CN112410438A - 一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物、方法以及应用 - Google Patents

一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物、方法以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物、方法以及应用，包括三组用于鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物。本发明只需要简单的加热装置即可实现可视化定性检测，操作更为简单，所需反应时长可缩短至1小时，本发明通过颜色反应进行精准判断，反应后的混合液若为粉红色即为阴性样品，只有当出现黄色时才为阳性样品，实现精准定性，针对三文鱼成分中虹鳟鱼成分的简便、快速的检测方法，对于规范三文鱼消费市场，保障大众的饮食健康具有重要的意义。

Description

一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物、方法以 及应用
技术领域
本发明涉及生物鉴定领域，具体地说，是涉及一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物、方法以及应用。
背景技术
目前市场上被称为三文鱼的商品繁多，包括挪威三文鱼、帝王三文鱼、红三文鱼、阿拉斯加三文鱼、淡水三文鱼等等。消费者在选购三文鱼产品时，单从名称和外形上难以区分产品真假。实际上，三文鱼本身并不是一个鱼的物种的名字，而是英文中鲑属“Salmon”的音译名，真正的三文鱼是指大西洋鲑鱼，其拉丁名为Salmon Salar，其中最出名的当属挪威三文鱼，多为进口，以其较高的营养价值和较好的口感，深得消费者的喜爱，因此市场价格也比较高。而淡水养殖的虹鳟鱼和多产于东北毗邻太平洋区域的大马哈鱼，与大西洋鲑同属于鲑科“Salmonidae”，但另被归为马哈鱼属“Oncorhynchus”，其拉丁名分别为Oncorhynchus mykiss和Oncorhynchus keta。虹鳟鱼和大马哈鱼品质不如大西洋鲑鱼，价格较低，多为国产或日本进口，近年来常被称为三文鱼或冒充三文鱼销售，普通消费者深受真假三文鱼迷惑。
现有技术依赖于PCR设备及荧光信号检测系统，难以实现便携式快速检测，检测所需时间长，从加样到上机得出结果通常需要约2小时。现有技术中采用虹鳟鱼的引物探针仍可扩增出其它相近鱼种的DNA样品；或扩增反应的ct值偏高容易导致对真实样品的误判，如利用大马哈鱼引物探针扩增油鱼DNA反应ct值大于30，已接近于判断的临界点，因此需要一种能有效解决上述问题的鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物、试剂盒以及方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物、应用以及方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明包括三文鱼上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO:1所示，下游外部引物B3，其序列如SEQ ID N0:2所示。
一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物,包括虹鳟鱼上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO:3所示，下游外部引物B3，其序列如SEQ IDN0:4所示。
一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物,包括大马哈鱼上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO:5所示，下游外部引物B3，其序列如SEQ ID N0:6所示。
一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的方法,包括以下步骤：
A提取样本DNA；
B将样本DNA与环介导等温扩增反应试剂、荧光染料和引物组进行混合得到混合试剂；
C将混合试剂置于实时荧光检测仪并将反应温度设置为65℃,反应50min得到显色后的混合试剂；
D反应结束后，根据混合试剂的显色判断是否检出三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分。
进一步地，所述环介导等温扩增反应反应体系包括
环介导等温扩增反应预混液(2×)5μL
引物混合液1.09μL
DNA 2μL
灭菌去离子水补充至总体积10μL
反应程序：65℃,50min。实验设置2个阴性对照。阴性对照1：不含相应物种的DNA。阴性对照2：以灭菌去离子水替代DNA加入环介导等温扩增反应反应体系。
所述的鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物在鉴定鱼肉成分的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明只需要简单的加热装置即可实现可视化定性检测，操作更为简单，所需反应时长可缩短至1小时，本发明通过颜色反应进行精准判断，反应后的混合液若为粉红色即为阴性样品，只有当出现黄色时才为阳性样品，实现精准定性。针对三文鱼中虹鳟鱼成分的简便、快速的检测方法，对于规范三文鱼消费市场，保障大众的饮食健康具有重要的意义。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
分析步骤
1)特异性引物设计
采用Cytb序列分别设计三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性的LAMP引物，共三套
2)样品前处理及DNA提取
使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉，尽可能剪碎并混匀，按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，每个样品设置两个平行，按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。
3)LAMP扩增
LAMP反应体系见表1。
表1LAMP反应体系
LAMP预混液(2×)5μL
引物混合液1.09μL
DNA 2μL
灭菌去离子水补充至总体积10μL
反应程序：65℃,50min。实验设置2个阴性对照。阴性对照1：不含相应物种的DNA。阴性对照2：以灭菌去离子水替代DNA加入LAMP反应体系。
LAMP预混液(2×) 5μL
引物混合液 1.09μL
DNA 2μL
灭菌去离子水
反应程序：65℃,50min。实验设置2个阴性对照。阴性对照1：不含相应物种的DNA。阴性对照2：以灭菌去离子水替代DNA加入LAMP反应体系。
4)结果判断与表述
a质量控制
阳性：反应体系出现明显的变色反应；
阴性：反应体系不变色；
鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的方法,包括以下步骤：
A提取样本DNA；
B将样本DNA与环介导等温扩增反应试剂、荧光染料和引物组进行混合得到混合试剂；
C将混合试剂置于实时荧光检测仪并将反应温度设置为65℃,反应50min得到显色后的混合试剂；
D反应结束后，根据混合试剂的显色判断是否检出三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性源性成分。
在实施例子1中，以三文鱼的LAMP反应检测中，
三文鱼的引物序列如下：
F3:ACCCATATATATAATATCGCATGTG
FIP:ACGTGTTTTGCTTTATGTAAACCTTTTATCAACATAAGTGGATTTAACCC
BIP:ACCAACTAAGTTGTTTTAACCCGA TTGGTGGGTAAAGACGGA
B3:CGGTTCTTACTACATTAAATAGGAC
以太平洋真鳕、狭鳕鱼、美露鳕鱼、南极犬牙鱼、异鳞蛇鲭、裸盖鱼、大西洋真鳕、三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼为对应检测，其中三文鱼显色为黄色，其他为粉红色。
在实施例子2中，在虹鳟鱼的LAMP反应检测中
虹鳟鱼的引物序列如下：
O.my-F3 CGTAGCCATACTCCTAGGCC
O.my-FIP GGTGGGGTCACTAGGGGGTTGCACCAAATCTCCTAGGGGA
O.my-B3 AGTGTGTAGGATGGGGACAA
O.my-BIP ACGATCCATCCCCAACAAGCTGCCATGAGGACAAGGATCGAG
以太平洋真鳕、狭鳕鱼、美露鳕鱼、南极犬牙鱼、异鳞蛇鲭、裸盖鱼、大西洋真鳕、三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼对应其中虹鳟鱼显色为黄色，其他为粉红色。
在实施例子3中，在大马哈鱼的LAMP反应检测中，
大马哈鱼的引物序列如下：
O.ke-F3 GGCCAACCTCCGAAAAACC
O.ke-FIP GCATAAGCCCAGGAGTGAACCACGCCAATGACGCACTAGTC
O.ke-B3 CGTAGCTGACATCTCGGC
O.ke-BIP AGCCACCCAAATTCTTACCGGGGGCAGACAGAGGAAAAAGCT
O.ke-LF CCTAGCCATGCACTACACCTCC
以太平洋真鳕、南极犬牙鱼、异鳞蛇鲭、裸盖鱼、大西洋真鳕、三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼为对应其中大马哈鱼显色为黄色，其他为粉红色。
本发明通过颜色反应进行精准判断，反应后的混合液若为粉红色即为阴性样品，只有当出现黄色时才为阳性样品，实现精准定性，针对三文鱼中虹鳟鱼成分的简便、快速的检测方法，对于规范三文鱼消费市场，保障大众的饮食健康具有重要的意义。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120> 一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物、方法 以及应用
<141> 2020-12-03
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Salmo salar
<400> 1
acccatatat ataatatcgc atgtg 25
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Salmo salar
<400> 2
acgtgttttg ctttatgtaa accttttatc aacataagtg gatttaaccc 50
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Salmo salar
<400> 3
accaactaag ttgttttaac ccgattggtg ggtaaagacg ga 42
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Salmo salar
<400> 4
cggttcttac tacattaaat aggac 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Oncorhynchus mykiss
<400> 5
cgtagccata ctcctaggcc 20
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Oncorhynchus mykiss
<400> 6
ggtggggtca ctagggggtt gcaccaaatc tcctagggga 40
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Oncorhynchus mykiss
<400> 7
agtgtgtagg atggggacaa 20
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> Oncorhynchus mykiss
<400> 8
acgatccatc cccaacaagc tgccatgagg acaaggatcg ag 42
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Oncorhynchus keta
<400> 9
ggccaacctc cgaaaaacc 19
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> Oncorhynchus keta
<400> 10
gcataagccc aggagtgaac cacgccaatg acgcactagt c 41
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Oncorhynchus keta
<400> 11
cgtagctgac atctcggc 18
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> Oncorhynchus keta
<400> 12
agccacccaa attcttaccg ggggcagaca gaggaaaaag ct 42
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Oncorhynchus keta
<400> 13
cctagccatg cactacacct cc 22

Claims (6)

1.一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物,其特征在于，包括三文鱼上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO:1所示，下游外部引物B3，其序列如SEQ ID N0:2所示。
2.一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物,其特征在于，包括虹鳟鱼上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO:3所示，下游外部引物B3，其序列如SEQ ID N0:4所示。
3.一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物,其特征在于，包括大马哈鱼上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO:5所示，下游外部引物B3，其序列如SEQ ID N0:6所示。
4.一种鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的方法,其特征在于:
包括以下步骤：
A提取样本DNA；
B将样本DNA与环介导等温扩增反应试剂、荧光染料和引物组进行混合得到混合试剂；
C将混合试剂置于实时荧光检测仪并将反应温度设置为65℃,反应50min得到显色后的混合试剂；
D反应结束后，根据混合试剂的显色判断是否检出三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性源性成分。
5.如权利要求4所述的检测三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的方法，其特征在于，
所述环介导等温扩增反应反应体系包括
环介导等温扩增反应预混液(2×)5μL
引物混合液1.09μL
DNA 2μL
灭菌去离子水 补充至总体积10μL
反应程序：65℃,50min。实验设置2个阴性对照。阴性对照1：不含相应物种的DNA。阴性对照2：以灭菌去离子水替代DNA加入环介导等温扩增反应反应体系。
6.按照权利要求1或2或3所述的鉴定三文鱼、虹鳟鱼和大马哈鱼源性成分的引物在鉴定鱼肉成分的应用。
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