CN113583097A

CN113583097A - CtRALF蛋白质、CtRALF基因、引物、原核表达载体及其应用

Info

Publication number: CN113583097A
Application number: CN202110570177.5A
Authority: CN
Inventors: 廖红东; 李鑫; 张纯; 梁秀辉; 郑井元; 文湘钰; 吴永红; 邓雪蕾; 王俊莹; 杨怡
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-05-25
Also published as: CN113583097B

Abstract

本发明公开了CtRALF蛋白质的氨基酸序列、CtRALF基因的核苷酸序列、扩增CtRALF基因的引物、原核表达载体及其应用。本发明的CtRALF蛋白质能调控炭疽菌的定植能力；调控寄主植物的共生信号；调控寄主植物在低磷条件下的生长。本发明对研究炭疽菌定植机制及其与寄主植物共生具有重大价值；其CtRALF蛋白质能够被植物受体蛋白FERONIA响应，从而抑制植物的免疫反应；编码CtRALF蛋白质的CtRALF基因作为与植物共生的靶标基因，调控着植物的生长并缓解磷饥饿。

Description

CtRALF蛋白质、CtRALF基因、引物、原核表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及CtRALF蛋白质、CtRALF基因、引物、原核表达载体及其应用。

背景技术

植物类受体激酶(RLKs)属于重要的受体家族，可响应植物内部信号和外部微生物效应蛋白。在拟南芥(Arabidopsis)中已鉴定出600多种RLKs。RLKs通过与各种配体和效应蛋白相互作用而广泛参与植物的生长、发育和免疫反应。内生效应蛋白与植物RLKs之间的相互作用可能是控制内生菌定植和建立共生关系的关键。例如，宿主植物的Lysin-motif(LysM)-RLKs 可以识别由丛枝菌根分泌的Myc-LCOs和Myc-Cos以促进共生。苜蓿分泌的壳寡糖和脂壳寡糖可与宿主植物RLK MtCERK1和LYR4相互作用，以提高苜蓿定植。

FERONIA(FER)是一种与植物生长和免疫有关的RLKs，可与多种植物配体-快速碱化因子(RALFs)结合，发挥多种功能。RALF也因其在细胞生长和应激反应调节中的多种功能而闻名。RALF与植物受体FER相互作用后，可以参与根毛伸长，细胞壁压力，激素信号串扰，营养代谢，植物免疫防御如活性氧(ROS)爆发，和稳定茉莉酸(JA)信号途径的的调节因子 MYC2等过程。最近的研究表明，模拟RALF配体与植物受体相互作用可能在植物-微生物定植过程中起关键作用，例如影响白粉病、丁香假单胞菌和尖孢镰刀菌的入侵以及线虫寄生。通过模拟RALF配体与FER的相互作用来平衡内生植物的生长并使植物保持健康可能是一种很好的策略。

炭疽菌(Colletotrichum sp.)是引起寄主植物炭疽病的破坏性病原体，有600多种，已有研究证明从健康植物中分离出一些内生炭疽菌。炭疽菌(Colletotrichumtofieldiae，Ct)是一种寄生在拟南芥根部的丝状内生真菌，属于子囊菌类，Ct能明显促进植物生长，缓解拟南芥的磷酸盐饥饿。

内生真菌(Endophytic fungi)在其生活史的某个阶段或所有阶段都生活在健康植物的细胞间隙或细胞内，对所寄生的植物不会引起明显的疾病症状，与植物建立起良好的共生关系。在共生关系过程中，内生真菌与寄主植物之间进行物质交换，内生真菌可以向植物提供必要的养分、生长激素或代谢产物，为了完成这些交换，多种真菌效应蛋白被分泌到寄主植物中。这些内生真菌效应蛋白可以被多种寄主植物受体直接或间接识别，从而与这些受体结合或寡聚，并触发下游信号，最终逃避寄主植物防御系统并改善内生真菌定植。尽管效应蛋白能够改善病原体入侵是众所周知的，但内生菌效应蛋白对共生关系建立的分子机制仍然是模糊的、有限的。而鉴定新型内生菌效应蛋白及其相应的受体将帮助理解内生菌和寄主防御中的分子机制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：如何阐述内生菌效应蛋白对共生关系建立的分子机制，本发明提供一种CtRALF蛋白质、CtRALF编码基因、引物、原核表达载体及其应用，该蛋白质及其编码基因可改善内生菌在寄主植物中的定植，为进一步理解内生菌和寄主防御中的分子相互作用模式奠定基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

CtRALF蛋白质，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO:1所示。

一种编码CtRALF蛋白质的CtRALF基因，所述CtRALF基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示，其中，所述SEQ ID NO:2的核酸分子编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质。

一对扩增CtRALF基因的引物，引物包括正向引物Hmt-CtRALF-F和反向引物 Hmt-CtRALF-R，所述正向引物Hmt-CtRALF-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示，所述反向引物Hmt-CtRALF-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示。

编码所述CtRALF蛋白质的核酸分子为最基础的基因，命名为CtRALF基因；CtRALF基因编码的蛋白质命名为CtRALF蛋白。

一种含有CtRALF基因的原核表达载体。

本发明还提供了一种CtRALF蛋白质的应用，为如下c1)至c3)中的至少一种：c1)调控炭疽菌的定植能力；c2)调控寄主植物的免疫反应；c3)调控寄主植物在低磷条件下的生长。

所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述炭疽菌具体为炭疽菌属。

本发明还提供了一种与所述CtRALF蛋白质相互作用的蛋白质FERONIA的应用，为如下d1)至d3)中的至少一种：d1)调控炭疽菌的定植能力；d2)调控寄主植物的免疫反应；d3)调控寄主植物在低磷条件下的生长。

有益效果：本发明提供了CtRALF蛋白质的氨基酸序列及其对应的CtRALF基因的核苷酸序列，该CtRALF蛋白质具有典型的RALF蛋白功能结构域，具有与植物RALF蛋白相同的生物活性，且能够被植物受体蛋白FERONIA(FER)所响应，从而抑制植物的免疫反应，促进内生炭疽菌的定植，缓解磷饥饿；编码CtRALF蛋白质的CtRALF基因可作为与植物共生的靶标基因，促进内生炭疽菌的定植，调控植物的生长并缓解磷饥饿；本发明对研究内生菌与寄主植物共生的分子作用模式具有重大价值。

附图说明

图1为炭疽菌的定植受到FERONIA(FER)的影响并影响植物生长检测图。

图2为CtRALF蛋白质核心结构域的对比分析图。

图3为CtRALF蛋白质的功能活性检测图。

图4为CtRALF蛋白质调节植物共生信号促进炭疽菌定植检测图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1炭疽菌的定植受到FERONIA(FER)的影响并影响植物生长

通过前期研究积累，Hiruma，K.，Gerlach，N.，Sacristan，S.，Nakano，R.T.，Hacquard， S.，Kracher，B.，Neumann，U.，Ramirez，D.，Bucher，M.，OConnell，R.J.，andSchulze-Lefert，P.(2016).Root endophyte Colletotrichum tofieldiae confersplant fitness benefits that are phosphate status dependent.Cell 165:464-474阐述了炭疽菌能在低磷条件下促进植物生长，但是在磷充足的条件下不能促进植物生长。

本实验用到FERONIA缺失突变体fer-4(Col-0背景)，srn(C24背景)，可表达胞质绿色荧光GFP的Ct(Ct-GFP)。收集200μL的Ct-GFP菌悬液(约10⁸孢子/mL)与500μL 1/2MS液体培养基(pH 5.8)混合，处理Col-0/fer-4、C24/srn植株。取处理3天后的Col-0/fer-4、C24/srn 植株，在蔡司共聚焦激光扫描显微镜激发波长488nm下捕获图像，进行可视化分析。用Image J处理图片，并进行菌丝荧光灰度分析以表明菌丝体定植程度。

用含Ct菌丝的1/2MS固体培养基培养5天大小的Col-0和fer-4植株，生长在不含Ct菌丝的1/2MS固体培养基上的Col-0和fer-4植株做对照，处理10天后进行拍照、测量和称重。

fer-4和srn对Ct定植的影响如图2所示，其中图1A、B为Ct-GFP处理3天后Col-0和fer-4幼苗的根，结果显示Col-0根上Ct-GFP菌丝的定植明显超过fer-4。图1C为对图1A、B的菌丝荧光灰度分析分析，其中**代表p-value值小于0.01、*代表p-value值小于0.05。图1D、E为Ct-GFP处理3天后C24和srn幼苗的根，结果显示C24根上Ct-GFP菌丝的定植明显超过srn，图1F为图1D、E的菌丝荧光灰度分析。图1G、I为用含Ct菌丝的1/2MS固体培养基培养Col-0和fer-4植株实验，相比对照组(1/2MS不含Ct菌丝)，经过Ct处理后，实验组Col-0的根长明显增加，而fer-4的根长没有明显变化，图1H、J是对图1G、I的根长和鲜重测定。通过Ct-GFP定植实验可知：FER突变会降低Ct的定植；且Ct在低磷条件下不能改善FER敲除突变体的生长，这表明FER介导的信号途径参与了Ct的定植过程，以改善低磷条件下寄主植物的根生长。

实施例2CtRALF蛋白质的蛋白活性检测

基于原核表达蛋白技术，构建CtRALF和AtRALF1基因的原核表达载体，用体外纯化的方式合成2种蛋白，进行体外活性检测(包括植物根长抑制实验，植物体外pH检测实验，和 GST pull-down实验)。具体操作步骤如下：

PCR克隆：PCR反应扩增CtRALF基因片段。PCR反应体系(50μL)：2×buffer 25μL，ddH20 19μL，10μm/L Primer F 1μL，10μm/L Primer R 1μL，Ct-cDNA 1μL，10mM dNTP 2μL，Hifi Taqase(100U)1μL；PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30 s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃继续延伸10min，完成后将PCR产物保存在4℃。PCR 产物回收：将上述PCR产物进行胶回收，4℃保存。对CtRALF基因进行PCR扩增的引物为正向引物Hmt-CtRALF-F和反向引物Hmt-CtRALF-R，引物序列如表1所示：

表1 PCR扩增引物表

引物名称	序列5’-3’
		Hmt-CtRALF-F	TGCATATGATGAAGTACTCCATTCTTGTTACTGC
Hmt-CtRALF-R	CGCTCGAGTTGAAAATTACTGCAACCCAATG
		Hmt-AtRALF1-F	TTCATATGGCGACCACAAAATACATAAGCT
Hmt-AtRALF1-R	CGCGGATCCCTAACTCCTGCAACGAGCAATTT

原核表达载体构建：利用XholⅠ和BamH I对pET-28a载体进行双酶切，并回收载体片段，将CtRALF片段与回收后的载体片段预混，利用同源重组的方法进行连接，转入感受态Top10菌株中，涂LB平板(含有50mg/L Kan)，37℃过夜培养后，即可获得单菌落，菌落 PCR鉴定获得阳性转化子后，37℃摇菌过夜，提取质粒，并测序。所得阳性质粒转入BL21 感受态细胞。所得携有原核表达重组质粒的BL21菌种加入0.5mM IPTG诱导，28℃，4h。诱导后菌体经超声破碎，用Ni-NTA琼脂糖树脂吸附纯化，纯化后蛋白储存于-20℃。

根据文献(Haruta et al.2014.A peptide hormone and its receptor proteinkinase regulate plant cell expansion.Science 343:408-411.)的方法，检测炭疽菌RALF蛋白质对拟南芥根长的抑制情况；根据文献(Masachis et al.2016.A fungalpathogen secretes plant alkalinizing peptides to increaseinfection.Nat.Microbiol 1:16043.)检测炭疽菌RALF蛋白质对体外酸碱值的变化；根据文献(Xiao，Y.，et al.2019.Mechanisms of RALF peptide perception by aheterotypic receptor complex.Nature，1.)检测炭疽菌RALF蛋白质与植物受体蛋白FER的体外结合情况。

内生炭疽菌的CtRALF蛋白质与典型的拟南芥AtRALF1核心结构域的对比分析图如图2 所示，通过生物信息学手段，推断基因CtRALF所编码蛋白具有典型的RALF功能结构域，分别为YISY结构域和四个半胱氨酸残基；CtRALF蛋白质的功能活性检测结果如图3所示，其中图3A为CtRALF蛋白质和AtRALF1蛋白质处理拟南芥幼苗，相比对照组Mock(不用 RALF处理)，用CtRALF蛋白质和AtRALF1蛋白质处理的拟南芥Col-0根长受到抑制，但fer-4 根长无明显变化，图3B为图A的统计学分析，其中**代表p-value值小于0.01。图3C为不同RALF处理下拟南芥幼苗胞外酸碱显色反应，用AtRALF1蛋白质和CtRALF蛋白质处理后的Col-0在含pH指示剂的固体培养基上均会发生变色，培养基本身是黄色，颜色越蓝，说明 pH值越大，呈碱性。图3D为不同RALF蛋白质处理下拟南芥幼苗培养基酸碱变化，且随着 RALF蛋白质处理时间的增加，AtRALF1蛋白质和CtRALF蛋白质处理的液体培养基pH值逐渐升高。图3E-3G为验证CtRALF蛋白质与FER蛋白质的相互作用实验，CtRALF会和 AtRALF1一样与FER发生结合。图3E为体外GST pull-down结合实验，证明了CtRALF可与FER在体外直接互作。图3F为竞争性结合实验，验证了CtRALF蛋白质与FER蛋白质的相互作用是真实可靠的。图3G为体内Co-IP实验，证明了CtRALF蛋白质可与FER蛋白质在体内互作。

实施例3CtRALF蛋白质调节植物共生信号促进炭疽菌定植

内生菌丝的定植与共生信号息息相关，为了探究CtRALF蛋白质是否影响植物共生信号，我们通过测定ROS信号、钙信号、MAPK磷酸化、JA调控因子MYC2稳定性来判断CtRALF蛋白质在共生信号中的功能。

图4A为CtRALF蛋白质和AtRALF1蛋白质对植物ROS的影响，CtRALF蛋白质和AtRALF1蛋白质一样，可以抑制活性氧的爆发。图4B为为CtRALF蛋白质和AtRALF1蛋白质对植物钙信号迸发的影响，CtRALF和AtRALF1都可以在短时间内引起钙信号波动。无论是活性氧还是钙信号，CtRALF蛋白质影响的程度要比AtRALF蛋白质轻。

图4C为CtRALF蛋白质在Ct侵染拟南芥Col-0和FER突变体fer-4的表达量。通过提取附着在植物根部Ct菌丝cDNA和生长在培养基上的Ct菌丝cDNA，通过定量PCR检测两个样本中CtRALF蛋白质的表达量，定量引物见表2；结果显示，Ct侵染野生型Col-0时CtRALF 表达量比侵染fer-4和未侵染植物时的表达量高。

表2 PCR扩增引物表

引物名称	序列5’-3’
		Ct-q-actin-F	CTCGTTATCGACAATGGTTC
Ct-q-actin-R	GAGTCCTTCTGGCCCATAC
		CtRALF-q-F	GCAACCCTGGAGGTGGTAAA
CtRALF-q-R	CTACAGCTCGGCTCATGTGT

图4D和图4F为CtRALF蛋白质对Col-0和fer-4中的MAPK磷酸化的影响。MAPK磷酸化实验结果证明了，随着CtRALF蛋白质处理时间的延长，野生型Col-0中的MAPK磷酸化逐渐增强，FER突变体fer-4中的MAPK磷酸化则没有显著变化。其显著性分析经过Image J软件进行灰度分析后再进行显著差异分析而得。图4E和图4G为CtRALF蛋白质对Col-0 和fer-4中的MYC2蛋白稳定的影响。茉莉酸信号途径中MYC2因子起重要作用，如图所示，随着RALF处理时间的延长，野生型Col-0中的MYC2蛋白稳定性逐渐降低，FER突变体fer-4 中的MYC2稳定并没有明显变化。其显著性分析方法如MAPK磷酸化分析一致。

为了进一步证实CtRALF蛋白质可以通过FER促进Ct的定植，用CtRALF蛋白质处理Ct对Col-0和fer-4的定植实验，结果如图4H、I所示：其中图4H为CtRALF蛋白质处理3 天后Ct在Col-0和fer-4根部的定植情况，结果显示，经CtRALF蛋白质处理后，附着于Col-0 根部的Ct菌丝相比较未处理(Mock)增加，fer-4根部的菌丝在CtRALF蛋白质处理前后没有明显变化；图4I是对图4H菌丝荧光灰度分析，其中**代表p-value值小于0.01。综上，说明CtRALF蛋白质可以调节寄主植物的共生信号并通过FER信号通路促进内生菌丝的定植，。

综上所述，CtRALF蛋白质能够被植物受体蛋白FERONIA(FER)所响应，从而抑制植物的免疫反应，促进内生炭疽菌的定植，缓解磷饥饿，调控寄主植物的共生信号，调控寄主植物在低磷条件下的生长。

序列表

<110> 湖南大学

<120> CtRALF蛋白质、CtRALF基因、引物、原核表达载体及其应用

<141> 2021-05-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 86

<212> PRT

<213> Colletotrichum sp.

<400> 1

Met Leu Ala Thr Thr Ser Ala Ile Pro Ser Arg Lys Val Ile Ser Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Leu Gly Ala Asn Arg Ile Pro Gly Cys Asp Gly Lys Asn Lys

20 25 30

Lys Asn Cys Asn Pro Gly Gly Gly Lys Pro Ala Asn Pro Tyr Thr Arg

35 40 45

Gly Cys Ser Ala Ile Asp Arg Cys Arg Thr Asp Gly Ile Arg Gly Arg

50 55 60

Asp Val Val Val Glu Val Arg Ala Thr Glu Glu Glu Glu His Met Ser

65 70 75 80

Arg Ala Val Val Glu Met

85

<210> 2

<211> 261

<212> DNA

<213> Colletotrichum sp.

<400> 2

atgctagcta cgacatctgc gattccttcc cgcaaggtaa tcagctacga agcacttggt 60

gctaacagga ttcctggatg cgatgggaaa aacaagaaga actgcaaccc tggaggtggt 120

aaacccgcga atccctacac ccgtggctgt agtgctatcg atagatgtcg taccgacggc 180

atcagaggcc gagatgtggt ggtcgaggtt cgggctactg aggaggagga acacatgagc 240

cgagctgtag ttgaaatgta g 261

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tgcatatgat gaagtactcc attcttgtta ctgc 34

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cgctcgagtt gaaaattact gcaacccaat g 31

Claims

1.CtRALF蛋白质，其特征在于，所述CtRALF蛋白质的氨基酸序列是序列表中SEQ IDNO:1所示。

2.一种编码如权利要求1所述CtRALF蛋白质的CtRALF基因，其特征在于，所述CtRALF基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示。

3.扩增如权利要求2所述CtRALF基因的引物，其特征在于，所述引物包括正向引物Hmt-CtRALF-F和反向引物Hmt-CtRALF-R，所述正向引物Hmt-CtRALF-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示，所述反向引物Hmt-CtRALF-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示。

4.含有如权利要求2所述CtRALF基因的原核表达载体。

5.根据权利要求4所述的原核表达载体，其特征在于，所述原核表达载体的构建方法为：利用限制性内切酶XholⅠ和BamH I对pET-28a载体进行双酶切，并回收载体片段，将CtRALF片段与回收后载体片段预混，利用同源重组的方法进行连接，转入感受态Top10菌株中，涂LB平板，LB平板含有50mg/L Kan，37℃过夜培养后，即可获得单菌落，菌落PCR鉴定获得阳性转化子后，37℃摇菌过夜，提取质粒，所述质粒为所述原核表达载体。

6.一种如权利要求1所述CtRALF蛋白质的应用，其特征在于，所述应用为如下c1)至c3)中的至少一种：c1)调控炭疽菌的定植能力；c2)调控寄主植物的共生信号；c3)调控寄主植物在低磷条件下的生长。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用中植物为单子叶植物或双子叶植物；所述炭疽菌为炭疽菌属。