CN103923972A - 一种刺参科17种经济海参基于coi基因的pcr-rflp鉴别方法 - Google Patents

一种刺参科17种经济海参基于coi基因的pcr-rflp鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法。它包括a、以待检测刺参科海参作为检测样品，提取其DNA，以其作为模板，利用引物COIe-F:5`-ATA ATGATAGGAGGRTTTGG-3`，COIe-R:5`-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3`PCR扩增出CO I片段，所述的R为A/G；b、用限制性内切酶组合DdeI/SfcI或BstNI/Sau3AI对COI片段进行酶切，酶切产物进行电泳，估算待检测样品各电泳条带大小，将电泳图中的电泳条带数量及条带大小的估算值与17种海参的标准带谱进行对比，查找到电泳条带数量及大小均与标准谱带匹配的，该标准谱带所代表的种类即为被检测样品的种类。本发明适用范围广，操作简单，检测准确、快速，尤其适用于大批量商品海参的鉴定，从而为刺参科海参样品的鉴定提供科学方法，为规范海参商品市场和保护海参资源提供技术支持。

Description

一种刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种简便的海参种类分子鉴定方法，具体涉及一种刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法。
背景技术：
海参具有较高的营养价值和药用价值，在我国被认为是传统的美味和滋补品，位列“八珍”之一。全球记录的海参种类有1400多种，而可供食用的海参种类约50多种，主要是海参科（Holothuriidae）和刺参科（Stichopodidae）种类。与海参科种类相比，刺参科海参背面有较大疣足，骨片多为桌形体，无扣状体，但有C形体或双分枝杆状体，或简单颗粒体。作为名贵的海产品，海参在市场上通常加工为干品或冻品出售，海参经过多道工序加工成干品后，很难从外部形体上分辨出其种类。目前在市面上销售的海参产品,大多根据其颜色和产地来命名贴标，如“美国红参”、“非洲海参”等，缺乏规范的商品命名，海参市场贴标混乱。因此，非常有必要开发出准确区分和鉴定海参种类的方法。
线粒体DNACOI序列被广泛应用在海参系统进化和种类鉴定的研究中，COIPCR-RFLP是一种操作简单、快捷的种类鉴别方法，目前该方法在海参种类鉴定中应用较少，缺乏系统研究。
发明内容：
本发明的目的是提供一种适用范围广，操作简单，对仪器设备要求低，检测准确、快速，尤其适用于大批量商品海参鉴定的刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法。
本发明的刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、以待检测刺参科海参作为检测样品，提取其DNA，然后以其作为模板，利用引物COIe-F:5`-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3`，COIe-R:5`-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3`PCR扩增出COI片段，所述的R为A/G；
b、用限制性内切酶组合DdeI/SfcI或BstNI/Sau3AI对COI片段进行酶切，酶切产物进行电泳，估算待检测样品各电泳条带大小，将电泳图中的电泳条带数量及条带大小的估算值与下表所示17种海参的标准带谱进行对比，查找到电泳条带数量及大小均与标准谱带匹配的，
该标准谱带所代表的种类即为被检测样品的种类：
所述的步骤a的PCR扩增出COI片段优选为：PCR反应体积为50μL，包含37.6μL无菌水，5μL10×PCRBuffer，1μL10uMCOIe-F引物，1μL10uMCOIe-R引物，4μL2.5mMdNTPmixture，0.4μL5U/μLTaqTM酶，1μLDNA模板；PCR反应条件为，先94℃预变性2分钟，而后94℃变性30秒，48℃复性30秒和72℃延伸45秒，共35个循环，最后72℃延伸7分钟,得COI片段。
所述的步骤b的用限制性内切酶组合DdeI/SfcI或BstNI/Sau3AI对COI片段进行酶切具体优选为：限制性内切酶DdeI/SfcI酶切反应体积为20μL，包含2μL10×buffer，SfcI和DdeI各3U，16μLCOI片段，余量为水，反应条件为37℃温浴2个小时；限制性内切酶BstNI/Sau3AI酶切反应体积为20μL，包含2μL10×buffer，BstNI和Sau3AI各4U，16μLCOI片段，余量为水，反应条件为先37℃温浴1个小时，随后60℃温浴1个小时。
本发明首次建立了刺参科17种经济海参的COIPCR-RFLP鉴定方法，它适用范围广，操作简单，对仪器设备要求低，检测准确、快速，尤其适用于大批量商品海参的鉴定，从而为刺参科海参样品的鉴定提供科学方法，为规范海参商品市场和保护海参资源提供技术支持。
附图说明：
图1是本发明的实施例1、2和3中海参COI片段的PCR-RFLP琼脂糖凝胶电泳图及各电泳片段估算值。图1a中泳道1、2、3分别为仿刺参、花刺参和糙刺参COI片段DdeI/SfcI的酶切电泳图，图1b中泳道1、2、3分别为仿刺参、花刺参和糙刺参COI片段BstNI/Sau3AI的酶切电泳图；M：50bpDNALadder(1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、450bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp)。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，不是对本发明的限制。
实施例1：仿刺参样品PCR-RFLP鉴定
a.仿刺参样品COI片段的PCR扩增：
常规方法提取仿刺参样品的DNA，然后以其作为模板PCR扩增COI片段，PCR扩增反应体积为50μL，取200μLPCR管置冰浴中，依次添加37.6μL无菌水，5μL10×PCRBuffer（包括15mMMg2+），1μL10uMCOIe-F引物，1μL10uMCOIe-R引物，4μL2.5mMdNTPmixture，0.4μL5U/μLTaKaRaTaqTM酶，1μL仿刺参样品DNA模板；采用ABIVeriti96孔热循环仪扩增，反应条件为先94℃预变性2分钟，而后94℃变性30秒、48℃复性30秒、72℃延伸45秒，共35个循环，最后72℃延伸7分钟。COIe-F引物序列为5`-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3`，COIe-R引物序列为5`-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3`，所述的R为A/G。由此得到PCR产物，即为仿刺参的COI片段。
b.仿刺参样品PCR产物（仿刺参的COI片段）的酶切：
限制性内切酶DdeI/SfcI（NEB公司）酶切反应，反应体积为20μL，取500μL离心管置冰浴中，依次添加1.4μL无菌水，2μL10×buffer，0.3μL10U/μLSfcI，0.3μL10U/μLDdeI，16μLCOI片段；反应条件为放置在金属浴上37℃温浴2个小时。限制性内切酶BstNI/Sau3AI（NEB公司）酶切反应，体积为20μL，取500μL离心管置冰浴中，依次添加0.6μL无菌水，2μL10×buffer，0.4μL10U/μLBstNI，1.0μL4U/μLSau3AI，16μLCOI片段；反应条件为放置在金属浴上先37℃温浴1个小时，随后60℃温浴1个小时。由此得到酶切反应液。
c.酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测：
琼脂糖凝胶电泳检测中，先制备2.5%琼脂糖凝胶；待胶凝固后，将胶置电泳槽（DYCP-31DN型，六一公司）中，注入0.5×TBE缓冲液淹没胶孔，胶孔中加入10μL酶切反应液与1.5μL上样缓冲液混合液，在相邻胶孔加入7.5μL50bpDNALadder（TaKaRa公司）；电泳时，电压为90V，电泳时间为1.5小时。
d.检测结果的判定
电泳结束后，凝胶成像系统（Bio-Rad公司）下拍照，获得仿刺参样品COI片段两组内切酶DdeI/SfcI和BstNI/Sau3AI的酶切电泳图（见图1）。添加的50bpDNALadder设定为分子量标准。采用Quantityone软件估算被检测样品各电泳条带的片段大小。将电泳条带数量及估算值与表1中各标准带谱进行对比，各电泳条带估算值与标准带谱中对应片段预测值相差不超过10bp，查找到条带数量及大小均与标准谱带匹配的，该标准谱带所代表的种类即为被检测样品的种类。Quantityone软件估算得到：①DdeI/SfcI双酶切下的3条带估算值，分别为251.39bp、126.42bp和69.26bp；②BstNI/Sau3AI双酶切下的4条带估算值，分别为209.80bp、188.29bp、149.24bp和114.67bp。与表1比对，与仿刺参条带数目相同，且每个电泳条带的估算值与标准带谱中对应的片段大小相匹配，因此可以判定待鉴定样品为仿刺参。
表1：刺参科17种海参COI扩增片段的酶切带谱数据（70bp以下片段不计）
实施例2：花刺参样品PCR-RFLP鉴定
步骤a-c同实施例1，只是以花刺参作为样品。
d.检测结果的判定
电泳结束后，凝胶成像系统（Bio-Rad公司）下拍照，获得花刺参样品COI片段两组内切酶DdeI/SfcI和BstNI/Sau3AI的酶切电泳图（见图1）；添加的50bpDNALadder设定为分子量标准，Quantityone软件估算得到：①DdeI/SfcI双酶切下的4条带估算值，为254.18bp、194.10bp、124.82bp和75.26bp；②BstNI/Sau3AI双酶切下的3条带估算值，为316.33bp、212.04bp和161.56bp。与表1比对，与花刺参条带数目相同，且每个电泳条带的估算值与标准带谱中对应的片段大小相匹配，因此可以判定待鉴定样品为花刺参。
实施例3：糙刺参样品PCR-RFLP鉴定
步骤a-c同实施例1，只是以糙刺参作为样品。
d.检测结果的判定
电泳结束后，凝胶成像系统（Bio-Rad公司）下拍照，获得糙刺参样品COI片段两组内切酶DdeI/SfcI和BstNI/Sau3AI的酶切电泳图（见图1）；添加的50bpDNALadder设定为分子量标准，Quantityone软件估算得到：①DdeI/SfcI双酶切下的3条带估算值，为254.18bp、194.10bp和123.25bp；②BstNI/Sau3AI双酶切下的3条带估算值，为319.39bp、206.48bp和160.07bp。与表1比对，与糙刺参条带数目相同，且每个电泳条带的估算值与标准带谱中对应的片段大小相匹配，因此可以判定待鉴定样品为糙刺参。

Claims (3)

1.一种刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法，其特征在于，包括以下 
步骤： 
a、以待检测刺参科海参作为检测样品，提取其DNA，然后以其作为模板，利用引物COIe-F:5`-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3`，COIe-R:5`-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3`PCR扩增出COI片段，所述的R为A/G； 
b、用限制性内切酶组合DdeI/SfcI或BstNI/Sau3AI对COI片段进行酶切，酶切产物进行电泳，估算待检测样品各电泳条带大小，将电泳图中的电泳条带数量及条带大小的估算值与下表所示17种海参的标准带谱进行对比，查找到电泳条带数量及大小均与标准谱带匹配的， 
该标准谱带所代表的种类即为被检测样品的种类： 
2.根据权利要求1所述的刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法，其特征在于，所述的步骤a的PCR扩增出COI片段为：PCR反应体积为50μL，包含37.6μL无菌水，5μL10×PCRBuffer，1μL10uMCOIe-F引物，1μL10uMCOIe-R引物，4μL2.5mMdNTPmixture，0.4μL5U/μLTaqTM酶，1μLDNA模板；PCR反应条件为，先94℃预变性2分钟，而后94℃变性30秒，48℃复性30秒和72℃延伸45秒，共35个循环，最后72℃延伸7分钟,得COI片段。 
3.根据权利要求1所述的刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法，其特征在于，所述的步骤b的用限制性内切酶组合DdeI/SfcI或BstNI/Sau3AI对COI片段进行酶切具体为：限制性内切酶DdeI/SfcI酶切反应体积为20μL，包含2μL10×buffer，SfcI 和DdeI各3U，16μLCOI片段，余量为水，反应条件为37℃温浴2个小时；限制性内切酶BstNI/Sau3AI酶切反应体积为20μL，包含2μL10×buffer，BstNI和Sau3AI各4U，16μLCOI片段，余量为水，反应条件为先37℃温浴1个小时，随后60℃温浴1个小时。 
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