CN107988344A - 一种基于多孔滤膜的核酸测序方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因测序技术领域，特别涉及一种基于多孔滤膜的核酸测序方法和装置。具体的，所述核酸测序方法包括：利用固定在多孔滤膜上的核酸探针与扩增后的靶基因杂交进行核酸测序反应或利用固定在多孔滤膜上的核酸引物和靶基因扩增后与核酸探针杂交进行核酸测序反应；然后，通过检测核酸测序反应过程中产生的pH值、焦磷酸浓度值、发光值或荧光值中一项的变化来检测反应信号。本发明还涉及一种基于多孔滤膜的核酸测序装置，包括如下单元：1)流控系统；2)反应器；3)温控系统；4)传感器。本发明运用常规核酸扩增产物与核酸探针在多孔滤膜上杂交的方法，在靶基因测序及基因突变检测上具有快速，正确率高，成本低的优势。

Description

一种基于多孔滤膜的核酸测序方法和装置

技术领域

本发明属于基因测序技术领域，特别涉及一种基于多孔滤膜的核酸测序方法和装置。

背景技术

核酸测序技术即测定DNA序列的技术，从1977年的Sanger测序法至今已经发展了3代，目前市场上主要采用的第二代测序方法可分为以下四种：Illumine测序法、Roche 454测序法、Solid测序法和Ion Torrent测序法；这四种第二代的测序方法基本上能实现高通量的基因组测序，但这些测序方法主要集中在如何解决在最短时间内测定出整个基因组DNA信息的问题，通常情况下，构建DNA文库需要2天时间，再到测序完成又需要2-3天时间，这就无法满足临床诊断上不需要大量的基因组DNA信息，但要求时间短，正确性高等方面的要求。因此，现在的临床DNA诊断是以荧光定量PCR和基因杂交芯片试剂盒为主。

荧光定量PCR法是指在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，并在其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团；那么，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当探针结合在DNA任意一条单链上进行PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，从而使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，这样荧光监测系统就可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，这就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。这种方法的优点是真正实现了定量检测，并且速度快，通常可在2-3小时得到结果；但也有明显的缺点：第一、由于所用设备的荧光通量限制目前只能做到4色荧光探针，单管只能对4个DNA突变进行检测，如果需要检测多个突变，则需要增加很多反应管；第二、仅能对已知的基因突变设计荧光探针，无法得知新的基因突变，如果出现新基因突变往往会造成假阴性。

基因芯片法是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面,然后与标记的样本杂交,再通过对杂交信号的检测分析得出样本的遗传信息。由于临床诊断的正确性要求，目前国内临床应用的基因芯片法中的HPV检测试剂都是采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术。其中，具有代表性的有：21种HPV分型检测试剂盒(pcr+膜杂交法)，将检测21种HPV病毒的探针固定到尼龙膜上，然后将PCR扩增产物加入到尼龙膜上进行杂交，通过尼龙膜上辣根过氧化酶催化显色的斑点判断出感染病毒亚型，其优点是可检测的基因突变种类多，理论上可达到数百种或者上千种。目前，基因芯片法已临床应用的试剂盒单通道可以一次检测21种不同的HPV病毒亚型，而常规荧光定量PCR单通道只能检测4种；但基因芯片法的缺点是操作繁琐，需要对PCR产物进行杂交，酶催化显色，检测时间通常需要4-6个小时，且由于21种探针杂交温度需要设计一致，这导致探针设计困难，也阻碍了该技术向更高的通量发展。

使用多孔滤膜的PCR膜杂交法不仅历史悠长和应用广泛，目前在转基因检测、基因表达、发育研究、临床肿瘤检测、染色体定位以及药物残留等方面也是主力技术之一。但常规的杂交反应操作步骤冗长，根据不同的实验目的，实验材料和仪器设备都需要设计一份单独的操作细节，而不同的操作方案通常会对最终的结果产生显著的影响。

因此，对使用多孔滤膜的PCR膜杂交法进行改进来开发一种快速、便捷且成本低廉的测序方法来分析生物样品的靶基因序列信息是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于解决现有第二代测序方法和膜杂交技术在临床应用上的缺点，提供一种可以用很低的成本快速得到所需要分析生物样品的靶基因序列信息的方法和装置。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种基于多孔滤膜的核酸测序方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)利用固定在多孔滤膜上的核酸探针与扩增后的靶基因杂交进行核酸测序反应；

或，利用固定在多孔滤膜上的核酸引物和靶基因扩增后与核酸探针杂交进行核酸测序反应；

2)通过检测核酸测序反应过程中产生的pH值、焦磷酸浓度值、发光值或荧光值中一项的变化来检测反应信号。

优选地，所述多孔滤膜由选自尼龙多孔材料、聚偏氟/四氟乙烯类多孔材料、聚砜/醚砜类多孔材料、聚丙烯/乙烯/苯乙烯类多孔材料、聚氨酯/酯类多孔材料、纤维树酯类材料中的一种或几种复合而成。

优选地，所述多孔滤膜由选自多孔硅胶及二氧化硅材料，多孔陶瓷材料中的一种或几种复合而成。

优选地，所述核酸探针与靶基因的杂交方法包括：将利用常规核酸扩增方法扩增得到的靶基因和固定有核酸探针的多孔滤膜加入到反应液中，通过对所形成的体系进行升温变性及退火复性即可将靶基因与核酸探针在多孔滤膜上进行杂交形成核酸探针与靶基因杂合体。

优选地，所述核酸探针与靶基因的杂交方法包括：将未扩增的靶基因和固定有核酸引物的多孔滤膜加入到反应液中，通过与固定在多孔滤膜上的核酸引物进行桥式PCR或者滚环扩增技术进行固相靶基因扩增后，再加入与靶基因互补的核酸探针，然后对所形成的体系进行升温变性退火复性即可将核酸探针与靶基因在多孔滤膜上进行杂交形成核酸探针与靶基因杂合体。

优选地，所述核酸测序的方法包括：分别按顺序将四种未修饰的dNTP和酶反应液依次加入到由含有核酸探针与靶基因杂合体的多孔滤膜以及测序反应液组成的体系中，当其中一种和靶基因序列匹配的dNTP与酶反应液加入后，如果核酸探针与靶基因上对应的序列匹配，那么就会发生一次测序反应，酶就会按照靶基因的序列在核酸探针上合成一个碱基，并释放出一个焦磷酸，焦磷酸水解后释放出一个氢离子；而当其它三种dNTP与酶的反应液流入反应体系后，由于和靶基因序列不匹配，故不发生测序反应，也不会释放出焦磷酸，并最终被反应液冲洗出反应体系；以此类推进入下一轮测序反应，直到完成整个测序反应。

优选地，所述核酸测序的方法包括：分别按顺序将四种带有荧光修饰的dNTP和酶反应液依次加入到由含有核酸探针靶基因杂合体的多孔滤膜以及测序反应液组成的体系中，当其中一种和靶基因序列匹配的带有荧光修饰的dNTP与酶反应液加入后，如果核酸探针与靶基因上对应的序列匹配，那么就会发生一次测序反应，酶就会按照靶基因的序列在核酸探针上合成一个碱基，并释放出一个荧光修饰物；而当其它三种dNTP与酶的反应液流入反应体系后，由于和靶基因序列不匹配，故不发生测序反应，也不会释放出荧光修饰物，并最终被反应液冲洗出反应体系；以此类推进入下一轮测序反应，直到完成整个测序反应。

优选地，所述核酸测序的方法包括：分别按顺序将四种未修饰的dNTP、酶反应液和荧光素依次加入到由含有核酸探针与靶基因杂合体的多孔滤膜以及测序反应液组成的体系中，当其中一种和靶基因序列匹配的dNTP与酶反应液和荧光素加入后，如果核酸探针与靶基因上对应的序列匹配，那么就会发生一次测序反应，酶就会按照靶基因的序列在核酸探针上合成一个碱基，并释放出一个焦磷酸，所产生的焦磷酸再与溶液中的ATP和荧光素反应形成发光组合物；而当其它三种dNTP与酶的反应液流入反应体系后，由于和靶基因序列不匹配，故不发生测序反应，也不会释放出焦磷酸，并最终被反应液冲洗出反应体系；以此类推进入下一轮测序反应，直到完成整个测序反应。

本发明还涉及一种基于多孔滤膜的核酸测序装置，其特征在于，包括如下单元：

1)流控系统，与反应器连接，用于传输反应液；

2)反应器，用于放置多孔滤膜及进行核酸测序反应，其中，可利用固定在多孔滤膜上的核酸探针与扩增后的靶基因杂交进行核酸测序反应；或利用固定在多孔滤膜上的核酸引物和靶基因扩增后与核酸探针杂交进行核酸测序反应；

3)温控系统，与反应器连接，用于控制反应器的温度；

4)传感器，置于反应器内部或与反应器连接的管道内，用于检测核酸测序反应过程中产生的pH值、焦磷酸浓度值、发光值或荧光值中一项的变化来检测反应信号。

优选地，所述反应器的内壁还可具有由多孔材料组成的涂层。

优选地，所述多孔材料由选自尼龙多孔材料，聚偏氟/四氟乙烯类多孔材料，聚砜/醚砜类多孔材料，聚丙烯/乙烯/苯乙烯类多孔材料，聚氨酯/酯类多孔材料，纤维树酯类材料，多孔硅胶及二氧化硅材料，多孔陶瓷材料中的一种或几种复合而成。

优选地，所述传感器为选自pH传感器、离子传感器、发光传感器或荧光传感器中的一种。

本发明的测序基本原理如下：首先，对多孔滤膜上含有的大量可以活化的化学基团(例如：羧基，氨基，亚氨基，羟基，巯基，卤素等)进行活化，通过化学键合的方式与核酸探针形成固定有核酸探针的多孔滤膜，然后在反应器中将其和检测所需的靶基因及相应的反应液通过升温变性进行杂交形成核酸探针靶基因杂合体。接下来，往反应器中按顺序依次将未修饰的dNTP或带有荧光修饰物的dNTP与酶反应液(如果采用发光传感器检测反应信号还需要加入荧光素)，当其中一种与靶基因序列匹配的dNTP与酶反应液加入后，如果核酸探针与靶基因上对应的序列匹配，那么就会发生一次测序反应，酶就会按照靶基因的序列在核酸探针或者引物上合成一个碱基，并释放出一个焦磷酸或者荧光修饰物；而当其它三种dNTP与酶的反应液流入反应体系后，由于和靶基因序列不匹配，故不发生测序反应，也不会释放出焦磷酸或者荧光修饰物，并最终被反应液冲洗出反应体系；以此类推进入下一轮测序反应，直到完成整个测序反应；最后通过检测测序反应前后体系的pH值、焦磷酸浓度值、发光强度值和荧光强度值的变化即可分析出靶基因的序列。

相对于现有的基因测序方法，本发明的增益效果如下：

(1)现有的第二代和第三代测序方法都需要通过显微纳米级加工的反应器，高精度摄像机，及对海量的数据分析才能完成测序，不仅测序时间漫长而且测序成本还非常高；本发明利用膜杂交技术采用普通加工生产的反应器即可完成测序，体现了膜杂交技术成本低且快速的特点，同时还具有测定靶向基因序列的功能。

(2)现有的膜杂交技术对杂交反应是否成功的判断通常需要对膜杂交体进行BSA封闭并加入碱性磷酸酶AP进行洗涤，然后通过NBT/BCIT系统显色肉眼观察结果，这样至少需要3.5小时以上的时间，而且显色背景容易受到操作者的影响导致误判。本发明的优点是仅需一个测序反应，在短短的几分钟时间内就可以判断出杂交反应是否成功，这是因为在本发明的测序方法中可通过判断加入的dNTP是否合成到核酸探针上，就可以推断出核酸探针是否已经与靶基因发生杂交，因为如果没有发生杂交，测序反应无法进行，那么根据第一次测序反应的信号检测结果就可以推断出靶基因里含有与核酸探针互补序列的碱基，从而快速判断出核酸探针是否与靶基因发生杂交反应。

(3)与现有的临床检测常用的芯片核酸测定方法相比，本发明不仅精确度高还具有成本低廉的优势。这是因为，目前的芯片核酸测定方法通常采用集成电路支持的传感器阵列，然后再构建基因组核酸DNA文库并偶联到微珠上，其反应室及微珠的直径大小在1-10微米之间，过小的反应室及超显微的检测传感器会导致过高的显微加工成本及较大的测序误差；此外，在测定序列前还需要花费2天的时间进行DNA文库的构建，单次测序虽然可以得到整个基因组的序列，但基因序列的信息分析工作量大，成本高昂，这并不符合常规的临床基因突变检测或者病毒核酸检测仅仅需要几十个碱基的序列信息的要求。由于本发明通过多孔滤膜上的PCR膜杂交与测序结合的方法，不需要构建DNA文库，运用常规PCR及核酸杂交方法，用相对较低的成本，在很短的时间内测定出靶基因的几十个碱基序列信息，故本发明在靶基因测序及基因突变检测上具有快速，正确率高，成本低的优势。

(4)本发明提供的基于多孔滤膜的核酸测序方法可以在病毒核酸检测，癌症基因的检测，遗传性疾病的筛查等需要对核酸进行分析的领域具有重要的检测意义，进而为临床早期诊断、早期治疗及指导用药提供参考依据和准确导向。

附图说明

图1通过pH传感器检测基于多孔滤膜的核酸测序反应的原理示意图

图2通过荧光传感器检测基于多孔滤膜的核酸测序反应的原理示意图

图3通过发光传感器检测基于多孔滤膜的核酸测序反应的原理示意图

图4SPF1/2引物结合区域38型HPV病毒的碱基位点差异图

具体实施方式

下面进一步结合附图和实施例以详细说明本发明。本发明可以发生多种修饰和替代形式，但是应当理解，本发明不将发明限于所述的特定实施方案。本发明意图覆盖落入本发明精神和范围内的所有修饰、等效方案和替代方案，实际实施具体方案可以根据不同的方案修饰或者更改。实施例中采用对38型的HPV病毒序列分析仅仅是为了方便公众理解本发明的精神和体现本发明对传统杂交分析的优点，本发明可以实施于任何含有核酸基因信息的生物样本。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1、通过pH传感器检测核酸测序反应

测序反应的原理如图1a所示：在反应器中使用常规的化学方法对多孔滤膜(11)进行活化，排出活化反应液后加入1-10pmol的核酸探针(12)，直到核酸探针固定到多孔滤膜上形成核酸探针多孔滤膜复合体(13)，然后加入PCR扩增完的靶基因(14)及10-100ul测序反应液，然后通过升温变性及降温复性的过程，在多孔滤膜上形成含有核酸探针靶基因杂合体(15)的测序反应体系，此处，必须把未杂交的靶基因清洗排出反应器。下一步，将10-100ul未修饰的dATP、dTTP、dCTP和dGTP与酶反应液加入到反应器中进行测序反应，pH检测传感器会探测到反应前后的pH值变化，结果，当dATP与酶反应液(16)加入到反应器后，酶会按照靶基因的序列在核酸探针上合成一个碱基A(17),并释放出1-10pmol焦磷酸(每一分子的核酸探针释放一分子的焦磷酸)，焦磷酸水解后释放出1-10pmol氢离子(18)，由于反应体系的体积是10-100ul，所以溶液中氢离子的浓度增加了10-1000nmol/L，溶液的pH值在反应前后变化了0.01-1；因此，pH传感器探测到溶液pH值的改变就说明dATP已经合成到核酸探针上，而当dGTP、dCTP和dTTP与酶的反应液流入反应器后由于与靶基因序列不匹配，故不发生测序反应，pH传感器无法探测到pH值的改变，而所加入的dGTP、dCTP和dTTP与酶的反应液随后被冲洗出反应器。通过判断dATP已经合成到核酸探针上，就可以推断出靶基因与核酸探针杂交后的第一个碱基序列是T(17)，由此完成第一轮测序反应；以此类推，当我们按顺序加入dTTP、dCTP和dGTP与酶的反应液时(20)，反应器中均可以检测到pH值的变化，而且由于每次反应均只有一个碱基发生反应，故每次反应检测到的pH值变化值是相同的。这里特别指出：当靶基因序列中存在连续相同的基因序列时的情况，如图1所示：在第五个位置加入dATP时，由于靶基因序列正好含有3个与dATP配对的碱基(21)，故这次反应会发生3个碱基的合成，释放出3倍浓度的焦磷酸，溶液的H⁺浓度也会增加3倍(22)，pH值的变化幅度大于发生一个碱基合成的情况，这样可以推断出靶基因序列这时含有3个碱基T(21)。

此外，如图1b所示，我们可以只需要一次性加入混合好的dNTP与酶的反应液(23)，然后通过检测溶液pH值变化就可判断核酸探针是否已经与靶基因形成杂交复合体，同时还可根据dNTP中的一个碱基发生反应(17)，就可以推断出靶基因与核酸探针发生杂交反应以及靶基因里含有与该核酸探针互补的序列。当我们需要得知更长的靶基因信息来对检测的结果做判断时，我们可将dATP、dTTP、dCTP和dGTP与酶反应液按照顺序加入到测序反应体系中，从而可以判断出如图1b所示的靶基因的全部序列信息(23)。在专利CN200710030723.6中描述对人乳头状瘤病毒HPV的DNA具体亚型的基因分型检测试剂制备过程，其中采用了21条不同序列的核酸探针分别针对21种不同的HPV亚型病毒进行检测，然而要将21种不同的探针设置到同一个TM值范围需要比较复杂的计算及大量的临床数据。因此，在本实施例中，我们可以只设置一条如图1c中所示的21种HPV亚型病毒同源的核酸探针(56)，然后根据我们已知的21种HPV亚型病毒序列，按照最流行的HPV16病毒的碱基序列设置优化的流程，接下来将dATP、dTTP、dCTP和dGTP与酶反应液按照设定次序依次流入反应器中，通过检测反应的pH值变化来判断该基因的序列，那么能探测到反应信号的dNTP(dATP、dTTP、dCTP和dGTP中的一种)的种类就是该基因的序列，因此，只需进行17个测序反应后我们就可以得出如图4中所示的探针后续16个碱基的序列(62)，这样就可以完成21种HPV病毒的分型，并且由于已经知道了病毒基因序列，我们就可以得知这21种亚型病毒新的突变变种。按照平均每个反应流程需要2分钟计算，17个反应仅需半小时左右时间即可完成，由此大大缩短了检测HPV的DNA具体亚型的操作步骤和时间。

保持其它条件不变，还可以使用检测焦磷酸浓度的离子传感器来代替pH传感器，那么通过对焦磷酸浓度信号变化的检测也可得到与pH值检测一样的结果。

实施例2、通过荧光传感器检测核酸测序反应

测序反应的原理如图2所示：与实施例1类似，首先使用常规的化学方法对多孔滤膜进行活化后，往反应器中加入1-10pmol的核酸探针，直到核酸探针固定到多孔滤膜上形成核酸探针多孔滤膜复合体，然后加入PCR扩增完的靶基因及10-100ul测序反应液，通过升温变性及降温复性的过程在反应器中形成含有核酸探针靶基因杂合体的测序反应体系，然后把未杂交的靶基因清洗排出反应器。下一步，将10-100ul带有荧光修饰物的dATP、dTTP、dCTP和dGTP与酶反应液依次加入反应器中进行测序反应。当把带有荧光修饰的dATP与酶反应液(31)加入反应器后，酶会按照靶基因的序列在核酸探针上合成一个碱基A(32),清洗排出未参与反应的带有荧光修饰的dATP,然后加入切割剂，碱基A(32)上的荧光剂(33)就会从多孔滤膜上释放到反应液中，通过检测溶液中荧光剂所发出的荧光值即可判断出dATP已经合成到核酸探针上，而当带有荧光修饰物的dTTP、dCTP和dGTP与酶的反应液加入测序反应体系后，由于和靶基因序列不匹配，故不发生测序反应，荧光传感器也无法探测到荧光值变化。以此类推，可以检测出与核酸探针杂交的全部靶基因序列。

实施例3、通过发光传感器检测核酸测序反应

测序反应的原理如图3所示：使用常规的化学方法对多孔滤膜进行活化后，往反应器中加入1-10pmol的核酸探针，直到核酸探针固定到多孔滤膜上形成核酸探针多孔滤膜复合体，然后加入扩增完的靶基因及10-100ul测序反应液，通过升温变性及降温复性的过程在反应器中形成含有核酸探针靶基因杂合体的测序反应体系，此处，必须把未杂交的靶基因清洗排出反应器。下一步，依次将10-100ul未修饰的dATP、dTTP、dCTP和dGTP与酶反应液和荧光素加入测序反应体系进行测序反应，然后通过发光传感器探测到反应前后的光量变化来判断是否发生测序反应。当dATP与酶反应液(42)和荧光素加入到反应器后，酶会按照靶基因的序列在核酸探针上合成一个碱基A,并释放出1-10pmol焦磷酸(每一分子的核酸探针释放一分子的焦磷酸)，焦磷酸进一步与溶液中的ATP和荧光素反应形成发光组合物(43)，由于反应体系的体积和荧光素的量是固定的，所以溶液中发光量的变化和焦磷酸的浓度成比例，由此判断dATP已经合成到核酸探针上；而当dGTP、dCTP和dTTP与酶和荧光素的反应液流入反应器后由于和靶基因序列不匹配，故不发生测序反应，发光传感器也无法探测到溶液中发光量的改变。由此，通过判断dATP已经合成到核酸探针上就可以推断出靶基因与探针杂交后的第一个碱基序列是T。以此类推，当我们按顺序加入dTTP、dCTP和dGTP与酶反应液和荧光素时，反应体系均可以检测到发光量的变化，而且由于每次反应均发生一个碱基的合成，故每次反应检测到的发光变化值是相同的。这里也特别指出：当靶基因序列中存在连续相同的基因序列时，例如，在第五个位置加入dATP时，由于靶基因序列在这个时候含有3个和dATP配对的碱基，故这次会有3个碱基发生反应并释放出3倍浓度的焦磷酸，溶液的发光量也会增加3倍(44)，发光量的变化幅度大于仅有一个碱基发生反应的情况；因此，可以推断出靶基因序列这时含有3个T，依次类推就可以测出全部的靶基因序列(45)。

实施例4、采用桥式PCR或者滚环PCR检测多个基因突变或者病毒种类

本发明的另一个方案是可以采用桥式PCR或者滚环PCR检测多个基因突变或者病毒种类。桥式PCR是直接在多孔滤膜上进行PCR扩增及靶基因序列测定，由于桥式PCR是固相反应，扩增后的PCR产物直接固定在多孔滤膜上可以避免PCR产物的污染问题，达到全闭管反应的效果，同时由于直接在测序体系里面做PCR反应和杂交测序从而减少了人工操作的步骤。如图1c所示是使用现有的常规技术对38型HPV病毒分型检测的步骤：首先，将5’端氨基化SPF1/2的探针引物(51)固定在多孔滤膜上，加入未知的HPV病毒核酸模板(52)和PCR试剂，通过温控系统进行桥式PCR扩增(53,54)，经过多个PCR循环后，在多孔滤膜上形成无数个含有相同的SPF1/2引物间核酸序列的克隆簇(55)；然后，加入核酸探针(56)进行杂交形成PCR扩增产物与核酸探针杂交体(57)，接下来，依次循环加入4种dNTP和酶反应液(58)，然后通过检测反应液的pH值变化来判断是否发生测序反应。那么，当4种dNTP按照常规的顺序(59)加入反应液后，总共需要发生16*4＝64个反应就可计算出如图4所示的核酸探针后续16个碱基(62)的信息，从而完成对38型的HPV病毒的分型检测，按每个反应2分钟计算，完成整个分型检测需要2个小时。在本发明中，我们可以通过设置dNTP的加入顺序对38型HPV病毒分型检测，即采用已知靶序列HPV16的基因序列顺序加入dCTP,dTTP，dATP，dGTP，dTTP，dGTP，dTTP,dATP,dCTP……(60)进行测序反应，那么，我们可以在进行到第4个测序反应时判断出是否含有HPV病毒，因为4个反应中如果有一个以上有信号就证明含有HPV病毒，如果4个反应都没有信号就表示不含有HPV病毒，在进行到第5个反应时判断出是否含有HPV 16，第7个反应判断出除了HPV 18，HPV39，HPV68的所有亚型，在第17个反应时判断出全部的亚型种类，按照每个反应2分钟算，只需要10分钟就可以判断出占比50％以上的HPV16亚型，14分钟即可判断出大部分的亚型，34分钟完成所有亚型的鉴定。同样可以针对不同地区的亚型分布情况设置不同的dNTP加入顺序，可以在最快时间内完成测定。如果需要测定探针后续的全部序列，可以依次分别加入四种不同的dNTP，然后根据pH值信号来推断出基因序列。本发明也可以采用滚环PCR方法代替桥式PCR方法，核酸探针的杂交方法及dNTP的加入顺序与采用桥式PCR一样，可以得到相同的结果。

Claims (12)

1.一种基于多孔滤膜的核酸测序方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)利用固定在多孔滤膜上的核酸探针与扩增后的靶基因杂交进行核酸测序反应；

或，利用固定在多孔滤膜上的核酸引物和靶基因扩增后与核酸探针杂交进行核酸测序反应；

2)通过检测核酸测序反应过程中产生的pH值、焦磷酸浓度值、发光值或荧光值中一项的变化来检测反应信号。

2.根据权利要求1所述的基于多孔滤膜的核酸测序方法，其特征在于，所述多孔滤膜由选自尼龙多孔材料、聚偏氟/四氟乙烯类多孔材料、聚砜/醚砜类多孔材料、聚丙烯/乙烯/苯乙烯类多孔材料、聚氨酯/酯类多孔材料、纤维树酯类材料中的一种或几种复合而成。

3.根据权利要求1所述的基于多孔滤膜的核酸测序方法，其特征在于，所述多孔滤膜由选自多孔硅胶及二氧化硅材料，多孔陶瓷材料中的一种或几种复合而成。

4.根据权利要求1所述的基于多孔滤膜的核酸测序方法，其特征在于，所述核酸探针与靶基因的杂交方法包括：将利用常规核酸扩增方法扩增得到的靶基因和固定有核酸探针的多孔滤膜加入到反应液中，通过对所形成的体系进行升温变性及退火复性即可将靶基因与核酸探针在多孔滤膜上进行杂交形成核酸探针与靶基因杂合体。

5.根据权利要求1所述的基于多孔滤膜的核酸测序方法，其特征在于，所述核酸探针与靶基因的杂交方法包括：将未扩增的靶基因和固定有核酸引物的多孔滤膜加入到反应液中，通过与固定在多孔滤膜上的核酸引物进行桥式PCR或者滚环扩增技术进行固相靶基因扩增后，再加入与靶基因互补的核酸探针，然后对所形成的体系进行升温变性退火复性即可将核酸探针与靶基因在多孔滤膜上进行杂交形成核酸探针与靶基因杂合体。

6.根据权利要求1所述的基于多孔滤膜的核酸测序方法，其特征在于，所述核酸测序的方法包括：分别按顺序将四种未修饰的dNTP和酶反应液依次加入到由含有核酸探针与靶基因杂合体的多孔滤膜以及测序反应液组成的体系中，当其中一种和靶基因序列匹配的dNTP与酶反应液加入后，如果核酸探针与靶基因上对应的序列匹配，那么就会发生一次测序反应，酶就会按照靶基因的序列在核酸探针上合成一个碱基，并释放出一个焦磷酸，焦磷酸水解后释放出一个氢离子；而当其它三种dNTP与酶的反应液流入反应体系后，由于和靶基因序列不匹配，故不发生测序反应，也不会释放出焦磷酸，并最终被反应液冲洗出反应体系；以此类推进入下一轮测序反应，直到完成整个测序反应。

7.根据权利要求1所述的基于多孔滤膜的核酸测序方法，其特征在于，所述核酸测序的方法包括：分别按顺序将四种带有荧光修饰的dNTP和酶反应液依次加入到由含有核酸探针靶基因杂合体的多孔滤膜以及测序反应液组成的体系中，当其中一种和靶基因序列匹配的带有荧光修饰的dNTP与酶反应液加入后，如果核酸探针与靶基因上对应的序列匹配，那么就会发生一次测序反应，酶就会按照靶基因的序列在核酸探针上合成一个碱基，并释放出一个荧光修饰物；而当其它三种dNTP与酶的反应液流入反应体系后，由于和靶基因序列不匹配，故不发生测序反应，也不会释放出荧光修饰物，并最终被反应液冲洗出反应体系；以此类推进入下一轮测序反应，直到完成整个测序反应。

8.根据权利要求1所述的基于多孔滤膜的核酸测序方法，其特征在于，所述核酸测序的方法包括：分别按顺序将四种未修饰的dNTP、酶反应液和荧光素依次加入到由含有核酸探针与靶基因杂合体的多孔滤膜以及测序反应液组成的体系中，当其中一种和靶基因序列匹配的dNTP与酶反应液和荧光素加入后，如果核酸探针与靶基因上对应的序列匹配，那么就会发生一次测序反应，酶就会按照靶基因的序列在核酸探针上合成一个碱基，并释放出一个焦磷酸，所产生的焦磷酸再与溶液中的ATP和荧光素反应形成发光组合物；而当其它三种dNTP与酶的反应液流入反应体系后，由于和靶基因序列不匹配，故不发生测序反应，也不会释放出焦磷酸，并最终被反应液冲洗出反应体系；以此类推进入下一轮测序反应，直到完成整个测序反应。

9.一种基于多孔滤膜的核酸测序装置，其特征在于，包括如下单元：

1)流控系统，与反应器连接，用于传输反应液；

2)反应器，用于放置多孔滤膜及进行核酸测序反应，其中，可利用固定在多孔滤膜上的核酸探针与扩增后的靶基因杂交进行核酸测序反应；或利用固定在多孔滤膜上的核酸引物和靶基因扩增后与核酸探针杂交进行核酸测序反应；

3)温控系统，与反应器连接，用于控制反应器的温度；

4)传感器，置于反应器内部或与反应器连接的管道内，用于检测核酸测序反应过程中产生的pH值、焦磷酸浓度值、发光值或荧光值中一项的变化来检测反应信号。

10.根据权利要求9所述的基于多孔滤膜的核酸测序装置，其特征在于，所述反应器的内壁还可具有由多孔材料组成的涂层。

11.根据权利要求10所述的基于多孔滤膜的核酸测序装置，其特征在于，所述多孔材料由选自尼龙多孔材料，聚偏氟/四氟乙烯类多孔材料，聚砜/醚砜类多孔材料，聚丙烯/乙烯/苯乙烯类多孔材料，聚氨酯/酯类多孔材料，纤维树酯类材料，多孔硅胶及二氧化硅材料，多孔陶瓷材料中的一种或几种复合而成。

12.根据权利要求9所述的基于多孔滤膜的核酸测序装置，其特征在于，所述传感器为选自pH传感器、离子传感器、发光传感器或荧光传感器中的一种。