量或外源信号分子，与FERONIA一起作用。

进一步的，氨基酸可能作为氮源能量与基因FERONIA一起参与促进植物生长。

进一步的，调控植物生长包括：氨基酸与基因FERONIA一起作用促进植物生长，特别是增加植物鲜重和/或叶绿素含量。

进一步的，氨基酸与基因FERONIA一起作用增加植物鲜重和/或叶绿素含量时，所述的氨基酸包括：精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸以及甘氨酸中的一种或多种。

本发明优选丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或多种时，这些氨基酸与基因FERONIA一起作用增加植物鲜重和/或叶绿素含量的效果更加突出。

进一步的，所述的应用，培养基中氨基酸浓度范围0.5-3.5mM，优选2-3mM，进一步优选3mM。

本发明在调控植物生长状况试验中发现培养基中含有少量的其他种类有机态氮，并不会影响基因FERONIA对氨基酸的响应作用。但当氨基酸浓度太小时，则会造成响应不明显，氨基酸浓度太大时，响应效果不会继续增强，因此，本发明选定了合适的氨基酸浓度范围。

进一步的，氨基酸可能作为外源信号分子与基因FERONIA一起参与植物根长调控。

进一步的，调控植物生长包括：氨基酸与基因FERONIA一起作用调控植物主根的生长，特别是增强根长抑制率。

进一步的，所述的应用，氨基酸与基因FERONIA一起作用增强根长抑制率时，所述的氨基酸包括：天冬氨酸、谷氨酰胺以及甘氨酸中的一种或多种。

本发明优选天冬氨酸时，其与基因FERONIA一起作用增强植物在营养缺陷时的主根伸长抑制的效果更加突出，即根长抑制效果尤为明显，提高植物对外界环境的适应。

进一步的，所述的应用，培养基中氨基酸浓度范围0.5-1mM，优选0.5-0.8mM，进一步优选0.5mM。

本发明在根抑制试验中发现，当氨基酸浓度太小时，根长抑制效果不显著，氨基酸浓度太大时，也不会明显增强根长抑制效果，因此，本发明选定了合适的氨基酸浓度范围。

本发明所述的应用，所述的基因FERONIA来源于拟南芥；所述的植物包括：拟南芥。

本发明采用的基因FERONIA不仅仅来源于拟南芥，可能还包括来源于其他植物的同源基因，甚至还可以将这类基因转入其他植物进行类似于本发明的氨基酸响应。

本发明所述的拟南芥基因FERONIA在Genebank中的编号为AT3G51550，该基因的CDS长度为2688bp，编码895个氨基酸的蛋白，该基因参与了植物响应氨基酸，具体是在缺乏无机氮的状态下参与利用氨基酸调控植物生长。包括氨基酸可能作为氮源能量或外源信号分子，与FERONIA一起作用参与促进植物生长，或者参与根长调控。

本发明为FERONIA基因的功能研究提供了理论和方法基础。本发明所述的FERONIA可为培育农作物新品种提供理论依据和遗传资源。

本发明FERONIA基因序列见SEQ ID NO.1。

附图说明

图1为拟南芥野生型植株Col-0和FERONIA完全缺失突变fer-4植株在正常1/2MS培养基、缺无机氮1/2MS培养基以及分别含有16种氨基酸的缺无机氮1/2MS固体培养基上生长的表型图。

图2为Col-0和fer-4植株在正常1/2MS培养基、缺无机氮1/2MS培养基以及分别含有6种氨基酸的缺无机氮1/2MS固体培养基上生长后的相对鲜重分析；*表示同处理下与Col-0相比差异性显著，数据以平均值±SD表示，统计学方法为Student’s t-test(单因素方差分析)(*P<0.05，**P<0.01)；下同。

图3为Col-0和fer-4植株在正常1/2MS培养基、缺无机氮1/2MS培养基以及分别含有6种氨基酸的缺无机氮1/2MS固体培养基上生长后的叶绿素含量分析。

图4为拟南芥野生型Col-0、FERONIA完全缺失突变fer-4植株在缺氮1/50^thB5培养基中添加天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)以及甘氨酸(Gly)后的根长表型图。

图5为拟南芥野生型Col-0、FERONIA完全缺失突变fer-4植株在缺氮1/50^thB5培养基中添加天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)以及甘氨酸(Gly)后的根长抑制率情况。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或替换，均属于本发明的保护范围。

下面以实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：

将拟南芥野生型Col-0和突变体fer-4(种子均来源于ABRC种子库)种子用75％酒精消毒5min，无菌水冲洗2次，然后用15％的次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗4次。将消毒好的种子置于4℃，春化3d。将春化好的种子分别点种于正常1/2MS培养基、缺无机氮1/2MS培养基以及分别含有3mM 16种氨基酸的缺无机氮1/2MS固体培养基上，水平放置在22℃长日照培养箱中生长10天，拍照(见图1)。(16种氨基酸分别为：丙氨酸(Ala)，精氨酸(Arg)，天冬酰胺(Asn)，天冬氨酸(Asp)，半胱氨酸(Cys)，谷氨酰胺(Gln)，谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，蛋氨酸(Met)，脯氨酸(Pro)，苏氨酸(Thr)，缬氨酸(Val)。)

表1缺无机氮MS母液培养基配方如下：

MS培养基工作浓度为1ⅹ，1/2MS培养基按照1ⅹMS浓度减半即可，蔗糖浓度0.8％,琼脂糖浓度1％。

叶绿素含量测定采用丙酮法：

剪取植株地上部分并称重记录后放入1.5ml离心管中，离心管外包裹一层锡箔纸避光。加入1ml 80％丙酮避光后放入4℃冰箱过夜。将提取液分别在645nm，663nm，470nm处测吸光值，并利用公式计算：叶绿素a色素浓度：C_a＝

12.21*A₆₆₃–2.81*A₆₄₅，叶绿素b色素浓度：C_b＝20.13*A₆₄₅–5.03*A₆₆₃，C_C＝(1000A₄₇₀-3.27C_a-104C_b)/229，总叶绿素色素浓度：C＝C_a+C_b+C_C，叶绿含量＝n·C·N·W^-1(mg·g^-1)。n-提取液体积；C-总叶绿素色素浓度；N-稀释倍数；W-样品鲜重。实验重复三次叶绿素含量(mg/g FW^-1)＝C(mg/L)×提取液总量(ml)×稀释倍数/[样品鲜重(mg)×1000]。

植物鲜重测定方法：

将每组处理取100株植物用电子天平称重并记录。相对鲜重(％)＝(实验组鲜重/对照组鲜重)х100，实验重复三次。

上述实验组为分别在含有3mM 6种氨基酸的缺无机氮1/2MS固体培养基上生长的Col-0和fer-4。

对照组为在正常1/2MS培养基上生长的Col-0和fer-4。

图2中正常1/2MS培养基、缺无机氮1/2MS培养基生长的Col-0和fer-4的数据也是以正常1/2MS培养基生长的数据为对照来计算的。

结果发现，与缺无机氮处理相比，分别添加精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)以及甘氨酸(Gly)这6种氨基酸能使由缺无机氮导致Col-0发白的子叶恢复成绿色(图1)，鲜重及叶绿素含量增加(图2，3)；而除了Ala和Gln部分恢复fer-4植株缺无机氮表型，fer-4植株对另外4种氨基酸均表现不敏感。以上结果说明FERONIA基因参与到以上6种氨基酸的响应过程，即6种氨基酸与基因FERONIA一起作用促进植物生长，特别是增加植物鲜重和叶绿素含量。提示6种氨基酸可能作为氮源能量与基因FERONIA一起参与促进植物生长。

实施例2：

将拟南芥野生型Col-0和突变体fer-4(来源于ABRC)种子用75％酒精消毒5min，无菌水冲洗2次，然后用15％的次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗4次。将消毒好的种子置于4℃，春化3d。将春化好的种子分别点种于不含氮的1/50^thB5培养基，4天后将苗子移植至分别含0.5mM的天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)以及甘氨酸(Gly)的不含氮的1/50^th B5培养基中，竖直放置在22℃长日照培养箱中生长10天，统计根长。

B5培养基配方：

配制1/50^th B5培养基，所用营养元素(大量元素、微量元素及铁盐)浓度为正常B5培养基的1/50，蔗糖浓度为0.5％，植物凝胶为1％。再加入终浓度为1mM MgCl₂和CaCl₂以增加植物凝胶的硬度，用1.0M KOH调pH到5.7。

抑制率计算：

抑制率(％)＝[(对照组根长-实验组根长)/对照组根长]х100

对照组根长为：将春化好的Col-0和fer-4种子分别点种于不含氮的1/50^th B5培养基，4天后将苗子移植至不含氮的1/50^th B5培养基中，竖直放置在22℃长日照培养箱中生长10天，统计的根长。

实验组根长为：将春化好的Col-0和fer-4种子分别点种于不含氮的1/50^th B5培养基，4天后将苗子移植至分别含0.5mM的天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)以及甘氨酸(Gly)的不含氮的1/50^th B5培养基中，竖直放置在22℃长日照培养箱中生长10天，统计的根长。

结果发现，添加天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)以及甘氨酸(Gly)后，无论是Col-0，还是fer-4，植株的根长相对于对照组都变短了(图4)，说明以上3种氨基酸参与植物根系形态建成过程；同时，还发现与Col-0相比，fer-4突变体植株的根长抑制率显著下降(图5)，说明以上3种氨基酸与基因FERONIA一起调节植株的根长抑制率，提示3种氨基酸可能作为信号分子被植物根系识别，从而进一步促使基因FERONIA发挥调控根长的作用。

序列表

<110> 湖南大学

<120> 一种基因FERONIA的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2688

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgaagatca cagagggacg attccgtctc tctcttcttc ttcttcttct tctcatatct 60

gcagcaactt taatctcagc tgctgattac tctccaacag agaaaatcct attgaattgc 120

ggtggtggtg cttctaatct aaccgacaca gataaccgta tatggatctc cgatgtcaaa 180

tcaaaattct tatcatcttc ctctgaagac tctaaaacat caccagcgtt aacacaagat 240

ccttccgttc ccgaagttcc ttacatgacg gcgagagttt tccgatctcc tttcacttac 300

actttccctg tagcatcagg tcgtaaattc gtgcgtctct acttctaccc aaactcgtac 360

gacggtctca acgctaccaa ctcgttattc tccgtctcct ttggtcctta cactcttctc 420

aagaatttca gtgcttctca gacggcggag gcgttgactt acgctttcat catcaaggag 480

tttgttgtca acgttgaagg tggaacgttg aacatgacgt ttacaccgga atcagctccg 540

tctaatgcgt atgcgtttgt taatgggatt gaggttactt caatgcctga tatgtatagt 600

agtactgatg ggactttgac tatggttgga tcatctggct ctgttactat tgataacagt 660

actgctcttg agaatgtgta taggctcaat gttggaggga atgatatctc gccttccgcg 720

gatacgggtt tgtataggtc gtggtatgat gatcagcctt atatatttgg tgcaggactt 780

ggtattccag agactgctga tcccaacatg acgattaagt atcctacggg gactcctact 840

tatgttgctc ctgtggatgt ttattcaacc gcgaggtcta tgggtccaac agctcagatc 900

aatctcaact acaatcttac ttggattttc agcattgact ctggtttcac ttaccttgtt 960

agacttcatt tctgtgaggt ttcttcgaat atcactaaga tcaaccaacg ggtgtttaca 1020

atctacctca acaatcaaac tgctgagcct gaagctgatg tgattgcttg gactagttca 1080

aacggggttc cgtttcacaa ggattacgtg gtgaatcctc cagagggaaa tggacagcaa 1140

gatttgtggc ttgctcttca tcctaaccca gttaacaagc cggagtatta tgattctctt 1200

cttaatggag tggagatatt caagatgaat acttctgatg gtaatctggc tggtaccaat 1260

cctatacctg gtccacaggt gactgctgat ccatctaaag tcctacgccc gactactagg 1320

aaatcgaaaa gcaatacggc tattattgca ggcgcagcca gtggtgcagt tgttctggcc 1380

cttatcattg ggttttgtgt gtttggtgct taccgcagac gtaagcgtgg tgattaccag 1440

cctgctagtg atgcaacatc agggtggctt ccactatctc tgtatggaaa ctcacattct 1500

gctggctcgg cgaagacaaa cacaacagga agttatgcct cgtcccttcc gtcaaatctt 1560

tgccgtcact tctcgtttgc tgagatcaaa gctgccacta aaaactttga tgagtcccgg 1620

gtgcttggtg ttggtggttt cggcaaggtt tacagaggag agattgatgg cggaactaca 1680

aaggtagcca tcaagagagg caacccaatg tccgagcaag gtgtacatga gttccagact 1740

gagattgaaa tgctttcaaa gcttagacat cgtcatcttg tgtccttgat tggatactgt 1800

gaagagaact gcgaaatgat cttagtctat gattacatgg ctcatggtac aatgagggag 1860

catctctaca aaacccagaa tccttctctt ccatggaagc aacgtcttga gatatgcatt 1920

ggagcagccc gaggtttaca ctatctacac actggtgcaa aacacacaat catccataga 1980

gatgtgaaga caacaaacat tctattggat gagaaatggg tggccaaggt ctctgatttt 2040

ggtctatcga agactggtcc tacactagac cacacacacg taagcacagt tgtgaaagga 2100

agtttcggtt atcttgaccc agagtatttc agacggcagc aactgactga gaaatccgat 2160

gtctactcct ttggcgttgt tctattcgaa gctctatgcg ctcgtccagc cttgaaccca 2220

acacttgcaa aggaacaagt gagcttagct gagtgggcac catactgcta caagaaaggc 2280

atgctagatc aaatcgttga tccctacctc aagggcaaga tcacaccaga atgcttcaaa 2340

aagtttgctg aaaccgcgat gaagtgtgtt ctagaccagg gcattgagag accatcaatg 2400

ggagatgttc tgtggaactt agaatttgcg ttgcagctcc aggaaagcgc agaagagaac 2460

ggaaaaggag tatgcggtga catggacatg gatgagatta agtacgatga tggaaactgt 2520

aaaggaaaga acgacaagag ttctgatgtg tatgaaggga atgtgacgga ctcgaggagc 2580

agtggaatag atatgagcat cggtggtagg agtttggcca gcgaagattc agatggactc 2640

actccaagtg ctgtgttttc tcagatcatg aatccaaagg gacgttag 2688

Claims (10)

1.一种基因FERONIA的应用，其特征在于，所述的基因FERONIA参与植物响应氨基酸中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因FERONIA在参与利用氨基酸调控植物生长中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，基因FERONIA在植物缺无机氮状态下，参与利用氨基酸调控植物生长中的应用。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，调控植物生长包括：氨基酸与基因FERONIA一起作用促进植物生长，尤其是增加植物鲜重和/或叶绿素含量。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，氨基酸包括：精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸以及甘氨酸中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，培养基中氨基酸浓度范围0.5-3.5mM，优选2-3mM，进一步优选3mM。

7.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，调控植物生长包括：氨基酸与基因FERONIA一起作用调控植物主根的生长，尤其是增强根长抑制率。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，氨基酸包括：天冬氨酸、谷氨酰胺以及甘氨酸中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，培养基中氨基酸浓度范围0.5-1mM，优选0.5-0.8mM，进一步优选0.5mM。

10.根据权利要求1-9任一项所述的应用，其特征在于，基因FERONIA来源于拟南芥；所述的植物包括：拟南芥。

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