CN103388023A - 实时聚合酶链反应的集成分析系统和dna芯片以及使用其的集成分析方法 - Google Patents

实时聚合酶链反应的集成分析系统和dna芯片以及使用其的集成分析方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供实时聚合酶链反应的集成分析系统和DNA芯片以及使用其的集成分析方法，更具体地涉及实时聚合酶链反应的集成分析仪器和DNA芯片以及使用其的集成分析方法。根据本发明的生物材料的集成分析方法，可在单反应器中进行基因扩增并随后进行杂交，从而防止在转移样品以进行反应时由于外部因素导致的样品污染，并可自动化进行一系列程序，如样品的加注、生物材料的反应及结果的检测和分析。

Description

实时聚合酶链反应的集成分析系统和DNA芯片以及使用其的集成分析方法
相关申请的交叉引用 
本申请要求根据35U.S.C.§119于2012年5月11日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2012-0050500的优先权，其公开内容通过全文引用的方式并入于此。 
技术领域
以下公开内容涉及实时聚合酶链反应的集成分析系统和DNA芯片以及使用其的集成分析方法，更具体地涉及实时聚合酶链反应的集成分析仪器和DNA芯片以及使用其的集成分析方法。 
背景技术
目前在分子诊断领域广泛采用的分析物靶基因的分析方法大体上可分为两种，测量靶基因的表达程度及其拷贝数的相对或绝对定量方法，以及分析靶基因的存在与否及其基因型的定性方法。 
在分析物靶基因的分析方法中，实时聚合酶链反应（PCR）是代表性的定量方法，其用于测量靶基因的表达程度及其拷贝数。 
实时PCR方法采用其中PCR仪（热循环仪）和分光光度计互相协作的仪器，通过在扩增过程中实时监控产生靶基因扩增产物的过程，分析早期供给或存在的DNA或RNA的量，没有PCR程序后用于确认PCR产物的单独电泳程序。更具体地，当荧光材料应用于PCR方法时，实时聚合酶链反应（PCR）可实时检测和定量分析反应期间与样品中存在的靶基因扩增成比例增加的荧光材料的发射程度，从而迅速并准确地分析靶基因的表达类型及其拷贝数。对于在实时聚合酶链反应中获得荧光信号的方法，有大量的非特异性检测方法 和特异性检测方法。对于非特异性检测方法，使用被插入到DNA双链中时发射荧光材料信号的荧光体（如SYBR GreenΙ、BEBO、BOXTO、EvaGreen等），并测量基因扩增期间形成的双链的全部荧光信号。对于特异性检测方法，荧光体被插入到具有可与靶基因互补结合的特定序列的短寡核苷酸链中，从而形成探针（如TaqMan探针、分子信标(Molecular Beacon)、光探针(Light-Up probe)、杂交探针等），当短寡核苷酸探针与靶基因一起扩增时，测量由短寡核苷酸探针产生的与基因扩增成比例的荧光信号。 
在特异性检测方法的使用TaqMan探针的实时聚合酶链反应中，当使用两种引物时其原理与一般PCR是相同的，但需要使用化学结合荧光材料的寡核苷酸探针。对于TaqMan探针、FAM等作为报告荧光材料(reporter fluorescent material)被附着到其5'端，TAMRA等作为抵消报告荧光材料的荧光的淬灭材料被附着到其3'端。当将TaqMan探针添加到PCR反应溶液时，在PCR过程中由于用模板DNA退火，TaqMan探针被退火到模板DNA，但由于报告材料和淬灭材料的抵消作用未检测到荧光。由于PCR过程中通过Taq DNA聚合酶在延长时激活了Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶，当与模板DNA杂交的TaqMan探针被分解时，FAM等荧光材料被分离出来，从而消除了猝灭材料产生的抵消，结果发出荧光。因此，可通过分析检出的荧光的量可测定产生的扩增产物的量。 
同时，在非特异性检测方法的使用SYBR Green I的实时聚合酶链反应（PCR）中，监测全部的荧光。这种方法应用的原理是荧光材料被插入到双链DNA链中。荧光材料SYBR Green I在PCR反应时添加，从而检测与PCR产物扩增成比例的荧光发光量，因此可测定扩增产物的生成量并测定扩增的DNA的熔点。 
此外，在分析靶基因的方法中，对于分析靶基因存在与否及其基因型的定性方法，最近有一种DNA微阵列（DNA芯片）方法，其 通过分子生物技术和电子工程技术相结合，可在一张载玻片上同时检测数十至数千种基因。 
更具体地，作为使用微阵列固定芯片(microarray-fixed chip)的方法，其使用能够检测到靶基因的寡核苷酸、PAN或cDNA作为探针，有一种微阵列芯片。按照这种方法，PCR反应后的扩增产物与靶微阵列芯片杂交，从而结合到固定在芯片固体表面（玻璃、塑料、膜、硅等）的几种探针（寡核苷酸、PAN或cDNA）上，然后可由标记在扩增产物上的荧光材料信号确定该结合的存在与否，因此，这种方法可用于分析各类基因型。然而，其检测程序复杂，有时需要大量的时间，且结果不能通过肉眼直观证实，而需要单独的荧光分析仪。 
最近，在上述分子诊断领域中在传染性机体疾病的情况下，应用了各种理念的诊断和治疗，同时且复杂地对分析物的靶基因进行分析的方法需要通过实时聚合酶链反应以确认感染程度的拷贝数定量信息，以及利用微阵列芯片通过确认传染性机体的类型以用于适当治疗剂处方的基因型定性信息。根据这一目的，实时聚合酶链反应和微阵列芯片分析方法以互相结合的方式独立使用。 
然而，根据上述分析方法的结合，分析方法的实验需按顺序在不同的反应器中进行和分析，因此，仍然需要大量的劳力和时间且仍有不便。此外，很难在单一的设备中自动化地进行这些分析方法。即使制造出自动化实施这些分析方法的简单组合的仪器，需要大空间安装该仪器且这种仪器非常昂贵，因此，不容易在医院常规使用该仪器进行分子诊断。因此，人们亟需开发解决这些问题的技术。 
相关技术文件 
专利文件 
（专利文件1）KR10-1068939B1（2011年9月23日） 
发明概述 
因此，关于分析物的靶基因的分析方法，本发明发现了生物材料的集成分析方法，通过在单反应器中以一站式的方式实施定量方法和定性方法并完成本发明，其能够方便地被任何人使用，且准确、高效地检测靶基因。 
本发明的一个实施方案涉及提供生物材料的集成分析方法，其能同时进行采用聚合酶链反应或实时聚合酶链反应的定量分析或定性分析以及采用DNA芯片对多个基因的定性分析。 
更具体地，本发明的一个实施方案涉及提供生物材料的集成分析仪器和使用其的集成分析方法，其能够在单反应器中同时且集成地进行采用聚合酶链反应或实时聚合酶链反应的定量分析或定性分析以及采用DNA芯片的定性分析。 
为了实现上述目的，本发明提供生物材料的集成分析方法，以及使用其的集成分析仪器，能够同时进行采用聚合酶链反应或实时聚合酶链反应的定量分析或定性分析以及采用DNA芯片的定性分析。 
本发明的生物材料的集成分析方法，其特征在于，在单反应器中同时进行采用聚合酶链反应或实时聚合酶链反应的定量分析或定性分析以及采用DNA芯片的定性分析。 
对于集成分析，可使用单反应器，其中生物芯片形成于反应器内的底面或侧面上，或形成于从反应器耦合器下部延伸的杆上。 
在本发明中，反应器包括反应器容器和与反应器容器的上部耦合的盖，且所述盖可包括本发明的反应器耦合器。 
下文将详细描述本发明。 
本发明提供生物材料的集成分析方法，其特征在于，在单反应器中同时进行采用聚合酶链反应或实时聚合酶链反应扩增的反应产物的定量或定性分析以及通过其上固定有靶基因探针的生物芯片得 到的反应产物的定性分析，其中在单反应器中，所述生物芯片形成于单反应器内的底面或侧面上，或形成于从单反应器的反应器耦合器下部延伸的杆上。参考图1和2。 
在本发明中，靶基因探针可包括选自肽、蛋白质、核酸、肽核酸（PNA）、适配子和抗体中的至少一种材料。 
本发明的探针可通过标记含有插入荧光、磷光或放射性物质的DNA的靶基因的任意核苷酸序列的至少一个位点获得。 
探针的荧光材料可为选自下组的至少一种：芘（Pyrene）、花青素2（Cyanine2）、GFP、钙黄绿素、FITC、Alexa488、FAM、荧光素氯三嗪基染料（Fluorescein Chlorotriazinyl）、荧光素、罗丹明110、俄勒冈绿、绿镁、钙绿、JOE、花青素3、四甲基罗丹明、TRITC、TAMRA、罗丹明鬼笔环肽、派洛宁Y、丽丝胺（Lissamine）、ROX、钙深红、得克萨斯红、尼罗红、花青素5和硫杂二羰花青（Thiadicarbocyanine）。 
在本发明中，可使用下组中的至少一种作为单反应器：具有多个孔的板、试验管、管和包括从反应器耦合器下部延伸的杆的生物材料检测装置。能进行PCR的任何反应器均可使用，没有限制。 
在本发明中，单反应器的特点是具有多个孔的板，或包括从反应器耦合器下部延伸的杆的生物材料检测装置。 
本发明的具有多个孔的板的特点是具有带有两个或多个阶的孔结构，所述具有多个孔的板可以分开，以便得到所需数量的孔。 
在本发明中，具有多个孔的板包括凹入地形成于该板一个面上的多个孔。所述孔包括上孔210和上孔210下面的下孔220，下孔220的直径小于上孔210。生物芯片形成于下孔220的底部。参考图3。 
更具体地，如图3所示，上孔210和下孔220可以在具有多个孔的板1000中以各种直径和深度形成。在本发明中，所述孔以微单元形成，这样用于生物材料反应的样品和样品上用于保护样品的油可含 于其中。 
具有多个孔的板1000可通过下面的方法制造。 
也就是，对于形成上孔210和下孔220的方法，第一，将抗蚀剂(resist)等的掩模图案形成于板100的上表面上，这样对应于上孔210直径的部分被清空，然后进行蚀刻，从而形成具有特定深度的上孔210。此外，上孔210形成后，将圆环圈型的掩模图案再形成于上孔210的底面上，这样对应于下孔220直径的部分被清空，然后再进行蚀刻，从而形成具有特定深度的下孔220。此外，上述的掩模图案可被移除和清洗，从而形成具有所需形状的孔结构（具有两个阶(step)）。 
作为另一种方法，孔200可通过物理处理形成，可根据板100的材料，通过使用各种方法，如切割处理、激光处理、放电处理等，如上所述形成具有两个阶的孔200。 
如上构建的本发明具有多个孔的板1000可用于基因扩增反应等，对于其应用，如图3的(B)所示，将待测样品400注入到下孔220，将用于保护样品400的油500注入到下孔220上面的上孔210。因此，注入到上孔210中的油500覆盖了下孔220中含有的样品400。在这里，在形成的所述孔具有一个阶(step)的情况下，样品按预定高度被注入到其中，然后在其上注入油，使样品的上表面被油层覆盖。然而，油和样品可能偏向一侧，或可能互相混合。即使它们在注入时不互相混合，在加热以使样品反应时可能会导致油和样品偏向一侧或互相混合，从而劣化生物材料反应的可靠性。 
因此，根据本发明的具有多个孔的板1000，所形成的孔具有两个阶(step)，这样使油覆盖样品，但由于其物理结构样品和油不互相混合，因此可以防止由于加热样品所致的样品蒸发。此外，由于所形成的孔具有两个阶，样品的注入量和油的注入量可均匀控制。此外，样品被油覆盖，从而防止外部杂质浸润到样品，因此可以改善 分析的可靠性。 
在本发明中，生物材料检测装置包括反应器和从反应器耦合器下部延伸的杆。生物芯片形成于杆的下侧(lower side)，且所述杆从反应器耦合器上可拆卸。参考图4。 
更具体地，如图4所示，在生物材料检测装置2000中，头部2100可以形成平板型、块形等。当用户通过手进行手动转移生物材料检测装置时，或该装置与含有样品的反应容器2700耦合或解耦时，头部可以接受应用于其上的力，或可与可移动的自动化装置结合。 
反应器耦合器2200从头部2100向下伸出，且反应器2700可从外部插入至反应器耦合器2200并与之耦合。此时，沿着反应器耦合器2200的外周方向在其外周表面形成凹槽，弹性密封件如O形环与该凹槽结合，以便当反应器插入至反应器耦合器2200中时管的内部可被密封。 
杆2300可从反应器耦合器2200向下延伸，且可沿着其更低的方向伸长形成棒状。此时，杆2300优选其直径小于反应器耦合器2200。由于杆300与样品如生物材料溶液接触，杆300优选由与样品不发生反应的玻璃制成。 
此外，杆2300可从反应器耦合器2200上拆卸下来。也即，反应器耦合器2200下部形成有孔洞，杆2300插入至该孔洞内并与反应器耦合器2200耦合。因此，必要时杆2300可更换。 
此外，生物芯片2400形成于杆2300下侧。生物芯片2400被浸入至样品中从而与样品反应，因此可检测目标材料。 
生物材料检测装置2000可包括头部2100、反应器耦合器2200、杆2300和生物芯片2400。如图4中的B所示，反应器耦合器2200可插入至含有样品的反应器2700中并与之耦合。此时，形成于杆300下侧的生物芯片2400浸入至反应器2700的样品2800中。因此基因扩增和杂交可以在反应器2700中进行，同时在杂交过程中扩增的基因可与 生物芯片2400的靶基因探针反应，以诱导与靶基因探针的结合和反应。 
也就是说，在反应器2700中进行实时聚合酶链反应(PCR，基因扩增)；反应器2700中产生的荧光信号通过监测设备实时获得；然后，与固定在生物芯片上的探针杂交；将杆2300和生物芯片2400从反应器2700中分离后洗涤；使用专门的荧光检测器获取与探针反应产生的荧光信号；进行生物芯片分析。因此，实时PCR和生物芯片分析可以集成地在单反应器中进行。 
本发明的生物材料集成分析方法，其特征在于，检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或乙型肝炎病毒的靶核酸，更具体地，诊断结核分枝杆菌的存在与否，诊断具有抗生素抗性的结核分枝杆菌的存在与否或诊断乙型肝炎病毒(HBV)的存在与否，以及检测抗药性改良的乙型肝炎病毒(HBV)。 
更具体地，用于区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria)的靶基因引物和探针可包括含有能够仅与结核分枝杆菌靶基因特异性结合的核苷酸序列或其互补核苷酸序列的寡核苷酸，更优选地，可包括包含SEQ.ID NO:1-3所示核苷酸序列或其补核苷酸序列的至少一种引物和探针。 
此外，用于检测抗生素抗性的靶基因引物和探针可包括能够特异性结合可诱导抗生素抗性的靶基因的核苷酸序列，例如，能够特异性与诱导利福平(RMP)和异烟肼(INH)抗性的核苷酸序列反应的核苷酸序列，也就是说，具有互补核苷酸序列的任何寡核苷酸，但优选包括含有诱导利福平抗性的rpoB基因的点突变核苷酸序列或其互补核苷酸序列的寡核苷酸，以及含有诱导异烟肼抗性的katG基因和inhA基因的点突变核苷酸序列或其互补核苷酸序列的寡核苷酸，更优选包括含有SEQ.ID.NO:4-35所示核苷酸序列或其互补核苷酸序列的至少一种引物和探针。 
用于检测HBV抗药性的靶基因引物和探针可包括含有能够特异性结合诱导拉米夫定抗性的靶基因的核苷酸序列的寡核苷酸，优选含有诱导拉米夫定抗性的在HBV DNA聚合酶基因的B区密码子528、529和514以及C区密码子552、548和555具有突变的点突变核苷酸序列的寡核苷酸，更优选包括SEQ ID.NO:36-46所示核苷酸序列或其互补核苷酸序列的至少一种引物和探针。 
为了同时检测对新开发抗生素或药物的抗性以及上述靶基因，本发明可进一步包括含有与新鉴定的抗生素有关的核苷酸序列或与抗药性有关的突变核苷酸序列的寡核苷酸。 
在本发明的探针中，用于定量分析采用实时聚合酶链反应(PCR)扩增的反应产物的探针的荧光材料和用于定性分析杂交后扩增的反应产物的探针的荧光材料可具有不同的波长。 
更具体地，本发明的探针使用FAM荧光材料定量分析采用实时聚合酶链反应(PCR)扩增的反应产物，使用Cy3荧光材料定性分析杂交后扩增的反应产物。 
对于具体的实例，根据本发明可使用具有多个孔的板1000或生物材料检测装置2000进行集成分析。 
如图1所示，多个靶基因探针排列于①和②的表面，将实时PCR试剂和靶基因引物置于含有靶基因探针的反应器中，如③所示，进行基因扩增。在基因扩增中当发生如④所示的反应时，通过照相机实时获得如⑤所示的反应器中产生的荧光材料(例如FAM)信号，从而得到定量分析的值。如⑥所示，仅通过温度变化而无单独处理，将基因扩增后的反应产物进行DNA微阵列反应。所得材料的定性分析可通过在洗涤后阅读荧光材料(例如，Cy3)信号来实施，该荧光信号不同于在实时PCR中通过荧光检测器检测到的荧光信号，从而获得如⑧所示的基因型信号。 
附图说明
图1为本发明生物材料集成分析方法的示意图； 
图2所示为本发明生物材料集成分析方法的操作原理； 
图3所示为本发明具有多个孔的板的透视图(A)，以及样品和油包含于具有多个孔的板的孔内的结构的横截面图(B)； 
图4所示为本发明生物材料检测装置的透视图(A)，以及生物材料检测装置与含有样品的反应器耦合的结构的横截面图(B)； 
图5所示为本发明实施例4检测结核分枝杆菌抗生素抗性的结果；以及 
图6所示为本发明结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的区别，及结核分枝杆菌的多药物抗性的检测结果。 
[主要部件的详细描述] 
1000:具有多个孔的板(本发明的) 
100:板 
200:孔 
210:上孔             220:下孔 
300:生物芯片 
400:样品 
500:油 
2000:生物材料检测装置(本发明的) 
2100:头部 
2200:反应器耦合器    2210:突出部 
2300:杆 
2400:生物芯片 
2500:方向显示器 
2600:适配器 
2700:反应器 
2800:样品 
具体实施方式
现参考如下实施例更详细描述本发明。然而，所提供的以下实施例仅为帮助理解本发明，但本发明的保护范围并不限于这些实施例。 
本文除非另有说明，本发明申请文件中所用的术语包括技术术语和科技术语均具有本领域技术人员通常理解的与本发明相关的相同含义，而对可能模糊本发明主旨的已知功能和结构的详细描述将加以省略。 
[实施例1]制备引物和探针 
(1)制备对结核分枝杆菌/非结核分枝杆菌彼此区分的引物、用于实时PCR的探针以及诊断抗生素抗性的DNA芯片的引物和探针
用于区分结核分枝杆菌和诊断利福平(rpoB)和异烟肼(inhA,katG)抗性的寡核苷酸引物、进行实时PCR的探针、DNA芯片的探针示于表1(用于区分结核分枝杆菌的引物)、表2(用于区分结核分枝杆菌的进行实时PCR的探针)、表3(用于诊断抗生素抗性的引物)以及表4(用于诊断抗生素抗性的固定DNA芯片的探针)。 
表1和表2所示的探针用于定量分析采用实时PCR扩增的结核分枝杆菌反应产物，FAM作为荧光材料，TAMRA作为淬灭材料。为使扩增的反应产物进行杂交，然后通过DNA芯片确定用于诊断抗生素抗性的基因型定性分析，在下面表3中将Cy3荧光材料与引物结合用于诊断抗生素抗性。因此，在基因扩增过程中，用于诊断抗生素抗性的探针结合有Cy3荧光材料，并预先固定于DNA芯片表面上，与扩增的反应产物进行反应，从而产生信号。 
[表1]用于检测结核分枝杆菌/非结核分枝杆菌的引物 
Figure BDA00001876950400111
Figure BDA00001876950400121
[表2]用于检测结核分枝杆菌/非结核分枝杆菌的进行实时PCR的探针 
Figure BDA00001876950400122
[表3]用于诊断抗生素抗性的引物 
Figure BDA00001876950400123
[表4]用于诊断抗生素抗性的固定DNA芯片的探针 
Figure BDA00001876950400124
Figure BDA00001876950400131
(2)制备用于检测具有抗药性的乙型肝炎病毒的引物和探针
制备用于检测具有抗药性的乙型肝炎病毒(HBV)的引物和靶探针，其包含诱导拉米夫定抗性的在HBV DNA聚合酶基因C区YMDD主型(motif)密码子552、548和555以及B区密码子528、529和514的点突变核苷酸序列，如下面表5、6和7所示。 
通过使用FAM作为荧光材料用于定量分析实时聚合酶链反应(PCR)扩增的反应产物，以及选用Cy3荧光材料用于定性分析杂交后扩增的反应产物，制备探针。 
在如下探针中，检测乙型肝炎病毒引物(表5)和检测乙型肝炎病毒进行实时PCR的探针(表6)用于对通过实时聚合酶链反应(PCR)扩增的乙型肝炎病毒的反应产物进行定量分析。此时，FAM作为荧光材料，TAMRA作为淬灭材料。为使扩增的反应产物进行杂交，然后通过DNA芯片确定用于诊断抗生素抗性的基因型定性分析，在下面表5中将Cy3荧光材料与引物结合用于诊断抗生素抗性。因此，在基因扩增过程中，表7的用于诊断抗生素抗性的探针结合有Cy3荧光材料，并预先固定于DNA芯片表面上，与扩增的反应产物进行反应，从而产生信号。 
[表5]用于检测乙型肝炎病毒的引物 
[表6]用于检测乙型肝炎病毒的进行实时PCR的探针 
Figure BDA00001876950400142
[表7]用于诊断抗生素抗性的固定DNA芯片的探针 
Figure BDA00001876950400143
Figure BDA00001876950400151
[实施例2]将探针附着于载体(supporter)上 
将实施例1中制备的用于定量和定性分析的各探针分别稀释至100pmol，然后转移至96孔微板上。向其中加入点样溶液，再混合至50pmol。采用微阵列(美国，Cartesian Technologies,PLXSYS7500SQXL微阵列点样器)将探针附着于载体如载玻片、膜等。 
为除去未附着于载体表面的探针，将如此获得的载体在室温下用0.2%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液洗涤。将如此获得的载体在室温下用硼氢化钠溶液洗涤，再用沸腾的蒸馏水洗涤。将如此获得的载体在室温下用0.2%SDS溶液和蒸馏水洗涤，然后使用离心分离器将载体表面完全干燥，从而完成微阵列(生物芯片)的制备。 
[实施例3]制备生物材料检测装置 
将实施例2制备的生物芯片固定于棒状杆的底部制备生物材料检测装置。 
[实施例4]从细菌分离基因组DNA 
(1)从结核分枝杆菌分离基因组DNA
本实验所用的结核分枝杆菌来自韩国结核病防治协会(Korean National Tuberculosis Association)，样品来自国立马山结核病医院(National Masan Tuberculosis Hospital)。使用InstaGene基质(美国， Bio-Rad Co.)以提取其DNA。将100μl InstaGene基质加入至1.5ml的管中。将本实验所用的细菌在固体培养基(Ogawa培养基)中培养，然后将1铂环细菌细胞接种并悬浮于含有InstaGene基质的管中。使其在56℃的恒温水浴中反应30分钟，再混匀10秒钟以使其均质化。然后，将其在100℃进行热处理8分钟，均匀搅拌10秒钟。将该混合物在12,000rpm离心分离3分钟，将分离的上清液转移至新的管中。将其用作实时PCR反应的模板DNA。 
(2)从乙型肝炎病毒分离基因组DNA
将从乙型肝炎病毒患者采集的血液直接冷冻以凝结1小时，然后将血清在3000rpm离心分离5分钟。所得血清于-70℃保存。使用QIAamp血液DNA提取试剂盒(美国加利福利亚，QIAGEN Inc.)提取其DNA。使用该试剂盒以保证最终从该血清中获得200μlHBV DNA。将其用作实时PCR反应的模板DNA。 
[实施例5]结果分析 
(1)检测是否存在结核分枝杆菌和抗生素抗性
将实施例3制备的生物材料检测装置放置到含有样品的管中，然后进行实时PCR。 
通过照相机实时获得在基因扩增过程中管内产生的FAM荧光信号；然后进行杂交；打开盖以分离与盖连接的玻璃杆，然后洗涤；使用专门的荧光检测器获得与探针反应的Cy3荧光信号；然后进行DNA芯片分析。 
结果如表6所示。 
(2)检测具有抗药性的乙型肝炎病毒
将实施例3制备的生物材料检测装置放置到含有样品的管中，然后进行实时PCR。 
通过照相机实时获得在基因扩增过程中管内产生的FAM荧光信号；然后进行杂交；打开盖以分离与盖连接的玻璃杆，然后洗 涤；使用专门的荧光检测器获得与探针反应的Cy3荧光信号；然后进行DNA芯片分析。 
如上述结果所证实，本发明的生物材料集成分析方法能够在单反应器中进行基因扩增并随后进行杂交，从而防止因为外部因素导致的样品污染，该污染可能在转移样品以进行反应时产生，所述方法还可自动进行一系列程序，如样品加注、生物材料反应以及结果的检测和分析。 
进一步地，与现有商业化的方法相比，本发明的生物材料集成分析方法可大大缩短检测导致各种疾病的对人类有害微生物所需的时间，在成本方面非常经济，并可准确而有效地检测到靶基因。 
如上所述，本发明的生物材料集成分析方法能够在单反应器中进行基因扩增并随后进行杂交，从而防止因为外部因素导致的样品污染，该污染可能在转移样品以进行反应时产生，所述方法还可自动进行一系列程序如样品加注、生物材料反应以及结果的检测和分析。 
与现有商业化的方法相比，本发明的生物材料集成分析方法可大大缩短检测导致各种疾病的对人类有害微生物所需的时间，在成本方面非常经济，并可准确而有效地检测到靶基因。 
Figure IDA00001876951000011
Figure IDA00001876951000021
Figure IDA00001876951000031
Figure IDA00001876951000051
Figure IDA00001876951000061
Figure IDA00001876951000071
Figure IDA00001876951000081
Figure IDA00001876951000091
Figure IDA00001876951000101
Figure IDA00001876951000111

Claims (9)

1.生物材料的集成分析方法，其特征在于，在单反应器中同时进行采用聚合酶链反应（PCR）或实时聚合酶链反应（实时PCR）扩增的反应产物的定量或定性分析以及通过其上固定有靶基因探针的生物芯片得到的反应产物的定性分析，
其中，所述生物芯片形成于单反应器内的底面或侧面上，或形成于从单反应器的反应器耦合器下部延伸的杆上。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶基因探针为选自下组中的至少一种：肽、蛋白、核酸、肽核酸(PNA)、适配子和抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述单反应器为选自下组中的至少一种：具有多个孔的板、试验管、管和包括从反应器耦合器下部延伸的杆的生物材料检测装置。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述具有多个孔的板含有带有两个或多个阶的孔结构。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述具有多个孔的板包括凹入地形成于其一个面上的多个孔；所述孔包括上孔和上孔下面的下孔，所述下孔的直径小于所述上孔；且所述生物芯片形成于所述下孔的底部。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物材料检测装置包括反应器和从反应器耦合器下部延伸的杆；且所述生物芯片形成于所述杆的下侧。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述杆从所述反应器耦合器上可拆卸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中该方法用于检测结核分枝杆菌或乙型肝炎病毒的靶核酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述结核分枝杆菌或乙型肝炎病毒的靶核酸采用由SEQ ID NO.:1-46所示的核苷酸序列组成的至少一种靶基因引物和至少一种靶基因探针进行检测。
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