CN102787115A

CN102787115A - 百合属est-ssr标记及应用

Info

Publication number: CN102787115A
Application number: CN2012102703286A
Authority: CN
Inventors: 杜方; 高中山; 夏宜平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2012-07-30
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2032-07-30
Also published as: CN102787115B

Abstract

本发明分子生物学DNA标记技术与应用领域，旨在提供4个百合属EST-SSR标记及应用。该4个标记分别是一组引物对，其序列如SEQ ID NO: 1-8所示。本发明的4个分子标记在26个百合种或品种中有多态性，在26个百合种或品种中进行的遗传多样性分析与百合属植物分类常识相吻合(图1)，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的4个引物对应用于更多百合属植物上，进行种质资源和遗传多样性分析。本发明的4 个分子标记均来自于百合花发育相关基因EST序列，为克隆百合属植物花发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的基础。

Description

百合属EST-SSR标记及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学DNA标记技术与应用领域，特别涉及4个百合属EST-SSR标记及应用。

背景技术

分子标记广泛应用于种质资源遗传多样性分析以及辅助育种工作中。百合属的分子标记研究始于1993年，然而限于科学技术发展的水平，之后的十多年在百合属植物上开发的标记主要是以随机扩增多态性DNA(RAPD)为主的第一代分子标记，这类标记重复性较差。表达序列标签(Express sequence tag,EST)中含有许多简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)，已经成为普遍认可的第二代分子标记，具有重复性好，共显性，易于检测的特点。

2008年和2011年，杨素丽和Sung-Il Lee 分别利用GeneBank公布的百合属EST序列(分别为1688条和2235条)开发了12条和19条EST-SSR标记。分子标记的数量影响着种质资源遗传多样性分析的准确性和遗传图谱构建的精确性，现有的百合属分子标记数量远远不能满足百合属分子生物学研究的需求。

为开发更多的标记，本发明利用GeneBank公布的百合属的3332条EST序列(截止2012年6月20日)以及MISA软件寻找SSR，合成了48对引物，经5类百合品种和2个野生型百合共26个不同基因型百合筛选，得到4个不同于前人的具有多态性的通用型标记。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供4个新的百合属EST-SSR标记及应用。

为了解决技术问题，增加百合属分子标记的数量以应用于今后的育种工作中，本发明提供了4个新的分子标记。所述百合属EST-SSR标记分别是一组引物对，其序列如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 8所示。

本发明还提供了所述的百合属EST-SSR标记在百合属植物种质资源遗传多样性分析以及辅助育种中的应用。

本发明提供4个百合属分子标记，4个分子标记的特征如表1所示：

表1 百合属EST-SSR标记的特征（SEQ ID NO：1-8）

本发明4个百合属EST-SSR标记是通过下述方法得到的：

（1）利用GeneBank公布的3332条百合属EST序列和MISA软件寻找到1277个重复基元，选取其中两碱基和三碱基重复次数大于5的48个SSR序列设计了48对引物,引物设计的原则为：最终产物长度为100-230bp,引物长度为18-22bp,退火温度为60℃。在设计好的正向引物的5'端统一加18个bp的尾巴(M13- TGTAAAACGACGGCCAGT)，另合成添加了NED、PET、FAM和HEX四种不同荧光基团标识的退火温度为53℃的引物，引物委托上海英潍捷基贸易有限公司合成；

（2）用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecy trimethyl ammonium bromide)法提取白精灵、莱瑞芙和索邦三个百合品种基因组DNA；

（3）采用SSR分子标记方法进行百合分子标记的筛选：以白精灵、莱瑞芙和索邦三个百合品种基因组DNA为模板进行PCR扩增：在20μl反应体系中分别加入10×PCR buffer(Mg2+) 2μl, 2mM dNTP 0.2μl, 5U rTaq DNA polymerase 0.1μl, 正向引物0.1μl，反向引物0.5μl，荧光标识引物0.4μl，50ng/μl DNA 模板 2μl。使用Eppendorf Mastercycler 进行DNA扩增，具体步骤为：94℃预变性5min,94℃(30s)/55℃(45s)/72℃(45s) 32个循环，之后94℃(30s)/53℃(45s)/72℃(45s) 10个循环，最后72℃延伸10min。产物检测：在含有0.5% μg/μl EB 的3% 的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。

（4）将初步筛选的有扩增产物的引物在另外26个不同基因型百合上进行扩增，于ABI遗传分析仪上进行分析，使用Gene Mapper version4.0 读取数据，NTSYS进行分析。

本产品发明的有益效果是：

（1）本发明的4个分子标记在26个百合种或品种(表2)中有多态性，在26个百合种或品种中进行的遗传多样性分析与百合属植物分类常识相吻合(图1)，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的4个引物对应用于更多百合属植物上，进行种质资源和遗传多样性分析。

（2）本发明的4 个分子标记均来自于百合花发育相关基因EST序列，为克隆百合属植物花发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的基础。

附图说明

图1为基于4个SSR位点数据构建的26份百合属植物UPGMA聚类图。

图中的品种或种名后的字母代表百合的类型：O, 东方百合杂种；OT，东喇百合杂种；W，野生型百合；A，亚洲百合杂种；LA，铁亚百合杂种。

具体实施方式

本发明中，用EST序列开发百合属SSR标记的具体做法是：

一、提取DNA

（1）配制DNA提取缓冲液：2% CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0和DNA溶解缓冲液TE：10 Mm Tris；1 Mm EDTA；PH=8.0。

表2 本发明实现方案中所用到的不同基因型百合

（2）对上述百合材料分别进行如下处理：

A、用天平迅速称取约0.2 g贮藏于-80℃冰箱中的百合嫩叶，用液氮于研钵中研磨。将粉末转入盛有4 ml CTAB溶液与80 μl β-巯基乙醇（65℃预热）的10 ml离心管中，65℃水浴1 h；加入4 ml氯仿/异戊醇（24:1），混匀，12，000转离心10 min，取上清液并再次加入4 ml氯仿/异戊醇（24:1），混匀，12，000rpm离心10 min。

B、在上述步骤A离心后所得的上清液中加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。10,000rpm离心2min，去上清液。

C、用75％的乙醇清洗步骤B所得DNA沉淀物2次。

D、将上述步骤C洗涤后的DNA晾干并溶于400 μl的TE缓冲液中，加入2 μl RNAase 酶（10 mg/ml）以去除RNA。

E、往上述步骤D得到的DNA粗提液中加入400 μl的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀后1.2，000rpm离心10 min。吸取上清液，加入400 μl氯仿/异戊醇（24:1）混匀后在同样条件下离心。

F、吸取上述步骤E中的上清液，用同上述步骤B、C的方法沉淀、清洗DNA后加入200 μl的TE 缓冲液溶解。

G、紫外分光光度法检测上述步骤F所得的DNA样品的浓度，1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。

二、SSR分析：

利用GeneBank公布的3332条百合属EST序列设计了48对引物，委托上海英潍捷基贸易有限公司合成，具体如表3所示：

表3 合成的48对EST-SSR引物序列

引物名称	左翼引物序列	右翼引物序列
			BE034671Y	TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGGAATTCGGCACGAG	GCCACATTGGACCATAAACC
BP176746	TGTAAAACGACGGCCAGTGTGAAGATCAGCAGCAGCAA	ATCATCGTCGTCATCGTCAA
			BP176823	TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTTCCTCATTTTCCACGG	AAGAATGAGATGGCTGTGGG
BP176985	TGTAAAACGACGGCCAGTATGTCCGTCTCTTTTCCTGC	CCATGTTCCTCTCCTTTCCA
			BP177041	TGTAAAACGACGGCCAGTACTGGGATGCTGAGAACCAG	TTCTTACCAACAGATTTACAAAAACA
BP177115	TGTAAAACGACGGCCAGTGACATAAGTGCAAGTGCCGA	CAGGTGAGTTTTCAGGGCTC
			BP177136	TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGATGCCTCGAGTGAGGA	TCGTGATCGATATCTCGTCTTC
BP177143	TGTAAAACGACGGCCAGTTGCCAGTCAATCTGTGAAGC	TGTCCAACATACTTCGCCTG
			BP177146	TGTAAAACGACGGCCAGTAATAGGCATGCCCTCATCAC	ACATTCAAGAGAAAGGGCGA
BP177173	TGTAAAACGACGGCCAGTGGCCCACTGGTTCTCCTTAC	GATCAGGCCACCCTTTATGA
			BP177196	TGTAAAACGACGGCCAGTGATCAGGCCACCCTTTATGA	GGCCCACTGGTTCTCCTTAC
BP177243	TGTAAAACGACGGCCAGTCATCATCAGATGTGGCAACC	GAATGGCCAGTTGAAGCC
			BP177270Y	TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTTCCTTCTTCGGCTCA	TCTTGGATCAGTTGGTGCTG
BP177427	TGTAAAACGACGGCCAGTATGTCCGTCTCTTTTCCTGC	CCATGTTCCTCTCCTTTCCA
			BP177457Y	TGTAAAACGACGGCCAGTCACCCAGGCGTAAGAAGAAG	GCACCTGTGTCAACACCCTA
BP177524	TGTAAAACGACGGCCAGTTACAAGGGCAGCCTGAAGTT	AGCATACTAGTCGAGGGCCA
			BP177542Y	TGTAAAACGACGGCCAGTAACCTACCTCCACCCCTACC	CAGAATCAGAGAGGCGGAAC
BP177547	TGTAAAACGACGGCCAGTGGAACCCCTAGGAGACGAAG	CATCCTCCTCTTGCATCCAT
			CF651039	TGTAAAACGACGGCCAGTAAACGATGATGTCTGTCCATC	ATAAACGGGTAGGGTTTGGG
CF651108	TGTAAAACGACGGCCAGTGAAACGATGATGTCTGTCCATC	GGGTAGCAGCACTTGCTAGG
			CF651121	TGTAAAACGACGGCCAGTGCGCTCTGTAGTGTGTTCCA	CCCGGATTAAATTCCTTCCT
CF651123	TGTAAAACGACGGCCAGTTGCGCTCTGTAGTGTGTTCC	ATGCCATGAAAACGAAGAGG
			CF651127	TGTAAAACGACGGCCAGTTGCGCTCTGTAGTGTGTTCC	ATGCCATGAAAACGAAGAGG
CF651172	TGTAAAACGACGGCCAGTTGCGCTCTGTAGTGTGTTCC	ATGCCATGAAAACGAAGAGG
			CF651177	TGTAAAACGACGGCCAGTGCTGAGAAGAAGCCCAATTC	CCTGCTTGAGAACCTTGAAGA
CF651184	TGTAAAACGACGGCCAGTAGCGGGTAGACCTTAGGCAT	ATGCCATGAAAACGAAGAGG
			DN985079	TGTAAAACGACGGCCAGTTTAAGTGTTGGGTGTCGCTG	TGAACACAAGGGATAAAAGCTG
DN985087	TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCATCACAAAAAGAGAGC	AGATCAAGAGTCGCCGAAAC
			DN985149	TGTAAAACGACGGCCAGTGCCACAATAAACGATGATGTCT	CTTGGCATCGAGAGGTTGTT
DN985153	TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTGAAGAATGCTGTCGG	TGCTCTGCTCTCACCGAGTA
			DW717930	TGTAAAACGACGGCCAGTGCGCTCTGTAGTGTGTTCCA	CAGACATGCCAGGATAACGA
DW718008	TGTAAAACGACGGCCAGTACGGTTGGACAGTTTGGTTC	TCTTGCAGAATTCGCCTCTT
			DW718012	TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGGGAGAGAGAGGGAGAG	AAGGCCACCAACATTAGCAC
DW718057	TGTAAAACGACGGCCAGTGCTGGAGCAAGAGAAATTGG	ACATTTGTTGGTCCCTCCTG
			DW718104	TGTAAAACGACGGCCAGTAATGGAGAGCCATTGGAGTG	CCAAAATTAGGCCCCAGAAT
FP038833	TGTAAAACGACGGCCAGTCACAAATCATTTTCGTGACTCAT	GCTCAGCTTCTGTTGGGTTC
			GT229446	TGTAAAACGACGGCCAGTGGGGCTCTTCATTCGTGTAG	TAATGGCGGGTTTTCTTGTC
GT229509	TGTAAAACGACGGCCAGTAGTCAGTGAGCGAGGAAGG	CCTTGAGGAGATCAACCTGC
			GT229558	TGTAAAACGACGGCCAGTGAGTCAGTGAGCGAGGAAGG	CATGTTACCGATGTCTCCGA
GT229572	TGTAAAACGACGGCCAGTCGCCTGCTGAATCTTAAAGC	ATCACACCCAAAATGGGAAA
			GT229575	TGTAAAACGACGGCCAGTGTCAGTGAGCGAGGAAGGG	GTGACTTGGCGGTTGATCTT
GW589891	TGTAAAACGACGGCCAGTAAACCCTCCACCGAATCC	ATTTGATGGAGCAGGAGGTG
			GW590330	TGTAAAACGACGGCCAGTCCCGCTGCAACAGTTTTAAT	TGGGTTCCATAATCGGATGT
GW590502	TGTAAAACGACGGCCAGTTCCCGTTCTTACCAGCTCTC	GGGGTTCACCAGAGACTTGA
			GW590602	TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTGAAGAATGCTGTCGG	CAGGCAGCCAAACACCTATT
GW590969	TGTAAAACGACGGCCAGTAACCCGCGAAACAACATAAG	GGTGGCGAAGAATATACGGA
			GW591060	TGTAAAACGACGGCCAGTGCAAAATTACCCGACCAAAA	TAGGAGAGCTTGACTGGGGA
GW591179	TGTAAAACGACGGCCAGTCAACTCCTCCTATCCAACGC	GGTAAGAGGAGTGGGGGAAG

1、PCR扩增

（1）反应体系为：

10×PCR buffer(Mg2+) 2μl, 2mM dNTP 0.2μl, 5U rTaqDNA polymerase 0.1μl, 正向引物0.1μl，反向引物0.5μl，荧光标识引物0.4μl，20ng/μlDNA 模板2μl，加ddH2O至20μl。

（2）反应程序：

94℃预变性5min，94℃(30s)/55℃(45s)/72℃(45s) 32个循环，之后94℃(30s)/53℃(45s)/72℃(45s) 10个循环，最后72℃延伸10min。

2、电泳检测：

取上述扩增产物10μl在含有0.5% μg/μl EB 的1% 的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。

首先利用48对SSR引物对白精灵、莱瑞芙和索邦三个百合品种进行SSR分析，电泳检测有扩增产物的引物在另外26个不同基因型百合上进行相同条件的PCR扩增，扩增产物经稀释后加入内参LIZ500于ABI3130遗传分析仪上进行多样性分析，发现有4个标记（即本发明所述标记SEQID NO：1-8，其特征如表1所示）在26个不同基因型百合上表现多态性，系统树表明这4个标记能将26个不同基因型百合分为东方百合和亚洲百合两大类，其中东喇百合杂种散布于东方百合类型中，亚洲百合大类中又包括亚洲百合，铁炮百合和铁亚百合杂种，这种分类与百合经典的形态学分类相符合，说明这4对引物可以用于百合种质资源遗传多样性分析和亲缘关系研究中。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种百合属EST-SSR标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。

2.一种百合属EST-SSR标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示。

3.一种百合属EST-SSR标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示。

4.一种百合属EST-SSR标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示。

5.权利要求1至4任意一项中所述的百合属EST-SSR标记在百合属植物种质资源遗传多样性分析以及辅助育种中的应用。