CN117849330A

CN117849330A - 一种免疫荧光检测方法、试剂及其应用

Info

Publication number: CN117849330A
Application number: CN202211228337.9A
Authority: CN
Inventors: 张迅; 张伯伦; 孙若为; 陈传品; 朱曲波
Original assignee: Hunan Zaochen Nano Robot Co ltd
Current assignee: Hunan Zaochen Nano Robot Co ltd
Priority date: 2022-10-08
Filing date: 2022-10-08
Publication date: 2024-04-09

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及使用荧光染料标记抗体的方法、免疫荧光检测方法、试剂及其应用。本发明提供的方法使用简便，能够对信号进行放大，提高检测的灵敏度，并可在同一体系中检测不同抗原。此外，本发明提供的试剂稳定性强，持续时间长，适用于生物标志物的各种免疫检测。

Description

一种免疫荧光检测方法、试剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及使用荧光染料标记抗体的方法、免疫荧光检测方法、试剂及其应用。

背景技术

免疫学检测方法是目前最常用的检测方法之一，广泛应用于医院、血站、体检中心等，主要用于肿瘤检测、肝炎检测、性病检测、孕检等。

POCT，即时检验(point-of-care testing)，指在病人旁边进行的临床检测及床边检测(bedside testing)，通常不一定需要由临床检验师来进行。即时检验是在采样现场即刻进行检测分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。主要用于体检中心、急诊、重症监护、门诊等部门。很多即时检验采用方法的是免疫检测，即利用抗体检测特定的标记物，例如肿瘤标记物、心肌标记物、病毒等等。

目前常见的检测方法主要包括放射免疫分析法(RIA)、胶体金法、酶联免疫法(ELISA)、时间分辨荧光免疫法(TRFIA)和化学发光免疫法(CLIA)。其中，放射免疫分析法需要使用放射性物质，对环境造成污染；胶体金法的检测灵敏度不高，不能满足临床检测的各种需要；酶联免疫法是把反应所需的酶偶联到抗体上，对试剂保存的条件要求高(保持酶的活性)，且需要加入底物进行反应，操作程序多；时间分辨荧光法灵敏度高，但极易受外源因素干扰，比如环境中的稀土元素；化学发光法对设备依赖性强，稳定性不够，通常不能在同一试管中同时检测不同目的分子。

这些检测方法的核心步骤主要包括两个部分，其一为通过免疫反应实现对待测物的识别，其二为使免疫反应产物产生信号并对其进行识别和报告。检测的特异性主要依赖于识别待测物/标记物的抗体的特异性；检测的灵敏度主要取决于标记抗体(例如酶标记抗体)产生的信号强度。目前来说，化学发光法具有较高的灵敏度。但化学发光法常用的发光试剂的发光过程十分短暂，例如罗氏E601型全自动电化学发光免疫分析系统使用的三联吡啶钌，直接发光时间仅约为25秒，贝克曼库特(Beckman Coulter)的DxI 800免疫分析系统使用的碱性磷酸酶(ALP)–金刚烷(adamantine,AMPPD)，酶促发光时间仅约为5秒。因此，样品反应后需要迅速测量或直接放在检测仪器内部进行反应。此外，常用的鲁米诺和吖啶酯类发光试剂释放的光子波长比较接近，因此，无法在同一反应体系中区别测量，也就无法在同一体系中同时检测两种或多种抗原。

近年来，由于新技术的发展和医学科学的进步，以及高效快节奏的工作方式，使得具有实验仪器小型化、操作简单化、报告结果即时化的POCT得到越来越广泛的应用。因此，操作简单、灵敏度高、能同时检测多种标志物的免疫检测方法仍在发展当中。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种用荧光染料标记抗体的方法、免疫荧光检测方法、试剂及其应用。本发明提供的方法使用简便，能够对免疫反应的信号进行级联放大，极大提高免疫荧光检测的灵敏度。其次，所述方法可对不同抗原或抗体标记不同的荧光，可以实现在同一体系中检测不同的抗原或抗体。再次，该方法可以很方便地对同一种抗体标记不同的荧光染料，用于不同的检测目的。此外，本发明提供的试剂稳定性强，荧光持续时间长，反应后在较长时间内，例如24小时内进行信号检测均可，对操作的要求降低，具有更强的应用性。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

在第一方面，本发明提供一种用荧光染料标记抗体的方法，包括步骤：

1)提供生物素(biotin)标记的抗体；

2)将所述生物素标记的抗体与亲和素(avidin)接触，以获得所述生物素标记抗体与亲和素的复合物；和

3)将步骤2)获得的复合物与生物素标记的激发剂(initiator)接触，其中，所述激发剂标记有荧光染料。

在本发明的一些实施方案中，所述亲和素可以是卵白亲和素(Avidin)、链霉亲和素(Streptavidin)、中性链亲和素(NeutrAvidin^TM)及类亲和素，优选为链霉亲和素。

本发明中的术语“激发剂”是指标记有生物素和荧光染料的物质，其中的荧光染料在被某一波长的光波照射后能发射出另一波长的光波，所述光波可被观察/检测到。在一些实施方案中，所述激发剂可以是多核苷酸、多肽和非多核苷酸非多肽的化合物或其组合。所述激发剂起桥梁作用，通过其标记的生物素将其携带的荧光染料连接到抗体上。

在另一些实施方案中，所述激发剂为修饰的多核苷酸，本文中称为Trigger DNA，所述Trigger DNA为单链DNA或双链DNA，优选为单链DNA。所述Trigger DNA的长度可以为10-200个核苷酸，例如10-150、11-100、12-100、13-50、15-30。本发明对Trigger DNA的序列无特殊限制，只要能被生物素和荧光染料标记即可。

在一些实施方案中，所述Trigger DNA被生物素标记，生物素位于所述TriggerDNA的5’端、3’端或中间任意位置，优选位于所述Trigger DNA的5’端或3’端。

任选地，所述生物素与所述Trigger DNA之间存在连接子(linker)，所述连接子可以是任意核苷酸序列，起到间隔生物素与Trigger DNA，使生物素与亲和素能够更充分结合的作用。优选地，所述连接子序列为Poly(A)序列。所述Poly(A)序列的长度可以为1-50、1-40、1-30、1-20个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

在另一些实施方案中，所述激发剂携带的荧光染料可以是现有技术已知的荧光染料，例如香豆素类(Coumarin Dyes)、荧光素类(Fluorescein Dyes)、罗丹明类(RhodamineDyes)、碳花青类(Cyanine Dyes)、新型染料Tide Flour(TF)或其组合，优选为FAM、CY3、CY5、CY7，AF488或AF647。所述激发剂携带的荧光染料分子可以是一个或更多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。优选地，所述荧光染料分子通过共价键连接至激发剂。

在一些具体实施方案中，所述Trigger DNA的序列包含TGAAGCTG(SEQ ID NO:17)，优选地，所述Trigger DNA选自：

AAAAA TGAAG CTG(SEQ ID NO:9)，

AAAAA GTTGA TGAAG CTG(SEQ ID NO:8)，

AAAAA AACTA GTTGA TGAAG CTG(SEQ ID NO:7)，

AAAAA TGACGAACTAGTTGATGAAGCTG(SEQ ID NO:1)。

在另一些实施方案中，在Trigger DNA与亲和素接触之前或之后，还包括TriggerDNA与FADNA反应的步骤，其中，所述FADNA与Trigger DNA全部或部分互补，所述FA DNA携带荧光染料，优选地，所述荧光染料选自香豆素类(Coumarin Dyes)、荧光素类(FluoresceinDyes)、罗丹明类(Rhodamine Dyes)、碳花青类(Cyanine Dyes)、新型染料Tide Flour(TF)或其组合，更优选地，所述荧光染料为FAM、CY3、CY5、CY7、AF488或AF647。

在一个具体实施方案中，所述FADNA的序列为：

GTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTGTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTCAGCTTCATCAACTAGTTCGTCA(SEQ ID NO:10)。

在另一些实施方案中，在所述FA DNA与Trigger DNA反应之前或之后，进一步包括将EA DNA与FA DNA反应的步骤，其中，所述EA DNA与FADNA全部或部分互补，所述EA DNA携带荧光染料，优选地，所述荧光染料选自香豆素类(Coumarin Dyes)、荧光素类(Fluorescein Dyes)、罗丹明类(Rhodamine Dyes)、碳花青类(Cyanine Dyes)、新型染料Tide Flour(TF)或其组合，更优选地，所述荧光染料为FAM、CY3、CY5、CY7、AF488或AF647。

第二个方面，本发明提供一种检测目的蛋白的方法，包括步骤：将待测样品与特异性结合目的蛋白的抗体相接触，其中，所述抗体在与待测样品接触之前或之后根据第一个方面所述的方法进行标记。

在一些实施方案中，所述检测目的蛋白的方法包括使用识别同一目的蛋白的捕获抗体和检测抗体，包括步骤：

1)将待测样品与特异性结合目的蛋白的捕获抗体相接触；

2)提供根据第一个方面所述方法标记的检测抗体；和

3)将所述检测抗体与步骤1)获得的混合物接触；

其中，步骤1)和2)的顺序可互换。

在一些实施方案中，捕获抗体可以固定在固相基质上，例如磁珠或玻璃珠，优选为磁珠。可采用本领域已知的技术将抗体连接到磁珠上，对磁珠无特殊限制，适用于本方法的磁珠均可使用。

在另一些实施方案中，所述方法可检测两种或更多种待测目的蛋白。具体地，在步骤1)中加入两种或更多种捕获抗体；根据第一个方面所述的方法标记两种或更多种检测抗体，每种检测抗体标记不同的荧光染料，以便信号被分别识别。例如，可采用不同荧光标记的Trigger DNA，一种荧光标记一种检测抗体。Trigger DNA的序列可以相同，也可以不同，只要标记的荧光不同即可。

荧光信号的检测可采用现有技术可以测量荧光强度的仪器进行，无具体限制，例如可使用流式细胞仪。

第三个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含用于采用荧光染料标记抗体的试剂，标记方法如第一个方面所述。所述试剂盒可用于标记任何携带生物素的抗体。

在一些实施方案中，所述试剂盒生物素标记的激发剂，所述激发剂可以是多核苷酸、多肽和非多核苷酸非多肽的化合物或其组合，所述激发剂标记有荧光素。优选地，所述试剂盒还包含亲和素。

在另一些实施方案中，所述试剂盒还包含FADNA，FADNA如第一个方面所述。在另一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含EADNA，EADNA如第一个方面所述。

在另一些实施方案中，所述试剂盒可以与其它包含生物素标记抗体的试剂/试剂盒一起使用，用于不同的免疫检测目的。

附图说明

图1示本发明用荧光染料间接标记抗体的一个实施方案。

图2示Trigger DNA的一种荧光标记方式。

图3示Trigger DNA的另一种荧光标记方式。

图4示Trigger DNA的另一种荧光标记方式。

图5示Trigger DNA的另一种荧光标记方式。

图6示本发明检测目的蛋白的一个实施方案。

图7示实施例2测定的PSA标准曲线。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。

本文使用的术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。

本文使用的术语例如“包含”、“含”、“含有”和“包括”不意在限制。

本发明的用荧光染料间接标记抗体的一个实施方案如图1所示。用生物素标记抗体，标记方法可采用本领域已知的方法。每个抗体分子可被一个或更多个生物素分子标记，每个生物素分子可与至少一个亲和素分子结合，即，每个抗体可结合一个或多个亲和素。根据现有文献报道，一个亲和素包含4个生物素结合位点。因此，与抗体上生物素结合了的亲和素还可以结合1-3个生物素。图1中，激发剂为生物素和荧光染料标记的DNA(TriggerDNA)，所述激发剂通过生物素与亲和素结合。通过这种方式，将荧光染料间接标记到抗体上。由于抗体可被多个生物素标记，亲和素可结合多个生物素，Trigger DNA可被多个荧光染料分子标记，这样的级联反应大大增加了标记到抗体上的荧光染料数，提高了检测时的荧光信号，相应提高了检测的灵敏度。

本发明中Trigger DNA可通过多种方式携带荧光。一种荧光标记方式如图2所示，荧光标记在核苷酸上。每个核苷酸均可被标记，也可选择特定的核苷酸进行标记，例如，合成DNA时只标记A，也可以只标记T，以此类推。根据现有技术，可以很方便地用不同荧光染料标记DNA。因此，对于相同的抗体分子，在应用于不同场景时，可以通过本发明的方法很容易地标记上不同颜色的荧光，极大地提高了抗体应用的灵活性。

本发明中Trigger DNA的另一种荧光标记方式如图3所示。FA DNA与Trigger DNA全部或部分互补，可通过碱基配对结合，所述FA DNA可携带一个或多个荧光染料分子。通过这种方式，可进一步增加Trigger DNA携带的荧光染料数量，提高了检测时的荧光信号。

本发明中Trigger DNA的另一种荧光标记方式如图4所示。EA DNA与FADNA全部或部分互补，可通过碱基配对结合，所述EA DNA可携带一个或多个荧光染料分子。通过EA DNA和FA DNA，可进一步增加Trigger DNA携带的荧光染料数量，提高了检测时的荧光信号。

本发明中Trigger DNA的另一种荧光标记方式如图5所示。其中，FA DNA包含多个重复单元，每个重复单元都可与EA DNA通过碱基配对结合。

用本发明的标记方法标记的抗体用于检测目的蛋白的一个实施方案如图6所示。其中，捕获抗体偶联于磁珠，与含目的蛋白(抗原)的样品混合后，加入生物素标记的检测抗体，加入亲和素，然后加入Trigger DNA，最后用可检测荧光的仪器进行检测。也可以是，先用本发明的标记方法标记检测抗体，然后与结合了抗原的捕获抗体的混合物一起反应。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的一些优选的实施方式和方面。这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。

实施例1：材料和方法

本发明实施例使用的试剂均可在市场上购买获得或合成得到。

磁珠

本领域常规的用于偶联抗体的磁珠均可用于本发明。可以为羧基磁珠、氨基磁珠或巯基磁珠，粒径100nm-5μm均可，优选1-3μm。可根据实际情况使用EDC一步活化法或EDC-NHS两步活化法对磁珠进活化处理。可选地，对活化后的磁珠进行封闭处理，封闭剂(例如TBST缓冲液)能够达到更好的降低背景的效果。

捕获抗体

能够与目的蛋白结合的特异性抗体。实施例中使用的捕获抗体有：PSA抗体(上海领潮生物科技，L1C00401)。

抗体的预处理:如果抗体溶液含有其他氨基、巯基的杂质分子，需先通过透析、G-25等手段将杂质分子去除。

偶联反应：将磁珠放入偶联反应瓶中，加入缓冲液，然后加入抗体(例如，磁珠量:抗体量(mg)＝20:1，可根据需要调整用量)；将偶联反应瓶关上后放入恒温摇床中，恒温25度震荡1-6小时，保证震荡混匀；

封闭：向偶联反应瓶中加入缓冲液清洗(利用磁性分离磁珠，弃上清液)，加入3-5％BSA封闭没有完全反应的活性基团，4度冰箱保存。

检测抗体

能够与目的蛋白结合的特异性抗体，带有生物素标记。例如，生物素标记的PSA抗体(上海领潮生物科技，L1C00402)。

链霉亲和素(翌圣生物科技(上海)股份有限公司，35101ES03)

Trigger DNA，由上海生工生物合成，可根据设计需要在碱基上标记荧光素，末端标记生物素。

FA DNA，由上海生工生物合成，可根据设计需要在碱基上标记荧光素，末端无生物素。

EA DNA，由上海生工生物合成，可根据设计需要在碱基上标记荧光素，末端无生物素。

链霉亲和素与生物素化检测抗体的反应条件：

混合，0-45度反应0-0.1小时，优选30-37度。

Trigger DNA与链霉亲和素的反应条件：

混合，0-45度反应0-1小时，优选30-37度。

FADNA与Trigger DNA的反应条件：

混合，0-45度反应0-1小时，优选30-37度。

EA DNA与FA DNA的反应条件：

混合，85-95度加热5分钟，自然冷却到50度后，室温保存。

EA DNA与FA DNA、Trigger DNA的反应条件：

先将EA DNA与FA DNA反应，然后再与Trigger DNA反应；也可以先将Trigger DNA与FA DNA反应，然后再与EA DNA反应；或者，三者混合反应。

实施例2：使用Trigger DNA检测一种抗原

1)配置抗原样品：用PBS溶液(Gibco，货号：10010023，浓度：1×，PH＝7.4)配置浓度为1ng/ml的PSA(上海领潮生物科技，L1C00403)，每个检测使用200μl抗原样品，阴性对照为没有抗原的相同溶液。

2)取0.004mg实施例1制备的偶联有PSA捕获抗体(上海领潮生物科技，L1C00401)的磁珠，加入步骤1)配置的200μl抗原样品，混匀。

3)加入50μl浓度为6.064μg/ml的生物素标记的PSA抗体(上海领潮生物科技，L1C00402)作为检测抗体，混匀。

4)加入50μl浓度为6μg/ml的链霉亲和素，室温混匀。

5)加入53μl浓度为1μmol/ml的Trigger DNA，在37度恒温箱反应1个小时。所述Trigger DNA如表1所示。

表1

注：下划线位置为带FAM荧光基团标记的核苷酸；所有序列5’端带生物素(Biotin)标记。

6)采用流式测量结果：流式细胞仪是BD LSRFortessa^TM，配备三个激光源，可提供几十种波长的激光，12个通道。本实施例使用的FAM荧光素的激发波长为488nm，选择相应通道进行测量即可。各样品的平均荧光强度如表2所示。

表2

名称	荧光强度读数(A.U)
		Trigger DNA 1	370
Trigger DNA 2	540
		Trigger DNA 3	780
阴性对照	50

从表2的结果可以看出，Trigger DNA能够通过亲和素与检测抗体结合，通过检测荧光强度可对抗原进行定量。此外，Trigger DNA标记的荧光基团越多，荧光信号越强，因此，可通过增加Trigger DNA上标记的荧光基团的数量来进一步增强信号。

标准曲线的建立

以PSA为例，按照常规标准曲线的测量和分析方式绘制标准曲线，如图7所示。由标准曲线图可以看出，本发明的检测方法在目的蛋白浓度很低的情况下仍具有线性关系，灵敏度高。

实施例3：使用Trigger DNA检测两种不同抗原

本实施例中，用不同荧光染料标记Trigger DNA，可在同一体系中同时检测两种不同抗原。

1)配置抗原样品：配置包含PSA(同实施例2)和AFP(上海领潮生物科技有限公司，L1G00201)的溶液，体积200μl，PSA和AFP的浓度分别为1ng/ml；

2)配置50μl浓度为6.064μg/ml的生物素标记的PSA检测抗体，加入50μl浓度为6μg/ml的链霉亲和素，混合均匀；

3)加入53μl浓度为1μmol/ml的Trigger DNA，在37度恒温箱反应30分钟，获得PSA检测抗体溶液；所述Trigger DNA序列为AAAAATGACGAACTAGTTGATGAAGCTG(SEQ ID NO:3),下划线位置为带FAM荧光基团标记的核苷酸，5’端带生物素(Biotin)标记；

4)配置50μl浓度为4.016μg/ml的生物素标记的AFP检测抗体(上海领潮生物科技有限公司，L1G00202)，加入50μl浓度为6μg/ml的链霉亲和素，混合均匀；

5)加入53μl浓度为1μmol/ml的Trigger DNA，在37度恒温箱反应30分钟，获得的AFP检测抗体溶液；所述Trigger DNA序列同步骤3)但荧光标记不同，T带CY3荧光素；

6)分别取0.004mg按照实施例1方法制备的偶联有PSA捕获抗体(上海领潮生物科技，L1C00401)的磁珠和偶联有AFP捕获抗体(海领潮生物科技，L1G00203)的磁珠，加入步骤1)配置的200μl抗原样品，混匀；加入步骤3)获得的PSA检测抗体溶液和步骤5)获得的AFP检测抗体溶液，在37度恒温箱反应1小时；

阴性对照组无抗原。

采用流式测量结果：流式细胞仪是BD LSRFortessa^TM。FAM荧光素的参数为EM＝495nm，Abs＝521nm，绿光通道；CY3荧光素的参数为EM＝550nm，Abs＝570nm，红光通道。各样品的荧光强度如表3所示。

表3

PSA	荧光强度读数(A.U)
		阴性对照	51
0.1ng/ml	110
		1ng/ml	778

		AFP
阴性对照	53
		0.1ng/ml	138
1ng/ml	932

从表3的结果可以看出，用2种不同荧光素标记Trigger DNA，让不同荧光素标记的Trigger DNA先与不同检测抗体混合，即可以很方便地在同一体系中同时检测2种抗原。

实施例4：使用Trigger DNA检测三种不同抗原

本实施例的实验过程基本与实施例3相同。

不同之处在于在抗原样品中增加了一种抗原CEA(上海领潮生物科技有限公司，LI3C02203)，即，抗原样品包含3种抗原：PSA\AFP\CEA，浓度分别为1ng/ml。相应地，增加CEA捕获抗体(上海领潮生物科技有限公司，LI3C02201)和CEA检测抗体(上海领潮生物科技有限公司，LI3C02202)。用3种荧光素FAM、CY3和CY5分别标记Trigger DNA。将3种Trigger DNA分别与PSA检测抗体、AFP检测抗体和CEA检测抗体混合反应，然后加入同一管抗原样品，同时检测3种荧光信号。FAM荧光素的参数为EM＝495nm，Abs＝521nm，绿光通道；CY3荧光素的参数为EM＝550nm，Abs＝570nm，红光通道；CY5荧光素的参数为EM＝649nm，Abs＝670nm，蓝紫光。结果如表4所示。

表4

PSA	荧光强度读数(A.U)
		阴性对照	53
0.1ng/ml	107
		1ng/ml	785

		AFP
阴性对照	54
		0.1ng/ml	145
1ng/ml	928

CEA
		阴性对照	52
0.1ng/ml	228
		1ng/ml	1130

从表4的结果可以看出，用不同荧光素标记Trigger DNA，可在同一体系中同时检测多种抗原，极大地提高了检测效率，且结果互不干扰。实施例5：使用不同Trigger DNA进行检测

本实施例的实验过程基本与实施例2相同。

I.不同序列的Trigger DNA，

设计不同Trigger DNA序列，如表5所示。

表5

抗原样品为PSA溶液，检测结果如表6所示。

表6

组	荧光强度读数(A.U)
		Trigger DNA 1	368
Trigger DNA 4	375
		Trigger DNA 5	362
Trigger DNA 6	385
		Trigger DNA 7	372
Trigger DNA 8	369
		Trigger DNA 9	388

从表6的结果可以看出，Trigger DNA的具体核苷酸序列对检测效果无显著影响，即，不同序列的DNA分子均可被标记作为Trigger DNA用于本发明的检测方法。

II.不同长度的Trigger DNA

设计5个Trigger DNA，与SEQ ID NO:1相比，其中3个序列更短，2个序列更长。具体序列如表7所示。

表7

抗原样品为PSA溶液，检测结果如表8所示。

表8

组	荧光强度读数(A.U)
		Trigger DNA 1	376
Trigger DNA 10	372
		Trigger DNA 11	366
Trigger DNA 12	389
		Trigger DNA 13	368
Trigger DNA 14	381

从表8的结果可以看出，Trigger DNA的长度对检测效果无显著影响，只要核苷酸分子被荧光素标记，就可以用于本发明的检测方法。

实施例6：使用Trigger DNA+FA DNA检测抗原

本实施例的实验过程基本与实施例2相同。区别在于，在实施例2的步骤5)中，Trigger DNA先与FADNA在37度恒温箱反应30分钟。FADNA与Trigger DNA部分互补，可通过互补配对而结合。具体地，本实施例使用的FADNA与Trigger DNA1(SEQ ID NO:1)部分互补，具体序列为：

GTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTGTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTCAGCTTCATCAACTAGTTCGTCA(SEQ ID NO:15)。FA DNA与Trigger DNA 1各携带1个FAM。

抗原样品为PSA溶液，检测结果如表9所示。

表9

组	荧光强度读数(A.U)
		Trigger DNA 1	370
Trigger DNA 1+FA DNA	550

从表9的结果可以看出，由于FA DNA也可以携带荧光素，与Trigger DNA互补结合后，增加了检测信号的强度，有利于提高检测的灵敏度。本实施例中，Trigger DNA携带1个FAM荧光素分子，(Trigger DNA 1+FA DNA)则相当于携带了2个FAM荧光素分子。

实施例7：使用Trigger DNA+FA DNA+EA DNA检测抗原

本实施例的实验过程基本与实施例6相同。区别在于，Trigger DNA先与FA DNA和EA DNA在37度恒温箱反应30分钟。EA DNA与FA DNA部分互补，可通过互补配对而结合。本实施例使用的EA DNA序列为：GACATAATAGGCACAC(SEQ ID NO:16)，FA DNA序列如SEQ ID NO:12所示。Trigger DNA、FA DNA和EA DNA各修饰1个FAM。本实施例使用的FA DNA包含不同数量的重复单元，每个重复单元可以与一个EA DNA结合，具体序列如表10所示。

表10

注：这里的“重复单元”是指能与EA DNA部分或全部互补的序列片段。0个重复单元表示该FA DNA不包含与EA DNA互补的序列，1个重复单元表示该FA DNA包含1个与EA DNA互补的序列，2个重复单元表示该FA DNA包含2个与EA DNA互补的序列，以此类推。

抗原样品为PSA溶液，检测结果如表11所示。

表11

注：

从表11的结果可以看出，随着FA DNA包含的重复单元数量的增加，检测信号也随之增强。

实施例8：稳定性测试

比较化学发光法与本发明检测方法信号的稳定性。

吖啶酯衍生物(北京索莱宝科技有限公司，solarbioca1140)直接发光法检测PSA(按照常规方法进行操作)

第1步：50μl样本与标记后的抗体或抗原免疫反应；

第2步：分离、洗涤后，反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质通过ProCell/ProCellM(Gibco，10010065)洗去；加入碱性H₂O₂溶液，最后测定发光强度。

在反应后2秒、1分钟、5分钟和2小时的时候记录测量结果，得到对应的抗原浓度，参见表12。

采用实施例2所述方法检测相同抗原样本，在反应后2秒、1分钟、5分钟和2小时的时候记录荧光读数，得到对应的抗原浓度，参见表12。

从表12的结果可以看出，采用化学发光法检测时，只有在较短时间内测量得到的数值比较准确，1分钟之后就几乎检测不到信号了。而本发明的方法采用的是较为稳定的荧光素，反应后2小时仍然可以检测到明显荧光信号，且荧光强度与2秒时无显著差别。该结果表明，相比于化学发光法，本发明的检测方法稳定性好，对操作要求低，可在较长时间内读取结果，或多次读取，确保结果的准确性。

表12不同时间点的检测结果比较

以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种用荧光染料标记抗体的方法，包括步骤：

1)提供生物素(biotin)标记的抗体；

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和素选自卵白亲和素(Avidin)、链霉亲和素(Streptavidin)、中性链亲和素(NeutrAvidin^TM)及类亲和素，优选为链霉亲和素(Streptavidin)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述激发剂选自多核苷酸、多肽和非核苷酸非氨基酸的化合物或其组合。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其中所述激发剂为Trigger DNA，所述TriggerDNA为单链DNA或双链DNA，优选为单链DNA。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述Trigger DNA的长度为10-200个核苷酸，例如10-150、11-100、12-100、13-50或15-30。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述Trigger DNA中的生物素位于所述TriggerDNA的5’端、3’端或中间任意位置，优选位于所述Trigger DNA的5’端或3’端。

7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其中，所述生物素与所述Trigger DNA之间存在连接子(linker)，优选地，所述连接子序列为Poly(A)序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述Poly(A)序列的长度为1-50、1-40、1-30、1-20，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其中所述荧光染料选自香豆素类(CoumarinDyes)、荧光素类(Fluorescein Dyes)、罗丹明类(Rhodamine Dyes)、碳花青类(CyanineDyes)、新型染料Tide Flour(TF)或其组合，优选地，所述荧光染料为FAM、CY3、CY5、CY7、AF488或AF647。

10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其中所述激发剂携带一个或更多个荧光染料，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

11.根据权利要求4-10任一所述的方法，在Trigger DNA与亲和素接触之前或之后，还包括Trigger DNA与FA DNA反应的步骤，其中，所述FA DNA与Trigger DNA全部或部分互补，所述FA DNA携带荧光染料，优选地，所述荧光染料选自香豆素类(Coumarin Dyes)、荧光素类(Fluorescein Dyes)、罗丹明类(Rhodamine Dyes)、碳花青类(Cyanine Dyes)、新型染料Tide Flour(TF)或其组合，更优选地，所述荧光染料为FAM、CY3、CY5、CY7、AF488或AF647。

12.根据权利要求11所述的方法，在所述FA DNA与Trigger DNA反应之前或之后，进一步包括EA DNA与FA DNA反应的步骤，其中，所述EA DNA与FA DNA全部或部分互补，所述EADNA携带荧光染料，优选地，所述荧光染料选自香豆素类(Coumarin Dyes)、荧光素类(Fluorescein Dyes)、罗丹明类(Rhodamine Dyes)、碳花青类(Cyanine Dyes)、新型染料Tide Flour(TF)或其组合，更优选地，所述荧光染料为FAM、CY3、CY5、CY7、AF488或AF647。

13.一种检测目的蛋白的方法，包括步骤：将待测样品与特异性结合目的蛋白的抗体相接触，其中，所述抗体在与待测样品接触之前或之后根据权利要求1-12任一所述的方法进行标记。

14.一种检测目的蛋白的方法，包括步骤：

1)将待测样品与特异性结合目的蛋白的捕获抗体相接触；

2)提供根据权利要求1-12任一所述方法标记的检测抗体；和

3)将所述检测抗体与步骤1)获得的混合物接触；

其中，步骤1)和2)的顺序可互换；

优选地，所述捕获抗体固定在固相基质上，例如磁珠或玻璃珠，更优选地，所述固相基质为磁珠。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，当待测目的蛋白为两种或更多种时，

步骤1)中使用两种或更多种捕获抗体；

提供根据权利要求1-12任一所述方法标记的两种或更多种检测抗体，每种检测抗体标记不同的荧光染料。

16.一种试剂盒，其包含生物素标记的激发剂，用于根据权利要求1-12任一所述的方法标记抗体；或

根据权利要求1-12任一所述方法获得的抗体。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中还包括亲和素。