CN105925676A - 一种鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法 - Google Patents

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钟其顶
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Abstract

本发明公开了一种鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法，特别是一种应用微条形码技术鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法，主要包括如下步骤：a)：称取一定质量的三文鱼罐头样品，提取DNA；b)：以a)中得到的DNA为模板，利用微条形码引物扩增出212bp的DNA片段；c)：将b)中扩增得到的片段进行测序，与已有DNA数据库进行序列特征比对，得到三文鱼品种信息。本发明建立了一种应用微条形码技术鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法，对提高我国罐头工业产品质量安全水平，规范行业发展，保护消费者合法权益和知情权具有十分重要的现实意义。

Description

一种鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法
技术领域
一种鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法，特别是一种应用微条形码技术鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法，属食品真实性鉴别技术领域。
背景技术
三文鱼，是鲑鳟科鱼类的总称，食用性名贵鱼类，主要分布于高纬度地区的冷水鱼类，由于其含有丰富蛋白质和人体所需的脂肪酸，健康绿色无污染，营养价值较高，深受大众的喜爱。鲑科鱼包括3亚科7属36种，主要为鲑亚科(Salmoniae)，白鲑亚科(Coregoninae)和茴鱼亚科(Thymallidae)。食品法典委员会CAC(CODEX STAN 3-1981)《三文鱼罐头》中规定，大西洋鲑鱼(Salmosalar)、红大麻哈鱼(Oncorhynchusnerka)、银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)、鲑鱼(Oncorhynchustschawytscha)、驼背大马哈鱼(Oncorhynchus gorbuscha)大马哈鱼(Oncorhynchus keta)、虹鳟(Oncorhynchus masou)7种鱼类均可以加工成三文鱼罐头。
鱼类制品原料品种鉴别成为水产加工行业中面临的重要问题之一，目前国内外市场上三文鱼以次充好、假冒的现象时有发生，损害了消费者的合法权益和知情权。例如，据统计国内挪威三文鱼每公斤市场价高达240元，虹鳟鱼的市场价格每公斤60元左右，三文鱼罐头食品标签中仅标注原料为三文鱼，并不标注出三文鱼的具体品种。
对于加工肉制品中原料品种鉴别技术，目前常基于对肉制品中特定理化成分的分析，如蛋白质、脂肪酸等，采用色谱、光谱、电泳等方法识别，这些方法适用于加工程度相对较低的肉制品，如火腿肠、肉干、肉脯等，对于三文鱼罐头食品，与一般加工肉类食品不同，其在制作过程中须经过长时间的高温杀菌处理，一般在118～121℃下处理20～90min，这给鱼罐头食品中所用原料的品种鉴别带来了困难。
细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)是线粒体内呼吸链电子传递的终末复合物,是线粒体氧化能力的关键调节物质。细胞色素C氧化酶亚基I(COⅠ)是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3个亚基之一。COXⅠ在生物的系统分类以及种类鉴定方面有着广泛、重要的作用。刘君等人报道了基于线粒体CO I的DNA条形码技术在贻贝科种类鉴定中的应用(水生生物学报,2011,35(5):874-88)；梁华芳等人报道了利用COI基因序列对中国沿海龙虾属8种龙虾进行分子系统学研究(2011)；王敏晓等人基于线粒体cox1片段序列对对胶州湾浮游动物进行了DNA条形码分析(2011)；李新光报道了基于COI的DNA条形码的鱼片(肉)真伪鉴别技术研究(2013)。
在鱼类物种鉴别中，DNA条形码技术是以一段650bp细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因序列作为标准序列，从而实现鱼类的快速鉴别。但是对于DNA降解严重的鱼类罐头，DNA条形码技术可能不能够扩增出650bp的目的片段，从而导致无法对鱼类品种进行有效鉴别。
为了提高我国鱼类罐头(尤其是三文鱼类罐头)工业产品质量安全水平，规范行业发展，保护消费者合法权益和知情权，急需能鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法。这对于消费者而言，将具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明的主要目的是针对三文鱼罐头食品原料标示模糊，现有鉴别分析技术无法准确鉴别其原料品种的问题，开发一种应用微条形码技术鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法。
本发明的发明人通过优化三文鱼罐头中DNA提取方法，得到适用于PCR扩增的DNA模板，以细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因部分序列为目的片段，设计引物扩增出DNA片段(例如长度212bp大小)，进行序列测定，与国际通用DNA数据库，如Genbank中的已有的三文鱼COI基因序列比对，确定罐头样品中的三文鱼品种。
一方面，本发明提供了一种应用微条形码技术鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法，其包括如下步骤：
(1)从三文鱼罐头制品中提取DNA，以得到适于PCR扩增的DNA模板；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，对细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因部分序列进行PCR扩增，以扩增出DNA片段(优选为长度100-500bp，更优选150-250bp，最优选212bp大小)；
(3)对步骤(2)中扩增出的DNA片段进行测序并将所测得的DNA序列与已知的三文鱼品种的COI基因序列进行比对，并确定该三文鱼罐头中的三文鱼品种。
任选地，步骤(3)中的比对是通过将所测定的COI基因的部分序列与DNA数据库(如Genbank)中的已有的三文鱼COI基因序列比对。优先地，所述比对是通过B l ast比对。
在本发明中，DNA的提取可以通过如下步骤进行：
a)：称取一定量的三文鱼罐头样品，加入适量氯仿：甲醇：水混合溶液，室温静置过夜，离心，弃上清，并用无菌去离子水清洗样品；和
b)：在步骤a)中得到的样品中加入适量DNA提取液，提取三文鱼罐头中DNA。
在本发明中，扩增DNA片段所用的引物可以为三文鱼的细胞色素C氧化酶亚基I(CO I)基因的部分序列的通用引物对，例如，上游引物序列可为：TGTAAAACGACGGCCAGTTCCACTAATCACAARGATATTGGTAC；下游引物序列可为：CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC。
示例性地，所述PCR的扩增条件为：95℃预变性2mi n；95℃变性1mi n，46℃退火1mi n，72℃延伸30s，5个循环；95℃变性1mi n，53℃退火1mi n，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5mi n；反应体系为10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 0.2mmo l/L，上游引物0.8pmo l/L，下游引物0.8pmo l/L，DNA模板200ng，Taq酶1.5U，用ddH2O将总体积补充至25μL。
作为一个非限制性的实施方式，本发明的鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法包括如下步骤：
a)：称取一定质量的三文鱼罐头样品，加入适量氯仿：甲醇：水混合溶液，室温静置过夜，离心，弃上清，并用无菌去离子水清洗样品；
b)：在步骤a)中得到的样品中加入适量DNA提取液，提取三文鱼罐头中DNA；
c)：以步骤b)中得到的DNA为模板，以细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因部分序列为目的片段，采用微条形码引物扩增，得到片段大小为212bp的DNA片段，上游引物序列：TGTAAAACGACGGCCAGTTCCACTAATCACAARGATATTGGTAC，下游引物序列：CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC。
d)：PCR扩增条件为95℃预变性2min；95℃变性1min，46℃退火1min，72℃延伸30s，5个循环；95℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；反应体系为10×PCRbuffer 2.5μL，dNTP 0.2mmol/L，上游引物0.8pmol/L，下游引物0.8pmol/L，DNA模板200ng，Taq酶1.5U，用ddH2O将总体积补充至25μL。
e)：将步骤d)中扩增得到的DNA片段进行序列测定，并将序列在Genbank中进行Blast比对，确定三文鱼品种。
优选地，本发明所述的氯仿：甲醇：水混合溶液是氯仿：甲醇：水＝1:2:0.8(体积比)的混合液。
本发明针对罐头中DNA降解严重，PCR反应容易失败的情况，以COI部分序列(微条形码)作为目的片段，同时优化了三文鱼罐头中DNA的提取方法，能够准确可靠的得到三文鱼罐头中三文鱼的具体品种信息，其优点在于操作简便易行，操作流程易于实现标准化。
附图说明：
图1显示了4％CTAB提取液和2％CTAB提取液对DNA提取效果的影响。
图2是针对三文鱼罐头进行引物筛选以扩增分别是212bp、358bp和472bp的目的片段的结果，其中：图2A是212bp目的片段扩增结果；图2B是358bp目的片段扩增结果；以及图2C是472bp目的片段扩增结果。
具体实施方式：
为了更好的理解本发明，下面结合具体实例对本发明进一步说明。
实施例：
1.样品采集从市面采集不同加工方式的三文鱼罐头样品，如蒲烧、水浸、油浸等。
2.DNA提取
a)称取100mg三文鱼罐头肌肉组织样品于2mL离心管中，加入1mL氯仿：甲醇：水＝1:2:0.8(体积比)，室温静置过夜，5000rpm离心3min，弃上清，无菌去离子水清洗样品，样品组织于-40℃保存备用；
b)将步骤a)得到样品，无菌条件下剪碎后加入1mL DNA提取液，提取液组成为4％CTAB、100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA(pH 8.0)，置于65℃恒温水浴槽中，温育1-2h，期间不时颠倒混匀，直至样品完全消化；温育后，离心取上清液至一新的2mL离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇＝24:1(体积比)溶液缓慢震荡至乳白色，12000r/min离心10min；重复上述步骤一次；取上清液加2/3体积预冷的异丙醇沉淀DNA，-20℃，1h；离心弃上清液，加入800μL 70％乙醇进行洗涤两次，然后弃去乙醇，干燥，沉淀用50μL无菌ddH2O溶解，-20℃保存。
3.PCR扩增
采用微条形码引物对提取的DNA进行PCR扩增，上游引物序列：TGTAAAACGACGGCCAGTTCCACTAATCACAARGATATTGGTAC，下游引物序列：CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC，目的片段大小为212bp。
PCR扩增条件为95℃预变性2min；95℃变性1min，46℃退火1min，72℃延伸30s，5个循环；95℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；反应体系为10×PCRbuffer2.5μL，dNTP 0.2mmol/L，上游引物0.8pmol/L，下游引物0.8pmol/L，DNA模板200ng，Taq酶1.5U，用ddH2O将总体积补充至25μL。
4.将扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，并送往测序公司测序，运用NCBI的BLAST程序，把所有样品的PCR产物测序结果与GenBank数据库中已有三文鱼COI基因序列进行比较，确认三文鱼品种，比对结果见表1。
表1 三文鱼罐头中三文鱼品种鉴别结果
对比实施例1：关于DNA提取说明
采用四种DNA提取方法针对不同加工类型的三文鱼罐头进行DNA提取。分别是如实施例1的CTAB法以及常规的SDS法、胍盐法、试剂盒法，以不同片段长度引物进行扩增，以扩增的结果(能否顺利扩增为依据)判断DNA提取方法的优劣。
四种DNA提取方法PCR扩增结果汇总
+：扩增良好，-：未扩增出
从扩增结果来看，4种提取方法均能得到123bp的目的片段，当目的片段增大到224bp时，CTAB法能够扩增绝大多数样品，所以CTAB法为最优的方法。
对比实施例2：关于CTAB法的优化
根据实施例1的方法，采用不同系列浓度的CTAB对三文鱼罐头进行DNA提取。结果发现，4％CTAB的提取效果最佳。示例性地，图1显示了4％CTAB提取液和2％CTAB提取液对DNA提取效果的影响。其中左侧的1-7泳道对应于4％CTAB提取液；右侧的泳道对应于2％CTAB提取液。
对比实施例3：关于目的片段的选择
尽管能从三文鱼罐头中获得123bp的目的片段(如上述实施例中的表1所示)，但根据研究结果，基于123bp并不能鉴定到种水平，只能到属(下表)。
三文鱼罐头商品原料品种鉴定
因此需要获得更大的片段。针对三文鱼罐头进行引物筛选以扩增分别是212bp、358bp和472bp的目的片段，扩增结果如图2A-图2C：其中图2A是212bp目的片段扩增结果；图2B是358bp目的片段扩增结果；以及图2C是472bp目的片段扩增结果。
根据电泳结果，发现在当目的片段为212bp时，所有样品均能获得较好的扩增，并且基于该片段的测序分析能够将三文鱼罐头鉴定至种水平。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种应用微条形码技术鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的方法，其包括如下步骤：
(1)从三文鱼罐头制品中提取DNA，以得到适于PCR扩增的DNA模板；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，对细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因部分序列进行PCR扩增，以扩增出200-230bp的DNA片段；
(3)对步骤(2)中扩增出的DNA片段进行测序并将所测得的DNA序列与已知的三文鱼品种的COI基因序列进行比对，并确定该三文鱼罐头中的三文鱼品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中DNA的提取通过DNA提取液进行，所述DNA提取液含有CTAB。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的DNA提取液含有4％的CTAB。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述DNA提取液的组成为4％CTAB、100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA(pH 8.0)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中扩增的DNA片段长度为212bp。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在用DNA提取液进行提取之前，称取一定量的三文鱼罐头样品，加入适量氯仿：甲醇：水混合溶液，室温静置过夜，离心，弃上清，并用无菌去离子水清洗样品。
7.根据权利要求6所述的方法，其中氯仿：甲醇：水混合溶液是氯仿：甲醇：水＝1:2:0.8(体积比)的混合液。
8.根据权利要求5所述的方法，其中用于PCR扩增的引物对的序列如下：上游引物序列为：TGTAAAACGACGGCCAGTTCCACTAATCACAARGATATTGGTAC；下游引物序列为：CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中的比对是通过将所测定的COI基因的部分序列与DNA数据库(如Genbank)中的已有的三文鱼COI基因序列比对。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述比对是通过Blast比对进行的。
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