WO2016056796A1 - 조류인플루엔자 바이러스를 고감도로 검사하기 위한 키트, 이를 위한 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브 조성물 및 유전자 칩, 그리고 이들을 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법 - Google Patents

조류인플루엔자 바이러스를 고감도로 검사하기 위한 키트, 이를 위한 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브 조성물 및 유전자 칩, 그리고 이들을 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법 Download PDF

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이동훈
황승용
김지훈
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바이오코아 주식회사
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Definitions

  • the present invention relates to a kit for testing avian influenza virus with high sensitivity, a probe composition and gene chip for avian influenza virus test for this, and a method for testing avian influenza virus using them, and more particularly serotypes of avian influenza virus
  • the present invention relates to a test kit for determining pathogenicity with high sensitivity, a probe composition and gene chip for avian influenza virus test, and a method for testing avian influenza virus using them.
  • the present invention can simultaneously determine the subtype of the HA gene that determines the serotype of avian influenza virus and test whether it is pathogenic, and can quickly and accurately detect whether the avian influenza virus being tested is highly pathogenic or low pathogenic.
  • the present invention relates to a kit for avian influenza virus test and a method for testing avian influenza virus using the same.
  • the present invention provides a quick and accurate and economical detection of the serotype and pathogenicity of avian influenza virus, which can be fatal to poultry and fatal to the human body, so as to promptly prepare an anti-influenza virus against avian influenza virus. It is about a technology that can prevent the risk of spreading early.
  • Premature ejaculation influenza virus is divided into A, B, and C types by the antigenic difference between NP (nuleocapsid) protein and M (matrix) protein.
  • type A is H1 type according to the antigenic characteristics of HA (hemagglutinin) protein. It is classified into subtype H15 and subtypes N1 through N9 according to the antigenic properties of NA (Neuraminidase) proteins.
  • HA protein and NA protein are antigenic proteins that determine serotypes in the classification of avian influenza virus. Differentiation of avian influenza virus is performed by discriminating subtypes of HA and NA genes encoding these proteins, respectively.
  • avian influenza virus the highly pathogenic avian influenza virus (hereinafter referred to as 'HPAI'), which occurs in H5 and H7 types, is known to cause high mortality when infected with poultry and cause many economic damages in the country.
  • Avian influenza virus also referred to as 'LPAI'
  • H5N1 type is infected with humans mainly in Asia
  • H9N2 is reported to be a public health risk because there is a report of common infection.
  • H9N2 type low-pathogenic avian influenza virus is present in domestic poultry farms, and the damage of high-pathogenic avian influenza virus is serious, and HA subtypes (H5, H7, H9 type) are prepared for its recurrence. ) And the development of a new diagnostic method for early diagnosis of high pathogenicity.
  • the conventional avian influenza virus (AIV) diagnostic method is a method of diagnosing the proliferation by a hemagglutination reaction after culturing the virus in SPF egg eggs, or RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) The amplification of avian influenza virus RNA using the method or NASBA method, and then the gene sequencing to determine the serotype and pathogenicity, but when using these methods, the diagnostic time is at least 2 days There was a limit of seven days, which could not meet the epidemiological demands that prevented the spread of the infection of avian influenza virus, which is a public health hazard.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2011-0028188 discloses a simultaneous detection method of general influenza A and new influenza by real-time multiple reverse transcriptase chain reaction
  • Korean Patent Publication No. 10-2011-0114978 discloses a multiplex.
  • the method for diagnosing avian influenza virus gene using a molecular biological method such as real-time PCR has a disadvantage that can result in false negatives when mutations in the attachment site of the primer and probe.
  • a new test microarray gene chip capable of simultaneously testing HA subtypes (H5 type, H7 type, H9 type) and pathogenicity of avian influenza virus, or a rapid, accurate and economical test or It is necessary to develop an inspection method.
  • the present inventors have proposed a new method for screening for avian influenza virus based on a microarray chip.
  • the new avian influenza virus test is designed to simultaneously test the serotype and pathogenicity of avian influenza virus.
  • An example of such a new device is disclosed in Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2013-0116609.
  • the avian influenza virus test method is an excellent technology, like the other excellent technology, the continuous improvement can be made.
  • the present invention belongs, it is possible to simultaneously determine the subtype of the HA gene that determines the serotype of avian influenza virus and to determine whether it is pathogenic, and to quickly and highly sensitively determine whether the avian influenza virus to be tested is highly pathogenic or low pathogenic.
  • avian influenza virus test kit that can accurately test and avian influenza virus test method using the same.
  • the present inventors select a gene specific region that can distinguish between the HA gene of the major serotypes (H5, H7, H9) of the avian influenza virus and the pathogenicity, and then specifically amplify the HA gene, while the gene for pathogenic determination
  • the present invention has been completed by developing a probe for avian influenza virus, a gene chip, and a test kit that can be quickly and accurately tested.
  • An object of the present invention is to provide a test kit for determining serotypes and pathogenicity of avian influenza virus with high sensitivity, a probe composition and gene chip for avian influenza virus test, and a method for testing avian influenza virus using them. .
  • the present invention can simultaneously determine the subtype of the HA gene that determines the serotype of avian influenza virus and test whether it is pathogenic, and can quickly and accurately detect whether the avian influenza virus being tested is highly pathogenic or low pathogenic.
  • the purpose of the present invention is to provide a kit for avian influenza virus test and a method for testing avian influenza virus using the same.
  • the present invention provides a quick and accurate and economical detection of the serotype and pathogenicity of avian influenza virus, which can be fatal to poultry and fatal to the human body, so as to promptly prepare an anti-influenza virus against avian influenza virus.
  • the aim is to provide a technology that can prevent the risk of spreading early.
  • the present invention is capable of simultaneously identifying subtypes of HA genes and testing for pathogenicity, while detecting avian influenza virus probes, gene chips, and the like, which can quickly and accurately detect whether avian influenza virus is highly pathogenic or low pathogenic. It provides a test kit and a test for avian influenza virus using the same.
  • Probe composition for determining the serotype and pathogenicity of avian influenza virus of an embodiment of the present invention Probe composition for determining the serotype and pathogenicity of avian influenza virus of an embodiment of the present invention
  • Probe for determining the H5 type of avian influenza virus of the subtype of the HA gene of avian influenza virus at least one selected from the group consisting of oligonucleotides of SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 20 and oligonucleotides complementary to these oligonucleotides
  • At least one probe selected and oligonucleotides of SEQ ID NO: 28 to SEQ ID NO: 35 and these oligonucleotides as probes for determining H9 type of avian influenza virus among subtypes of HA gene of avian influenza virus At least one probe selected from the group consisting of oligonucleotides complementary to the
  • Probes for determining the low pathogenicity of avian influenza virus include at least one probe selected from the group consisting of oligonucleotides of SEQ ID NO: 80 to SEQ ID NO: 87 and oligonucleotides complementary to these oligonucleotides.
  • the probe composition for determining the serotype and pathogenicity of avian influenza virus of one embodiment of the present invention is hybridized to a gene (ie, positive control gene) (eg, M gene) commonly included in avian influenza virus
  • the positive control probe may further include at least one probe selected from the group consisting of oligonucleotides of SEQ ID NO: 89 and oligonucleotides complementary to these oligonucleotides having improved specificity and sensitivity than conventional ones.
  • Positive control probes with improved specificity and sensitivity are used in combination with a new positive control amplification primer pair (primary pairs of SEQ ID NOs: 7 and 8) with improved amplification specificity for positive control genes as described below.
  • Gene amplification of the viral gene sample can be confirmed whether or not normal, and whether the signal of the other hybridized probe is a false positive signal.
  • the hybridization signal is not generated from the positive control probe, it is confirmed that there is a problem of gene amplification of the avian influenza virus gene sample. Can be.
  • the hybridization signal is not generated in the positive control probe, when the hybridization signal is generated in other probes, it may be determined as a false positive signal.
  • the M gene is a gene widely used as a positive control among avian influenza genes in a commercial test kit (GenBank Accession Number: GU122038.1), which means a matrix protein gene of influenza A virus segment 7 (Influenza A virus segment 7 matrix protein 1 (M1) and matrix protein 2 (M2) genes, partial cds).
  • Probe for determining the H5 type of avian influenza virus of the subtype of the HA gene of avian influenza virus at least one selected from the group consisting of oligonucleotides of SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 20 and oligonucleotides complementary to these oligonucleotides
  • At least one probe selected and oligonucleotides of SEQ ID NO: 28 to SEQ ID NO: 35 and these oligonucleotides as probes for determining H9 type of avian influenza virus among subtypes of HA gene of avian influenza virus At least one probe selected from the group consisting of oligonucleotides complementary to the
  • Probes for determining the low pathogenicity of avian influenza virus include at least one probe selected from the group consisting of oligonucleotides of SEQ ID NO: 80 to SEQ ID NO: 87 and oligonucleotides complementary to these oligonucleotides.
  • the gene chip for determining the serotype and pathogenicity of the avian influenza virus of one embodiment of the present invention may further include at least one probe selected from the group consisting of oligonucleotides of SEQ ID NO: 89 and oligonucleotides complementary to such oligonucleotides having improved specificity and sensitivity than the prior art.
  • a gene chip spotted with a positive control probe with improved specificity and sensitivity is a new pair of positive control amplification primers having improved amplification specificity for a positive control gene as described below (primary pairs of SEQ ID NOs: 7 and 8). It can be used in conjunction with to confirm whether gene amplification of the avian influenza virus gene sample is normal, and whether the signal of other hybridized probes is a false positive signal. For example, after hybridization with the amplification product for the M gene, which is the positive control of the avian influenza virus gene, if the hybridization signal is not generated from the positive control probe, it is confirmed that there is a problem of gene amplification of the avian influenza virus gene sample. Can be. In addition, even though the hybridization signal is not generated in the positive control probe, when the hybridization signal is generated in other probes, it may be determined as a false positive signal.
  • a probe for determining the subtype of the HA gene of the avian influenza virus can be microarrayed on the same substrate as a glass slide. It is preferable that the substrate is a glass substrate or a plastic substrate which is generally used for gene chip fabrication. In addition, it is preferable to additionally fix a position marker represented by a specific base sequence in the gene chip to which the probe is microarrayed so as to increase the accuracy of hybridization and detection with the probe.
  • the present invention is characterized by using a primer pair of SEQ ID NO: 1 and 2 to specifically amplify the HA gene, and a primer pair of SEQ ID NO: 3 and 4 capable of amplifying the gene region for pathogenicity with high sensitivity. It is done.
  • the PCR amplification kit for avian influenza virus test includes a primer pair of SEQ ID NOs: 1 and 2 for specifically amplifying the HA gene, and a sequence for specifically amplifying a pathogenic discrimination gene region.
  • Primer pairs of Nos. 3 and 4 DNA polymerases, dNTPs, PCR buffers and PCR amplification products.
  • the PCR amplification kit for avian influenza virus test of an embodiment of the present invention can specifically amplify a gene (ie, positive control gene) (eg, M gene) commonly included in avian influenza virus.
  • a primer pair for positive control amplification a primer pair of SEQ ID NOs: 7 and 8 having an improved amplification specificity for the positive control gene may be further included.
  • the amplification products of the positive control genes amplified by these primer pairs of SEQ ID NOs: 7 and 8 hybridize with the positive control probes as described above.
  • At least one probe selected from the group consisting of oligonucleotides of SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 20 and oligonucleotides complementary to these oligonucleotides is When hybridized with the amplification product, at least one probe selected from the group consisting of oligonucleotides of SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 27 and oligonucleotides complementary to these oligonucleotides is hybridized with the amplification product.
  • oligonucleotides of SEQ ID NO: 28 to SEQ ID NO: 35 and oligonucleotides complementary to these oligonucleotides is hybridized with the amplification product. Determined by The features.
  • the gene chip of step (b) is a positive control probe hybridized to a positive control gene commonly included in avian influenza virus, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 89 in the group consisting of oligonucleotides complementary to such oligonucleotide At least one probe selected may be further spotted. More preferably, (a2) amplifying the positive control gene in the avian influenza virus gene sample using the primer pair of SEQ ID NO: 7 and 8 as a primer pair for amplifying the positive control gene, The amplification product of the positive control gene may be hybridized to the gene chip together with the amplification product of step (a1). Therefore, in the step (c), whether amplification of the avian influenza virus gene sample is normally performed according to hybridization with the amplification product of the positive control probe, and whether the signal of the other probes is a false positive signal.
  • the present invention also provides a kit for testing avian influenza virus.
  • the avian influenza virus test kit of an embodiment of the present invention a gene chip for discriminating the serotype and pathogenicity of avian influenza virus as described above, and a sequence for specifically amplifying the HA gene of avian influenza virus Primer pairs of Nos. 1 and 2, primer pairs of SEQ ID NOs. 3 and 4 for specifically amplifying a pathogenic discrimination gene region, and labeling means for detecting the amplified gene product hybridized with the gene chip.
  • the gene chip comprises a positive control probe hybridized to a positive control gene commonly included in avian influenza virus, and at least one selected from the group consisting of an oligonucleotide of SEQ ID NO: 89 and an oligonucleotide complementary to the oligonucleotide.
  • the probe can be further spotted.
  • the avian influenza virus test kit of an embodiment of the present invention may further include a primer pair of SEQ ID NOs: 7 and 8 as a primer pair for amplifying the positive control gene.
  • the labeling material is not limited to a specific fluorescent material, as well as a variety of fluorescent materials that can be identified as a fluorescence detector can be used, enzymatic coloration reaction and isotope labeling is also possible.
  • the label is Cy5, Cy3, biotin-binding material, EDANS (5- (2'-aminoethyl) amino-1-naphthalene sulfate), tetramethyltamine (TMR), tetramethyltamine isocyanate (TMRITC ), x-rhodamine or Texas red and the like, and it is preferable that the phosphor is Cy3 or Cy5.
  • the present invention is not limited thereto, and various labeling materials such as various fluorescent materials, radioactive materials, or luminescent materials known in the art may be used.
  • the present invention it is possible to simultaneously determine the subtype of the HA gene for determining the serotype of avian influenza virus and to test whether it is pathogenic, and to quickly and accurately detect whether the avian influenza virus to be tested is highly pathogenic or low pathogenic. have.
  • the present invention is capable of simultaneously testing the serotype and pathogenicity of avian influenza virus, which can be fatal to poultry and fatal to the human body, and in particular, a technique for rapidly and accurately and economically detecting whether highly pathogenic or low pathogenic is highly sensitive. Providing rapid prevention measures against avian influenza virus can provide early protection against the risk of the spread of avian influenza virus.
  • the technique of the present invention it is possible to discriminate between the serotype and pathogenicity of avian influenza virus in a short time and at a low cost at a low cost, especially when avian influenza occurs by quickly and accurately sensitively checking whether avian influenza is highly pathogenic or low pathogenic. Early response to early diagnosis can contribute to minimizing the risk of disease.
  • FIG. 1 is a result of electrophoresis of PCR amplification products obtained by amplifying each avian influenza virus gene samples using primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 for specifically amplifying the HA gene of avian influenza virus (FIG. 1) obtained by amplifying each avian influenza virus gene sample using primer pairs of SEQ ID NOs: 3 and 4 to specifically amplify the pathogenic discrimination gene region together with (a)) and the primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 It is a photograph showing the result of electrophoresis of the PCR amplification product (Fig. 1 (b)).
  • FIG. 2 shows a layout of a microarray gene chip in which HA gene related probes and pathogenic related probes are integrated according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 (a) is a hybridization of the amplification product obtained by performing PCR amplification using the primer pairs of SEQ ID NO: 1 and 2 for the HA subtype H5 type and highly pathogenic avian influenza virus gene samples hybridized to the microarray gene chip of Figure 2 After the fluorescence image of the gene chip confirmed,
  • Figure 3 (b) is an amplification product obtained by performing PCR amplification using the primer pair of SEQ ID NO: 3 and 4 with the primer pair of SEQ ID NO: 1 and 2 for the same sample Is a fluorescence image photograph of the gene chip identified after hybridization to the microarray gene chip of FIG.
  • FIG. 4 (a) shows PCR amplification using primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 for each of the avian influenza virus gene samples having HA subtype H9N2 and the HA influenza H5N2 type and low pathogenic avian influenza virus gene samples, respectively.
  • Figure 4 (b) is the SEQ ID NO: 3 with the primer pairs of SEQ ID NO: 1 and 2 for the same sample
  • amplified products obtained by PCR amplification using the primer pairs of 4 are hybridized to the microarray gene chip of FIG.
  • FIG. 5 (a) shows the amplification products obtained by performing PCR amplification using the primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 on the avian influenza virus gene sample having the HA subtype H7N1, and hybridizing the microarray gene chip of FIG.
  • Fig. 5 (b) shows an amplification product obtained by performing PCR amplification using the primer pairs of SEQ ID NOS: 3 and 4 together with the primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 for the same sample. Fluorescence image of the gene chip confirmed after hybridization to the microarray gene chip of.
  • FIG. 6 illustrates a layout of a microarray gene chip in which HA gene related probes, pathogenic related probes, and positive control probes are integrated according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 (a) shows a result of performing an amplification reaction for each of the avian influenza virus gene samples, the highly pathogenic avian influenza virus gene sample, the negative control (no template) and the M gene sample, according to the conventional positive control probe (SEQ ID NO: 88).
  • SEQ ID NO: 88 Is a fluorescence image photograph of the gene chip confirmed after hybridization to the integrated microarray gene chip of Figure 6
  • Figure 7 (b) is a new positive control probe (SEQ ID NO: 89) Is a fluorescent image of the gene chip confirmed after hybridization to the integrated microarray gene chip of FIG.
  • HA genes H5, H7, H9 extracted from avian influenza virus. Primer pairs for specific amplification and new primer pairs for amplifying highly sensitive pathogenic discrimination gene regions were synthesized.
  • a new positive control amplification primer capable of specifically amplifying a gene of avian influenza virus (for example, M gene) was synthesized.
  • Spackman, E. et al Development of real-time RT-PCR for the detection of avian influenza virus. Avian Dis. 47, 1079-1082 (2003); Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, RG & Perez, DR Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch. Virol . 146, 2275-2289 (2001).
  • primers are used. These primers were synthesized by a request from Korea Bioneer (Daejeon Metropolitan City).
  • HA-F 5'-AGC AAA AGC AGG GG-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • HA-R 5'-AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • HP / LPAI-F 5'-GGA AAY TTY ATT GCT CCA G-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • HP / LPAI-R 5'-TAG AGT YCT CTC ATT TTC CAT-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Primer for AIV gene positive control
  • AI P.C forward primer-1 5'-AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • AI P.C reverse primer-1 5'-TGCAAAAACATCTTCAAGTCTCTG-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • AI P.C forward primer-2 5'-AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • AI P.C reverse primer-2 5'-CACTKGGCACGGTGAGC-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • translocation direction (sense) primers and the rear direction (antisense) primers used for symmetric or asymmetric polymerase chain reaction (PCR) such as SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 are confirmed by fluorescence after the hybridization reaction (hybridization) It was prepared by attaching rhodamine, cy3, or cy5 to the terminal, or by attaching biotin. When biotin was attached, it was combined with streptavidin-cyanine after hybridization. Used. A preferred example is to attach cy3 to the primer terminus.
  • PCR amplification was performed on each of the prepared gene samples. Specifically, in Example 2-1, PCR amplification was performed using only the primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 (excluding the primer pairs of SEQ ID NOs: 3 and 4 from the composition of Table 1), and in Example 2-2, SEQ ID NO: PCR amplification was performed using primer pairs of SEQ ID NOs: 3 and 4 together with primer pairs of 1 and 2.
  • Example 2-2 with the PCR amplification product generation of the HA gene by the primer pairs of SEQ ID NOS: 1 and 2, additional PCR amplification products restricted to the pathogenic discrimination gene region by the primer pairs of SEQ ID NOs: 3 and 4 were generated. (Refer to FIG. 1 (b)).
  • the PCR amplification premix shown in Table 1 is provided by the above-described DNA engine manufacturer, for example, the PCR buffer, dNTP, TaKaRa Ex Taq TM (DNA polymerase) and the like.
  • PCR Amplification Reaction Composition Template (gene sample) 1 ⁇ l 2 ⁇ PCR premix 10 ⁇ l HA forward primer (SEQ ID NO: 1) (10 pmole/ ⁇ l) 1 ⁇ l HA reverse primer (SEQ ID NO: 2) (10 pmole/ ⁇ l) 1 ⁇ l HP / LP Forward Primer (SEQ ID NO: 3) (10 pmole/ ⁇ l) 0.5 ⁇ l HP / LP reverse primer (SEQ ID NO: 4) (10 pmole/ ⁇ l) 0.5 ⁇ l Distilled water 6 ⁇ l Sum 20 ⁇ l
  • bands of PCR amplification products in lanes 1 to 7 for avian influenza virus gene samples (H5 type highly pathogenic sample, H5 type low pathogenic sample, H7 type sample, H9 type sample, etc.) for each serotype.
  • Figure 1 (a) the electrophoresis results of PCR amplification products obtained by amplifying avian influenza virus gene samples using only the primer pairs of SEQ ID NO: 1 and 2 H5 type highly pathogenic samples (lane 1, 2) There was little difference between the amplification product bands of the H5 type low pathogenic sample (lane 3) (Example 2-1).
  • Example 2-2 in the case of the H5 type highly pathogenic sample (lanes 1 and 2), the primer pairs of SEQ ID NOs: 3 and 4 together with the PCR amplification products of the HA gene were generated by the primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2. Additional PCR amplification products limited to the pathogenic discriminator gene region could be used to test the high pathogenicity of avian influenza gene samples.
  • Example 3 Preparation of a probe for discriminating avian influenza virus major serotypes and pathogenicity
  • probes specific for each of the HA gene subtypes were synthesized.
  • new high-sensitivity probes for discriminating high and low pathogenic avian influenza viruses were also synthesized.
  • Sequence information of the probes for the hybridization reaction is shown in Table 3 below.
  • Table 3 below shows avian influenza virus serotypes (H5, H7, H9) and probe sequences for pathogenicity determination (except positive control probes).
  • 10 to 20 oligos (dT) were added to minimize spatial interference between probes integrated on the slide glass, thereby completing the probes used in the embodiments of the present invention.
  • Subtype of the HA gene that determines the serotype of the avian influenza virus to be tested according to hybridization of the PCR amplification products obtained by performing PCR amplification using a primer pair for amplifying a region and the probes of Table 3 above.
  • H5, H7, and H9 types can be distinguished and at the same time high pathogenicity or low pathogenicity can be accurately identified with high sensitivity using additional probes (HPAI probe and LPAI probe).
  • an amplification product of the avian influenza virus gene sample to be tested hybridizes with at least one of the probes (H5 probes) of SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 20, while the probes of SEQ ID NO: 36 to SEQ ID NO: 56 (HPAI Hybridized with at least one of the probes, and further, among the probes of SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 66 to SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 77, and SEQ ID NO: 78 (additional HPAI probes) When hybridized with at least one, the avian influenza virus to be tested can be reliably determined to be highly pathogenic H5.
  • the avian influenza virus to be tested can be reliably determined to be low pathogenic type H5.
  • the amplification product of the avian influenza virus gene sample to be tested is hybridized with at least one of the probes (H7 probes) of SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 27, while the probes of SEQ ID NO: 36 to SEQ ID NO: 56 (HPAI probes And at least one of the probes (additional HPAI probes) of SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 66 to SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 77, and SEQ ID NO: 78);
  • the avian influenza virus to be tested can be reliably determined to be highly pathogenic type H7.
  • the amplification product of the avian influenza virus gene sample to be tested is hybridized with at least one of the probes (H9 probes) comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 28 to SEQ ID NO: 35, and at the same time Hybridization with at least one of the probes (LPAI probes) allows the avian influenza virus to be tested to be determined to be low pathogenic type H9.
  • H9 probes the probes comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 28 to SEQ ID NO: 35
  • LPAI probes Hybridization with at least one of the probes
  • the avian influenza virus test kit and test method of the present invention using the avian influenza virus test probe, the primer pair of SEQ ID NO: 1 and 2 and the primer pair of SEQ ID NO: 3 and 4 designed in Example 1 as described above While subtype identification of HA genes and pathogenicity tests are possible at the same time, it provides the advantage of being able to quickly and accurately test whether the avian influenza virus, which can be fatal to poultry and deadly to humans, is highly pathogenic or low pathogenic.
  • Primer pairs and the new AIV positive control probe are designed to provide superior amplification specificity and detection sensitivity than conventional ones.
  • AI P.C probe-1 5'-CAGGCCCCCTCAAAGCCGA-3 '(SEQ ID NO: 88)
  • AI P.C probe-2 5'-RATWGGTCTTGTCTTWARCCAYTCC-3 '(SEQ ID NO: 89)
  • Fabrication of microarrayed gene chips is carried out using methods well known to those skilled in the art.
  • an amino link is modified at the 5'-end of an oligonucleotide having each probe base sequence (SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 87) of Example 3 (Table 3) on a glass treated with an aldehyde functional group, and then hybridized.
  • 10 to 20 oligos (dT) were added to minimize spatial interference between probes integrated on the slide glass, thereby completing the probes used in the embodiments of the present invention.
  • Probes of the present invention were synthesized by the request of Bioneer Korea (Daejeon Metropolitan City).
  • the amino link is modified at a concentration of 50 ⁇ M on a CSS-100 silylated slide (Silylated Slide, Cell Associate, USA).
  • the same amount of 3X SSC solution was mixed by mixing with the probe, which was reacted at room temperature for at least 16 hours. After the reaction was completed, the slides were washed once with 0.1% SDS for 5 minutes and twice with distilled water for 5 minutes.
  • the prepared chip was reacted with sodium borohydride (0.625g NaBH 4 , 168.75ml ddH 2 O, 18.75ml PBS, 62.5ml 100% EtOH 62.5ml) for 5 minutes, washed twice with distilled water for 5 minutes and at 800 rpm. Centrifuge for 5 minutes.
  • sodium borohydride 0.625g NaBH 4 , 168.75ml ddH 2 O, 18.75ml PBS, 62.5ml 100% EtOH 62.5ml
  • the fabricated microarray chips were divided into four sub-arrays and covered with a CoverWell perfusion chamber (Grace-Bio Labs, USA) so that the microarray chips prepared in the hybridization experiment could be independently reacted.
  • the configuration (layout) of the microarray chip finally fabricated by integrating the HA gene-related probes and the pathogenic-related probes (SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 87) shown in Table 3 is as shown in FIG.
  • each index number assigned to the microarray chip layout is shown, and each probe name corresponding to each index number is described (see Table 3 for sequence numbers corresponding to each probe name). ).
  • FIG. 2 In the configuration of the microarray chip of FIG. It consists of nonhomologous sequences for genes.
  • probes corresponding to indexes 52-59, 65, 67, 69, 70, and 73 probes of SEQ ID NOs: 58-65, 71, 73, 75, 76, and 79 in the layout of FIG. It can be omitted without spotting, and the microarray chip may be configured with the probe on the layout of the spot where the probe is spotted.
  • a microarray chip was manufactured in a manner similar to that of Example 4-1, but among the probes of Table 3 of Example 3, SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 to SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 to SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53 to SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 66 to SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, Microarray chips were constructed using the probes of SEQ ID NO: 77 to SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80 to SEQ ID NO: 81, and SEQ ID NO: 85.
  • a new AIV positive control probe (SEQ ID NO: 89) of the present invention is further integrated to construct a microarray chip, and as a control, the conventional AIV positive control probe (SEQ ID NO: 88) is further integrated.
  • a microarray chip was constructed.
  • the configuration (layout) of the finally produced microarray chip is as shown in FIG. 6.
  • each index number assigned to the microarray chip layout is shown, and each probe name corresponding to each index number is described (see Table 3 for sequence numbers corresponding to each probe name). ).
  • the probes corresponding to indexes 1 and 60 are HA as position markers. It consists of nonhomologous sequences for genes.
  • the microarray chip layout of FIG. 6 the microarray chip spotted a new AIV positive control probe (SEQ ID NO: 89) at the position of index 59, and the conventional AIV positive control probe (SEQ ID NO: 88) at the position of index 59. Spotted control microarray chips were prepared separately.
  • PCR amplification products amplified according to Examples 1 and 2 and bound with a label were mixed with a hybridization solution (3X SSC, 0.3% Sarcosyl) in a ratio of 1: 9.
  • a hybridization solution 3X SSC, 0.3% Sarcosyl
  • Each avian influenza virus gene sample was amplified using only HA gene amplification primers (primary pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2)
  • a hybridization reaction solution in which the amplification product was mixed with the hybridization solution was prepared as a control.
  • HA gene amplification primer pair SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 primer pair
  • pathogenicity for each avian influenza virus gene sample H5 type high pathogenic sample, H5 type low pathogenic sample, H7 type sample, H9 type gene sample
  • Hybridization reaction solutions in which amplification products amplified using a primer pair (primary pairs of SEQ ID NOs: 3 and 4) for specifically amplifying a discrimination gene region were mixed with a hybridization solution were separately prepared as test groups of the present invention.
  • Hybridization solutions of each of the control and test groups for each gene sample were reacted with the microarray chip of FIG. 2.
  • the hybridization reaction solution prepared separately as described above was loaded and reacted on the microarray chip of FIG. 2 prepared in Example 4-1. It was then first washed for 5 minutes in 1X SSC, 0.1% SDS solution and again for 5 minutes in 1X SSC solution. It was then further washed in 0.1X SSC solution for 5 minutes. The washed slides were dried and the images scanned.
  • a fluorescent image was scanned by scanning the hybridization signal (fluorescence signal) of the microarray chip using a Genepix 4000B (Axon Instrument). The positive and negative signals of each probe were judged by the fluorescence value. Fluorescence intensity data was analyzed using GenePix Pro 4.1 software (Axon instrument, USA), and the background value was subtracted from the mean value of each spot. All probes were spotted in duplicate so the signal intensities of the target probes were calculated from the average of the two spots.
  • the hybridization reaction solution (control hybridization reaction solution) of an amplification product obtained by amplification using primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 for an avian influenza virus gene sample having an HA subtype of H5 type and highly pathogenic. ) Hybridized to the microarray gene chip of FIG. 2, no signal was observed for the H5 type detection probe and the high pathogenicity detection probe except for the position marker (see FIG. 3A).
  • the hybridization reaction solution (test group hybridization reaction solution of the present invention) obtained by performing amplification using the primer pairs of SEQ ID NOs.
  • the fluorescence signal of the H5 type detection probe and the fluorescence signal of the highly pathogenic detection probe were clearly observed (see FIG. 3B).
  • index Nos. 4-7 and 10-13 positions are determined.
  • the fluorescent signals were clearly observed at the spots where the probes of SEQ ID NOS: 10 to 13 and 16 to 19 were spotted to detect the H5 subtype, and the index number 36-39 (SEQ ID NO: 42 for determining high pathogenicity) Fluorescence signal is clearly observed at the positions where the probes of SEQ ID NO: 45 are spotted, and at the same time, index No.
  • the hybridization reaction solution of the amplification product obtained by amplification using a primer pair of SEQ ID NO: 1 and 2 for the HA influenza virus gene samples H5 or H5N2 type and low pathogenic When (control hybridization reaction solution) was hybridized to the microarray gene chip of FIG. 2, no signal was observed for the H5 type detection probe and the low pathogenicity detection probe except for the position marker (see FIG. 4A). ).
  • the hybridization reaction solution (test group hybridization reaction solution of the present invention) obtained by performing amplification using the primer pairs of SEQ ID NOs. When hybridized to the array gene chip, the fluorescence signal of the H5 type detection probe and the fluorescence signal of the low pathogenicity detection probe were clearly observed (see FIG. 4B).
  • the control hybridization solution was hybridized to the gene chip of FIG. 2 and the test group hybridization solution of the present invention was used in the gene of FIG. 2. In all cases hybridized to the chip, only the probe fluorescence signal for discriminating the HA subtype, that is, the H9 subtype and the H7 subtype was identified.
  • the avian influenza virus test kit and the test method using the same according to the present invention while being able to simultaneously perform the test for the serotype and pathogenicity of the avian influenza virus, whether it is highly pathogenic or low pathogenic, but more sensitive and faster than conventional There is an advantage that can be detected accurately.
  • a primer pair for amplification of HA gene primer pairs of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a pathogenic discrimination gene region according to Examples 1 and 2 were specifically identified.
  • Amplified first amplification products were separately prepared using primer pairs (a primer pair of SEQ ID NOs: 3 and 4) for amplification.
  • primer pairs of SEQ ID NOs: 5 and 6 which are primer pairs for amplifying conventional positive control genes (i.e., M genes) for each H5 type, highly pathogenic avian influenza virus gene sample, negative control (no template) and M gene sample.
  • primer pairs of SEQ ID NOs: 7 and 8 which are primer pairs for amplifying a new positive control gene (i.e., M gene) for each H5 type, highly pathogenic avian influenza virus gene sample, negative control (no template) and M gene sample, respectively.
  • a new positive control gene i.e., M gene
  • PCR amplification reaction composition as shown in Table 4 below
  • PCR amplification according to a method known in the art see Example 2 under the PCR amplification reaction conditions as shown in Table 5 to prepare a third amplification product, respectively .
  • the third amplification product of the H5 type and highly pathogenic avian influenza virus gene sample was mixed with the first amplification product prepared above.
  • PCR Amplification Reaction Composition Template (gene sample) 1 ⁇ l 2 ⁇ PCR premix 10 ⁇ l Forward primer for positive control amplification (10 pmole / ⁇ l) 0.5 ⁇ l Reverse primer for positive control amplification (10 pmole / ⁇ l) 0.5 ⁇ l Distilled water 8 ⁇ l Sum 20 ⁇ l
  • the preparation of the hybridization reaction solution for the third amplification product the preparation of the hybridization reaction solution for the mixture of the first amplification product and the third amplification product, the test group micro array having the layout of Figure 6
  • the hybridization reaction and the fluorescence signal analysis procedure for reacting the chip were performed in the same manner as in Example 5-1.
  • the result is shown in the fluorescence image photograph of FIG.
  • the negative control (NTC) without the template does not show any false positive fluorescence signal in the positive control probe and thus does not show false positive error signal, unlike FIG.
  • the kit for avian influenza virus test using the positive control amplification primer pairs of SEQ ID NOS: 7 and 8 and the positive control probe of SEQ ID NO: 89 and the test method using the same are the gene amplification of each avian influenza virus gene samples. It is possible to check whether or not it is made normally, and there is an advantage of checking whether the signal of the hybridized other probes is a false positive signal.

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Abstract

본 발명은 HA 유전자의 아형 판별과 병원성 여부의 검사가 동시에 가능하면서도, 검사대상 조류 인플루엔자 바이러스가 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브, 유전자 칩 및 검사용 키트 그리고 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 가금류에 치명적이고 인체에도 치명적일 수 있는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형과 병원성 여부의 검사가 동시에 가능하되, 특히 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하면서도 정확하게 그리고 경제적으로 검출하는 기술을 제공하여 조류인플루엔자 바이러스에 대한 방역 대책을 신속하게 마련하게 함으로써 조류인플루엔자 바이러스의 확산에 의한 위험을 조기에 차단할 수 있다.

Description

조류인플루엔자 바이러스를 고감도로 검사하기 위한 키트, 이를 위한 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브 조성물 및 유전자 칩, 그리고 이들을 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법
본 발명은 조류인플루엔자 바이러스를 고감도로 검사하기 위한 키트, 이를 위한 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브 조성물 및 유전자 칩, 그리고 이들을 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 여부를 고감도로 판별하기 위한 검사용 키트, 이를 위한 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브 조성물 및 유전자 칩, 그리고 이들을 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형을 결정하는 HA 유전자의 아형 판별과 병원성 여부의 검사가 동시에 가능하면서도, 검사대상 조류 인플루엔자 바이러스가 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 가금류에 치명적이고 인체에도 치명적일 수 있는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형과 병원성 여부를 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 경제적으로 검출하여 조류인플루엔자 바이러스에 대한 방역 대책을 신속하게 마련하게 함으로써 조류인플루엔자 바이러스의 확산에 의한 위험을 조기에 차단할 수 있는 기술에 관한 것이다.
조루인플루엔자 바이러스는 NP(nuleocapsid) 단백질과 M(matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분되고, 이중 A형은 다시 HA (hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H15형의 아형으로 분류되며 NA (Neuraminidase) 단백질의 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류된다. 일반적으로, HA 단백질과 NA 단백질은 조류인플루엔자 바이러스의 분류에 있어 혈청형을 결정하는 항원 단백질로서 이들 단백질을 각각 코딩하는 HA 유전자 및 NA 유전자의 아형 판별에 의해 조류인플루엔자 바이러스의 감별이 이루어진다.
조류인플루엔자 바이러스 중 H5형과 H7형에서 나타나는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(이하, 'HPAI'라고도 함)는 가금류에 감염시 높은 폐사율을 보이며 국가적으로 많은 경제적 피해를 주는 것으로 알려져 있으며, HPAI와 더불어 H9형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(이하, 'LPAI'라고도 함)는 산란계 농가 등에서 많은 피해를 일으킬 뿐 아니라 HPAI와 함께 사람으로의 감염에 대한 보고가 이루어지고 있다. 특히, 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 H5N1형은 아시아지역을 중심으로 인체감염이 이루어지고 있으며, 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 H9N2형도 인수공통감염의 보고가 있어 공중보건학적인 위해가 큰 것으로 알려져 있다.
따라서, 조류인플루엔자 바이러스의 감염 확산 방지를 위해 이들 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 여부를 조기에 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 진단 시스템이 필요한 실정이다. 특히, 현재 국내 양계농장에는 많은 폐사를 동반하는 H9N2형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스가 만연되어 있고 고병원성 조류인플루엔자 바이러스의 피해가 심각한 점을 고려할 때 이의 재발에 대비하여 HA 아형 (H5형, H7형, H9형)과 고병원성 여부를 조기에 동시 감별하여 진단할 수 있는 새로운 진단법 개발이 요구된다고 하겠다.
이와 관련하여 종래의 조류인플루엔자 바이러스(avina influenza virus: AIV) 진단방법으로는 SPF 종란에서 바이러스 배양 후 혈구응집 반응으로 증식 여부를 확인하여 진단하는 방식, 또는 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction) 방법이나 NASBA 방법을 이용하여 조류인플루엔자 바이러스의 RNA를 증폭한 후 유전자 염기서열 분석을 실시하여 혈청형 및 병원성을 판별하는 방식을 들 수 있으나, 이들 진단방식을 사용할 경우 진단 소요시간이 최소 2일에서 길게는 7일 정도의 기간이 소요되어 공중보건학적인 위해가 큰 조류인플루엔자 바이러스의 감염 확산을 조기에 차단하는 방역학적 요구에는 부응하지 못하는 한계가 있었다.
한편, 대한민국 공개특허 제10-2011-0028188호에서는 실시간 다중 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 일반 인플루엔자 Ａ와 신종 인플루엔자의 동시 검출방법을 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제10-2011-0114978호에서는 멀티플렉스 실시간 RT-PCR을 이용한 신종 및 계절 인플루엔자 바이러스 검출방법을 개시하고 있다. 이들 종래기술들은 리얼타임 방식의 RT-PCR 증폭방법을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 RNA 유전자 증폭 및 아형 판별을 함으로써 비교적 단시간에 대량으로 분석이 가능하지만, 멀티플렉스 방식으로는 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형 판별과 병원성 분석을 동시에 할 수 없는 한계와 확장성의 제한이 있었다. 특히, 리얼타임 PCR과 같은 분자생물학적 방법을 이용한 조류인플루엔자 바이러스 유전자 진단 방법은 프라이머 및 프로브 부착부위에 변이가 발생시 위음성의 결과가 초래할 수 있는 단점이 있다.
또한, 기존의 마이크로어레이 방식의 인플루엔자 혈청형 감별법 연구는 대상 바이러스가 주로 사람에서 최근 문제시 되고 있는 혈청형(H1N1, H3N2, H5N1)에 치중되어 있는 실정이며, 양계산업에서 중요시 되고 있는 혈청형(H9N2, H5N1, H7N7 등)을 포함한 조류인플루엔자 바이러스 전문 유전자칩 관련 연구는 미미한 실정이다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 조류인플루엔자 바이러스의 HA 아형(H5형, H7형, H9형)과 병원성을 동시에 검사하되, 신속하면서도 정확하게 그리고 경제적으로 검사할 수 있는 새로운 검사용 마이크로어레이 유전자칩 또는 검사 방법의 개발이 필요한 실정이다.
이러한 문제점들을 감안하여 본 발명자들은 마이크로어레이 칩 기반의 새로운 조류인플루엔자 바이러스의 검사방법을 제시한 바 있다. 이 새로운 조류인플루엔자 바이러스의 검사방법은 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형과 병원성을 동시에 검사할 수 있도록 구성되어 있다. 이러한 새로운 장치의 예가 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0116609호에 개시되어 있다. 이러한 조류인플루엔자 바이러스의 검사방법이 우수한 기술임에도 다른 우수한 기술과 마찬가지로 끊임없는 개선이 이루어질 수 있는 것이다.
특히, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형을 결정하는 HA 유전자의 아형 판별과 병원성 여부의 검사가 동시에 가능하면서도, 검사대상 조류 인플루엔자 바이러스가 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법의 개발에 대한 요구가 꾸준히 지속되고 있다.
이에 본 발명자들은 조류인플루엔자 바이러스의 주요 혈청형(H5형, H7형, H9형)의 HA 유전자와 병원성을 구분할 수 있는 유전자 특이 영역을 선정한 후, HA 유전자를 특이적으로 증폭하면서도 병원성 판별을 위한 유전자 영역을 민감도 높게 증폭할 수 있는 새로운 증폭용 프라이머 쌍을 설계하였고, 이를 기반으로 HA 유전자의 아형 판별과 병원성 여부의 검사가 동시에 가능하면서도, 검사대상 조류 인플루엔자 바이러스가 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브, 유전자 칩 및 검사용 키트를 개발하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 여부를 고감도로 판별하기 위한 검사용 키트, 이를 위한 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브 조성물 및 유전자 칩, 그리고 이들을 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
특히, 본 발명은 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형을 결정하는 HA 유전자의 아형 판별과 병원성 여부의 검사가 동시에 가능하면서도, 검사대상 조류 인플루엔자 바이러스가 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
추가로, 본 발명은 가금류에 치명적이고 인체에도 치명적일 수 있는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형과 병원성 여부를 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 경제적으로 검출하여 조류인플루엔자 바이러스에 대한 방역 대책을 신속하게 마련하게 함으로써 조류인플루엔자 바이러스의 확산에 의한 위험을 조기에 차단할 수 있는 기술을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 HA 유전자의 아형 판별과 병원성 여부의 검사가 동시에 가능하면서도, 검사대상 조류 인플루엔자 바이러스가 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브, 유전자 칩 및 검사용 키트 그리고 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 프로브 조성물은,
조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 프로브로서 서열번호 9 내지 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 프로브로서 서열번호 21 내지 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 프로브로서 서열번호 28 내지 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
조류인플루엔자 바이러스의 고병원성을 판별하는 프로브로서 서열번호 36 내지 서열번호 56의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브, 및 추가로 서열번호 57, 서열번호 66 내지 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 77 및 서열번호 78의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
조류인플루엔자 바이러스의 저병원성을 판별하는 프로브로서 서열번호 80 내지 서열번호 87의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 프로브 조성물은, 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 유전자(즉, 포지티브 콘트롤 유전자)(예를 들어, M 유전자)에 혼성화되는 포지티브 콘트롤 프로브로서, 종래 보다 특이도 및 민감도가 개선된 서열번호 89의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 특이도 및 민감도가 개선된 포지티브 콘트롤 프로브는 후술하는 바와 같은 포지티브 콘트롤 유전자에 대한 증폭 특이도가 개선된 새로운 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍(서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍)과 함께 사용되어 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 유전자 증폭이 정상적으로 이루어졌는지 여부를 확인할 수 있고, 혼성화된 다른 프로브들의 신호가 위양성 신호인지 여부를 확인할 수 있다. 예를 들어, 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 포지티브 콘트롤인 M 유전자에 대한 증폭 산물과의 혼성화 과정 후, 포지티브 콘트롤 프로브에서 혼성화 신호가 발생하지 않은 경우 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 유전자 증폭 과정의 문제가 있음을 확인할 수 있다. 또한, 포지티브 콘트롤 프로브에서 혼성화 신호가 발생하지 않았음에도 불구하고 다른 프로브들에서 혼성화 신호가 발생하는 경우 이를 위양성 신호로 판단할 수 있다.
상기 M 유전자는 시판되는 검사용 키트에서 조류인플루엔자 유전자들 중 포지티브 콘트롤로서 널리 사용되는 유전자(GenBank Accession Number: GU122038.1)로서, 인플루엔자 A 바이러스 세그먼트 7의 매트릭스 단백질 유전자를 의미한다(Influenza A virus segment 7 matrix protein 1 (M1) and matrix protein 2 (M2) genes, partial cds).
본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 유전자 칩은,
조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 프로브로서 서열번호 9 내지 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 프로브로서 서열번호 21 내지 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 프로브로서 서열번호 28 내지 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
조류인플루엔자 바이러스의 고병원성을 판별하는 프로브로서 서열번호 36 내지 서열번호 56의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브, 및 추가로 서열번호 57, 서열번호 66 내지 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 77 및 서열번호 78의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
조류인플루엔자 바이러스의 저병원성을 판별하는 프로브로서 서열번호 80 내지 서열번호 87의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 유전자 칩은, 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 포지티브 콘트롤 유전자(예를 들어, M 유전자)에 혼성화되는 포지티브 콘트롤 프로브로서, 종래 보다 특이도 및 민감도가 개선된 서열번호 89의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 특이도 및 민감도가 개선된 포지티브 콘트롤 프로브가 스폿팅된 유전자 칩은 후술하는 바와 같은 포지티브 콘트롤 유전자에 대한 증폭 특이도가 개선된 새로운 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍(서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍)과 함께 사용되어 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 유전자 증폭이 정상적으로 이루어졌는지 여부를 확인할 수 있고, 혼성화된 다른 프로브들의 신호가 위양성 신호인지 여부를 확인할 수 있다. 예를 들어, 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 포지티브 콘트롤인 M 유전자에 대한 증폭 산물과의 혼성화 과정 후, 포지티브 콘트롤 프로브에서 혼성화 신호가 발생하지 않은 경우 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 유전자 증폭 과정의 문제가 있음을 확인할 수 있다. 또한, 포지티브 콘트롤 프로브에서 혼성화 신호가 발생하지 않았음에도 불구하고 다른 프로브들에서 혼성화 신호가 발생하는 경우 이를 위양성 신호로 판단할 수 있다.
추가로, 본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 유전자 칩에 있어서, 상기 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형을 판별하는 프로브, 상기 조류인플루엔자 바이러스의 고병원성을 판별하는 프로브, 상기 조류인플루엔자 바이러스의 저병원성을 판별하는 프로브, 및 선택적으로 포지티브 콘트롤 프로브는 유리 슬라이드와 같은 동일 기판 상에 마이크로어레이될 수 있다. 상기 기판은 유전자 칩 제작에 일반적으로 사용되는 유리기판 또는 플라스틱 기판인 것이 바람직하다. 또한, 프로브가 마이크로어레이되는 유전자 칩에는 프로브와의 혼성화 및 검출의 정확성을 높일 수 있도록 특정한 염기서열로 표시되는 위치 마커(position marker)를 추가적으로 고정시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 HA 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 병원성 판별을 위한 유전자 영역을 민감도 높게 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용하는 것을 특징으로 한다.
이와 관련하여 본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스 검사를 위한 PCR 증폭키트는, HA 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 포함한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스 검사를 위한 PCR 증폭키트는, 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 유전자(즉, 포지티브 콘트롤 유전자)(예를 들어, M 유전자)를 특이적으로 증폭할 수 있는 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍으로서, 종래 보다 포지티브 콘트롤 유전자에 대한 증폭 특이도가 개선된 새로운 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍에 의해 증폭된 포지티브 콘트롤 유전자의 증폭 산물은 전술한 바와 같은 포지티브 콘트롤 프로브와 혼성화된다.
본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스 검사방법은,
(a1) 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 이용하여 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료를 증폭하는 단계와,
(b) 상기 증폭 산물을 전술한 바와 같은 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 유전자 칩에 혼성화시키는 단계와,
(c) 상기 혼성화 여부에 따라 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성을 판별하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스 검사방법에 있어서, 서열번호 9 내지 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 증폭 산물과 혼성화될 때 H5형으로 판별하고, 서열번호 21 내지 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 증폭 산물과 혼성화될 때 H7형으로 판별하며, 서열번호 28 내지 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 증폭 산물과 혼성화될 때 H9형으로 판별하는 것을 특징으로 한다.
추가로, 본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스 검사방법에 있어서, 서열번호 36 내지 서열번호 56의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브, 및 추가로 서열번호 57, 서열번호 66 내지 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 77 및 서열번호 78의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 증폭 산물과 혼성화될 때 고병원성으로 판별하고, 서열번호 80 내지 서열번호 87의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 증폭 산물과 혼성화될 때 저병원성으로 판별하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 (b) 단계의 유전자 칩에는 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 포지티브 콘트롤 유전자에 혼성화되는 포지티브 콘트롤 프로브로서 서열번호 89의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 추가로 스폿팅될 수 있다. 더욱 바람직하게는, (a2) 상기 포지티브 콘트롤 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 이용하여 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료 내의 포지티브 콘트롤 유전자를 증폭하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 포지티브 콘트롤 유전자의 증폭 산물을 상기 (a1) 단계의 증폭 산물과 함께 상기 유전자 칩에 혼성화시킬 수 있다. 따라서, 상기 (c) 단계에서는 상기 포지티브 콘트롤 프로브의 증폭 산물과의 혼성화 여부에 따라 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 유전자 증폭이 정상적으로 이루어졌는지 여부와, 다른 프로브들의 신호가 위양성 신호인지 여부를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트를 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트는, 전술한 바와 같은 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 유전자 칩과, 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍과, 상기 유전자 칩과 혼성화되는 증폭된 유전자 산물을 검출하기 위한 표지수단을 포함한다.
바람직하게는, 상기 유전자 칩에는 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 포지티브 콘트롤 유전자에 혼성화되는 포지티브 콘트롤 프로브로서 서열번호 89의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 추가로 스폿팅될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 일실시예의 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트는 상기 포지티브 콘트롤 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 표지물질은 특정 형광물질에 제한되지 않음은 물론이고, 형광 검출기로서 확인이 가능한 다양한 형광물질이 사용될 수 있으며 효소학적 발색반응 및 동위원소 표지도 가능하다. 예를 들어, 표지물질은 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS (5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트 (TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드 등일 수 있으며, 형광물질인 Cy3 또는 Cy5인 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질, 방사성 물질 또는 발광성 물질 등 다양한 표지물질이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형을 결정하는 HA 유전자의 아형 판별과 병원성 여부의 검사가 동시에 가능하면서도, 검사대상 조류 인플루엔자 바이러스가 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하고 정확하게 검사할 수 있다.
또한, 본 발명은 가금류에 치명적이고 인체에도 치명적일 수 있는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형과 병원성 여부의 검사가 동시에 가능하되, 특히 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하면서도 정확하게 그리고 경제적으로 검출하는 기술을 제공하여 조류인플루엔자 바이러스에 대한 방역 대책을 신속하게 마련하게 함으로써 조류인플루엔자 바이러스의 확산에 의한 위험을 조기에 차단할 수 있다.
따라서, 본 발명의 기술을 이용하면 저가의 비용으로 빠른 시간 이내에 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 감별이 가능하고, 특히 조류인플루엔자가 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하고 정확하게 검사함으로써 조류인플루엔자 발생시 조기 진단에 따른 초동대처로 질병 발생 피해를 최소화하는데 기여할 수 있다.
도 1은 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 사용하여 각각의 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료를 증폭하여 얻은 PCR 증폭산물을 전기영동한 결과(도 1의 (a))와, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 함께 병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용하여 각각의 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료를 증폭하여 얻은 PCR 증폭산물을 전기영동한 결과(도 1의 (b))를 나타내는 사진이다.
도 2은 본 발명의 일실시예에 따른 HA 유전자 관련 프로브들 및 병원성 관련 프로브들이 집적된 마이크로어레이 유전자 칩의 레이아웃을 나타낸 것이다.
도 3의 (a)는 HA 아형이 H5형이고 고병원성인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료에 대해 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 증폭을 수행하여 얻은 증폭산물을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 후 확인한 유전자 칩의 형광이미지 사진이고, 도 3의 (b)는 동일한 시료에 대해 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 함께 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 증폭을 수행하여 얻은 증폭산물을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 후 확인한 유전자 칩의 형광이미지 사진이다.
도 4의 (a)는 HA 아형이 H9N2형인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료 및 HA 아형이 H5형 또는 H5N2형이고 저병원성인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료 각각에 대해 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 증폭을 수행하여 얻은 증폭산물을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 후 확인한 유전자 칩의 형광이미지 사진이고, 도 4의 (b)는 동일한 시료에 대해 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 함께 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 증폭을 수행하여 얻은 증폭산물을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 후 확인한 유전자 칩의 형광이미지 사진이다.
도 5의 (a)는 HA 아형이 H7N1형인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료에 대해 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 증폭을 수행하여 얻은 증폭산물을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 후 확인한 유전자 칩의 형광이미지 사진이고, 도 5의 (b)는 동일한 시료에 대해 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 함께 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 증폭을 수행하여 얻은 증폭산물을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 후 확인한 유전자 칩의 형광이미지 사진이다.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 HA 유전자 관련 프로브들, 병원성 관련 프로브들 및 포지티브 콘트롤 프로브가 집적된 마이크로어레이 유전자 칩의 레이아웃을 나타낸 것이다.
도 7의 (a)는 HA 아형이 H5형이고 고병원성인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료, 네가티브 콘트롤(주형이 없는 것) 및 M 유전자 시료 각각에 대한 증폭 반응 수행 결과물을 종래의 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 88의 프로브)가 집적된 도 6의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 후 확인한 유전자 칩의 형광이미지 사진이고, 도 7의 (b)는 동일한 시료에 대한 증폭 반응 수행 결과물을 새로운 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 89의 프로브)가 집적된 도 6의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 후 확인한 유전자 칩의 형광이미지 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예 1: 프라이머의 제작
GenBank 데이터 베이스와 선행연구에서 확보된 유전자 정보를 이용하여 HA 유전자와 병원성을 구분할 수 있는 유전자 특이 영역을 선정하고 이를 기초로 조류인플루엔자 바이러스로부터 추출된 HA 유전자(H5형, H7형, H9형)를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 쌍과, 병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 민감도 높게 증폭하기 위한 새로운 프라이머 쌍을 합성하였다.
또한, HA 유전자 및 병원성 판별 유전자 영역에 대한 PCR 증폭의 정상적인 진행여부를 확인하기 위해 조류인플루엔자 바이러스의 유전자(예를 들어, M 유전자)를 특이적으로 증폭할 수 있는 새로운 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머를 합성하였다[Spackman, E. et al. Development of real-time RT-PCR for the detection of avian influenza virus. Avian Dis. 47, 1079-1082 (2003); Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R.G. & Perez, D.R. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch. Virol. 146, 2275-2289 (2001)].
후술하는 본 실시예에서는 하기의 프라이머들을 사용한다. 이들 프라이머는 한국의 바이오니아社(대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다.
HA 유전자 증폭용 프라이머
HA 프라이머 (대한민국 공개특허공보 제10-2013-0116609호의 프라이머)
HA-F : 5'-AGC AAA AGC AGG GG-3' (서열번호 1)
HA-R : 5'-AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT-3' (서열번호 2)
병원성 판별을 위한 유전자 영역 증폭용 프라이머
HP/LP AI 프라이머 (본 발명의 새로운 프라이머)
HP/LPAI-F : 5'-GGA AAY TTY ATT GCT CCA G-3' (서열번호 3)
HP/LPAI-R : 5'-TAG AGT YCT CTC ATT TTC CAT-3'(서열번호 4)
AIV 유전자(포지티브 콘트롤) 증폭용 프라이머
AI P.C 프라이머 쌍-1 (대한민국 공개특허공보 제10-2013-0116609호의 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍)
AI P.C forward primer-1: 5'-AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3' (서열번호 5)
AI P.C reverse primer-1: 5'-TGCAAAAACATCTTCAAGTCTCTG-3' (서열번호 6)
AI P.C 프라이머 쌍-2 (본 발명의 새로운 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍)
AI P.C forward primer-2: 5'-AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3' (서열번호 7)
AI P.C reverse primer-2: 5'-CACTKGGCACGGTGAGC-3' (서열번호 8)
또한, 서열번호 1 내지 서열번호 8과 같은 대칭 또는 비대칭 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 사용하는 전위 방향 (센스) 프라이머 및 후위 방향 (안티센스) 프라이머는 혼성화 (hybridization) 반응을 시킨 이후에 형광으로 확인할 수 있도록 말단에 로다민, cy3, 또는 cy5를 부착시켜서 제작하거나 비오틴(biotin)을 부착시켰으며, 비오틴을 부착시킨 경우에는 혼성화 반응 이후에 스트렙타비딘-사이아닌 (Streptavidin-Cyanine)과 결합하도록 하여 사용하였다. 바람직한 예는 cy3를 프라이머 말단에 부착시키는 것이다.
실시예 2: PCR 증폭반응의 수행
지금까지 국내에서 수행된 연구를 통해 분리되어 확보된 조류인플루엔자 바이러스 샘플을 종란에 접종하여 분리한 조류인플루엔자 바이러스의 RNA 유전자의 cDNA(2014년 건국대학교 수의과대학에서 종란에 접종하여 분리한 조류인플루엔자 바이러스 RNA 유전자의 cDNA)를 각 혈청형 별 조류인플루엔자 유전자 시료로서 준비하여 사용하였다.
그리고, 아래의 표 1과 같은 PCR 증폭 반응 조성 및 표 2와 같은 PCR 증폭 반응 조건 하에서 당업계에 알려진 방법, 예를 들어, DNA 엔진 (DNA Engine)(일본 타카라사 (Takara))을 사용하여 상기 준비된 유전자 시료 각각에 대해 PCR 증폭을 수행하였다. 구체적으로, 실시예 2-1에서는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍만을 이용하여 PCR 증폭을 수행하였고(표 1의 조성에서 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 배제), 실시예 2-2에서는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 함께 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 증폭을 수행하였다. 실시예 2-2에서는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍에 의한 HA 유전자의 PCR 증폭 산물 생성과 함께, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍에 의해 병원성 판별 유전자 영역으로 제한된 추가의 PCR 증폭 산물을 생성하게 된다(도 1의 (b) 참조).
참고로, 하기 표 1에 표시된 PCR 증폭용 프리믹스는 전술한 DNA 엔진 제조사에서 제공하는 것으로서 예를 들어, PCR 버퍼, dNTP, TaKaRa Ex Taq TM (DNA 중합효소) 등으로 이루어진 것이다.
PCR 증폭 반응 조성
주형 (유전자 시료) 1㎕
2×PCR 프리믹스 (2× premix) 10㎕
HA 정방향 프라이머 (서열번호 1) (10pmole/㎕) 1㎕
HA 역방향 프라이머 (서열번호 2)(10pmole/㎕) 1㎕
HP/LP 정방향 프라이머 (서열번호 3)(10pmole/㎕) 0.5㎕
HP/LP 역방향 프라이머 (서열번호 4)(10pmole/㎕) 0.5㎕
증류수 6㎕
합계 20㎕
PCR 증폭 반응 조건
온도 시간 사이클
95℃ 5분 1사이클
95℃ 1분 40 사이클
57℃ 1분
72℃ 1분 30초
72℃ 10분 1사이클
8℃ 중지
상기와 같은 조건 하에서 PCR 증폭반응이 끝난 후, PCR 증폭산물 3㎕에 젤 로딩 버퍼(0.2% orange G, 0.25% xylene cyanol FF, 60% glycerol) 2㎕를 넣고 1㎍/㎖ 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)가 함유된 1.5% 아가로스젤에서 전기영동한 후 UV 트랜스일루미네이터 (UV transilluminator)가 부착된 이미지 애널라이저(Image analyzer)(HITACHI, 일본)에서 PCR 증폭산물의 밴드를 확인하였다(도 1 참조).
도 1에 도시된 바와 같이, 각 혈청형 별 조류 인플루엔자 바이러스 유전자 시료(H5형 고병원성 시료, H5형 저병원성 시료, H7형 시료, H9형 시료 등)에 대해 레인 1 내지 레인 7에서 PCR 증폭산물의 밴드가 확인되었다. 도 1의 (a)에 도시된 바와 같이, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 만을 사용하여 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료를 증폭하여 얻은 PCR 증폭산물의 전기영동결과에서는 H5형 고병원성 시료(레인 1, 2)와, H5형 저병원성 시료(레인 3)의 증폭산물 밴드의 차이가 거의 없었다(실시예 2-1). 반면에, 도 1의 (b)에 도시된 바와 같이, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 함께 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용하여 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료를 증폭하여 얻은 PCR 증폭산물의 전기영동결과에서는 H5형 고병원성 시료(레인 1, 2)와, H5형 저병원성 시료(레인 3)의 증폭산물 밴드의 차이가 확연하게 관찰되었다(실시예 2-2). 즉, 실시예 2-2는 H5형 고병원성 시료의 경우(레인 1, 2) 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍에 의한 HA 유전자의 PCR 증폭 산물 생성과 함께, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍에 의해 병원성 판별 유전자 영역으로 제한된 추가의 PCR 증폭 산물을 생성하여 조류인플루엔자 유전자 시료의 고병원성 여부를 검사하는데 유용하다고 할 수 있다.
실시예 3: 조류인플루엔자 바이러스 주요 혈청형 및 병원성 판별을 위한 프로브의 제작
본 실시예에서는 HA 유전자 아형(H5형, H7형, H9형) 각각에 대해 특이적인 프로브들을 합성하였고, 추가로 고병원성과 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 판별을 위한 새로운 고감도 프로브들도 합성하였다. 혼성화 반응을 위한 프로브들의 서열정보는 하기 표 3에 나타낸 것과 같다. 하기 표 3에는 조류인플루엔자 바이러스 혈청형(H5형, H7형, H9형) 및 병원성 판별을 위한 프로브 염기서열(단, 포지티브 콘트롤 프로브 제외)이 제시되어 있다. 혼성화 반응 시 슬라이드 글라스 위에 집적되어 있는 프로브 간의 공간적인 방해를 최소화시키도록 10 내지 20 개의 올리고(dT)를 부가하여 본 발명의 실시예에서 사용하는 프로브들을 완성하였다.
Figure PCTKR2015010460-appb-T000001
후술하는 혼성화 반응 실시예에 기술된 바와 같이, 실시예 2에서 준비된 각 혈청별 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료 각각에 대해 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 함께 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍(병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 쌍)을 이용한 PCR 증폭을 수행하여 얻은 PCR 증폭산물과 상기 표 3의 프로브들의 혼성화 여부에 따라, 검사 대상 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형을 결정하는 HA 유전자의 아형인 H5형, H7형, H9형을 판별하고 동시에 고병원성인지 또는 저병원성인 여부를 추가 프로브 (HPAI 프로브 및 LPAI 프로브)를 이용하여 높은 민감도로 정확하게 확인할 수 있다.
예를 들어, 검사 대상 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 증폭산물이 서열번호 9 내지 서열번호 20의 프로브들(H5 프로브들) 중 적어도 하나와 혼성화되는 동시에, 서열번호 36 내지 서열번호 56의 프로브들(HPAI 프로브들) 중 적어도 하나와 혼성화되고, 추가로 서열번호 57, 서열번호 66 내지 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 77 및 서열번호 78의 프로브들(추가의 HPAI 프로브들)중 적어도 하나와도 혼성화되면 검사 대상 조류인플루엔자 바이러스는 고병원성인 H5형으로 확실하게 판정할 수 있게 된다.
반면에, 검사 대상 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 증폭산물이 서열번호 9 내지 서열번호 20의 프로브들(H5 프로브들) 중 적어도 하나와 혼성화되는 동시에, 서열번호 80 내지 서열번호 87의 프로브들(LPAI 프로브들) 중 적어도 하나와 혼성화되는 경우에는 검사 대상 조류인플루엔자 바이러스는 저병원성인 H5형으로 확실하게 판정할 수 있게 된다.
또한, 검사 대상 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 증폭산물이 서열번호 21 내지 서열번호 27의 프로브들(H7 프로브들) 중 적어도 하나와 혼성화되는 동시에, 서열번호 36 내지 서열번호 56의 프로브들(HPAI 프로브들) 중 적어도 하나와 혼성화되고, 추가로 서열번호 57, 서열번호 66 내지 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 77 및 서열번호 78의 프로브들(추가의 HPAI 프로브들)중 적어도 하나와도 혼성화되면 검사 대상 조류인플루엔자 바이러스는 고병원성인 H7형으로 확실하게 판정할 수 있게 된다.
반면에, 검사 대상 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 증폭산물이 서열번호 28 내지 서열번호 35의 염기서열을 포함하는 프로브들(H9 프로브들) 중 적어도 하나와 혼성화되는 동시에, 서열번호 80 내지 서열번호 87의 프로브들(LPAI 프로브들) 중 적어도 하나와 혼성화되면 검사 대상 조류인플루엔자 바이러스는 저병원성인 H9형으로 판정할 수 있게 된다.
따라서, 이러한 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브, 전술한 바와 같은 실시예 1에서 설계된 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 이용한 본 발명의 조류인플루엔자 바이러스 검사 키트 및 검사 방법은 HA 유전자의 아형 판별과 병원성 여부의 검사가 동시에 가능하면서도, 가금류에 치명적이고 인체에도 치명적일 수 있는 조류 인플루엔자 바이러스가 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 민감도 높게 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 장점을 제공하게 된다.
한편, 전술한 바와 같은 실시예 1에서 제작된 종래의 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍인 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭된 AIV 포지티브 콘트롤 증폭산물에 상보적으로 결합하는 종래의 AIV 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 88의 포지티브 콘트롤 프로브)와, 본 발명의 새로운 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍인 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭된 AIV 포지티브 콘트롤 증폭산물에 상보적으로 결합하는 새로운 AIV 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 89의 포지티브 콘트롤 프로브)를 제작하였다. 이들은 조류인플루엔자 바이러스의 유전자 증폭이 정상적으로 이루어졌는지 여부를 확인하고 혼성화된 다른 프로브들의 신호가 위양성 신호인지 여부를 확인하기 위해 사용되는데, 본 발명의 새로운 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍(서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍)과 새로운 AIV 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 89의 포지티브 콘트롤 프로브)는 종래의 것 보다 증폭 특이도 및 검출 민감도가 월등히 우수하도록 설계되었다.
AIV 포지티브 콘트롤 검출용 프로브
종래의 AIV 포지티브 콘트롤 프로브 (대한민국 공개특허공보 제10-2013-0116609호의 포지티브 콘트롤 프로브)
AI P.C probe-1: 5'-CAGGCCCCCTCAAAGCCGA-3' (서열번호 88)
본 발명의 새로운 AIV 포지티브 콘트롤 프로브
AI P.C probe-2: 5'-RATWGGTCTTGTCTTWARCCAYTCC-3' (서열번호 89)
실시예 4: 마이크로어레이 칩의 제작
실시예 4-1: 도 2에 도시된 레이아웃을 갖는 마이크로어레이 칩의 제작
마이크로어레이된 유전자 칩의 제작은 당업자에게 널리 알려진 방법을 사용하여 수행된다.
먼저, 알데히드 작용기가 처리되어 있는 글라스 위에 실시예 3(표 3)의 각각의 프로브 염기서열(서열번호 9 내지 서열번호 87)을 가지는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 아미노 링크를 수식한 다음, 혼성화 반응 시 슬라이드 글라스 위에 집적되어 있는 프로브 간의 공간적인 방해를 최소화시키도록 10 내지 20 개의 올리고(dT)를 부가하여 본 발명의 실시예에서 사용하는 프로브들을 완성하였다. 본 발명의 프로브들은 한국 바이오니아사(대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다.
그리고, 상기 제작된 올리고뉴클레오티드 프로브들이 고정된 마이크로어레이 칩을 제작하기 위하여, CSS-100 시릴화된 슬라이드[Silylated Slide, 셀 어소시에이트사(Cel Associate), 미국] 상에 50μM의 농도로 아미노 링크가 수식되어 있는 프로브와 동일한 양의 3X SSC 용액을 혼합하여 집적하였고, 이를 16시간 이상 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 다음 슬라이드를 0.1% SDS로 5분 동안 1회 세척하였고, 증류수로 5분 동안 2회 세척하였다. 상기 제작된 칩을 소디움 보로하이드리드 (0.625g NaBH4, 168.75ml ddH2O, 18.75ml PBS, 100% EtOH 62.5ml)와 5분 동안 반응시킨 다음, 증류수로 5분 동안 2회 세척하였고 800rpm으로 5분 동안 원심분리하였다.
제작된 마이크로어레이 칩은 4개의 서브-어레이로 구분하고, 혼성화 실험에 있어서 준비된 마이크로어레이 칩이 독립적으로 반응을 진행할 수 있도록 CoverWell 관류 체임버(perfusion chamber)(Grace-Bio Labs, 미국)로 커버하였다. 상기 표 3의 HA 유전자 관련 프로브들 및 병원성 관련 프로브들(서열번호 9 내지 서열번호 87)이 집적되어 최종적으로 제작된 마이크로어레이 칩의 구성(레이아웃)은 도 2에 도시된 바와 같다. 도 2에서는 마이크로어레이 칩 레이 아웃에 할당된 각 인덱스 번호가 표시되어 있고, 이러한 각 인덱스 번호에 대응하는 각 프로브 명칭(probe name)이 기재되어 있다(각 프로브 명칭에 대응하는 서열번호는 표 3 참조). 도 2의 마이크로어레이 칩의 구성에서 인덱스 1과 84에 해당되는 프로브는 위치 마커로서 HA 유전자에 대해 비상동성 서열로 구성된다.
한편, 선택적으로 도 2의 레이 아웃에서 인덱스 52-59, 65, 67, 69, 70 및 73에 해당하는 프로브들(서열번호 58-65, 71, 73, 75, 76 및 79의 프로브들)을 스폿팅하지 않고 생략가능하며, 상기 프로브들이 스폿팅되는 칩의 레이 아웃 상의 위치를 비워둔 채로 마이크로어레이 칩을 구성할 수도 있다.
실시예 4-2: 도 6에 도시된 레이아웃을 갖는 마이크로어레이 칩의 제작
상기 실시예 4-1과 거의 유사한 방식으로 마이크로어레이 칩을 제작하되, 실시예 3의 표 3의 프로브들 중 서열번호 9 내지 서열번호 21, 서열번호 23 내지 서열번호 25, 서열번호 27 내지 서열번호 28, 서열번호 31 내지 서열번호 34, 서열번호 37, 서열번호 39 내지 서열번호 50, 서열번호 53 내지 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 66 내지 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 77 내지 서열번호 78, 서열번호 80 내지 서열번호 81 및 서열번호 85의 프로브들을 사용하여 마이크로어레이 칩을 구성하였다. 또한, 본 실시예에서는 본 발명의 새로운 AIV 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 89)를 추가로 집적하여 마이크로어레이 칩을 구성하였고, 또한 대조군으로서 종래의 AIV 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 88)를 추가로 집적하여 마이크로어레이 칩을 구성하였다.
최종적으로 제작된 마이크로어레이 칩의 구성(레이아웃)은 도 6에 도시된 바와 같다. 도 6에서는 마이크로어레이 칩 레이 아웃에 할당된 각 인덱스 번호가 표시되어 있고, 이러한 각 인덱스 번호에 대응하는 각 프로브 명칭(probe name)이 기재되어 있다(각 프로브 명칭에 대응하는 서열번호는 표 3 참조). 도 6의 레이 아웃에서 인덱스 1과 60에 해당되는 프로브는 위치 마커로서 HA 유전자에 대해 비상동성 서열로 구성된다. 도 6의 마이크로어레이 칩 레이 아웃에 있어서 인덱스 59의 위치에 새로운 AIV 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 89)를 스폿팅한 마이크로어레이 칩과, 인덱스 59의 위치에 종래의 AIV 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 88)를 스폿팅한 대조군 마이크로어레이 칩을 각각 별개로 준비하였다.
실시예 5: 혼성화 반응
실시예 5-1: 도 2의 유전자 칩에 대한 혼성화 반응 결과
실시예 1 및 실시예 2에 따라 증폭되고 표지물질(예를 들어, cy3)이 결합된 PCR 증폭산물을 혼성화 용액(3X SSC, 0.3% Sarcosyl)과 1:9의 비율로 혼합하였다. 조류 인플루엔자 바이러스 유전자 시료 각각(H5형 고병원성 시료, H5형 저병원성 시료, H7형 시료, H9형 유전자 시료)에 대해 HA 유전자 증폭용 프라이머(서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍)만을 이용하여 증폭한 증폭산물을 혼성화 용액에 혼합한 혼성화 반응 용액을 대조군으로서 준비하였다. 또한, 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료 각각(H5형 고병원성 시료, H5형 저병원성 시료, H7형 시료, H9형 유전자 시료)에 대해 HA 유전자 증폭용 프라이머 쌍(서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍)과 병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 쌍(서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍)을 이용하여 증폭한 증폭산물을 혼성화 용액에 혼합한 혼성화 반응 용액을 본 발명의 시험군으로서 별도로 준비하였다. 각각의 유전자 시료에 대한 대조군 및 시험군 각각의 혼성화 반응 용액을 도 2의 마이크로어레이 칩에 반응시켰다.
즉, 실시예 4-1에서 제작한 도 2의 마이크로어레이 칩에 상기와 같이 별도로 준비된 혼성화 반응 용액을 각각 로딩하여 반응시켰다. 그런 다음, 1X SSC, 0.1% SDS 용액에서 5분 동안 1차 세척하였고 다시 1X SSC 용액에서 5분 동안 세척하였다. 이후 추가로 0.1X SSC 용액에서 5분 동안 세척하였다. 세척된 슬라이드를 건조시킨 후 이미지를 스캔닝하였다.
도 2의 마이크로어레이 칩에 대한 혼성화 결과를 확인하기 위해, 예를 들어, Genepix 4000B (미국 액손 인스트루먼트사 (Axon Instrument))를 이용하여 마이크로어레이 칩의 혼성화 신호(형광 신호)를 스캔하여 형광 이미지를 저장하였고, 각각의 프로브의 양성 및 음성 신호를 형광값으로 판단하였다. 형광 강도 데이터는 GenePix Pro 4.1 소프트웨어(Axon instrument, USA)를 사용하여 분석되었고, 배경값은 각 스팟의 평균값에서 감산되었다. 모든 프로브들은 이중으로 스폿팅되어 타겟 프로브들의 신호 강도들은 2개의 스폿의 평균값으로부터 계산되었다.
도 3에 도시된 바와 같이, HA 아형이 H5형이고 고병원성인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료에 대해 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭을 수행하여 얻은 증폭산물의 혼성화 반응 용액(대조군 혼성화 반응 용액)을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 경우에는 위치 마커를 제외하고는 H5형 검출용 프로브와 고병원성 검출용 프로브에 대한 신호가 관찰되지 않았다(도 3의 (a) 참조). 반면에, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 함께 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭을 수행하여 얻은 증폭산물의 혼성화 반응 용액(본 발명의 시험군 혼성화 반응 용액)을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 경우에는 H5형 검출용 프로브의 형광 신호와, 고병원성 검출용 프로브에 대한 형광 신호가 명확하게 관찰되었다(도 3의 (b) 참조).
즉, 도 3의 (b)에 도시된 바와 같이, 본 발명의 시험군 혼성화 반응 용액을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 경우에는 인덱스 번호 4-7, 10-13 위치 (H5형을 판별하는 서열번호 10 내지 13 및 서열번호 16 내지 19의 프로브들이 스폿팅된 위치)에서 형광 신호가 뚜렷하게 관찰되어 H5형 아형임을 검출할 수 있었고, 인덱스 번호 36-39 위치 (고병원성을 판별하는 서열번호 42 내지 서열번호 45의 프로브들이 스폿팅된 위치)에서 형광 신호가 뚜렷하게 관찰됨과 동시에 인덱스 번호 41, 42, 47, 51, 60-62, 64, 66, 68, 71 및 72 위치(고병원성을 판별하는 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 66 내지 서열번호 68, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 77 및 서열번호 78의 추가 프로브들이 스폿팅된 위치)에서도 추가적으로 형광 신호가 뚜렷하게 관찰되어 고병원성임을 종래 보다 민감도가 매우 높게 검출할 수 있었다.
또한, 도 4에 도시된 바와 같이, HA 아형이 H5형 또는 H5N2형이고 저병원성인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료에 대해 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭을 수행하여 얻은 증폭산물의 혼성화 반응 용액(대조군 혼성화 반응 용액)을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 경우에는 위치 마커를 제외하고는 H5형 검출용 프로브와 저병원성 검출용 프로브에 대한 신호가 관찰되지 않았다(도 4의 (a) 참조). 반면에, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 함께 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭을 수행하여 얻은 증폭산물의 혼성화 반응 용액(본 발명의 시험군 혼성화 반응 용액)을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 경우에는 H5형 검출용 프로브의 형광 신호와, 저병원성 검출용 프로브에 대한 형광 신호가 명확하게 관찰되었다(도 4의 (b) 참조).
즉, 도 4의 (b)에 도시된 바와 같이, 본 발명의 시험군 혼성화 반응 용액을 도 2의 마이크로어레이 유전자 칩에 혼성화시킨 경우에는 인덱스 번호 4 위치 (H5형을 판별하는 서열번호 10의 프로브가 스폿팅된 위치)에서 공통적으로 형광 신호가 뚜렷하게 관찰되어 H5형 아형임을 검출할 수 있었고, 인덱스 번호 74, 75 및 79 위치 (저병원성을 판별하는 서열번호 80, 서열번호 81 및 서열번호 85의 프로브들이 스폿팅된 위치)에서 형광 신호가 뚜렷하게 관찰되어 저병원성임을 종래 보다 민감도가 매우 높게 검출할 수 있었다.
한편, 혈청형만 확인된 H9N2형 및 H7N1형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료 각각에 대해서는, 대조군 혼성화 반응 용액을 도 2의 유전자 칩에 혼성화시킨 경우와, 본 발명의 시험군 혼성화 반응 용액을 도 2의 유전자 칩에 혼성화시킨 경우 모두에 있어서 해당 HA 아형, 즉 H9형 아형과 H7형 아형을 판별하는 프로브 형광 신호만이 확인되었다.
따라서, 본 발명에 따른 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트 및 이를 이용한 검사방법을 이용하면 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형과 병원성 여부의 검사를 동시에 수행할 수 있으면서도 고병원성인지 또는 저병원성인지 여부를 종래 보다 민감도 높게 신속하면서도 정확하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
실시예 5-2: 도 6의 유전자 칩에 대한 혼성화 반응 결과
우선, H5형이고 고병원성인 조류 인플루엔자 바이러스 유전자 시료에 대해서는 실시예 1 및 실시예 2에 따라 HA 유전자 증폭용 프라이머 쌍(서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍)과 병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 쌍(서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍)을 이용하여 증폭한 제1 증폭산물을 별도로 준비하였다.
그리고, H5형이고 고병원성인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료, 네가티브 콘트롤(주형이 없는 것) 및 M 유전자 시료 각각에 대해 종래의 포지티브 콘트롤 유전자(즉 M 유전자) 증폭용 프라이머 쌍인 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여, 아래의 표 4와 같은 PCR 증폭 반응 조성 및 표 5와 같은 PCR 증폭 반응 조건 하에서 당업계에 알려진 방법(실시예 2 참조)에 따라 PCR 증폭을 수행하여 제2 증폭 산물을 각각 준비하였다. 이들 중 H5형이고 고병원성인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 제2 증폭산물은 앞서 준비한 제1 증폭산물과 혼합하였다.
다음으로, H5형이고 고병원성인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료, 네가티브 콘트롤(주형이 없는 것) 및 M 유전자 시료 각각에 대해 새로운 포지티브 콘트롤 유전자(즉 M 유전자) 증폭용 프라이머 쌍인 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 이용하여, 아래의 표 4와 같은 PCR 증폭 반응 조성 및 표 5와 같은 PCR 증폭 반응 조건 하에서 당업계에 알려진 방법(실시예 2 참조)에 따라 PCR 증폭을 수행하여 제3 증폭산물을 각각 준비하였다. 이들 중 H5형이고 고병원성인 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 제3 증폭산물은 앞서 준비한 제1 증폭산물과 혼합하였다.
PCR 증폭 반응 조성
주형 (유전자 시료) 1㎕
2×PCR 프리믹스 (2× premix) 10㎕
포지티브 콘트롤 증폭용 정방향 프라이머(10pmole/㎕) 0.5㎕
포지티브 콘트롤 증폭용 역방향 프라이머(10pmole/㎕) 0.5㎕
증류수 8㎕
합계 20㎕
PCR 증폭 반응 조건
온도 시간 사이클
95℃ 5분 1사이클
95℃ 1분 40 사이클
57℃ 1분
72℃ 1분 30초
72℃ 10분 1사이클
8℃ 중지
이후, 제2 증폭산물에 대한 혼성화 반응 용액의 준비, 제1 증폭산물과 제2 증폭산물과의 혼합물에 대한 혼성화 반응 용액의 준비, 이러한 혼성화 반응 용액들을 도 6의 레이 아웃을 갖는 대조군 마이크로 어레이 칩(종래의 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 88의 프로브)를 스폿팅한 대조군 마이크로어레이 칩)에 대해 반응시키는 혼성화 반응, 및 형광 신호 분석 과정 등은 실시예 5-1과 동일한 방식으로 수행하였다. 그 결과가 도 7의 (a)의 형광이미지 사진에 도시되어 있다. 도 7의 (a)에 도시된 바와 같이, 주형이 없는 네가티브 콘트롤(NTC)의 경우 포지티브 콘트롤 프로브에서 위양성의 형광 신호가 발생하는 것을 알 수 있다. 즉, 네가티브 콘트롤(NTC)에는 어떠한 주형도 포함되어 있지 않기 때문에 위치 마커 이외에는 어떠한 신호도 발생시키지 않아야 하지만, M 유전가가 존재하는 것으로 위양성의 오류 신호를 나타내었다.
또한, 제3 증폭산물에 대한 혼성화 반응 용액의 준비, 제1 증폭산물과 제3 증폭산물과의 혼합물에 대한 혼성화 반응 용액의 준비, 이러한 혼성화 반응 용액들을 도 6의 레이 아웃을 갖는 시험군 마이크로 어레이 칩(새로운 포지티브 콘트롤 프로브(서열번호 89의 프로브)를 스폿팅한 대조군 마이크로어레이 칩)에 대해 반응시키는 혼성화 반응, 및 형광 신호 분석 과정 등은 실시예 5-1과 동일한 방식으로 수행하였다. 그 결과가 도 7의 (b)의 형광이미지 사진에 도시되어 있다. 도 7의 (b)에 도시된 바와 같이, 주형이 없는 네가티브 콘트롤(NTC)의 경우 포지티브 콘트롤 프로브에서 어떠한 위양성의 형광 신호도 나타나지 않아 도 7의 (a)와는 달리 위양성의 오류 신호를 나타내지 않은 것을 알 수 있으며, 이로부터 서열번호 7 및 8의 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍의 증폭 특이도가 종래 보다 높고, 서열번호 89의 프로브의 검출 특이도 및 민감도 역시 우수하다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 서열번호 7 및 8의 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍과 서열번호 89의 포지티브 콘트롤 프로브를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트와 이를 이용한 검사방법은 각각의 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료의 유전자 증폭이 정상적으로 이루어졌는지 여부를 확인할 수 있고, 혼성화된 다른 프로브들의 신호가 위양성 신호인지 여부를 확인할 수 있는 장점이 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (15)

  1. 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 프로브로서 서열번호 9 내지 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 프로브로서 서열번호 21 내지 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 프로브로서 서열번호 28 내지 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
    조류인플루엔자 바이러스의 고병원성을 판별하는 프로브로서 서열번호 36 내지 서열번호 56의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브, 및 추가로 서열번호 57, 서열번호 66 내지 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 77 및 서열번호 78의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
    조류인플루엔자 바이러스의 저병원성을 판별하는 프로브로서 서열번호 80 내지 서열번호 87의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 프로브 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 포지티브 콘트롤 유전자에 혼성화되는 포지티브 콘트롤 프로브로서, 서열번호 89의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 프로브 조성물.
  3. 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H5형을 판별하는 프로브로서 서열번호 9 내지 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H7형을 판별하는 프로브로서 서열번호 21 내지 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 아형 중 조류인플루엔자 바이러스의 H9형을 판별하는 프로브로서 서열번호 28 내지 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
    조류인플루엔자 바이러스의 고병원성을 판별하는 프로브로서 서열번호 36 내지 서열번호 56의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브, 및 추가로 서열번호 57, 서열번호 66 내지 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 77 및 서열번호 78의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
    조류인플루엔자 바이러스의 저병원성을 판별하는 프로브로서 서열번호 80 내지 서열번호 87의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 유전자 칩.
  4. 제3항에 있어서,
    조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 포지티브 콘트롤 유전자에 혼성화되는 포지티브 콘트롤 프로브로서, 서열번호 89의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 유전자 칩.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 프로브들은 동일 기판 상에 마이크로어레이되는 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 유전자 칩.
  6. HA 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 검사를 위한 PCR 증폭키트.
  7. 제6항에 있어서,
    조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 포지티브 콘트롤 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 포지티브 콘트롤 증폭용 프라이머 쌍으로서, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 추가로 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 검사를 위한 PCR 증폭키트.
  8. (a1) 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 이용하여 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료를 증폭하는 단계와,
    (b) 상기 증폭 산물을 청구항 제3항의 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 유전자 칩에 혼성화시키는 단계와,
    (c) 상기 혼성화 여부에 따라 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성을 판별하는 단계를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 검사방법.
  9. 제8항에 있어서,
    서열번호 9 내지 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 증폭 산물과 혼성화될 때 H5형으로 판별하고, 서열번호 21 내지 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 증폭 산물과 혼성화될 때 H7형으로 판별하며, 서열번호 28 내지 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 증폭 산물과 혼성화될 때 H9형으로 판별하는 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 검사방법.
  10. 제8항에 있어서,
    서열번호 36 내지 서열번호 56의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브, 및 추가로 서열번호 57, 서열번호 66 내지 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 77 및 서열번호 78의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 증폭 산물과 혼성화될 때 고병원성으로 판별하고, 서열번호 80 내지 서열번호 87의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 증폭 산물과 혼성화될 때 저병원성으로 판별하는 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 검사방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 유전자 칩에는 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 포지티브 콘트롤 유전자에 혼성화되는 포지티브 콘트롤 프로브로서, 서열번호 89의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 추가로 스폿팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 검사방법.
  12. 제11항에 있어서,
    (a2) 상기 포지티브 콘트롤 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 이용하여 조류인플루엔자 바이러스 유전자 시료 내의 포지티브 콘트롤 유전자를 증폭하는 단계를 더 포함하고, 상기 포지티브 콘트롤 유전자의 증폭 산물을 상기 (a1) 단계의 증폭 산물과 함께 상기 유전자 칩에 혼성화시키는 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 검사방법.
  13. 청구항 제3항의 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형 및 병원성 판별을 위한 유전자 칩과,
    조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과,
    병원성 판별 유전자 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍과,
    상기 유전자 칩과 혼성화되는 증폭된 유전자 산물을 검출하기 위한 표지수단을 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 유전자 칩에는 조류인플루엔자 바이러스에 공통적으로 포함되는 포지티브 콘트롤 유전자에 혼성화되는 포지티브 콘트롤 프로브로서 서열번호 89의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 추가로 스폿팅되는 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 포지티브 콘트롤 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 추가로 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 검사용 키트.
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