CN110461463B - 合成多核苷酸分子的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及根据预限定的核苷酸序列合成多核苷酸分子的新方法。本发明还涉及合成后组装合成多核苷酸的方法，以及用于进行合成和/或组装方法的系统和试剂盒。

Description

合成多核苷酸分子的方法和试剂
技术领域
本发明涉及根据预限定的核苷酸序列合成多核苷酸分子的新方法。本发明还涉及合成后组装合成多核苷酸的方法，以及用于进行合成和/或组装方法的系统和试剂盒。
背景技术
目前存在两种用于合成和组装多核苷酸分子特别是DNA的主要方法。
亚磷酰胺化学是一种合成方法，其通过逐步方法将化学活化的T、C、A 或G的单体组装成长度约为100/150个碱基的寡核苷酸。化学反应步骤是高度敏感的，并且条件在完全无水(完全不存在水)、水性氧化和酸性条件之间交替 (Roy和Caruthers，Molecules，2013，18，14268-14284)。如果来自先前反应步骤的试剂尚未完全除去，则这将对未来的合成步骤产生不利影响。因此，该合成方法限于产生长度约为100个核苷酸的多核苷酸。
聚合酶合成方法使用聚合酶使用T、C、A和G三磷酸合成DNA模板的互补链。反应条件是含水的和温和的，并且该方法可用于合成长度为数千碱基的DNA多核苷酸。该方法的主要缺点是单链和双链DNA不能通过该方法从头合成，它需要从中制备拷贝的DNA模板。(Kosuri和Church，Nature Methods，2014，11，499-507)。
因此，先前的方法不能用于在没有复制的预先存在的模板分子的帮助下从头合成双链DNA。
本发明人开发了新的方法，通过该方法可以以逐步的方式从头合成单链和双链多核苷酸分子，而无需复制预先存在的模板分子。这些方法还避免了与亚磷酰胺化学技术相关的极端条件，相反，在中性pH附近的温和水性条件下进行。这样的方法也能使单链或双链多核苷酸分子的从头合成与当前合成方法具有>100聚体的核苷酸长度至完整基因组相比具有潜在的108改进，提供了广泛的在合成生物学可能的应用。
发明内容
本发明提供合成具有预定序列的双链多核苷酸分子的体外方法，该方法包括进行合成循环，其中在每个循环中通过掺入预定序列的核苷酸延伸第一多核苷酸链，然后通过掺入核苷酸延伸与第一链杂交的第二多核苷酸链，从而与第一链的掺入的核苷酸形成核苷酸对。优选地，该方法用于合成DNA。
在本文所述的本发明的任何方法中，所述方法可以提供单链多核苷酸分子的合成，其中在合成具有预定序列的双链多核苷酸分子后，去除或复制和/或扩增双链多核苷酸分子的一条链，以提供单链多核苷酸分子。
在本文所述的本发明的任何方法中，所述方法提供双链或单链寡核苷酸的合成。因此，本文对使用本发明的任何方法合成双链多核苷酸的所有提及适用于合成双链寡核苷酸。
在本发明的方法中，每个循环可以包括通过将预定序列的核苷酸与连接的可逆封闭基团结合，然后延伸第二链来延伸第一链，其中在第二链延伸之前或之后除去可逆封闭基团。在任何这样的方法中，在每个循环中，核苷酸可以掺入支架多核苷酸中。
本发明提供如上所述和本文的方法，其中每个循环包括：
(1)提供支架多核苷酸；
(2)通过聚合酶的作用将预定序列的核苷酸掺入支架多核苷酸，所述核苷酸包括通过聚合酶防止进一步延伸的可逆终止子基团；
(3)在切割位点切割所述支架多核苷酸；
(4)将连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸，所述连接多核苷酸包含 (2)的预定序列的核苷酸的配偶体核苷酸，其中在连接时，预定序列的核苷酸与配偶体核苷酸配对；和
(5)从(2)的预定序列的核苷酸中去除所述可逆终止子基团。
在涉及支架多核苷酸的方法中，可以提供支架多核苷酸，其包含合成链和与其杂交的支持链，其中合成链包含引物链部分和辅助链部分。在任何这样的方法中，在将预定序列的核苷酸掺入支架多核苷酸的任何一个、多个或所有步骤之前，可以从支架多核苷酸中除去辅助链部分。
在涉及支架多核苷酸的任何此类方法中，合成链可以是第一链，支持链可以是第二链。
在任何这样的方法中，支持链可以通过连接多核苷酸连接到支持链而延伸，其中在每个合成循环中，所述连接多核苷酸包含与在该循环中掺入第一链中的预定的核苷酸形成核苷酸对的核苷酸。
连接多核苷酸可以是单链或双链的。优选地，连接多核苷酸是双链的。
在连接多核苷酸是双链的方法中，连接多核苷酸可以优选包含支持链和辅助链。在下一个合成循环中将预定序列的核苷酸掺入支架多核苷酸的步骤之前，可以从支架多核苷酸中除去辅助链，在这些方法中，在连接步骤后除去辅助链。
本发明提供如上所述的方法，其中步骤(1)包括提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链包含引物链部分，并且所述支持链包含通用核苷酸；其中步骤(3)包括在切割位点切割支架多核苷酸，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定，其中切割包括切割支持链并除去通用核苷酸；并且其中在步骤(4)中，连接多核苷酸包含支持链，所述支持链包含通用核苷酸，所述通用核苷酸有助于/限定用于下一循环的切割位点，并且其中所述连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸的支持链。
本发明提供一种如上所述的方法，包括：
(1)提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链包含通过单链断裂分开的引物链部分和辅助链部分，并且所述支持链包含通用核苷酸；
(2)通过聚合酶的作用掺入所述预定序列的第一核苷酸到合成链中，第一核苷酸包含通过聚合酶防止进一步延伸的可逆终止子基团；
(3)在切割位点切割支架多核苷酸，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定，其中切割包括切割支持链并除去通用核苷酸以在合成链中提供包含第一核苷酸的突出末端；
(4)将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸，所述连接多核苷酸包含支持链、辅助链和互补连接末端，所述连接末端包含在支持链中的通用核苷酸和第一核苷酸的配偶体核苷酸(其突出了辅助链)，以及在辅助链中的缺少磷酸基团的末端核苷酸，其中在将连接多核苷酸的支持链和切割的支架多核苷酸的支持链连接时，第一核苷酸与配偶体核苷酸配对，
(5)从第一核苷酸中除去可逆终止子基团；
(6)通过聚合酶的作用将预定的核苷酸序列的下一个核苷酸掺入支架多核苷酸的合成链中，下一个核苷酸包含通过聚合酶防止进一步延伸的可逆终止子基团；
(7)在切割位点切割支架多核苷酸，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定，其中切割包括切割支持链并除去通用核苷酸以在合成链中提供包含下一个核苷酸的突出末端；
(8)将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸，所述连接多核苷酸包含支持链、辅助链和互补连接末端，所述连接末端包含在支持链中的通用核苷酸和下一个核苷酸的配偶体核苷酸，其突出了辅助链，以及在辅助链中的缺少磷酸基团的末端核苷酸，其中在将连接多核苷酸的支持链和切割的支架多核苷酸的支持链连接时，所述下一个核苷酸与配偶体核苷酸配对；
(9)从下一个核苷酸中去除可逆终止子基团；和
(10)多次重复步骤6至9以提供具有预定核苷酸序列的双链多核苷酸。
在给定合成循环中的任何此类方法中，通用核苷酸占据以下中的位置n： (a)步骤1和6中的支架多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，合成链中的位置在该循环中掺入时将被预定序列的核苷酸占据，和(b)步骤4和8中连接多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，当其在下一个合成循环中掺入时，该合成链中的位置将被预定序列的下一个核苷酸占据；其中位置n-1是支持链中相对于通用核苷酸在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上占据的位置的下一个核苷酸位置；并且其中支架多核苷酸的支持链在步骤3和7中在位置n和n-1之间切割。
或者，在给定合成循环中的任何此类方法中，通用核苷酸占据以下中的位置n+1：(a)步骤1和6中的支架多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，合成链中的位置在该循环中掺入时将被预定序列的核苷酸占据，和(b)步骤4和8中连接多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，当其在下一个合成循环中掺入时，该合成链中的位置将被预定序列的下一个核苷酸占据；其中位置n-1是支持链中相对于在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上的位置n 的下一个核苷酸位置，并且其中位置n+1是支持链中相对于在向辅助链的近端/ 引物链的远端的方向上的位置n的下一个核苷酸位置；并且其中支架多核苷酸的支持链在步骤3和7中在位置n和n-1之间切割。
仍替代地，在给定合成循环中的任何此类方法中，通用核苷酸占据以下中的位置n：(a)步骤1和6中的支架多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，合成链中的位置在该循环中掺入时将被预定序列的核苷酸占据，和(b)步骤4和8中连接多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，当其在下一个合成循环中掺入时，该合成链中的位置将被预定序列的下一个核苷酸占据；其中位置n-1是支持链中的相对于在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上被通用核苷酸占据的位置的下一个核苷酸位置，并且其中位置n-2是支持链中在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上相对于位置n-1的下一个核苷酸位置；并且其中支架多核苷酸的支持链在步骤3和7中在位置n-1和n-2之间切割。
在上文和本文所述的任何此类方法中，其中通用核苷酸占据位置n并且其中支架多核苷酸的支持链在位置n和n-1之间被切割，该方法的性能可包括：
a)在步骤(1)/(6)中，支持链中的通用核苷酸位于与单链断裂相邻的辅助链的末端核苷酸对面，并与其配对(位置n)；
b)在步骤(2)/(6)中，第一个/下一个核苷酸在与支持链中的通用核苷酸相对的位置(位置n)掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与通用核苷酸配对而不是辅助链的末端核苷酸；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在通用核苷酸位置(位置n)和支持链中通用核苷酸位置旁边的核苷酸(在辅助链的远端/接近引物链的方向上位置n-1) 之间的位置处切割，其中切割在支架多核苷酸中产生单核苷酸突出端，所述支架多核苷酸包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；和
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的连接末端包含单核苷酸突出端，其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于辅助链的末端核苷酸对面，并与其配对；
ii.通用核苷酸位于支持链的末端核苷酸旁边(位置n)；
iii.支持链的末端核苷酸(位置n-1)突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)/(6)的第一/下一个核苷酸的配偶体核苷酸。
在上文和本文所述的任何此类方法中，其中通用核苷酸占据位置n+1并且其中支架多核苷酸的支持链在位置n和n-1之间被切割，该方法的性能可包括：
a)在步骤(1)中，支架链中提供支架多核苷酸，其核苷酸(位置n)是步骤 (2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，并与辅助链的末端核苷酸配对，并且支持链中的通用核苷酸位于配偶体核苷酸旁边(在辅助链的近端/引物链的远端的方向上位置n+1)；
b)在步骤(2)/(6)中，第一个/下一个核苷酸在与支持链中的配偶体核苷酸相对的位置(位置n)掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与配偶体核苷酸配对而不是辅助链的末端核苷酸；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在第一核苷酸(位置n)和第二核苷酸(位置n-1) 之间的位置处在辅助链的远端/引物链的近端的方向上从支持链中的通用核苷酸切割，其中切割去除通用核苷酸并在支架多核苷酸中产生单核苷酸突出端，其包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的互补连接末端包含单核苷酸突出端，其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于辅助链的倒数第二个核苷酸(位置 n+1)的对面，并与其配对；
ii.所述通用核苷酸位于支持链的倒数第二个核苷酸旁边(位置 n)；
iii.支持链的倒数第二个核苷酸与辅助链的末端核苷酸配对，并且是下一个合成循环的步骤(6)中下一个核苷酸的配偶体核苷酸；和
iv.支持链的末端核苷酸(位置n-1)突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，或者是当前合成循环的步骤(6)的新掺入核苷酸的配偶体核苷酸。
在上文和本文所述的任何此类方法中，其中通用核苷酸占据位置n并且其中支架多核苷酸的支持链在位置n-1和n-2之间被切割，该方法的性能可包括：
a)在步骤(1)/(6)中，支架多核苷酸的支持链中的通用核苷酸位于与单链断裂相邻的辅助链的末端核苷酸对面，并与其配对(位置n)；
b)在步骤(2)/(6)中，第一个/下一个核苷酸在与支持链中的通用核苷酸相对的位置掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与通用核苷酸配对而不是辅助链的末端核苷酸；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在第一核苷酸(位置n-1)和第二核苷酸(位置n- 2)之间的位置处在辅助链的远端/引物链的近端的方向上从支持链中的通用核苷酸切割，其中切割去除通用核苷酸并在支架多核苷酸中产生双核苷酸突出端，其包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸，其中合成链的末端核苷酸是掺入的第一/下一个核苷酸；
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的互补连接末端包含双核苷酸突出端，其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于与辅助链的末端核苷酸相对的(位置n)并与其配对；
ii.通用核苷酸位于支持链的倒数第二个核苷酸旁边(位置n-1)；和
iii.支持链的倒数第二个核苷酸(位置n-1)突出于辅助链的末端核苷酸(位置n-2)，并且是步骤(2)/(6)中第一/下一个核苷酸的配偶体核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种如上所述的和本文的方法，其中：
a)在步骤(1)中，支架链中提供支架多核苷酸，其核苷酸(位置n)是步骤 (2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，并且支持链中的通用核苷酸位于位置n+2(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)；
b)在步骤(2)/(6)中，第一/下一个核苷酸在与支持链中的配偶体核苷酸相对的位置(位置n)掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与配偶体核苷酸配对；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在第二核苷酸(位置n)和第三核苷酸(位置n-1) 之间的位置处在辅助链的远端/引物链的近端的方向上从支持链中的通用核苷酸切割，其中切割去除通用核苷酸并在支架多核苷酸中产生单核苷酸突出端，其包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的互补连接末端包含单核苷酸突出端，其中：
i.通用核苷酸位于支持链中与辅助链中的核苷酸相对的位置 n+2处并与其配对；
ii.支持链的倒数第二个核苷酸与辅助链的末端核苷酸配对，并且是下一个合成循环的步骤(6)中下一个核苷酸的配偶体核苷酸(位置n)；和
iii.支持链的末端核苷酸(位置n-1)突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，或者是当前合成循环的步骤(6)的新掺入核苷酸的配偶体核苷酸。
在上面刚刚描述的该方法的修改中，在步骤(1)中，支持链中的通用核苷酸位于n+3位置(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)，并且在步骤 (4)/(8)中连接多核苷酸的互补连接末端具有位于n+3位置的支持链中的通用核苷酸。或者，在步骤(1)中，支持链中的通用核苷酸位于n+3+x位置(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)，并且在步骤(4)/(8)中连接多核苷酸的互补连接末端具有位于n+3+x位置的支持链中的通用核苷酸，其中x是1至10或更大的整数。
在另一替代实施方案中，本发明提供如上所述和本文所述的方法，其中：
a)在步骤(1)中，支架链中提供支架多核苷酸，其核苷酸(位置n)是步骤 (2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，并且支持链中的通用核苷酸位于位置n+1(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)；
b)在步骤(2)/(6)中，第一/下一个核苷酸在与支持链中的配偶体核苷酸相对的位置(位置n)掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与配偶体核苷酸配对；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在第二核苷酸(位置n-1)和第三核苷酸(位置n- 2)之间的位置处在辅助链的远端/引物链的近端的方向上从支持链中的通用核苷酸切割，其中切割去除通用核苷酸并在支架多核苷酸中产生双核苷酸突出端，其包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的互补连接末端包含双核苷酸突出端，并且其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于与辅助链中的核苷酸相对的位置 n+1处并与其配对；
ii.支持链的倒数第二个核苷酸(位置n-1)突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，或者是当前合成循环的步骤(6)的新掺入核苷酸的配偶体核苷酸；和
iii.支持链的n位核苷酸与辅助链的末端核苷酸配对，并且是下一个合成循环的步骤(6)中下一个核苷酸的配偶体核苷酸。
在上面刚刚描述的该方法的修改中，在步骤(1)中，支持链中的通用核苷酸位于n+2位置(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)，并且在步骤 (4)/(8)中连接多核苷酸的互补连接末端具有位于n+2位置的支持链中的通用核苷酸。或者，在步骤(1)中，支持链中的通用核苷酸位于n+2+x位置(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)，并且在步骤(4)/(8)中连接多核苷酸的互补连接末端具有位于n+2+x位置的支持链中的通用核苷酸，其中x是1至10或更大的整数。
在上文和本文所述的任何方法中，与预定序列的第一个/下一个核苷酸配对的核苷酸可以是与第一个/下一个核苷酸互补的核苷酸，优选天然互补的核苷酸。
在上文和本文所述的任何方法中，步骤(1)/(6)可包括提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中提供的合成链没有辅助链部分。
在上述和本文所述的任何方法中，在任何一个或多个合成循环中，或在所有合成循环中，在将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸的步骤之后和在将预定核苷酸序列的核苷酸掺入支架多核苷酸的合成链的步骤之前，可以从支架多核苷酸中除去合成链的辅助链部分。在任何这样的方法中，合成链的辅助链部分可以通过以下方式从支架多核苷酸中除去：(i)将支架多核苷酸加热至约80℃至约95℃的温度并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，(ii)用尿素溶液(例如8M尿素)处理支架多核苷酸并将辅助链部分与支架多核苷酸分离， (iii)用甲酰胺或甲酰胺溶液(例如100％甲酰胺)处理支架多核苷酸并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，或(iv)使支架多核苷酸与单链多核苷酸分子接触，所述单链多核苷酸分子包含与辅助链部分的序列互补的核苷酸序列区域，从而竞争性地抑制辅助链部分与支架多核苷酸的杂交。
在上文和本文所述的任何此类方法中，其中通用核苷酸占据位置n并且其中支架多核苷酸的支持链在位置n和n-1之间被切割，每个切割步骤可以包括第一步，其包括去除通用核苷酸，从而形成无碱基位点，和第二步，其包括在所述无碱基位点切割支持链。在任何这样的方法中，第一步可以用核苷酸切除酶进行。核苷酸切除酶可以是3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶。核苷酸切除酶可以是人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)。在任何这样的方法中，第二步可以用作为碱的化学品进行。碱可以是NaOH。在任何这样的方法中，第二步可以用具有无碱基位点切割活性的有机化学品进行。所述有机化学品可以是 N,N'-二甲基乙二胺。在任何这样的方法中，第二步可以用具有无碱基位点切割酶活性的酶如内切核酸酶VIII进行。
在上文和本文所述的任何此类方法中，其中通用核苷酸占据位置n+1并且其中支架多核苷酸的支持链在位置n和n-1之间切割，或者在上文和本文所述的任何此类方法中，其中通用核苷酸占据位置n并且其中支架多核苷酸的支持链在位置n-1和n-2之间被切割，切割步骤可以包括用酶切割支持链。酶可以在靠近引物链部分的方向上与通用核苷酸相邻的核苷酸之后切割支持链，从而在包含第一/下一个核苷酸的合成链中产生突出端。这种酶可以是内切核酸酶 V。
在上文和本文所述的任何方法中，合成的双链多核苷酸的两条链可以是 DNA链。合成链和支持链可以是DNA链。在这种情况下，掺入的核苷酸优选是dNTP，优选地是包含可逆终止子基团的dNTP。在任何此类方法中，包含可逆终止子基团的任何一种或多种或所有掺入的核苷酸可包含3’-O-烯丙基-dNTP 或3’-O-叠氮基甲基-dNTP。
在上文和本文所述的任何方法中，合成的双链多核苷酸的第一链可以是 DNA链，合成的双链多核苷酸的第二链可以是RNA链。合成链可以是RNA 链，支持链可以是DNA链。在这种情况下，掺入的核苷酸优选为NTP，优选地是包含可逆终止子基团的NTP。在任何此类方法中，包含可逆终止子基团的任何一种或多种或所有掺入的核苷酸可以是3’-O-烯丙基-NTP或3’-O-叠氮基甲基-NTP。
在上述和本文所述的涉及将核苷酸掺入包含DNA的合成链中例如掺入一种或多种dNTP的任何方法中，所述酶可以是聚合酶，优选DNA聚合酶，更优选地是与未修饰的聚合酶相比具有增强的掺入包含可逆终止子基团的dNTP 的能力的修饰的DNA聚合酶。聚合酶可以是来自嗜热球菌(Thermococcus)种 9°N，优选地种9°N-7的天然DNA聚合酶的变体。
在上文和本文所述的涉及将核苷酸掺入包含RNA的合成链中例如掺入一种或多种NTP的任何方法中，所述酶可以是聚合酶，优选RNA聚合酶，例如 T3或T7 RNA聚合酶，更优选地是与未修饰的聚合酶相比具有增强的掺入包含可逆终止子基团的NTP的能力的修饰的RNA聚合酶。
在上文和本文所述的任何方法中，合成的双链多核苷酸的第一链可以是 DNA链，合成的双链多核苷酸的第二链可以是RNA链。或者，合成的双链多核苷酸的第一链可以是RNA链，合成的双链多核苷酸的第二链可以是DNA 链。
在上文和本文所述的任何方法中，从第一个/下一个核苷酸去除可逆终止子基团的步骤可以用三(羧乙基)膦(TCEP)进行。
在上文和本文所述的任何方法中，将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸的步骤优选用连接酶进行。连接酶可以是T3 DNA连接酶或T4 DNA连接酶。
在上文和本文所述的任何方法中，在步骤(1)和/或(6)中，辅助链和与其杂交的支持链部分可通过发夹环连接。
在上文和本文所述的任何方法中，在步骤(1)中，包含引物链部分和与其杂交的支持链部分的合成链可以通过发夹环连接。
在上文和本文描述的任何方法中，在步骤(1)和/或(6)中：
a)辅助链和与其杂交的支持链部分可以通过发夹环连接；和
b)包含引物链部分的合成链和与其杂交的支持链部分可以通过发夹环连接。
在上文和本文所述的任何方法中，至少一种或多种或所有连接多核苷酸可以作为单个分子提供，所述单个分子包含在与突出端相对的末端连接支持链和辅助链的发夹环。在上文和本文所述的任何方法中，每个合成循环的连接多核苷酸可以作为单个分子提供，每个单个分子包含在与突出端相对的末端连接支持链和辅助链的发夹环。
在上文和本文所述的任何方法中，在步骤(1)中，包含引物链部分和与其杂交的支持链部分的合成链可以连接到共同表面。引物链部分和与其杂交的支持链部分可各自包含可切割的接头，其中接头可被切割以在合成后从表面分离双链多核苷酸。
在上文和本文所述的任何方法中，在步骤(1)中，合成链的引物链部分和与其杂交的支持链部分可以通过发夹环连接，并且其中发夹环连接至表面。
在上文和本文所述的任何方法中，发夹环可以通过可切割的接头与表面连接，其中可以切割接头以在合成后从表面分离双链多核苷酸。可切割接头可以是UV可切割接头。
在上文和本文所述的任何方法中，多核苷酸所附着的表面可以是微粒的表面或平的表面。
在上文和本文所述的任何方法中，多核苷酸所附着的表面可包含凝胶。该表面包含聚丙烯酰胺表面，例如约2％的聚丙烯酰胺，优选其中聚丙烯酰胺表面与固体载体如玻璃偶联。
在上文和本文所述的任何方法中，包含引物链部分和与其杂交的支持链部分的合成链可以通过一个或多个共价键连接到共同表面。一个或多个共价键可以在共同表面上的官能团和支架分子上的官能团之间形成，其中支架分子上的官能团可以是胺基、硫醇基、硫代磷酸酯基或硫代酰胺基。共同表面上的官能团可以是溴乙酰基，任选地其中溴乙酰基在使用N-(5-溴乙酰基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)衍生的聚丙烯酰胺表面上提供。
在上文和本文所述的任何方法中，从预定序列的核苷酸中去除可逆终止子基团的步骤可以在切割步骤之前或在连接步骤之前进行。
在上文和本文所述的任何方法中，与上文和本文所述的任何合成循环有关的反应可以在微流体系统内以液滴进行。微流体系统可以是电润湿系统。微流体系统可以是电介质上电润湿系统(EWOD)。
在一个相关方面，本发明进一步提供了通用核苷酸在合成具有预定序列的双链多核苷酸的体外方法中的用途，其中通用核苷酸用于在每个合成循环期间产生多核苷酸切割位点，其中在每个合成循环中，所述用途包括：提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链包含引物链部分和任选地通过单链断裂与所述引物链部分分开的辅助链部分，并且其中通用核苷酸提供在支持链中；通过聚合酶将包含可逆终止子基团的预定序列的新核苷酸掺入合成链中，其中新核苷酸占据支架多核苷酸中与通用核苷酸接近的位置，从而限定包含通用核苷酸的多核苷酸切割位点；在切割位点切割支架多核苷酸，其中从支架多核苷酸中除去通用核苷酸，在支架多核苷酸中产生切割末端，并在包含新核苷酸的合成链中产生突出末端；其中所述切割的末端充当连接多核苷酸的连接受体位点，所述连接多核苷酸具有支持链和与其杂交的辅助链，所述支持链包含与支架多核苷酸的合成链中的新核苷酸配对的核苷酸，并且还包含用于下一合成循环的新的通用核苷酸。通用核苷酸在合成具有预定序列的双链多核苷酸的方法中的这种用途可以使用上文和本文限定和描述的任何特定方法实施。
在相关方面，本发明进一步提供了用预定的核苷酸延伸多核苷酸分子的合成链的体外方法，该方法包括：提供包含所述合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链包含引物链部分和任选地通过单链断裂与所述引物链部分分开的辅助链部分，并且其中通用核苷酸提供在支持链中；通过聚合酶将包含可逆终止子基团的预定的核苷酸掺入合成链中，其中所述预定的核苷酸占据支架多核苷酸中与通用核苷酸接近的位置，从而限定包含通用核苷酸的多核苷酸切割位点；在切割位点切割支架多核苷酸，其中从支架多核苷酸中除去通用核苷酸，在支架多核苷酸中产生切割末端，并在包含所述预定的核苷酸的合成链中产生突出末端；其中所述切割的末端充当连接多核苷酸的连接受体位点，所述连接多核苷酸具有支持链和与其杂交的辅助链，所述支持链包含与支架多核苷酸的合成链中的所述预定的核苷酸配对的核苷酸，并且还包含用于下一合成循环的新的通用核苷酸。在用预定的核苷酸延伸多核苷酸分子的合成链的任何这种方法中，该方法可以使用上文和本文限定和描述的任何特定方法实施。
在相关方面，本发明进一步提供合成具有预定序列的双链多核苷酸的体外方法，该方法包括合成循环，并且其中每个合成循环包括：提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链包含引物链部分和任选地通过单链断裂与所述引物链部分分开的辅助链部分，并且其中通用核苷酸提供在支持链中；通过聚合酶将包含可逆终止子基团的预定序列的新核苷酸掺入合成链中，其中新核苷酸占据支架多核苷酸中与通用核苷酸接近的位置，从而限定包含通用核苷酸的多核苷酸切割位点；在切割位点切割支架多核苷酸，其中从支架多核苷酸中除去通用核苷酸，在支架多核苷酸中产生切割末端，并在包含新核苷酸的合成链中产生突出末端；将连接多核苷酸连接至所述切割末端，所述连接多核苷酸具有支持链和与其杂交的辅助链，所述支持链包含与支架多核苷酸的合成链中的新核苷酸配对的核苷酸，并且还包含用于下一合成循环的新的通用核苷酸；在切割或连接步骤后从所述新核苷酸中除去可逆终止子基团以产生用于所述下一合成循环的新支架多核苷酸；在连接步骤之后和在下一个循环的掺入步骤之前，任选地除去辅助链。在合成具有预定序列的双链多核苷酸的任何这种方法中，该方法可以使用上文和本文限定和描述的任何特定方法实施。
在相关方面，本发明进一步提供了在合成具有预定序列的双链多核苷酸的循环期间将包含通用核苷酸的连接多核苷酸连接至双链多核苷酸的体外方法，其中在合成循环期间双链多核苷酸用预定的核苷酸及其配偶体延伸；该方法包括提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链包含引物链部分和任选地通过单链断裂与所述引物链部分分开的辅助链部分，并且其中通用核苷酸提供在支持链中；通过聚合酶将包含可逆终止子基团的预定序列的新核苷酸掺入合成链中，其中新核苷酸占据支架多核苷酸中与通用核苷酸接近的位置，从而限定包含通用核苷酸的多核苷酸切割位点；在切割位点切割支架多核苷酸，其中从支架多核苷酸中除去通用核苷酸，在支架多核苷酸中产生切割末端，并在包含新核苷酸的合成链中产生突出末端；将连接多核苷酸连接至所述切割末端，所述连接多核苷酸具有支持链和与其杂交的辅助链，所述支持链包含与支架多核苷酸的合成链中的新核苷酸配对的核苷酸，并且还包含用于下一合成循环的新的通用核苷酸；在切割或连接步骤后从所述新核苷酸中除去可逆终止子基团以产生用于所述下一合成循环的新支架多核苷酸；在连接步骤之后和在下一个循环的掺入步骤之前，任选地除去辅助链。在合成具有预定序列的双链多核苷酸的循环期间将包含通用核苷酸的连接多核苷酸连接至双链多核苷酸的任何此类方法中，该方法可使用上文和本文限定和描述的任何特定方法实施。
在上文和本文所述的任何方法中，在合成之后，可以分离双链多核苷酸的链以提供具有预定序列的单链多核苷酸。
在上文和本文所述的任何方法中，在合成后，扩增双链多核苷酸或其区域，优选通过PCR扩增。
本发明还提供了组装具有预定序列的多核苷酸的方法，该方法包括进行上述和本文所述的任何合成方法以合成具有预定序列的第一多核苷酸和具有预定序列的一种或多种另外的多核苷酸并将所述第一多核苷酸和所述一种或多种另外的多核苷酸连接在一起。所述第一多核苷酸和所述一种或多种另外的多核苷酸可以优选地包含不同的预定序列。所述第一多核苷酸和所述一种或多种另外的多核苷酸可以是双链的或可以是单链的。可首先切割第一多核苷酸和一种或多种另外的多核苷酸以产生相容的末端，然后例如通过连接将其连接在一起。第一多核苷酸和一种或多种另外的多核苷酸可以在切割位点被限制酶切割以产生相容的末端。
上文和本文所描述的用于合成具有预定序列的双链多核苷酸的任何体外方法，和/或上文和本文所描述的用于组装具有预定序列的多核苷酸的任何体外方法可以在微流体系统内的液滴中进行。在任何这样的方法中，组装方法可以包括组装步骤，其包括提供包含具有预定序列的第一合成多核苷酸的第一液滴和包含另外的一种或多种具有预定序列的合成多核苷酸的第二液滴，其中使所述液滴彼此接触并且其中将合成多核苷酸连接在一起，从而组装包含第一核苷酸和另外的一种或多种多核苷酸的多核苷酸。在任何这样的方法中，合成步骤可以通过提供多个液滴来进行，每个液滴包含对应于合成循环步骤的反应试剂，并且根据合成循环的步骤将液滴依次递送到支架多核苷酸。在任何这样的方法中，在递送液滴之后并且在递送下一个液滴之前，可以进行洗涤步骤以除去过量的反应试剂。在任何这样的方法中，微流体系统可以是电润湿系统。在任何这样的方法中，微流体系统可以是电介质上电润湿系统(EWOD)。在任何这样的方法中，合成和组装步骤可以在同一系统内进行。
本发明另外提供了用于实施上文和本文所述的任何合成和/或组装方法的多核苷酸合成系统，其包含(a)反应区域阵列，其中每个反应区域包含至少一种支架多核苷酸；(b)将反应试剂输送到反应区域的装置，和任选地，(c)从支架多核苷酸切割合成的双链多核苷酸的装置。这种系统可以进一步包括用于以液滴形式提供反应试剂的装置和用于根据合成循环将液滴输送到支架多核苷酸的装置。
本发明进一步提供了与上文和本文所述的任何系统一起使用并且用于实施上文和本文所述的任何合成方法的试剂盒，该试剂盒包含对应于合成循环的步骤的反应试剂的体积。
本发明还提供了制备多核苷酸微阵列的方法，其中所述微阵列包含多个反应区域，每个区域包含一个或多个具有预定序列的多核苷酸，所述方法包括：
a)提供包含多个反应区域的表面，每个区域包含一个或多个双链锚或支架多核苷酸，和
b)在每个反应区域根据上述和本文所述的任何方法进行合成循环，从而在每个区域合成一种或多种具有预定序列的双链多核苷酸。
在此类方法中，在合成后，可以分离双链多核苷酸的链以提供微阵列，其中每个区域包含一个或多个具有预定序列的单链多核苷酸。
本发明还涉及核苷酸分子构建体，其包含具有SEQ ID NO：1至67中任一所定义的序列的多核苷酸分子。
本发明还涉及核苷酸分子构建体，其包含具有如SEQ ID NO：1至67中任一项所定义的序列的多核苷酸分子，其中SEQ ID NO：1至67中任一所定义的每个多核苷酸序列用图中所示的各个修饰(如果存在的话)以及本文所述的末端修饰进行修饰。
附图说明
本文提供的和下文描述的相关图显示了使用本发明方法的合成循环的一些或所有步骤，以及用于实施方法的方面的手段，例如寡核苷酸、表面、表面附着化学、接头等。这些图以及其所有描述和所有相关方法、试剂和方案仅用于说明而不应解释为限制。
相关的图，例如图1、2、3a、3b、3c、6a、7a、8a等显示合成循环的一些或所有步骤，包括掺入核苷酸(例如包含可逆终止子的核苷酸)、切割(例如将支架多核苷酸切割成第一部分和第二部分，其中第一部分包含通用核苷酸，第二部分包含掺入的核苷酸)、连接(例如将包含单链部分的多核苷酸构建体连接至包含掺入的核苷酸的切割的支架多核苷酸第二部分，其中单链部分包含与掺入的核苷酸互补的配偶体核苷酸)和去保护(例如从掺入的核苷酸中去除可逆终止子基团)。
图1.示例性方法版本1的方案
显示根据示例性方法版本1的第一合成循环的方案，包括提供支架多核苷酸、掺入、切割、连接和去保护的循环。该方案显示胸腺嘧啶核苷酸在第一个合成循环中的掺入(101、102)及其与配偶体腺嘌呤核苷酸相对的配对(104)，以及提供用于下一个合成循环的支架多核苷酸(106)。显示该对仅用于说明目的而不是限制性的，取决于所需的预定序列，它可以是任何对。核苷酸Z可以是任何核苷酸。核苷酸X可以是任何合适的核苷酸。该图还示出了对应于第二合成循环的参考标记。
图2.示例性方法版本2的方案
显示根据示例性方法版本2的第一合成循环的方案，包括提供支架多核苷酸、掺入、切割、连接和去保护的循环。该方案显示在第一个循环中掺入胸腺嘧啶核苷酸(201、202)及其与配偶体腺嘌呤核苷酸相对的配对(204)，以及在下一个合成循环中提供包含与胞嘧啶配对的鸟嘌呤的支架多核苷酸(206)。这些对仅用于说明目的而不是限制性的，取决于所需的预定序列，它们可以是任何对。核苷酸Z可以是任何核苷酸。核苷酸X可以是任何合适的核苷酸。该图还示出了对应于第二合成循环的参考标记。
图3a.示例性方法版本3的方案
显示根据示例性方法版本3的第一合成循环的方案，包括提供支架多核苷酸、掺入、切割、连接和去保护的循环。该方案显示在第一个循环中掺入胸腺嘧啶核苷酸(301、302)及其与配偶体腺嘌呤核苷酸相对的配对(304)，以及提供用于下一个合成循环的支架多核苷酸(306)。显示该对仅用于说明目的而不是限制性的，取决于所需的预定序列，它可以是任何对。该方案还显示胞嘧啶-鸟嘌呤对作为支架多核苷酸的组分并且不是预定序列的一部分。该对也仅出于说明目的而示出，并非限制性的，它可以是任何一对。核苷酸Z可以是任何核苷酸。核苷酸X可以是任何合适的核苷酸。
图3b.示例性方法版本4的方案
显示根据示例性方法版本4的第一合成循环的方案，包括提供支架多核苷酸、掺入、切割、连接和去保护的循环。该方案显示在第一个循环中掺入胸腺嘧啶核苷酸(401、402)及其与配偶体通用核苷酸相对的配对(404)，以及在下一个合成循环中提供包含与胞嘧啶配对的鸟嘌呤的支架多核苷酸(406)。这些对仅用于说明目的而不是限制性的，取决于所需的预定序列，它们可以是任何对。核苷酸X、Y和Z可以是任何核苷酸。
图3c.示例性方法版本5的方案
显示根据示例性方法版本5的第一合成循环的方案，包括提供支架多核苷酸、掺入、切割、连接和去保护的循环。该方案显示在第一个循环中掺入胸腺嘧啶核苷酸(501、502)及其与配偶体腺嘌呤核苷酸相对的配对(504)，以及在下一个合成循环中提供包含与胞嘧啶配对的鸟嘌呤的支架多核苷酸(506)。该方案还显示胞嘧啶-鸟嘌呤对(位置n-2)作为支架多核苷酸的组分并且不是预定序列的一部分。这些对仅用于说明目的而不是限制性的，取决于所需的预定序列，它们可以是任何对。核苷酸X、Y和Z可以是任何核苷酸。
图4.显示支架多核苷酸表面固定化的方案
方案显示(a至h)支架多核苷酸的可能的示例发夹环构型及其固定至表面。
方案(i和j)显示了用于将多核苷酸连接到表面的表面化学的实例。实施例显示了双链实施方案，其中两条链通过发夹连接，但是相同的化学方法可用于附接未连接的双链多核苷酸的一条或两条链。
图5.没有辅助链-掺入
a)方案以虚线框突出显示掺入步骤。
b)对于与肌苷相对掺入3’-O-修饰的dTTP评估DNA聚合酶。该图描绘了凝胶，其显示在50℃在Mn2+离子的存在下通过各种DNA聚合酶(BST、Deep Vent(Exo-)、终止子I和终止子IX)进行3’-O-改性dTTP掺入的结果。泳道1：使用Bst DNA聚合酶掺入3’-O-烯丙基-dTTP。泳道2：使用Bst DNA聚合酶掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP。泳道3：使用Deep vent(exo-)DNA聚合酶掺入3’- O-烯丙基-dTTP。泳道4：使用Deep vent(exo-)DNA聚合酶掺入3’-O-叠氮甲基- dTTP。泳道5：使用终止子I DNA聚合酶掺入3’-O-烯丙基-dTTP。泳道6：使用终止子IDNA聚合酶掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP。泳道7：使用终止子IX DNA聚合酶掺入3’-O-烯丙基-dTTP。泳道8：使用终止子IX DNA聚合酶掺入 3’-O-叠氮基甲基-dTTP。
c)对于与肌苷相对掺入3’-O-修饰的dTTP评估DNA聚合酶。使用各种 DNA聚合酶掺入的结果。
d)使用终止子IX DNA聚合酶评估掺入温度。该图描绘了凝胶，其显示了在不同温度下使用终止子IX DNA聚合酶在Mn2+离子存在下与肌苷相对掺入 3'-修饰的dTTP的结果。泳道1：在37℃掺入3’-O-烯丙基dTTP。泳道2：在 37℃掺入3'-O-叠氮基甲基dTTP。泳道3：在50℃掺入3’-O-烯丙基dTTP。泳道4：在50℃掺入3'-O-叠氮基甲基dTTP。泳道5：在65℃掺入3’-O-烯丙基 dTTP。泳道6：在65℃掺入3'-O-叠氮基甲基dTTP。
e)使用终止子IX DNA聚合酶评估掺入温度。在不同温度下进行的掺入的结果。
f)使用终止子IX DNA聚合酶评估掺入时Mn2+的存在。该图描绘了凝胶，其显示在65℃相对肌苷掺入3'-O-修饰的dTTP的结果。泳道S：标准。泳道1：没有Mn2+离子的3’-O-烯丙基-dTTP的掺入。泳道2：没有Mn2+离子的 3’-O-叠氮基甲基-dTTP的掺入。泳道3：在Mn2+离子存在下掺入3’-O-烯丙基- dTTP。泳道4：在Mn2+离子存在下掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP。
g)使用终止子IX DNA聚合酶评估掺入时Mn2+的存在。在存在和不存在 Mn2+离子的情况下掺入的结果。
h)用于研究掺入步骤的寡核苷酸。
图6.没有辅助链-切割
a)显示在不存在辅助链的情况下切割杂交的多核苷酸链的方案。切割步骤以虚线框突出显示。
b)凝胶显示分别在37℃和室温24℃下用hAAG和0.2M NaOH(强碱)切割寡核苷酸。泳道1.起始寡核苷酸。作为含有两条全长链的阳性对照的泳道2显示出切割与未切割的DNA比率为90％：10％的更高产率。包含没有辅助链的切割反应的泳道3显示切割与未切割的DNA的比率为10％：90％的低百分比产率。
c)凝胶显示寡核苷酸在37℃下用hAAG和Endo VIII切割。作为含有两条全长链的阳性对照的泳道2显示出切割与未切割的DNA比率为～90％：10％的更高产率。包含没有辅助链的切割反应的泳道3显示切割与未切割的DNA的比率为～7％：93％的低百分比产率。
d)用hAAG/Endo VIII和hAAG/化学碱切割寡核苷酸的总结。
e)用于研究切割步骤的寡核苷酸。
图7.没有辅助链-连接
a)显示在不存在辅助链的情况下连接杂交的多核苷酸链的方案。在虚线框中突出显示连接步骤。
b)凝胶显示在没有辅助链的情况下在室温(24℃)下用Quick T4 DNA连接酶连接寡核苷酸。泳道1含有36聚体TAMRA单链寡核苷酸和18聚体 TAMRA单链寡核苷酸的混合物。这些寡核苷酸用作参考条带。
c)用于研究连接步骤的寡核苷酸。
图8.用辅助链的版本1化学-掺入
a)方案以虚线框突出显示掺入步骤。
b)适用于研究掺入步骤的寡核苷酸。
图9.用辅助链的版本1化学-切割
a)显示在不存在辅助链的情况下切割杂交的多核苷酸链的方案。切割步骤以虚线框突出显示。
b)凝胶显示分别在37℃和室温24℃下用hAAG和0.2M NaOH(强碱)切割寡核苷酸。泳道1.起始寡核苷酸。作为含有两条全长链的阳性对照的泳道2显示出切割与未切割的DNA比率为90％：10％的更高产率。包含没有辅助链的切割反应的泳道3显示切割与未切割的DNA的比率为10％：90％的低百分比产率。包含与辅助链的切割反应的泳道4显示切割与未切割的DNA的比率为 50％：50％的相同百分比产率。
c)评估内切核酸酶VIII切割无碱基位点。凝胶显示寡核苷酸在37℃下用 hAAG和Endo VIII切割。作为含有两条全长链的阳性对照的泳道2显示出切割与未切割的DNA比率为～90％：10％的更高产率。包含没有辅助链的切割反应的泳道3显示切割与未切割的DNA的比率为～7％：93％的低百分比产率。包含有辅助链的切割反应的泳道4显示切割与未切割的DNA的比率为10％：90％的低百分比产率。
d)评估N,N'-二甲基乙二胺切割无碱基位点。凝胶显示寡核苷酸用hAAG 和100mMN,N'-二甲基乙二胺在37℃下切割。泳道1.起始寡核苷酸。作为含有两条全长链的阳性对照的泳道2显示100％切割的DNA。包含有辅助链的切割反应的泳道3显示切割与未切割的DNA的比率为90％：10％的较高百分比产率。
e)用hAAG/Endo VIII、hAAG/化学碱和hAAG/替代化学碱切割寡核苷酸的总结。
f)用于研究切割步骤的寡核苷酸。
图10.用辅助链的版本1化学-连接
a)显示在存在辅助链的情况下连接杂交的多核苷酸链的方案。在虚线框中突出显示连接步骤。
b)凝胶显示在存在辅助链的情况下在室温(24℃)下用Quick T4 DNA连接酶连接寡核苷酸。泳道1含有36聚体TAMRA单链寡核苷酸和18聚体 TAMRA单链寡核苷酸的混合物。这些寡核苷酸用作参考条带。在泳道2中，在20分钟后存在预期条带大小为36聚体的可观察的连接产物。
c)凝胶显示在辅助链存在下温育过夜后，在室温(24℃)下用Quick T4 DNA连接酶连接寡核苷酸。泳道1含有36聚体TAMRA单链寡核苷酸和18聚体TAMRA单链寡核苷酸的混合物。这些寡核苷酸作为参考条带。在泳道2 中，存在可观察到的完全连接的产物，其预期条带大小为36聚体。
d)用于研究连接步骤的寡核苷酸。
图11.用辅助链的版本2化学-掺入
a)显示掺入步骤的方案以橙色虚线框突出显示
b)凝胶显示在27℃通过终止子IX DNA聚合酶掺入3'-O-改性dTTP的结果。泳道1.起始材料。泳道2：1分钟后掺入，转化率为5％。泳道3：2分钟后掺入，转化率10％。泳道4：5分钟后掺入，转化率20％。泳道5：10分钟后掺入，转化率30％。泳道6：20分钟后掺入，转化率35％。
c)该图描绘了凝胶，其显示在37℃通过终止子IX DNA聚合酶掺入3'-O- 改性dTTP的结果。泳道1.起始材料。泳道2：1分钟后掺入，转化率为 30％。泳道3：2分钟后掺入，转化率60％。泳道4：5分钟后掺入，转化率 90％。泳道5：10分钟后掺入，转化率90％。泳道6：20分钟后掺入，转化率 90％。
d)凝胶显示在47℃通过终止子IX DNA聚合酶掺入3'-O-改性dTTP的结果。泳道1.起始材料。泳道2：1分钟后掺入，转化率为30％。泳道3：2分钟后掺入，转化率65％。泳道4：5分钟后掺入，转化率90％。泳道5：10分钟后掺入，转化率90％。泳道6：20分钟后掺入，转化率90％。
e)凝胶显示在27℃通过终止子IX DNA聚合酶掺入3'-O-改性dTTP的结果。泳道1.起始材料。泳道2：1分钟后掺入，转化率为70％。泳道3：2分钟后掺入，转化率85％。泳道4：5分钟后掺入，转化率92％。泳道5：10分钟后掺入，转化率96％。泳道6：20分钟后掺入，转化率96％。
f)凝胶显示在37℃通过终止子IX DNA聚合酶掺入3'-O-改性dTTP的结果。泳道1.起始材料。泳道2：1分钟后掺入，转化率为85％。泳道3：2分钟后掺入，转化率95％。泳道4：5分钟后掺入，转化率96％。泳道5：10分钟后掺入，转化率96％。泳道6：20分钟后掺入，转化率96％。
g)凝胶显示在47℃通过终止子IX DNA聚合酶掺入3'-O-改性dTTP的结果。泳道1.起始材料。泳道2：1分钟后掺入，转化率为85％。泳道3：2分钟后掺入，转化率90％。泳道4：5分钟后掺入，转化率96％。泳道5：10分钟后掺入，转化率96％。泳道6：20分钟后掺入，转化率96％。
h)在各种温度和Mn2+离子存在下掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP的总结。
i)凝胶显示在37℃在Mn2+的存在下通过终止子IX DNA聚合酶与互补碱基相对3'-O-改性的dNTP的掺入结果。泳道1.起始材料。泳道2：3’-O-叠氮基甲基-dTTP掺入5分钟。泳道3：3’-O-叠氮基甲基-dATP掺入5分钟。泳道4： 3’-O-叠氮基甲基-dCTP掺入5分钟。泳道5：3’-O-叠氮基甲基-dGTP掺入5分钟。
j)用于研究掺入步骤的寡核苷酸。
图12.用辅助链的版本2化学-切割
a)显示在辅助链存在下切割杂交的多核苷酸链的方案。切割步骤以橙色虚线框突出显示。
b)凝胶显示用Endo V在37℃下切割寡核苷酸。泳道1.起始寡核苷酸。作为含有两条全长链的阳性对照的泳道2显示出切割与未切割的DNA比率为 80％：20％的产率。包含没有辅助链的切割反应的泳道3显示出高得多的切割的DNA产率>99％。包含有辅助链的切割反应的泳道4也显示出>99％的DNA 切割产率。
c)内切核酸酶V的切割研究总结。
d)用于研究切割步骤的寡核苷酸。
图13.用辅助链的版本2化学-连接
a)显示在不存在辅助链的情况下连接杂交的多核苷酸链的方案。连接步骤以橙色虚线框突出显示。
b)用于研究连接步骤的寡核苷酸。
图14.用辅助链的版本2化学-脱保护
a)显示脱保护步骤的方案在橙色虚线框中突出显示。
b)该图描绘了凝胶，其显示在掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP后通过50mM TCEP脱保护3’-O-叠氮基甲基的结果。泳道1：起始引物。泳道2：在Mn2+存在下掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP。泳道3：通过添加所有天然dNTP在泳道2 中延伸产物。泳道4：通过50mM TCEP将泳道2中的产物(0.5μM)脱保护。泳道5：通过添加所有天然dNTP在泳道4中延伸产物。
c)该图描绘了凝胶，其显示在掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP后通过300mM TCEP脱保护3’-O-叠氮基甲基的结果。泳道1：起始引物。泳道2：在存在 Mn2+下掺入3-O-叠氮基甲基-dTTP。泳道3：通过添加所有天然dNTP在泳道2 中延伸产物。泳道4：通过300mM TCEP将泳道2中的产物(0.5μM)脱保护。泳道5：通过添加所有天然dNTP在泳道4中延伸产物。
d)该图描绘了凝胶，其显示在掺入3’-O-叠氮基甲基-dCTP后通过50mM TCEP脱保护3’-O-叠氮基甲基的结果。泳道1：起始引物。泳道2：在存在 Mn2+下掺入3-O-叠氮基甲基-dCTP。泳道3：通过添加所有天然dNTP在泳道2 中延伸产物。泳道4：通过300mM TCEP将泳道2中的产物(0.5μM)脱保护。泳道5：通过添加所有天然dNTP在泳道4中延伸产物。
e)该图描绘了凝胶，其显示在掺入3’-O-叠氮基甲基-dCTP后通过300mM TCEP脱保护3’-O-叠氮基甲基的结果。泳道1：起始引物。泳道2：在存在 Mn2+下掺入3-O-叠氮基甲基-dCTP。泳道3：通过添加所有天然dNTP在泳道1 中延伸产物。泳道4：通过300mM TCEP将泳道1中的产物(0.5μM)脱保护。泳道5：通过添加所有天然dNTP在泳道3中延伸产物。
f).该图描绘了凝胶，其显示在掺入3’-O-叠氮基甲基-dATP后通过300mM TCEP脱保护3’-O-叠氮基甲基的结果。
泳道1：起始引物
泳道2：在存在Mn2+下掺入3-O-叠氮基甲基-dATP。泳道3：通过添加所有天然dNTP在泳道2中延伸产物。泳道4：通过300mM TCEP将泳道2中的产物(0.5μM)脱保护。泳道5：通过添加所有天然dNTP在泳道4中延伸产物。
g)该图描绘了凝胶，其显示在掺入3’-O-叠氮基甲基-dGTP后通过300mM TCEP脱保护3’-O-叠氮基甲基的结果。泳道1：起始引物。泳道2：在存在 Mn2+下掺入3-O-叠氮基甲基-dGTP。泳道3：通过添加所有天然dNTP在泳道2 中延伸产物。泳道4：通过300mM TCEP将泳道2中的产物(0.5μM)脱保护。泳道5：通过添加所有天然dNTP在泳道4中延伸产物。
h)TCEP在0.2μM DNA上脱保护的效率。
i)用于研究切割步骤的寡核苷酸。
图15.有双发夹模型的版本2化学-掺入
a)方案以虚线框突出显示掺入步骤。
b)对于与它的天然对应物相对掺入3’-O-修饰的dTTP评估DNA聚合酶。该图描绘了凝胶，其显示在37℃通过终止子IX DNA聚合酶掺入3'-O-改性 dTTP的结果。泳道1.起始材料。泳道2：掺入天然dNTP混合物。泳道3：通过终止子IX DNA聚合酶掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP。泳道4：通过添加所有天然dNTP在泳道3中延伸产物。
c)对于与它的天然对应物相对掺入3’-O-修饰的dTTP评估DNA聚合酶。适用于研究掺入步骤的寡核苷酸。
图16.有双发夹模型的版本2化学-切割
a)显示发夹寡核苷酸切割的方案。切割步骤以虚线框突出显示。
b)凝胶显示用Endo V在37℃下切割发夹寡核苷酸。泳道1.起始发夹寡核苷酸。作为在5分钟后的切割的发夹寡核苷酸的泳道2显示出高产率的消化 DNA，比率为～98％。作为在10分钟后的切割的发夹寡核苷酸的泳道3显示出高产率的消化DNA，比率为～99％。作为在30分钟后的切割的发夹寡核苷酸的泳道4显示出高产率的消化DNA，比率为～99％，以及在作为在1小时后的切割的发夹寡核苷酸的泳道5显示出高产率的消化DNA，比率为～99％。
c)用于研究切割步骤的寡核苷酸。
图17.有双发夹模型的版本2化学-连接
a)显示杂交发夹的连接的方案。在虚线框中突出显示连接步骤。
b)凝胶显示在存在辅助链的情况下在室温(24℃)下将发夹寡核苷酸用 Blunt/TADNA连接酶连接。泳道1含有起始发夹寡核苷酸。1分钟后连接的发夹寡核苷酸的泳道2显示出高产率的连接DNA产物，比率为～85％。2分钟后连接的发夹寡核苷酸的泳道3显示出高产率的消化DNA，比率为～85％。3分钟后连接的发夹寡核苷酸的泳道4显示出高产率的连接DNA产物，比率为～85％。4分钟后连接的发夹寡核苷酸的泳道5显示高产率的连接DNA产物，比率为～>85％。
c)用于研究连接步骤的发夹寡核苷酸。
图18.版本2化学-双发夹模型的完整循环
a)显示涉及酶掺入、切割、连接和脱保护步骤的完整循环的方案。
b)对于与它的天然对应物相对掺入3’-O-修饰的dTTP评估DNA聚合酶。该图描绘了凝胶，其显示在37℃通过终止子IX DNA聚合酶掺入3'-O-改性 dTTP的结果。泳道1.起始材料。泳道2：通过终止子IX DNA聚合酶掺入3’- O-叠氮基甲基-dTTP。泳道3：通过添加所有天然dNTP在泳道2中延伸产物。泳道4：通过内切核酸酶V在泳道2中切割产物。泳道5：通过钝性TA连接酶试剂盒在泳道4中连接产物。
c)适用于研究掺入步骤的寡核苷酸。
图19.版本2化学-使用辅助链的单发夹模型的完整循环
a)显示涉及酶掺入、切割、连接和脱保护步骤的完整循环的方案。
b)适用于研究掺入步骤的寡核苷酸。
图20.版本3化学-双发夹模型的完整循环
a)显示涉及酶掺入、切割、连接和脱保护步骤的完整循环的方案。
b)适用于研究掺入步骤的寡核苷酸。
图21.版本2化学-双发夹模型的完整双循环
a)显示涉及酶促掺入、去保护、切割和连接步骤的第一个完整循环的方案。
b)显示第一个完整循环后的第二个完整循环的方案，涉及酶促掺入、去保护、切割和连接步骤。
c)该图描绘了凝胶，其显示完整双循环实验，包括：掺入、去保护、切割和连接步骤。
泳道1.起始材料。
泳道2.用天然dNTP扩展起始材料。
泳道3.通过终止子IX DNA聚合酶掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP。
泳道4.通过添加所有天然dNTP在泳道3中延伸产物。
泳道5.TCEP在泳道3将产品脱保护。
泳道6.通过添加所有天然dNTP在泳道5中延伸产物。
泳道7.内切核酸酶V在泳道5中切割产物。
泳道8.通过钝性TA连接酶试剂盒在泳道7中连接产物。
泳道9.通过λ外切核酸酶切割泳道8中的产物。
泳道10.第二循环的起始材料-与泳道9中的材料相同。
泳道11.通过终止子IX DNA聚合酶掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP。
泳道12.通过添加所有天然dNTP在泳道11中延伸产物。
泳道13.TCEP在泳道11将产品脱保护。
泳道14.通过添加所有天然dNTP在泳道13中延伸产物。
泳道15.内切核酸酶V在泳道13中切割产物。
泳道16.通过钝性TA连接酶试剂盒在泳道15中连接产物。
d )用于研究的寡核苷酸。
图22
显示从根据本文所述方法合成的预定序列的多核苷酸的支架多核苷酸释放机制的实施例。
图23
用于根据本发明合成RNA的示例性方法的示意图。示例性方法显示在不存在辅助链的情况下合成。
图24
用于根据本发明合成RNA的示例性方法的示意图。示例性方法显示在辅助链存在下的合成。
图25
用于根据本发明合成RNA的示例性方法的示意图。示例性方法显示在辅助链存在下的合成。
图26
根据具有单发夹模型的合成方法版本2合成DNA的示例性方法的第1个完整循环的示意图，包括在掺入步骤之前使辅助链变性的步骤。
图27
根据具有单发夹模型的合成方法版本2合成DNA的示例性方法的第2个完整循环的示意图，包括在掺入步骤之前使辅助链变性的步骤。
图28
根据具有单发夹模型的合成方法版本2合成DNA的示例性方法的第3个完整循环的示意图，包括在掺入步骤之前使辅助链变性的步骤。
图29
实施例9中详述的实验中使用的寡核苷酸。
图30
凝胶显示对应于实施例9中详述的完整三循环实验的反应产物。
该图描绘了凝胶，其显示了完整的三循环实验的结果，包括：掺入、解封闭、切割和连接步骤。
泳道1.起始材料。
泳道2.用天然dNTP扩展起始材料
泳道3：通过终止子X DNA聚合酶掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP。
泳道4：通过添加所有天然dNTP延伸泳道3中的产物
泳道5：TCEP在泳道3中对产品进行解封闭
泳道6：通过添加所有天然dNTP延伸泳道5中的产物
泳道7：内切核酸酶V对泳道5中的产物的切割。
泳道8：通过T3 DNA连接酶在泳道7中连接产物
泳道9：第二循环的起始材料-与泳道9中的材料相同。
泳道10：通过添加所有天然dNTP在泳道9中延伸产物。
泳道11：通过终止子X DNA聚合酶掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP。
泳道12：通过添加所有天然dNTP在泳道11中延伸产物。
泳道13：TCEP在泳道11中对产品进行解封闭
泳道14：通过添加所有天然dNTP在泳道13中延伸产物。
泳道15：核酸内切酶V在泳道13中切割产物
泳道16：通过T3 DNA连接酶在泳道15中连接产物
泳道17：第三循环的起始材料-与泳道16中的材料相同。
泳道18：通过添加所有天然dNTP在泳道17中延伸产物。
泳道19：通过终止子X DNA聚合酶掺入3’-O-叠氮基甲基-dTTP。
泳道20：通过添加所有天然dNTP在泳道19中延伸产物。
泳道21：TCEP在泳道19中对产品进行解封闭
泳道22：通过添加所有天然dNTP在泳道21中延伸产物。
泳道23：核酸内切酶V在泳道21中切割产物
泳道24：通过T3 DNA连接酶在泳道23中连接产物
图31
来自聚丙烯酰胺凝胶表面的荧光信号掺入不同量的BRAPA，其暴露于 FITC-PEG-SH和FITC-PEG-COOH。
图32
测量来自聚丙烯酰胺凝胶表面上的荧光素通道的荧光信号，其掺入不同量的BRAPA，其暴露于FITC-PEG-SH和FITC-PEG-COOH。
图33
(a)显示没有接头固定在不同的样品上的发夹DNA的序列。
(b)显示接头固定在不同样品上的发夹DNA序的列。
图34
来自发夹DNA寡聚体的荧光信号，有和没有接头固定在溴乙酰基官能化的聚丙烯酰胺表面上。
图35
测量来自发夹DNA寡聚体的荧光，有和没有接头固定在溴乙酰基官能化的聚丙烯酰胺表面上。
图36
在掺入三磷酸盐后，来自发夹DNA寡聚体的荧光信号，有和没有接头固定在溴乙酰基官能化的聚丙烯酰胺表面上。
图37
在掺入三磷酸盐之后，测量来自发夹DNA寡聚体的荧光，其中有和没有接头固定在溴乙酰基官能化的聚丙烯酰胺表面上。
图38
(a)如实施例12中详述的每个反应步骤的实验概述和结果。
(b)实施例12中详述的实验中使用的寡核苷酸。
图39
显示在切割反应之前和之后来自发夹DNA寡聚体的荧光信号(实施例 12)。
图40
显示在切割反应之前和之后测量的来自发夹DNA寡聚体的荧光信号(实施例12)。
图41
显示含肌苷的链和用于连接反应的互补“辅助”链的序列(实施例12)。
图42
与发夹DNA寡聚体的荧光信号相关的结果，其对应于连接反应的监测 (实施例12)。
图43
与发夹DNA寡聚体的测量的荧光相关的结果，其对应于连接反应的监测 (实施例12)。
数字的说明
图4、5a、6a、7a、8a、9a、10a、11a、12a、13a、14a、15a、16a、 17a、18a、19a、20a、21a、21b、22、23、24、25、26、27和28中所示的结构将与图1、2和3a中所示的那些一致地解释。因此，在这些图中，双链支架多核苷酸分子的每个左手链涉及支持链(对应于图1、2和3a中的链“a”)；双链支架多核苷酸分子的每个右手链涉及合成链(对应于图1、2和3a中的链“b”)；所有支架多核苷酸分子包含较低的合成链，其对应于包含引物链部分的链(对应于图1、2和3a中的链“b”的实线和虚线)；在掺入新核苷酸之前，显示了某些支架多核苷酸分子(例如图8a和16a)，其上合成链对应于包含辅助链部分的链(对应于图1、2和3a中链“b”的虚线)；某些支架多核苷酸分子(例如图5a，6a和 7a中)显示没有辅助链部分(对应于图1、2和3a中不存在链“b”的虚线)；在连接步骤后，显示了某些支架多核苷酸分子(例如图26、27和28中)，其上合成链对应于包含辅助链部分的链(对应于图1、2和3a中链“b”的虚线)并且其中在下一个合成循环中掺入新核苷酸之前除去辅助链部分。
另外，在这些图中，在相关的情况下，显示每个新核苷酸与可逆终止子基团掺入在一起，标记为rtNTP并描绘为小的圆形结构(对应于图1、2和3a中的小三角形结构)和末端磷酸基团标记为“p”并描绘为小的椭圆形结构。
图4c、4d、4g、4h、15a、16a、17a、18a、20a、21a、21b和22显示支架多核苷酸分子，其中包含辅助链部分和支持链的链通过发夹环连接。图4b、 15a、16a、17a、18a、19a、20a、21a、21b、22、26、27和28显示了支架多核苷酸分子，其中包含引物链部分和支持链的链通过发夹环连接。
图20a和21a等图显示了支架多核苷酸分子，其中包含辅助链部分(右上链)和支持链(左上链)的链通过发夹环连接，并且在同一分子中过发夹环连接包含引物链部分(右下链)和支持链(左下链)的链。
具体实施方式
本发明提供了根据预定的核苷酸序列从头合成多核苷酸分子的方法。合成的多核苷酸优选为DNA，并且优选为双链多核苷酸分子。与现有的合成方法相比，本发明提供了优点。例如，所有反应步骤可以在温和pH的含水条件下进行，不需要广泛的保护和去保护程序。此外，合成不依赖于复制包含预定的核苷酸序列的预先存在的模板链。
本发明人已经确定，如本文所定义的通用核苷酸的使用允许新掺入的核苷酸在每个合成循环期间与其期望的配偶体核苷酸正确配对。通用核苷酸的使用允许在从头合成的区域内产生切割位点，这有利于切割和合成的重复循环。本发明提供了用于合成多核苷酸和用于组装包含此类合成多核苷酸的大片段的通用方法。
本文将通过参考包括五种方法版本的示例性方法更详细地描述本发明合成方法的某些实施方案。方法版本也在实施例中具体描述。应理解，所有示例性方法，包括五种方法版本，并不旨在限制本发明。本发明提供合成具有预定序列的双链多核苷酸分子的体外方法，该方法包括进行合成循环，其中在每个循环中通过掺入预定序列的核苷酸延伸第一多核苷酸链，然后通过掺入核苷酸延伸与第一链杂交的第二多核苷酸链，从而与第一链的掺入的核苷酸形成核苷酸对。优选地，该方法用于合成DNA。提供本文描述的具体方法作为本发明的实施方案。
反应条件
在一个方面，本发明提供了合成具有预定序列的双链多核苷酸的方法。在一个方面，本发明提供了合成具有预定序列的双链多核苷酸的方法。
在一些实施方案中，合成在适合于双链多核苷酸内的核苷酸杂交的条件下进行。通常在允许核苷酸与互补核苷酸杂交的条件下使多核苷酸与试剂接触。允许杂交的条件是本领域公知的(例如，Sambrook等人，2001，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:alaboratory manual)》，第3版，冷泉港实验室出版社；以及《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)》，格林出版与威利交叉科学出版社(GreenePublishing and Wiley- lnterscience)，纽约，(1995))。
将核苷酸掺入多核苷酸中可以在合适的条件下进行，例如使用聚合酶(例如终止子IX聚合酶)以在合适的温度(例如～65℃)下在合适的缓冲溶液存在下掺入修饰的核苷酸(例如3’-O-修饰的-dNTP)。在一个实施方案中，缓冲溶液可以包含2mM Tris-HCL、1mM(NH4)2SO4、1mM KCl、0.2mM MgSO4和0.01％
Figure GDA0003160615080000341
X-100。
多核苷酸的切割可以在合适的条件下进行，例如在合适的缓冲溶液存在下，在与酶相容的温度(例如37℃)下使用多核苷酸切割酶(例如内切核酸酶)。在一个实施方案中，缓冲溶液可包含5mM乙酸钾、2mM Tris-乙酸盐、1mM乙酸镁和0.1mM DTT。
多核苷酸的连接可以在合适的条件下进行，例如在合适的缓冲溶液存在下，在与酶相容的温度(例如室温)下使用连接酶(例如T4 DNA连接酶)。在一个实施方案中，缓冲溶液可以包含4.4mM Tris-HCl、7mM MgCl2、0.7mM二硫苏糖醇、0.7mM ATP、5％聚乙二醇(PEG6000)。
脱保护可以在合适的条件下进行，例如使用还原剂(例如TCEP)。例如，可以使用Tris缓冲液中的TCEP(例如终浓度为300mM)进行脱保护。
锚多核苷酸和支架多核苷酸
具有预定序列的双链多核苷酸通过本发明的方法通过将预定的核苷酸掺入预先存在的多核苷酸中来合成，所述多核苷酸在本文中称为支架多核苷酸，其可附接于或能够附接于表面，如本文所述。如本文更详细描述的，支架多核苷酸形成支持结构以容纳新合成的多核苷酸，并且如从本文的描述中显而易见的，其不包含如常规合成方法中那样复制的预先存在的模板链。如果支架多核苷酸附接于表面，则支架多核苷酸可称为锚多核苷酸。本文更详细地描述了用于将支架多核苷酸附接到表面以形成锚多核苷酸的表面附接化学。
在一个实施方案中，支架多核苷酸包含与互补支持链杂交的合成链。合成链包含聚合酶引物链部分和任选的由单链断裂或“缺口”分开的辅助链部分(例如图1至3a)。合成链的引物链部分和辅助链部分都可以与互补支持链杂交提供。或者，可以单独提供合成链的辅助链部分。可首先提供合成链的引物链部分，然后提供支持链和辅助链。或者，可以单独提供支架多核苷酸的组分。例如，可首先提供支持链，然后提供合成链的引物链部分，然后提供辅助链。可首先提供支持链，然后提供合成链的辅助链部分，然后提供引物链。可以在切割步骤之前提供辅助链部分。在掺入新的预定的核苷酸之前，可以从支架多核苷酸中省略辅助链部分。在掺入新的预定的核苷酸之前，例如通过变性，可以从支架多核苷酸中除去辅助链部分，如本文更详细描述的。在合适条件下混合组分后，支架多核苷酸在单独组分杂交时形成。
在单链断裂位点由聚合酶引发新的合成。因此，聚合酶将起作用以在单链断裂位点延伸引物链部分的末端核苷酸。合成链的辅助链部分和合成链的引物链部分之间的单链断裂或“缺口”通常通过将合成链的两个部分提供为分开的分子来实现，所述分开的分子在与支持链杂交后将对齐。通常在缺乏磷酸基团的情况下提供单链断裂位点处的辅助链的(5')末端核苷酸。缺乏末端磷酸基团防止辅助链部分的末端核苷酸与单链断裂位点处的引物链部分的末端核苷酸连接，从而维持单链断裂。单链断裂的产生和维持可以通过其他方式实现。例如，辅助链部分的末端核苷酸可以具有合适的封闭基团，其阻止与引物链部分的连接。优选地，在单链断裂位点处提供缺少末端磷酸基团的辅助链。
可以提供支架多核苷酸，其中每个支持和合成链在相邻末端不连接。支架多核苷酸可以在支架多核苷酸的两端提供有支持和合成链，它们在相邻末端连接，例如通过发夹环。支架多核苷酸可以在支架多核苷酸或任何其他合适的接头的一端提供有支持和合成链，它们在相邻末端连接，例如通过发夹环。
具有或不具有发夹的支架多核苷酸可以固定在固体支持物或表面上，如本文更详细描述的(参见图4)。
术语“发夹”或“发夹环”通常用于当前技术领域。术语“发夹环”通常也称为“茎环”。这些术语是指多核苷酸中的二级结构区域，其包含未配对核碱基的环，当多核苷酸分子的一条链由于分子内碱基配对而与相同链的另一部分杂交时形成。因此发夹可以类似于U形结构。这种结构的例子如图4所示。
核苷酸和通用核苷酸
可以通过本文描述的任何方法掺入合成多核苷酸中的核苷酸可以是核苷酸、核苷酸类似物和修饰的核苷酸。可以通过本文描述的任何方法将核苷酸、核苷酸类似物和修饰的核苷酸掺入合成的多核苷酸中。
在本文定义和描述的本发明的任何合成方法中，核苷酸优选作为包含如本文所述的可逆终止子基团的核苷酸掺入。
核苷酸可包含天然核碱基或非天然核碱基。核苷酸可含有天然核碱基、糖和磷酸基团。天然核碱基包含腺苷(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤 (G)和胞嘧啶(C)。可以进一步修饰核苷酸的一种组分。
核苷酸类似物是在碱基、糖或磷酸盐或其组合中在结构上被修饰并且仍然是聚合酶可接受作为掺入寡核苷酸链的底物的核苷酸。
非天然核碱基可以是在一定程度上将与靶多核苷酸中的所有核碱基键合例如氢键合的核碱基。非天然核碱基优选地是在某种程度上与包括核苷腺苷 (A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的核苷酸键合例如氢键合的核碱基。
非天然核苷酸可以是肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和解锁核酸(UNA)、桥接核酸(BNA)或吗啉代、硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。
非天然核苷酸可以包括经修饰的糖和/或经修饰的核碱基。经修饰的糖包含但不限于2’-O-亚甲基核糖。修饰的核碱基包括但不限于甲基化的核碱基。核碱基的甲基化是表观遗传修饰的公认形式，其具有改变基因和其他元件如微小RNA的表达的能力。核碱基的甲基化发生在离散的基因座上，该基因座主要是由CpG基序组成的二核苷酸，但也可以在CHH基序(其中H是A、C或 T)处发生。通常，在甲基化过程中，将甲基加到胞嘧啶碱基的第五个碳上以产生甲基胞嘧啶。因此，修饰的核碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶。
预定序列的核苷酸可以与配偶体核苷酸相对掺入以形成核苷酸对。配偶体核苷酸可以是互补核苷酸。互补核苷酸是这样的核苷酸，其能够在一定程度上与所述预定序列的核苷酸键合，例如氢键合。
通常，将预定序列的核苷酸掺入多核苷酸中与天然互补的配偶体核碱基相对。因此，可以掺入腺苷，与胸腺嘧啶相对，反之亦然。可以掺入鸟嘌呤，与胞嘧啶相对，反之亦然。可替代地，可以掺入预定序列的核苷酸，与其在一定程度上将键合例如氢键合的配偶体核碱基相对。
或者，配偶体核苷酸可以是非互补核苷酸。非互补核苷酸是这样的核苷酸，其不能够键合例如氢键至预定序列的核苷酸。因此，预定序列的核苷酸可以与配偶体核苷酸相对掺入以形成错配，条件是合成的多核苷酸总体上是双链的，并且其中第一链通过杂交与第二链连接。
术语“相对”应理解为涉及该术语在核酸生物化学领域中的正常使用，并且具体地涉及常规的Watson-Crick碱基配对。因此，序列5'-ACGA-3'的第一核酸分子可与序列5'-TCGT-3'的第二核酸分子形成双链体，其中第一分子的G将位于与第二分子的C相对并与之形成氢键。序列5'-ATGA-3'的第一核酸分子可以与序列5'-TCGT-3'的第二核酸分子形成双链体，其中第一分子的T与第二分子的G错配，但仍然位于与其相对，并将作为配偶体核苷酸。该原理适用于本文公开的任何核苷酸配偶体对关系，包括包含通用核苷酸的配偶体对。
在本文所述的所有方法中，支持链中的位置和合成链中的相对位置被赋予位置编号“n”。该位置是指支架多核苷酸的支持链中核苷酸的位置，其在任何给定的合成循环中与合成链中的在步骤(2)掺入时将被新掺入的预定序列的核苷酸占据的位置相对。它还指在步骤(4)中连接多核苷酸在支持链中的位置，该位置与合成链中的将在下一个合成循环中步骤(6)掺入时由新掺入的预定序列的核苷酸占据的位置相对。支持链中的位置和合成链中的相对位置都可以称为位置 n。关于参考，参见图1、2、3a、3b和3c。
术语“接近于”，其涉及预定序列的新掺入的核苷酸及其配偶体在支架多核苷酸中相对于通用核苷酸的位置的定位，应理解为与该术语在本发明的上下文中的正常使用有关。因此，在诸如本文所述的方法版本1的方法中，其中预定序列的新掺入的核苷酸(其占据位置“n”)最初具有通用核苷酸作为其配偶体(因此也占据位置n)，然后如上所述，新掺入的核苷酸与通用核苷酸“相对”定位。这是新掺入的核苷酸位于通用核苷酸附近的一个实例。或者，预定序列的新掺入的核苷酸(其占据位置n)最初可以具有与其配偶体不同的核苷酸，并且通用核苷酸可以占据不同的位置，例如如本文所述的方法版本2中的位置n+1。在这种情况下，新掺入的核苷酸位于通用核苷酸附近但不与通用核苷酸相对。在替代方法中，通用核苷酸可以从位置n递增地移除一个位置以占据位置例如 n+2、n+3、n+3+x，其中x是1到10或更大的整数等。在该替代方法中新掺入的核苷酸仍然位于通用核苷酸附近，条件是可以产生由通用核苷酸限定的切割位点，并且条件是本文所述的突出结构可以在切割后产生，允许随后的连接多核苷酸的连接。
核苷酸和核苷酸类似物可以优选作为核苷三磷酸提供。因此，在本发明的任何方法中，为了合成DNA多核苷酸，可以从2'-脱氧核糖核苷-5’-O-三磷酸(dNTP)掺入核苷酸，例如通过DNA聚合酶的作用。在本发明的任何方法中，为了合成RNA多核苷酸，可以从核糖核苷-5'-O-三磷酸(NTP)掺入核苷酸，例如通过RNA聚合酶的作用。三磷酸盐可以被四磷酸盐或五磷酸盐(一般地低聚磷酸盐)取代。这些低聚磷酸盐可以被其他烷基或酰基取代：
Figure GDA0003160615080000381
本发明的方法可以使用通用核苷酸。通用核苷酸可以用作支架分子的支持链的组分，以促进新掺入的核苷酸被正确地在合成的每一个循环期间与其期望的配偶体核苷酸配对。如果需要，通用核苷酸也可以作为预定核苷酸序列的组分掺入合成链中。
通用核苷酸是其中核碱基将在一定程度上键合例如氢键至所述预定序列的任何核苷酸的核苷碱基的核苷酸。通用核苷酸优选地是在某种程度上与包括核苷腺苷(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的核苷酸键合例如氢键合的核碱基。与其它核苷酸相比，通用核苷酸可以更强地与一些核苷酸结合。例如，包括核苷、2'-脱氧的通用核苷酸(I)将示出I-C>I-A>I-G约＝ I-T的配对的优先顺序。
可能的通用核苷酸的实例是肌苷或硝基吲哚。通用核苷酸优选地包括以下核碱基中的一个：次黄嘌呤、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚、6-硝基吲哚、3-硝基吡咯、硝基咪唑、4-硝基吡唑、4-硝基苯并咪唑、5-硝基吲唑、4-氨基苯并咪唑或苯基(C6-芳环)。通用核苷酸更优选地包括以下核苷中的一个：2’-脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2’-脱氧肌苷、7-脱氮-肌苷、2-氮杂-脱氧肌苷、2-氮杂-肌苷、4- 硝基吲哚2’-脱氧核苷、4-硝基吲哚核苷、5-硝基吲哚2’--脱氧核苷、5-硝基吲哚核苷、6-硝基吲哚2’-脱氧核苷、6-硝基吲哚核苷、3-硝基吡咯2’-脱氧核苷、 3-硝基吡咯核苷、次黄嘌呤的非环糖类似物、硝基咪唑2’-脱氧核苷、硝基咪唑核苷、4-硝基吡唑2’-脱氧核苷、4-硝基吡唑核苷、4-硝基苯并咪唑2’-脱氧核苷、4-硝基苯并咪唑核苷、5-硝基吲唑2’-脱氧核苷、5-硝基吲唑核苷、4-氨基苯并咪唑2’-脱氧核苷、4-氨基苯并咪唑核苷、苯基C-核苷或苯基C-2’-脱氧核糖基核苷。
通用碱基的一些例子如下所示：
Figure GDA0003160615080000391
Figure GDA0003160615080000401
还可以使用掺入可切割碱基的通用核苷酸，包括光可切割和酶促可切割的碱基，其一些实例如下所示。
光可切割碱基：
Figure GDA0003160615080000402
内切核酸酶III可切割的碱基类似物：
Figure GDA0003160615080000403
Figure GDA0003160615080000411
甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(Fpg)可切割的碱基类似物：
Figure GDA0003160615080000421
8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)可切割的碱基类似物：
Figure GDA0003160615080000422
hNeil1可切割的碱基类似物：
Figure GDA0003160615080000423
胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)可切割的碱基类似物：
Figure GDA0003160615080000424
人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)可切割的碱基类似物：
Figure GDA0003160615080000431
尿嘧啶DNA糖基化酶可切割的碱基：
Figure GDA0003160615080000432
人单链选择性单功能尿嘧啶-DNA糖基化酶(SMUG1)可切割的碱基：
Figure GDA0003160615080000433
5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶(ROS1)可切割的碱基：
Figure GDA0003160615080000441
(参见S.S.David,S.D.Williams Chemical reviews 1998,98,1221-1262 andM.I. Ponferrada-Marín,T.Roldán-Arjona,R.R.Ariza,Nucleic Acids Res 2009,37,4264– 4274)。
在涉及支架多核苷酸的任何方法中，通用核苷酸最优选包含2'-脱氧肌苷。
可以使用本文描述的任何合成方法掺入的表观遗传碱基的实例包括以下：
Figure GDA0003160615080000442
可以使用本文描述的任何合成方法掺入的修饰碱基的实例包括以下：
Figure GDA0003160615080000443
可使用本文所述的任何合成方法掺入的卤代碱基的实例包括以下：
Figure GDA0003160615080000444
其中R1＝F、Cl、Br、I、烷基、芳基、荧光标记、氨基炔丙基、氨基烯丙基。
其可以使用本文描述的任何合成方法掺入的可以用于例如附接/接头化学的氨基修饰的碱基的实例包括以下：
Figure GDA0003160615080000451
其中碱基＝A、T、G或C，具有炔烃或烯烃接头。
其可以使用本文描述的任何合成方法掺入的可以用于例如点击化学的修饰的碱基的实例包括以下：
Figure GDA0003160615080000452
可以使用本文描述的任何合成方法掺入的生物素修饰的碱基的实例包括以下：
Figure GDA0003160615080000453
其中碱基＝A、T、G或C，具有炔烃或烯烃接头。
可以使用本文所述的任何合成方法掺入的带有荧光团和猝灭剂的碱基的实例包括以下：
Figure GDA0003160615080000461
核苷酸掺入酶
可以使用任何合适的酶来使用本文描述的方法掺入预定的核苷酸。因此，在本文中限定和描述的涉及使用聚合酶的所有方法中，聚合酶可以被另一种能够在本发明方法的背景下发挥与聚合酶相同功能的酶取代。
优选地，聚合酶可用于本文所述的方法中。可以基于它们掺入修饰的核苷酸的能力来选择聚合酶，特别是具有连接的可逆终止子基团的核苷酸，如本文所述。在本文所述的示例性方法中，作用于DNA的所有聚合酶必须不具有 3'至5'外切核酸酶活性。优选地，聚合酶具有链置换活性。
因此，优选地，聚合酶是修饰的聚合酶，其与未修饰的聚合酶相比具有增强的掺入包含可逆终止子基团的核苷酸的能力。聚合酶更优选地是来自嗜热球菌(Thermococcus)种9°N，优选地种9°N-7的天然DNA聚合酶的基因工程变体。修饰的聚合酶的一个这样的实例是可从New England BioLabs获得的终止子IX DNA聚合酶。该酶具有增强的掺入3'-O-修饰的dNTP的能力。
可用于在本发明的任何方法中掺入可逆终止子dNTP的其他聚合酶的实例是DeepVent(exo-)、Vent(Exo-)、9°N DNA聚合酶、终止子DNA聚合酶、终止子IX DNA聚合酶、Klenow片段(Exo-)、Bst DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Sulfolobus DNA聚合酶I和Taq聚合酶。
可用于在本发明的任何方法中掺入可逆终止子NTP的其他聚合酶的实例是T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
可逆封闭基团
本文限定和描述的所有方法均涉及可逆封闭基团或可逆终止子基团。这些基团的作用是阻止酶在给定的合成循环中进一步延伸作用，使得只有预定序列的核苷酸可以可控制地用于延伸合成链，因此防止了非特异性核苷酸掺入。实现该效果的任何功能可以用于本文限定和描述的任何方法中。与核苷酸连接的可逆封闭基团/可逆终止子基团和解封闭步骤是实现该效果的优选方法。然而，这种效果可以通过适当的替代手段来实现。
任何合适的可逆封闭基团可以连接到核苷酸上，以防止在给定循环中掺入核苷酸后酶进一步延伸，并限制每个循环掺入至一个核苷酸。在本发明的任何方法中，可逆封闭基团优选是可逆终止子基团，其起到防止聚合酶进一步延伸的作用。以下提供可逆终止子的实例。
炔丙基可逆终止子：
Figure GDA0003160615080000471
烯丙基可逆终止子：
Figure GDA0003160615080000472
环辛烯可逆终止子：
Figure GDA0003160615080000481
氰乙基可逆终止子：
Figure GDA0003160615080000482
硝基苄基可逆终止子：
Figure GDA0003160615080000483
二硫化物可逆终止子：
Figure GDA0003160615080000484
叠氮基甲基可逆终止子：
Figure GDA0003160615080000491
氨基烷氧基可逆终止子：
Figure GDA0003160615080000492
具有与碱基连接的庞大基团的核苷三磷酸可以作为3'-羟基上的可逆终止子基团的替代物并且可以阻止进一步掺入。该基团可以通过TCEP或DTT去保护，产生天然核苷酸。
Figure GDA0003160615080000493
为了根据本发明的任何方法合成DNA多核苷酸，优选的修饰核苷是3'- O-修饰的-2'-脱氧核糖核苷-5'-O-三磷酸。为了根据本发明的任何方法合成RNA 多核苷酸，优选的修饰核苷是3'-O-修饰的-核糖核苷-5'-O-三磷酸。
优选的经修饰的dNTP是经修饰的dNTP，其为3'-O-烯丙基-dNTP和3'- O-叠氮基甲基-dNTP。
3'-O-烯丙基-dNTP如下所示。
Figure GDA0003160615080000501
3'-O-叠氮基甲基-dNTP如下所示。
Figure GDA0003160615080000502
本文描述和限定的本发明方法可以涉及脱保护或解封闭步骤。这样的步骤包括通过任何合适的方法除去可逆封闭基团(例如可逆终止子基团)，或以其他方式逆转阻断/终止子基团的功能以抑制酶/聚合酶的进一步延伸作用。
可以使用任何合适的试剂在去保护步骤中除去可逆终止子基团。
优选的脱保护试剂是三(羧乙基)膦(TCEP)。TCEP可用于在掺入后从3'-O- 烯丙基-核苷酸(与Pd0结合)和3'-O-叠氮基甲基-核苷酸去除可逆终止子基团。
脱保护试剂的实例提供如下。
炔丙基可逆终止子：
用Pd催化剂Na2PdCl4、PdCl2处理。
可以使用配体，例如：三苯基膦-3,3′,3″-三磺酸三钠盐。
烯丙基可逆终止子：
用Pd催化剂Na2PdCl4、PdCl2处理。
可以使用配体，例如：三苯基膦-3,3′,3″-三磺酸三钠盐。
叠氮基甲基可逆终止子：
通过硫醇(巯基乙醇或二硫苏糖醇)或三(2-羧乙基)膦-TCEP处理。
氰乙基可逆终止子：
氟化物-氟化铵、氟化四丁基铵(TBAF)处理。
硝基苄基可逆终止子：
暴露在UV光下
二硫化物可逆终止子：
通过硫醇(巯基乙醇或二硫苏糖醇)或三(2-羧乙基)膦-TCEP处理。
氨基烷氧基可逆终止子：
用亚硝酸盐(NO2 -、HNO2)pH＝5.5处理
可逆封闭基团(例如可逆终止子基团)可以通过在掺入步骤之后和切割步骤之前立即进行的步骤除去，条件是去除掺入步骤中的不需要的试剂以防止在去除可逆终止子基团后进一步掺入。可逆封闭基团(例如可逆终止子基团)可以通过在切割步骤之后和连接步骤之前立即进行的步骤除去。可逆封闭基团(例如可逆终止子基团)可以通过在连接步骤之后立即进行的步骤除去。
合成多核苷酸
具有根据本文所述方法合成的预定序列的多核苷酸是双链的。合成的多核苷酸总体上是双链的，并且其中第一链通过杂交与第二链连接。只要整个第一链通过杂交与第二链连接，可以容忍错配和非杂交区域。
具有根据本文所述方法合成的预定序列的双链多核苷酸可以保留为双链多核苷酸。或者，可以分离双链多核苷酸的两条链以提供具有预定序列的单链多核苷酸。允许双链多核苷酸的两条链分离的条件(熔融)是本领域公知的(例如，Sambrook等人，2001，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:a laboratory manual)》，第3版，冷泉港实验室出版社；以及《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)》，格林出版与威利交叉科学出版社(Greene Publishing and Wiley-lnterscience)，纽约，(1995))。
具有根据本文所述方法合成的预定序列的双链多核苷酸可以在合成后扩增。可以扩增双链多核苷酸的任何区域。双链多核苷酸的全部或任何区域可以与支架多核苷酸的全部或任何区域一起扩增。允许双链多核苷酸扩增的条件是本领域公知的(例如，Sambrook等人，2001，《分子克隆：实验室手册 (Molecular Cloning:a laboratory manual)》，第3版，冷泉港实验室出版社；以及《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in MolecularBiology)》，格林出版与威利交叉科学出版社(Greene Publishing and Wiley-lnterscience)，纽约， (1995))。因此，本文所述的任何合成方法可以进一步包括扩增步骤，其中如上所述扩增具有预定序列的双链多核苷酸或其任何区域。扩增可以通过任何合适的方法进行，例如聚合酶链反应(PCR)、聚合酶螺旋反应(PSR)、环介导的等温扩增(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持序列复制(3SR)、滚环扩增 (RCA)、链置换扩增(SDA)，多重置换扩增(MDA)、连接酶链反应(LCR)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、衍生化扩增方法(RAM)等。优选地，通过聚合酶链反应 (PCR)进行扩增。
具有根据本文所述方法合成的预定序列的双链或单链多核苷酸可以是任何长度。例如，多核苷酸的长度可以是至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或至少 500个核苷酸或核苷酸对。例如，长度上，多核苷酸可以是约10至约100个核苷酸或核苷酸对，约10至约200个核苷酸或核苷酸对，约10至约300个核苷酸或核苷酸对，约10至约400个核苷酸或核苷酸对和约10至约500个核苷酸或核苷酸对。多核苷酸可以是多达约1000个或更多个核苷酸或核苷酸对，长度多达约5000个或更多个核苷酸或核苷酸对或长度多达约100000个或更多个核苷酸或核苷酸对。
支架多核苷酸的切割
在需要存在支架多核苷酸的方法和连接前的切割步骤中，进行切割步骤的试剂的选择将取决于所用的具体方法。切割位点由支持链中通用核苷酸的特定位置以及一旦切割需要支架多核苷酸中的单核苷酸或双核苷酸突出端限定。因此，所需切割位点的构型和适当切割试剂的选择将取决于该方法中采用的特定化学，通过参考本文所述的示例性方法将很容易明白。
识别修饰碱基的DNA切割酶的一些实例显示在下表中：
Figure GDA0003160615080000541
Figure GDA0003160615080000551
连接多核苷酸
在需要支架多核苷酸存在的方法和切割后连接步骤中，连接多核苷酸的构型和结构的选择也取决于所用的具体方法。连接多核苷酸通常包含如本文所述的支持链和如本文所述的辅助链。连接多核苷酸中使用的支持链和辅助链可以与初始支架多核苷酸构建体中使用的那些相同或不同。例如，在连接多核苷酸的连接末端的支持链中对单核苷酸或双核苷酸突出端的需求将取决于所用的方法。通过参考本文描述的示例性方法可以容易地实现适当的结构。
连接多核苷酸的连接末端通常在与突出端相邻的辅助链中提供非磷酸化的末端核苷酸。这防止了合成链的辅助链部分与合成链的引物链部分的连接，从而保持合成链中的单链断裂。可以使用用于防止合成链中连接的替代方法。例如，阻断部分可以与辅助链中的末端核苷酸连接。此外，如下文进一步所述，在下一个合成循环中掺入下一个预定核苷酸之前，可以从支架分子中除去辅助链，例如通过变性。
连接
在涉及连接步骤的本发明方法中，可以使用任何合适的方法实现连接。优选地，连接步骤将通过连接酶进行。连接酶可以是修饰的连接酶，其对单碱基突出端底物具有增强的活性。连接酶可以是T3 DNA连接酶或T4 DNA连接酶。连接酶可以是钝性TA连接酶。例如，钝性TA连接酶可从New England BioLabs(NEB)获得。这是一种即用型T4 DNA连接酶、连接增强剂和优化的反应缓冲液的母混合溶液，专门配制用于改善平端和单碱基突出底物的连接和转化。用于连接(连结)单链和双链多核苷酸的分子、酶、化学品和方法是本领域技术人员公知的。
固相合成
根据本发明的合成方法产生的合成多核苷酸可优选使用固相或可逆固相技术合成。各种这样的技术在本领域中是已知的并且可以使用。在开始合成预定序列的新双链多核苷酸之前，可以将支架多核苷酸固定到表面上，例如平面，例如玻璃、基于凝胶的材料、或微粒例如珠子或官能化量子点的表面上。包含表面的材料本身可以与基底结合。例如，支架多核苷酸可以固定在基于凝胶的材料上，例如聚丙烯酰胺，并且其中基于凝胶的材料与支撑基底如玻璃结合。
多核苷酸可以直接或间接地固定或栓系到表面。例如，它们可以通过化学键合直接附着在表面上。它们可以通过中间表面间接地拴系在表面上，例如微粒或珠子的表面，例如在SPRI中或在电润湿系统中，如下所述。然后可以启动并完成合成循环，同时固定掺入新合成的多核苷酸的支架多核苷酸。
在此类方法中，可以在掺入预定序列的第一核苷酸之前将双链支架多核苷酸固定到表面。因此，这种固定的双链支架多核苷酸可以充当锚，以在合成期间和之后将预定序列的双链多核苷酸连接到表面。
这种双链锚/支架多核苷酸的仅一条链可以在分子同一端固定在表面上。或者，双链锚/支架多核苷酸的两条链可各自在分子同一末端固定在表面上。可以提供双链锚/支架多核苷酸，其中每条链在相邻末端连接，例如通过与新合成起始位点相对的末端的发夹环，并且连接的末端可以固定在表面上(例如如图4 中示意性描绘的)。
在涉及支架多核苷酸的方法中，如本文所述，支架多核苷酸可以在以预定序列掺入第一核苷酸之前附着于表面。因此，包含引物链部分和与其杂交的支持链部分的合成链可以分别附着于表面，如图4(a)和(c)所示。包含引物链部分和与其杂交的支持链部分的合成链可以在相邻末端连接，例如通过发夹环，例如在新合成起始位点的相对末端，并且连接末端可以拴在表面上，如图4(b) 和(d)所示。包含引物链部分和与其杂交的支持链部分的一条或另一条合成链可以分别附着于表面，如图4(e)至(h)所示。优选地，包含引物链部分和与其杂交的支持链部分的合成链附着于表面。
平表面上的固相合成
在开始合成预定序列的新双链多核苷酸之前，合成锚/支架多核苷酸可通过本领域已知的方法合成，包括本文所述的那些，并拴在表面上。
可以通过常用于产生附着于平表面的核酸微阵列的方法将预形成的多核苷酸拴在表面上。例如，可以产生锚/支架多核苷酸，然后将其点样或印刷到平表面上。可以使用接触印刷技术将锚/支架多核苷酸沉积在表面上。例如，可将固体或空心尖端或针浸入包含预形成的支架多核苷酸的溶液中并与平表面接触。或者，可以将寡核苷酸吸附到微型印模上，然后通过物理接触转移到平表面。非接触印刷技术包括热印刷或压电印刷，其中包含预形成的支架多核苷酸的亚纳升尺寸微滴可以使用与喷墨和喷泡印刷中使用的方法类似的方法从印刷尖端喷出。
单链寡核苷酸可以直接在平表面上合成，例如使用用于产生微阵列的所谓“芯片上”方法。然后，此类单链寡核苷酸可以充当附着位点以固定预先形成的锚/支架多核苷酸。
用于产生单链寡核苷酸的芯片上技术包括光刻法，其涉及使用通过光刻掩模引导的UV光来选择性地激活受保护的核苷酸，从而允许随后掺入新的受保护的核苷酸。UV介导的脱保护和预定核苷酸偶联的循环允许原位产生具有所需序列的寡核苷酸。作为使用光刻掩模的替代方案，可以通过使用喷墨印刷技术顺序沉积核碱基并使用偶联、氧化和去保护的循环来产生具有所需序列的寡核苷酸，从而在平表面上产生寡核苷酸(对于综述，见Kosuri和Church, Nature Methods,2014,11,499-507)。
在本文所述的任何合成方法中，包括如下所述的涉及可逆固定的方法，表面可由任何合适的材料制成。通常，表面可包括硅、玻璃或聚合物材料。表面可包括凝胶表面，例如聚丙烯酰胺表面，例如约2％聚丙烯酰胺，任选地使用N-(5-溴乙酰基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)衍生的聚丙烯酰胺表面，优选地聚丙烯酰胺表面与固体载体比如玻璃偶联。
可逆固定
具有预定序列的合成多核苷酸可以根据本发明使用促进可逆固定的结合表面和结构(例如微粒和珠子)来合成。固相可逆固定(SPRI)方法或改良方法是本领域已知的并且可以使用(例如参见DeAngelis M.M.等人(1995)Solid-Phase ReversibleImmobilization for the Isolation of PCR Products，Nucleic Acids Research，23(22)：4742-4743)。
表面可以以微粒的形式提供，例如顺磁珠。顺磁珠可以在磁场的影响下聚集。例如，顺磁表面可以具有化学基团，例如羧基，其在适当的附着条件下将充当核酸的结合部分，如下面更详细描述的。可以在适当的洗脱条件下从这些表面洗脱核酸。微粒和珠子的表面可以提供UV敏感的聚碳酸酯。在合适的固定缓冲液存在下，核酸可以与活化表面结合。
可使微粒和珠粒在反应溶液中自由移动，然后可逆地固定，例如通过将珠粒保持在微孔或蚀刻到表面中的凹坑中。珠子可以定位为阵列的一部分，例如通过使用附着于珠子的独特核酸“条形码”或通过使用颜色编码。
因此，在开始合成预定序列的新双链多核苷酸之前，可以合成根据本发明的锚/支架多核苷酸，然后可逆地固定到这样的结合表面上。通过本发明方法合成的多核苷酸可以合成，同时可逆地固定在这样的结合表面上。
微流体技术和系统
表面可以是电介质上电润湿系统(EWOD)的一部分。EWOD系统提供电介质涂覆的表面，其有助于以微滴形式的非常小的液体体积的微流体操纵(例如参见Chou,W-L.等人(2015)Recent Advances in Applications of Droplet Microfluidics,Micromachines,6:1249-1271.)。通过电润湿技术可以可编程地在芯片上创建、移动、分区和组合液滴体积。因此，电润湿系统提供了在合成期间和之后可逆地固定多核苷酸的替代手段。
具有预定序列的多核苷酸可以通过本文所述的方法在固相中合成，其中多核苷酸固定在EWOD表面上，并且通过电润湿技术促进每个循环中所需的步骤。例如，在涉及支架多核苷酸并需要掺入、切割、连接和去保护步骤的方法中，每个步骤所需的试剂以及用于除去用过的和不需要的试剂的任何所需洗涤步骤，可以以通过电润湿技术在电场的影响下传输的微滴的形式提供。
可以用于本发明的合成方法中的其他微流体平台是可用的。例如，可以使用通常用于核酸操作的基于乳液的微滴技术。在这样的系统中，微滴在通过混合两种不混溶的流体(通常是水和油)产生的乳液中形成。可以在微流体网络中可编程地创建、移动、分割和组合乳液微滴。水凝胶系统也可提供。在本文所述的任何合成方法中，微滴可以在任何合适的相容系统中操作，例如上述 EWOD系统和其他微流体系统，例如包含基于包含弹性体材料的组件的结构的微流体系统。
微滴可具有任何合适的尺寸，条件是它们与本文的合成方法相容。微滴尺寸将根据所采用的特定系统和系统的相关架构而变化。因此适当地可以调整尺寸。在本文所述的任何合成方法中，液滴直径可以在约150nm至约5mm的范围内。低于1μm的液滴直径可通过本领域已知的方法验证，例如通过涉及毛细管喷射方法的技术，例如
Figure GDA0003160615080000591
等人(Nature Physics，2007，3， pp737-742)中所述。
表面附着化学
尽管寡核苷酸通常是化学连接的，但它们也可以通过间接方式例如通过亲和相互作用附着于表面。例如，寡核苷酸可以用生物素官能化并结合到用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的表面上。
为了将多核苷酸固定到表面(例如平表面)、微粒和珠子等，可以使用各种表面附着方法和化学品。表面可以被官能化或衍生化以促进附着。这种功能化是本领域中已知的。例如，表面可以用以下各者进行功能化：多组氨酸标签(六组氨酸标签、6xHis-标签、His6标签或
Figure GDA0003160615080000592
)、Ni-NTA、链霉亲和素、生物素、寡核苷酸、多核苷酸(如DNA、RNA、PNA、GNA、TNA或LNA)、羧基、季胺基、硫醇基、叠氮基、炔基、DIBO、脂质、FLAG-标签(FLAG八肽)、多核苷酸结合蛋白、肽、蛋白质、抗体或抗体片段。表面可以用与锚/支架多核苷酸特异性地结合的分子或基团进行功能化。
适合于将多核苷酸连接到表面的化学物质的一些实例显示在图4i和图4j 中。
在本文所述的任何方法中，包含含有引物链部分和与其杂交的支持链部分的合成链的支架多核苷酸可以通过一个或多个共价键连接到共同表面。一个或多个共价键可以在共同表面上的官能团和支架分子上的官能团之间形成。支架分子上的官能团可以是例如胺基、硫醇基、硫代磷酸酯基或硫代酰胺基。共同表面上的官能团可以是溴乙酰基，任选地其中溴乙酰基在使用N-(5-溴乙酰基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)衍生的聚丙烯酰胺表面上提供。
在本发明的任何方法中，支架多核苷酸可以通过接头直接或间接附着于表面。可以使用任何合适的属性是生物相容且亲水的接头。
接头可以是直链接头或支链接头。
接头可包含烃链。烃链可包含2至约2000或更多个碳原子。烃链可包含亚烷基，例如C2至约2000或更多个亚烷基。烃链可具有通式-(CH2)n-，其中n 为2至约2000或更高。烃链可任选地被一个或多个酯基(即–C(O)-O-)或一个或多个酰胺基团(即-C(O)-N(H)-)中断。
可以使用选自包括以下的组的任何接头：PEG、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚-2-甲基-2-噁唑啉(PMOXA)、两性离子聚合物，例如聚(羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯)(PCBMA)、聚[N-(3-磺丙基)-N-甲基丙烯酰氧基乙基-N,N 二甲基铵甜菜碱](PSBMA)、糖聚合物和多肽。
接头可包含通式为-(CH2-CH2-O)n-的聚乙二醇(PEG)，其中n为1至约 600或更高。
接头可包括具有通式为-[(CH2-CH2-O)n-PO2 --O]m-的低聚乙二醇磷酸酯单元，其中n是从1到约600或更多，且m可以是1-200或更多。
任何上述接头可以在接头的一端连接至如本文所述的支架分子，并且在接头的另一端连接至第一官能团，其中第一官能团可以提供与表面的共价连接。第一官能团可以是例如胺基、硫醇基、硫代磷酸酯基或硫代酰胺基，如本文进一步描述的。表面可以用另外的官能团官能化以提供与第一官能团的共价键。另外的官能团可以是例如本文进一步描述的2-溴乙酰氨基。任选地，在使用N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)衍生的聚丙烯酰胺表面上提供溴乙酰基。表面上的进一步官能团可以是溴乙酰基，任选地其中溴乙酰基在使用N- (5-溴乙酰基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)衍生的聚丙烯酰胺表面上提供，并且适当时第一官能团可以是例如胺基、巯基、硫代磷酸酯基或硫代酰胺基。多核苷酸附着的表面可包含凝胶。该表面包含聚丙烯酰胺表面，例如约2％的聚丙烯酰胺，优选聚丙烯酰胺表面与固体载体如玻璃偶联。
在本发明的任何方法中，支架多核苷酸可任选地通过掺入支架多核苷酸中的支化核苷酸连接至接头。任何合适的支化核苷酸可以与任何合适的相容性接头一起使用。
在开始本发明的合成循环之前，可以合成支架多核苷酸，其中一个或多个支化核苷酸被掺入支架多核苷酸中。将一个或多个支化核苷酸掺入支架多核苷酸中并因此可以连接接头的确切位置可以变化，并且可以根据需要选择。该位置可以例如在支持链和/或合成链的末端或例如在包含发夹环的实施方案中将支持链连接至合成链的环区域中。
在支架多核苷酸的合成期间，可以将一个或多个支化核苷酸掺入支架多核苷酸中，其中封闭基团阻断支化部分的反应基团。然后可以在偶联至接头的分支部分之前除去(解封闭)封闭基团，或者如果接头包含多个单元，则将接头的第一单元(分子)除去。
在支架多核苷酸的合成期间，可以将一个或多个支化核苷酸掺入支架多核苷酸中，该支架多核苷酸具有适合用于随后的“点击化学”反应的基团，以与连接体的分支部分偶联，或者如果接头包含多个单元，与第一个单元偶联。这种基团的一个例子是乙炔基。
一些非限制性示例性支化核苷酸如下所示。
Figure GDA0003160615080000611
Figure GDA0003160615080000621
接头可任选地包含一个或多个间隔分子(单元)，诸如例如SP9间隔基，其中第一间隔基单元被附接到分支核苷酸。
接头可包含连接至第一间隔基团的一个或多个其他间隔基团。例如，接头可包含多个例如Sp9间隔基团。将第一间隔基团连接到支化部分，然后依次加入一个或多个另外的间隔基团以延伸包含多个间隔单元的间隔基链，所述间隔单元与其间的磷酸酯基团连接。
下面显示的是间隔基单元(Sp3、Sp9和Sp13)的一些非限制性实例，其可以包含与分支核苷酸连接的第一间隔基单元，或者与已经与分支核苷酸连接的现有间隔基单元连接的另外的间隔基单元。
Figure GDA0003160615080000622
接头可包含一个或多个乙二醇单元。
接头可包含寡核苷酸，其中多个单元是核苷酸。
在上文描述的结构中，术语5”用于区分与支化部分连接的核苷酸的5'末端，其中5'具有本领域的普通含义。5”意指核苷酸上可以延伸接头的位置。5”的位置可能会有所不同。5”位置通常是核苷酸的核碱基中的位置。核碱基中的 5”位置可以根据所需支化部分的性质而变化，如上述结构所示。
微阵列
本文描述的任何多核苷酸合成方法可用于制造多核苷酸微阵列(Trevino, V.等，Mol.Med.2007 13，pp527-541)。因此，锚或支架多核苷酸可以连接到表面上的多个可单独寻址的反应位点，并且具有预定序列的多核苷酸可以在微阵列上原位合成。
合成后，在每个反应区域，可以为预定序列的多核苷酸提供独特的序列。可以向锚或支架多核苷酸提供条形码序列以便于鉴定。
除了合成预定序列的多核苷酸的方法之外，可以使用本技术领域中常用的技术，包括本文所述的技术，进行微阵列制造。例如，可以使用已知的表面附着方法和化学方法将锚或支架多核苷酸拴在表面上，包括本文所述的那些。
在合成预定序列的多核苷酸后，可以提供最终切割步骤以从无栓系末端除去任何不需要的多核苷酸序列。
可以双链形式在反应位点提供预定序列的多核苷酸。或者，在合成之后，可以分离双链多核苷酸并除去一条链，在反应位点留下单链多核苷酸。可以提供链的选择性栓系以促进该过程。例如，在涉及支架多核苷酸的方法中，合成链可以栓系在表面上，支持链可以不被栓系，反之亦然。合成链可以具有不可切割的接头，并且支持链可以具有可切割的接头，反之亦然。链的分离可以通过常规方法进行，例如热处理。
合成多核苷酸的组装
具有通过本文所述方法合成的预定序列并且任选地通过本文所述方法扩增的多核苷酸可以与一种或多种其他此类多核苷酸连接以产生更大的合成多核苷酸。
可以通过本领域公知的技术实现多个多核苷酸的连接。可以切割通过本文描述的方法合成的第一多核苷酸和一种或多种另外的多核苷酸以产生相容的末端，然后通过连接将多核苷酸连接在一起。可以通过任何合适的方法实现切割。通常，可以在多核苷酸中产生限制酶切割位点，然后使用限制酶进行切割步骤，从而从任何锚/支架多核苷酸释放合成的多核苷酸。切割位点可以设计为锚/支架多核苷酸的一部分。或者，可以在新合成的多核苷酸内产生切割位点，作为预定的核苷酸序列的一部分。
多核苷酸的组装优选地使用固相方法进行。例如，在合成后，第一多核苷酸可以在远离表面固定位点的合适位置进行单一切割。因此，第一多核苷酸将保持固定在表面上，并且单个切割将产生与另一个多核苷酸连接相容的末端。另外的多核苷酸可以在两个合适的位置进行切割，以在每个末端产生用于连接其他多核苷酸的相容末端，同时从表面固定中释放另外的多核苷酸。另外的多核苷酸可以与第一多核苷酸相容地连接，从而产生更大的固定化多核苷酸，其具有预定序列并且具有与另一个额外多核苷酸连接相容的末端。因此，预选的切割的合成多核苷酸的连接的迭代循环可以产生更长的合成多核苷酸分子。另外的多核苷酸的连接顺序将由所需的预定序列确定。
因此，本发明的组装方法可以允许产生长度为一个或多个Mb左右的合成多核苷酸分子。
可以使用本领域已知的装置进行本发明的组装和/或合成方法。可获得的技术和装置允许非常小体积的试剂被选择性地移动、分配并与阵列的不同位置中的其他体积组合，通常以液滴的形式，可以使用电润湿技术，例如电介质上的电润湿(EWOD)，如上所述。例如在US8653832、US8828336、 US20140197028和US20140202863中公开了可以在本发明中使用的能够操纵液滴的合适的电润湿技术和系统。
可以通过在引物链部分和与其杂交的支持链部分中的一个或两个中提供可切割接头来实现从固相切割。可切割接头可以是例如UV可切割接头。
涉及酶促切割的切割方法的实例显示在图22中。该示意图显示了附着于表面(通过黑色金刚石结构表示)并包含预定序列的多核苷酸的支架多核苷酸。支架多核苷酸包括顶部和底部发夹。在每种情况下，可以使用通用核苷酸的切割步骤切割顶部发夹，以限定切割位点。底部发夹可以通过限制性内切核酸酶经由设计到支架多核苷酸中的位点移除或者工程化到新合成的预定序列的多核苷酸中。
因此，如上所述，可以合成具有预定序列的多核苷酸，同时固定在电润湿表面上。合成的多核苷酸可以从电润湿表面切割下来并以液滴形式在电场的影响下移动。液滴可以在表面上的特定反应位点处组合，在那里它们可以递送切割的合成多核苷酸用于与其他切割的合成多核苷酸连接。然后可以连结多核苷酸，例如通过连接。使用这些技术，可以合成不同多核苷酸的群体，并根据所需的预定序列依次附接。使用这样的系统，可以设计完全自动化的多核苷酸合成和组装系统。系统可以被编程为接收期望的序列、供应试剂、执行合成循环并随后根据期望的预定序列组装期望的多核苷酸。
系统和试剂盒
本发明还提供了用于实施本文描述和限定的任何合成方法以及本文描述和限定的任何后续扩增和组装步骤的多核苷酸合成系统。
通常，合成循环反应将通过将预定序列的核苷酸掺入支架多核苷酸分子来进行，所述支架多核苷酸分子通过本文描述和限定的方式与表面栓系。表面可以是如本文所述和限定的任何合适的表面。
在一个实施方案中，将预定序列的核苷酸掺入支架多核苷酸分子的反应涉及在反应区域内在支架多核苷酸上进行任何合成方法。
反应区域是支架多核苷酸分子附着的合适基底的任何区域，并且其中可以递送用于进行合成方法的试剂。
在一个实施方案中，反应区域可以是包含单个支架多核苷酸分子的表面的单个区域，其中单个支架多核苷酸分子可以用试剂寻址。
在另一个实施方案中，反应区域可以是包含多个支架多核苷酸分子的表面的单个区域，其中支架多核苷酸分子不能用彼此隔离的试剂单独寻址。因此，在这样的实施方案中，反应区域中的多个支架多核苷酸分子暴露于相同的试剂和条件，因此可以产生具有相同或基本相同的核苷酸序列的合成多核苷酸分子。
在一个实施方案中，用于实施本文所述和限定的任何合成方法的合成系统可以包含多个反应区域，其中每个反应区域包含一个或多个附着的支架多核苷酸分子，并且其中每个反应区域可以与每个其他反应区域隔离地用试剂单独寻址。这种系统可以例如以阵列的形式配置，例如其中反应区域形成在基底上，通常是平面基底。
具有包含单个反应区域或包含多个反应区域的基底的系统可包含在例如 EWOD系统或微流体系统内，并且系统配置成将试剂递送至反应位点。本文更详细地描述了EWOD和微流体系统。例如，EWOD系统可以配置成在电控制下将试剂递送到反应位点。微流体系统，例如包括微制造结构，例如由弹性体或类似材料形成的微流体系统，可以配置成在流体压力和/或抽吸控制下或通过机械手段将试剂输送到反应位点。试剂可以通过任何合适的方式递送，例如通过用作试剂递送导管的碳纳米管。可以设想任何合适的系统。
EWOD、微流体和其他系统可以配置成将任何其他所需的试剂递送至反应位点，例如用于在合成后从支架多核苷酸切割合成的双链多核苷酸的酶，和/ 或用于切割接头以从基底释放整个支架多核苷酸的试剂和/或用于在合成后扩增多核苷酸分子的试剂或其任何区域或部分，和/或用于从较小多核苷酸分子组装较大多核苷酸分子的试剂，所述较小多核苷酸分子是根据本发明的合成方法合成的。
本发明还提供了用于实施本文所述和限定的任何合成方法的试剂盒。试剂盒可含有任何所需的试剂组合，其用于进行本文所述和限定的本发明的任何合成和/或组装方法。例如，试剂盒可包含任何一个或多个体积的反应试剂，其包含支架多核苷酸、对应于本文所述和限定的合成循环的任何一个或多个步骤的反应试剂的体积、包含含有可逆封闭基团或可逆终止子基团的核苷酸的反应试剂的体积、用于在合成之后扩增一种或多种多核苷酸分子或其任何区域或部分的反应试剂的体积、用于从根据本发明的合成方法合成的较小多核苷酸分子组装较大多核苷酸分子的反应试剂的体积、用于在合成后从支架多核苷酸切割合成的双链多核苷酸的反应试剂的体积、以及用于切割一个或多个接头从基底释放完整的支架多核苷酸的反应试剂的体积。
示例性方法
本文描述了合成根据本发明的多核苷酸或寡核苷酸分子的示例性方法，其包括在所附权利要求中。以下文本中的附图标记对应于图1、2、3a、3b和 3c中的那些。
在下面描述的每个示例性方法中，每个步骤中描述的结构可以在适当时借助于附图标记参考具体附图来参考。然而，这些参考并不旨在限于附图中所示的结构，并且相关结构的描述对应于以其整体在此提供的描述，包括如图所示。
下面描述五种非限制性示例性方法，方法版本1至5(分别参见例如图1 至3c)。在这些示例性方法中的每一个的步骤(1)中，提供支架多核苷酸(参见图 1至3c中的每一个的步骤1中描绘的结构)(101、201、301、401、501)，其包含合成链(参见图1至3c中每一个的步骤1中描绘的结构中的标记“b”的链)，其与互补的支持链(参见图1至3c中每一个的步骤1中描述的结构中标记为“a”的链)杂交。
支架多核苷酸是双链的并且提供支持结构以适应合成多核苷酸的区域，因为它是从头合成的。支架多核苷酸包含合成链，所述合成链包含由单链断裂或“切口”分开的聚合酶引物链部分(参见图1至3c中的每一个的步骤1中描绘的结构中标记为“b”的链的点线部分)和辅助链部分(参见“在图1至3c中的每一个的步骤1中描绘的结构中标记为“b”的链的虚线部分)。如本文更详细描述的，在本文所述的任何示例性方法版本1至5及其变型中，可在掺入步骤(2)之前，例如通过变性，除去辅助链。合成链的引物链部分和辅助链部分都与互补支持链杂交提供。合成链的引物链部分提供用于通过聚合酶引发合成的引物序列。在单链断裂位点开始合成。因此，聚合酶将起作用以在单链断裂位点延伸引物链部分的末端核苷酸。因此，该末端核苷酸通常限定引物链部分的3'末端，以允许通过聚合酶延伸，所述聚合酶催化5'至3'方向的延伸。因此，包含引物链部分的合成链的相对末端通常将限定5'末端，并且因此与合成链的5'末端相邻的支持链的末端核苷酸通常限定支链链的3'末端。
位于单链断裂的位点处的合成链的辅助链部分的末端核苷酸通常将限定辅助链部分的5'末端，并因此合成链的辅助链部分的相对末端通常将限定合成链的3'末端。
通常通过提供辅助链的(5')末端核苷酸而没有磷酸基团来实现合成链的辅助链部分和引物链部分之间的单链断裂或“切口”。断裂通常通过组装来自单独组分的支架多核苷酸来实现，所述组分包含：(i)支持链；(ii)合成链的辅助链部分，其具有非磷酸化的(5')末端核苷酸；和(iii)包含引物序列的合成链部分。在合适条件下混合组分后，支架多核苷酸在单独组分杂交时形成。
在所述方法的步骤(2)中，通过聚合酶的作用将预定核苷酸序列中的第一个核苷酸掺入合成链中(102、202、302、402、502)。第一核苷酸设置有可逆终止子基团(在每个图1至图3c的步骤2中描绘为掺入的核苷酸的小三角形)，其防止聚合酶的进一步延伸作用。因此，在步骤(2)中仅掺入单个核苷酸。
可以使用包含任何合适的可逆终止子基团的核苷酸。具有可逆终止子基团的优选核苷酸是如本文所述的3’-O-烯丙基-dNTP和/或3’-O-叠氮基甲基- dNTP。
在五种方法的每一种中，在支持链中提供通用核苷酸(在图1至3c的每一个中描绘的结构中标记为“Un”)，其有助于掺入预定序列的核苷酸和/或促进支架多核苷酸的切割(103、203、303、403、503)。通用核苷酸的作用将从以下每种方法的详细描述中显而易见。
合成方法版本1
在本发明合成方法的第一示例性版本中，将新核苷酸掺入双链支架多核苷酸中，与位于支持链中的通用核苷酸相对(图1的步骤1和2；101、102)。在每个合成循环中，支架多核苷酸在由包含通用核苷酸的序列限定的切割位点处切割(图1的步骤3；103)。在切割的支架多核苷酸中产生包含新掺入的核苷酸的单核苷酸突出端(参见图1下部中间描绘的结构)。连接多核苷酸(参见图1下部最左侧描绘的结构)与切割的支架多核苷酸的连接将配偶体核苷酸掺入支架多核苷酸中并允许新掺入的核苷酸与配偶体核苷酸配对(图1步骤4；104)，从而完成合成循环。
在本发明合成方法的第一个示例性版本中，如上所述在步骤(1)中提供支架多核苷酸(101)。在该方法中，支架多核苷酸的支持链中的通用核苷酸位于单链断裂位点(在图1的结构中标记为“X”)的辅助链的末端核苷酸的对面，并与其配对(参见图1的步骤1中描绘的结构)。
在步骤(2)中，预定序列的第一个核苷酸与通用核苷酸相对地掺入(102)，使得通用核苷酸在掺入时与第一个核苷酸配对。因此，在该构型中，通用核苷酸在步骤(1)和(2)中相对于合成链中掺入的第一个核苷酸在支持链中位于“n”位置，如图1所示(步骤3)。
在延伸期间，聚合酶将起作用以“侵入”辅助链(如果存在)并置换辅助链的末端核苷酸。掺入的第一核苷酸将占据先前被辅助链的置换末端核苷酸占据的位置(图1的步骤3)。
在该方法的步骤(3)中，支架多核苷酸在切割位点被切割(103)。切割位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定。切割包括切割支持链以在合成链中提供包含第一核苷酸的突出末端。切割导致支架多核苷酸中的双链断裂。在该示例性方法中，合成链已经具有单链断裂或“切口”，因此仅需要切割支持链以在支架多核苷酸中提供双链断裂。
在该示例性方法版本中，切割在合成链中产生突出端，其突出于支持链。切割位点处合成链的突出末端仅包含单个未杂交的核苷酸，其是掺入的第一核苷酸。通常，突出的第一核苷酸将限定合成链的3'末端，其突出于切割的支架多核苷酸中支持链的5'末端(参见图1下部中间描绘的结构)。
在该方法中，通用核苷酸在切割步骤之前占据支持链中的位置“n”。当通用核苷酸占据支持链中的位置“n”时，为了获得这种单核苷酸突出端，支持链在相对于通用核苷酸的特定位置被切割。支架多核苷酸的支持链在核苷酸位置“n”和“n-1”之间被切割。
“n”是指支持链中被通用核苷酸占据或已经被其占据的核苷酸位置，所述通用核苷酸与在该给定循环中掺入的预定序列的核苷酸配对。因此，在切割步骤中，支持链中的位置“n”与该循环中掺入的预定序列的核苷酸占据的位置相对，即合成链的引物链部分的末端核苷酸。“n-1”是指支持链中的相对于被通用核苷酸占据或已经被其占据的位置在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上的下一个核苷酸位置(在位置n-1处标记为“z”的核苷酸，如图1的步骤3中示意性所示)。因此，在切割步骤中，支持链中的位置“n-1”与合成链的引物链部分的倒数第二个核苷酸占据的位置相对(如图1的步骤3中所示；103)。
在核苷酸位置n和n-1之间切割支持链时，从剩余的支架多核苷酸中除去通用核苷酸、辅助链和与辅助链杂交的支持链部分(参见图1的下部最右边描绘的结构)，因此产生单核苷酸突出端，其包含在切割的支架多核苷酸中突出于支持链的在合成链中的第一个核苷酸。
磷酸酯基团应继续在突出端的位点连接到支持链的末端核苷酸上(如图1 下部中间所示的结构所描绘)。这确保了连接多核苷酸的支持链可以在连接步骤中连接到切割的支架多核苷酸的支持链上。
因此，在方法版本1中，通用核苷酸占据支持链中的位置n，并且支持链在核苷酸位置n和n-1之间被切割。
优选地，通过切割核苷酸位置n和n-1之间的磷酸二酯键(在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上相对于通用核苷酸的位置的支持链的第一磷酸二酯键)切割支持链。
可以通过切割核苷酸位置n和n-1之间的磷酸二酯键的一个酯键来切割支持链。
优选地，通过相对于核苷酸位置n切割第一酯键来切割支持链。这将具有在切割位置处在切割的支架多核苷酸的支持链上保留末端磷酸酯基团的作用。
如上所述，在核苷酸位置n和n-1之间切割支持链可以通过酶的作用进行。
如上所述，核苷酸位置n和n-1之间的支持链的切割可以作为两步过程进行。
第一切割步骤可包括从支持链除去通用核苷酸，从而在位置n处形成无碱基位点，第二切割步骤可包括在无基位点在位置n和n-1之间切割支持链。
在实施例2中描述了在由包含占据支持链中的位置n的通用核苷酸的序列限定的切割位点处切割支持链的一种机制。所描述的机制是示例性的，并且可以采用其他机制，条件是实现上述单核苷酸突出端。
在第一个切割步骤中，从支持链上除去通用核苷酸，同时保留糖-磷酸酯骨架完整。这可以通过酶的作用来实现，所述酶可以从双链多核苷酸中特异性地切除单个通用核苷酸。在示例性方法中，通用核苷酸是肌苷，并且通过酶的作用从支持链切除肌苷，从而形成无碱基位点。在示例性方法中，酶是3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶，特别是人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)。可以使用其他酶、分子或化学品，条件是形成无碱基位点。
在第二切割步骤中，通过进行单链断裂，在无碱基位点切割支持链。在示例性方法中，支持链通过作为碱如NaOH的化学物质的作用切割。或者，可以使用有机化学品如N,N'-二甲基乙二胺。或者，可以使用具有无碱基位点切割酶活性的酶，例如内切核酸酶VIII。可以使用其他酶、分子或化学品，条件是支持链在如上所述的无碱基位点处被切割。
因此，在通用核苷酸位于支持链的n位并且支持链在位置n和n-1之间切割的实施方案中，可以用核苷酸切除酶进行第一切割步骤。这种酶的实例是3- 甲基腺嘌呤DNA糖基化酶，例如人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)。第二切割步骤可以用作为碱的化学物质如NaOH进行。第二步可以用具有无碱基位点切割活性的有机化学品如N,N'-二甲基乙二胺进行。第二步可以用具有无碱基位点切割酶活性的酶如内切核酸酶VIII进行。
在该方法的步骤(4)中，将双链连接多核苷酸连接(104)至切割的支架多核苷酸。连接多核苷酸包含支持链和辅助链。连接多核苷酸还包含互补连接末端，其在支持链中包含通用核苷酸和单个突出核苷酸，所述突出核苷酸是预定序列的第一个核苷酸的配偶体核苷酸。连接多核苷酸在与突出端相邻的辅助链中还包含缺少磷酸酯基团的末端核苷酸(参见图1下部最左侧所示结构中标记为“X”的位置)。配置互补连接末端，使其在经受合适的连接条件时与步骤(3)的切割支架多核苷酸产物的突出端相容地连接。在连接支持链后，第一个核苷酸变成与其配偶体核苷酸配对。
因此，在该示例性方法的步骤(4)(104)中，在连接多核苷酸的互补连接末端，支持链中的通用核苷酸与辅助链的末端核苷酸相对定位并与其配对。通用核苷酸位于支持链的末端核苷酸旁边(位置n)。连接多核苷酸中的位置n是指当连接多核苷酸的连接末端与切割的支架多核苷酸连接时，通用核苷酸将位于支持链中，使得其将与在步骤(6)即下一个合成循环中掺入的下一个核苷酸配对，如图1(106、107)所示。在步骤(4)的连接多核苷酸的互补连接末端，支持链的末端核苷酸是步骤(2)的第一个核苷酸的配偶体核苷酸，并且突出于辅助链的末端核苷酸。
在连接多核苷酸中，提供辅助链，使得与突出端相邻的末端核苷酸缺少磷酸基团。通常，如上所述，辅助链的这种非磷酸化末端核苷酸将限定辅助链的5'末端。
在步骤(4)中，在连接多核苷酸的支持链和切割的支架多核苷酸的支持链连接(104)后，合成链中的第一个核苷酸与其在支持链中的配偶体核苷酸配对。
支持链的连接可以通过任何合适的方式进行。连接将导致仅支持链的连结，维持合成链中第一个核苷酸(即引物链部分)与邻近第一个核苷酸的辅助链的末端核苷酸之间的单链断裂。
连接通常可以通过具有连接酶活性的酶进行。例如，可以用T3 DNA连接酶或T4DNA连接酶进行连接。使用这些酶将导致维持合成链中的单链断裂，因为辅助链的末端核苷酸由于不存在末端磷酸基团而不能作为连接酶的底物。
连接多核苷酸与切割的支架多核苷酸的连接完成第一个合成循环，其中步骤(1)的支架多核苷酸被有效地重新构建，除了预定的核苷酸序列的第一个核苷酸与其配偶体核苷酸相对地掺入多核苷酸中以外。在该示例性方法中，在给定合成循环结束时，在合成循环期间，通用核苷酸相对于前一循环中支持链中通用核苷酸占据的位置占据支持链中的位置n+1。同时，在给定的合成循环结束时，通用核苷酸将相对于合成链中的位置占据支持链中的的位置n，所述合成链中的位置将被在下一个循环中掺入的预定的核苷酸序列的下一个核苷酸占据。因此，在给定的合成循环结束时，提供修饰的支架分子(106)用于下一个合成循环，其中通用核苷酸再次定位在支持链中以促进预定核苷酸序列的下一个核苷酸的掺入和在下一个合成循环中支持链的切割。
在本发明的该示例性方法版本以及版本2和3中，为了允许下一个核苷酸掺入下一个合成循环中，必须从第一个核苷酸中除去可逆终止子基团(脱保护步骤；105)。这可以在第一循环的各个阶段执行。通常，在连接步骤(4)之后，将其作为该方法的步骤(5)进行，如图1的步骤5；(105)所示。然而，脱保护步骤可以在掺入新核苷酸后的任何步骤进行。无论哪个阶段进行脱保护步骤，都应首先除去聚合酶和残留的未掺入的第一核苷酸，以防止第一核苷酸的多重掺入。优选在切割步骤(步骤(3))之前除去聚合酶和未掺入的第一核苷酸。因此，可以在切割步骤(步骤(3))之前，在连接步骤(步骤(4))之前，或在连接步骤之后 (作为步骤(5))从第一核苷酸中除去可逆终止子基团。
从第一核苷酸中除去可逆终止子基团可以通过任何合适的方法进行。例如，可以通过使用化学物质如三(羧乙基)膦(TCEP)进行去除。
在方法版本1中，可以如上针对第一合成循环所述执行第二和后续合成循环。
因此，在步骤(6)中，为下一个合成循环(106)提供的支架多核苷酸是第一个合成循环的连接步骤(4)和脱保护步骤(5)的产物。在步骤(6)中，通过聚合酶的作用将预定核苷酸序列中的下一个核苷酸掺入(107)到支架多核苷酸的合成链中，如上文对第一个循环的步骤(2)所述。下一个核苷酸还包含可逆终止子基团，其阻止聚合酶在该循环中的进一步延伸作用。如本文进一步描述的，可在掺入步骤(6)之前任选地除去辅助链。
如在方法版本1的第一个合成循环的步骤(2)中，在步骤(6)中，将下一个核苷酸与通用核苷酸相对地掺入，所述通用核苷酸位于支持链中，使得其在掺入时与下一个核苷酸配对。在该构型中，通用核苷酸再次位于相对于合成链中掺入的下一个核苷酸的“n”位置。此外，如上文对于第一个合成循环所述，在下一个合成循环的步骤(6)中，通用核苷酸将占据支持链中相对于上一个循环的步骤(2)中支持链中通用核苷酸占据的位置的位置“n+1”。这是因为在先前合成循环的连接多核苷酸中通用核苷酸被定位成与辅助链的末端非磷酸化核苷酸相对并与其配对而实现的。
在步骤(7)中，支架多核苷酸在切割位点被切割(108)，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定。切割包括切割支持链并除去通用核苷酸以在合成链中提供单核苷酸突出末端，其包含预定核苷酸序列中的下一个核苷酸作为突出端的末端核苷酸。合成链的单核苷酸突出端突出于切割的支架多核苷酸中支持链的末端核苷酸。可以如上针对第一循环的步骤(3)所述进行切割步骤。
在下一循环的步骤(8)中，将双链连接多核苷酸连接(109)至切割的支架多核苷酸。连接多核苷酸包含支持链和辅助链。连接多核苷酸还包含互补连接末端，其在支持链中包含通用核苷酸和单个突出核苷酸，所述突出核苷酸是预定核苷酸序列的下一个核苷酸的配偶体核苷酸。连接多核苷酸在与突出端相邻的辅助链中还包含缺少磷酸酯基团的末端核苷酸。配置互补连接末端，使其在经受合适的连接条件时与步骤(7)的切割支架多核苷酸产物的突出端相容地连接。在连接支持链后，预定核苷酸序列的下一个核苷酸变为与其配偶体核苷酸配对。
可以配置下一个和随后的合成循环的步骤(8)的连接多核苷酸，并且可以进行连接步骤，如上文针对第一合成循环的步骤(4)所述。
因此，在步骤(8)中，在连接(109)后，支持链中的通用核苷酸与辅助链的末端核苷酸相对，并与其配对。支持链中的通用核苷酸位于相对于将在下一个循环中掺入的下一个核苷酸的位置“n”。此外，如上所述，在步骤(8)之后，通用核苷酸相对于在步骤(6)开始之前支持链中通用核苷酸占据的位置占据支持链中的位置“n+1”。
可以如上文关于第一合成循环所述执行在下一个和后续循环(110)中对可逆终止子基团的去保护。
根据需要重复合成循环多次，以合成具有预定核苷酸序列的双链多核苷酸。
合成方法版本2
在本发明合成方法的第二示例性版本中，将新核苷酸掺入双链支架多核苷酸中，与位于支持链中的互补核苷酸相对(图2的步骤1和2；201、202)。在每个合成循环中，支架多核苷酸在由包含通用核苷酸的序列限定的切割位点处切割(图2的步骤3；203)。在切割的支架多核苷酸中产生包含新掺入的核苷酸的单核苷酸突出端(参见图2下部中间描绘的结构)。
连接多核苷酸与切割的支架多核苷酸的连接(204)将配偶体核苷酸掺入支架多核苷酸中并允许新掺入的核苷酸与配偶体核苷酸配对，从而完成完整的合成循环。连接多核苷酸(参见图2下部最左侧描绘的结构)与切割的支架多核苷酸的连接(204)也将能够在下一个循环中与掺入的下一个核苷酸配对的核苷酸掺入支架多核苷酸(图2的步骤4)。
在本发明合成方法的第二个示例性版本中，如上所述在步骤(1)中提供支架多核苷酸(201)。在该方法中，在支架多核苷酸的支持链中提供能够与步骤(2) 的第一核苷酸配对的核苷酸，并且在单链断裂位点处与辅助链的末端核苷酸相对地定位，并且与之配对。互补核苷酸相对于合成链中掺入的第一个核苷酸位于支持链的“n”位置，如图2的步骤1所示。
在步骤(2)中，预定序列的第一个核苷酸与互补核苷酸相对地掺入(202)，使得互补核苷酸在掺入时与第一个核苷酸配对。
在合成方法的第二版本的步骤(1)中，支架多核苷酸还在支持链中提供有通用核苷酸。在该方法中，通用核苷酸位于支持链中(位置“n+1”)，与单链断裂位点处辅助链中倒数第二个核苷酸相对并配对，即通常位于辅助链的5'末端(参见图2的步骤1中描绘的结构)。
在延伸期间，聚合酶将起作用以“侵入”辅助链(如果存在的话)，并置换辅助链的末端核苷酸，并且掺入的第一核苷酸将占据先前由辅助链的置换的末端核苷酸占据的位置。在掺入第一个核苷酸后，通用核苷酸将位于支持链中相对于单链断裂位点处合成链中第一个核苷酸的“n+1”位置，如图2的步骤3的结构所示。
在该方法的步骤(3)中，支架多核苷酸在切割位点被切割(203)。切割位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定。切割包括切割支持链以在合成链中提供包含预定核苷酸序列的第一核苷酸的突出末端。切割导致支架多核苷酸中的双链断裂。合成链已经具有单链断裂或“切口”，因此仅需要切割支持链以在支架多核苷酸中提供双链断裂。
在该示例性方法版本中，切割在合成链中产生突出端，其突出于支持链。合成链的突出末端仅包含单个未杂交的核苷酸，其是掺入的第一核苷酸。通常，突出的第一核苷酸将限定合成链的3'末端，其突出于切割的支架多核苷酸中支持链的5'末端，如图2下部中间显示的结构所描绘。
在该方法中，通用核苷酸占据支持链中的位置“n+1”。当通用核苷酸占据支持链中的“n+1”位置时，为了获得这种单核苷酸突出端，支持链在步骤3中在核苷酸位置“n”和“n-1”之间被切割。
示例性方法版本2中的“n”是指支持链中的核苷酸位置，其是相对于通用核苷酸占据的位置在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上在支持链中的下一个核苷酸位置。因此，在切割步骤中，支持链中的位置“n”与该循环中掺入的预定序列的核苷酸占据的位置相对，即合成链的引物链部分/接近引物链的末端核苷酸。“n-1”是指支持链中的相对于已经被通用核苷酸占据的位置在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上的第二个核苷酸位置(图2中标记为“z”的核苷酸)。因此，在切割步骤中，支持链中的“n-1”位置与合成链的引物链部分的倒数第二个核苷酸占据的位置相对。在该配置中，通用核苷酸占据位置“n+1”。在该方法中，位置“n+1”处的通用核苷酸与合成链的辅助链部分中的倒数第二个核苷酸相对于切口相对(如图2的步骤3中所示)。
在切割支持链(203)时，从剩余的支架多核苷酸中除去通用核苷酸、辅助链(如果存在)和与辅助链杂交的支持链部分(参见图2的下部最右边描绘的结构)，因此产生单核苷酸突出端，其包含在切割的支架多核苷酸中突出于支持链的在合成链中的预定多核苷酸序列的第一个核苷酸(参见图2的下部中间所描绘的结构)。
磷酸酯基团应继续在突出端的位点连接到支持链的末端核苷酸上(如图2 下部中间所示的结构所描绘)。这确保了连接多核苷酸的支持链可以在连接步骤中连接到切割的支架多核苷酸的支持链上。
因此，在方法版本2中，支持链在核苷酸位置n和n-1之间被切割。
优选地，通过切割核苷酸位置n和n-1之间的磷酸二酯键(在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上相对于通用核苷酸的位置n+1的支持链的第二磷酸二酯键)切割支持链。
可以通过切割核苷酸位置n和n-1之间的磷酸二酯键的一个酯键来切割支持链。
优选地，通过相对于核苷酸位置n切割第一酯键来切割支持链。这将具有在切割位置处在切割的支架多核苷酸的支持链上保留末端磷酸酯基团的作用。
如上所述，在核苷酸位置n和n-1之间切割支持链可以通过酶如内切核酸酶V的作用进行。
在实施例3中描述了在由包含占据支持链中的位置n+1的通用核苷酸的序列限定的切割位点处在核苷酸位置n和n-1之间切割支持链的一种机制。所描述的机制是示例性的，并且可以采用其他机制，条件是实现上述单核苷酸突出端。
在该示例性机制中，使用内切核酸酶。在示例性方法中，酶是内切核酸酶V。可以使用其他酶、分子或化学品，条件是形成上述单核苷酸突出端。
在该方法的步骤(4)中，将连接多核苷酸连接(204)至切割的支架多核苷酸。连接多核苷酸包含支持链和辅助链。连接多核苷酸还包含互补连接末端，其在支持链中包含通用核苷酸和突出核苷酸，所述突出核苷酸是第一个核苷酸的配偶体核苷酸。连接多核苷酸在与突出端相邻的辅助链中还包含缺少磷酸酯基团的末端核苷酸(参见图2下部最左侧所示结构)。配置互补连接末端，使其在经受合适的连接条件时与步骤(3)的切割支架多核苷酸产物的突出端相容地连接。在连接支持链后，第一个核苷酸变成与其配偶体核苷酸配对。
在该方法中，连接多核苷酸的支持链中的通用核苷酸位于与单链断裂位点位点处的辅助链的倒数第二个核苷酸相对的互补连接末端，并与其杂交。支持链中的通用核苷酸相对于待掺入到步骤(6)的合成链中的预定义核苷酸序列的下一个核苷酸，即在下一个合成循环中，位于连接多核苷酸中“n+1”位置，如图2中示意性所示。在连接多核苷酸的互补连接末端，支持链的倒数第二个核苷酸是步骤(6)的下一个核苷酸的配偶体核苷酸，并与辅助链的末端核苷酸配对。支持链的末端核苷酸是步骤(2)的第一个核苷酸的配偶体核苷酸。支持链的末端核苷酸突出于辅助链的末端核苷酸。
在连接多核苷酸中，提供辅助链，使得与突出端相邻的末端核苷酸缺少磷酸基团。通常，如上所述，辅助链的这种非磷酸化末端核苷酸将限定辅助链的5'末端。
在步骤(4)中，在连接多核苷酸的支持链和切割的支架多核苷酸的支持链连接(204)后，合成链中的第一个核苷酸变成与其在支持链中的配偶体核苷酸配对。
支持链的连接可以通过任何合适的方式进行。连接将导致仅支持链的连结，维持合成链中第一个核苷酸(即引物链部分)与邻近第一个核苷酸的辅助链的末端核苷酸之间的单链断裂。
与方法版本1一样，方法版本2中的连接通常可以通过具有连接酶活性的酶进行。例如，可以用T3 DNA连接酶或T4 DNA连接酶进行连接。使用这些酶将导致维持合成链中的单链断裂，因为辅助链的末端核苷酸由于不存在末端磷酸基团而不能作为连接酶的底物。
连接多核苷酸与切割的支架多核苷酸的连接完成第一个合成循环，其中步骤(1)的支架多核苷酸被有效地重新构建，除了预定的核苷酸序列的第一个核苷酸与其配偶体核苷酸相对地掺入多核苷酸中以及作为在下一个合成循环中掺入的下一个核苷酸的配偶体核苷酸的核苷酸位于支持链中并与辅助链的末端核苷酸配对，如图2所示(步骤4)。如在示例性方法版本1中，在示例性方法版本 2中，在给定合成循环结束时，在合成循环期间，通用核苷酸相对于前一循环中支持链中通用核苷酸占据的位置占据支持链中的位置n+1。同时，在给定的合成循环结束时，通用核苷酸也将相对于合成链中的位置占据支持链中的的位置n+1，所述合成链中的位置将被在下一个循环中掺入的预定的核苷酸序列的下一个核苷酸占据。因此，在给定的合成循环结束时，提供修饰的支架分子 (206)用于下一个合成循环，其中通用核苷酸再次定位在支持链中以促进在下一个合成循环中支持链的切割。
为了使下一个核苷酸在下一个合成循环中掺入，必须从第一个核苷酸中除去可逆终止子基团(脱保护步骤；205)。这可以如上面针对方法版本1所描述的那样执行。
在示例性方法版本2中，可以如上针对第一合成循环所述执行第二和后续合成循环。
因此，在步骤(6)中，为下一个合成循环(206)提供的支架多核苷酸是连接步骤(4)和去保护步骤例如第一个合成循环的步骤(5)(205)的产物。在步骤(6) 中，通过聚合酶的作用将预定核苷酸序列中的下一个核苷酸掺入(207)到支架多核苷酸的合成链中，如上文对第一个循环的步骤(2)所述。下一个核苷酸还包含可逆终止子基团，其阻止聚合酶在该循环中的进一步延伸作用。
如在示例性方法版本2的第一合成循环的步骤(2)中，在步骤(6)中，预定核苷酸序列的下一个核苷酸与其配偶体核苷酸相对地掺入(207)，所述配偶体核苷酸位于支持链中使得其在其掺入时与下一个核苷酸配对。在该构型中，通用核苷酸相对于合成链中掺入的下一个核苷酸位于“n+1”位置。此外，如上文对于第一个合成循环所述，在下一个合成循环的步骤(6)中，通用核苷酸也将占据支持链中相对于上一个循环的步骤(2)中支持链中通用核苷酸占据的位置的位置“n+1”。这是因为在先前合成循环的连接多核苷酸中通用核苷酸被定位成与辅助链的倒数第二核苷酸相对并与其配对而实现的。
在步骤(7)中，支架多核苷酸在切割位点被切割(208)，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定。切割包括切割支持链并除去通用核苷酸以在合成链中提供单核苷酸突出末端，其包含所述下一个核苷酸作为剩余支架多核苷酸中突出端的末端核苷酸。合成链的单核苷酸突出端突出于剩余的切割的支架多核苷酸中支持链的末端核苷酸。可以如上针对第一循环的步骤(3)所述进行切割步骤。
在下一循环的步骤(8)中，将双链连接多核苷酸连接(209)至切割的支架多核苷酸。连接多核苷酸包含支持链和辅助链。连接多核苷酸还包含互补连接末端，其在支持链中包含通用核苷酸和突出核苷酸，所述突出核苷酸是预定核苷酸序列的下一个核苷酸的配偶体核苷酸。连接多核苷酸在与突出端相邻的辅助链中还包含缺少磷酸酯基团的末端核苷酸。配置互补连接末端，使其在经受合适的连接条件时与步骤(7)的切割支架多核苷酸产物的突出端相容地连接。在连接支持链后，预定核苷酸序列的下一个核苷酸变为与其配偶体核苷酸配对。
可以配置下一个和随后的合成循环的步骤(8)的连接多核苷酸，并且可以进行连接步骤，如上文针对第一合成循环的步骤(4)所述。
因此，在步骤(8)中，在连接(209)后，支持链中的通用核苷酸与辅助链的倒数第二个核苷酸相对，并与其配对。支持链中的通用核苷酸位于相对于将在下一个循环中掺入的下一个核苷酸的位置“n+1”。此外，如上所述，在步骤(8) 之后，通用核苷酸相对于在步骤(6)开始之前支持链中通用核苷酸占据的位置占据支持链中的位置“n+1”。
可以如上文关于第一合成循环所述执行在下一个循环中对可逆终止子基团的去保护(210)。
根据需要重复合成循环多次，以合成具有预定核苷酸序列的双链多核苷酸。
合成方法版本3
在本发明合成方法的第三示例性版本中，将新核苷酸掺入双链支架多核苷酸中，与位于支持链中的通用核苷酸相对(图3a的步骤1和2；301、302)。在每个合成循环中，支架多核苷酸在由包含通用核苷酸的序列限定的切割位点处切割(图3a的步骤3；303)。在切割的支架多核苷酸中产生包含新掺入的核苷酸的双核苷酸突出端(参见图3a下部中间描绘的结构)。连接多核苷酸(参见图 3a下部最左侧描绘的结构)与切割的支架多核苷酸的连接将配偶体核苷酸掺入支架多核苷酸中并因此允许新掺入的核苷酸与配偶体核苷酸配对(图3a步骤 4；304)，从而完成完整合成循环。
在本发明合成方法的第三个示例性版本中，如上所述在步骤(1)中提供支架多核苷酸(301)。在该方法中，支架多核苷酸的支持链中的通用核苷酸位于单链断裂位点的辅助链的末端核苷酸的对面，并与其配对(参见图3a的步骤1中描绘的结构)。
在步骤(2)中，第一核苷酸与通用核苷酸相对地掺入(302)，所述通用核苷酸位于支持链中，使得其在掺入时与第一核苷酸配对。在该构型中，通用核苷酸相对于合成链中掺入的第一个核苷酸位于“n”位置，如图3a所示(步骤3)。
在延伸期间，聚合酶将起作用以“侵入”辅助链(如果存在)并置换辅助链的末端核苷酸。掺入的第一核苷酸将占据先前被辅助链的置换末端核苷酸占据的位置(图3a的步骤3)。
在该方法的步骤(3)中，支架多核苷酸在切割位点被切割(303)。切割位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定。切割包括切割支持链以在合成链中提供包含第一核苷酸的突出末端。切割导致支架多核苷酸中的双链断裂。合成链已经具有单链断裂或“切口”，因此仅需要切割支持链以在支架多核苷酸中提供双链断裂。
在该示例性方法版本中，切割在合成链中产生突出端，其突出于支持链。合成链的突出末端包含两个未杂交的核苷酸。第一突出的未杂交核苷酸是切割的支架多核苷酸的合成链的末端核苷酸，并且是预定的核苷酸序列的掺入的第一核苷酸。第二个未杂交的核苷酸是合成链中第一个核苷酸旁边的核苷酸。通常，突出的第一核苷酸将限定合成链的3'末端，其突出于切割的支架多核苷酸中支持链的5'末端(参见图3a下部中间描绘的结构)。
在该方法中，通用核苷酸占据支持链中的位置“n”。当通用核苷酸占据支持链中的位置“n”时，为了获得这种双核苷酸突出端，支持链在位置“n-1”和“n- 2”之间被切割。
“n”是指支持链中被通用核苷酸占据的核苷酸位置，所述通用核苷酸与在该给定循环中掺入的预定序列的核苷酸配对。因此，在切割步骤中，支持链中的位置“n”与该给定循环中掺入的预定序列的核苷酸占据的位置相对，即合成链的引物链部分的末端核苷酸。“n-1”是指相对于通用核苷酸占据的位置在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上在支持链中的下一个核苷酸位置。因此，在切割步骤中，支持链中的“n-1”位置与合成链的引物链部分的倒数第二个核苷酸占据的位置相对。“n-2”是指相对于通用核苷酸占据的位置在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上在支持链中的第二个核苷酸位置(如图3a的步骤3中所示；303)。
因此，在切割支持链时，从剩余的支架多核苷酸中除去通用核苷酸、辅助链(如果存在)和与辅助链杂交的支持链部分(参见图3a下部最右侧描绘的结构)，由此产生双核苷酸突出端，其包含突出于剩余支持链的合成链中的第一个核苷酸。
磷酸酯基团应继续在突出端的位点连接到支持链的末端核苷酸上(如图3a 下部中间所示的结构所描绘)。这确保了连接多核苷酸的支持链可以在连接步骤中连接到切割的支架多核苷酸的支持链上。
因此，支持链在核苷酸位置n-1和n-2之间被切割。
优选地，通过切割核苷酸位置n-1和n-2之间的磷酸二酯键(在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上相对于通用核苷酸的位置的支持链的第二磷酸二酯键)切割支持链。
可以通过切割核苷酸位置n-1和n-2之间的磷酸二酯键的一个酯键来切割支持链。
优选地，通过相对于核苷酸位置n-1切割第一酯键来切割支持链。这将具有在切割位置处在切割的支架多核苷酸的支持链上保留末端磷酸酯基团的作用。
如上所述，在核苷酸位置n-1和n-2之间切割支持链可以通过酶如内切核酸酶V的作用进行。
在实施例7中描述了在切割位点切割支持链的一种机制，所述切割位点由包含支持链中占据位置n的通用核苷酸的序列限定，以产生双核苷酸突出端。所描述的机制是示例性的，并且可以采用其他机制，条件是实现上述双核苷酸突出端。
在该示例性机制中，使用内切核酸酶。在示例性方法中，酶是内切核酸酶V。可以使用其他酶、分子或化学品，条件是形成上述单核苷酸突出端。
在该方法的步骤(4)中，将双链连接多核苷酸连接(304)至切割的支架多核苷酸。连接多核苷酸包含支持链和辅助链。连接多核苷酸还包含互补连接末端，其在支持链中包含通用核苷酸和突出核苷酸，所述突出核苷酸是第一个核苷酸的配偶体核苷酸。连接多核苷酸在与突出端相邻的辅助链中还包含缺少磷酸酯基团的末端核苷酸(参见图3a下部最左侧所示结构)。配置互补连接末端，使其在经受合适的连接条件时与步骤(3)的切割支架多核苷酸产物的突出端相容地连接。在连接支持链后，第一个核苷酸变成与其配偶体核苷酸配对。
在该方法中，连接多核苷酸的支持链中的通用核苷酸位于与单链断裂位点处的辅助链的末端核苷酸相对的互补连接末端，并与其配对。连接多核苷酸的支持链中的通用核苷酸相对于待掺入到步骤(6)的合成链中的预定核苷酸序列的下一个核苷酸，即在下一个合成循环中，位于“n”位置，如图3a中示意性所示。在连接多核苷酸的互补连接末端，支持链的倒数第二个核苷酸是步骤(2)的第一个核苷酸的配偶体核苷酸，并突出于辅助链的末端核苷酸。
在连接多核苷酸中，提供辅助链，使得与突出端相邻的末端核苷酸缺少磷酸基团。通常，如上所述，辅助链的这种非磷酸化末端核苷酸将限定辅助链的5'末端。
在步骤(4)中，在连接多核苷酸的支持链和切割的支架多核苷酸的支持链的连接(304)后，合成链中预定的核苷酸序列的第一个核苷酸与其在支持链中的配偶体核苷酸配对。
连接通常可以通过具有连接酶活性的酶进行。例如，可以用T3 DNA连接酶或T4DNA连接酶进行连接。使用这些酶将导致维持合成链中的单链断裂，因为辅助链的末端核苷酸由于不存在末端磷酸基团而不能作为连接酶的底物。
连接多核苷酸与切割的支架多核苷酸的连接完成第一个合成循环，其中步骤(1)的支架多核苷酸被有效地重新构建，除了预定的核苷酸序列的第一个核苷酸与其配偶体核苷酸相对地掺入多核苷酸中以外。
与方法版本1和2一样，方法版本3中的连接通常可以通过具有连接酶活性的酶进行。例如，可以用T3 DNA连接酶或T4 DNA连接酶进行连接。使用连接酶将导致维持合成链中的单链断裂，因为辅助链的末端核苷酸由于不存在末端磷酸基团而不能作为连接酶的底物。
连接多核苷酸与切割的支架多核苷酸的连接完成第一个合成循环，其中步骤(1)的支架多核苷酸被有效地重新构建，除了预定的核苷酸序列的第一个核苷酸与其配偶体核苷酸相对地掺入多核苷酸中以外，如如图3a所示。如在示例性方法版本1和2中，在示例性方法版本3中，在给定合成循环结束时，在合成循环期间，通用核苷酸相对于前一循环中支持链中通用核苷酸占据的位置占据支持链中的位置n+1。同时，并且如在示例性方法版本1中，在给定的合成循环结束时，通用核苷酸也将相对于合成链中的位置占据支持链中的的位置n，所述合成链中的位置将被在下一个循环中掺入的预定的核苷酸序列的下一个核苷酸占据。因此，在给定的合成循环结束时，提供修饰的支架分子(306)用于下一个合成循环，其中通用核苷酸再次定位在支持链中以促进预定核苷酸序列的下一个核苷酸的掺入和在下一个合成循环中支持链的切割。
为了使预定核苷酸序列的下一个核苷酸掺入下一个合成循环中，必须从第一个核苷酸中除去可逆终止子基团(脱保护步骤；305)。这可以如上面针对方法版本1所描述的那样执行。
在示例性方法版本3中，可以如上针对第一合成循环所述执行第二和后续合成循环。
因此，在步骤(6)中，为下一个合成循环(306)提供的支架多核苷酸是第一个合成循环的连接步骤(4)和脱保护步骤例如步骤(5)的产物。在步骤(6)中，通过聚合酶的作用将预定核苷酸序列中的下一个核苷酸掺入(307)到支架多核苷酸的合成链中，如上文对第一个循环的步骤(2)所述。下一个核苷酸还包含可逆终止子基团，其阻止聚合酶在该循环中的进一步延伸作用。
如在示例性方法版本3的第一个合成循环的步骤(2)中，在步骤(6)中，将下一个核苷酸与通用核苷酸相对地掺入，所述通用核苷酸位于支持链中，使得其在掺入时与下一个核苷酸配对。在该构型中，通用核苷酸再次位于相对于合成链中掺入的下一个核苷酸的“n”位置。此外，如上文对于第一个合成循环所述，在下一个合成循环的步骤(6)中，通用核苷酸将占据支持链中相对于上一个循环的步骤(2)中支持链中通用核苷酸占据的位置的位置“n+1”。这是因为在先前合成循环的连接多核苷酸中通用核苷酸被定位成与辅助链的末端非磷酸化核苷酸相对并与其配对而实现的。
在步骤(7)中，支架多核苷酸在切割位点被切割(308)，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定。切割包括切割支持链并除去通用核苷酸以在合成链中提供双核苷酸突出末端，其包含所述下一个核苷酸作为剩余支架多核苷酸中突出端的末端核苷酸。合成链的双核苷酸突出端突出于剩余的切割的支架多核苷酸中支持链的末端核苷酸。可以如上针对第一循环的步骤(3)所述进行切割步骤。
在下一循环的步骤(8)中，将双链连接多核苷酸连接(309)至切割的支架多核苷酸。连接多核苷酸包含支持链和辅助链。连接多核苷酸还包含互补连接末端，其在支持链中包含通用核苷酸和突出核苷酸，所述突出核苷酸是预定核苷酸序列的下一个核苷酸的配偶体核苷酸。连接多核苷酸在与突出端相邻的辅助链中还包含缺少磷酸酯基团的末端核苷酸。配置互补连接末端，使其在经受合适的连接条件时与步骤(7)的切割支架多核苷酸产物的突出端相容地连接。在连接支持链后，预定核苷酸序列的下一个核苷酸变为与其配偶体核苷酸配对，从而完成进一步的合成循环。
可以配置下一个和随后的合成循环的步骤(8)的连接多核苷酸，并且可以进行连接步骤，如上文针对第一合成循环的步骤(4)所述。
因此，在步骤(8)中，在连接(309)后，支持链中的通用核苷酸与辅助链的末端核苷酸相对，并与其配对。如上文关于第一合成循环所述，支持链中的通用核苷酸相对于下一个核苷酸位于“n”位置。此外，如上所述，在步骤(8)之后，通用核苷酸相对于在步骤(6)开始之前支持链中通用核苷酸占据的位置占据支持链中的位置“n+1”。
可以如上文关于第一合成循环所述执行在下一个循环(310)中对可逆终止子基团的去保护。
根据需要重复合成循环多次，以合成具有预定核苷酸序列的双链多核苷酸。
合成方法版本4
合成方法版本4是合成方法版本2的变体。因此，与合成方法版本2一样，在合成方法版本4中，新掺入的预定核苷酸在步骤(2)/(6)期间在位置n处与支持链中的配偶体核苷酸相对地掺入合成链中，并且在步骤(3)/(7)期间支持链在位置n和n-1之间被切割。与通用核苷酸占据位置n+1的合成方法版本2 不同，在合成方法版本4中，通用核苷酸在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上占据位置n+2。因此，考虑到该差异，可以参考图3b及其在以上关于方法版本2的描述的上下文中的描述来描述合成方法版本4。设想该方法的进一步变化，其中在每个变化方法中，支持链在步骤(3)/(7)期间在位置n和n-1之间被切割，并且其中通用核苷酸递增地占据支持链中的进一步分别从位置n+2离开的一个位置，例如位置n+3或位置n+3+x，其中x是1到10或更大的整数。
因此，本发明还提供了合成具有如上所述和本文所述的预定序列的双链多核苷酸分子的体外方法，该方法包括进行合成循环，其中：
a)在步骤(1)中，支架链中提供支架多核苷酸，其核苷酸(位置n)是步骤 (2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，并且支持链中的通用核苷酸位于位置n+2(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)；
b)在步骤(2)/(6)中，第一/下一个核苷酸在与支持链中的配偶体核苷酸相对的位置(位置n)掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与配偶体核苷酸配对；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在第二核苷酸(位置n)和第三核苷酸(位置n-1) 之间的位置处在辅助链的远端/引物链的近端的方向上从支持链中的通用核苷酸切割，其中切割去除通用核苷酸并在支架多核苷酸中产生单核苷酸突出端，其包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的互补连接末端包含单核苷酸突出端，其中：
i.通用核苷酸位于支持链中与辅助链中的核苷酸相对的位置
n+2处并与其配对；
ii.支持链的倒数第二个核苷酸与辅助链的末端核苷酸配对，并且是下一个合成循环的步骤(6)中下一个核苷酸的配偶体核苷酸(位置n)；和
iii.支持链的末端核苷酸(位置n-1)突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，或者是当前合成循环的步骤(6)的新掺入核苷酸的配偶体核苷酸。
在上面刚刚描述的该方法的修改中，在步骤(1)中，支持链中的通用核苷酸位于n+3位置(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)，并且在步骤 (4)/(8)中连接多核苷酸的互补连接末端具有位于n+3位置的支持链中的通用核苷酸。或者，在步骤(1)中，支持链中的通用核苷酸位于n+3+x位置(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)，并且在步骤(4)/(8)中连接多核苷酸的互补连接末端具有位于n+3+x位置的支持链中的通用核苷酸，其中x是1至10或更大的整数。
与方法版本2一样，在方法版本4及其变化中，在掺入新的预定的核苷酸之前，可以从支架多核苷酸中省略辅助链部分。在掺入新的预定的核苷酸之前，例如通过变性，可以从支架多核苷酸中除去辅助链部分，如本文更详细描述的。
合成方法版本5
合成方法版本5是合成方法版本3的变体。因此，与合成方法版本3一样，在合成方法版本4中，新掺入的预定核苷酸在步骤(2)/(6)期间在位置n处与支持链中的配偶体通用核苷酸相对地掺入合成链中，并且在步骤(3)/(7)期间支持链在位置n-1和n-2之间被切割。与通用核苷酸占据位置n的合成方法版本3不同，在合成方法版本5中，通用核苷酸在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上占据位置n+1。因此，考虑到该差异，可以参考图3c及其在以上关于方法版本3的描述的上下文中的描述来描述合成方法版本5。设想该方法的进一步变化，其中在每个变化方法中，支持链在步骤(3)/(7)期间在位置n-1和n-2 之间被切割，并且其中通用核苷酸递增地占据支持链中的进一步分别从位置 n+1离开的一个位置，例如位置n+2或位置n+2+x，其中x是1到10或更大的整数。
因此，本发明还提供了合成具有如上所述和本文所述的预定序列的双链多核苷酸分子的体外方法，该方法包括进行合成循环，其中：
a)在步骤(1)中，支架链中提供支架多核苷酸，其核苷酸(位置n)是步骤 (2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，并且支持链中的通用核苷酸位于位置n+1(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)；
b)在步骤(2)/(6)中，第一/下一个核苷酸在与支持链中的配偶体核苷酸相对的位置(位置n)掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与配偶体核苷酸配对；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在第二核苷酸(位置n-1)和第三核苷酸(位置n- 2)之间的位置处在辅助链的远端/引物链的近端的方向上从支持链中的通用核苷酸切割，其中切割去除通用核苷酸并在支架多核苷酸中产生双核苷酸突出端，其包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的互补连接末端包含双核苷酸突出端，并且其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于与辅助链中的核苷酸相对的位置 n+1处并与其配对；
ii.支持链的倒数第二个核苷酸(位置n-1)突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，或者是当前合成循环的步骤(6)的新掺入核苷酸的配偶体核苷酸；和
iii.支持链的n位核苷酸与辅助链的末端核苷酸配对，并且是下一个合成循环的步骤(6)中下一个核苷酸的配偶体核苷酸。
在上面刚刚描述的该方法的修改中，在步骤(1)中，支持链中的通用核苷酸位于n+2位置(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)，并且在步骤 (4)/(8)中连接多核苷酸的互补连接末端具有位于n+2位置的支持链中的通用核苷酸。或者，在步骤(1)中，支持链中的通用核苷酸位于n+2+x位置(在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上)，并且在步骤(4)/(8)中连接多核苷酸的互补连接末端具有位于n+2+x位置的支持链中的通用核苷酸，其中x是1至10或更大的整数。
与方法版本3一样，在方法版本5及其变化中，在掺入新的预定的核苷酸之前，可以从支架多核苷酸中省略辅助链部分。在掺入新的预定的核苷酸之前，例如通过变性，可以从支架多核苷酸中除去辅助链部分，如本文更详细描述的。
合成链
在合成本文所述的多核苷酸或寡核苷酸的方法中，包括但不限于如上所述的方法版本1、2和3中，所述支架多核苷酸具有合成链。在合成循环期间，将预定序列的每个新核苷酸掺入合成链中。聚合酶可用于催化每个新核苷酸、核苷酸类似物/衍生物或非核苷酸的掺入。合成链包含引物链部分，并且优选包含辅助链部分。
辅助链
可在支架多核苷酸中提供辅助链以促进切割步骤中切割酶的结合。可以省略辅助链，条件是提供替代手段以确保在切割步骤中切割酶的结合并且如果需要的话确保在连接步骤中的连接。在本发明的优选方法中，合成链具有辅助链。
对辅助链的长度、序列和结构的参数没有特殊要求，条件是辅助链适合于促进切割步骤中切割酶的结合。
辅助链可包含核苷酸、核苷酸类似物/衍生物和/或非核苷酸。
优选地，应该避免辅助链的序列区域内与支持链的错配，应避免富含GC 和AT的区域，此外应避免二级结构的区域，例如发夹或凸起。
辅助链的长度可以是10个碱基或更多。任选地，辅助链的长度可以是15 个碱基或更多，优选30个碱基或更多。然而，辅助链的长度可以变化，条件是辅助链能够促进切割和/或连接。
辅助链必须与支持链的相应区域杂交。如果辅助链可以促进切割步骤中切割酶的结合和/或连接步骤中连接酶的结合，则整个辅助链与支持链的相应区域杂交不是必需的。因此，可以容忍辅助链和支持链的相应区域之间的错配。辅助链可以比支持链的相应区域长。支持链可以在远离引物链的方向上延伸超出与辅助链相对应的区域。辅助链可以例如通过发夹连接到支持链的相应区域。
辅助链优选与支持链杂交，使得切口位点处的辅助链的末端核苷酸占据相对于切口位点处的引物链的末端核苷酸的在合成链中的下一个连续核苷酸位置。因此，在该构型中，辅助链和引物链之间没有核苷酸位置缺口。然而，由于存在单链断裂或缺口，辅助链和引物链将是物理分离的。优选地，切口位点处的辅助链的末端核碱基与支持链中的其配偶体核苷酸杂交。
与通用核苷酸配对的辅助链中的核苷酸可以是任何合适的核苷酸。优选地，应该避免可能扭曲分子螺旋结构的配对。优选地，胞嘧啶充当通用核苷酸的配偶体。在特别优选的实施方案中，通用核苷酸是肌苷或其类似物、变体或衍生物，并且辅助链中通用核苷酸的配偶体核苷酸是胞嘧啶。
去除辅助链
在本文所述的任何合成方法中，包括示例性方法版本1、2和3中，在提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸的步骤(1)中(即在第一循环中)(101、106、201、206、301、306)，可以在没有辅助链的情况下提供合成链。这可以改善聚合酶与支架多核苷酸的结合。
此外，在任何一个或多个合成循环中，或在所有合成循环中，在将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸的步骤之后和在将预定核苷酸序列的核苷酸掺入支架多核苷酸的合成链的步骤之前，可以从支架多核苷酸中除去合成链的辅助链部分。合成链的辅助链部分可以通过任何合适的方法从支架多核苷酸中除去，包括但不限于：(i)将支架多核苷酸加热至约80℃至约95℃的温度并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，(ii)用尿素溶液(例如8M尿素)处理支架多核苷酸并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，(iii)用甲酰胺或甲酰胺溶液 (例如100％甲酰胺)处理支架多核苷酸并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，或 (iv)使支架多核苷酸与单链多核苷酸分子接触，所述单链多核苷酸分子包含与辅助链部分的序列互补的核苷酸序列区域，从而竞争性地抑制辅助链部分与支架多核苷酸的杂交。
在将双链连接多核苷酸连接到切割的支架多核苷酸的步骤之后和在将预定的核苷酸序列的下一个核苷酸掺入支架多核苷酸的合成链的步骤之前从支架多核苷酸中除去辅助链部分的方法中，切割步骤将包括在不存在由辅助链提供的双链区域的情况下切割支持链。可以选择任何合适的酶来进行这样的切割步骤，例如选自本文公开的任何合适的酶。
引物链
引物链应该具有足够的长度并且应该具有序列和结构，使得它适合于允许聚合酶启动合成，即催化在缺口位点处在引物链的末端掺入新的核苷酸。
引物链可以包含可以用于引发新的多核苷酸合成的序列区域(例如如图1 至3中的每一个中描绘的结构中的虚线所示)。引物链可以由可以起到引发新多核苷酸合成的作用的序列区域组成，因此整个引物链可以是可以起到引发新多核苷酸合成的序列。
对引物链的长度、序列和结构的参数没有特殊要求，条件是引物链适合引发新的多核苷酸合成。
引物链可包含核苷酸、核苷酸类似物/衍生物和/或非核苷酸。
技术人员能够容易地构建能够引发新的多核苷酸合成的引物链。因此，在可以起到引发新的多核苷酸的作用的引物链的序列区域内，应该避免与支持链的错配，应避免富含GC和AT的区域，以及此外应避免二级结构的区域，如发夹或凸起。
本领域技术人员可根据需要和所用的聚合酶选择可用于引发新的多核苷酸合成的引导链的序列区域的长度。该区域的长度可以是7个碱基或更多，8 个碱基或更多，9个碱基或更多个或10个碱基或更多。任选地，该区域的长度为15个碱基或更多，优选30个碱基或更多。
引物链必须与支持链的相应区域杂交。如果引物链能够引发新的多核苷酸合成，则整个引物链与支持链的相应区域杂交不是必需的。因此，引物链和支持链的相应区域之间的错配可以在一定程度上被容忍。优选地，可用于引发新多核苷酸合成的引物链序列区域应包含与支持链中相应核碱基互补的核碱基。
引物链可以比支持链的相应区域长。支持链可以在远离辅助链的方向上延伸超出与引物链对应的区域。引物链可以例如通过发夹连接到支持链的相应区域。
支持链
在本发明的方法中，包括但不限于如上所述的方法版本1、2和3中，支架多核苷酸具有支持链。支持链与合成链杂交。对支持链的长度、序列和结构的参数没有特殊要求，条件是支持链与引物链部分相容，并且如果包括的话，如上所述，与合成链的辅助链部分相容。
RNA合成
描述用于DNA合成的方法可以适用于RNA的合成。在一种调整中，可以调整针对方法版本1-3描述的合成步骤。因此，在每个方法版本1-3中，支架多核苷酸的支持链是DNA链，如上所述。支架多核苷酸的合成链的引物链部分是RNA链。如果存在，辅助链优选是RNA链。如果存在，辅助链可以是 DNA链。
核苷酸可以从核糖核苷-5'-O-三磷酸(NTP)掺入，其可以被修饰以包含可逆终止子基团，如上所述。优选使用3'-O-修饰的核糖核苷-5'-O-三磷酸。通过 RNA聚合酶的作用掺入修饰的核苷酸。
因此，与方法版本1-3有关的上述描述可以在必要的变更后应用于RNA 合成，但如所描述的那样进行调整。与方法版本1和2相关的示例性适应反应方案示于图23至25中。方法版本3可以以相同的方式进行调整。在任何适用于RNA合成的方法中，支持链、引物链、辅助链、连接多核苷酸和通用核苷酸的上述描述可以在必要的变更后应用，但如所述进行调整。如前所述的切割步骤和切割位置可以在必要的变更后应用，因为包含通用核苷酸的支持链是 DNA链。在优选的实施方案中，SplintR DNA连接酶用于连接步骤。
实施例
以下实施例说明了用于合成根据本发明的多核苷酸或寡核苷酸的方法的某些实施方案，以及用于该方法的示例性构建体。实施例不限制本发明。
实施例1.没有辅助链下的合成.
该实施例描述了使用4个步骤合成多核苷酸：在部分双链DNA上掺入3’-O-修饰的dNTP，切割，连接和去保护，第一步发生在通用核苷酸的对面，在这种特殊情况下其是肌苷。
第1步：掺入
第一步描述了通过DNA聚合酶的酶促掺入将3’-O-保护的单核苷酸受控的添加到寡核苷酸中(图5a)。
材料和方法
材料
1.3’-O-修饰的dNTP根据博士论文中描述的方案内部合成：Jian Wu: MolecularEngineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis,Columbia University,2008。用于合成的方案还描述于专利申请公开： J.WilliamEfcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-Independent Enzymes forPolydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1。
2.寡核苷酸是内部设计的并从Sigma-Aldrich获得(图5h)。以100μM的浓度制备储备溶液。
3.使用终止子IX DNA聚合酶，其由New England BioLabs工程化，具有增强的掺入3-O-修饰的dNTP的能力。然而，可以使用任何可以掺入修饰的 dNTP的DNA聚合酶。
测试了两种类型的可逆终止剂：
Figure GDA0003160615080000911
方法
1.将2μl的10x
Figure GDA0003160615080000912
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10 mM KCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080000913
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)与 12.25μl无菌去离子水(ELGA VEOLIA)在1.5ml Eppendorf管中混合。
2.将0.5μl的10μM引物(合成链)(5pmol，1当量)(SEQ ID NO：1，图5h)和 0.75μl的10μM模板(支持链)(6pmol，1.5当量)(SEQ ID NO：2，图5h)加入到反应混合物中。
3.加入3’-O-修饰的-dTTP(2μl的100μM)和MnCl2(1μl的40mM)。
4.然后加入1.5μl的终止子IX DNA聚合酶(15U，New England BioLabs)。然而，可以使用任何可以掺入修饰的dNTP的DNA聚合酶。
5.将反应物在65℃温育20分钟。
6.将反应物通过加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)停止。
7.将反应物在聚丙烯酰胺凝胶(15％)上用TBE缓冲液分离，并通过 ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行可视化。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.在无菌1.5ml Eppendorf管中将5μl反应混合物加入5μl的TBE-尿素样品缓冲液(Novex)中，并使用加热ThermoMixer(Eppendorf)加热至95℃，持续5分钟。
2.然后将5μl样品加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳； 260V，90Amp，室温下40分钟。
4.将凝胶通过使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
结果
来自New England BioLabs的定制工程化终止子IX DNA聚合酶是一种有效的 DNA聚合酶，其能够与通用核苷酸例如肌苷相对地掺入3’-O-修饰的dNTP(图 5b-c)。
相对肌苷有效地掺入发生在65℃的温度(图5d-e)。
相对肌苷掺入3’-O-修饰的dTTP需要存在Mn2+离子(图5f-g)。成功转换在图 5c、e、g和h中以粗体标记。
结论
3-O-改性dTTP与肌苷相对地掺入可用New England Biolabs的定制工程化终止子IX DNA聚合酶在Mn2+离子存在下和在65℃的温度下以特别高的效率实现。
第二步：切割
第二步描述了用hAAG/Endo VIII或hAAG/化学碱两步切割多核苷酸(图6a)。
材料和方法
材料
1.实施例1中使用的寡核苷酸是内部设计的并由Sigma Aldrich合成(参见图 6(e)的序列表)。
2.使用无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)将寡核苷酸稀释至100μM的储备浓度。
方法
使用以下程序对寡核苷酸进行切割反应：
1.用移液管(Gilson)将41μl无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)转移到1.5ml Eppendorf管中。
2.然后将5μl的10X
Figure GDA0003160615080000941
反应缓冲液NEB(20mM Tris-HCl,10mM (NH4)2SO4,10mM KCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080000942
X-100,pH 8.8)加入同一 Eppendorf管中。
3.加入1μl每种寡核苷酸(图6e)；模板(SEQ ID NO：3)或任何荧光标记的长寡链，具有T(SEQ ID NO：4)和对照(SEQ ID NO：5)的引物到同一管中，均为 5pmol。
4.将1μl人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)NEB(10单位/μl)加入同一管中。
5.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在37℃温育1小时。
6.通常在温育时间过去之后，将反应物通过酶促热失活(即65℃下20分钟) 终止。
在环境条件下纯化。使用下面概述的方案纯化样品混合物：
1.将500μl缓冲液PNI QIAGEN(5M氯化胍)加入到样品中并通过用移液管重悬浮温和混合。
2.将混合物转移到QIAquick旋转柱(QIAGEN)并以6000rpm离心1分钟。
3.离心后，弃去流过液，向旋转柱中加入750μl缓冲液PE QIAGEN(10mM Tris-HClpH7.5和80％乙醇)，并以6000rpm离心1分钟。
4.将流过液丢弃并将旋转柱以13000rpm离心另外的1分钟以除去残余的 PE缓冲液。
5.然后将旋转柱置于无菌的1.5ml Eppendorf管中。
6.对于DNA洗脱，将50μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)加入柱膜中心并在室温下静置1分钟。
7.然后将管以13000rpm离心1分钟。测量洗脱的DNA浓度并储存在-20℃下以备后用。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop one(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽 (blank)NanoDropone。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加到基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
使用以下程序进行产生的无碱基位点的切割：
1.将2μl(10-100ng/μl)DNA加入无菌的1.5ml Eppendorf管中。
2.在同一管中加入40μl(0.2M)NaOH或1.5μl Endo VIII NEB(10单位/μl)和 5μl的10X反应缓冲液NEB(10mM Tris-HCl，75mM NaCl，1mM EDTA，pH 8@25℃)并通过再悬浮温和混合和在13000rpm离心5秒。
3.将得到的混合物在室温下温育5分钟以使NaOH处理样品，同时将Endo VIII反应混合物在37℃下温育1小时。
4.温育时间过去之后，将反应混合物用如上面概述的纯化方案的步骤1-7纯化。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.将5μl的DNA和TBE-尿素样品缓冲液(Novex)加入无菌1.5ml Eppendorf 管中，并使用加热热块(Eppendorf)加热至95℃，持续2分钟。
2.然后DNA混合物加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM 硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳； 260V，90Amp，室温下40分钟。
4.采用使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)进行检测和DNA在凝胶中的可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
结果和结论
没有辅助链的切割反应显示切割与未切割的DNA的比率为～7％：93％的低百分比产率(图6b-d)。
切割结果显示，在该具体实施例中，并且基于所用的特定试剂，与阳性对照相比，在不存在辅助链的情况下获得了低产率的切割DNA。此外，与EndoVIII 切割相比，使用化学碱来切割无碱基位点的时间消耗较少。
第3步：连接
第三步描述了在不存在辅助链的情况下用DNA连接酶连接多核苷酸。图7中显示了示意图。
材料和方法
材料
1.实施例1中使用的寡核苷酸是内部设计的并由Sigma Aldrich合成(参见图 7c的序列表)。
2.使用无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)将寡核苷酸稀释至100μM的储备浓度。
方法
使用以下程序进行寡核苷酸的连接反应：
1.用移液管(Gilson)将16μl无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)转移到1.5ml Eppendorf管中。
2.然后将10μL的2X快速连接反应缓冲液NEB(132mM Tris-HCl,20mM MgCl2,2mM二硫苏糖醇，2mM ATP，15％聚乙二醇(PEG6000)和pH 7.6，在 25℃)加入到相同的Eppendorf管中。
3.加入1μl每种寡核苷酸(图7c)；TAMRA或任何荧光标记的磷酸酯链(SEQ ID NO：7)，具有T(SEQ ID NO：8)和肌苷链(SEQ ID NO：9)的引物到同一管中，均为5pmol。
4.将1μl的Quick T4 DNA连接酶NEB(400单位/μl)加入同一管中。
5.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在室温温育20分钟。
6.通常在温育时间过去后，加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)终止反应。
7.使用如上所述的纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop one(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽 (blank)NanoDropone，然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加到基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
5.将纯化的DNA在聚丙烯酰胺凝胶上运行，并按照上述步骤5-8中的程序可视化。没有引入条件或试剂的变化。
结果和结论
在该具体实施例中，并且基于所用的特定试剂，在没有辅助链的情况下，在室温(24℃)下用DNA连接酶(在该特定情况下为快速T4 DNA连接酶)连接寡核苷酸导致减少量的连接产物(图7b)。
实施例2.用辅助链的版本1化学.
该实施例描述了使用4个步骤合成多核苷酸：从切口位点掺入切割3’-O-修饰的dNTP，连接和去保护，其中第一步与通用核苷酸相对地进行，在该特定情况下通用核苷酸为肌苷。该方法使用辅助链，其提高了连接和切割步骤的效率。
第1步：掺入
第一步描述了通过DNA聚合酶的酶促掺入将3’-O-保护的单核苷酸受控的添加到寡核苷酸中(图8a)。
材料和方法
材料
1.3’-O-修饰的dNTP根据博士论文中描述的方案内部合成：Jian Wu: MolecularEngineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing bySynthesis.Columbia University,2008。用于合成的方案还描述于专利申请公开：J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-IndependentEnzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1。
2.寡核苷酸是内部设计的并从Sigma-Aldrich获得。以100μM的浓度制备储备溶液。寡核苷酸显示在图8b中。
3.使用终止子IX DNA聚合酶，其由New England BioLabs工程化，具有增强的掺入3-O-修饰的dNTP的能力。
测试了两种类型的可逆终止剂：
Figure GDA0003160615080000991
方法
1.将2μl的10x
Figure GDA0003160615080000992
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10 mM KCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080000993
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)与 10.25μl无菌去离子水(ELGA VEOLIA)在1.5ml Eppendorf管中混合。
2.将0.5μl的10μM引物(5pmol，1当量)(SEQ ID NO：10，图8(b)中的表)、0.75μl的10μM模板(6pmol，1.5当量)(SEQ ID NO：11，图8(b)中的表)、2μl的10μM辅助链(SEQ ID NO：12，图8(b)中的表)加入到反应混合物中。
3.加入3’-O-修饰的-dTTP(2μl的100μM)和MnCl2(1μl的40mM)。
4.然后加入1.5μl的终止子IX DNA聚合酶(15U，New England BioLabs)。
5.将反应物在65℃温育20分钟。
6.将反应物通过加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)停止。
7.将反应物在聚丙烯酰胺凝胶(15％)上用TBE缓冲液分离，并通过 ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行可视化。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.在无菌1.5ml Eppendorf管中将5μl反应混合物加入5μl的TBE-尿素样品缓冲液(Novex)中，并使用加热ThermoMixer(Eppendorf)加热至95℃，持续5分钟。
2.然后将5μl样品加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳； 260V，90Amp，室温下40分钟。
4.将凝胶通过使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
可以根据上述方案研究掺入步骤。
第二步：切割
第二步描述了用hAAG/Endo VIII或hAAG/化学碱(x2)两步切割多核苷酸(图 9a)。
材料和方法
材料
1.实施例2中使用的寡核苷酸是内部设计的并由Sigma Aldrich合成(参见图 9f序列)。
2.使用无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)将寡核苷酸稀释至100μM的储备浓度。
方法
使用以下程序进行寡核苷酸的切割反应：
1.用移液管(Gilson)将41μl无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)转移到1.5ml Eppendorf管中。
2.然后将5μl的10X
Figure GDA0003160615080001011
反应缓冲液NEB(20mM Tris-HCl,10mM (NH4)2SO4,10mM KCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001012
X-100,pH 8.8)加入同一 Eppendorf管中。
3.加入1μl每种寡核苷酸(图9f)；模板(SEQ ID NO：13)或任何荧光标记的长寡链，具有T(SEQ ID NO：14)的引物，对照(SEQ ID NO：15)和辅助链(SEQ ID NO：16)到同一管中，均为5pmol。
4.将1μl人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)NEB(10单位/μl)加入同一管中。
5.在使用替代碱的反应中，加入1μl的人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶 (hAAG)NEB(100单位/μl)。
6.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在37℃温育1小时。
7.通常在温育时间过去之后，将反应物通过酶促热失活(即65℃下20分钟) 终止。
在环境条件下纯化。使用下面概述的方案纯化样品混合物：
1.将500μl缓冲液PNI QIAGEN(5M氯化胍)加入到样品中并通过用移液管重悬浮温和混合。
2.将混合物转移到QIAquick旋转柱(QIAGEN)并以6000rpm离心1分钟。
3.离心后，弃去流过液，向旋转柱中加入750μl缓冲液PE QIAGEN(10mM Tris-HClpH7.5和80％乙醇)，并以6000rpm离心1分钟。
4.将流过液丢弃并将旋转柱以13000rpm离心另外的1分钟以除去残余的 PE缓冲液。
5.然后将旋转柱置于无菌的1.5ml Eppendorf管中。
6.对于DNA洗脱，将50μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)加入柱膜中心并在室温下静置1分钟。
7.然后将管以13000rpm离心1分钟。测量洗脱的DNA浓度并储存在-20℃下以备后用。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop one(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽(blank) NanoDropone。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加到基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
使用以下程序进行产生的无碱基位点的切割：
1.将2μl(10-100ng/μl)DNA加入无菌的1.5ml Eppendorf管中。
2.在同一管中加入40μl(0.2M)NaOH或1.5μl Endo VIII NEB(10单位/μl)和 5μl的10X反应缓冲液NEB(10mM Tris-HCl，75mM NaCl，1mM EDTA，pH 8@25℃)并通过再悬浮温和混合和在13000rpm离心5秒。
3.将得到的混合物在室温下温育5分钟以使0.2M NaOH处理样品，同时将 EndoVIII反应混合物在37℃下温育1小时。
4.温育时间过去之后，将反应混合物用如上面所述的纯化方案的步骤1-7纯化。
使用以下程序进行使用替代碱性化学品的产生的无碱基位点的切割：
1.将1μl(10-100ng/μl)DNA加入无菌的1.5ml Eppendorf管中。然后将在室温下用乙酸溶液sigma(99.8％)缓冲至pH7.4的2μl的N,N'-二甲基乙二胺Sigma (100mM)加入同一管中。
2.将20μl无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)加入管中，通过重悬浮轻轻混合和在13000rpm离心5秒。
3.将所得混合物在37℃下温育20分钟。
4.温育时间过去之后，将反应混合物用如上面所述的纯化方案的步骤1-7纯化。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.将5μl的DNA和TBE-尿素样品缓冲液(Novex)加入无菌1.5ml Eppendorf 管中，并使用加热热块(Eppendorf)加热至95℃，持续2分钟。
2.然后DNA混合物加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM 硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳； 260V，90Amp，室温下40分钟。
4.采用使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)进行检测和DNA在凝胶中的可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
结果
通过hAAG DNA糖基化酶在包含通用核苷酸(在该特定情况下为肌苷)的切割位点处的切割效率从辅助链不存在时的10％显著增加至辅助链存在下的50％(图 9b)。hAAG和核酸内切酶VIII以比hAAG和NaOH(50％)更低的效率(10％)切割肌苷。在使用带切口的DNA的所述系统中，使用0.2M NaOH的化学切割显示对于AP位点的切割优于内切核酸酶VIII(图9c)。在中性pH下的温和N,N'- 二甲基乙二胺具有如0.2M NaOH高的效率切割无碱基位点，并因此与内切核酸酶VIII和NaOH相比是优选的(图9d-e)。
结论
对于切割含有肌苷的DNA，评估了三种方法。在实施例2中对于DNA切割研究了一种完全的酶促方法-hAAG/核酸内切酶VIII，以及两种结合化学和酶促切割的方法-hAAG/NaOH和hAAG/二甲基乙胺。
hAAG/NaOH结果显示，与不存在辅助链(10％)相比，在辅助链存在下切割 DNA的产率(50％)高得多。在这些具体的实施例中，并且基于所用的特定试剂，辅助链增加了DNA切割的产率。
在辅助链存在下，与NaOH(50％)相比，使用内切核酸酶VIII作为NaOH的替代物的酶促切割效率较低(10％)。
包含替代的温和化学碱N,N'-二甲基乙二胺导致AP位点的高切割效率，与 NaOH一样有效，并且与添加10x hAAG酶一起对切割的DNA具有显著增加(参见图9e)。
第3步：连接
第三步描述了在辅助链存在下用DNA连接酶连接多核苷酸。图10a中示出了图解说明。
材料和方法
材料
1.寡核苷酸是内部设计的并由Sigma Aldrich合成(参见图10d序列)。
2.使用无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)将寡核苷酸稀释至100μM的储备浓度。
方法
使用以下程序进行寡核苷酸的连接反应：
1.用移液管(Gilson)将16μl无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)转移到1.5ml Eppendorf管中。
2.然后将10μL的2X快速连接反应缓冲液NEB(132mM Tris-HCl,20mM MgCl2,2mM二硫苏糖醇，2mM ATP，15％聚乙二醇(PEG6000)和pH 7.6，在 25℃)加入到相同的Eppendorf管中。
3.加入1μl每种寡核苷酸(图10d)；TAMRA或任何荧光标记的磷酸酯链(SEQ ID NO：18)，具有T(SEQ ID NO：19)和肌苷链(SEQ ID NO：20)和辅助链(SEQ ID NO:21)的引物到同一管中，均为5pmol。
4.将1μl的Quick T4 DNA连接酶NEB(400单位/μl)加入同一管中。
5.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在室温温育20分钟。
6.通常在温育时间过去后，加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)终止反应。
7.使用如上所述的纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop one(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽(blank) NanoDropone。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加到基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
5.将纯化的DNA在聚丙烯酰胺凝胶上运行，并按照上述步骤5-8中的程序可视化。没有引入条件或试剂的变化。
结果和结论
在该具体实施例中，并且基于所使用的特定试剂，在没有辅助链的情况下观察到降低的连接活性(图10b)，而在辅助链存在下连接以高效率进行(图10c)并且产物以高产率形成。
实施例3.用辅助链的版本2化学.
该实施例描述了使用4个步骤合成多核苷酸：在部分双链DNA上掺入3’-O-修饰的dNTP；在第一步掺入与天然互补核苷酸相对地进行的情况下切割、连接和去保护，该天然互补核苷酸位于支持链中与通用核苷酸相邻，在该特定情况下通用核苷酸为肌苷。
第1步：掺入
材料和方法
材料
第一步描述了通过DNA聚合酶的酶促掺入将3’-O-保护的单核苷酸受控的添加到寡核苷酸中(图11a)。
1.3’-O-修饰的dNTP根据博士论文中描述的方案内部合成：Jian Wu: MolecularEngineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing bySynthesis.Columbia University,2008。用于合成的方案还描述于专利申请公开：J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-IndependentEnzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1。
2.寡核苷酸是内部设计的并从Sigma-Aldrich获得(图11j)。以100μM的浓度制备储备溶液。
3.使用终止子IX DNA聚合酶，其由New England BioLabs工程化，具有增强的掺入3-O-修饰的dNTP的能力。
所有dNTP的3'-O-叠氮甲基可逆终止子独立测试其掺入：
Figure GDA0003160615080001081
方法
1.将2μl的10x
Figure GDA0003160615080001082
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001083
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)与12.25μl 无菌去离子水(ELGA VEOLIA)在1.5ml Eppendorf管中混合。
2.将0.5μl的10μM引物(5pmol,1当量)(SEQ ID NO:22,图11j)和0.75μl的 10μM模板-A/G/T/C(6pmol,1.5当量)(SEQ ID NOS:23-26,图11j)以及1μl的 10μM辅助链-T/C/A/G(10pmol,2当量)(SEQ ID NOS:27-30,图11j)加入反应混合物中。
3.加入3’-O-修饰的-dTTP/dCTP/dATP/dGTP(2μl的100μM)和MnCl2(1μl的 40mM)。
4.然后加入1.5μl的终止子IX DNA聚合酶(15U，New England BioLabs)。
5.将反应物在65℃温育20分钟。
6.将反应物通过加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)停止。
7.将反应物在聚丙烯酰胺凝胶(15％)上用TBE缓冲液分离，并通过ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行可视化。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.在无菌1.5ml Eppendorf管中将5μl反应混合物加入5μl的TBE-尿素样品缓冲液(Novex)中，并使用加热ThermoMixer(Eppendorf)加热至95℃，持续5分钟。
2.然后将5μl样品加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳； 260V，90Amp，室温下40分钟。
4.将凝胶通过使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
结果和结论
关于使用终止子IX DNA聚合酶评估3-O-叠氮甲基-dTTP掺入温度，结果表明在用于连接的辅助链存在下3'-O-叠氮甲基-dTTP的掺入在5分钟后达到90％。在37℃和47℃下20分钟后，10％的引物保持未延伸。
终止子IX DNA聚合酶在2mM的Mn2+离子和37℃的温度下提供了在辅助链的存在下与DNA中互补碱基相对地高效率(从前一个循环开始的连接步骤)掺入 3’-O-修饰的dNTP的良好条件。
第二步：切割
第二步描述了用核酸内切酶V一步切割多核苷酸(图12a)。
材料和方法
材料
1.实施例3中使用的寡核苷酸是内部设计的并由Sigma Aldrich合成(参见图 12d的序列表)。
2.使用无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)将寡核苷酸稀释至100μM的储备浓度。
方法
使用以下程序进行寡核苷酸的切割反应：
1.用移液管(Gilson)将41μl无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)转移到1.5ml Eppendorf管中。
2.然后将5μ1的10X Reaction
Figure GDA0003160615080001101
NEB(50mM的醋酸钾，20mM的Tris- 乙酸盐，10mM的醋酸镁，1mM的DTT，pH值7.9@25℃)加入到相同的 Eppendorf管中。
3.加入1μl每种寡核苷酸(图12d)；模板(SEQ ID NO：31)或任何荧光标记的长寡链，具有T(SEQ ID NO：32)和对照(SEQ ID NO：33)以及辅助链(SEQ ID NO：34)的引物到同一管中，均为5pmol。
4.将1μl人核酸内切酶V(Endo V)NEB(10单位/μl)加入到同一管中。
5.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在37℃温育1小时。
6.通常在温育时间过去之后，将反应物通过酶促热失活(即65℃下20分钟) 终止。
使用下面概述的方案纯化样品混合物：
1.将500μl缓冲液PNI QIAGEN(5M氯化胍)加入到样品中并通过用移液管重悬浮温和混合。
2.将混合物转移到QIAquick旋转柱(QIAGEN)并以6000rpm离心1分钟。
3.离心后，弃去流过液，向旋转柱中加入750μl缓冲液PE QIAGEN(10mM Tris-HClpH7.5和80％乙醇)，并以6000rpm离心1分钟。
4.将流过液丢弃并将旋转柱以13000rpm离心另外的1分钟以除去残余的PE 缓冲液。
5.然后将旋转柱置于无菌的1.5ml Eppendorf管中。
6.对于DNA洗脱，将50μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)加入柱膜中心并在室温下静置1分钟。
7.然后将管以13000rpm离心1分钟。测量洗脱的DNA浓度并储存在-20℃下以备后用。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop one(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽 (blank)NanoDropone。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加到基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.将5μl的DNA和TBE-尿素样品缓冲液(Novex)加入无菌1.5ml Eppendorf 管中，并使用加热热块(Eppendorf)加热至95℃，持续2分钟。
2.然后DNA混合物加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳；260V，90Amp，室温下40分钟。
4.采用使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)进行检测和DNA在凝胶中的可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
结果和结论
来自实施例3的切割结果显示，在存在或不存在辅助链的情况下，内切核酸酶 V可以获得显著高的切割DNA产量(图12c)。
第3步：连接
第三步描述了在辅助链存在下用DNA连接酶连接多核苷酸。图13a中示出了图解说明。
材料和方法
材料
1.实施例3中使用的寡核苷酸是内部设计的并由Sigma Aldrich合成(参见图 13b的序列表)。
2.使用无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)将寡核苷酸稀释至100μM的储备浓度。
方法
使用以下程序进行寡核苷酸的连接反应：
1.用移液管(Gilson)将16μl无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)转移到1.5ml Eppendorf管中。
2.然后将10μL的2X快速连接反应缓冲液NEB(132mM Tris-HCl,20mM MgCl2,2mM二硫苏糖醇，2mM ATP，15％聚乙二醇(PEG6000)和pH 7.6，在 25℃)加入到相同的Eppendorf管中。
3.加入1μl每种寡核苷酸(图13b)；TAMRA或任何荧光标记的磷酸酯链(SEQ ID NO：35)，具有T(SEQ ID NO：36)和肌苷链(SEQ ID NO：37)和辅助链(SEQ ID NO:38)的引物到同一管中，均具有5pmol量。
4.将1μl的Quick T4 DNA连接酶NEB(400单位/μl)加入同一管中。
5.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在室温温育20分钟。
6.通常在温育时间过去后，加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)终止反应。
7.使用如上所述的纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop one(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽 (blank)NanoDropone。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加到基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
5.将纯化的DNA在聚丙烯酰胺凝胶上运行，并按照上述步骤5-8中的程序可视化。没有引入条件或试剂的变化。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.将5μl的DNA和TBE-尿素样品缓冲液(Novex)加入无菌1.5ml Eppendorf 管中，并使用加热热块(Eppendorf)加热至95℃，持续2分钟。
2.然后DNA混合物加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳；260V，90Amp，室温下40分钟。
4.采用使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)进行检测和DNA在凝胶中的可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
第4步：脱保护
在DNA模型上研究了脱保护步骤(图14a)，该模型带有由通过终止子IX DNA 聚合酶掺入3'-O-叠氮基甲基-dNTP引入到DNA的3′-O-叠氮基甲基基团。通过三(羧乙基)膦(TCEP)进行脱保护，并且当将所有天然dNTP的混合物加入到纯化的脱保护DNA的溶液中时通过延伸反应进行监测。
材料和方法
材料
1.实施例3中使用的寡核苷酸是内部设计的并由Sigma Aldrich合成(参见图 14i序列)。
2.使用无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)将寡核苷酸稀释至100μM的储备浓度。
3.酶购自New England BioLabs。
方法
1.将2μl的10x
Figure GDA0003160615080001151
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10 mM KCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001152
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)与 12.25μl无菌去离子水(ELGA VEOLIA)在1.5ml Eppendorf管中混合。
2.将1μl的10μM引物(10pmol,1当量)(SEQ ID NO:39,图14i)和1.5μl的 10μM模板-A/G/T/C(15pmol,1.5当量)(SEQ ID NOS:40-43,图14i)加入反应混合物中。
3.加入3’-O-修饰的-dTTP/dCTP/dATP/dGTP(2μl的100μM)和MnCl2(1μl 的40mM)。
4.然后加入1.5μl的终止子IX DNA聚合酶(15U，New England BioLabs)。
5.将反应物在37℃温育5分钟。
6.取出4μL样品并与0.5μ的l5mM dNTP混合物混合并使其反应10分钟以进行对照反应。
7.将在1M TRIS缓冲液pH 7.4中的40μL的500mM TCEP加入到反应混合物中，并使其在37℃反应10分钟。
8.通过用20μL的1x
Figure GDA0003160615080001161
缓冲液洗脱，使用QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物。
9.将1μL的5mM dNTP混合物和1μL的DeepVent(exo-)DNA聚合酶加入到纯化的反应混合物中并使其反应10分钟。
10.将反应物通过加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)停止。
11.将反应物在聚丙烯酰胺凝胶(15％)上用TBE缓冲液分离，并通过 ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行可视化。
结果和结论
50mM TCEP不足以在0.2μM DNA模型上高效切割3'-O-叠氮甲基(图14h)。相反，300mM TCEP成功地在0.2μM DNA模型上以95％的效率切割3'-O-叠氮基甲基(图14h)。
实施例4.有双发夹模型的版本2化学.
该实施例描述了使用4个步骤在双发夹模型上合成多核苷酸：从切口位点掺入3’-O-修饰的dNTP；在第一步在与天然互补核苷酸相对地发生的情况下切割、连接和去保护，该天然互补核苷酸位于支持链中与通用核苷酸相邻，在该特定情况下通用核苷酸为肌苷。
第1步：掺入
第一步描述了通过DNA聚合酶的酶促掺入将3’-O-保护的单核苷酸受控的添加到寡核苷酸中(图15a)。
材料和方法
材料
1.3’-O-修饰的dNTP根据博士论文中描述的方案内部合成：Jian Wu: MolecularEngineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing bySynthesis.Columbia University,2008。用于合成的方案还描述于专利申请公开：J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-IndependentEnzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1。
2.寡核苷酸是内部设计的并从Sigma-Aldrich获得(图15c)。以100μM的浓度制备储备溶液。
3.使用终止子IX DNA聚合酶，其由New England BioLabs工程化，具有增强的掺入3-O-修饰的dNTP的能力。
测试3'-O-叠氮甲基-dTTP的掺入：
3'-O-叠氮甲基-dTTP：
Figure GDA0003160615080001171
方法
1.将2μl的10x
Figure GDA0003160615080001172
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10 mM KCl，2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001173
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)与 10.25μl无菌去离子水(ELGA VEOLIA)在1.5ml Eppendorf管中混合。
2.将0.5μl的10μM发夹寡核苷酸(5pmol，1当量)(SEQ ID NO：44，图15c) 加入到反应混合物中。
3.加入3’-O-修饰的-dTTP(2μl的100μM)和MnCl2(1μl的40mM)。
4.然后加入1.5μl的终止子IX DNA聚合酶(15U，New England BioLabs)。
5.将反应物在65℃温育20分钟。
6.将反应物通过加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)停止。
7.将反应物在聚丙烯酰胺凝胶(15％)上用TBE缓冲液分离，并通过 ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行可视化。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.在无菌1.5ml Eppendorf管中将5μl反应混合物加入5μl的TBE-尿素样品缓冲液(Novex)中，并使用加热ThermoMixer(Eppendorf)加热至95℃，持续5分钟。
2.然后将5μl样品加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳；260V，90Amp，室温下40分钟。
4.将凝胶通过使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
结果
DNA聚合酶在发夹构建体中掺入与其天然互补碱基相对的3’-O-修饰的dTTP。
第二步：切割
第二步描述了用内切核酸酶V在此特定情况下一步切割发夹模型(图16a)。
材料和方法
材料
1.实施例4中使用的寡核苷酸是内部设计的并由Sigma Aldrich合成(参见图 16c序列)。
2.使用无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)将寡核苷酸稀释至100μM的储备浓度。
方法
发夹寡核苷酸的切割反应使用以下步骤进行：
1.用移液管(Gilson)将43μl无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)转移到1.5ml Eppendorf管中。
2.然后将5μ1的10X Reaction
Figure GDA0003160615080001191
NEB(50mM的醋酸钾，20mM的Tris- 乙酸盐，10mM的醋酸镁，1mM的DTT，pH值7.9@25℃)加入到相同的 Eppendorf管中。
3.将具有5pmol量的1μl发夹寡核苷酸(SEQ ID NO：45，图16c)加入同一管中。
4.将1μl人核酸内切酶V(Endo V)NEB(30单位/μl)加入到同一管中。
5.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在37℃温育1小时。
6.通常在温育时间过去之后，将反应物通过酶促热失活(即65℃下20分钟) 终止。
使用下面概述的方案纯化样品混合物：
1.将500μl缓冲液PNI QIAGEN(5M氯化胍)加入到样品中并通过用移液管重悬浮温和混合。
2.将混合物转移到QIAquick旋转柱(QIAGEN)并以6000rpm离心1分钟。
3.离心后，弃去流过液，向旋转柱中加入750μl缓冲液PE QIAGEN(10mM Tris-HClpH7.5和80％乙醇)，并以6000rpm离心1分钟。
4.将流过液丢弃并将旋转柱以13000rpm离心另外的1分钟以除去残余的PE 缓冲液。
5.然后将旋转柱置于无菌的1.5ml Eppendorf管中。
6.对于DNA洗脱，将50μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)加入柱膜中心并在室温下静置1分钟。
7.然后将管以13000rpm离心1分钟。测量洗脱的DNA浓度并储存在-20℃下以备后用。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop One(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽 (blank)NanoDropOne。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加到基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.将5μl的DNA和TBE-尿素样品缓冲液(Novex)加入无菌1.5ml Eppendorf 管中，并使用加热ThermoMixer(Eppendorf)加热至95℃，持续2分钟。
2.然后DNA混合物加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳；260V，90Amp，室温下40分钟。
4.采用使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)进行检测和DNA在凝胶中的可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
结果和结论
来自实施例4的切割结果显示，使用内切核酸酶V在37℃下获得了显著高的消化的发夹DNA产率(图16b)。
第3步：连接
第三步描述了用DNA连接酶连接发夹模型。示意图如图17a所示。
材料和方法
材料
1.实施例4中使用的寡核苷酸是内部设计的并由Sigma Aldrich合成(参见图 17c序列)。
2.使用无菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)将寡核苷酸稀释至100μM的储备浓度。
方法
使用以下程序进行寡核苷酸的连接反应：
1.使用移液管(Gilson)将1μl(5pmols)TAMRA或任何荧光标记磷酸盐发夹寡核苷酸(SEQ ID NO：46)转移入1.5毫升Eppendorf管中。
2.然后将15μl(100pmol)含肌苷的发夹构建体(SEQ ID NO：47)加入到相同的管中，并通过用移液管重悬浮轻轻混合3秒。
3.将40μl的Blunt/TA DNA连接酶NEB(180单位/μl)加入同一管中。
4.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在室温温育20分钟。
5.通常在温育时间过去后，加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)终止反应。
6.使用上面的纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop One(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽(blank) NanoDropOne。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加到基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
5.将纯化的DNA在聚丙烯酰胺凝胶上运行，并按照上述步骤5-8中的方法可视化。没有引入条件或试剂的变化。
凝胶电泳和DNA可视化。
1.将5μl的DNA和TBE-尿素样品缓冲液(Novex)加入无菌1.5ml Eppendorf 管中，并使用加热ThermoMixer(Eppendorf)加热至95℃，持续2分钟。
2.然后DNA混合物加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM 硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳； 260V，90Amp，室温下40分钟。
4.采用使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)进行检测和DNA在凝胶中的可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
结果
在辅助链的存在下，在室温(24℃)下用发夹/TA DNA连接酶连接发夹寡核苷酸，得到高产率的连接产物。1分钟后连接的发夹寡核苷酸显示出高产率的连接DNA产物，比率为～85％。2分钟后连接的发夹寡核苷酸显示出高产率的连接DNA，比率为～85％。3分钟后连接的发夹寡核苷酸显示出高产率的连接 DNA产物，比率为～85％。4分钟后连接的发夹寡核苷酸显示高产率的连接 DNA产物，比率为～>85％(图17b)。
实施例5.版本2化学-双发夹模型的完整循环.
该实施例描述了使用4个步骤在双发夹模型上合成多核苷酸：从切口位点掺入3’-O-修饰的dNTP；在第一步在与天然互补核苷酸相对地发生的情况下切割、连接和去保护，该天然互补核苷酸位于支持链中与通用核苷酸相邻，在该特定情况下通用核苷酸为肌苷。发夹的一端用作附着锚。
该方法首先是通过DNA聚合酶的酶促掺入，然后肌苷切割、连接和去保护，将3'-O-保护的单核苷酸受控的添加到寡核苷酸中(图18a)。
材料和方法
材料
1.3’-O-修饰的dNTP根据博士论文中描述的方案内部合成：Jian Wu: MolecularEngineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing bySynthesis.Columbia University,2008。用于合成的方案还描述于专利申请公开：J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-IndependentEnzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1。
2.寡核苷酸是内部设计的并从Sigma-Aldrich获得(图18c)。以100μM的浓度制备储备溶液。
3.使用终止子IX DNA聚合酶，其由New England BioLabs工程化，具有增强的掺入3-O-修饰的dNTP的能力。
测试3'-O-叠氮甲基-dTTP的掺入：
3'-O-叠氮甲基-dTTP：
Figure GDA0003160615080001241
方法
1.将2μl的10x
Figure GDA0003160615080001242
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10 mM KCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001243
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)与12.5 μl无菌去离子水(ELGA VEOLIA)在1.5ml Eppendorf管中混合。
2.将2μl的10μM双发夹模型寡核苷酸(20pmol，1当量)(SEQ ID NO：48，图18c)加入到反应混合物中。
3.加入3’-O-修饰的-dTTP(2μl的100μM)和MnCl2(1μl的40mM)。
4.然后加入1.5μl的终止子IX DNA聚合酶(15U，New England BioLabs)。
5.将反应物在37℃温育10分钟。
6.从反应混合物取出等分试样(5μL)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
7.使用纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
8.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001251
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
9.将1μl人核酸内切酶V(Endo V)NEB(30单位/μl)加入到同一管中。
10.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在37℃温育1小时。
11.在温育时间过去之后，将反应物通过酶促热失活(即65℃下20分钟)终止。
12.将等分试样(5μL)从反应混合物取出，并在使用TBE缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶(15％)上分析，并用ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行可视化。
13.使用上面纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
14.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001261
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
15.将10μl用于连接的100μM链(1nmol)(SEQ ID NO：49，图18c)加入到反应混合物中。
16.将40μl的Blunt/TA DNA连接酶NEB(180单位/μl)加入到纯化的DNA样品中。
17.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在室温温育20分钟。
18.将在1M TRIS缓冲液pH 7.4中的40μL的500mM TCEP加入到反应混合物中，并使其在37℃反应10分钟。
19.通过用20μL的1x
Figure GDA0003160615080001262
缓冲液洗脱，使用QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.在无菌1.5ml Eppendorf管中将5μl反应混合物加入5μl的TBE-尿素样品缓冲液(Novex)中，并使用加热ThermoMixer(Eppendorf)加热至95℃，持续5分钟。
2.然后将5μl样品加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳； 260V，90Amp，室温下40分钟。
4.将凝胶通过使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop One(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽 (blank)NanoDropOne。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加到基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
5.将纯化的DNA在聚丙烯酰胺凝胶上运行，并按照章节2步骤5-8中的程序可视化。没有引入条件或试剂的变化。
使用下面概述的方案在每个步骤后纯化样品混合物：
1.将500μl缓冲液PNI QIAGEN(5M氯化胍)加入到样品中并通过用移液管重悬浮温和混合。
2.将混合物转移到QIAquick旋转柱(QIAGEN)并以6000rpm离心1分钟。
3.离心后，弃去流过液，向旋转柱中加入750μl缓冲液PE QIAGEN(10mM Tris-HClpH7.5和80％乙醇)，并以6000rpm离心1分钟。
4.将流过液丢弃并将旋转柱以13000rpm离心另外的1分钟以除去残余的 PE缓冲液。
5.然后将旋转柱置于无菌的1.5ml Eppendorf管中。
6.对于DNA洗脱，将20μl适当的反应缓冲液加入到柱膜中心，并在室温下静置1分钟。
7.然后将管以13000rpm离心1分钟。测量洗脱的DNA浓度并储存在-20℃下以备后用。
结果
DNA聚合酶在双发夹构建体中掺入与其天然互补碱基相对的3'-O-修饰的 dTTP(图18b)。
实施例6.版本2化学-使用辅助链的单发夹模型的完整循环.
该实施例描述了使用4个步骤在单发夹模型上合成多核苷酸：从切口位点掺入3’-O-修饰的dNTP；在第一步在与天然互补碱基相对地发生的情况下切割、连接和去保护。DNA合成在该过程中使用辅助链。
该方法首先是通过DNA聚合酶的酶促掺入，然后肌苷切割、连接和去保护，将3'-O-保护的单核苷酸受控的添加到寡核苷酸中(图19a)。
材料和方法
材料
1.3’-O-修饰的dNTP根据博士论文中描述的方案内部合成：Jian Wu: MolecularEngineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing bySynthesis.Columbia University,2008。用于合成的方案还描述于专利申请公开：J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-IndependentEnzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1。
2.寡核苷酸是内部设计的并从Sigma Aldrich获得(图19b)。以100μM的浓度制备储备溶液。
3.使用终止子IX DNA聚合酶，其由New England BioLabs工程化，具有增强的掺入3-O-修饰的dNTP的能力。
测试3'-O-叠氮甲基-dTTP的掺入：
3'-O-叠氮甲基-dTTP：
Figure GDA0003160615080001291
方法
1.将2μl的10x
Figure GDA0003160615080001292
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10 mM KCl，2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001293
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)与 12.5μl无菌去离子水(ELGA VEOLIA)在1.5ml Eppendorf管中混合。
2.将2μl的10μM单发夹模型寡核苷酸(20pmol，1当量)(SEQ ID NO：50，图19b)和辅助链(30pmol，1.5当量)(SEQ ID NO：51，图19b)加入到反应混合物中。
3.加入3’-O-修饰的-dTTP(2μl的100μM)和MnCl2(1μl的40mM)。
4.然后加入1.5μl的终止子IX DNA聚合酶(15U，New England BioLabs)。
5.将反应物在37℃温育10分钟。
6.从反应混合物取出等分试样(5μL)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
7.使用上面纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
8.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001301
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
9.将1μl人核酸内切酶V(Endo V)NEB(30单位/μl)加入到同一管中。
10.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在37℃温育1小时。
11.在温育时间过去之后，将反应物通过酶促热失活(即65℃下20分钟)终止。
12.将等分试样(5μL)从反应混合物取出，并在使用TBE缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶(15％)上分析，并用ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行可视化。
13.使用上面纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
14.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001302
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
15.将用于连接的10μl的100μM链(1nmol)(SEQ ID NO：52，图19b)和用于连接的10μl的100μM辅助链(1nmol)(SEQ ID NO：53，图19b)加入到反应混合物中。
16.将40μl的Blunt/TA DNA连接酶NEB(180单位/μl)加入同一管中。
17.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在室温温育20分钟。
18.将在1M TRIS缓冲液pH 7.4中的40μL的500mM TCEP加入到反应混合物中，并使其在37℃反应10分钟。
19.通过用20μL的1x NEB
Figure GDA0003160615080001311
缓冲液洗脱，使用QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物。
20.通常在温育时间过去后，加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)终止反应。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.在无菌1.5ml Eppendorf管中将5μl反应混合物加入5μl的TBE-尿素样品缓冲液(Novex)中，并使用加热ThermoMixer(Eppendorf)加热至95℃，持续5分钟。
2.然后将5μl样品加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳； 260V，90amp，室温下40分钟。
4.将凝胶通过使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop One(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽(blank) NanoDropOne。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加在基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
5.将纯化的DNA在聚丙烯酰胺凝胶上运行，并按照上述步骤5-8中的程序可视化。没有引入条件或试剂的变化。
使用下面概述的方案在每个步骤后纯化样品混合物：
1.将500μl缓冲液PNI QIAGEN(5M氯化胍)加入到样品中并通过用移液管重悬浮温和混合。
2.将混合物转移到QIAquick旋转柱(QIAGEN)并以6000rpm离心1分钟。
3.离心后，弃去流过液，向旋转柱中加入750μl缓冲液PE QIAGEN(10mM Tris-HClpH7.5和80％乙醇)，并以6000rpm离心1分钟。
4.将流过液丢弃并将旋转柱以13000rpm离心另外的1分钟以除去残余的 PE缓冲液。
5.然后将旋转柱置于无菌的1.5ml Eppendorf管中。
6.对于DNA洗脱，将20μl适当的反应缓冲液加入到柱膜中心，并在室温下静置1分钟。
7.然后将管以13000rpm离心1分钟。测量洗脱的DNA浓度并储存在-20℃下以备后用。
实施例7.版本3化学-双发夹模型的完整循环.
该实施例描述了使用4个步骤在双发夹构建体模型上合成多核苷酸：从切口位点掺入3’-O-修饰的dNTP；在第一步在与通用核苷酸相邻(在该特定情况下是苷酸)相对地发生的情况下切割、连接和去保护。
该方法首先是通过DNA聚合酶的酶促掺入，然后肌苷切割、连接和去保护，将3'-O-保护的单核苷酸受控的添加到寡核苷酸中(图20a)。
材料和方法
材料
1.3’-O-修饰的dNTP根据博士论文中描述的方案内部合成：Jian Wu: MolecularEngineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing bySynthesis.Columbia University,2008。用于合成的方案还描述于专利申请公开：J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-IndependentEnzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1。
2.寡核苷酸是内部设计的并从Sigma-Aldrich获得(图20b)。以100μM的浓度制备储备溶液。
3.其由New England BioLabs工程化的终止子IX DNA聚合酶具有增强的掺入3-O-修饰的dNTP的能力。
测试3'-O-叠氮甲基-dTTP的掺入：
3'-O-叠氮甲基-dTTP：
Figure GDA0003160615080001331
方法
1.将2μl的10x
Figure GDA0003160615080001332
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10 mM KCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001333
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)与12.5 μl无菌去离子水(ELGA VEOLIA)在1.5ml Eppendorf管中混合。
2.将2μl的10μM双发夹模型寡核苷酸(20pmol，1当量)(SEQ ID NO：54，图20b)加入到反应混合物中。
3.加入3’-O-修饰的-dTTP(2μl的100μM)和MnCl2(1μl的40mM)。
4.然后加入1.5μl的终止子IX DNA聚合酶(15U，New England BioLabs)。
5.将反应物在37℃温育10分钟。
6.从反应混合物取出等分试样(5μL)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
7.使用纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
8.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001341
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
9.将1μl人核酸内切酶V(Endo V)NEB(30单位/μl)加入到同一管中。
10.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在37℃温育1小时。
11.在温育时间过去之后，将反应物通过酶促热失活(即65℃下20分钟)终止。
12.将等分试样(5μL)从反应混合物取出，并在使用TBE缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶(15％)上分析，并用ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行可视化。
13.使用上面纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
14.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001342
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
15.将10μl用于连接的100μM链(1nmol)(SEQ ID NO：55，图20b)加入到反应混合物中。
16.将40μl的Blunt/TA DNA连接酶NEB(180单位/μl)加入同一管中。
17.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在室温温育20分钟。
18.将在1M TRIS缓冲液pH 7.4中的40μL的500mM TCEP加入到反应混合物中，并使其在37℃反应10分钟。
19.通过用20μL的1x NEB
Figure GDA0003160615080001351
缓冲液洗脱，使用QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物。
20.通常在温育时间过去后，加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)终止反应。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.在无菌1.5ml Eppendorf管中将5μl反应混合物加入5μl的TBE-尿素样品缓冲液(Novex)中，并使用加热ThermoMixer(Eppendorf)加热至95℃，持续5分钟。
2.然后将5μl样品加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并在以下条件下进行电泳； 260V，90amp，室温下40分钟。
4.将凝胶通过使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop One(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽(blank) NanoDropOne。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加在基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
5.将纯化的DNA在聚丙烯酰胺凝胶上运行，并按照章节2步骤5-8中的程序可视化。没有引入条件或试剂的变化。
使用下面概述的方案在每个步骤后纯化样品混合物：
1.将500μl缓冲液PNI QIAGEN(5M氯化胍)加入到样品中并通过用移液管重悬浮温和混合。
2.将混合物转移到QIAquick旋转柱(QIAGEN)并以6000rpm离心1分钟。
3.离心后，弃去流过液，向旋转柱中加入750μl缓冲液PE QIAGEN(10mM Tris-HClpH7.5和80％乙醇)，并以6000rpm离心1分钟。
4.将流过液丢弃并将旋转柱以13000rpm离心另外的1分钟以除去残余的 PE缓冲液。
5.然后将旋转柱置于无菌的1.5ml Eppendorf管中。
6.对于DNA洗脱，将20μl适当的反应缓冲液加入到柱膜中心，并在室温下静置1分钟。
7.然后将管以13000rpm离心1分钟。测量洗脱的DNA浓度并储存在-20℃下以备后用。
实施例8.版本2化学-双发夹模型的完整双循环实验.
该实施例描述了在双发夹模型上使用4个步骤合成多核苷酸的完整双循环实验：从切口位点掺入3'-O-修饰的dNTP；在第一步在与互补碱基相对地发生的情况下去保护、切割和连接。
该方法首先是通过DNA聚合酶的酶促掺入，然后脱保护、肌苷切割和连接，将3'-O-保护的单核苷酸受控地加入寡核苷酸，如图21a所示的第一个循环的反应示意图所示。图21b显示了第二循环的反应示意图。
材料和方法
材料
1.3’-O-修饰的dNTP根据博士论文中描述的方案内部合成：Jian Wu: MolecularEngineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing bySynthesis.Columbia University,2008。用于合成的方案还描述于专利申请公开：J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-IndependentEnzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1。
2.寡核苷酸是内部设计的并从Sigma-Aldrich获得(图21d)。以100μM的浓度制备储备溶液。
3.其由New England BioLabs工程化的终止子IX DNA聚合酶具有增强的掺入3’-O-修饰的dNTP的能力。
3’-O-叠氮甲基-dTTP和3'-O-叠氮基甲基-dCTP被用于掺入：
Figure GDA0003160615080001371
Figure GDA0003160615080001381
方法
第一循环：
1.将2μl的10x
Figure GDA0003160615080001382
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10 mM KCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001383
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)与 12.5μl无菌去离子水(ELGA VEOLIA)在1.5ml Eppendorf管中混合。
2.将2μl的10μM双发夹模型寡核苷酸(20pmol，1当量)(SEQ ID NO：56，图21d)加入到反应混合物中。
3.加入3’-O-修饰的-dTTP(2μl的100μM)和MnCl2(1μl的40mM)。
4.然后加入1.5μl的终止子IX DNA聚合酶(15U，New England BioLabs)。
5.将反应物在37℃温育10分钟。
6.从反应混合物取出等分试样(5μL)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
7.将在1M TRIS缓冲液pH 7.4中的40μL的500mM TCEP加入到反应混合物中，并使其在37℃反应10分钟。
8.使用纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
9.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001384
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
10.将1μl人核酸内切酶V(Endo V)NEB(30单位/μl)加入到同一管中。
11.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在37℃温育1小时。
12.在温育时间过去之后，将反应物通过酶促热失活(即65℃下20分钟)终止。
13.将等分试样(5μL)从反应混合物取出，并在使用TBE缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶(15％)上分析，并用ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行可视化。
14.使用QIAGEN核苷酸去除试剂盒，使用纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
15.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001391
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
16.将10μl用于连接的100μM链(1nmol)(SEQ ID NO：57，图21d)加入到反应混合物中。
17.将40μl的Blunt/TA DNA连接酶NEB(180单位/μl)加入同一管中。
18.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在室温温育20分钟。
19.使用纯化步骤1-5中概述的方案，通过链霉抗生物素蛋白磁珠试剂盒纯化反应混合物。
20.未连接的寡核苷酸用λ外切核酸酶消化。
21.使用QIAGEN核苷酸去除试剂盒，使用纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
22.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001401
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
第二循环：
23.加入3’-O-修饰的-dCTP(2μl的100μM)和MnCl2(1μl的40mM)。
24.然后加入1.5μl的终止子IX DNA聚合酶(15U，New England BioLabs)。
25.将反应物在37℃温育10分钟。
26.从反应混合物取出等分试样(5μL)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
27.将在1M TRIS缓冲液pH 7.4中的40μL的500mM TCEP加入到反应混合物中，并使其在37℃反应10分钟。
28.使用纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
29.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001402
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
30.将1μl人核酸内切酶V(Endo V)NEB(30单位/μl)加入到同一管中。
31.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在37℃温育1小时。
32.在温育时间过去之后，将反应物通过酶促热失活(即65℃下20分钟)终止。
33.将等分试样(5μL)从反应混合物取出，并在使用TBE缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶(15％)上分析，并用ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行可视化。
34.使用纯化步骤1-7中概述的方案纯化反应混合物。
35.通过20μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001411
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
36.将10μl用于连接的100μM链(1nmol)(SEQ ID NO：58，图21d)加入到反应混合物中。
37.将40μl的Blunt/TA DNA连接酶NEB(180单位/μl)加入同一管中。
38.然后将反应混合物通过用移液管重悬温和混合，13,000rpm下离心5秒钟并在室温温育10分钟。
39.在温育时间过去后，加入TBE-尿素样品缓冲液(Novex)终止反应。
凝胶电泳和DNA可视化：
1.在无菌1.5ml Eppendorf管中将5μl反应混合物加入5μl的TBE-尿素样品缓冲液(Novex)中，并使用加热ThermoMixer(Eppendorf)加热至95℃，持续5分钟。
2.然后将5μl样品加载到15％TBE-尿素凝胶1.0mm x 10孔(Invitrogen)的孔中，该凝胶含有预热的1X TBE缓冲液Thermo Scientific(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA)。
3.将X-cell sure lock模块(Novex)固定到位并通过应用以下条件下进行电泳；260V，90amp，室温下40分钟。
4.将凝胶通过使用Cy3 LEDS的ChemiDoc MP(BioRad)可视化。可视化和分析在Image lab 2.0平台上进行。
使用以下方案测定纯化的DNA浓度：
1.加入2μl灭菌蒸馏水(ELGA VEOLIA)到基座平衡NanoDrop One(ThermoScientific)。
2.平衡后，用不起毛的镜片清洁纸(Whatman)轻轻擦去水。
3.通过加入2μl缓冲液EB QIAGEN(10mM Tris.CL，pH8.5)掩蔽(blank) NanoDropOne。然后在掩蔽后重复步骤2。
4.通过将2μl样品加在基座上并在触摸屏上选择测量图标来测量DNA浓度。
使用下面概述的方案，通过QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化样品混合物：
1.将500μl缓冲液PNI QIAGEN(5M氯化胍)加入到样品中并通过用移液管重悬浮温和混合。
2.将混合物转移到QIAquick旋转柱(QIAGEN)并以6000rpm离心1分钟。
3.离心后，弃去流过液，向旋转柱中加入750μl缓冲液PE QIAGEN(10mM Tris-HClpH7.5和80％乙醇)，并以6000rpm离心1分钟。
4.将流过液丢弃并将旋转柱以13000rpm离心另外的1分钟以除去残余的 PE缓冲液。
5.然后将旋转柱置于无菌的1.5ml Eppendorf管中。
6.对于DNA洗脱，将20μl适当的反应缓冲液加入到柱膜中心，并在室温下静置1分钟。
7.然后将管以13000rpm离心1分钟。
在连接步骤后，使用链霉抗生物素蛋白磁珠通过下面概述的方案纯化样品混合物：
1.用200μl结合缓冲液(20mM TRIS，500mM NaCl，pH＝7.4)洗涤100μl链霉抗生物素蛋白磁珠(New England BioLabs)3次。
2.连接步骤之后反应混合物与10倍体积的结合缓冲液(20mM的TRIS， 500mM的NaCl，pH值＝7.4)混合，并用链霉抗生物素蛋白磁珠在20℃温育15 分钟。
3.用200μl结合缓冲液(20mM TRIS，500mM NaCl，pH＝7.4)洗涤链霉抗生物素蛋白磁珠3次。
4.用去离子水洗涤链霉抗生物素蛋白磁珠3次。
5.通过加热至95℃持续3分钟将寡核苷酸用40μl去离子水洗脱。
图21c中所示的结果证明了使用本发明的示例性方法的两个完整合成循环的性能。
实施例9.版本2化学-单发夹模型上的完整三循环实验。
该实施例描述了在双发夹模型上使用5个步骤合成多核苷酸的完整三循环实验：从切口位点掺入3'-O-修饰的dNTP；在第一步在与互补碱基相对地发生的情况下去保护、切割、连接和变性步骤。
该方法的示例性示意图概述显示在图26、27和28中。
该方法首先是通过DNA聚合酶的酶促掺入，然后肌苷去保护、切割、连接和辅助链的变性，将3'-O-保护的单核苷酸受控的添加到寡核苷酸中。图26显示了涉及酶掺入、去保护、切割、连接和变性步骤的第一个完整循环。在该实施例中，寡核苷酸由T核苷酸延伸。图27显示了第一个循环后的第二个完整循环，包括酶促掺入、去保护、切割、连接步骤和变性步骤。在该实施例中，寡核苷酸由T核苷酸延伸。图28显示了第二个循环后的第3个完整循环，包括酶促掺入、去保护、切割、连接和变性步骤。在该实施例中，寡核苷酸由T核苷酸延伸。
材料和方法
材料
1.3’-O-修饰的dNTP根据博士论文中描述的方案内部合成：Jian Wu: MolecularEngineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis,Columbia University,2008。用于合成的方案还描述于专利申请公开： J.WilliamEfcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-Independent Enzymes forPolydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1。
2.寡核苷酸是内部设计的并从Integrated DNA Technologies，Sigma-Aldrich获得(图29)。以100μM的浓度制备储备溶液。
3.使用终止子X DNA聚合酶，其由New England BioLabs工程化，具有增强的掺入3-O-修饰的dNTP的能力。可以替代地使用任何可以掺入修饰的dNTP 的DNA聚合酶或其他酶。
使用3'-O-叠氮甲基-dTTP掺入：
Figure GDA0003160615080001451
方法
第一循环：
1.将20μl的10x
Figure GDA0003160615080001452
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10 mM KCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001453
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)和 MnCl2溶液(10μl的40mM)与139μl无菌去离子水(ELGA VEOLIA)在1.5ml Eppendorf管中混合。
2.将20μl的100μM单发夹模型寡核苷酸(2nmol,1当量)(SEQ ID NO:59, 图29)加入到反应混合物中。
3.从反应混合物取出等分试样(4μl)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物和 0.5μl的Bst DNA聚合酶以及0.5μl的Sulfolobus DNA聚合酶IV并使其反应10 分钟。通过凝胶电泳分析反应。
4.加入3'-O-修饰的-dTTP(10μl，2mM)。
5.然后加入5μl的终止子IX DNA聚合酶(50U，New England BioLabs)。然而，可以使用任何可以掺入修饰的dNTP的DNA聚合酶或其他酶。
6.将反应物在37℃温育30分钟。
7.使用在纯化步骤66-72中概述的QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物。
8.通过200μl的TE缓冲液将DNA样品洗脱到干净的Eppendorf管中。
9.从反应混合物取出等分试样(4μl)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物 (4mM)和0.5μl的Bst DNA聚合酶以及0.5μl的Sulfolobus DNA聚合酶IV并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
10.将400μL的500mM TCEP加入到反应混合物中，并使其在37℃反应10 分钟。
11.使用在纯化步骤66-72中概述的QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物。
12.通过150μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001461
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
13.从反应混合物取出等分试样(4μl)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物 (4mM)和0.5μl的Bst DNA聚合酶以及0.5μl的Sulfolobus DNA聚合酶IV并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
14.将5μl的人核酸内切酶V(Endo V)NEB(30单位/μl)加入洗脱液并在37℃温育30分钟。可以使用任何合适的替代性内切核酸酶。
15.在温育时间过去之后，将反应物通过在65℃下酶促热失活20分钟终止。
16.将等分试样(5μl)取出反应混合物，并在聚丙烯酰胺凝胶上分析。
17.通过QIAGEN核苷酸去除试剂盒，使用纯化步骤66-72中概述的方案纯化反应混合物。
18.通过100μl的T3 DNA连接酶缓冲液(2x浓度)将DNA样品洗脱到干净的Eppendorf管中。
19.将20μl的100μM用于连接的肌苷链(2nmol)和20μl的100μM用于连接的辅助链(2nmol)(SEQ ID NO:60,51,图29)以及40μl水加入到反应混合物中。
20.将20μl的T3 DNA连接酶NEB(3000单位/μl)加入同一管中(这可包括任何DNA连接酶)并在室温下温育30分钟。
使用对于链霉抗生物素蛋白磁珠试剂盒的方案纯化反应混合物，包括纯化步骤73-78中概述的变性步骤。
21.使用在纯化步骤66-72中概述的QIAGEN核苷酸去除试剂盒的方案纯化反应混合物。
22.通过100μl的TE缓冲液将DNA样品洗脱到干净的Eppendorf管中。
第二循环：
23.加入15μl的10x
Figure GDA0003160615080001471
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4, 10mMKCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001472
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)、 MnCl2溶液(7.5μl，40mM)和19μl去离子水。
24.从反应混合物取出等分试样(4μl)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物 (4mM)和0.5μl的Bst DNA聚合酶以及0.5μl的Sulfolobus DNA聚合酶IV并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
25.加入3'-O-修饰的-dTTP(7.5μl，2mM)。
26.然后加入5μl的终止子IX DNA聚合酶(50U，New England BioLabs)。可以使用任何可以掺入修饰的dNTP的DNA聚合酶。
27.将反应物在37℃温育30分钟。
28.使用在纯化步骤66-72中概述的QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物。
29.通过100μl的TE缓冲液将DNA样品洗脱到干净的Eppendorf管中。
30.从反应混合物取出等分试样(4μl)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物 (4mM)和0.5μl的Bst DNA聚合酶以及0.5μl的Sulfolobus DNA聚合酶IV并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
31.将200μL的500mM TCEP加入到反应混合物中，并使其在37℃反应10 分钟。
32.使用在纯化步骤66-72中概述的QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物。
33.通过100μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001481
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐， 10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的 Eppendorf管中。
34.从反应混合物取出等分试样(4μl)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物 (4mM)和0.5μl的Bst DNA聚合酶以及0.5μl的Sulfolobus DNA聚合酶IV并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
35.将5μl的人核酸内切酶V(Endo V)NEB(30单位/μl)加入洗脱液并在37℃温育30分钟。可以使用任何合适的替代性内切核酸酶。
36.在温育时间过去之后，将反应物通过在65℃下酶促热失活20分钟终止。
37.将等分试样(5μl)取出反应混合物，并在聚丙烯酰胺凝胶上分析。
38.通过QIAGEN核苷酸去除试剂盒，使用纯化步骤66-72中概述的方案纯化反应混合物。
39.通过60μl的T3 DNA连接酶缓冲液(2x浓度)将DNA样品洗脱到干净的Eppendorf管中。
40.将20μl的100μM用于连接的肌苷链(2nmol)和20μl的100μM用于连接的辅助链(2nmol)(SEQ ID NO:60,51,图29)以及10μl去离子水加入到反应混合物中。
41.将10μl的T3 DNA连接酶NEB(3000单位/μl)加入同一管中并在室温下温育30分钟。可以使用任何合适的DNA连接酶。
42.使用对于链霉抗生物素蛋白磁珠试剂盒的方案纯化反应混合物，包括纯化步骤73-78中概述的变性步骤。
43.使用在纯化步骤66-72中概述的QIAGEN核苷酸去除试剂盒的方案纯化反应混合物。
44.通过46μl的TE缓冲液将DNA样品洗脱到干净的Eppendorf管中。
第三循环：
45.加入6μl的10x
Figure GDA0003160615080001491
缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10 mMKCl,2mM MgSO4,0.1％
Figure GDA0003160615080001492
X-100,pH 8.8,New England BioLabs)、 MnCl2溶液(3μl，40mM)。
46.从反应混合物取出等分试样(4μl)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物 (4mM)和0.5μl的Bst DNA聚合酶以及0.5μl的Sulfolobus DNA聚合酶IV并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
47.加入3'-O-修饰的dTTP(6μl，200μM)。
48.然后加入3μl的终止子IX DNA聚合酶(30U，New England BioLabs)。可以使用任何可以掺入修饰的dNTP的DNA聚合酶或其他合适的酶。
49.将反应物在37℃温育30分钟。
50.使用在纯化步骤66-72中概述的QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物。
51.通过50μl的TE缓冲液将DNA样品洗脱到干净的Eppendorf管中。
52.从反应混合物取出等分试样(4μl)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物 (4mM)和0.5μl的Bst DNA聚合酶以及0.5μl的Sulfolobus DNA聚合酶IV并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
53.将100μL的500mM TCEP加入到反应混合物中，并使其在37℃反应10 分钟。
54.使用在纯化步骤66-72中概述的QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物。
55.通过49μl的NEB反应缓冲液
Figure GDA0003160615080001501
(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，10mM 乙酸镁，1mM DTT，pH7.9，25℃下)将DNA样品洗脱到干净的Eppendorf管中。
56.从反应混合物取出等分试样(4μl)，以及加入0.5μl的天然dNTP混合物 (4mM)和0.5μl的Bst DNA聚合酶以及0.5μl的Sulfolobus DNA聚合酶IV并使其反应10分钟。通过凝胶电泳分析反应。
57.将5μl的人核酸内切酶V(Endo V)NEB(30单位/μl)加入洗脱液并在37℃温育30分钟。或者可以使用任何合适的内切核酸酶。
58.在温育时间过去之后，将反应物通过在65℃下酶促热失活20分钟终止。
59.将等分试样(5μl)取出反应混合物，并在聚丙烯酰胺凝胶上分析。
60.通过QIAGEN核苷酸去除试剂盒，使用纯化步骤66-72中概述的方案纯化反应混合物。
61.通过30μl的T3 DNA连接酶缓冲液(2x浓度)将DNA样品洗脱到干净的Eppendorf管中。
62.将10μl的100μM用于连接的肌苷链(2nmol)、10μl的100μM用于连接的辅助链(2nmol)(SEQ ID NO:60,51,图29)以及5μl水加入到反应混合物中。
63.将5μl的T3 DNA连接酶NEB(3000单位/μl)加入同一管中。(这可包括任何DNA连接酶)并在室温下温育30分钟。
64.通过凝胶电泳分析反应混合物。
使用下述方案在掺入、解封闭和切割步骤后通过QIAGEN核苷酸去除试剂盒纯化反应混合物：
65.将10体积的缓冲液PNI QIAGEN(5M氯化胍)加入到样品中并通过用移液管重悬浮温和混合。
66.将混合物转移到QIAquick旋转柱(QIAGEN)并以6000rpm离心1分钟。
67.离心后，弃去流过液，向旋转柱中加入750μl缓冲液PE QIAGEN(10mM Tris-HClpH7.5和80％乙醇)，并以6000rpm离心1分钟。
68.将流过液丢弃并将旋转柱以13000rpm离心另外的1分钟以除去残余的PE 缓冲液。
69.然后将旋转柱置于无菌的1.5ml Eppendorf管中。
70.对于DNA洗脱，将20-200μl适当的反应缓冲液加入到柱膜中心，并在室温下静置1分钟。
71.然后将管以13000rpm离心1分钟。
通过下面概述的方案，在使用涉及变性步骤的链霉抗生物素蛋白磁珠的连接步骤后进行反应的纯化：
72.用100μl结合缓冲液(20mM TRIS，500mM NaCl，pH＝7.4)洗涤200μl链霉抗生物素蛋白磁珠(New England BioLabs)3次。
73.连接步骤之后反应混合物与10倍体积的结合缓冲液(20mM的TRIS， 500mM的NaCl，pH值＝7.4)混合，并用链霉抗生物素蛋白磁珠在20℃使其温育15分钟。
74.用200μl结合缓冲液(20mM TRIS，500mM NaCl，pH＝7.4)洗涤链霉抗生物素蛋白磁珠3次。
75.为了除去辅助链，在放置于磁体上的200μl结合缓冲液(20mM TRIS,500 mMNaCl,pH＝7.4)中将链霉抗生物素蛋白磁珠加热至80℃，并将上清液迅速丢弃。
76.用去离子水洗涤链霉抗生物素蛋白磁珠3次。
77.通过加热至95℃持续3分钟将寡核苷酸用50-100μl去离子水洗脱。
结果和结论
图30描绘了显示对应于完整三循环实验的反应产物的凝胶，所述实验包括：掺入、解封闭、切割和连接步骤。所示结果证明了使用本发明的示例性方法的三个完整合成循环的性能。
实施例10.衍生化聚丙烯酰胺表面并随后固定分子。
该实施例描述了使用N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)在聚丙烯酰胺表面上呈现溴乙酰基，并且随后通过它们与溴乙酰基的共价偶联来表面固定硫醇化分子。
材料和方法
通过在丙酮、乙醇和水中依次超声处理，每次10分钟，并用氩气干燥，清洁玻璃显微镜载玻片和盖玻片。将清洁的盖玻片在聚苯乙烯培养皿中用三氯 (1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷在气相中硅烷化，在乙醇中超声处理两次并用Ar 干燥(下文‘氟化盖玻片’)。在玻璃显微镜载玻片上，将4％丙烯酰胺/N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(19：1)溶液与100μl的10％(w/v)过硫酸铵(APS)、10μl的四甲基乙二胺(TEMED)混合，用0、0.1、0.2和0.3％(w/v)的N-(5-溴乙酰胺基戊基) 丙烯酰胺(BRAPA)掺杂，并快速分配到4mm直径的橡胶垫圈中，随后用氟化盖玻片夹在中间，氟化面朝向丙烯酰胺溶液，并聚合10分钟。10分钟后，将表面浸入去离子水中并浸没总共4小时，在此期间小心地除去氟化盖玻片。聚合的聚丙烯酰胺表面用氩气干燥。
随后将聚丙烯酰胺表面暴露于磷酸钠缓冲液(10mM，pH 8)中的硫醇化聚乙二醇(1kDa)荧光素(FITC-PEG-SH)和作为阴性对照的羧化聚乙二醇(1kDa)荧光素 (FITC-PEG-COOH)1小时，然后依次用磷酸钠缓冲液(10mM，pH7)和含有 0.05％Tween20/0.5M NaCl的相同缓冲液洗涤，以除去非特异性吸附的硫醇化和羧化荧光团。随后通过ChemiDoc(Bio-Rad)在荧光素通道中对表面成像。
结果和结论
图31显示荧光信号，图32显示从聚丙烯酰胺凝胶表面测量的荧光，其中掺入不同量的BRAPA，其暴露于FITC-PEG-SH和FITC-PEG-COOH。荧光素的固定仅在掺有BRAPA并且仅有硫醇化荧光素的聚丙烯酰胺表面成功，对羧化荧光素的非特异性吸附接近于零。
与不含BRAPA(BRAPA 0％)的那些聚丙烯酰胺表面和含有BRAPA和羧化分子(FITC-PEG-COOH)的那些聚丙烯酰胺表面相比，含有(BRAPA 0.1、0.2和0.3％)和仅来自巯基化分子(FITC-PEG-SH)的聚丙烯酰胺表面获得了显著高的正荧光信号。结果表明，来自表面的溴乙酰基部分和来自荧光素标记分子的硫醇部分之间发生了特异性共价偶联。
结果表明，分子，例如包含用于本发明方法的支持链和合成链的分子，可以容易地固定在与本文所述的多核苷酸合成反应相容的表面基底上。
实施例11.发夹DNA寡聚体的表面固定和随后掺入荧光标记的脱氧核苷三磷酸。
本实施例描述：
(1)在薄的聚丙烯酰胺表面上呈现溴乙酰基的方法；
(2)随后通过硫代磷酸酯官能化的发夹DNA在有或没有接头下的共价偶联来固定发夹DNA；和
(3)将2'-脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)掺入发夹DNA中。
该方法几乎与任何类型的材料表面(例如金属、聚合物等)相容。
(1)：溴乙酰基官能化的薄聚丙烯酰胺表面的制备
材料和方法
首先在纯净的Decon 90(30分钟)、水(30分钟)、1M NaOH(15分钟)、水(30分钟)、0.1M HCl(15分钟)、水(30分钟)中通过超声处理清洁玻璃显微镜载玻片，最后用氩干燥。
首先通过将1g丙烯酰胺单体溶解在50ml水中制备2％(w/v)丙烯酰胺单体溶液。将丙烯酰胺单体溶液涡旋并在氩气中脱气15分钟。将N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(BRAPA，82.5mg)溶解在825μl的DMF中，并加入到丙烯酰胺单体溶液中并进一步涡旋。最后，将1ml 5％(w/v)过硫酸钾(KPS)和115μl纯四甲基乙二胺(TEMED)加入到丙烯酰胺溶液中，涡旋并将干净的玻璃显微镜载玻片暴露于该丙烯酰胺聚合混合物中90分钟。90分钟后，用去离子水洗涤表面并用氩气干燥。在这个实施例的下文中，这些表面将被称为“BRAPA改性表面”。作为阴性对照，通过排除向丙烯酰胺单体溶液中添加BRAPA溶液，也以与上述类似的方式制备不含BRAPA的聚丙烯酰胺表面。在这个实施例的下文中，这些表面将被称为“BRAPA对照表面”。
(2)：硫代磷酸酯官能化的发夹DNA在聚丙烯酰胺表面上的共价偶联
材料和方法
将具有4mm直径圆形开口的橡胶垫圈放置并固定在BRAPA改性表面和 BRAPA对照表面上。首先用磷酸钠缓冲液(10mM，pH 7)引发表面10分钟。随后除去缓冲液，并将表面暴露于5'-荧光标记的(Alexa 647)发夹DNA寡聚体，分别具有和不具有以1μM浓度用六种和单一硫代磷酸酯修饰的接头，并在黑暗中温育1小时。BRAPA改性表面也与具有和不具有接头但没有硫代磷酸酯作为对照的DNA寡聚体一起温育(在下文中称为“寡聚体对照表面”)。温育后，将表面用磷酸钠(100mM，pH7)冲洗，然后用Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris， 10mMEDTA，pH8)冲洗，最后用水冲洗。为了除去任何非特异性吸附的DNA 寡聚体，随后用含有1M氯化钠和0.05％(v/v)Tween20的水洗涤表面，用水洗涤并用氩气干燥。在ChemiDoc成像仪上在Alexa 647通道中扫描表面。
图33a显示了固定在不同样品上的没有接头的发夹DNA序列。图33b显示了固定在不同样品上的具有接头的发夹DNA序列。
结果
结果显示在图34和35中。图34显示源自发夹DNA寡聚体的荧光信号，其中有和没有接头固定在溴乙酰基官能化的聚丙烯酰胺表面上，但不是来自 BRAPA或寡聚物对照。
图35显示了在聚丙烯酰胺表面上DNA固定后测量的荧光强度。该图显示了从各种聚丙烯酰胺表面获得的表面荧光信号，并显示由于DNA在溴乙酰基官能化的聚丙烯酰胺表面上成功的共价固定，与BRAPA和寡聚物对照表面(如(2)中所述)相比，从固定在BRAPA改性表面上的发夹DNA寡聚体获得显著更高的信号。
结论
来自DNA的荧光信号仅突出地存在于掺有BRAPA的BRAPA改性表面，表明通过硫代磷酸酯官能团将DNA成功共价偶联到表面上。与没有接头的DNA相比，从有接头的DNA获得同源和更高的信号。
(3)：将三磷酸酯掺入具有接头的发夹DNA寡聚体中
材料和方法
将具有9mm直径的圆形开口的橡胶密封垫放在固定有具有接头的DNA寡聚体的BRAPA改性表面上，并用掺入缓冲液(50mM TRIS pH 8,1mM EDTA,6 mM MgSO4,0.05％tween20 and 2mM MnCl2)引发10分钟。随后将表面暴露于含有DNA聚合酶(0.5U/μl终止子XDNA聚合酶)和三磷酸盐(20μM Alexa488标记的dUTP)的掺入缓冲液中并温育1小时(此后在该实施例中称为“聚合酶表面”)。另外一组表面也暴露于没有终止子X DNA聚合酶的掺入缓冲液1小时作为阴性对照(在下文中称为“阴性表面”)。1小时后，将两种类型的样品在水中洗涤，随后暴露于含有1M氯化钠和0.05％(v/v)Tween20的水中，并再次用水洗涤。在Alexa647和Alexa 488通道中使用ChemiDoc测量来自表面的荧光信号，以监测发夹DNA(Alexa647)的存在和dUTP(Alexa 488)的掺入。
结果
图36显示在掺入Alexa 488标记的dUTP之前和之后从Alexa 647和Alexa 488 通道检测到的荧光信号。在掺入之前和之后来自Alexa 647的未改变的阳性信号表明表面固定的发夹DNA在掺入反应期间是稳定的，而来自Alexa 488的阳性信号仅在掺入反应后从聚合酶表面观察到，显示仅在聚合酶存在时成功掺入 dUTP。
图37显示了如(3)中所述在掺入Alexa 488标记的dUTP之前和之后从‘聚合酶表面'和‘阴性表面'获得的Alexa 647(发夹DNA)和Alexa 488(dUTP)通道中的测量荧光信号。由于成功掺入，在聚合酶表面的掺入反应后获得Alexa 488荧光信号的显著增加，而由于不存在聚合酶，来自阴性表面的信号在掺入反应后保持相同。在掺入反应后，Alexa 647通道中的荧光信号基本保持不变，表明表面上存在发夹DNA。荧光信号的轻微降低可能归因于第二轮曝光引起的光漂白效应。
结论
结果表明，包含用于本发明方法的支持链和合成链的分子，可以容易地固定在与本文所述的多核苷酸合成反应相容的表面基底上。结果进一步证明，这种分子可以接受新dNTP的掺入以延伸合成链，同时分子保持稳定并附着于基底。
实施例12.通过接头和硫代磷酸酯共价键连接固定于衍生化表面的发夹DNA寡聚 体的切割和连接。
该实施例描述了用接头与硫代磷酸酯官能化的发夹DNA的衍生化表面的共价偶联，然后是切割和连接反应。如实施例11所述进行基底制备和发夹DNA的偶联。
(1)：切割具有接头的固定的发夹DNA寡聚体
材料和方法
如实施例11中所述，将发夹DNA固定在表面BRAPA改性表面上。制备四组一式三份表面，包括用于切割和连接反应的所有实验对照。实验条件如图38a 所示。图38b显示固定在不同样品上的发夹DNA的序列。
在DNA固定步骤后，将具有9mm直径圆形开口的橡胶垫圈放置在所有表面上，所述表面用在5'末端用Alexa 647标记的DNA固定，并用1X NEBuffer 4 (50mM醋酸钾，20mMTris-乙酸盐，10mM乙酸镁，1mM DTT，pH7.9)引发10 分钟。注意，对于样品D，固定的发夹DNA不含肌苷，肌苷被鸟嘌呤取代。随后将所有样品暴露于含有1.5U/μl内切核酸酶V的NEBuffer 4(样品A、B和 D)或不含内切核酸酶V的NEBuffer 4(样品C)1小时。随后用1X T3DNA连接酶缓冲液(66mM Tris-HCl，10mM MgCl2,1mM ATP，7.5％PEG6000,1mM DTT，pH7.6)、含有1M氯化钠和0.05％(v/v)Tween20的1X T3 DNA连接酶缓冲液洗涤所有样品，再用1X T3 DNA连接酶缓冲液洗涤，并在Alexa 647通道中在ChemiDoc成像仪上扫描。
结果
图39显示了在切割反应之前和之后来自发夹DNA寡聚体的荧光信号。
图40显示了如上所述从DNA固定表面获得的在切割反应之前和之后测量的荧光信号。仅从样品A和B观察到成功的切割反应，而由于序列中没有内切核酸酶V(样品C)或肌苷(样品D)，样品C和D的荧光信号强度保持几乎相同。
从样品A和B中观察到荧光信号的显著降低是由于在内切核酸酶V存在下在 DNA链内的肌苷位点的成功切割反应。对于样品C和D，在DNA内没有内切核酸酶V和缺乏肌苷分别导致荧光信号保持与DNA固定后获得的初始信号几乎相同的水平。
(2)：连接反应
材料和方法
在如(1)中所述的切割反应后，将样品A和B(如图38a中所述)暴露于含有 MnCl2(2mM)、在5'末端用Alexa 647标记的肌苷链(16μM)和互补‘辅助'链 (16μM)(序列显示在下面的图41中)的1X T3 DNA连接酶缓冲液，用于样品A 用T3 DNA连接酶(250U/μl)，对于样品B，没有T3 DNA连接酶，作为阴性对照。将样品在各自的溶液中温育1小时。1小时后，将表面在水中洗涤，随后暴露于含有1M氯化钠和0.05％(v/v)Tween20的水中，并再次用水洗涤。在Alexa 647通道中使用ChemiDoc测量来自表面的荧光信号。图41显示了用于连接反应的含肌苷链和互补“辅助”链的序列。
结果
图42显示了与连接反应监测有关的结果。在连接反应之前和之后从Alexa 647 通道检测到荧光信号。连接后Alexa 647通道中荧光信号的增加仅从具有T3 DNA连接酶的样品A获得，而由于不存在T3 DNA连接酶，在样品B的连接反应后荧光信号保持在相同水平。
图43显示，由于成功连接，样品A的连接反应后Alexa 647荧光信号显著增加，其中信号水平恢复到如图40所示的DNA固定后和切割反应前的初始信号水平。由于不存在T3DNA连接酶，来自样品B的荧光信号在连接反应后保持相同。
结论
该实施例中的结果表明，包含用于本发明方法的支持链和合成链的分子，可以容易地固定在与本文所述的多核苷酸合成反应相容的表面基底上，并且可以在保持稳定以及附接于基底的同时进行切割和连接反应。
在上述实施例中，SEQ ID NO 1-67中所示的所有寡核苷酸在3'末端具有羟基。除了SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 35之外，SEQ ID NO 1-67中所示的所有寡核苷酸在5'末端缺少磷酸基团。
应理解，所公开的方法和产品的不同应用可以根据本领域的特定需要而定制。还应理解，本文所用的术语仅出于描述本发明的特定实施方案的目的，而不打算是限制性的。
除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。因此，例如，提及“连接多核苷酸”包括两种或更多种这样的多核苷酸，提及“支架多核苷酸”包括两种或更多种这样的支架多核苷酸等。
本文中所引用的所有公开、专利和专利申请特此通过引用以其全部内容并入。

Claims (98)

1.一种合成具有预定序列的双链多核苷酸的体外方法，所述方法包括进行合成循环，其中在每个循环中通过掺入预定序列的核苷酸延伸第一链，然后通过掺入核苷酸延伸与第一链杂交的第二链，从而与第一链的掺入的核苷酸形成核苷酸对；其中每个循环包括通过将预定序列的核苷酸与连接的可逆终止子基团结合，然后延伸第二链来延伸第一链；进一步，其中在每个循环中，将核苷酸掺入支架多核苷酸中，并且其中每个循环包括：
(1)提供支架多核苷酸；
(2)通过聚合酶的作用将预定序列的核苷酸掺入支架多核苷酸，所述核苷酸包括通过聚合酶防止进一步延伸的可逆终止子基团；
(3)在切割位点切割所述支架多核苷酸；
(4)将连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸，所述连接多核苷酸包含预定序列的核苷酸的配偶体核苷酸，其中在连接时，预定序列的核苷酸与配偶体核苷酸配对；和
(5)在步骤(4)之后，从预定序列的核苷酸中去除所述可逆终止子基团，或者在步骤(2)之后且在步骤(3)之前或在步骤(3)之后且在步骤(4)之前，从预定序列的核苷酸中去除所述可逆终止子基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)包括提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链包含引物链部分，并且所述支持链包含通用核苷酸；其中步骤(3)包括在切割位点切割支架多核苷酸，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定，其中切割包括切割支持链并除去通用核苷酸；并且其中在步骤(4)中，连接多核苷酸包含支持链，所述支持链包含通用核苷酸，所述通用核苷酸限定用于下一循环的切割位点，并且其中所述连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸的支持链。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：
(1)提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链包含通过单链断裂分开的引物链部分和辅助链部分，并且所述支持链包含通用核苷酸；
(2)通过聚合酶的作用掺入所述预定序列的第一核苷酸到合成链中，第一核苷酸包含通过聚合酶防止进一步延伸的可逆终止子基团；
(3)在切割位点切割支架多核苷酸，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定，其中切割包括切割支持链并除去通用核苷酸以在合成链中提供包含第一核苷酸的突出末端；
(4)将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸，所述连接多核苷酸包含支持链、辅助链和互补连接末端，所述连接末端包含在支持链中的通用核苷酸和突出了辅助链的第一核苷酸的配偶体核苷酸，以及在辅助链中的缺少磷酸基团的末端核苷酸，其中在连接支持链时，第一核苷酸与配偶体核苷酸配对，
(5)在步骤(4)之后且在步骤(6)之前，或在步骤(2)之后且在步骤(3)之前，或在步骤(3)之后且在步骤(4)之前，从第一核苷酸中除去所述可逆终止子基团；
(6)通过聚合酶的作用将预定的核苷酸序列的下一个核苷酸掺入支架多核苷酸的合成链中，所述下一个核苷酸包含通过聚合酶防止进一步延伸的可逆终止子基团；
(7)在切割位点切割支架多核苷酸，该位点由包含支持链中的通用核苷酸的序列限定，其中切割包括切割支持链并除去通用核苷酸以在合成链中提供包含所述下一个核苷酸的突出末端；
(8)将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸，所述连接多核苷酸包含支持链、辅助链和互补连接末端，所述连接末端包含在支持链中的通用核苷酸和突出了辅助链的下一个核苷酸的配偶体核苷酸，以及在辅助链中的缺少磷酸基团的末端核苷酸，其中在连接支持链时，所述下一个核苷酸与配偶体核苷酸配对；
(9)在步骤(8)之后且在步骤(10)之前，或在步骤(6)之后且在步骤(7)之前，或在步骤(7)之后且在步骤(8)之前，从所述下一个核苷酸中去除所述可逆终止子基团；和
(10)多次重复步骤6至9以提供具有预定核苷酸序列的双链多核苷酸。
4.根据权利要求2所述的方法，其中在给定合成循环中，通用核苷酸占据以下中的位置n：(a)步骤1和6中的支架多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，合成链中的位置在该循环中掺入时将被预定序列的核苷酸占据，和(b)步骤4和8中连接多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，当其在下一个合成循环中掺入时，该合成链中的位置将被预定序列的下一个核苷酸占据；其中位置n-1是支持链中相对于通用核苷酸在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上占据的位置的下一个核苷酸位置；并且其中支架多核苷酸的支持链在步骤3和7中在位置n和n-1之间切割。
5.根据权利要求2所述的方法，其中在给定合成循环中，通用核苷酸占据以下中的位置n+1：(a)步骤1和6中的支架多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，合成链中的位置在该循环中掺入时将被预定序列的核苷酸占据，和(b)步骤4和8中连接多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，当其在下一个合成循环中掺入时，该合成链中的位置将被预定序列的下一个核苷酸占据；其中位置n-1是支持链中相对于在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上的位置n的下一个核苷酸位置，并且其中位置n+1是支持链中相对于在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上的位置n的下一个核苷酸位置；并且其中支架多核苷酸的支持链在步骤3和7中在位置n和n-1之间切割。
6.根据权利要求2所述的方法，其中在给定合成循环中，通用核苷酸占据以下中的位置n：(a)步骤1和6中的支架多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，合成链中的位置在该循环中掺入时将被预定序列的核苷酸占据，和(b)步骤4和8中连接多核苷酸的支持链，其中位置n是支持链中的核苷酸位置，其与合成链中的位置相对，当其在下一个合成循环中掺入时，该合成链中的位置将被预定序列的下一个核苷酸占据；其中位置n-1是支持链中的相对于在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上被通用核苷酸占据的位置的下一个核苷酸位置，并且其中位置n-2是支持链中在向辅助链的远端/引物链的近端的方向上相对于位置n-1的下一个核苷酸位置；并且其中支架多核苷酸的支持链在步骤3和7中在位置n-1和n-2之间切割。
7.根据权利要求3所述的方法，其中:
a)在步骤(1)/(6)中，支持链中的通用核苷酸位于与单链断裂相邻的辅助链的末端核苷酸对面，并与其配对位置n；
b)在步骤(2)/(6)中，第一个/下一个核苷酸在与支持链中的通用核苷酸相对的位置-位置n，掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与通用核苷酸配对；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在通用核苷酸位置-位置n和支持链中在辅助链的远端/接近引物链的方向上通用核苷酸位置旁边的核苷酸位置n-1之间的位置处切割，其中切割在支架多核苷酸中产生单核苷酸突出端，所述支架多核苷酸包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；和
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的连接末端包含单核苷酸突出端，并且其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于与辅助链的末端核苷酸相对的位置n并与其配对；
ii.通用核苷酸位于支持链的末端核苷酸旁边；
iii.支持链的末端核苷酸位置n-1突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)/(6)的第一/下一个核苷酸的配偶体核苷酸。
8.根据权利要求3所述的方法，其中:
a)在步骤(1)中，支架链中提供支架多核苷酸，其核苷酸位置n是步骤(2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，并且支持链中的通用核苷酸在向辅助链的近端/引物链的远端的方向上位于配偶体核苷酸旁边位置n+1；
b)在步骤(2)/(6)中，第一/下一个核苷酸在与支持链中的配偶体核苷酸相对的位置-位置n，掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与配偶体核苷酸配对；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在第一核苷酸位置n和第二核苷酸位置n-1之间的位置处在辅助链的远端/引物链的近端的方向上从支持链中的通用核苷酸切割，其中切割去除通用核苷酸并在支架多核苷酸中产生单核苷酸突出端，其包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的互补连接末端包含单核苷酸突出端，并且其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于辅助链的倒数第二个核苷酸位置n+1的对面，并与其配对；
ii.所述通用核苷酸位于支持链的倒数第二个核苷酸旁边位置n；
iii.支持链的倒数第二个核苷酸位置n与辅助链的末端核苷酸配对，并且是下一个合成循环的步骤(6)中下一个核苷酸的配偶体核苷酸；和
iv.支持链的末端核苷酸位置n-1突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)的第一核苷酸的配偶体核苷酸，或者是当前合成循环的步骤(6)的新掺入核苷酸的配偶体核苷酸。
9.根据权利要求3所述的方法，其中:
a)在步骤(1)/(6)中，支架多核苷酸的支持链中的通用核苷酸位于与单链断裂相邻的辅助链的末端核苷酸对面，并与其配对位置n；
b)在步骤(2)/(6)中，第一个/下一个核苷酸在与支持链中的通用核苷酸相对的位置掺入合成链中，于是第一/下一个核苷酸与通用核苷酸配对；
c)在步骤(3)/(7)中，支持链在第一核苷酸位置n-1和第二核苷酸位置n-2之间的位置处在辅助链的远端/引物链的近端的方向上从支持链中的通用核苷酸切割，其中切割去除通用核苷酸并在支架多核苷酸中产生双核苷酸突出端，其包含突出于支持链的第一/下一个核苷酸；
d)在步骤(4)/(8)中，连接多核苷酸的互补连接末端包含双核苷酸突出端，并且其中：
i.支持链中的通用核苷酸位于与辅助链的末端核苷酸相对的位置n并与其配对；
ii.所述通用核苷酸位于支持链的倒数第二个核苷酸旁边；和
iii.支持链的倒数第二个核苷酸位置n-1突出于辅助链的末端核苷酸，并且是步骤(2)/(6)中第一/下一个核苷酸的配偶体核苷酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中与预定序列的第一个/下一个核苷酸配对的核苷酸是与第一个/下一个核苷酸互补的核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中核苷酸为天然互补的核苷酸。
12.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(1)和/或(6)包括提供包含合成链和与其杂交的支持链的支架多核苷酸，其中所述合成链没有辅助链。
13.根据权利要求3所述的方法，其中在任何一个或多个合成循环中，或在所有合成循环中，在将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸的步骤之后和在将预定核苷酸序列的核苷酸掺入支架多核苷酸的合成链的步骤之前，从支架多核苷酸中除去合成链的辅助链部分。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述合成链的辅助链部分通过以下方式从支架多核苷酸中除去：(i)将支架多核苷酸加热至80℃至95℃的温度并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，(ii)用尿素溶液处理支架多核苷酸并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，(iii)用甲酰胺或甲酰胺溶液处理支架多核苷酸并将辅助链部分与支架多核苷酸分离，或(iv)使支架多核苷酸与单链多核苷酸分子接触，所述单链多核苷酸分子包含与辅助链部分的序列互补的核苷酸序列区域，从而竞争性地抑制辅助链部分与支架多核苷酸的杂交。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述尿素溶液为8M尿素。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述甲酰胺或甲酰胺溶液为100％甲酰胺。
17.根据权利要求1所述的方法，其中每个切割步骤包括第一步，其包括去除通用核苷酸，从而形成无碱基位点，和第二步，其包括在所述无碱基位点切割支持链。
18.根据权利要求17所述的方法，其中第一步用核苷酸切除酶进行。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述核苷酸切除酶是3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述核苷酸切除酶是人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)。
21.根据权利要求17所述的方法，其中第二步用作为碱的化学品进行。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述碱是NaOH。
23.根据权利要求17所述的方法，其中第二步用具有无碱基位点切割活性的有机化学品进行。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述有机化学品是N,N'-二甲基乙二胺。
25.根据权利要求17所述的方法，其中第二步用具有无碱基位点切割酶活性的酶进行。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述酶是内切核酸酶VIII。
27.根据权利要求2所述的方法，其中所述切割步骤包括用酶切割所述支持链。
28.根据权利要求27所述的方法，其中是酶在与通用核苷酸相邻的核苷酸之后切割支持链，从而在包含第一/下一个核苷酸的合成链中产生突出端。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述酶是内切核酸酶V。
30.根据权利要求1所述的方法，其中合成的双链多核苷酸的两条链都是DNA链。
31.根据权利要求2所述的方法，其中合成链和支持链是DNA链。
32.根据权利要求30所述的方法，其中掺入的核苷酸是dNTP。
33.根据权利要求32所述的方法，其中掺入的核苷酸是包含可逆终止子基团的dNTP。
34.根据权利要求33所述的方法，其中包含可逆终止子基团的一个或多个掺入的核苷酸是3’-O-烯丙基-dNTP。
35.根据权利要求33所述的方法，其中包含可逆终止子基团的一个或多个掺入的核苷酸是3’-O-叠氮基甲基-dNTP。
36.根据权利要求1所述的方法，其中合成的双链多核苷酸的第一条链是DNA链，合成的双链多核苷酸的第二条链是RNA链。
37.根据权利要求2所述的方法，其中合成链是RNA链，支持链是DNA链。
38.根据权利要求37所述的方法，其中掺入的核苷酸是NTP。
39.根据权利要求38所述的方法，其中掺入的核苷酸是包含可逆终止子基团的NTP。
40.根据权利要求39所述的方法，其中包含可逆终止子基团的掺入核苷酸是3’-O-烯丙基-NTP。
41.根据权利要求39所述的方法，其中包含可逆终止子基团的掺入核苷酸是3’-O-叠氮基甲基-NTP。
42.根据权利要求1所述的方法，其中聚合酶是DNA聚合酶。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述聚合酶是修饰的DNA聚合酶，与未修饰的聚合酶相比，其具有增强的掺入包含可逆终止子基团的dNTP的能力。
44.根据权利要求42所述的方法，其中聚合酶是来自嗜热球菌种9°N的天然DNA聚合酶的变体。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述聚合酶是来自嗜热球菌种9°N-7的天然DNA聚合酶的变体。
46.根据权利要求1所述的方法，其中聚合酶是RNA聚合酶。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述RNA聚合酶是T3或T7 RNA聚合酶。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述RNA聚合酶是修饰的RNA聚合酶，与未修饰的聚合酶相比，其具有增强的掺入包含可逆终止子基团的NTP的能力。
49.根据权利要求1所述的方法，其中从第一个/下一个核苷酸去除可逆终止子基团的步骤用三(羧乙基)膦(TCEP)进行。
50.根据权利要求1所述的方法，其中将双链连接多核苷酸连接至切割的支架多核苷酸的步骤用连接酶进行。
51.根据权利要求50所述的方法，其中连接酶是T3 DNA连接酶或T4 DNA连接酶。
52.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(1)和/或(6)中，辅助链和与其杂交的支持链部分通过发夹环连接。
53.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)中，包含引物链部分的合成链和与其杂交的支持链部分通过发夹环连接。
54.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(1)和/或(6)中：
a)辅助链和与其杂交的支持链部分通过发夹环连接；和
b)包含引物链部分的合成链和与其杂交的支持链部分通过发夹环连接。
55.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个连接多核苷酸作为单个分子提供，所述单个分子包含在与突出端相对的末端连接支持链和辅助链的发夹环。
56.根据权利要求1所述的方法，其中每个合成循环的连接多核苷酸作为单个分子提供，每个单个分子包含在与突出端相对的末端连接支持链和辅助链的发夹环。
57.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)中，包含引物链部分合成链和与其杂交的支持链的部分被栓系在共同的表面上。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述引物链部分和与其杂交的支持链部分各自包含可切割的接头，其中接头可被切割以在合成后从表面分离双链多核苷酸。
59.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)中，合成链的引物链部分和与其杂交的支持链部分通过发夹环连接，并且其中发夹环连接至表面。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述发夹环通过可切割的接头栓系在表面上，其中所述接头可被切割以在合成后从表面分离双链多核苷酸。
61.根据权利要求58所述的方法，其中可切割的接头是UV可切割的接头。
62.根据权利要求57所述的方法，其中所述表面是微粒。
63.根据权利要求57所述的方法，其中所述表面是平表面。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述表面包含凝胶。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述表面包含聚丙烯酰胺表面。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述聚丙烯酰胺表面为2％的聚丙烯酰胺。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述聚丙烯酰胺表面与固体载体偶联。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述固体载体为玻璃。
69.根据权利要求57所述的方法，其中包含引物链部分和与其杂交的支持链部分的合成链通过一个或多个共价键连接到共同表面。
70.根据权利要求69所述的方法，其中一个或多个共价键在共同表面上的官能团和支架分子上的官能团之间形成，其中支架分子上的官能团是胺基、硫醇基、硫代磷酸酯基或硫代酰胺基。
71.根据权利要求70所述的方法，其中共同表面上的官能团是溴乙酰基。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述溴乙酰基在使用N-(5-溴乙酰基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)衍生的聚丙烯酰胺表面上提供。
73.根据权利要求1所述的方法，其中从预定序列的核苷酸中去除可逆终止子基团的步骤在切割步骤之前或在连接步骤之前进行。
74.根据权利要求1所述的方法，其中在微流体系统内以液滴进行合成循环。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述微流体系统是电润湿系统。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述微流体系统是电介质上电润湿系统(EWOD)。
77.根据权利要求1所述的方法，其中在合成之后，分离双链多核苷酸的链以提供具有预定序列的单链多核苷酸。
78.根据权利要求1所述的方法，其中在合成后，扩增双链多核苷酸或其区域。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述双链多核苷酸或其区域通过PCR扩增。
80.一种组装具有预定序列的多核苷酸的方法，所述方法包括进行前述权利要求任一项所述的方法以合成具有预定序列的第一多核苷酸和具有预定序列的一种或多种另外的多核苷酸并将所述第一多核苷酸和一种或多种另外的多核苷酸连接在一起。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述一个或多个另外的多核苷酸是双链的。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述一个或多个另外的多核苷酸是单链的。
83.根据权利要求80所述的方法，其中将第一多核苷酸和所述一种或多种另外的多核苷酸切割以产生相容的末端并通过连接将其连结在一起。
84.根据权利要求83所述的方法，其中第一多核苷酸和所述一种或多种另外的多核苷酸在切割位点被限制酶切割。
85.根据权利要求76所述的方法，其中所述合成和/或组装步骤在微流体系统内以液滴进行。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述组装步骤包括提供包含具有预定序列的第一合成多核苷酸的第一液滴和包含另外的一种或多种具有预定序列的合成多核苷酸的第二液滴，其中使所述液滴彼此接触并且其中将合成多核苷酸连接在一起，从而组装包含第一核苷酸和另外的一种或多种多核苷酸的多核苷酸。
87.根据权利要求86所述的方法，其中合成步骤通过提供多个液滴来进行，每个液滴包含对应于合成循环步骤的反应试剂，并且根据合成循环的步骤将液滴依次递送到支架多核苷酸。
88.根据权利要求87所述的方法，其中在递送液滴之后并且在递送下一个液滴之前，进行洗涤步骤以除去过量的反应试剂。
89.根据权利要求87所述的方法，其中所述微流体系统是电润湿系统。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述微流体系统是电介质上电润湿系统(EWOD)。
91.根据权利要求87所述的方法，其中合成和组装步骤在同一系统中进行。
92.用于实施权利要求1-85和权利要求87-91中任一项的方法的多核苷酸合成系统，其包含(a)反应区域阵列，其中每个反应区域包含至少一种支架多核苷酸；(b)将反应试剂输送到反应区域的装置。
93.根据权利要求92所述的多核苷酸合成系统，其中所述多核苷酸合成系统还包括(c)从支架多核苷酸切割合成的双链多核苷酸的装置。
94.根据权利要求92所述的系统，还包括用于以液滴形式提供反应试剂的装置和用于根据合成循环将液滴输送到支架多核苷酸的装置。
95.一种与权利要求92至94中的任一项所述的系统一起使用并用于实施根据权利要求1-84中任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包含对应于合成循环的步骤的反应试剂体积。
96.一种制备多核苷酸微阵列的方法，其中所述微阵列包含多个反应区域，每个区域包含一个或多个具有预定序列的多核苷酸，所述方法包括：
a)提供包含多个反应区域的表面，每个区域包含一个或多个双链锚或支架多核苷酸，和
b)根据权利要求1至76中任一项所述的方法在每个反应区域进行合成循环，从而在每个区域合成一种或多种具有预定序列的双链多核苷酸。
97.根据权利要求96所述的方法，其中在合成后，分离双链多核苷酸的链以提供微阵列，其中每个区域包含一个或多个具有预定序列的单链多核苷酸。
98.一种核苷酸分子构建体，其包含具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：64中任一项限定的序列的多核苷酸分子。
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