CN104531867A - 产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量pcr快速检测试剂盒 - Google Patents

产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量pcr快速检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种特异检测产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌感染的荧光定量PCR检测试剂盒，包括：a)荧光定量反应液、b)产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品、c)阴性质控品；其中荧光定量反应液包含有引物2对和探针1对，为产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02以及荧光探针cpap；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02以及荧光探针cpep，本发明具有以下优点：能够对肠毒素cpe阳性的产气荚膜梭菌进行快速诊断；特异性好，灵敏度高，假阳性率低；检测速度快，仅需1个半小时。

Description

产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种特异检测产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌感染的荧光定量PCR检测试剂盒，属于细菌核酸检测领域，适用于临床及科研中对产气荚膜梭菌肠毒素阳性的快速定性定量检测。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人畜共患病的病原体，广泛存在于环境中的土壤、水源、人和动物肠道中。该菌的致病性主要依据其产生各种毒素的能力，到目前为止，共发现至少15种以上的产气荚膜梭菌毒素，除了分型的四种分型致死性毒素α、β、ε、ι毒素外，其中所有型的产气荚膜梭菌均含有外毒素cpα，还发现了与人和动物疾病有密切关系的重要的新细菌毒素，如肠毒素(clostridium perfringens enterotoxin,CPE)。虽然产肠毒素的产气荚膜梭菌约占产气荚膜梭菌的2～5％，但CPE阳性的产气荚膜梭菌可引起人的食物中毒、抗生素相关腹泻和散发性腹泻等非食源性胃肠疾病及动物胃肠疾病，与食品公共安全息息相关，目前根据国际最新标准，将检测样品中CPE阳性产气荚膜梭菌作为产气荚膜梭菌食物中毒的指标。
已有多种免疫学方法用于检测临床样品中的肠毒素，但是存在有检测的局限性，免疫学检测方法检测的是毒素蛋白，易出现假阴性的检测结果。主要是由于检测的样品如腹泻粪便等肠毒素含量处于较低水平，另一方面由于肠毒素产生于该菌的芽孢阶段，在体外培养时，很难形成芽孢产生肠毒素蛋白，因此按照常规的免疫学检测方法不能从人工培养物中检测到。随着PCR技术的广泛应用，对产气荚膜梭菌的检测从传统方法过渡到以PCR及杂交探针为主的快速检测现代方法，目前根据产气荚膜梭菌的不同毒素建立了多重PCR检测方法，可对产气荚膜梭菌进行检测与分型。虽然PCR方法灵敏度较高，特异性强，但也有一些缺陷，不能够检测极低病毒含量的临床样品，如何改进和提高方法的特异性仍有待进一步的研究。
荧光定量PCR检测技术在普通PCR的基础上又高了一个新的水平，无论敏感性、特异性与检测速度都具有显著优势。但它对引物和探针也提出了更高的要求。产气荚膜梭菌肠毒素cpe有两种基因型，一种是位于细菌染色体上，一种是细菌质粒上。
现有技术关于产气荚膜梭菌抗原、抗体检测及荧光定量PCR技术的文献很少，未涉及到产气荚膜梭菌外毒素cpa和肠毒素cpe的诊断技术。
发明内容
本发明的目的是建立一种利用荧光定量PCR技术特异检测含肠毒素cpe产气荚膜梭菌的荧光定量PCR快速检测试剂盒，该试剂盒能够特异灵敏地检测出产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性菌，从而达到快速诊断的目的。
本发明为解决以上技术问题采用的技术方案是：产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)荧光定量反应液、b)产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品、c)阴性质控品；其中荧光定量反应液包含有引物2对和探针1对，为产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02以及荧光探针cpap；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02以及荧光探针cpep，其中，
产气荚膜梭菌外毒素cpa的引物序列为：
上游引物cpa01：5’-GATTTGTAAGGCGCTTATTTGT-3’，
下游引物cpa02：5’-ATAGCATGAGTTCCTGTTCCA-3’，
荧光探针cpap：5’-CTACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTG-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是TAMRA，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-2；
产气荚膜梭菌肠毒素cpe的引物序列为：
上游引物cpe01：5’-AGTGTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA-3’，
下游引物cpe02：5’-TAGCTGCTGCTACAGAAAGATTAA-3’，
荧光探针cpep为5’-AAGGGTATGAGTTAGAAGAACGCCAATCA-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-1。
按上述方案，所述的荧光定量反应液由1×PCR buffer(含Mg2+)，dNTPs 0.5mM，Taq酶2U，产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02各0.4μM，荧光探针cpap为0.4μM，产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02各0.4μM，荧光探针cpep为0.4μM组成。
按上述方案，所述的产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品为含有α毒素和cpe序列的克隆质粒，其中产气荚膜梭菌外毒素cpa的阳性质控品为构建的载体pUC57-cpa，其序列为：ATGAA AAGAA AGATT TGTAA GGCGC TTATT TGTGC TACGC TAGCA ACTAGCCTAT GGGCT GGGGC ATCAA CTAAA GTCTA CGCTT GGGAT GGAAA GATTG ATGGA ACAGG AACTC ATGCTATGAT TG；
产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品为合成的长链构建的载体pUC57-cpe，其序列为AGATATAGAA AAAGA AATCC TTGAT TTAGC TGCTG CTACA GAAAG ATTAA ATTTA ACTGA TGCAT TAAAC TCAAATCCAG CTGGT AATTT ATATG ATTGG CGTTC TTCTA ACTCA TACCC TTGGA CTCAA AAGCT TAATT TACACTTAAC AATTA CAGCT ACTGG ACAAA AATAT AGAAT CTTAG CTAGC AAAAT TGTTG ATTTT AATAT TTATTCAAAT AATTT TAATA ATCTA GTGAA ATT。
按上述方案，所述的阴性质控品是灭菌的无酶双蒸水。
本发明建立的方法利用荧光定量技术，设计两条具有高特异性的荧光标记DNA探针，通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现检测到产气荚膜梭菌的外毒素基因cpa和肠毒素基因cpe。通过一次试验结果直接验证该菌是否为肠毒素阳性产气荚膜梭菌，克服了常规方法的局限性。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、能够对肠毒素cpe阳性的产气荚膜梭菌进行快速诊断，可以对危害公共食品安全的产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌进行有效的筛查，弥补了现有检测技术的空缺；
2、特异性好，灵敏度高，假阳性率低。通过两对特异性引物高特异性扩增和两条荧光探针的高特异杂交双重控制，具有很高的准确性；反应过程由荧光检测系统实时监控，荧光检测系统对荧光信号具有很高的检测灵敏度；
3、检测速度快，仅需1个半小时。没有后期处理，不用杂交、电泳、拍照等过程，所有试剂均是一次扩增，毋需开盖，不产生污染。
附图说明
图1是外毒素cpa标准品pUC57-cpa 10倍梯度稀释进行荧光定量PCR所得到的扩增曲线，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光强度，图中平行原理横坐标的直线代表荧光阀值，①～⑥依次为10倍稀释的外毒素cpa标准品；
图2是根据外毒素cpa标准品pUC57-cpa 10倍稀释进行荧光定量结果所制作的标准曲线，横坐标代表外毒素cpa标准品稀释倍数对数值，纵坐标代表循环数；
图3是肠毒素cpe标准品pUC57-cpe 10倍稀释进行荧光定量PCR所得到的扩增曲线，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光强度，图中平行原理横坐标的直线代表荧光阀值，①～⑤依次为10倍稀释的肠毒素cpe标准品；
图4是根据肠毒素cpe标准品pUC57-cpe 10倍稀释进行荧光定量结果所制作的标准曲线，横坐标代表肠毒素cpe标准品稀释倍数对数值，纵坐标代表循环数。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
实施例1
产气荚膜梭菌肠毒素阳性双重荧光定量PCR快速检测试剂盒组成与配制
1.试剂组成：
EasyTaq酶(5U/μL)、dNTPs(10mM)、均购自Promega公司；PCR引物对cpa01、cpa02和cpe01、cpe02、以及探针cpap、cpep均由上海生工生物工程公司合成；
2.试剂配制
A)荧光定量反应液：1×PCR Buffer(含Mg2+)，dNTPs 0.5mM，Taq酶2U，产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02各0.4μM，荧光探针cpap为0.4μM，产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02各0.4μM，荧光探针cpep为0.4μM。其中外毒素cpa的引物序列，上游引物cpa01:5’-GATTTGTAAGGCGCTTATTTGT-3’，下游引物cpa02：5’-ATAGCATGAGTTCCTGTTCCA-3’,探针引物cpap：5’-CTACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTG-3’。探针上游5’端标记的荧光报告基因是TAMRA，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-2；肠毒素cpe引物序列为，上游引物cpe01：5’-AGTGTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA-3’，下游引物cpe02：5’-TAGCTGCTGCTACAGAAAGATTAA-3’，探针引物cpep为5’-AAGGGTATGAGTTAGAAGAACGCCAATCA-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-1；
B)产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和肠毒素cpe阳性质控品为含有α毒素和cpe序列的克隆质粒：其中外毒素cpa的阳性质控品为构建的载体pUC57-cpa，其序列为：ATGAA AAGAA AGATTTGTAA GGCGC TTATT TGTGC TACGC TAGCA ACTAG CCTAT GGGCT GGGGC ATCAA CTAAA GTCTA CGCTTGGGAT GGAAA GATTG ATGGA ACAGG AACTC ATGCT ATGAT TG；
肠毒素cpe阳性质控品为合成的长链构建的载体pUC57-cpe,其序列为AGATA TAGAA AAAGAAATCC TTGAT TTAGC TGCTG CTACA GAAAG ATTAA ATTTA ACTGA TGCAT TAAAC TCAAA TCCAG CTGGTAATTT ATATG ATTGG CGTTC TTCTA ACTCA TACCC TTGGA CTCAA AAGCT TAATT TACAC TTAAC AATTACAGCT ACTGG ACAAA AATAT AGAAT CTTAG CTAGC AAAAT TGTTG ATTTT AATAT TTATT CAAAT AATTTTAATA ATCTA GTGAA ATT。
C)阴性质控品：灭菌的无酶双蒸水。
实施例2
产气荚膜梭菌肠毒素阳性双重荧光定量PCR快速检测引物及试剂盒的使用方法
1、样本的处理
被检样本为组织或液体样品：按国标方法，无菌取样品10g(mL)放入到90mL 0.5％缓冲蛋白胨水中，振摇混匀，然后取样品液接种于TSC培养基进行增菌，37℃厌氧培养24h。
2、被检样本的处理采用快速煮沸法抽提细菌的基因组DNA，作为荧光定量PCR反应的模板。挑取TSC培养基上的单个菌落，放入含200μl灭菌去离子水，加热煮沸15min,取出试管，10000rpm离心5min，取上清作为荧光定量PCR反应的模板。
3、荧光定量PCR反应
分别取荧光定量反应液各18μl，取第2步所得的模板各2μl，分别加入不同的PCR反应管,用荧光定量检测仪进行PCR反应并实时检测反应过程中释放的荧光强度，PCR反应得到产气荚膜梭菌外毒素cpa特异性扩增目的基因序列为：GATTT GTAAG GCGCT TATTT GTGCT ACGCT AGCAA CTAGC CTATG GGCTG GGGCA TCAAC TAAAG TCTAC GCTTG GGATG GAAAG ATTGA TGGAA CAGGA ACTCA TGCT。PCR反应得到的产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性菌特异性扩增目的基因序列为：AGTGT AAATT AAGCT TTTGA GTCCA AGGGT ATGAG TTAGA AGAAC GCCAA TCATA TAAAT TACCA GCTGG ATTTG AGTTT AATGC ATCAG TTAAA TTTAA TCTTT CTGTA GCAGC AGC。选择荧光信号FAM和TAMRA。循环条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s56℃退火、延伸30s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设定在每个循环第二部结束时进行双重荧光检测，检测波长为530nm；阈值设置为阈值线刚好超过正常阴性样品的最高点。
4、结果判断
A)结果分析条件设定
循环结束后，运用仪器自带软件分析检测结果。循环域值(Threshold cycle,Ct)设定原则根据仪器噪声情况调整，以Ct值刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准；
B)质控标准
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；
阳性对照Ct值应该在20左右，并出现典型的扩增曲线。否则此次实验视为无效。
结果判定
阴性结果判定：无Ct值，且无典型的扩增曲线；
阳性结果判定：Ct值小于35，且出现典型的扩增曲线；
实施例3
产气荚膜梭菌肠毒素阳性双重荧光定量PCR快速检测引物及试剂盒的应用
1、灵敏度试验
以10倍系列稀释的外毒素cpa阳性质控品pUC57-cpa(1.5×104～1.5×10-2ng/ml)和肠毒素cpe的阳性质控品pUC57-cpe(1.8×103～1.8×10-2ng/ml)做为模板，在荧光定量PCR仪上检测，得到实时PCR扩增曲线和标准曲线分别见附图1、附图2、附图3、附图4。由附图1显示，当外毒素cpa的阳性质控品质粒浓度≥1.5×10-2ng/ml时，动力学曲线呈上升趋势，由附图3所示，当肠毒素cpe的阳性质控品质粒浓度≥1.8×10-2ng/ml时，动力学曲线呈上升趋势。因此，该方法的外毒素cpa的检测灵敏度为1.5×10-2ng/ml，肠毒素cpe的检测灵敏度为1.8×10-2ng/ml。附图2和附图4分别显示该方法定量的线性范围为1.5×104～1.5×10-2ng/ml和1.8×103～1.8×10-2ng/ml，相关系数R2分别为0.991和0.996。
2、特异性试验
采用产气荚膜梭菌肠毒素阳性双重荧光定量PCR试剂盒对大肠杆菌O78、大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌DH5α、沙门氏菌、巴氏杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌、肠球菌、胸膜肺炎放线杆菌进行特异性试验，对上述12种细菌的检测结果均为阴性，另外对水、鸡和鸭的各种组织进行检测，结果均为阴性。以上结果充分证明了该试剂盒在临床样品检测中具有很好的特异性。
对A型和C型产气荚膜梭标准菌株以及其他30株实验室自行分离保存的地方菌株进行检测，检测结果均为阳性。初步证明该方法对产气荚膜梭菌的不同血清型检测适应性良好。
3、重复性试验
取3份不同浓度的产气荚膜梭菌样品进行组间重复性试验，得到表1和表2，算得产气荚膜梭菌外毒素cpa重复性检测的组间变异系数β值(见表1)分别为4.53％、3.18％、2.52％，肠毒素cpe重复性检测的组间变异系数β值(见表2)分别为3.9％、4.6％、2.6％，均小于5％，证明该检测方法重复性很好，具有很好的特异性。
表1样品的组间重复性检测产气荚膜梭菌不同浓度外毒素cpa的结果
表2样品的组间重复性检测产气荚膜梭菌不同浓度肠毒素cpe的结果
a:循环域值
b:平均CT值

Claims (4)

1.产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)荧光定量反应液、b)产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品、c)阴性质控品；其中荧光定量反应液包含有引物2对和探针1对，为产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02以及荧光探针cpap；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02以及荧光探针cpep，其中，
产气荚膜梭菌外毒素cpa的引物序列为：
上游引物cpa01：5’-GATTTGTAAGGCGCTTATTTGT-3’，
下游引物cpa02：5’-ATAGCATGAGTTCCTGTTCCA-3’，
荧光探针cpap：5’-CTACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTG-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是TAMRA，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-2；
产气荚膜梭菌肠毒素cpe的引物序列为：
上游引物cpe01：5’-AGTGTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA-3’，
下游引物cpe02：5’-TAGCTGCTGCTACAGAAAGATTAA-3’，
荧光探针cpep为5’-AAGGGTATGAGTTAGAAGAACGCCAATCA-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-1。
2.按权利要求1所述的产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述的荧光定量反应液由1×PCR buffer(含Mg2+)，dNTPs 0.5mM，Taq酶2U，产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02各0.4μM，荧光探针cpap为0.4μM，产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02各0.4μM，荧光探针cpep为0.4μM组成。
3.按权利要求1所述的产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述的产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品为含有α毒素和cpe序列的克隆质粒，其中产气荚膜梭菌外毒素cpa的阳性质控品为构建的载体pUC57-cpa，其序列为：ATGAA AAGAA AGATT TGTAA GGCGC TTATT TGTGC TACGC TAGCA ACTAG CCTATGGGCT GGGGC ATCAA CTAAA GTCTA CGCTT GGGAT GGAAA GATTG ATGGA ACAGG AACTC ATGCT ATGATTG；
产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品为合成的长链构建的载体pUC57-cpe，其序列为AGATATAGAA AAAGA AATCC TTGAT TTAGC TGCTG CTACA GAAAG ATTAA ATTTA ACTGA TGCAT TAAAC TCAAATCCAG CTGGT AATTT ATATG ATTGG CGTTC TTCTA ACTCA TACCC TTGGA CTCAA AAGCT TAATT TACACTTAAC AATTA CAGCT ACTGG ACAAA AATAT AGAAT CTTAG CTAGC AAAAT TGTTG ATTTT AATAT TTATTCAAAT AATTT TAATA ATCTA GTGAA ATT。
4.按权利要求1所述的产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述的阴性质控品是灭菌的无酶双蒸水。
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