CN112423887A - 核酸扩增用基板及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种核酸扩增用基板及其制造方法，所述用于快速和精确PCR分析的基板包括：透明基材；形成在透明基材上的金属层；一端退火到金属层表面的N‑杂环卡宾化合物；和固定在所述N‑杂环卡宾化合物的另一端的引物。

Description

核酸扩增用基板及其制造方法

技术领域

本发明涉及核酸扩增用基板及其制造方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法是允许在体外大量扩增DNA或RNA的特定区域的技术。使用这种技术的PCR机器用于在医院、研究中心等中扩增血液中包含的少量DNA，并且该PCR机器还用于诊断包括疟疾、结核病、肝炎等的各种疾病。

PCR通过一个包括变性、退火和延伸三个步骤的循环进行，温度快速升高和降低至与适于每个步骤的温度一致，对于减少PCR反应时间是非常重要的。即，PCR需要温度瞬时变化至与为每个步骤设定的温度一致，但是如果在将温度改变到预设温度的过程中产生时间延迟，则反应速率降低，总PCR反应时间增加，并且存在产生不必要的反应以产生副产物的问题。特别是，减少PCR时间使得能够在最近迅速传播的传染病的现场进行迅速诊断，并且在早期消毒中起到重要作用。

但是，以往使用的PCR装置使用电能作为热能源，为了完成核酸扩增反应需要1小时以上的长时间，并且需要包括加热器和散热器(heat sink)的附件，因此存在装置占用空间大的不便。因此，应用在需要疾病的即时诊断的现场有点不方便。另外，韩国专利公开号2017-0106995公开了基于光能的PCR系统，但是存在的问题在于，PCR在液相中进行，在一个腔中不可能进行多次诊断，并且不可能回收使用的引物。特别是，由于价格高、设备的扩大和检测时间长(1小时或更长)，常规PCR机器不便于携带，并且限制了现场的即时诊断。

因此，用于稳定、快速和精确诊断而与高温和温度的快速变化无关的PCR研究，正在稳定地进行。

[现有技术文献]

(专利文献1)韩国专利公开号2017-0106995

发明内容

技术问题

本发明旨在解决上述问题，并提供一种核酸扩增用基板，其通过使用N-杂环卡宾化合物作为接头将引物固定在金属层的表面上，同时使用通过照射光能产生的热能扩增核酸，从而稳定且快速地进行多重PCR反应。

技术方案

本发明提供一种核酸扩增用基板，其包括透明基材、形成于所述透明基材上的金属层、一端结合至所述金属层表面的N-杂环卡宾化合物和固定于所述N-杂环卡宾化合物另一端的引物。

另外，本发明提供一种核酸扩增用基板的制造方法，其特征在于，在透明基材上形成金属层，在该金属层的表面导入N-杂环卡宾化合物的一端，在该N-杂环卡宾化合物的另一端固定引物。

有益效果

在聚合酶链式反应(PCR)中使用本发明的核酸扩增用基板的情况下，通过在金属层的表面(固相)上退火N-杂环卡宾化合物之后固定引物，与使用通过金属和硫醇(-SH)之间的键的接头的情况相比，PCR反应可以在高温下更稳定并且在非常短的时间内完成。

另外，基于固相(透明基材/金属层)上的PCR反应，容易在PCR反应后回收引物，且可以在每个金属层表面的N-杂环卡宾化合物上固定各种类型的引物，因此，可以同时扩增多种核酸，并且具有进行多重PCR反应的优点。

附图说明

图1是示意性示出使用本发明的核酸扩增用基板的一系列的基于光的PCR反应图。

图2是示意性示出使用本发明的核酸扩增用基板的固相上的基于光的PCR装置图。

图3是示出在本发明的核酸扩增用基板中所含的透明基材上形成的金层的图。

图4是示出根据本发明制造实例1制备的N-杂环卡宾化合物1的¹H-NMR谱图。

图5是示出根据本发明制造实例2制备的N-杂环卡宾化合物2的¹H-NMR谱图。

图6是示出根据本发明制造实例3制备的N-杂环卡宾化合物3的¹H-NMR谱图。

图7是示出根据本发明制造实例4制备的N-杂环卡宾化合物4的¹H-NMR谱图。

图8是示出根据本发明制造实例5制备的N-杂环卡宾化合物5的¹H-NMR谱图。

图9是示出本发明实施例1和2中进行40个循环的PCR反应所需时间的图。

图10是示出根据本发明实施例1的其上键合有N-杂环卡宾化合物4的金层的XPS元素分析结果图。

图11是示意性示出使用本发明的N-杂环卡宾化合物4将引物固定在金层上的一系列过程图。

图12是示意性示出使用本发明的N-杂环卡宾化合物4将引物固定在金层上的一系列过程图。

图13是示出根据本发明实施例的透明基材和形成在透明基材上的金属层的图。

图14是示出根据本发明实施例的透明基材和形成在透明基材上的金属层的图。

图15是示出在本发明的实施例3中进行40个循环的PCR反应所需时间的图。

图16是示出在本发明的实施例1中进行PCR反应后使用荧光物质的检测结果图。

图17是示出在本发明的实施例2中进行PCR反应后使用荧光物质的检测结果图。

图18是示出在本发明的实施例3中进行PCR反应后使用荧光物质的检测结果图。

图19是示出在本发明的比较例1中进行PCR反应后使用荧光物质的检测结果图。

图20是示出根据本发明的实施例的包括金网格的透明基材的图。

图21是示出在包含如图20的金属网的情况下进行40个循环的PCR反应所需时间的图。

图22是示出在本发明的实施例1中进行PCR反应后确认PCR反应结束的电泳结果图。

[符号说明]

10：透明基材 20：金属层 30：热电偶(thermocouple)

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

本发明提供一种核酸扩增用基板，包括：透明基材；形成在透明基材上的金属层；一端键合到金属层表面的N-杂环卡宾化合物；和固定在所述N-杂环卡宾化合物的另一端的引物。

核酸扩增用基板可用于聚合酶链反应(PCR)，其是复制和扩增所需DNA或RNA片段的分子生物学技术。

PCR的第一步是DNA(或RNA)变性(denaturation)的步骤。DNA的两条链可以通过加热而分离，并且每个分离的DNA起到模板的作用。变性温度通常为90℃至96℃，但根据DNA中碱基G+C的量和DNA的长度而变化。PCR的第二步是退火(annealing)步骤。在该步骤中，两种类型的引物(primer)退火至各自的互补模板DNA上。退火温度是决定反应准确性的重要因素，如果温度太高，引物可能退火至DNA上太弱，扩增的DNA产物可能非常小。如果温度太低，引物可能非特异性退火，并且可能扩增不需要的DNA。一般的退火温度为50℃至65℃。PCR的第三步是延伸(elongation)步骤。在该步骤中，耐热的DNA聚合酶(polymerase)在模板DNA中产生新的DNA。如上所述，在PCR反应中有一系列的三个步骤，如果将这三个步骤设定为1个循环，则PCR反应进行约30至40个循环。

可以通过在上述PCR中光能的照射产生热能，将该核酸扩增用基板用于基于光的PCR。

基于光的PCR可以通过金属表面上光子(photon)、电子(electron)和声子(phonon)的相互作用，使用等离子体光热转换。特别是，如果光子从激发的(excited)能量源到达金属层的表面，则发生光吸收，并且表面周围的电子被激发到更高的状态以形成高温的电子。根据这种高温电子向整个金属层的快速扩散和均匀分布，高温金属层可能加热周围的溶液。此外，高温电子可以通过与晶格声子的能量交换而再次冷却。

其中有如上所述激发的等离子体的金属层温度可以升高到最高500℃，并且金属层周围的PCR样品溶液可以在短时间内被加热到150℃或更高。

透明基材可以被制造为使得从位于所形成的金属层的相对表面(countersurface)下方的光源照射的光无损耗地被传递到金属层，并且与金属层之间的粘附性是优异的。

光源并不限于只产生紫外线、可见光或红外线，可以使用卤素灯、LED灯、荧光灯、白炽灯、电弧源灯(arc source lamp)、红外灯、HMI灯、UV灯等，考虑到功率效率和经济可行性，优选使用LED灯。

透明基材可以使用透明材料形成，以透射照射的光，并且可以使用几乎不因光或热而变形的材料形成。优选地，可以使用玻璃基材、塑料基材、硅基材等，但不限于此。

透明基材具有恒定的厚度，并且透明基质的厚度可以是0.1mm至10mm，优选0.5mm至5mm，更优选0.5mm至1.5mm。如果透明基材的厚度满足上述范围，则可以有效地传递由光源照射的光能产生的热能，并且可以优化PCR反应循环。

透明基材可以包括平面型的二维基质，选自球型、半球型、多面体型、多棱镜型或圆柱型的三维基材，或其混合类型。例如，如图13和图14所示，透明基材可包括三维基材的混合类型的基材，其中多面体型基材的至少一个局部表面包括半球型基材。

在透明基质包括如上所述的三维基质的情况下，可以在许多面进行PCR反应，并且优点在于可以同时扩增多种核酸，并且可以进行多重诊断。

核酸扩增用基板可以利用金属层用于利用通过光能照射的热能。在使用金属层的情况下，温度可以立即升高到最高500℃，并且可以迅速地进行PCR循环的温度范围(从约50℃至95℃)内的温度变化。

金属层可以包括金属薄膜。

金属层还可以包括金属网。在金属层还包括金属网的情况下，首先可以在透明基材上形成金属网，然后可以在金属网上形成金属层。在金属层还包括金属网的情况下，与仅使用金属层的情况相比，可以迅速加热和冷却、可以迅速地进行PCR循环的温度变化，并且可以进行更有效的PCR反应。

如图20所示，如果设置金属网，则可以迅速进行PCR循环的温度范围(约50℃至95℃)的温度变化，并如图21所示，可以确认进行40个循环的PCR反应所需的时间非常短，约为7分钟。

在金属层形成在透明基材上的情况下，金属层可以形成在透明基材的至少一个面上。在这种情况下，金属层可以形成在透明基材的至少一个面的整个面上，或者可以部分地形成在透明基材的至少一个面上。即，在透明基材上，可以形成一个金属层，或者可以形成多个金属层。

金属网可以具有二维或三维结构，并且在这种情况下，所述网可以包括多边形图案，包括三角形、四边形、五边形和六边形，或者圆形图案。

在所述网包括多边形图案的情况下，所述网的一边的长度可以是50μm至200μm，并且在所述网包括圆形图案的情况下，所述网的直径可以是50μm至200μm。另外，所述网的网孔的间距可以是1至5μm，特别是1至2μm。金属网的厚度可以是10nm至200nm，特别是100至200nm。在金属网的厚度和网的尺寸满足上述范围的情况下，与仅使用金属层的情况相比，可以进行迅速的加热和冷却，并且可以迅速地进行PCR循环的温度变化。

金属层可以包括从由铜(Cu)、银(Ag)、金(Au)、钯(Pd)、铂(Pt)、铑(Rh)及其组合(例如，双金属纳米颗粒(bimetallic nanoparticles))组成的组中选择的任何一种。优选地，可以包括与N-杂环卡宾化合物具有优异的结合性能和稳定性以及快速光吸收的金。

在透明基质的一侧涂覆金属层的方法可以使用任何涂覆或沉积技术，没有限制，并且透明基材可以通过化学气相沉积(chemical vapor deposition，CVD)、物理气相沉积(physical vapor deposition，PVD)、热蒸发沉积(thermal evaporation deposition)、溅射沉积(sputtering deposition)或原子层沉积(atomic layer deposition，ALD)的方法形成为均匀厚度。

金属层的厚度可以是10nm至200nm。如果金属层的厚度大于该范围，则存在的问题在于，在固定接头的步骤期间金属层可能被损坏，或者可能接头形成得不均匀。

图3示出了在透明基材上形成的金层。

作为用于将引物固定在金属层表面上的接头，可以使用N-杂环卡宾化合物。N-杂环卡宾化合物可以通过金属–卡宾键引入到金属层的表面上。

特别是，在常规固相PCR中使用的具有硫醇(thiol：-SH)基团的接头的情况下，由于在高温(约90℃)下金属–硫键的不稳定性(金属–硫键的断裂)，存在降低PCR反应结果的再现性的问题。相反，在使用N-杂环卡宾化合物作为将引物固定到金属层上的接头的情况下，尽管由于光源，金属层的表面温度暂时升高到最高500℃，但是由于金属–卡宾键，可以实现高温下的稳定性，并且可以将其应用于使用光能的PCR仪。

N-杂环卡宾化合物可以由下面的化学式1或2表示。

[化学式1]

[化学式2]

在化学式1和2中，

R1、R2、R5和R6相同或不同，各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基、3至20个碳原子的环烷基、6至30个碳原子的芳基或2至30个碳原子的杂芳基，

R3、R4、R7、R8、R9和R10相同或不同，各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基、3至20个碳原子的环烷基、6至30个碳原子的芳基、2至30个碳原子的杂芳基或由以下化学式3表示的结构，其中R7至R10中相邻的两个或更多个取代基键合形成烃环，

R3和R4中至少一个是由以下化学式3表示的结构，和

R7至R10中至少一个被由以下化学式3表示的结构取代，或者在R7至R10中相邻的两个或更多个取代基键合形成烃环的情况下，形成所述烃环的碳原子中至少一个被由以下化学式3表示的结构取代，

[化学式3

在化学式3中，

n是括号内单元的重复数，且是1至30的整数，和

A是1至20个碳原子的含氮(N)烷基或2至30个碳原子的含氮杂芳基。

R1、R2、R5和R6可以相同或不同，并且可以各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基或6至30个碳原子的芳基。

R1、R2、R5和R6可以相同或不同，并且可以各自独立地为氢、1至10个碳原子的烷基或6至10个碳原子的芳基。

R1、R2、R5和R6可以相同或不同，并且可以各自独立地为氢或1至10个碳原子的烷基。

R1、R2、R5和R6可以相同或不同，并且可以各自独立地为氢、异丙基或苄基。

R1和R2中至少一个与R5和R6中至少一个可以相同或不同，并且可以各自独立地为1至20个碳原子的烷基或6至30个碳原子的芳基。

R1和R2中至少一个与R5和R6中至少一个可以相同或不同，并且可以各自独立地为异丙基或苄基。

R3、R4、R7、R8、R9和R10可以相同或不同，并且可以各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基、3至20个碳原子的环烷基、6至30个碳原子的芳基、2至30个碳原子的杂芳基或化学式3表示的结构，或者R7至R10中的两个或更多个相邻取代基可以键合形成烃环。

R3、R4、R7、R8、R9和R10可以相同或不同，并且可以各自独立地为氢或由化学式3表示的结构，或者R7至R10中的两个或更多个相邻取代基可以键合形成烃环。

在R7至R10中两个或多个相邻的取代基键合形成烃环的情况下，形成烃环的至少一个碳可被化学式3表示的结构取代。

R3和R4中至少一个可以是由化学式3表示的结构。此外，R7至R10中至少一个可以是由化学式3表示的结构。

n是括号内单元的重复数，可以是1至30的整数，优选1至10，更优选1至3。

A是1至20个碳原子的含氮烷基，或2至30个碳原子的含氮杂芳基。特别地，A可以是叠氮化物(azide)、邻苯二甲酰亚胺(phthalimide)或胺(amine)。

在本发明中，“相邻”基团可以指与相应取代基被取代的元素直接偶联的取代基、空间上最接近相应取代基的取代基、或在相应取代基被取代的元素处被取代的另一个取代基。例如，在苯环的邻位(ortho)取代的两个取代基，和在脂族环中的相同碳原子上取代的两个取代基可以被解释为“相邻”基团。

烷基可以是直链或支链，碳数可以是1至20，优选1至10，更优选碳数可以是1至6。烷基的具体实例可以包括甲基、乙基、丙基、正丙基、异丙基、丁基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、1-甲基丁基、1-乙基丁基、戊基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、4-甲基-2-戊基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、庚基、正庚基、1-甲基己基、环戊基甲基、环己基甲基、辛基、正辛基、叔辛基、1-甲基庚基、2-乙基己基、2-丙基戊基、正壬基、2,2-二甲基庚基、1-乙基丙基、1,1-二甲基丙基、异己基、4-甲基己基、5-甲基己基、苄基等，但不限于此。

环烷基可以具有3至20个碳原子，优选3至10个碳原子。环烷基的具体实例可以包括环丙基、环丁基、环戊基、3-甲基环戊基、2,3-二甲基环戊基、环己基、3-甲基环己基、4-甲基环己基、2,3-二甲基环己基、3,4,5-三甲基环己基、4-叔丁基环己基、环庚基、环辛基等，但不限于此。

芳基可以具有6至30个碳原子，优选6至10个碳原子。芳基可以是单环芳基或多环芳基。单环芳基的具体实例可以包括苯基、联苯基、三联苯基等，多环芳基的具体实例可以包括萘基、蒽基、菲基、芘基、苝基、屈苯基、芴基、三亚苯基等，但不限于此。

杂芳基是包括选自N、O、P、S、Si和Se中的一种或多种作为杂原子的芳环基，并且碳数可以是2至30，优选2至20。杂芳基的具体实例可以包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、噁二唑基、三唑基、吡啶基、嘧啶基、三嗪基、三唑基、吖啶基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、异喹啉基、吲哚基、咔唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并咔唑基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、苯并呋喃基等，但不限于此。

另外，烷基、环烷基、芳基、杂芳基或烃环可以进一步被烷基、环烷基、芳基或杂芳基取代或未取代。

在金属层的表面上，可以键合N-杂环卡宾化合物的一端，在这种情况下，可以通过化学气相沉积、物理气相沉积、热蒸发沉积、溅射沉积、原子层沉积或化学浴沉积(chemical-bath deposition，CBD)的方法形成金属–卡宾键。

根据本发明的一个实施例，通过化学气相沉积法将N-杂环卡宾化合物的一端键合到金属层表面的一系列机理如图11所示，通过化学浴沉积法将N-杂环卡宾化合物的一端键合到金属层表面的一系列机理如图12所示。

在N-杂环卡宾化合物的另一端，可以结合和固定引物。

N-杂环卡宾化合物的另一端可以用叠氮化物、邻苯二甲酰亚胺或胺官能化。

如果N-杂环卡宾化合物的另一端用叠氮化物、邻苯二甲酰亚胺或胺官能化，则可以使用点击反应(click reaction)将引物结合到叠氮化物、邻苯二甲酰亚胺或胺，如图11和12所示。因此，与通常通过静电吸引使引物与金属层结合相反，引物可以通过更强的化学键固定在金属层上，并且如果用于高温的固相PCR反应，可以实现优异的稳定性、改善的可储存性和易于储存的效果。

引物可以是至少一种类型的引物。至少一种类型的引物可以指选自可以与不同的扩增靶模板DNA(或RNA)形成互补键的引物中的任何一种。

引物可以是两种或更多种不同类型的引物。在引物是两种或多种不同类型的引物的情况下，一对引物中的任何一个可以与待扩增的第一模板DNA(或RNA)形成互补键，一对引物中的任何一个可以与待扩增的第二模板DNA(或RNA)形成互补键。这里，第一模板DNA(或RNA)和第二模板DNA(或RNA)可以指具有不同碱基序列的DNA(或RNA)。

如上所述，通过将能够延伸不同模板DNA(或RNA)的引物固定到N-杂环卡宾化合物的另一端，所述N-杂环卡宾化合物结合到金属层的表面上，可以同时扩增多种DNA(或RNA)，并且可以在一个腔中进行通过多个PCR反应的诊断。

本发明还提供一种核酸扩增用基板的制造方法，其包括：在透明基材上形成金属层；将氮杂环卡宾化合物的一端引入到金属层表面；将引物固定在氮杂环卡宾化合物的另一端。

图1是使用本发明的核酸扩增用基板的基于光的PCR反应的一系列工序的示意图。

使用本发明的核酸扩增用基板进行基于光能PCR反应的方法的概略说明如下，但PCR反应并不仅限于下述方法。

制备含有扩增靶模板DNA、dNTP、Taq聚合酶等的PCR样品。制备与模板DNA互补结合的两种类型的引物(正向引物、反向引物)。正向引物的一部分通过与作为本发明的核酸扩增用基板的透明基材/金属层/N-杂环卡宾化合物接头的末端结合而被固定，其余的正向引物和反向引物包含在PCR反应样品中。然后，通过位于透明基材下的光源(LED等)照射光能，进行PCR反应。

在使用硫醇(-SH)基团作为接头通过金属–硫键将引物固定在金属层表面上的常规PCR基板中，存在的问题是金属–硫键在高温(约90℃或更高)下是容易的，并且接头容易分离。因此，不可能将其应用于基于光能的PCR，其中光能导致的表面温度通过该PCR升高到500℃，并且其仅可能应用于使用从电能转换的热能的PCR机器。

然而，在使用本发明的核酸扩增用基板进行PCR反应的情况下，N-杂环卡宾化合物作为接头附着在金属层的表面(固相)上，然后固定引物，并因此，高温下的稳定性优于金属和硫醇(-SH)之间的键的接头，因此，可以应用于使用由光能转化的热能的PCR机器，通过光能的照射可以迅速控制金属层的温度，并且PCR反应可以在非常短的时间内完成，对于40个循环的PCR反应，该时间为约12分钟至15分钟。

此外，如上所述，由于通过使用至少一种类型的引物(或两种不同类型的引物)可以同时扩增多种核酸，因此具有可以进行多重PCR反应和可以提供更精确诊断的优点。另外，与仅在液相中进行的PCR不同，在PCR反应后，可以容易地回收扩增核酸用的基板，并且引物的保存容易，可以再生。

以下，将参照优选实施例更详细地解释本发明。

然而，这些实施例用于更具体地解释本发明，并且本发明的范围不限于此。

〈制造实例〉

〈制造实例1〉

根据上述反应，制备N-杂环卡宾化合物1。

在图4中，示出了N-杂环卡宾化合物1的¹H-NMR谱图。

〈制造实例2〉

根据上述反应，制备N-杂环卡宾化合物2。

在图5中，示出了N-杂环卡宾化合物2的¹H-NMR谱图。

〈制造实例3〉

根据上述反应，制备N-杂环卡宾化合物3。

在图6中，示出了N-杂环卡宾化合物3的¹H-NMR谱图。

〈制造实例4〉

根据上述反应，制备N-杂环卡宾化合物4。

在图7中，示出了N-杂环卡宾化合物4的¹H-NMR谱图。

〈制造实例5〉

根据上述反应，制备N-杂环卡宾化合物5。

在图8中，示出了N-杂环卡宾化合物5的¹H-NMR谱图。

〈实施例〉

〈实施例1〉

肺癌细胞系A549的cDNA作为模板DNA使用，并且制备包括dNTP、Taq聚合酶、下述反向引物和下述正向引物的，液相PCR反应物。

使用制造例4中得到的N-杂环卡宾化合物4，下述正向引物被固定在在通过CVD法在平面型玻璃基材上形成的金(Au)层的表面。将固定有正向引物的基板投入含有较少量正向引物的液相PCR反应液中，使用图2的装置进行40个循环的PCR反应。进行40个循环的PCR反应所需的时间如图9所示，将5μl的PCR反应产物上样于1wt％的琼脂糖凝胶，在100V和20分钟的条件下进行电泳(Geneomibase公司的Mupid 2Plus)。与常规RT PCR反应产物相比，通过图22确认了使用本发明的PCR基板的PCR反应的完成。

[固相基材上固定的引物]

-正向引物：5′-氨基(C12)-TTTTTTTTTTGACCCAATCATGAGCACTGCTTT-3′

[液相PCR反应物中的引物]

-正向引物：5′-GACCCAATCATGAGCACTG-3′

-反向引物：5′-TGAAGCGACCCTCTGATG-3′

〈实施例2〉

在实施例1中，除了使用NCI-H-1975的突变肺癌细胞系cDNA代替肺癌细胞系A549的cDNA作为模板DNA外，通过与实施例1相同的方法进行PCR反应。

〈实施例3〉

在实施例1中，除了使用图13和图14中的六面体玻璃基材代替平面型玻璃基材外，通过与实施例1相同的方法进行PCR反应。

〈比较例1〉

除了不使用模板DNA进行PCR反应以外，与实施例1同样地进行PCR反应。

将实施例1至3和比较例1的PCR产物用EtBr处理，测定荧光，结果示于图16至图19。

根据图19，在不使用模板DNA、不进行PCR反应的比较例1中，不产生荧光。相反，根据图9、图16和图17，在使用A549细胞系和NCI-H-1975细胞系的cDNA作为模板的实施例1和2中，在大约15分钟的短时间内，在实施例1和2中都产生了足够的PCR产物，并且确认荧光的产生。

根据图15和图18，在使用六面体玻璃基材的实施例3中，在约8至9分钟内产生足够的PCR产物，并确认荧光的产生。

以上，仅对本发明的实施方式进行了详细说明，但在本发明的技术范围内，各种变更、修正对本领域技术人员来说是显而易见的，当然这些变更、修正包含在权利要求书中。

Claims (16)

1.一种核酸扩增用基板，包含：

透明基材；

形成在所述透明基材上的金属层；

一端键合到所述金属层表面的N-杂环卡宾化合物；以及

固定在所述N-杂环卡宾化合物另一端的引物。

2.根据权利要求1所述的核酸扩增用基板，其中，所述透明基材是选自，平面型的二维基材，球型、半球型、多面体型、多棱镜型和圆柱型的三维基材，及其混合物类型，中的至少一种基材。

3.根据权利要求1所述的核酸扩增用基板，其中，所述金属层还包括金属网。

4.根据权利要求1所述的核酸扩增用基板，其中，所述金属层包括金。

5.根据权利要求1所述的核酸扩增用基板，其中，所述N-杂环卡宾化合物的另一端被叠氮、邻苯二甲酰亚胺或胺官能化。

6.根据权利要求1所述的核酸扩增用基板，其中，所述N-杂环卡宾化合物由以下化学式1或2表示：

[化学式1]

[化学式2]

在化学式1和2中，

R1、R2、R5和R6相同或不同，并各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基、3至20个碳原子的环烷基、6至30个碳原子的芳基或2至30个碳原子的杂芳基，

R3、R4、R7、R8、R9和R10相同或不同，并各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基、3至20个碳原子的环烷基、6至30个碳原子的芳基、2至30个碳原子的杂芳基或由以下化学式3表示的结构，其中R7至R10中相邻的两个或更多个取代基键合形成烃环，

R3和R4中至少一个是由以下化学式3表示的结构，和

R7至R10中至少一个被由以下化学式3表示的结构取代，或者在R7至R10中相邻的两个或更多个取代基键合形成烃环的情况下，形成所述烃环的碳原子中至少一个被由以下化学式3表示的结构取代：

[化学式3]

在化学式3中，

n是括号内单元的重复数，且是1至30的整数，和

A是1至20个碳原子的含氮烷基或2至30个碳原子的含氮杂芳基。

7.根据权利要求1所述的核酸扩增用基板，其特征在于：所述引物是至少一种引物。

8.一种制造核酸扩增用基板的方法，包括：

在透明基材上形成金属层；

将氮杂环卡宾化合物的一端引入到所述金属层表面；以及

将引物固定在所述氮杂环卡宾化合物的另一端。

9.根据权利要求8所述的核酸扩增用基板的制造方法，其中，所述透明基材包含选自，平面型的二维基质，球型、半球型、多面体型、多棱镜型和圆柱型的三维基材，及其混合物类型，中的至少一种基材。

10.根据权利要求8所述的核酸扩增用基板的制造方法，其中，所述金属层还包括金属网。

11.根据权利要求8所述的核酸扩增用基板的制造方法，其中，所述N-杂环卡宾化合物的所述一端通过金属–卡宾键导入到所述金属层的表面。

12.根据权利要求8所述的核酸扩增用基板的制造方法，其中，所述N-杂环卡宾化合物的所述另一端被叠氮、邻苯二甲酰亚胺或胺官能化。

13.根据权利要求8所述的核酸扩增用基板的制造方法，其中，通过点击反应将所述引物固定在所述N-杂环卡宾化合物的所述另一端。

14.根据权利要求8所述的核酸扩增用基板的制造方法，其中，所述金属层包括金。

15.根据权利要求8所述的核酸扩增用基板的制造方法，其中，所述N-杂环卡宾化合物由以下化学式1或2表示：

[化学式1]

[化学式2]

在化学式1和2中，

R1、R2、R5和R6相同或不同，并各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基、3至20个碳原子的环烷基、6至30个碳原子的芳基或2至30个碳原子的杂芳基，

R3、R4、R7、R8、R9和R10相同或不同，并各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基、3至20个碳原子的环烷基、6至30个碳原子的芳基、2至30个碳原子的杂芳基或由以下化学式3表示的结构，其中R7至R10中相邻的两个或更多个取代基键合形成烃环，

R3和R4中至少一个是由以下化学式3表示的结构，和

R7至R10中至少一个被由以下化学式3表示的结构取代，或者在R7至R10中相邻的两个或更多个取代基键合形成烃环的情况下，形成所述烃环的碳原子中至少一个被由以下化学式3表示的结构取代：

[化学式3]

在化学式3中，

n是括号内单元的重复数，且是1至30的整数，和

A是1至20个碳原子的含氮烷基或2至30个碳原子的含氮杂芳基。

16.根据权利要求8所述的核酸扩增用基板的制造方法，其中，所述引物是至少一种引物。

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