CN105779628B - 用于鉴别霍山石斛的snp标记及其分子检测方法 - Google Patents

用于鉴别霍山石斛的snp标记及其分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别霍山石斛的SNP标记及其分子检测方法。本发明提供了石斛基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测石斛基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定霍山石斛中的应用；所述SNP位点在石斛基因组中对应于序列表中序列3所示核苷酸序列的第113位；所述SNP位点处的核苷酸为T或G。本发明通过RAD测序技术对包含霍山石斛复合体所有物种在内的27种石斛样品进行测序分析，寻找到了一个只存在于霍山石斛的功能性SNP分子标记，并建立了该SNP标记的检测方法，实现了对霍山石斛与其他石斛(包括霍山石斛与其他石斛的杂交种)的准确鉴定。

Description

用于鉴别霍山石斛的SNP标记及其分子检测方法
技术领域
本发明属于中药分子鉴定领域，涉及一种用于鉴别霍山石斛的SNP标记及其分子检测方法，特别涉及一种用于鉴别霍山石斛的SNP标记，及其基于PCR-RFLP鉴定霍山石斛的试剂盒与鉴定方法。
背景技术
药材霍山石斛来源于石斛属植物霍山石斛Dendrobium huoshanense C.Z.Tanget S.J.Cheng的新鲜或干燥茎。霍山石斛味甘、粘牙、嚼之无渣，是石斛类药材的最上品，价格昂贵，长期以来有市无货。目前国内外市场上冠以“霍山石斛”“霍斗”或“野生金霍斛”等名称的一些枫斗产品，往往均非正品霍山石斛加工而成，其伪品产量日益增大，市场极度混乱。目前市场上常用的假冒霍山石斛包括铁皮石斛D.officinale Kimura et Migo、细茎石斛D.moniliforme(L.)Sweet.、黄花石斛D.tosaense Makino重唇石斛D.hercoglossumReichb.、美花石斛D.loddigesii Rolfe、细叶石斛D.hancockii Rolfe、广东石斛D.wilsonii Rolfe、罗河石斛D.lohohense T.Tang et F.T.Wang、河南石斛D.henanenseJ.L.Lu et L.X.Gao等(刘石泉,李小军,余庆波等.霍山石斛及相似种的位点特异性PCR鉴别[J].中草药,2006,37(1):111-114)。
目前人们主要通过传统的性状鉴别方法来区分霍山石斛及其混伪品，但在经过炮制加工，尤其是加工成枫斗或干条后，霍山石斛的一些特征消失，与其他石斛的差别不显著，难以区分。此外，也有研究表明可采用ISSR-PCR扩增图谱或位点特异性PCR技术对这两个品系进行鉴别。然而，最新的分子系统学理论表明，霍山石斛属于细茎石斛复合体，包括梵净山石斛D.fanjingshanense、河南石斛D.henanense、霍山石斛D.huoshanense、细茎石斛D.moniliforme、琉球石斛D.okinawense及西畴石斛D.xichouense等6个物种(Xiang XGet al,Molecular Phylogenetics and Evolution,2013,69:950-960)，复合体内的物种不能通过性状无关的标记区分。另一方面，ISSR-PCR和位点特异性PCR技术只能检测待测样品是否含有霍山石斛基原，无法判断是否是霍山石斛与其他石斛的杂交品种。而霍山石斛与其他石斛的杂交品种不能作为霍山石斛药用。
市场流通的商品霍山石斛经由炮制加工、运输储藏后，形态有所改变，难以区分。因此，急需建立科学性强、使用方便的，同时具有共显性特点，能同时检测正品、伪品、或其杂交样品的霍山石斛鉴别方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供石斛基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测石斛基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定霍山石斛中的应用；
所述SNP位点在石斛基因组中对应于序列表中序列3所示核苷酸序列的第113位；所述SNP位点处的核苷酸为T或G。
在所述应用中，检测待测石斛的基因组中所述SNP位点处的核苷酸，若所述SNP位点处的核苷酸为T，则所述待测石斛为霍山石斛；若所述SNP位点处的核苷酸为G或者为T和G，则所述待测石斛不为霍山石斛(当所述SNP位点为T和G时，所述待测石斛为霍山石斛和其他石斛的杂交种)。
其中，所述用于检测石斛基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质可为如下产品(试剂盒或引物对)。
本发明的第二个目的是提供如下用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的产品，具体为如下A)所示的试剂盒或B)所示的引物对：
A)一种用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的试剂盒，含有如下(a)或(b)或(c)所示的引物对，以及限制性内切酶AluI或其同裂酶；
(a)根据石斛基因组中如下SNP位点的上游序列和下游序列设计的用于扩增含有所述SNP位点的片段的引物对；所述SNP位点在石斛基因组中对应于序列表中序列3所示核苷酸序列的第113位；所述SNP位点处的核苷酸为T或G；
(b)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(c)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(b)中所述引物对功能相同的引物对；
B)一种用于鉴定中药霍山石斛的引物对，为所述(a)或所述(b)或所述(c)所示的引物对。
本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测石斛是否为霍山石斛的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测石斛是否为霍山石斛的方法，可包括如下步骤：检测待测石斛的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为纯合T还是纯合G还是T和G的杂合，以确定所述待测石斛是否为霍山石斛：若所述待测石斛的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为纯合T，则所述待测石斛为或候选为霍山石斛；若所述待测石斛的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为纯合G或者是T和G的杂合，则所述待测石斛不为或候选不为霍山石斛(当所述SNP位点处的核苷酸为纯合G时，所述待测石斛为其他石斛；当所述SNP位点处的核苷酸为T和G的杂合时，所述待测石斛为霍山石斛和其他石斛的杂交种)；
所述SNP位点在石斛基因组中对应于序列表中序列3所示核苷酸序列的第113位；所述SNP位点处的核苷酸为T或G。
在本发明中，所述方法具体可为如下C)或D)：
C)一种基于限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)鉴定或辅助鉴定待测石斛是否为霍山石斛的方法，具体可包括如下(1)-(3)的步骤：
(1)从待测石斛中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增；
(2)采用限制性内切酶AluI对步骤(1)所得PCR产物进行完全酶切；
(3)按照如下方法确定所述待测石斛是否为霍山石斛：若经步骤(2)酶切获得的DNA片段为如下(a1)，则所述待测石斛为或候选为霍山石斛；若经步骤(2)酶切获得的DNA片段为如下(a2)或(a3)，则所述待测石斛不为或候选不为霍山石斛：
(a1)大小为153bp的单一DNA片段(霍山石斛)；
(a2)大小分别为113bp和40bp的两个DNA片段(其他石斛)；
(a3)大小为153bp、113bp和40bp的三个DNA片段(霍山石斛和其他石斛的杂交种)。
D)一种基于普通PCR鉴定或辅助鉴定待测石斛是否为霍山石斛的方法，具体可包括如下(4)-(5)的步骤：
(4)从待测石斛中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，得到PCR产物；
(5)按照如下方法确定所述待测石斛是否为霍山石斛：若所述PCR产物为如下(b1)，则所述待测石斛为或候选为霍山石斛；若所述PCR产物为如下(b2)或(b3)，则所述待测石斛不为或候选不为霍山石斛：
(b1)单一PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段，其中序列3的第113位为T，即TT纯合型(霍山石斛)；
(b2)单一PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段，其中序列3的第113位为G，即GG纯合型(其他石斛)；
(b3)两种PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段，其中序列3的第113位为T和G，即TG杂合型(霍山石斛和其他石斛的杂交种)。
其中，序列1由25个核苷酸组成，序列2由19个核苷酸组成。
在所述C)方法的步骤(3)中，大小为153bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列3，其中序列3的第113位为T；大小为113bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列3的第1-113位，其中序列3的第113位为G；大小为40bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列3的第114-153位。
在实际应用中，判断酶切产物中是否含有目的大小的DNA片段时，可通过将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，看电泳图谱上是否含有目的条带：电泳图谱上含有目的大小条带，则酶切产物中含有相应的目的大小的DNA片段。进一步，可通过对酶切产物进行核苷酸序列测定来进一步确定PCR产物或酶切产物的序列信息。
在所述方法中，所述待测石斛可为霍山石斛、其他石斛，或霍山石斛和所述其他石斛的杂交种。
在本发明的一个实施例中，所述其他石斛具体为如下中任一种：铁皮石斛、细茎石斛、河南石斛、金草石斛、金耳石斛、齿瓣石斛、罗河石斛、美花石斛、疏花石斛和杯鞘石斛。
在所述方法中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度可为56-62℃，具体如58℃。
在所述C)方法的步骤(2)中，采用限制性内切酶AluI对步骤(1)所得PCR产物进行酶切时，酶切反应条件具体可为37℃孵育30min。
在本发明中，所述霍山石斛具体为兰科石斛属植物霍山石斛Dendrobiumhuoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng的新鲜或干燥茎。因此，本发明以上所提供的所述试剂盒或所述引物对或所述方法也可以用于霍山石斛Dendrobium huoshanense C.Z.Tanget S.J.Cheng这种植物的鉴定。
本发明还保护所述试剂盒和所述引物对的制备方法。
所述试剂盒的制备方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子以及限制性内切酶AluI或其同裂酶分别单独包装的步骤。
所述引物对的制备方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
本发明通过RAD(Restriction site Associated DNA)测序技术对包含霍山石斛复合体所有物种在内的27种石斛样品进行测序分析，寻找到了一个只存在于霍山石斛的功能性SNP分子标记，并建立了该SNP标记的检测方法，实现了对霍山石斛与其他石斛(包括霍山石斛与其他石斛的杂交种)的准确鉴定。
附图说明
图1为部分供试石斛类样品PCR-RFLP电泳检测结果。其中，M为DNA分子量标准(100bp ladder)；泳道1-14为已知的霍山石斛样品(对应表1中编号为1-5，11-15以及21-24的共14个霍山石斛)；泳道15-24为其他石斛样品(对应表1中编号为41-45以及53-57的共10个其他石斛样品)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的仪器有：台式高速离心机(Eppendorf公司)、9700基因扩增仪(ABI公司)、电泳仪、紫外凝胶成像仪。
实施例1、鉴定霍山石斛的试剂盒的制备及鉴定方法的建立
一、鉴定霍山石斛的试剂盒的组成
本发明用于鉴定鉴定霍山石斛的试剂盒，是基于PCR-RFLP技术设计的，含有由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对，以及限制性内切酶Alu I。其设计过程大致如下：
本发明的发明人通过RAD测序技术对包含霍山石斛复合体所有物种在内的27种石斛样品进行测序分析，发现在Tag C12722046的序列上有一个SNP位点的存在造成了在霍山石斛混伪品中形成限制性内切酶AluI的识别位点，而在霍山石斛中的相应位置则没有形成限制性内切酶AluI的识别位点，且在这个SNP位点的上下游石斛属物种均有一段保守区段，进而设计了用于鉴别两种品系的引物对C12722046F/C12722046R和对应的限制性内切酶Alu I。
其中，引物对为：
C12722046F：5’-ATTCTTCATCAAGTTTAGTGCATTC-3’(序列1)；
C12722046R：5’-AGAGCTGATGGGCCTTTGA-3’(序列2)。
二、基于PCR-RFLP鉴定霍山石斛方法的建立
1、待测样品DNA的提取
选取无霉变的待测石斛的干燥标本1g，置于粉碎机中研磨粉碎至可过40目筛；将0.02g粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入900μL已灭菌的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)沉淀液(配方：2％(2g/100ml)CTAB，100mmol/L Tris-HCl pH＝8.0，100mmol/L EDTA)、0.02g PVP 40000、10μLβ-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次；结束后取出冷却至室温(25℃)，12000×g离心10min，弃上清；加入900μL已灭菌的CTAB提取液(配方：2％(2g/100ml)CTAB，100mmol/L Tris-HCl pH8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCl)、0.02g PVP 40000、10μLβ-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴30min，加入900μL氯仿-异戊醇(体积比24：1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min；取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(体积比24：1)充分振荡混匀，12000×g离心10min；取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上；取出，12000×g离心10min，弃上清，沉淀用70％(体积分数)乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20℃保存。
2、PCR扩增
以步骤1所得待测石斛的基因组DNA作为模板，采用引物对C12722046F/C12722046R进行PCR扩增。
反应体系(25μL)：2.5μL 10×Speedstar HS Taq缓冲液、1μL 2.5mmol/L dNTPs，上下游引物各2.0pmol，Speedstar HS Taq酶1U，10mg·ml-1BSA0.5μl，25％(25g/100ml)PVP40000 1μl，DNA模板约20ng，灭菌蒸馏水补足至25μL。其中，10×Speedstar HS Taq缓冲液和Speedstar HS Taq酶均为Takara公司产品，其产品目录号为RR070A。
在ABI公司的9700型基因扩增仪上进行扩增，循环参数为：95℃预变性5min；95℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸20s，40个循环；72℃延伸5min；反应结束后4℃保存。
3、完全酶切
采用限制性内切酶AluI对步骤2的PCR产物进行酶切鉴定。
酶切体系(20μl)：限制性内切酶AluI的buffer 2.0μl，限制性内切酶AluI 0.5μl(相当于0.5U)，步骤2获得的PCR产物17.5μl。其中，限制性内切酶AluI及相应的buffer均为NEB公司产品，其产品目录号为#R0137S。
反应条件：37℃孵育30min。
4、酶切产物检测
酶切反应结束后，取4μL反应液，与2μL 6×上样缓冲液充分混匀，于2.5％的EB染色的琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像观察。
5、目的条带的测序及分析
6、根据电泳和测序结果确定待测石斛是否为霍山石斛
鉴于存在霍山石斛与其他石斛杂交的情况，故而得到根据电泳和测序结果确定待测石斛是否为霍山石斛的方法具体如下：
若电泳仅得到大小为153bp(序列3，且第113位为T)的单一目的条带，则所述待测石斛为霍山石斛；若电泳得到大小分别为113bp(序列3的第1-113位，且第113位为G)和40bp(序列3的第114-153位)两个目的条带，则所述待测石斛为其他种石斛；若电泳得到大小分别为113bp(序列3的第1-113位，且第113位为G)、40bp(序列3的第114-153位)和153bp(序列3，且第113位为T)的三个目的条带，则所述待测石斛为霍山石斛与其他种石斛的杂交种。
当然，在实际操作中，也可以不采用限制性内切酶Alu I对PCR产物进行酶切，而是直接将PCR产物进行测序，按照如下确定待测石斛是为霍山石斛：若PCR产物为单一产物——序列表中序列3(第113位为TT纯合型)所示的DNA片段(153bp)，则所述待测石斛为霍山石斛；若PCR产物为单一产物——序列表中序列3(第113位为GG纯合型)所示的DNA片段(153bp)，则所述待测石斛为其他石斛；若PCR产物为两种产物——序列表中序列3所示的DNA片段(第113位为TG杂合型)，则所述待测样品为霍山石斛与其他石斛的杂交种。
实施例2、基于PCR-RFLP鉴定霍山石斛方法的有效验证
供试样品：表1中所示的60个来自不同产地的已知物种的石斛属材料。表中各样品均符合《中国药典》、《本草纲目》等各药材项下的有关规定。通过鉴定，各味药材实物与名称相符，质量符合标准。
采用实施例1步骤一中的试剂盒，按照实施例1步骤二的方法对各供试样品进行PCR-RFLP检测。
结果显示，所有的60个已知物种的石斛属材料，采用实施例1的方法进行PCR-RFLP检测的结果均与实际情况相符，可见检测准确率高达100％。60个石斛属材料的具体检测结果参见表1。图1为部分供试石斛属材料的PCR-RFLP电泳结果。
进一步，将表1中的霍山石斛样品扩增得到的大小为153bp的目的条带进行测序，发现其正为序列表中序列3(第113位为T)；将表1中的其他石斛样品扩增得到的大小为113bp的目的条带进行测序，发现其正为序列表中序列3(第113位为G)的第1-113位；将表1中的其他石斛样品扩增得到的大小为40bp目的条带进行测序，发现其正为序列表中序列3的第114-153位。
表1 60个来自不同产地的已知物种的石斛属样品及其PCR-RFLP检测结果

Claims (12)

1.石斛基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测石斛基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定霍山石斛中的应用；
所述SNP位点在石斛基因组中对应于序列表中序列3所示核苷酸序列的第113位；所述SNP位点处的核苷酸为T或G。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测石斛基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质为如下A）或B）：
A）一种用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的试剂盒，含有如下（a）所示的引物对，以及限制性内切酶AluI或其同裂酶；
（a）根据石斛基因组中如下SNP位点的上游序列和下游序列设计的用于扩增含有所述SNP位点的片段的引物对；所述SNP位点在石斛基因组中对应于序列表中序列3所示核苷酸序列的第113位；所述SNP位点处的核苷酸为T或G；
B）一种用于鉴定中药霍山石斛的引物对，为所述（a）所示的引物对。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测石斛基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质为如下A）或B）：
A）一种用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的试剂盒，含有如下（b）所示的引物对，以及限制性内切酶AluI或其同裂酶；
（b）由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
B）一种用于鉴定中药霍山石斛的引物对，为所述（b）所示的引物对。
4.产品，为如下A）或B）：
A）一种用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的试剂盒，含有如下（a）所示的引物对，以及限制性内切酶AluI或其同裂酶；
（a）根据石斛基因组中如下SNP位点的上游序列和下游序列设计的用于扩增含有所述SNP位点的片段的引物对；所述SNP位点在石斛基因组中对应于序列表中序列3所示核苷酸序列的第113位；所述SNP位点处的核苷酸为T或G；
B）一种用于鉴定中药霍山石斛的引物对，为所述（a）所示的引物对。
5.产品，为如下A）或B）：
A）一种用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的试剂盒，含有如下（b）所示的引物对，以及限制性内切酶AluI或其同裂酶；
（b）由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
B）一种用于鉴定中药霍山石斛的引物对，为所述（b）所示的引物对。
6.一种鉴定或辅助鉴定待测石斛是否为霍山石斛的方法，包括如下步骤：检测待测石斛的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为纯合T还是纯合G还是T和G的杂合，以确定所述待测石斛是否为霍山石斛：若所述待测石斛的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为纯合T，则所述待测石斛为或候选为霍山石斛；若所述待测石斛的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为纯合G或者是T和G的杂合，则所述待测石斛不为或候选不为霍山石斛；
所述SNP位点在石斛基因组中对应于序列表中序列3所示核苷酸序列的第113位；所述SNP位点处的核苷酸为T或G。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法为如下C）或D）：
C）包括如下（1）-（3）的步骤：
（1）从待测石斛中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求3中所述（b）所示的引物对进行PCR扩增；
（2）采用限制性内切酶AluI对步骤（1）所得PCR产物进行完全酶切；
（3）按照如下方法确定所述待测石斛是否为霍山石斛：若经步骤（2）酶切获得的DNA片段为如下（a1），则所述待测石斛为或候选为霍山石斛；若经步骤（2）酶切获得的DNA片段为如下（a2）或（a3），则所述待测石斛不为或候选不为霍山石斛：
（a1）大小为153 bp的单一DNA片段；
（a2）大小分别为113bp和40bp的两个DNA片段；
（a3）大小为153 bp、113bp和40bp的三个DNA片段；
D）包括如下的步骤：
首先，从待测石斛中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求3所述（b）所示的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
其次，按照如下方法确定所述待测石斛是否为霍山石斛：若所述PCR产物为如下（b1），则所述待测石斛为或候选为霍山石斛；若所述PCR产物为如下（b2）或（b3），则所述待测石斛不为或候选不为霍山石斛：
（b1）单一PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段，其中序列3的第113位为T；
（b2）单一PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段，其中序列3的第113位为G；
（b3）两种PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段，其中序列3的第113位为T和G。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，大小为153bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3，其中序列3的第113位为T；大小为113bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-113位，其中序列3的第113位为G；大小为40bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3的第114-153位。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述待测石斛为霍山石斛、其他石斛，或霍山石斛和所述其他石斛的杂交种；所述其他石斛为如下中任一种：铁皮石斛、细茎石斛、河南石斛、金草石斛、金耳石斛、齿瓣石斛、罗河石斛、美花石斛、疏花石斛和杯鞘石斛。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：进行所述PCR扩增时采用的退火温度为56-62℃。
11.权利要求4或5中所述试剂盒的制备方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子以及限制性内切酶AluI或其同裂酶分别单独包装的步骤。
12.权利要求4或5中所述引物对的制备方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
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