CN105154528B - 同时检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒 - Google Patents

同时检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了同时检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒，属于多重PCR检测技术领域。本发明试剂盒含有三对分别针对空肠弯曲菌血清型HS:41、HS:19、HS:2的特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2，SEQ ID NO.3‑4，SEQ ID NO.5‑6所示。本发明还提供了用于检测空肠弯曲菌上述三种血清型的特异性靶序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示。本发明基于空肠弯曲菌各血清型的特异序列建立多重PCR检测试剂盒对空肠弯曲菌上述三种血清型检测灵敏度、特异度均为100％，具有检测准确，节约成本，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

Description

同时检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒
技术领域
本发明涉及PCR检测技术领域，特别是涉及用于检测空肠弯曲菌血清型HS:41、HS:19、HS:2的特异性引物对组合和三重PCR检测方法，本发明还涉及同时检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒。
背景技术
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是弯曲菌属中主要导致人类疾病的食源性病原菌，是导致人类腹泻的主要病原之一。空肠弯曲菌分布广泛，人类感染主要是由于空肠弯曲菌污染食品、饮用水以及环境引起的，除肠炎外，空肠弯曲菌的感染可导致格林-巴利综合症(Guillian-Barre syndrome，简称GBS)，给人类带来严重的疾病负担。国内外对空肠弯曲菌的监测都非常关注。
空肠弯曲菌感染后导致GBS的机率不大，但特异菌型菌株，如血清型(Pennerheat-stable serotype，HS)为HS:41，HS:19，HS:2的菌株感染后导致GBS的危险度大大增高。血清型为HS:41菌株的感染，曾经导致我国36人GBS的暴发。对于这种感染后可导致严重疾病后果的空肠弯曲菌血清型的鉴别确定有利于疾病防控和保障公共卫生安全。
目前空肠弯曲菌的血清型鉴定试剂匮乏、昂贵，实验步骤繁琐，需要有经验的专业人员操作，造成空肠弯曲菌血清分型的困难。因此迫切需要一种快速、准确、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌血清型HS:41，HS:19，HS：2的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供用于同时检测空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)三种血清型HS:41，HS:19，HS：2的特异性引物对组合。
本发明的另一个目的在于提供能够同时检测空肠弯曲菌HS:41，HS:19，HS：2血清型的试剂盒。
为实现上述目的，本发明通过对决定菌株血清型的荚膜多糖(polysaccharidecapsule，简称CPS)合成相关基因簇的特异核苷酸序列的检测确定弯曲菌的血清型特征。对HS:41，HS:19，HS：2三种血清型空肠弯曲菌分别找出其共同的CPS合成基因簇相关DNA序列，以及区别于其它血清型的特异DNA序列，在NCBI上进行BLAST比对，确定筛选出这些序列针对上述三种血清型菌株的共同性以及特异性。通过比对，获得HS:41，HS:19，HS：2三种血清型菌株共有而其它血清型菌株中不存在的三段特异序列：HS:41血清型菌株特异性序列命名为SE-HS41-3,HS：19血清型菌株特异序列命名为SE-HS19-1，HS：2血清型菌株特异序列命名为SE-HS2-4，具体核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-9所示。
Vector NTI Suite 6比对已测序HS：41，HS:19，HS：2的CPS相关基因的特异序列一的保守性。并用primer premier 5设计引物，引物设计避开序列的突变点，同时要考虑所设计的三对引物之间以及引物与靶序列之间不错配，不出现二级结构，并且三对引物扩增的目的片段的长度具有区别度，大小不能太接近。
经过反复验证对比，最终确定用于检测空肠弯曲菌三种血清型的特异性引物对组合，分别为：
用于检测血清型HS:41的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、2所示；
用于检测血清型HS:19的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3、4所示；
用于检测血清型HS:2的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5、6所示。
进一步地，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:41试剂盒或诊断试剂中的应用。
本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物对在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:19试剂盒或诊断试剂中的应用。
本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物对在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:2试剂盒或诊断试剂中的应用。
在本发明的实施例中，使用序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对空肠弯曲菌血清型HS:41采用PCR方法检测，反应条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃10min，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，若目的条带为328bp，则说明待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:41。
在本发明的实施例中，使用序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物对空肠弯曲菌血清型HS:19采用PCR方法检测，反应条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃10min，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，若目的条带为649bp，则说明待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:19。
在本发明的实施例中，使用序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物对空肠弯曲菌血清型HS:2采用PCR方法检测，反应条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃10min，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，若目的条带为780bp，则说明待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:2。
进一步地，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.7所述的靶序列在检测空肠弯曲菌血清型HS:41中的用途以及该靶序列在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:41的试剂盒或试剂中的用途。
SEQ ID NO.7编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
进一步地，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.8所述的靶序列在检测空肠弯曲菌血清型HS:19中的用途以及该靶序列在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:19的试剂盒或试剂中的用途。
SEQ ID NO.7编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步地，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.9所述的靶序列在检测空肠弯曲菌血清型HS:2中的用途以及该靶序列在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:2的试剂盒或试剂中的用途。
SEQ ID NO.7编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明提供了含有上述3对特异性引物对的组合在制备检测空肠弯曲菌血清型试剂盒中的应用。
本发明提供了含有上述特异性引物对组合的试剂盒。
本发明的试剂盒是以上述针对3种血清型的特异性引物对组合为引物，以待测菌DNA为模板，进行PCR，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳结果显示目的条带为328bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:41；若电泳结果显示目的条带为649bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:19；若电泳结果显示目的条带为780bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:2。
优选地，本发明试剂盒的25μl PCR反应体系为，Easy SuperMix 12.5μl，ddH2O8.5μl，3对特异性引物对的上、下游引物均为0.5μl，浓度均为10μM，DNA模板1μl。
优选地，本发明试剂盒的PCR的反应程序为：
94℃预变性5min；
94℃变性1min，60℃退火1min，72℃1min，30个循环；
72℃7min；4℃保持。
本发明提供了一种非诊断目的的检测空肠弯曲菌三种血清型的方法，所述三种血清型为HS:41、HS:19和HS:2，同时使用3对特异性引物，通过一次PCR反应，对待测菌DNA进行检测，若将扩增产物大小为328bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:41；若扩增产物大小为649bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:19；若扩增产物大小为780bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:2；
所述3对特异性引物分别为：
用于检测血清型HS:41的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、2所示；
用于检测血清型HS:19的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3、4所示；
用于检测血清型HS:2的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5、6所示。
本法提供的非诊断目的的检测空肠弯曲菌三种血清型的方法中PCR反应的反应程序为：94℃预变性5min；
94℃变性1min，60℃退火1min，72℃1min，30个循环；
72℃7min；4℃保持。
本发明还提供了用于检测空肠弯曲菌三种血清型的特异性靶序列组合，分别是：检测血清型HS:41的特异性靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；检测血清型HS:19的特异性靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；检测血清型HS:2的特异性靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
上述用于检测空肠弯曲菌三种血清型的特异性靶序列组合，检测血清型HS:41的特异性靶序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；检测血清型HS:19的特异性靶序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；检测血清型HS:2的特异性靶序列，其氨基酸序列如SEQID NO.12所示。
本发明以病原编码CPS核苷酸遗传物质的多样性和特异性为基础，首先获得空肠弯曲菌病原的编码CPS特异的DNA序列，再根据CPS的多样性找出各自血清型别中的特异序列，建立了高特异度、并且重复性稳定的多重PCR的检测方法，通过识别菌株特异的DNA序列，从而确定菌株的血清型，大大提高了高致病性菌株识别的灵敏度和特异度。利用本发明获得的各血清型的特异序列建立的多重PCR检测方法对三种型别细菌检测的灵敏度、特异度均为100％。本发明建立的多重PCR检测空肠弯曲菌三种血清型方法操作简单，大大降低了检测成本以及操作难度。为防治和监测空肠弯曲菌病提供技术支持。
附图说明
图1为SEQ ID NO.1-2所示的引物PCR检测空肠弯曲菌的电泳结果，图中，泳道M为DL2000marker，泳道1为血清型为HS:41的空肠弯曲菌HN-CJD07035，泳道2为血清型为HS:2的空肠弯曲菌BJ-CJH18，泳道3为血清型为HS:2的空肠弯曲菌NCTC11168，泳道4为血清型为HS:19的空肠弯曲菌BJ-CJGB96G25；图中A为引物对HS41-1的扩增产物，B为引物对HS41-2的扩增产物，C为引物对HS41-3的扩增产物，D为引物对HS41-4的扩增产物。
图2为SEQ ID NO.3-4所示的引物PCR检测空肠弯曲菌的电泳结果，图中，泳道M为DL2000marker，泳道1为血清型为HS:19的空肠弯曲菌BJ-CJGB96G25，泳道2为血清型为HS:19的空肠弯曲菌HB-CJGB-LXC，泳道3为血清型为HS:41的空肠弯曲菌HN-CJD07035，泳道4为血清型为HS:2的空肠弯曲菌NCTC11168；图中A为引物对HS19-1的扩增产物，B为引物对HS19-2的扩增产物，C为引物对HS19-3的扩增产物，D为引物对HS19-4的扩增产物。
图3为SEQ ID NO.5-6所示的引物PCR检测空肠弯曲菌的电泳结果，图中，泳道M为DL2000marker，泳道1为血清型为HS:2的空肠弯曲菌NCTC11168，泳道2为血清型为HS:2的空肠弯曲菌HB-CJGB-QYT，泳道3为血清型为HS:41的空肠弯曲菌HN-CJD07035，泳道4为血清型为HS:19的空肠弯曲菌BJ-CJGB96G25；图中A为引物对HS2-1的扩增产物，B为引物对HS2-2的扩增产物，C为引物对HS2-3的扩增产物，D为引物对HS2-4的扩增产物。
图4为本发明的三重PCR同时检测三种血清型的空肠弯曲菌结果；M为DL2000marker，泳道1为血清型为HS:41的空肠弯曲菌HN-CJD07035，泳道2为血清型为HS:41的空肠弯曲菌ICDCCJ07001，泳道3为血清型为HS:19的空肠弯曲菌BJ-CJGB96G25，泳道4为血清型为HS:19的空肠弯曲菌HB-CJGB-LXC，泳道5为血清型为HS:2的空肠弯曲菌NCTC11168，泳道6为血清型为HS:2的空肠弯曲菌HB-CJGB-QYT；图中A为引物对HS41-3的扩增产物，B为引物对HS19-1的扩增产物，C为引物对HS2-4的扩增产物。
图5A和图5B为本发明的三重PCR方法的灵敏度、特异性检测结果。图5A中，M为DL2000marker，泳道1-4分别分别为血清型为HS:2的空肠弯曲菌CJD59、CJD97、HB-QYT、CJH18；泳道5-8分别为血清型为HS:3的空肠弯曲菌CJD55、CJD113、CJD5、06017；泳道9为HS:12空肠弯曲菌CJD70；泳道10-14、16分别为HS:19空肠弯曲菌CJD101、HB-LXC、HB-ZB、CJD101、:96144、HB-ZHX；泳道15为HS:2空肠弯曲菌95377；泳道17为HS:21空肠弯曲菌JL-Liu1-1；泳道18-19为空肠弯曲菌HS:31CJD39、JL-Yin3-1；泳道20-23为HS:37空肠弯曲菌CJD29、CJD83、HB-LL、HB-ZX；泳道24为HS:41空肠弯曲菌07001；泳道25为水作为空白对照；泳道26为血清型为HS41、HS19、HS2的空肠弯曲菌的混合模板，作为阳性对照。
图5B中，M为DL2000marker，泳道1-3分别为血清型为HS:41的空肠弯曲菌07002、07004、07035；泳道4-5分别为血清型为HS:1/44的空肠弯曲菌CJD120、CJD81；泳道6-10分别为血清型为HS:6/7的空肠弯曲菌CJD106、CJD95、CJD63、CJD131、CJD100；泳道11为血清型为HS:53的空肠弯曲菌HB-XWM；泳道12-14为未分型的空肠弯曲菌；泳道15为结肠弯曲菌；泳道16为链球菌；泳道17为幽门螺杆菌；泳道18为水(空白对照)；泳道19为血清型为HS41、HS19、HS2的空肠弯曲菌的混合模板(阳性对照)，HS：2为菌株11168，HS：19为菌株96G25，HS：41为菌株ICDCCJ07001。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本实施例中涉及的空肠弯曲菌不同血清型不同分离株均来自中国疾病预防控制中心。
实施例1空肠弯曲菌三种血清型特异DNA序列的确定
本发明通过对决定菌株血清型的荚膜多糖(polysaccharide capsule，简称CPS)合成相关基因簇的特异核苷酸序列的检测确定弯曲菌的血清型特征。对HS:41，HS:19，HS：2三种血清型空肠弯曲菌的菌株测序，获得不同血清型菌株CPS合成相关基因簇序列，以及区别于其它血清型的特异DNA序列，确定针对HS:41，HS:19，HS：2三种血清型菌株特异核苷酸序列，在NCBI上进行BLAST比对，确定筛选出这些序列针对上述三种血清型菌株的共同性以及特异性。通过比对，获得HS:41，HS:19，HS：2三种血清型菌株共有而其它血清型菌株中不存在的三段特异序列：HS:41血清型菌株特异性序列命名为SE-HS41-3,HS：19血清型菌株特异序列命名为SE-HS19-1，HS：2血清型菌株特异序列命名为SE-HS2-4，具体核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-9所示，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10-12所示。
Vector NTI Suite 6比对已测序HS：41，HS:19，HS：2的CPS相关基因的特异序列一的保守性。以上每个血清型的特异区域的保守性非常好，几乎没有点突变；并且在NCBI上BLSAT上也无与其他种类菌株和空肠弯曲菌的其他任何血清型的序列有匹配，所以特异性高。
实施例2引物设计与确定
针对实施例1确定的3个血清型的3条特异性靶序列，用primer premier 5设计引物，引物设计避开序列的突变点，同时要考虑所设计的三对引物之间以及引物与靶序列之间不错配，不出现二级结构，并且三对引物扩增的目的片段的长度具有区别度，大小不能太接近。
针对HS:41的特性靶序列，本发明设计了4对引物，分别命名为HS41-1、HS41-2、HS41-3、HS41-4。其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.17-18所示。
针对HS:19的特性靶序列，本发明设计了4对引物，分别命名为HS19-1、HS19-2、HS19-3、HS19-4。其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.19-20、SEQID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24所示。
针对HS:2的特性靶序列，本发明设计了4对引物，分别命名为HS2-1、HS2-2、HS2-3、HS2-4。其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ IDNO.29-30、SEQ ID NO.5-6所示。
经过反复验证对比，结果见图1、图2、图3，综合考虑扩增结果的特异性、灵敏度，最终确定针对HS：41特异靶序列的特异引物序列如下，目标条带大小为328bp：
HS41-3：AGATGTATGGAAGGTATGTGGTC(SEQ ID NO.1)tm：55.2
HS41-3：TAAATGGGGTGCTCGTGAA(SEQ ID NO.2)tm：57.0
针对HS：19特异靶序列的特异引物序列如下，目标条带大小为649bp：
HS19-1：GAATGCGTTATGAGCAACAGGAT(SEQ ID NO.3)tm：61.1
HS19-1：GATCATCATCAAGCCTTTGC(SEQ ID NO.4)tm：55.3
针对HS：2特异靶序列的特异引物序列如下，目标条带大小为780bp：
HS2-4：CCCCGCCAGTAGTTAAGGT(SEQ ID NO.5)tm：56.8
HS2-4：AATGAGGCTACGATTCCGC(SEQ ID NO.6)tm：57.7。
实施例3多重PCR检测空肠弯曲菌三种血清型方法的建立
根据实施例2的比对结果，利用clone manager8软件对以上确定的引物组合中各对引物进行各血清型之间引物的匹配筛选，每个血清型选取一对引物(并且产物长度差距超过100bp)，建立多重PCR方法检测空肠弯曲菌HS41、HS19、HS2三种血清型。
利用实施例2最终确定的3对引物，通过优化PCR反应体系和反应程序，确定多重PCR检测空肠弯曲菌三种血清型的反应体系、反应程序分别为：
表1多重PCR反应体系优化结果
表2多重PCR反应程序：
提取以下6个菌株的DNA，作为模板，采用上述多重PCR方法进行血清型的检测。待测菌株分别为：血清型为HS:41的空肠弯曲菌HN-CJD07035，血清型为HS:41的空肠弯曲菌ICDCCJ07001，血清型为HS:19的空肠弯曲菌BJ-CJGB96G25，血清型为HS:19的空肠弯曲菌HB-CJGB-LXC，血清型为HS:2的空肠弯曲菌NCTC11168，血清型为HS:2的空肠弯曲菌HB-CJGB-QYT。检测结果见图4。
实施例4本发明方法的特异度和灵敏度评价
用无菌牙签挑取单个菌落，悬浮于100μl蒸馏水中，100℃2分钟后离心，取上清。取5μl作为模板按照实施例3的方法对各个血清型、各个菌种进行三重PCR。
对于已经确定血清型的菌株，包括血清型2、3、12、19、21、31、37、41、6/7、1/44、53等11种血清型共40株空肠弯曲菌及对照菌株链球菌、幽门螺杆菌等进行单菌落PCE扩增，扩增结果显示，使用本发明实施例3建立的多重PCR方法检测空肠弯曲菌三种血清型方法，仅血清型为2、19、41的菌株出现阳性扩增产物，且产物条带大小分别为780bp，649bp，328bp，其他血清型的空肠弯曲菌和其他菌种的菌株检测结果均为阴性，说明本发明方法的特异度为100％，单个菌落可扩增出产物，因此本发明方法鉴定空肠弯曲菌2、19、41三种血清型的灵敏度为100％，如图5A和图5B所示。
实施例5本发明方法的临床应用
选取来自北京、上海临床腹泻患者分离株192株，家禽、家畜来源菌株100株，共292株不同血清型的空肠弯曲菌。
1、利用日本生研试剂盒(Campylobacter Antisera Set(Cat 270030,Lot169026,DENKA SEIKEN CO.,LTD,Japan；Reagent for Preparing Sensitzed Blood Cells(Cat 271051,Lot 149031,DENKA SEIKEN CO.,LTD,Japan)进行血清分型分析，参照说明书操作进行。
血清型检测结果显示大部分菌株对抗血清的反应与对照血清相同，无法获得其确切的血清型，生研血清鉴定试剂盒仅鉴定出32株血清型。
表3 96孔板抗血清布局
2、采用本发明实施例3建立的多重PCR的方法进行鉴定，其中160株无法鉴定血清型，PCR检测结果显示为阴性，而日本生研试剂盒鉴定为HS:41，HS:19和HS:2的菌株，使用本发明多重PCR方法，鉴定结果一致。说明本发明的奖惩空肠弯曲菌三种血清型的方法具有100％的准确率。
表4本发明方法验证32株日本生研试剂盒鉴定出结果的菌株
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.用于检测空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)三种血清型的特异性引物对组合，其特征在于，
用于检测血清型HS:41的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、2所示；
用于检测血清型HS:19的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3、4所示；
用于检测血清型HS:2的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5、6所示；上述3对引物可通过一次PCR实现对空肠弯曲菌血清型HS:41、HS:19、HS:2的检测。
2.权利要求1所述的特异性引物对组合在制备检测空肠弯曲菌血清型试剂盒或诊断试剂中的应用。
3.含有权利要求1所述特异性引物对组合的试剂盒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其以权利要求1所述的特异性引物对组合为引物，以待测菌DNA为模板，进行PCR，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳结果显示目的条带为328bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:41；若电泳结果显示目的条带为649bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:19；若电泳结果显示目的条带为780bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:2。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，25μl PCR反应体系为，Easy SuperMix12.5μl，ddH2O 8.5μl，3对特异性引物对的上、下游引物均为0.5μl，浓度均为10μM，DNA模板1μl。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，PCR的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃7min；4℃保持。
7.一种非诊断目的的检测空肠弯曲菌三种血清型的方法，所述三种血清型为HS:41、HS:19和HS:2，其特征在于，同时使用3对特异性引物，通过一次PCR反应，对待测菌DNA进行检测，若将扩增产物大小为328bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:41；若扩增产物大小为649bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:19；若扩增产物大小为780bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:2；
所述3对特异性引物为：
用于检测血清型HS:41的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、2所示；
用于检测血清型HS:19的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3、4所示；
用于检测血清型HS:2的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5、6所示。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应程序为：94℃预变性5min；
94℃变性1min，60℃退火1min，72℃，1min，30个循环；
72℃7min；4℃保持。
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