CN116334314A - 一种区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光pcr阳性对照品及其试剂盒、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光PCR阳性对照品及其试剂盒、应用，属于动物检疫技术领域。本发明所提供的阳性对照品为经序列改造的阳性对照，选取特异性检测引物扩增的非洲猪瘟病毒P72基因靶标序列中的一部分区域更改为内标探针序列；引物探针以非洲猪瘟病毒P72基因序列为靶目标，设计了一对特异性引物、探针以及内标探针。利用探针引物制备了检测用试剂盒，试剂盒中含有经序列改造的阳性对照，防污染双重荧光PCR检测反应液、酶制剂、阴性对照。本发明提供的试剂盒在检测应用中，能够排除实验中待测样品被试剂盒中阳性对照污染的因素，准确获得非洲猪瘟病毒检测结果。本发明的试剂盒具有结果准确、检测特异性强、敏感性高、操作简便防污染等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光PCR阳性对照品及其试剂盒、应用，属于动物检疫技术领域。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种急性、烈性的传染病，强毒株感染时死亡率高达100％。我国于2018年8月首次发生非洲猪瘟疫情后开始在全国范围不断蔓延，对我国养猪业造成严重危害，由于目前缺乏针对非洲猪瘟病毒的有效疫苗，使用荧光PCR检测技术精准检出病猪以达到对非洲猪瘟病猪“拔牙”的效果便成了防范疫情在猪场蔓延的主要手段，因此迅速、准确的检测方法对该疫病的防控就处于十分重要的地位。
荧光PCR技术在病原检测方面有独到优势，快速、灵敏、准确是其最大亮点，近年来越来越受到大家的青睐。TaqMan荧光实时定量检测病原的技术具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点，灵敏度比普通PCR灵敏度高100倍以上，是国际上公认的快速准确的检测技术之一。
目前市面上已有较多的商品化试剂盒，并已经成功应用在养殖企业的非洲猪瘟防控实践中。随着PCR实验频率的增加，实验室污染问题也成了困扰实验人员的一个大问题。实验室的核酸气溶胶污染主要来源于荧光PCR扩增产物和试剂盒内的阳性对照，采用UNG-dUTP防污染系统可以解决PCR扩增产物造成的潜在污染风险，而试剂盒的阳性对照污染导致样品检测假阳性的问题仍是困扰实验人员判定样品阴阳性的难题。
中国专利CN103757134A公开了非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其针对非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段为靶目标，设计了一对特异性引物、一条特异性探针和一条内标探针，其能够实现对低含量非洲猪瘟病毒感染、隐性感染等的检测需求，该试剂盒使用了非洲猪瘟病毒阳性质控品和假病毒内标质控品用来判定扩增反应的成立与否，无法解决阳性对照污染导致样品检测假阳性的问题。中国CN 106868202A公开了一种监控荧光定量PCR反应污染的方法，该方法使用一种外参基因作为额外的阳性对照同它配套的引物探针添加至反应体系中达到监测实验过程中待检样品是否被阳性对照污染的目的。但由于外参基因阳性对照与目标阳性对照为独立的质粒，因此在对试剂盒阳性对照的污染监测过程中仍然存在误判风险，且反应体系中多加入一对引物探针会增加对目标检测反应的干扰。因此，开发一种能够区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测用试剂盒成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光PCR阳性对照品。
本发明还提供了一种含有上述非洲猪瘟病毒荧光PCR阳性对照品的试剂盒，该试剂盒能够解决阳性对照污染待测样品造成的判定假阳性问题。
本发明还提供了一种上述试剂盒在检测非洲猪瘟病毒并区分阳性对照污染待测样品中的应用，具有结果准确、操作简便、特异性强、敏感性高等优点，使一线检测人员可以使用荧光实时定量的技术做出准确的检测判断。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光PCR阳性对照品，所述阳性对照品为经序列改造的阳性对照，选取特异性检测引物扩增的非洲猪瘟病毒P72基因靶标序列的一部分区域更改为内标探针序列。
优选的，上述经序列改造的阳性对照的序列如SEQ ID No.1所示为：
aattctcttgctctggatacgttaatatgaccactgggttggtattcctcccgtggcttcaaagcaaaggtaaTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAggttttaatcgcattgcctccgtagtggaagggtatgtaagagctgcagaactttgatgga。
本发明提供了一种区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测引物探针，所述引物探针以非洲猪瘟病毒P72基因序列为靶目标，序列为：
上游引物 ASFVF，如SEQ ID No.2所示: TCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATAC；
下游引物 ASFVR，如SEQ ID No.3所示: TCTTGCTCTRGATACGTTAATATGRC；
检测探针 ASFVP，如SEQ ID No.4所示: FAM-CACTGGGTTGGTATTCCTCCCGT-BHQ1；
内标探针，如SEQ ID No.5所示：HEX-TCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCA-BHQ1。
本发明还提供了一种含有上述区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测引物探针或荧光PCR阳性对照品的试剂盒，包括以下组分：经序列改造的阳性对照，防污染双重荧光PCR检测反应液、酶制剂、阴性对照。
优选的，所述防污染双重荧光PCR检测反应液是由2体积浓度为10μmol/L上游引物、2体积浓度为10μmol/L的下游引物、0.5体积浓度为10μmol/L的检测探针、0.2体积浓度为10μmol/L的内标探针、5体积的5×RT缓冲液、3体积浓度为25mmol/L的MgCl2、3体积的dNTP Mix和4.3体积的焦碳酸二乙酯处理水组成。
优选的，所述dNTP Mix为dATP /dUTP/dCTP/dGTP混合物。
优选的，所述酶制剂是由Taq聚合酶与UDG酶按照体积比4：1混匀分装制备而成；所述Taq聚合酶的浓度为5U/μL；所述UDG酶的浓度为2U/μL。
本发明通过上述试剂盒检测过程中的反应条件为：
第一阶段，50℃/2 min；
第二阶段，95℃/3分钟；
第三阶段，95℃/15 sec，60℃/30 sec，共45个循环；荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。
第一方面，本发明通过改造阳性对照序列，同时在反应液中加入一条内标探针来实现解决阳性对照污染待测样品造成的假阳性问题。本发明提供的试剂盒中所描述的方法只需要添加一条内标探针到反应应体系中，阳性对照也与目标阳性对照为同一个质粒，技术实施上更为简单，且适用性更为广泛。
1内标探针设计及阳性对照序列改造方法：
1.1内标探针设计原则：在荧光PCR反应过程中与靶标检测反应共用检测引物，因此探针Tm值需与靶标检测探针相近且与引物探针均无互补序列，探针的长度在20～30个碱基左右，无二级结构和重复性，Tm值比引物Tm值高5℃以上，并且荧光标记与检测探针不同。
1.2 阳性对照序列改造方法：选取靶标检测特异性引物扩增的非洲猪瘟病毒P72基因序列的一部分区域更改为内标探针序列。所选区域应与对照探针序列GC含量接近，由此检测引物在对阳性对照模板进行扩增时不影响其扩增效率，保证阳性对照改造序列在与内标探针结合的同时不影响靶标检测探针的正常结合，不影响其作为试剂盒的阳性对照的功能。
2 内标探针及防污染阳性对照在荧光PCR扩增过程中的作用：在使用添加内标探针的荧光PCR反应液检测样品的过程中，当扩增的目标基因为非洲猪瘟病毒序列时，检测引物成功扩增，检测探针被水解，可收集到检测探针的荧光信号，而内标探针与之不匹配，故收集不到内标探针的荧光信号，仅检测探针荧光信号通道出现扩增曲线；当扩增目标基因为经过改造的阳性对照时，检测探针和内标探针在引物扩增的过程中均被水解，荧光信号均可被仪器收集，在两个通道内均出现扩增曲线。通过仪器收集不同荧光通道的信号就可以判断待检样品中是否有混入经过改造的阳性对照。
第二方面，本发明还提供了一种含有上述方法的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括防污染双重荧光PCR反应液、酶制剂、阴性对照、阳性对照中的一种或多种，具体制备方法如下：
1 非洲猪瘟病毒检测引物、探针设计：为确保引物、探针的保守性和特异性，选取非洲猪瘟病毒P72基因作为靶区域，所有涵盖所有毒株的VP72基因序列，在多重序列比对的基础上，设计检测引物和探针。
2 防污染双重荧光PCR反应液配制：
2.1 5×PCR缓冲液的配制：称取Tris base：3.03g，KCl：9.32g，MgCl2.6H2O：0.76g，TritonX-100：2.5 mL，加DEPC处理水至400mL，调pH值至8.3（25℃），定容至500 mL。过滤（0.45μm）除菌后放在2～8℃保存备用。
2.2 dNTP Mixture 的配制：使用DEPC水稀释100mM的dATP，dCTP，dGTP及dUTP，使dATP，dCTP，dGTP终浓度为2.5mM，dUTP终浓度为7.5mM。
2.3 防污染双重荧光PCR反应液配制：取上游引物ASFVF（10 μmol/L）2.5μL、下游引物ASFVR（10μmol/L）2.5μL、检测探针ASFP（10 μmol/L）0.5μL、内标探针（10 μmol/L）0.2μL、5×PCR缓冲液5 μL、25mmol/L MgCl23μL、dNTP Mixture 3μL、0.1%DEPC处理水4.3μL，混匀后（全程无菌低温）用0.45μm滤膜过滤除菌。
2.4酶制剂的制备：Taq DNA聚合酶为外购商品（Promega公司），浓度为5U/μL；UDG酶均为外购商品（生工生物公司），浓度为2U/μL，Taq聚合酶与UDG酶按照体积比4：1混匀，低温无菌操作。
2.5 阴性对照的制备：0.1% DEPC水溶液，无菌分装。
2.6改造型阳性对照的制备：将经过改造的非洲猪瘟P72基因的一段序列合成后测序，确认正确后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，做100000倍稀释，无菌分装。
第三方面，本发明还提供了该检测试剂盒的检测方法，所述检测方法如下：
（1）在反应管中加入荧光PCR反应液20 μL和酶制剂0.5μL，混合均匀后再加入待测样品核酸5.0 μL，同时设置阳性及阴性对照管，盖紧管帽，500g离心10s，放入荧光PCR检测仪内进行荧光PCR反应。
（2）荧光定量PCR的反应参数如下设置：
第一阶段，50℃/2 min；
第二阶段，95℃/3分钟；
第三阶段，95℃/15 sec，60℃/30 sec，共45个循环；荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。
（3）结果读取：对于多通道PCR仪，利用FAM（465-510）通道和HEX（VIC）（533-580）读取结果。
本发明进行PCR反应后进行结果的读取：FAM荧光通道为ASFV的检测通道，当无Ct值，且无特征性扩增曲线，判定样品为阴性；当Ct值≤38.0，且出现典型的扩增曲线，且HEX通道无特征性扩增曲线，判定样品为非洲猪瘟病毒核酸阳性。当Ct值＞38.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。HEX荧光通道为内标探针检测通道，当检测阳性对照时，Ct值应与FAM检测通道的Ct值相差小于2；当检测待检样本时，HEX通道应无Ct值，且无特征性扩增曲线。当检测样本FAM与HEX检测通道均有Ct值时，且均出现特征性扩增曲线时，说明检测样本受到阳性对照污染，建议在对检测环境做核酸去除处理后重新进行实验。
本发明的试剂盒可以根据荧光PCR反应中两个荧光检测通道读取的结果，有效区别阳性对照污染造成的样品假阳性问题，由此排除阳性对照污染对结果判读的干扰，取得了优异的技术效果：
（1）可使荧光PCR结果判读准确、可靠，为非洲猪瘟防控的一线检测人员提供了极大方便，克服了结果判定存在的假阳性干扰的难题。
（2）灵敏度高，特异性强。本发明所述试剂盒荧光PCR反应液中额外加入的内标探针特异性强，不影响非洲猪瘟病毒靶标检测的灵敏度，检测极限达到1copies/μL。同时与常见猪病如蓝耳病病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、圆环2型病毒等均无阳性交叉反应。
（3）本发明适用范围广，所述试剂盒中的内标探针及改造阳性对照序列的方法可用于多种荧光PCR检测试剂盒中。
附图说明
图1为本发明一实施例中设计的内标探针及检测引物探针与阳性对照序列比对情况；
图2为本发明一实施例中证实本发明所述试剂盒可区别阳性对照污染待测样品的实验结果图；
图3为本发明一实施例中（本发明所述试剂盒）灵敏度试验结果图；
图4为本发明一实施例中（本发明所述试剂盒）特异性试验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一种可以区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括：包括防污染双重荧光PCR反应液、酶制剂、阴性对照、阳性对照。试剂盒的制备方法，具体包括：
1内标探针设计及阳性对照序列改造方法：
1.1内标探针设计原则：在荧光PCR反应过程中与靶标检测反应共用检测引物，因此探针Tm值需与靶标检测探针相近且与引物探针均无互补序列，探针的长度在20～30个碱基左右，无二级结构和重复性，Tm值比引物Tm值高5℃以上，并且荧光标记与检测探针不同。
1.2 阳性对照序列改造方法：选取特异性检测引物扩增的非洲猪瘟病毒P72基因靶标序列的一部分区域更改为内标探针序列（图1）。所选区域（下划线所示）应与内标探针序列GC含量接近，由此阳性对照的扩增效率与样品扩增效率基本一致，可以保证阳性对照在与内标探针结合的同时仍可以最大程度上模拟样品扩增，不影响其作为试剂盒的阳性对照的功能。
2 非洲猪瘟病毒检测引物、探针设计：为确保引物、探针的保守性和特异性，选取非洲猪瘟病毒P72基因作为靶区域，所有涵盖所有毒株的VP72基因序列，在多重序列比对的基础上，秉着引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%～60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于2℃。探针Tm值比引物Tm值高5℃左右的原则进行特异性引物、探针设计。
3 荧光PCR反应液配制：由2体积浓度为10μmol/L非洲猪瘟病毒上游引物、2体积浓度为10μmol/L的非洲猪瘟病毒下游引物、0.5体积浓度为10μmol/L的检测探针、0.2体积浓度为10μmol/L的内标探针、5体积5×PCR缓冲液、3体积浓度为25mmol/L的MgCl2、3体积的dNTP Mix（dATP /dUTP/dCTP/dGTP混合物）和4.7体积焦碳酸二乙酯处理水组成。
4 制备阳性对照：人工合成经过序列改造的非洲猪瘟病毒P72基因片段，测序结果正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，经稀释后作为阳性对照。
5 制备阴性对照：量取1mL的焦碳酸二乙酯，加入到双蒸水中并定容至1L，使其终浓度为0.1% ，室温搅拌处理12h，高压121℃蒸汽灭菌15 min，即阴性对照。
6 酶制剂的制备：所述U-Taq酶由0.4 μL的Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）和0.1 μL的UDG酶（2 U/μL）组成。
7 经过优化的反应条件为：第一阶段，50℃/2 min；第二阶段95℃/3分钟；第三阶段95℃/15 sec，60℃/30 sec，共45个循环；荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。
8 结果判定：FAM荧光通道为ASFV的检测通道，当无Ct值，且无特征性扩增曲线，判定样品为阴性；当Ct值≤38.0，且出现典型的扩增曲线，且HEX通道无特征性扩增曲线，判定样品为非洲猪瘟病毒核酸阳性。当Ct值＞38.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。HEX荧光通道为内标探针检测通道，当检测阳性对照时，Ct值应与FAM检测通道的Ct值相差小于2；当检测待检样本时，HEX通道应无Ct值，且无特征性扩增曲线。当检测样本FAM与HEX检测通道均有Ct值时，且均出现特征性扩增曲线时，说明检测样本受到阳性对照污染，建议在对检测环境做核酸去除处理后重新进行实验。
实施例1 本发明所述试剂盒可区别阳性对照污染待测样品的试验验证
模拟实验室阳性对照污染情形制备如下样品：将试剂盒中的阳性对照（104copies/μL）1μL加入到10mL非洲猪瘟病毒阴性样品中提取核酸，采用本专利所述非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒对模拟被污染样品与正常的临床阴性样本进行检测，图2表明本专利试剂盒可区分被阳性对照污染的临床样本，检测限可达1copie/μL：正常样本FAM与HEX检测通道结果均为阴性，被污染的阴性样本FAM与HEX检测通道均为阳性。由此应用于实际检测过程中，双通道为阴性的样本可判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性样本。
实施实例2 本发明所述可区别阳性对照污染待测样品试剂盒的敏感性试验
将含有非洲猪瘟病毒P72基因序列的标准品质粒（104copies/μL）倍比稀释10、100、1000、10000倍（拷贝数依次为103、102、101、1copies/μL），按照本专利所述方法分别配制检测非洲猪瘟病毒的防污染荧光PCR反应液与无内标探针加入的荧光PCR反应液（其余组份一致，内标探针在体系中的体积用水替代），依据本发明所述方法进行检测判定，结果如图3所示。结果表明：（1）防污染荧光PCR反应液与无内标探针加入的荧光PCR反应液对非洲猪瘟病毒核酸检测灵敏度一致，可达到1copies/μL，表示内标探针的加入不影响非洲猪瘟病毒的检测灵敏度。（2）防污染荧光PCR反应液内标检测通道与非洲猪瘟病毒核酸无交叉反应。
实施实例3 本发明所述可区别阳性对照污染待测样品试剂盒的特异性试验
采用本发明所述非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，检测猪瘟病毒核酸、高致病蓝耳病病毒核酸、伪狂犬病毒核酸、猪圆环病毒核酸、正常猪组织的核酸，均无阳性交叉反应。检测60份经临床诊断并鉴定为非洲猪瘟病毒阴性的样品，包括唾液、血液、精液、环境拭子，如图4所示，FAM及HEX检测通道结果全部为阴性，特异性为100%。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光PCR阳性对照品，其特征在于，所述阳性对照品为经序列改造的阳性对照，选取特异性检测引物扩增的非洲猪瘟病毒P72基因靶标序列的一部分区域更改为内标探针序列。
2.根据权利要求1所述的区分阳性对照污染待测样品的非洲猪瘟病毒荧光PCR阳性对照品，其特征在于，所述经序列改造的阳性对照的序列如SEQ ID No.1所示，下划线为序列改造部分，具体为：
aattctcttgctctggatacgttaatatgaccactgggttggtattcctcccgtggcttcaaagcaaaggtaaTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAggttttaatcgcattgcctccgtagtggaagggtatgtaagagctgcagaactttgatgga。
3.一种含有如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR阳性对照品的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：经序列改造的阳性对照，防污染双重荧光PCR检测反应液、酶制剂、阴性对照。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述防污染双重荧光PCR检测反应液是由2体积浓度为10μmol/L上游引物、2体积浓度为10μmol/L的下游引物、0.5体积浓度为10μmol/L的检测探针、0.2体积浓度为10μmol/L的内标探针、5体积的5×RT缓冲液、3体积浓度为25mmol/L的MgCl2、3体积的dNTP Mix和4.3体积的焦碳酸二乙酯处理水组成。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测引物探针以非洲猪瘟病毒P72基因序列为靶目标，内标探针可与检测探针共用引物，无序列交叉，序列为：
上游引物 ASFVF，如SEQ ID No.2所示: TCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATAC；
下游引物 ASFVR，如SEQ ID No.3所示: TCTTGCTCTRGATACGTTAATATGRC；
检测探针 ASFVP，如SEQ ID No.4所示:FAM-CACTGGGTTGGTATTCCTCCCGT-BHQ1；
内标探针，如SEQ ID No.5所示：HEX-TCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCA-BHQ1。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTP Mix为dATP /dUTP/dCTP/dGTP混合物。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶制剂是由Taq聚合酶与UDG酶按照体积比4：1混匀分装制备而成；所述Taq聚合酶的浓度为5U/μL；所述UDG酶的浓度为2U/μL。
8.根据权利要求3-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，检测过程中的反应条件为：
第一阶段，50℃/2分钟；
第二阶段，95℃/3分钟；
第三阶段，95℃/15 秒，60℃/30秒，共45个循环；荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。
9.一种如权利要求3-8任一项所述的试剂盒在检测非洲猪瘟病毒并区分阳性对照污染待测样品中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（a）在0.2 mL反应管中加入荧光PCR反应液20 μL，再加入提取的核酸5.0 μL ，同时设置阳性及阴性对照管；瞬时离心，进行检测；反应条件为：50℃/2分钟；94℃/3分钟；94℃/15秒，60℃/30秒共45个循环；每个循环60℃结束时收集FAM和HEX两个检测通道得荧光值。
（b）结果判定。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤（b）中，结果判定具体为：FAM荧光通道为ASFV的检测通道：当无Ct值，且无特征性扩增曲线，判定样品为阴性；当Ct值≤38.0，出现典型的扩增曲线，且HEX通道无Ct值，且无特征性扩增曲线时，判定样品为阳性。当Ct值＞38.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。HEX荧光通道为内标探针检测通道：阳性对照HEX通道的Ct值应与FAM检测通道的Ct值相差小于2；待测样本HEX通道应无Ct值，且无特征性扩增曲线；当待测样本在FAM与HEX检测通道均有Ct值时，则样本受到阳性对照污染。
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