KR20230141623A - 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포획항체에 부착되는 형광분자와 검출항체에 부착되는 형광분자를 이용하여 바이오마커를 용이하게 검출할 수 있는 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 기판; 상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 제1 형광물질이 표지된 포획항체; 및 상기 포획항체에 부착되는 항원과 결합할 수 있으며, 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 포함하되, 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 상이한 피크파장을 가지는 형광을 발산하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트를 제공한다.

Description

위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트{Antigen detection method and kit with false positive signal removed}
본 발명은 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포획항체에 부착되는 형광분자와 검출항체에 부착되는 형광분자를 이용하여 바이오마커를 용이하게 검출할 수 있는 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트에 관한 것이다.
종래 면역분석(immunoassay)에 있어서, 포획항체를 이용하여 항원을 기판 표면에 고정하고, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP) 또는 형광물질 등이 표지되어 있는 검출항체를 항원과 결합시킨 후 HRP에 의한 버퍼의 색깔 변화 또는 형광물질의 밝기 등을 이용해 항원의 양을 측정하는 방법이 자주 사용되어 왔다.
하지만 검출항체는 항원으로 사용되는 바이오마커에 특이적으로 결합하는 것이 대부분이지만, 일부 검출항체의 경우 세척에 의하여 완전히 기판에서 제거되지 않거나 비특이적 결합에 의해 기판 표면과 같이 항원이 아닌 다른 곳에 결합할 수 있으며, 그 결과 위양성(false positive) 신호로 나타나 측정된 항원의 양을 부정확하게 만들 수 있다.
이런 위양성 신호는 시료 내에 항원(바이오마커)의 양이 많은 경우는 무시할 수 있지만, 바이러스 항원 검출 등 항원의 양이 적은 경우에는 큰 오차를 발생시킬 수 있는 문제가 있다. 도 1은 종래 면역분석에 있어서 발생할 수 있는 위양성 문제를 나타내는 도면이다. 특히 이러한 위양성 신호의 경우 바이러스성 질환 또는 암진단과 같이 항원의 양이 극히 적은 질병을 진단할 때 진단의 정확도를 떨어트리는 요인으로 작용할 수 있다.
따라서 항원의 양이 적을 경우 다량의 채혈에 따른 피검자의 심리적, 신체적 부담을 줄이고 진단의 정확성을 높이기 위해 높은 민감도를 가지면서 위양성 신호가 없는 신규한 기술의 개발이 요구된다.
미국공개특허 제20030190760호, "Reducing non-specific binding in immunoassays performed on polymeric solid phases" (공개일: 2003.10.9) 미국등록특허 제8445293호, "Method to increase specificity and/or accuracy of lateral flow immunoassays" (등록일: 2013.05.21)
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 포획항체에 부착되는 형광분자와 검출항체에 부착되는 형광분자를 이용하여 바이오마커를 용이하게 검출할 수 있는 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트를 제공하고자 한다.
상술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 기판; 상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 제1 형광물질이 표지된 포획항체; 및 상기 포획항체에 부착되는 항원과 결합할 수 있으며, 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 포함하되, 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 상이한 피크파장을 가지는 형광을 발산하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 하나 이상의 여기광에 의하여 동시에 발광되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 발광스펙트럼의 일부가 오버랩되어 있는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항원 검출용 키트; 및 상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분석하는 형광현미경을 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 형광현미경은, 상기 항원 검출용 키트가 설치되는 대물부; 상기 대물부에 여기광을 공급하는 광원부; 및 상기 여기광에 의하여 발산되는 형광을 분석하는 검출부를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출부는 상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분광시키는 분광수단을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출부는 상기 분광된 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 비교하여 항원의 위치를 검출할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출부는, 1개 이상의 다이크로익 미러; 및 1개 이상의 검출수단을 포함하여 형광의 색상에 따른 화상을 각각 제공하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출부는 상기 형광의 색상에 따른 화상에서 각 형광의 위치를 비교하여 항원의 위치를 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 제1 형광물질이 표지된 포획항체를 준비하는 단계; (b) 상기 제1 형광물질과 상이한 피크파장을 가지는 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 준비하는 단계; (c) 항원을 포함하는 시료를 도입하여, 상기 항원, 상기 포획항체 및 상기 검출항체 간에 항원-항체 반응을 유도하는 단계; (d) 여기광을 공급하여 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질을 발광시키는 단계; 및 (e) 상기 제1형광물질 및 상기 제2 형광물질에서 발생되는 형광을 분석하여 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계는, 상기 형광을 분광시켜 각 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 판독하는 단계; 또는 상기 형광을 색상에 따라 분리하여 각 색상에 따른 화상을 형성하며, 상기 화상에서 각 형광의 위치를 비교하여 판독하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 포획항체는 상기 항원과 결합되기 이전 또는 상기 항원과 결합된 이후 기판에 부착되는 것일 수 있다.
본 발명에 의한 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트는 포획항체 및 검출항체에 형광물질을 직접 부착하고 있으므로, 취급이 간편하고 제작이 용이한 항원 검출용 키트를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 경우 발생되는 형광을 분광학적 분석방법을 이용하여 위양성을 구분함에 따라 기존의 방법에 비하여 빠르고 정확하게 위양성을 판독할 수 있다.
도 1은 종래의 면역 분석에 있어서 발생할 수 있는 위양성 분제를 나타낸 것이다.
도 2는 형광물질이 부착된 항체를 이용한 면역 분석에 있어서 위양성이 발생할 수 있는 경우를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광물질의 흡수스펙트럼과 발광스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 항원 검출 시스템의 구성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 분광수단을 이용하여 관찰된 시료의 형광을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 식별필터를 이용하여 스펙트럼의 일부가 차단되는 원리를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 시료의 형광을 나타낸 것으로 (a)는 분광되기이전, (b)는 식벽필터를 통과하고 분광된 이후를 각각 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 항원 검출 시스템의 다른 구성을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광이 관찰된 것을 나타낸 것으로 각각의 색상에 따라 상이한 카메라에서 촬영된 것을 각각 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 사용된 형광체인 CF532와 Alexa Fluor 594의 발광스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의한 분광을 이용한 시료관찰이미지를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광색상에 따른 시료관찰이미지를 나타낸 것이다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
본 명세서에서, '및/또는' 이라는 용어는 복수의 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다. 본 명세서에서, 'A 또는 B'는, 'A', 'B', 또는 'A와 B 모두'를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "바이오마커"는 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인할 수 있는 생체물질을 모두 포함한다.
본 명세서에서 "도너"는 빛을 받아 여기되면 에너지를 전달하는 형광물질을 의미하고, 2 이상의 형광물질이 인접하는 경우, 상대적으로 짧은 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광물질을 의미한다.
본 명세서에서 "억셉터"는 여기상태의 도너로부터 에너지를 전달받는 형광물질을 의미하고, 2 이상의 형광물질이 인접하는 경우, 상대적으로 긴 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광물질을 의미한다.
최근 단분자 형광현미경 기술의 개발로 분자를 하나씩 관찰할 수 있게 되었고 이를 바이오마커 검출에 적용함으로써 민감도는 fg/ml 수준으로 1000배 가량 증가하게 되었다(Nature 473, 484-488, 2011). 통상적으로 사용하는 형광 이미징에서는 관찰하려는 분자에 형광물질을 고정하여, 서로 다른 종류의 바이오마커를 형광신호를 이용해 구분하는 방법을 사용한다. 이때 각각 서로 다른 색의 형광물질을 고정하고 색깔 차이를 이용해 바이오마커의 종류를 구분하는 방법을 사용하나, 통상의 이미지 센서로 구분하여 관찰할 수 있는 형광물질의 종류는 3~4가지 정도이다.
따라서, 단분자 형광현미경 기술을 사용할 경우, 민감도는 fg/ml로 기존 방법에 비해 1000배 가량 증가하나 검출할 수 있는 바이오마커의 종류는 여전히 3~4 가지 정도로 제한된다.
한편, 단분자 형광현미경의 높은 민감도를 유지하면서 다양한 타겟 물질을 동시에 검출하는 방법으로서, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)에 기초한 DNA-PAINT 기술인 FRET-PAINT 기술이 제공된다. FRET이란 최초에 여기된 도너(donor)의 여기된 상태의 에너지가 억셉터(acceptor)로 전달되는 현상을 의미한다. 도너 물질은 일반적으로 억셉터 물질에 비해 더 짧은 파장의 빛을 방출하게 되는데, 이때의 방출 파장은 억셉터의 흡수 파장과 중첩(spectral overlap)된다. 에너지 전달 속도와 효율은 도너의 방출 파장과 억셉터의 흡수 파장의 중첩의 정도, 도너의 양자 효율, 도너와 억셉터의 전이 쌍극자의 상대적인 배열 정도, 그리고 도너와 억셉터 사이의 거리 등에 의존하게 된다.
예를 들어 FRET-PAINT 기술에 따르면, 도킹스트랜드에 두 가지 DNA 결합 자리들을 가질 수 있으며, 각각 도너스트랜드 및 억셉터스트랜드를 위한 자리가 될 수 있다. 단일 분자 국지화(single-molecule localization)를 위해서 억셉터의 FRET 신호가 사용된다. FRET-PAINT 기술을 사용하면 억셉터가 직접 여기되지 않고 FRET에 의해 여기되어 이미저(도너 및 억셉터) 농도를 수십~수백배 높일 수 있으므로 DNA-PAINT에 비해 이미징 스피드가 수십~수백 배 향상될 수 있다. (대한민국 등록특허 제2195625호))
하지만 이러한 FRET를 이용한 기술의 경우 FRET쌍을 형성하기 위하여 항체를 특정한 형상을 가지도록 가공해야 하므로 항체의 제조에 많은 비용이 발생될 수 있다. 또한 상기와 같이 가공된 항체의 경우 그 안정성이 떨어질 수 있으며, 이에 따라 보관 및 운반에 어려움을 가질 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 경우 항체에 직접 형광물질을 포함시킴에 따라 항체의 제조가 용이할 뿐만 아니라 항체의 안정성 까지 향상되는 효과를 가져올 수 있다. 다만 항체에 형광체를 포함시키는 경우 항원과 부착된 항체를 구분하는 방법이 필요하며 본 발명의 경우 분광학적인 분석방법을 이용하여 상기 항원과 부착된 항체만을 식별하는 것이 가능하다.
이를 상세히 살펴보면 검출항체에 형광물질이 표지된 경우 항원에 부착된 검출항체가 형광을 발산하여 식별될 수 있다. 하지만 상기 검출항체는 상기 항원에 특이적으로 결합될 뿐만 아니라 기판에도 비특이적으로 결합될 수 있어 위양성을 나타내는 경우가 발생한다(도 1 참조).
이를 개선하기 위하여 검출항체 뿐 아니라 포획항체에도 형광물질을 표지하여 분석할 수 있다. 이 경우 검출항체와 포획항체 모두 기판에 비특이적으로 결합할 수 있다. 동일한 위치에서 검출항체에 표지된 제1 형광물질과 포획항체에 표지된 제2 형광물질이 동시에 검출되는 경우에만 진양성임을 알 수 있다(도 2 참조).
이에 본 발명의 경우 분광학적인 방법을 이용하여 항원에 부착된 항체를 식별하는 것으로 비특이적 결합에 의한 위양성을 제거할 수 있는 항원 검출용 키트를 제공할 수 있다.
따라서 본 발명은 기판; 상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 제1 형광물질이 표지된 포획항체; 및 상기 포획항체에 부착되는 항원과 결합할 수 있으며, 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 포함하되, 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 상이한 피크파장을 가지는 형광을 발산하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 기판은 타겟 항원을 포획하고 관찰하기 위한 영역으로 그 형태는 특별히 제한되지 않으나, 평판, 구형 입자, 막대형 구조, 및 기타 비정형 구조의 형태를 가질 수 있으며 그 재질도 유리, 석영, 플라스틱 등으로 이루어질 수 있다. 상기 기판은 통상 유리 재질로 된 평판 형태의 슬라이드 글라스나 커버슬립일 수 있다. 바람직하게는 상기 기판은 #1 또는 #1.5 커버슬립일 수 있다. 상기 기판은 상기 포획항체를 부착할 수 있도록 폴리에틸렌글리콜-비오틴(PEG-Biotin)과 같은 유기물로 표면처리된 것일 수 있다.
상기 기판은 비특이적 결합은 방지하되 포획항체는 특이적으로 결합할 수 있도록 처리되어 있을 수 있다, 이때 비특이적 결합 방지를 위하여 상기 기판의 표면은 폴리에틸렌글리콜, BSA 등이 코팅될 수 있으며, 포획항체의 특이적 결합 유도하기 위하여 비오틴-폴리에텔린글리콜, 비오틴-BSA, Anti-DIG 항체 등을 코팅할 수 있다.
상기 포획항체는 바이러스나 바이오마커와 같은 항원을 특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 항체로서, 상기 포획항체의 표면에 비오틴(biotin)을 도입하고 상기 기판에는 비오틴과 결합하는 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘(strepavidin)을 도입하여 상기 포획항체를 상기 기판에 부착시킬 수 있다. 상기 검출항체는 상기 포획항체에 결합되어 있는 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다.
본 명세서에서 상기 포획항체와 검출항체로서 사용되는 '항체'는 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어, 가변 영역 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서의 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하고, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), 나노바디(nanobody) 또는 scFv를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 scFv, Fab, 나노바디(nanobody) 및 면역글로불린 분자일 수 있다. 본 명세서에서 “항체”는 면역글로불린 외에도 타겟 물질과 특이적 결합을 할 수 있어 상기 항체와 동일한 기능을 할 수 있는 핵산, 핵산 유사체, 펩타이드로 구성된 압타머(aptamer)를 포함한다.
상기 형광물질은 자외선, 전기에너지, 열에너지 등의 외부 에너지에 의해 여기되어 그 에너지를 빛으로 바꾸는 물질로서, 유기 형광체 또는 무기 형광체를 포함할 수 있다. 상기 유기 형광체의 예는 로다민(Rhodamine), 알렉사(Alexa) Fluor dye, 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), FAM(5-carboxy fluorescein), ATTO dye, BODIPY, CF dye, Cyanine(Cy) dye, DyLight Fluor 및 텍사스 레드(Texas Red)일 수 있고, 상기 무기 형광체의 예는 양자점을 들 수 있다.
본 발명의 형광물질의 경우 상기 포획항체 및 상기 검출항체에 포함될 수 있다. 즉 상기 포획항체에는 제1 형광물질이 표지될 수 있으며, 상기 검출항체에는 제2 형광물질이 표지될 수 있다.
이때 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질을 상이한 피크파장을 가지는 것이 바람직하다. 형광물질은 여기광이 공급되는 경우 각 형광물질의 종류에 따른 각각의 발광스펙트럼을 가질 수 있다. 이때 상기 발광스펙트럼 중 가장 높은 광량을 보이는 부분을 피크파장이라 한다. 따라서 상기 형광물질을 구분하기 위하여 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질은 상이한 피크파장을 가지는 것이 바람직하다(도 3참조).
다만 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질의 경우 발광스펙트럼의 일부가 오버랩되어 있는 것이 바람직하다. 상기 제1형광물질 및 상기 제2 형광물질을 여기시키기 위해서는 여기광을 필요로 한다. 이때 상기 제1형광물질과 상기 제2 형광물질의 발광피크가 떨어져 있는 경우 상기 제1형광물질과 상기 제2형광물질의 흡수 스펙트럼 역시 오버랩되는 부분이 없을 수 있다. 이 경우에는 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질을 동시에 발광시키기 위해서는 2개의 여기광을 사용해야만 한다.
하지만 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질의 발광스펙트럼 일부가 오버랩되어 있는 경우 일반적으로는 각각의 흡수스펙트럼 역시 오버랩되어 있으며, 따라서 1개의 여기광을 이용하는 경우에도 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질을 동시에 발광시키는 것이 가능하다. 다만 각각의 형광을 독립적으로 관찰하는 것이 필요하거나 각각의 항체에 사용되는 형광물질이 지정되어 있는 경우 2개의 여기광을 이용하여 발광시키는 것도 가능하다(도 3 참조).
상기와 같이 1개의 여기광을 이용하여 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질을 동시에 발광시키는 경우 상기 항원에 부착되어 있는 항체(특이적 결합)와 항원에 부착되어 있지 않은 항체(비특이적 결합)의 구별이 어려울 수 있다(도 2 참조). 특히 상기 포획항체의 경우 상기 기판에 부착되는 항체이므로 상기 항원이 없는 경우에도 상기 기판에 부착되어 발광을 수행할 수 있다. 아울러 상기 기판에 비특이적으로 결합된 포획항체 역시 발광을 수행하게 되므로 위양성을 구분할 수 없다는 단점을 가지고 있다(도 2 참조).
이에 본 발명의 경우 상기 제1 형광물질 및 상기 제2형광물질에서 발생되는 형광을 분광학적으로 분석하여 상기 항원이 부착된 항체만을 구분하는 시스템 및 방법을 제공한다.
따라서 본 발명의 다른 관점에서 상기 항원 검출용 키트; 및 상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분석하는 형광현미경을 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템을 제공한다.
상기 형광현미경은, 상기 항원 검출용 키트가 설치되는 대물부; 상기 대물부에 여기광을 공급하는 광원부; 및 상기 여기광에 의하여 발산되는 형광을 분석하는 검출부를 포함할 수 있다.
상기 대물부(100)는 상기 항원검출용 키트(110)가 안착되어 관찰이 용이하도록 고정되는 부분으로, 상기 항원검출용 키트(110)를 고정하기 위한 고정 수단을 포함하고 있으며 상기 항원검출용 키트(110)에 여기광을 공급함과 동시에 상기 항원검출용 키트(110)에서 발광되는 형광을 수집/확대하기 위한 대물렌즈(120)가 설치될 수 있다. 또한 다이크로익 미러(130)가 설치되어 상기 광원부(200)에서 공급되는 여기광을 반사하여 상기 항원검출용 키트방향으로 공급함과 동시에 상기 항원검출용 키트(110)에서 발생되는 형광을 투과하여 상기 검출부로 전달할 수 있다(도 4 참조).
상기 다이크로익(Dichroic mirror) 미러(130)는 특정 파장대역의 빛을 반사하고 나머지 파장대역의 빛은 투과시키는 거울의 일종으로 본 발명의 경우 상기 여기광을 반사하면서도 상기 형광을 투과시키는 다이크로익 미러를 이용하여 상기 여기광의 반사와 상기 형광의 투과를 동시에 수행할 수 있다.
상기 광원부(200)는 상기 시료의 형광체를 여기시키기 위한 여기광을 발생시키는 부분으로, 상기 시료에 필요한 여기광만을 공급하기 위하여 여기광 필터(220)가 설치될 수 있다. 상기 여기광 필터(220)는 상기 광원부의 광원(210)에서 공급되는 빛 중 상기 시료에 부착되어 있는 형광체를 여기 시킬 수 있는 파장의 빛만을 투과시키는 필터일 수 있다. 또한 상기 여기광 필터(220)는 다양한 파장의 여기광을 형성할 수 있도록 교체식으로 부착되는 것이 바람직하다.
상기 광원(210)은 상기 여기광의 파장을 포함할 수 있는 빛이라면 제한 없이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 연색성이 높은 백색 발광소자가 사용될 수 있다. 상기 고연색 백색 발광소자는 가시광 전역에 걸쳐 매끄러운 발광 스펙트럼이 분포되어 있으며, 또한 여기광으로 많이 사용되는 자외선 영역까지 이러한 스펙트럼이 이어지도록 발광되고 있어 태양광과 유사한 발광 패턴을 가지고 있다. 이 고연색 발광소자의 경우 다양한 발광체와 형광체를 혼합하여 발광을 수행하고 있으므로 상기 여기광 필터(220)를 이용하여 원하는 스펙트럼의 여기광을 형성할 수 있다. 특히 기존에 사용되는 광원의 경우 좁은 영역의 스펙트럼을 가지는 빛 만을 공급하고 있어 광원에서 공급되는 스펙트럼 외의 여기광이 필요한 경우 광원 자체를 교환하여야 하지만, 상기와 같이 고연색성 백색 발광소자를 사용하는 경우 광원의 교체 없이 상기 여기광 필터(220)를 교환하는 것만으로도 원하는 여기광을 형성할 수 있다.
또한 상기 백색발광소자 이외에도 단색광을 발산하는 레이저를 광원으로 사용될 수 있으며, 이 경우 상기 레이저가 발산하는 단색광은 상기 형광체를 동시에 여기시킬 수 있는 것이 바람직하다. 상기 레이저의 경우 상기 발광소자를 사용한 광원에 비하여 높은 광도를 가질 수 있으며, 스펙트럼 대역이 좁은 단색광을 발산할 수 있다. 따라서 상기 형광체를 더욱 밝게 여기시킬 수 있으므로, 상기 형광체들이 동일한 여기광을 사용할 수 있는 경우라면 이러한 레이저 광원을 사용할 수 있다. 다만 상기 형광체를 여기시키기 위하여 넓은 스펙트럼이 필요한 경우에는 상기 고연색의 백색 발광소자를 사용하는 것이 바람직하므로 각 실험의 조건에 따라 적절한 광원을 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 형광체가 여기된 이후 상기 형광체에서 발생된 형광은 상기 검출부에서 관찰될 수 있다. 상기 검출부(300)는 상기 시료에서 발생되는 형광을 관찰하기 위하여 설치되는 부분으로 튜브렌즈(tube lens, 330)를 포함하고 있어 상기 형광의 관찰을 용이하게 할 수 있다.
기존에 사용되는 형광현미경의 경우 단순히 형광의 피크파장을 측정하여 형광의 종류를 판별하고 있으므로, 분광분석을 추가로 수행해야 하며, 그 결과 역시 한눈에 표시되지 않는 문제점을 가지고 있다.
하지만 본 발명의 경우 분광학적인 방법을 이용하되, 상기 검출부(300)를 이용하여 상기 형광의 종류를 바로 확인할 수 있도록 하는 것으로 추가적인 분광분석 없이도 형광의 종류 특히 상기 항원에 부착되어 있는 형광물질을 위치를 신속하게 확인하는 것이 가능하다.
이를 위하여 상기 검출부는 크게 두 가지 방법으로 상기 형광물질을 확인할 수 있다.
그 첫 번째로 상기 검출부는 상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분광시키는 분광수단(320)을 포함할 수 있다.
상기 분광수단(320)은 상기 검출부에 입사되는 형광을 분광시키는 수단을 의미하는 것으로 상기 형광을 분광시킬 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 프리즘(prism) 또는 회절격자(diffraction grating)를 포함하는 분광기를 사용할 수 있다.
이를 이용하는 경우 상기 형광은 파장에 따라 분광되어 관찰될 수 있다. 이때 상기 항원은 상기 포획항체에 부착되어 있으며, 상기 항원에는 또한 상기 검출항체가 부착되어 있으므로, 검출항체 및 포획항체가 각각 존재하는 지점(도 5의 b)에 비하여 길이가 긴 스펙트럼이 관측될 수 있다(도 5의 a). 특히 본 발명의 포획항체 및 검출항체에 부착되는 제1 형광체 및 제2 형광체의 경우 상이한 피크파장을 가짐에 따라(도 3참조) 상기 분광된 스펙트럼의 길이는 항원에 상기 포획항체 및 상기 검출항체가 부착되어 있는 경우 각각 독립적으로 존재하는 것에 비하여 길이가 길게 관측될 수 있다.
즉 상기 검출부는 상기 분광된 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 비교하여 항원의 위치를 검출할 수 있다(도 5 참조).
또한 이러한 형태 또는 상대적인 길이의 비교를 더욱 용이하도록 상기 검출부에는 식별필터가 설치될 수 있다.
상기 식별필터(310)는 상기 분광수단(320)의 전면부에 또는 후면부에 설치될 수 있다. 상기 분광수단(320)을 통과하는 형광의 경우 위에서 살펴본 바와 같이 파장에 따라 분광되어 타원형으로 관측될 수 있으며, 상기 형광의 일부 파장을 상기 식별필터(310)를 이용하여 차단하고 있다.
따라서 일정한 파장을 차단하는 식별필터를 통과시키는 경우 상기 형광을 분광하였을 때 타원형의 일부가 절단되어 있는 형상으로 관찰될 수 있으며(도 6 참조), 이러한 절단의 위치는 상기 형광의 스펙트럼 분포 및 식별필터의 차단 파장과의 상대적인 조합에 의하여 결정될 수 있다.
예를 들어 470nm~670nm의 스펙트럼 분포를 가지며, 530nm의 발광피크를 가지는 적색 형광의 경우 500nm이하의 파장을 차단하는 식별필터를 통과하게 되면 좌측 일부가 절단된 타원형의 형광을 관찰할 수 있다(짧은 파장의 빛이 좌측으로 가도록 분광). 또한 600nm이상의 파장을 차단하는 식별필터를 사용하는 경우 상기 타원의 우측이 잘려있는 형상으로 관찰될 수 있다. 즉 적절한 식별필터를 사용하는 경우 상기 형광의 종류에 따라 다른 차단부를 가지는 타원이 관측될 수 있으며, 이는 상기 식별필터를 적절히 선택하여 사용하는 것만으로도 상기 형광의 식별이 가능한 것을 의미한다.
또한 상기 형광의 스펙트럼 피크가 근접하여 있는 경우에는 상기 잘려있는 부분으로부터 남아있는 타원형 형광의 상대적인 형상 차이에 의하여 두 가지 형광을 식별할 수 있으며, 이는 발광피크가 근접하는 다수개의 형광체를 동시에 사용하는 경우에도 이를 식별할 수 있음을 의미한다(도 7 참조).
또한 상기와 같은 식별을 용이하게 할 수 있도록 상기 식별필터(310)는, 상기 시료에서 발산되는 형광 중 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 일부; 상기 시료에서 발산되는 형광 중 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 일부 중 적어도 하나 이상을 차단할 수 있다.
일반적으로 발광 스펙트럼의 경우 발광 피크대역에서 가장 밝은 형광이 관찰되기 때문에 상기와 같은 차단은 상기 발광 스펙트럼의 피크대역을 제외한 일부를 가리는 것이 바람직하다. 하지만 상기 발광 피크 대역을 포함하는 부분을 차단하는 경우에도 남아 있는 부분으로 인하여 형광이 관찰될 수 있으므로, 상기와 같이 형광 스펙트럼의 일부를 가릴 수 있는 식별필터를 사용하는 것이 바람직하다.
또한 상기와 같은 식별을 용이하게 할 수 있도록 상기 식별필터(310)는, 상기 시료에서 발산되는 형광 중 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 피크 파장 이하의 파장; 및 상기 시료에서 발산되는 형광 중 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 피크 파장 이상의 파장을 차단할 수 있다. 이때 상기 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼 및 상기 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼은 피크 파장 이하 또는 이상의 파장이 제거되어 관찰되며, 나머지 형광의 경우 상기 두 형광의 사이에 피크 파장이 위치하게 된다. 따라서 상기 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼 및 상기 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼은 일종의 기준점으로 작용할 수 있으며, 이를 기준으로 하여 타원의 형상 및 차단부와의 상대적인 위치차이를 측정하여 상기 형광을 식별할 수 있다.
또한 이 경우 상기 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광은 바람직하게는 가장 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광일 수 있으며, 상기 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광은 바람직하게는 가장 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광인 것이 바람직하다. 가장 짧은 발광피크 또는 가장 긴 발광피크를 가지는 형광의 피크 파장 이하 또는 이상의 파장을 차단하는 것으로 상기와 같은 식별필터의 효과를 최대화 할 수 있다.
상기 식별필터(310)는 한 개 이상의 장파장통과필터(long-pass filter), 단파장통과필터(short-pass filter), 대역통과필터(band-pass filter) 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 상기 장파장통과필터는 상대적으로 장파장의 대역을 통과시키는 필터로 상기 필터를 사용하는 경우 단파장 부분을 차단할 수 있다. 또한 이와는 반대로 상기 단파장통과필터는 상대적으로 단파장의 대역을 통과시키는 필터로 상기 필터는 사용하는 경우 장파장 부분을 차단할 수 있다. 따라서 본 발명의 경우 이러한 장파장통과필터와 단파장통과필터를 조합하여 사용하는 것으로 일정대역대만을 통과시키는 식별필터로서 사용할 수 있다. 이와는 별도로 일정한 대역의 파장만을 통과시키는 대역통과필터를 사용하는 것도 가능하다.
상기 형광물질을 확인하기 위한 두 번째 방법으로는 상기 검출부는, 1개 이상의 다이크로익 미러; 및 1개 이상의 검출수단을 포함하여 형광의 색상에 따른 화상을 각각 제공할 수 있다.
두 번째 방법에서는 상기 검출부(400)에 다이크로익 미러(410)를 설치하여 각 형광을 색상에 따라 분해하여 관측할 수 있다. 이때 상기 검출부(400)에 설치되는 다이크로익 미러(410)의 경우 상기 제1 형광물질의 형광 또는 상기 제2 형광물질의 형광중 하나만을 반사하는 것을 사용할 수 있으며, 이를 통하여 상기 제1 형광물질의 형광(제1 화상, 도 9의 (a))과 상기 제2 형광물질의 형광(제2 화상, 도 9의 (b))이 각각 분리되어 독립적으로 관측될 수 있다.
이때 상기 제1 화상과 제2 화상을 비교하게 되면 상기 항원에 상기 포획항체 및 상기 검출항체가 부착되어 있는 경우 상기 제1 화상과 상기 제2 화상에 공동되는 지점에서 발광에 수행되며, 상기 검출항체 또는 상기 포획항체가 독립적으로 존재하는 경우에는 상기 제1 화상 또는 상기 제2 화상 중 하나에서만 형광이 관찰될 수 있다.
즉 상기 제1 화상 및 상기 제2 화상을 비교하여 공통되는 위치에서 형광이 관측되는 경우 상기 항원이 존재하는 부분으로 확인할 수 있으며, 상기 제1화상 또는 상기 제2화상 중 하나에서만 형광이 관측되는 경우 항원이 없는 위양성으로 판독될 수 있다.
이를 상세히 살펴보면 도 9에 나타난 바와 같이 본 발명에 의한 형광은 상기 검출부에서 각각의 색상으로 분리되어 독립적으로 관찰될 수 잇다. 이때 상기 도 9의 (a)과 (b)를 비교하면 상부의 4개의 점으로 표시된 형광을 공통된 위치에서 관측되고 있지만, 하부의 점은 각각 상이한 위치에서 관측되고 있다. 이는 상기 상부의 4개의 점은 2종의 형광체가 존재한다는 것이며, 하부의 점은 각각 하나의 형광체가 존재하는 것을 알 수 있다. 즉, 상기 상부의 4개의 점은 포획항체 및 검출항체가 각각 부착된 진양성을 나타내고 있으며, 하부의 점은 검출항체 또는 포획항체만으로 구성되어 있는 위양성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 제1 형광물질이 표지된 포획항체를 준비하는 단계; (b) 상기 제1 형광물질과 상이한 피크파장을 가지는 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 준비하는 단계; (c) 항원을 포함하는 시료를 도입하여, 상기 항원, 상기 포획항체 및 상기 검출항체 간에 항원-항체 반응을 유도하는 단계; (d) 여기광을 공급하여 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질을 발광시키는 단계; 및 (e) 상기 제1형광물질 및 상기 제2 형광물질에서 발생되는 형광을 분석하여 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 상기 포획항체와 검출항체로서 사용되는 '항체'는 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어, 가변 영역 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서의 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하고, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), 나노바디(nanobody) 또는 scFv를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 scFv, Fab, 나노바디(nanobody) 및 면역글로불린 분자일 수 있다. 본 명세서에서 “항체”는 면역글로불린 외에도 타겟 물질과 특이적 결합을 할 수 있어 상기 항체와 동일한 기능을 할 수 있는 핵산, 핵산 유사체, 펩타이드로 구성된 압타머(aptamer)를 포함한다.
상기 형광물질은 자외선, 전기에너지, 열에너지 등의 외부 에너지에 의해 여기되어 그 에너지를 빛으로 바꾸는 물질로서, 유기 형광체 또는 무기 형광체를 포함할 수 있다. 상기 유기 형광체의 예는 로다민(Rhodamine), 알렉사(Alexa) Fluor dye, 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), FAM(5-carboxy fluorescein), ATTO dye, BODIPY, CF dye, Cyanine(Cy) dye, DyLight Fluor 및 텍사스 레드(Texas Red)일 수 있고, 상기 무기 형광체의 예는 양자점을 들 수 있다.
상기 시료는 검출 대상이 되는 타겟 물질을 함유한 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 점막액, 뇨 등일 수 있으며, 예를 들어 질환이 의심되는 동물 또는 인간 개체로부터 분리 수득된 것일 수 있다.
상기 항원은 바이러스, 박테리아, 핵산, 펩타이드, 단백질, 소포체, miRNA, 엑소좀, 순환종양세포, 바이오마커 등일 수 있다. 바람직하게는 상기 항원은 바이오마커일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술은 세포, 조직 및 기관 등을 관찰하는 데 사용될 수 있다. 특히 본 명세서에 개시된 기술이 한 번의 검사에서 여러 종의 생체물질을 검출하여 신속하게 질병을 조기진단할 수 있다는 점에서 바이오마커 검출용으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 바이오마커는 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가 등의 통상적인 과학 또는 의료분야에서 사용되는 것이면 제한 없이 이용가능하고, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오마커는 예를 들어 혈액, 타액, 소변 등의 생체액에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있으며, 구체적으로는 AFP(alpha fetoprotein), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, 칼시토닌(calcitonin), 칼레티닌(calretinin), CEA(carcinoembryonic antigen), CD34, CD99, MIC-2, CD117, 크라모그라닌(chromogranin), 사이토케라틴(cytokeratin, various types: TPA, TPS, Cyfra21-1), 데스민(desmin), EMA(epithelial membrane antigen), Factor VIII, CD31, FL1, GFAP(glial fibrillary acidic protein), GCDFP-15(gross cystic disease fluid protein), HMB-45, hCG(human chorionic gonadotropin), 면역글로불린(immunoglobulin), 인히빈(inhibin), 케라틴(keratin, various types of keratin), 백혈구 마커(lymphocyte marker), MART-1(Melan-A), Myo D1, MSA (muscle-specific actin), 뉴로필라멘트(neurofilament), NSE(neuron-specific enolase), PLAP(placental alkaline phosphatase), PSA(prostate-specific antigen), PTPRC(CD45), S100 protein, SMA(smooth muscle actin), 시냅토파이신(synaptophysin), TK(thymidine kinase), Tg(thyroglobulin), TTF-1(thyroid transcription factor-1), M2-PK, 바이멘틴(vimentin), 인터루킨(interleukin), CD24, CD40, 인테그린(integrin), 시스타틴(cystatin), 인터페론(interferon), TNF(tumor necrosis factor), MCP, VEGF, GLP, ICA, HLA-DR, ICAM, EGFR, FGF, BRAF, GFEB, FRS, LZTS, CCN, 뮤신(mucin), 렉틴(lectin), 아포리포단백질, 티로신, 신경세포 접착분자 유사 단백질, 파이브로넥틴, 포도당, 요산, 탄산탈수효소 또는 콜레스테롤 등일 수 있다.
또한 상기 시료는 상기 바이오마커가 포함되지 않은 용액으로 희석될 수 있으며, 상기 시료에 포함된 상기 바이오마커의 농도는 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 크게 차이가 날 수 있다. 바람직하게는 이미지 센서에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 희석될 수 있다. 바람직하게는 서로 다른 비율로 희석된 동일한 시료에 대해서 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1:10 내지 1,000의 중량비로 수 차례 희석하여 사용할 수 있다.
상기와 같이 항원이 공급되면 항원-항체반응을 통하여 포획항체-항원-검출항체의 복합체를 구성할 수 있다. 이때 상기 포획항체는 상기 항원과 결합되기 이전 상기 기판에 부착되어 있거나 상기 항원과 결합된 이후 상기 기판에 부착될 수 있다. 즉 상기 기판에 부착된 상기 포획항체에 상기 항원 및 상기 검출항체가 부착될 수 있으며, 이와는 별도로 포획항체-항원-검출항체의 복합체를 구성한 다음 상기 기판에 부착되는 것도 가능하다.
상기 포획항체-항원-검출항체의 복합체가 상기 기판상에 형성된 이후 미결합된 포획항체 및 검출항체를 제거하기 위하여 상기 기판은 1~10회 세척될 수 있다. 이때 사용되는 세척액으로는 물 또는 버퍼를 함유하는 용액일 수 있다.
상기 버퍼는 상기 포획항체 및 상기 검출항체의 혼합을 용이하도록 할 뿐만 아니라 상기 항체들의 보관을 용이하게 할 수 있도록 첨가되는 물질로서 PBS버퍼 또는 트리스(Tris)버퍼를 사용할 수 있다.
상기와 같이 준비된 시료는 형광 현미경의 대물부에 위치된 다음, 상기 시료에 광원을 이용하여 여기광을 공급할 수 있다. 이때 상기 시료는 위에서 살펴본 바와 같이 키트형태로 제공될 수 있다.
상기 여기광은 상기 시료에 포함되어 있는 형광체를 발광시킬 수 있는 에너지를 공급하는 광을 의미하는 것으로 상기 여기광을 이용하여 상기 형광체의 일부 전자가 들뜬 상태로 되며, 이러한 들뜬 상태의 전자가 정상 상태로 돌아오면서 일정한 파장의 형광을 발산하게 된다. 따라서 상기 형광체는 그 종류에 따라 적절한 여기광을 사용하여 여기시키는 것이 바람직하다. 아울러 본 발명의 경우 상기 형광물질의 흡수스펙트럼이 오버랩되어 있으므로 상이한 발광피크를 가지는 형광물질을 포함하는 시료의 경우에도 동일한 여기광을 사용할 수 있음은 위에서 살펴본 바와 같다.
상기와 같이 여기광에 의하여 형광이 발산되면 상기 형광은 검출부에 입사될 수 있다. 이때 상기 검출부는 위에서 살펴본 바와 같이 분광학적인 방법을 이용하여 상기 항원의 존재여부를 판별할 수 있다.
이때 상기 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계는, 상기 형광을 분광시켜 각 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 판독하는 단계; 또는 상기 형광을 색상에 따라 분리하여 각 색상에 따른 화상을 형성하며, 상기 화상에서 각 형광의 위치를 비교하여 판독하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1. 포획항체 및 검출항체 구성
CEA(암태아성항원, Carcino-Embryonic Antigen)을 검출하기 위해 포획항체에는 비오틴(biotin)과 형광물질 CF532를 표지하였고, 검출항체에는 형광물질 Alexa Fluor 594를 표지하였다. 포획항체에는 항체당 평균 2개의 비오틴과 평균 3개의 CF532를 표지하였고, 검출항체에는 항체당 평균 5개의 Alexa Fluor 594를 표지하였다. 포획항체에 비오틴을 표지하는 것은 기판에 고정하기 위함이고, 평균 3~5개의 형광물질을 붙이는 것은 신호의 크기를 키우고, 단 하나의 형광물질도 표지되지 않아 관찰되는 않는 항체의 존재 가능성을 낮추기 위함이다. 공통적으로 532 nm 파장의 레이저를 잘 흡수하되 발광스펙트럼은 서로 구분될 수 있도록 CF532와 Alexa Fluor 594를 선택했다(도 10 참조).
실시예 2. 분광을 이용한 시료 관찰
분광을 이용한 시료 관찰을 위해 도4와 같이 현미경을 구성했다. 포획항체에 표지한 CF532와 검출항체에 표지한 Alexa Fluor 594를 동시에 여기하기 위해 광원(210)으로 532 nm 레이저를 사용했고, 단파장 광원을 사용했으므로 별도의 여기광 필터(220)는 사용하지 않았다. 대물렌즈(120)로는 NA가 1.2이고, 배율은 60이며, infinity-corrected water-immersion인 렌즈를 사용했다. 광원(210)은 반사하되 CF532와 Alexa Fluor 594에서 방출된 빛은 통과하도록 장파장 통과(long-pass) 다이크로익 미러(130)를 사용했고, 동일한 투과 특성의 식별 필터(310)을 사용했다. CF532와 Alexa Fluor 594에서 방출된 빛의 스펙트럼 형태를 관찰하기 위한 분광수단(320)으로 각도 7도 41분의 석영 웨지(wedge) 프리즘을 사용했다. Infinity-corrected 대물렌즈를 사용했고, 넓은 파장 범위를 이미징 하므로 초점거리가 180 mm이고, 색수차가 보정된 튜브렌즈(330)를 사용했다.
1 pM 포획항체, 1pM 검출항체, 100 fM 항원을 혼합하여 포획항체-항원-검출항체 사이의 면역반응을 유도하여 복합체를 만든 후 기판에 주입하여 포획항체를 고정했다. 포획항체는 비오틴에 의해 기판에 고정되므로 대부분의 포획항체는 기판에 고정된다. 검출항체는 포획항체에 항원이 결합되어 있는 경우 항원에 결합하며 기판에 고정될 수 있고, 일부는 비특이적으로 기판에 고정될 수 있으므로 상대적으로 소수의 검출항체만이 기판에 고정될 수 있다.
도 11의 (a)는 저배율로 형광을 관찰한 것이며, 도 11의 (b)는 흰색 사각형 부분을 고배율로 관찰한 것이다. 도 11의 (b)에 나타난 바와 같이 항원과 무관하게 기판에 고정된 포획항체와 검출항체는 프리즘에 의해 타원형태로 나타나고, 포획항체-항원-검출항체 복합체는 두 개의 타원이 이어진 형태로 나타난다. 즉 두 개의 타원이 이어진 형태로 나타난 부분에만 포획항체와 검출항체가 동시에 존재한다는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통하여 위양성 신호(단순타원)와 진양성 신호(두개의 이어진 타원)를 구분할 수 있다. 이처럼 이미지를 분석하여 위양성 신호(검출항체 단독, 포획항체 단독)를 제거하고 진양성 신호(포획항체-항원-검출항체 복합체)만을 정확히 검출할 수 있다.
실시예 3. 형광의 색상에 따른 시료 관찰
형광의 색상에 따른 시료 관찰을 위해 도 8과 같이 현미경을 구성했다. 포획항체에 표지한 CF532와 검출항체에 표지한 Alexa Fluor 594를 동시에 여기하기 위해 광원(210)으로 532 nm 레이저를 사용했고, 단파장 광원을 사용했으므로 별도의 여기광 필터(220)는 사용하지 않았다. 대물렌즈(120)로는 NA가 1.2이고, 배율은 60이며, infinity-corrected water-immersion인 렌즈를 사용했다. 광원(210)은 반사하되 CF532와 Alexa Fluor 594에서 방출된 빛은 통과하도록 장파장 통과(long-pass) 다이크로익 미러(130)를 사용했다. 상대적으로 짧은 파장의 빛을 방출하는 CF532의 신호는 반사해 제2 카메라(431)에서 관측되도록 하고, 상대적으로 긴 파장의 빛을 방출하는 Alexa Fluor 594의 신호는 투과해 제1 카메라(430)에서 관측되도록 하기 위해 600 nm cut-on 파장의 식별 필터(410)를 사용했다. Infinity-corrected 대물렌즈를 사용했고, 넓은 파장 범위를 이미징 하므로 초점거리가 180 mm이고, 색수차가 보정된 제1 튜브렌즈(420)와 제2 튜브렌즈(421)를 사용했다.
1 pM 포획항체, 1pM 검출항체, 100 fM 항원을 혼합하여 포획항체-항원-검출항체 사이의 면역반응을 유도하여 복합체를 만든 후 기판에 주입하여 포획항체를 고정했다. 포획항체는 비오틴에 의해 기판에 고정되므로 대부분의 포획항체는 기판에 고정된다. 검출항체는 포획항체에 항원이 결합되어 있는 경우 항원에 결합하며 기판에 고정될 수 있고, 일부는 비특이적으로 기판에 고정될 수 있으므로 상대적으로 소수의 검출항체만이 기판에 고정될 수 있다. 도 12의 (a)는 포획항체에 표지되어 있는 CF532를 제2 카메라로 관찰한 것이고, 도 12의 (b)는 검출항체에 표지되어 있는 Alexa Fluor 594를 제1 카메라로 관찰한 것이다. 원으로 표시한 부분은 두 카메라에 공통적으로 신호가 나타난 곳이며, 동일한 위치에 포획항체와 검출항체가 동시에 존재함을 의미한다. 이는 두 항체가 항원에 의해 결합하고 있음을 의미하므로 진양성 신호라 할 수 있다. 화살표로 표시한 부분은 제1 카메라에만 신호가 나타난 곳으로, 포획항체는 존재하지 않고, 검출항체만 존재하므로 검출항체가 비특이적으로 기판에 고정된 것이며, 기존 방법의 위양성 신호라 할 수 있다. 이처럼 포획항체와 검출항체에 서로 다른 형광분자를 표지하고, 이 둘을 동시에 검출함으로써 기존 방법의 문제점인 위양성 신호를 제거할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
100 : 대물부
110 : 시료
120 : 대물렌즈
130 : 다이크로익 미러
200 : 광원부
210 : 광원
220 : 여기광 필터
300 : 검출부
310 : 식별 필터
320 : 분광수단
330 : 튜브렌즈
340 : 카메라
400 : 검출부
410 : 식별 필터
420 : 제1 튜브렌즈
421 : 제2 튜브렌즈
430 : 제1 카메라
431 : 제2 카메라

Claims (12)

  1. 기판;
    상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 제1 형광물질이 표지된 포획항체; 및
    상기 포획항체에 부착되는 항원과 결합할 수 있으며, 제2 형광물질이 표지된 검출항체;
    를 포함하되,
    상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 상이한 피크파장을 가지는 형광을 발산하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 하나 이상의 여기광에 의하여 동시에 발광되는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 발광스펙트럼의 일부가 오버랩되어 있는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항원 검출용 키트; 및
    상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분석하는 형광현미경;
    을 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광현미경은,
    상기 항원 검출용 키트가 설치되는 대물부;
    상기 대물부에 여기광을 공급하는 광원부; 및
    상기 여기광에 의하여 발산되는 형광을 분석하는 검출부;
    를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 검출부는 상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분광시키는 분광수단을 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 검출부는 상기 분광된 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 비교하여 항원의 위치를 검출하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 검출부는,
    1개 이상의 다이크로익 미러; 및
    1개 이상의 검출수단;
    을 포함하여 형광의 색상에 따른 화상을 각각 제공하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 검출부는 상기 형광의 색상에 따른 화상에서 각 형광의 위치를 비교하여 항원의 위치를 검출하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  10. (a) 제1 형광물질이 표지된 포획항체를 준비하는 단계;
    (b) 상기 제1 형광물질과 상이한 피크파장을 가지는 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 준비하는 단계;

    (c) 항원을 포함하는 시료를 도입하여, 상기 항원, 상기 포획항체 및 상기 검출항체 간에 항원-항체 반응을 유도하는 단계;
    (d) 여기광을 공급하여 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질을 발광시키는 단계; 및
    (e) 상기 제1형광물질 및 상기 제2 형광물질에서 발생되는 형광을 분석하여 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계;
    를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계는,
    상기 형광을 분광시켜 각 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 판독하는 단계; 또는
    상기 형광을 색상에 따라 분리하여 각 색상에 따른 화상을 형성하며, 상기 화상에서 각 형광의 위치를 비교하여 판독하는 단계;
    를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 포획항체는 상기 항원과 결합되기 이전 또는 상기 항원과 결합된 이후 기판에 부착되는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법.
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