KR101618182B1

KR101618182B1 - 김 붉은갯병의 병원균 결정방법

Info

Publication number: KR101618182B1
Application number: KR1020150071008A
Authority: KR
Inventors: 이순정; 박명애; 백재민; 황미숙; 하동수; 이상래; 이지은
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2015-05-21
Publication date: 2016-05-09

Abstract

본 발명은 김 붉은갯병에 적절하게 대처할 수 있도록 붉은갯병의 병원균을 정확하게 판정하기 위한 김 붉은갯병의 병원균 결정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 병원균의 cox1 (cytochrome c oxidase subunit 1) 부위의 서열을 비교하는 것을 특징으로 하는 김 붉은갯병의 병원균 결정방법에 관한 것이다.

Description

김 붉은갯병의 병원균 결정방법{Method for Deciding Pathogen of Red Rot Disease}

본 발명은 김 붉은갯병에 적절하게 대처할 수 있도록 붉은갯병의 병원균을 정확하게 판정하기 위한 김 붉은갯병의 병원균 결정방법에 관한 것이다.

김은 홍조식물 김파래목 김파래과의 해조류로, 그 종류는 약 140여 종으로 매우 다양한데, 이 중 참김, 방사무늬김, 잇바디돌김, 모무늬돌김은 우리나라에서 양식되고 있다. 김은 맛과 향이 좋을 뿐만 아니라 칼슘, 단백질, 비타민A 등 영양이 풍부하여 골다공증, 혈관질환 및 안질환 등에 효과가 있는 식품이며, 건조된 상태 그대로 또는 굽거나 소금 및 식용유(옥배유 등)가 첨가된 가공 상태로 섭취된다.

이러한 김은 우리나라에서 연간 1억 3~4천만 속 내외로 대량 생산되어 쉽게 구할 수 있으며, 열량이 낮으면서 몸에 좋은 영양소가 많다는 점 때문에 일상적으로 많이 소비되고 있다. 또한 우리나라 김은 전 세계적으로 그 맛을 인정받아 2014년에는 미국, 일본, 중국 등 세계 90개국에 2억7400만달러(한화 약 3000억원)의 금액으로 수출될 만큼 해외 수요도 점차 증가하고 있다.

그러나 양식현장에서 발생하는 김의 질병인 각종 갯병으로 인하여 김의 품질이 저하되거나 수확량이 감소되어 어민들에게 피해를 입히기도 한다. 김 갯병은 김 엽체가 퇴색되거나 김발에서 유실되는 것을 말하는 것으로 생리적 장애 또는 병원균의 감염으로 발생하며, 그 원인이나 발병기작은 매우 다양하다.

일반적으로 김의 생리적 장애는 기상 및 해황의 이변 등 환경 이상 현상이나 김발 관리 소홀, 공장폐수의 유입 등 다양한 요인에 의해 발생되는 것으로 알려져 있다.

특히, 난균류(Oomycetes)에 속하는 균류 감염에 의한 김 갯병은 한국과 일본에서 김 양식에 어려움을 주고 있으며, 김 양식 산업의 생산을 심각하게 감소시키고 있다(가와무라 외 2005, Kim 등 2014). 김 갯병의 일종인 붉은갯병(red rot disease)은 주요 해조류 질병 중 하나로서, 일본에서 참김(Porphyra tenera = Pyropia tenera)에서 최초로 보고되었다. 이후 감염된 Pyropia종의 붉은갯병 발생 부위에서 Pythium종이 분리되어 특성분석을 거쳐 Pythium porphyrae로 명명되었다(다카하시 등. 1977).

Pythium porphyrae는 지금까지 김(Pyropia종)에서 붉은갯병을 일으키는 유일한 병원체로 알려져 있다(다카하시 외. 1977, Kim 등. 2014). 이 종은 사상형 비팽창성 포자낭과 느린 성장, 1-4개의 자웅이주 조정기(antheridia)라는 특성으로 보아 Pythium속의 종 중에서 Pythium adhaerens 및 P. chondricola와 밀접한 유연관계를 형성하고 있다(Levesque & De Cock 2004). P. adhaerens는 토양에서 분리되었고, P. chondricola는 Chondrus crispus (진두발)에서 최초로 발견·보고되었다(레베 & 드 콕 2004). 이들 근연의 세 종은 각기 다른 숙주/기질-특이적 관계를 보여준다(마츠모토 외. 1999, 레베 & 드 콕 2004). Pythium속의 분류학적 위치를 밝히기 위해, 마츠모토 등은 30개 Pythium종의 ITS (internal transcribed spacer) 서열을 분석하였고, Levesque & De Cock (2004)은 ITS 및 핵 리보솜 DNA의 D1, D2 및 D3 부위를 이용하여 102개의 균주(isolates) 간의 계통관계를 조사하였다. 또한 ITS와 cox1을 가지고 oomycetes에 대한 DNA 바코딩 연구가 수행되었고, cox1 및 ITS 부위 사이에서 분자 마커의 분류학적 해상도가 비교되었다(Robideau 등. 2011). 최근 슈뢰더 등(2013)이 Pythium종에 대한 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 위한 프라이머 기반의 진단 및 정량을 제안하였다. 핵 리보솜 DNA 및 cox1 부위에 기반한 분자 계통수에서, Pythium adhaerens, P. porphyrae 및 P. chondricola는 단일 분지(clade)를 이루었다(Levesque & De Cock 2004, Robideau et al. 2011). 한편 Park 등(2001, 2006)은 Pythium porphyrae 특이적 ITS 마커를 개발하고, 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 양식장에서 붉은갯병 감염을 예측하는 데 적용하였다.

모든 경우가 그러하듯이, 김의 붉은갯병에 있어서도 병원체의 정확한 식별 및 숙주-기생체 관계의 명확화가 김의 질병을 예측/예방하고 대처하는 데 우선적으로 요구된다. 방사무늬김에서 붉은갯병과 호상균병에 의한 동시 감염이 보고(Ding & Ma 2005)된 사례가 있으나, 붉은갯병이 발생한 김에서 Pythium 병원균의 감염여부를 확인하고 감염 과정을 분석하기 위해서는 병원균의 정확한 동정이 필요하다. 이를 위해서는 Pythium종의 유전적 다양성에 대한 정보가 필수적인데 개발된 분자마커의 효율성과 데이터베이스 확보 측면에선 현 단계의 분석시스템만으론 부족하다.

본 발명자들은 붉은갯병에 감염된 방사무늬김의 엽체와 한반도 연안에서 채집한 환경해수시료로부터 붉은갯병 병원균을 식별하는 과정에서, 한국 방사무늬김의 붉은갯병 병원균이 Pythium porphyrae이라는 선행연구와는 달리, 현 단계의 식별 분자마커인 ITS 유전자로는 근연한 P. porphyrae와 P. chondricola간의 구별이 불가능함을 발견하였다. 또한, cox1 유전자 부위의 유전정보가 두 종을 판별하는데 유용한 정보를 가지고 있음을 확인하고, 감염 김 엽체 및 Pythium 배양균주에서 분석가능하도록 cox1 유전자 분석용 프라이머 조합을 새로이 개발하고 이를 붉은갯병 감염 김 시료에 적용하여 종 구분 가능성을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

Kawamura Y, Yokoo K, Tojo M, Hishiike M (2005) Distribution of Pythium porphyrae, the causal agent of red rot disease of Porphyrae spp., in the Ariake Sea, Japan. Plant Dis 89:1041-1047 Kim GH, Moon, K-H, Kim J-Y, Shim J, Klochkova TA (2014) A revaluation of algal diseases in Korean Pyropia (Porphyra) sea farms and their economic impact. Algae 29:249-265 Takahashi M, Ichitani T, Sasaki M (1977) Pythium porphyrae Takahashi et Sasaki, sp. nov. causing red rot of marine red algae Porphyra spp. Trans Mycol Soc Jpn 18:279-285 Levesque CA, De Cock AW (2004) Molecular phylogeny and taxonomy of the genus Pythium. Microbiol Res 108:1363-1383 Matsumoto C, Kageyama K, Suga H, Hyakumachi M (1999) Phylogenetic relationships of Pythium species based on ITS and 5.8 S sequences of the ribosomal DNA. Mycoscience 40:321-331 Robideau GP et al. (2011) DNA barcoding of oomycetes with cytochrome c oxidase subunit I and internal transcribed spacer. Mol Ecol Resour 11:1002-1011 Park CS, Kakinuma M, Amano H (2001) Detection of the red rot disease fungi Pythium spp. by polymerase chain reaction. Fish Sci 67:197-199 Park CS, Kakinuma M, Amano H (2006) Forecasting infections of the red rot disease on Porphyra yezoensis Ueda (Rhodophyta) cultivation farms. J Appl Phycol 18:295-299

본 발명은 김의 기생성 질병인 붉은갯병을 예방/예측 및 대처할 수 있도록 병원균의 신속·정확한 검출 및 결정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 병원균의 cox1 (cytochrome c oxidase subunit 1) 부위의 서열을 비교하는 것을 특징으로 하는 김 붉은갯병의 병원균 결정방법에 관한 것이다.

이상과 같이 본 발명에 의하면 특히 한국 김에서의 붉은갯병 병원균을 빠르고 정확하게 검출할 수 있게 된다.

이에 따라 김의 품질과 수확량에 막대한 영향을 끼치고 있는 붉은갯병에 대하여 병원균의 신속·정확한 동정에 의한 효과적인 전염병 방역체계를 준비할 수 있게 된다.

도 1은 본 발명의 실시예에서, PCR 결과 ITS(707 bp)와 cox1(428 bp)이 증폭됨을 보여주는 사진.
도 2a 및 2b는 각각 Pythium종의 ITS 계통수 및 cox1 계통수.
도 3은 P. porphyrae 및 P. chondricola의 cox1 서열.

이하 첨부된 도면과 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 첨부된 도면이나 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 cox1 (cytochrome c oxidase subunit 1) 부위의 서열을 비교하는 것을 특징으로 하는 김 붉은갯병의 병원균 결정방법에 관한 것이다. 본 발명은 cox1을 비교함으로써 한국 김의 붉은갯병 병원균이 종래 알려진 것과는 달리 P. porphyrae가 아닌 P. chondricola인 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 된 것이다.

이때 cox1의 증폭을 위해서 서열번호1 및 서열번호2로 이루어진 프라이머 세트를 이용할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 P. ultimum (NC_014280)의 미토콘드리아 전체서열(=PU서열)을 참조하여 개발하였다.

보다 상세하게 본 발명은 다음과 같은 단계들로 이루어질 수 있다. :

먼저 (A) 붉은갯병 감염이 의심되는 김 시료 또는 환경해수시료를 준비한다. 이어서, (B) 통상의 방법에 따라 시료의 전체 게놈 DNA를 추출한 후, (C) 추출된 전체 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 cox1을 증폭한다. 이때 cox1 증폭을 위한 프라이머 세트로 상기 서열번호1 및 2를 이용할 수 있다. 이어서 (D) 증폭된 cox1의 서열을 분석하여 P. porphyrae 및 P. chondricola의 cox1 서열과 비교한다. 도 3에 도시된 바와 같이 위 두 종의 cox1 서열은 1% (4염기/총386염기)의 차이가 있으므로 이에 의해 종 구별이 가능하게 된다.

한편, P. porphyrae인지 P. chondricola인지를 밝히기 이전에, 과연 감염이 의심되는 김 시료 또는 환경해수시료에 '붉은갯병' 병원균이 있는 것인지 확인하는 것도 필요할 수 있다. 이를 위해, 본 발명은, 단계(B) 이후 즉 시료의 전체 게놈 DNA를 추출한 이후에, (E) 추출된 전체 게놈 DNA를 주형으로 하여 ITS (internal transcribed spacer)를 증폭하고, (D) 증폭된 ITS의 서열을 분석하여 Pythium 속의 ITS 서열과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어 ITS 서열 분석결과 Pythium속의 그것이 발견되지 않는다면 위 시료는 붉은갯병과 관계없는 것이 되므로 다른 병원균인지를 탐색하게 되며, Pythium속의 그것이 발견되면 정확한 병원균 확정을 위해 cox1의 서열을 분석하는 것이다.

[실시예]

1. 붉은갯병 감염엽체 및 환경해수의 입수

붉은갯병 병원체의 식별을 위해 3가지 시료를 준비하였다. 첫째, 군산 비안도 양식장에서 붉은갯병에 감염된 방사무늬김의 엽체를 채취(2014년 12월)하였다. 질병증상에 따른 형태적 특이성으로 조류(藻類) 병원균에 의한 감염여부를 일차적으로 판단하였다. 둘째, 신안 압해도 양식장에서 채취(2014년 12월)한 감염된 방사무늬김으로부터 Pythium 배양 균주를 분리하였으며, 이를 해조류바이오연구센터(국립수산과학원, 목포, 한국)에 보관 중이다. 배양균주는 콘밀아가를 이용하여 실내조건에서 배양하여 Pythium 배양시료로 이용하였다. 셋째, 낙동강 하구의 김 양식장 부근에서 환경해수시료를 채취(2011년 8월)하였다.

2. 시료로부터 전체 게놈 DNA 추출, ITS 및 cox1 부위 증폭

(1) DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen 사, USA)를 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 시료들로부터 각각 전체 게놈 DNA를 추출하였다.

(2) Pythium종의 ITS 부위 증폭을 위해 박 등(Park CS, Kakinuma M, Amano H (2001) Detection of the red rot disease fungi Pythium spp. by polymerase chain reaction. Fish Sci 67:197-199)이 제안한 프라이머 세트를 이용하였다.

Pythium종의 미토콘드리아 cox1 (cytochrome c oxidase subunit 1) 부위의 증폭을 위해, GenBank에 등록된 P. ultimum (NC_014280)의 미토콘드리아 전체서열(=PU서열)을 참조하여 아래 표와 같은 Pythium속에 특이적인 프라이머 세트 [서열번호1, 서열번호2]를 개발하였다. 서열번호1 및 2는 각각 PU서열의 36405-36426 및 36813-36832 서열에 해당한다.

증폭은 20 μl로 AmpliXand를 가지고 PCR 조건 95도 2분 그리고 94도 30초, 48도 30초 및 72도 1분을 40회 반복하였고, 최종 72도에서 7분간 처리하였다.

PCR산물은 양방향으로 시퀀싱하였고, 크로마토그램은 Sequencher 5.3프로그램을 사용하여 분석하였다.

(3) PCR 및 분석 결과, ITS의 경우 프라이머 포함 707 bp, cox1은 428 bp의 증폭산물을 확보하였다(도 1). ITS의 경우 엽체, 배양시료 및 환경해수시료 모두에서 결과를 얻었다. 환경시료의 경우 아주 약한 밴드를 보였으나, 시컨싱은 성공적으로 이루어졌다. cox1 부위의 경우 방사무늬김 감염 엽체와 Pythium 배양시료에서만 결과를 확보하였다.

ITS와 cox1에 대한 염기서열유사도 분석은 GenBank의 Blast기능을 사용하였고, 분자계통분석을 위해서 GenBank에서 참고서열을 획득하고 ClustalX를 이용하여 정렬하였다. 계통수는 PAUP 4.0을 이용하여 NJ 방법으로 분석하였고, 이에 대한 bootstrap분석은 2000 replicates를 이용하여 수행하였다.

유사도 분석을 통하여 상기 세 시료 모두 동일한 ITS염기서열을 가지고 있었으며, GenBank의 참고서열 P. porphyrae (Korea - AB043506; Japan - AY598673, AB185111, AB043506; USA - JQ898472) 및 P. chondricola (the Netherlands - AY598620, HQ643496, HQ643497, HQ643498; USA - HQ643499)와 100% 일치도를 보였다.

ITS 계통수에서, 상기 세 시료는 P. porphyrae (Korea, Japan and USA), P. chondricola (Netherlands)와 함께 단일한 분지(clade)를 이루었으며, P. chondricola (EF016916, Thailand)와는 먼 근연관계를 보였다(도 2a).

반면에 cox1의 경우(환경시료에서는 확인되지 않음) 모두 P. chondricola (the Netherlands - HQ708542, HQ708543, HQ708544; USA - HQ708545)와 100% 일치도를 보였지만 P. porphyrae (Japan-HQ708794)와는 99% (382/386)의 일치도를 보였다(도 3 참조).

cox1 계통수에서는, 상기 두 시료는 네덜란드와 미국에서 보고된 P. chondricola 서열들과 같은 분지를 형성하고, 일본에서 보고된 P. porphyrae와는 계통수에서 분리된 별도의 계통군을 형성하였다(도 2b).

이상과 같은 분석결과, 한국 방사무늬김의 붉은갯병 병원균은 종래 알려진 P. porphyrae이 아니거나, 최소한 P. chondricola도 붉은갯병을 유발하는 병원균임을 알 수 있다.

P. chondricola는 네덜란드의 염분 호수 근처에서 채집된 부패한 Chondrus crispus에서 처음으로 분리 보고된(De Cock 1986) 이후 미국에서 보고된 바 있다. 따라서 본 발명자들은 이들 두 지역을 제외한 지역에서 P. chondricola를 처음 발견한 것이며, 또한 P. chondricola가 김의 붉은갯병을 유발함을 처음 확인한 것이다.

<110> Republic of Korea(National Fisheries Research and Development Institute) <120> Method for Deciding Pathogen of Red Rot Disease <130> P0515-405 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 attagaatgg aattagcaca ac 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cttaaaccwg gagctctcat 20

Claims

삭제
붉은갯병 감염이 의심되는 김 시료 또는 환경해수 시료에서 추출된 전체 게놈 DNA로부터 Pythium 속의 cox1 (cytochrome c oxidase subunit 1) 유전자 증폭을 위한 서열번호1 및 서열번호2로 이루어진 프라이머 세트.
(A) 붉은갯병 감염이 의심되는 김 시료 또는 환경해수시료를 준비하는 단계;
(B) 시료의 전체 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(C) 추출된 전체 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항에 의한 프라이머 세트를 이용하여 cox1을 증폭하는 단계;
(D) 증폭된 cox1의 서열을 분석하여 P. porphyrae 및 P. chondricola의 cox1 서열과 비교하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 김 붉은갯병의 병원균 결정방법.
제 3 항에 있어서,
단계(B) 이후에
(E) 추출된 전체 게놈 DNA를 주형으로 하여 ITS (internal transcribed spacer)를 증폭하는 단계;
(F) 증폭된 ITS의 서열을 분석하여 Pythium 속의 ITS 서열과 비교하는 단계;
를 추가로 포함하며,
상기 단계(E) 및 단계(F)의 진행 순서는 단계(C) 및 단계(D)와 무관한 것을 특징으로 하는 김 붉은갯병의 병원균 결정방법.