KR20190126776A - 폴리뉴클레오티드 분자의 합성을 위한 방법 및 시약 - Google Patents

폴리뉴클레오티드 분자의 합성을 위한 방법 및 시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소정의 뉴클레오티드 서열에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 합성하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 합성 후 합성 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법뿐만 아니라, 합성 및/또는 어셈블리 방법을 수행하기 위한 시스템 및 키트에 관한 것이다.

Description

폴리뉴클레오티드 분자를 합성하기 위한 방법 및 시약
본 발명은 소정의 뉴클레오티드 서열에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 합성하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 합성 후 합성 폴리뉴클레오티드의 어셈블리(assembly) 방법뿐만 아니라, 합성 및/또는 어셈블리 방법을 수행하기 위한 시스템 및 키트에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드 분자, 특히 DNA의 합성 및 어셈블리를 위한 2가지 주요 방법이 현재 존재한다.
포스포라미디트(phosphoramidite) 화학은, 단계적 공정을 통해 화학적으로 활성화된 T, C, A 또는 G의 단량체를 약 100/150개 염기 길이의 올리고뉴클레오티드로 어셈블리하는 합성 접근법이다. 화학 반응 단계는 고도로 민감하며, 조건은 완전 무수(물의 완전한 부재), 수성 산화 및 산성 조건 사이에서 교대로 일어난다(문헌[Roy and Caruthers, Molecules, 2013, 18, 14268-14284] 참조). 이전 반응 단계로부터의 시약이 완전히 제거되지 않는 경우, 이는 이후의 합성 단계에 유해할 수 있다. 따라서, 이러한 합성 방법은 약 100개 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드의 생산에 제한된다.
폴리머라아제 합성 접근법은 T, C, A 및 G 트리포스페이트를 사용하여 DNA 주형에 상보적 가닥을 합성하기 위해 폴리머라아제를 사용한다. 반응 조건은 수성이고 온건하며, 이러한 접근법은 수 천개 염기 길이의 DNA 폴리뉴클레오티드를 합성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법의 주요 단점은, 단일 및 이중 가닥 DNA가 이러한 방법에 의해 새롭게(de novo) 합성될 수 없으며, 카피(copy)가 만들어지는 DNA 주형을 필요로 한다는 점이다(문헌[Kosuri and Church, Nature Methods, 2014, 11, 499-507] 참조).
따라서, 이전 방법은 카피된 기존 주형 분자의 도움 없이 새로운 이중 가닥 DNA를 합성하는 데 사용될 수 없다.
본 발명자들은, 기존 주형 분자를 카피할 필요 없이 단계적 방식으로 단일 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 새롭게 합성할 수 있는 새로운 방법론을 개발하였다. 이러한 방법은 또한 포스포라미디트 화학 기술과 관련된 극한 조건을 피하고, 대조적으로 대략 중성 pH의 온건한 수성 조건 하에서 수행된다. 이러한 방법은 또한 완전 게놈에 대하여 100량체(mer) 초과의 뉴클레오티드 길이를 이용하는 현재 합성 방법에 대해 잠재적인 108 배 개선을 갖는 단일 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 새로운 합성을 가능하게 하며, 이는 합성 생물학에서의 광범위한 응용 가능성을 제공한다.
본 발명은, 각 사이클에서, 제1 폴리뉴클레오티드 가닥이 소정의 서열(predefined sequence)의 뉴클레오티드의 혼입에 의해 연장된 후, 제1 가닥에 하이브리드화된 제2 폴리뉴클레오티드 가닥이 뉴클레오티드의 혼입에 의해 연장되어 제1 가닥의 혼입된 뉴클레오티드와 뉴클레오티드 쌍을 형성하는 합성의 사이클을 수행하는 것을 포함하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관내 합성 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 DNA의 합성을 위한 것이다.
본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에서, 상기 방법은 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 합성 후, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 중 하나의 가닥이 제거되거나, 카피 및/또는 증폭되어 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 제공하는, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 합성을 제공할 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에서, 상기 방법은 이중 가닥 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 합성을 제공한다. 따라서, 본 발명의 임의의 방법을 사용하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 합성에 대한 본원에서의 모든 언급은, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 합성에 준용된다.
본 발명의 방법에서, 각 사이클은 소정의 서열의 뉴클레오티드를 부착된 가역적 차단기(reversible blocking group)와 함께 혼입시킴으로써 제1 가닥을 연장시킨 후, 제2 가닥이 연장되기 전 또는 후 가역적 차단기를 제거하여 제2 가닥을 연장시키는 것을 포함할 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 각 사이클에서, 뉴클레오티드는 스캐폴드(scaffold) 폴리뉴클레오티드에 혼입될 수 있다.
본 발명은, 각 사이클이 하기와 같은 단계를 포함하는, 본원에서 상기에 기재된 바와 같은 방법을 제공한다:
(1) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
(2) 폴리머라아제에 의한 추가 연장을 방지하는 가역적 종결자기(reversible terminator group)를 포함하는 소정의 서열의 뉴클레오티드를, 폴리머라아제의 작용에 의해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입시키는 단계;
(3) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단 부위에서 절단하는 단계;
(4) 단계 (2)의 소정의 서열의 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드를 포함하는 라이게이션(ligation) 폴리뉴클레오티드를, 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계로서, 라이게이션 시, 소정의 서열의 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루는, 단계; 및
(5) 단계 (2)의 소정의 서열의 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 단계.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된(hybridized) 지지 가닥(support strand)을 포함하는 것으로 제공될 수 있으며, 여기서 합성 가닥은 프라이머(primer) 가닥 부분 및 헬퍼(helper) 가닥 부분을 포함한다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 헬퍼 가닥 부분은, 소정의 서열의 뉴클레오티드를 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입시키는 임의의 하나, 하나 이상 또는 모든 단계 전에, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거될 수 있다.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 상기와 같은 방법에서, 합성 가닥은 제1 가닥일 수 있고, 지지 가닥은 제2 가닥일 수 있다.
임의의 상기와 같은 방법에서, 지지 가닥은 지지 가닥에 라이게이션 폴리뉴클레오티드를 라이게이션함으로써 연장될 수 있으며, 합성의 각 사이클에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 해당 사이클에서 제1 가닥에 혼입된 소정의 뉴클레오티드와 뉴클레오티드 쌍을 형성하는 뉴클레오티드를 포함한다.
라이게이션 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 바람직하게는, 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이다.
라이게이션 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥인 방법에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 지지 가닥 및 헬퍼 가닥을 포함할 수 있다. 헬퍼 가닥은 다음 합성 사이클에서 소정의 서열의 뉴클레오티드를 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입시키는 단계 전에 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거될 수 있으며, 이러한 방법에서 헬퍼 가닥은 라이게이션 단계 후 제거된다.
본 발명은, 단계 (1)이 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하며, 합성 가닥은 프라이머 가닥 부분을 포함하고, 지지 가닥은 범용(universal) 뉴클레오티드를 포함하며; 단계 (3)이 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단하는 단계를 포함하며, 여기서 절단이 지지 가닥을 절단하고, 범용 뉴클레오티드를 제거하는 것을 포함하며; 단계 (4)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드가 다음 사이클에서 사용하기 위한 절단 부위를 한정하는/이에 기여하는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 지지 가닥을 포함하고, 라이게이션 폴리뉴클레오티드가 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에 라이게이션되는, 상기 기재된 바와 같은 방법을 제공한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 방법을 제공한다:
(1) 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 합성 가닥은 단일 가닥 절단부(single-strand break)에 의해 분리된 프라이머 가닥 부분과 헬퍼 가닥 부분을 포함하고, 지지 가닥은 범용 뉴클레오티드를 포함하는, 단계;
(2) 폴리머라아제에 의한 추가 연장을 방지하는 가역적 종결자기를 포함하는 소정의 서열의 제1 뉴클레오티드를, 폴리머라아제의 작용에 의해 합성 가닥에 혼입시키는 단계;
(3) 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단하는 단계로서, 여기서 절단은 합성 가닥에 제1 뉴클레오티드를 포함하는 돌출 말단(overhanging end)을 제공하기 위해 지지 가닥을 절단하고, 범용 뉴클레오티드를 제거하는 것을 포함하는, 단계;
(4) 지지 가닥, 헬퍼 가닥 및 상보적 라이게이션 말단을 포함하는 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드를, 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계로서, 여기서 상기 라이게이션 말단은 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드 및 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드(헬퍼 가닥이 돌출해 있음)를 포함하고, 헬퍼 가닥에 포스페이트기가 결여된 말단 뉴클레오티드를 포함하며, 라이게이션 뉴클레오티드의 지지 가닥과 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 라이게이션 시, 제1 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루는, 단계;
(5) 제1 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 단계;
(6) 폴리머라아제에 의한 추가 연장을 방지하는 가역적 종결자기를 포함하는 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드를, 폴리머라아제의 작용에 의해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥에 혼입시키는 단계;
(7) 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단하는 단계로서, 여기서 절단은 다음 뉴클레오티드를 포함하는 돌출 말단을 합성 가닥에 제공하기 위해 지지 가닥을 절단하고, 범용 뉴클레오티드를 제거하는 것을 포함하는, 단계;
(8) 지지 가닥, 헬퍼 가닥 및 상보적 라이게이션 말단을 포함하는 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드를, 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계로서, 여기서 상기 라이게이션 말단은 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드 및 헬퍼 가닥이 돌출해 있는 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드를 포함하고, 헬퍼 가닥에 포스페이트기가 결여된 말단 뉴클레오티드를 포함하며, 라이게이션 뉴클레오티드의 지지 가닥과 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 라이게이션 시, 다음 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루는, 단계;
(9) 다음 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 단계; 및
(10) 소정의 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해, 단계 (6) 내지 단계 (9)를 여러 번 반복하는 단계.
임의의 상기와 같은 방법에서, 주어진 합성 사이클에서, 범용 뉴클레오티드는, (a) 단계 (1) 및 단계 (6)에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n을 점유하고, 여기서, 위치 n은 해당 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고; (b) 단계 (4) 및 단계 (8)에서 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n을 점유하고, 여기서, 위치 n은 다음 합성 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 다음 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고, 위치 n-1은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대한 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치이고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥은 단계 (3) 및 단계 (7)에서 위치 n과 n-1 사이에서 절단된다.
대안적으로, 임의의 상기와 같은 방법에서, 주어진 합성 사이클에서, 범용 뉴클레오티드는, (a) 단계 (1) 및 단계 (6)에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n+1을 점유하고, 여기서, 위치 n은 해당 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고; (b) 단계 (4) 및 단계 (8)에서 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n+1을 점유하고, 여기서, 위치 n은 다음 합성 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 다음 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고; 위치 n-1은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 위치 n에 대한 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치이고; 위치 n+1은 헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로 위치 n에 대한 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치이고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥은 단계 (3) 및 단계 (7)에서 위치 n과 n-1 사이에서 절단된다.
또한 대안적으로, 임의의 상기와 같은 방법에서, 주어진 합성 사이클에서, 범용 뉴클레오티드는, (a) 단계 (1) 및 단계 (6)에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n을 점유하고, 여기서, 위치 n은 해당 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고; (b) 단계 (4) 및 단계 (8)에서 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n을 점유하고, 여기서, 위치 n은 다음 합성 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 다음 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고; 위치 n-1은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대한 지지 가닥의 다음 뉴클레오티드의 위치이고; 위치 n-2는 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 위치 n-1에 대한 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치이고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥은 단계 (3) 및 단계 (7)에서 위치 n-1과 n-2 사이에서 절단된다.
범용 뉴클레오티드가 위치 n을 점유하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 위치 n과 n-1 사이에서 절단되는 본원에서 상기에 기재된 임의의 상기와 같은 방법에서, 방법의 수행은 하기를 포함할 수 있다:
a) 단계 (1)/(6)에서, 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 단일 가닥 절단부에 인접한 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이루며(위치 n);
b) 단계 (2)/(6)에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드의 반대편 위치(위치 n)에서 합성 가닥에 혼입되고, 그 결과 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드 대신 범용 뉴클레오티드와 쌍을 이루며;
c) 단계 (3)/(7)에서, 지지 가닥은 범용 뉴클레오티드 위치(위치 n)와 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드 위치 다음의 뉴클레오티드(헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로, 위치 n-1) 사이의 위치에서 절단되고, 여기서 절단은 지지 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 단일 뉴클레오티드 돌출부를 생성하며;
d) 단계 (4)/(8)에서, 상기 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션 말단은 단일 뉴클레오티드 돌출부를 포함하고, 여기서
i. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이루며;
ii. 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드 다음에 위치하고(위치 n);
iii. 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드(위치 n-1)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있고, 단계 (2)/(6)의 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드임.
범용 뉴클레오티드가 위치 n+1을 점유하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 위치 n과 n-1 사이에서 절단되는 본원에서 상기에 기재된 임의의 상기와 같은 방법에서, 방법의 수행은 하기를 포함할 수 있다:
a) 단계 (1)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 지지 가닥에 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 뉴클레오티드(위치 n)가 제공되고, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드와 쌍을 이루며, 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 파트너 뉴클레오티드 다음에 위치하고(헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로, 위치 n+1);
b) 단계 (2)/(6)에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 지지 가닥의 파트너 뉴클레오티드의 반대편 위치(위치 n)에서 합성 가닥에 혼입되고, 그 결과 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드 대신 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루며;
c) 단계 (3)/(7)에서, 지지 가닥이 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드로부터 제1 뉴클레오티드(위치 n)와 제2 뉴클레오티드(위치 n-1) 사이에서 절단되고, 여기서 절단은 범용 뉴클레오티드를 제거하고, 지지 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 단일 뉴클레오티드 돌출부를 생성하며;
d) 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단은 단일 뉴클레오티드 돌출부를 포함하고, 여기서
i. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고(위치 n+1), 그와 쌍을 이루며;
ii. 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드 다음에 위치하고(위치 n);
iii. 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드와 쌍을 이루고, 다음 합성 사이클의 단계 (6)에서 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이며;
iv. 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드(위치 n-1)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있고, 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이거나, 또는 현재 합성 사이클의 단계 (6)의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드임.
범용 뉴클레오티드가 위치 n을 점유하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 위치 n-1과 n-2 사이에서 절단되는 본원에서 상기에 기재된 임의의 상기와 같은 방법에서, 방법의 수행은 하기를 포함할 수 있다:
a) 단계 (1)/(6)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 단일 가닥 절단부에 인접한 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이루며(위치 n);
b) 단계 (2)/(6)에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드의 반대편 위치에서 합성 가닥에 혼입되고, 그 결과 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드 대신 범용 뉴클레오티드와 쌍을 이루며;
c) 단계 (3)/(7)에서, 지지 가닥은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드로부터 제1 뉴클레오티드(위치 n-1)와 제2 뉴클레오티드(위치 n-2) 사이의 위치에서 절단되고, 여기서 절단은 범용 뉴클레오티드를 제거하고, 지지 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 이중 뉴클레오티드 돌출부를 생성하며, 여기서 합성 가닥의 말단 뉴클레오티드는 혼입된 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드이고;
d) 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단은 이중 뉴클레오티드 돌출부를 포함하고, 여기서
i. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고(위치 n), 그와 쌍을 이루며;
ii. 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드 다음에 위치하고(위치 n-1);
iii. 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드(위치 n-1)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드(위치 n-2)가 돌출해 있고, 단계 (2)/(6)에서 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드임.
대안적인 구현예에서, 본 발명은 본원에서 상기에 기재된 바와 같은 방법으로서, 다음과 같이 구성된 방법을 제공한다:
a) 단계 (1)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 지지 가닥에 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 뉴클레오티드(위치 n)가 제공되고, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+2에 위치하고;
b) 단계 (2)/(6)에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 지지 가닥의 파트너 뉴클레오티드의 반대편 위치(위치 n)에서 합성 가닥에 혼입되고, 그 결과 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루며;
c) 단계 (3)/(7)에서, 지지 가닥은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드로부터 제2 뉴클레오티드(위치 n)와 제3 뉴클레오티드(위치 n-1) 사이의 위치에서 절단되고, 여기서 절단은 범용 뉴클레오티드를 제거하고, 지지 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 단일 뉴클레오티드 돌출부를 생성하며;
d) 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단은 단일 뉴클레오티드 돌출부를 포함하고, 여기서
i. 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥에서의 뉴클레오티드 반대편인 지지 가닥에서 위치 n+2에 위치하고, 그와 쌍을 이루며;
ii. 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드와 쌍을 이루고, 다음 합성 사이클에서 단계 (6)의 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드(위치 n)이며;
iii. 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드(위치 n-1)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있고, 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이거나, 또는 현재 합성 사이클의 단계 (6)의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드임.
바로 상기 기재된 바와 같은 방법의 변형에서, 단계 (1)에서, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+3에 위치하고, 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에는 위치 n+3에 위치한 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 제공된다. 대안적으로, 단계 (1)에서, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+3+x에 위치하고, 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에는 위치 n+3+x(여기서, x는 1 내지 10 또는 그 이상의 정수임)에 위치한 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 제공된다.
추가의 대안적인 구현예에서, 본 발명은 본원에서 상기에 기재된 바와 같은 방법으로서, 다음과 같이 구성된 방법을 제공한다:
a) 단계 (1)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 지지 가닥에 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 뉴클레오티드(위치 n)가 제공되고, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+1에 위치하며;
b) 단계 (2)/(6)에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 지지 가닥의 파트너 뉴클레오티드의 반대편 위치(위치 n)에서 합성 가닥에 혼입되고, 그 결과 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루며;
c) 단계 (3)/(7)에서, 지지 가닥은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드로부터 제2 뉴클레오티드(위치 n-1)와 제3 뉴클레오티드(위치 n-2) 사이의 위치에서 절단되고, 여기서 절단은 범용 뉴클레오티드를 제거하고, 지지 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 이중 뉴클레오티드 돌출부를 생성하며;
d) 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단은 이중 뉴클레오티드 돌출부를 포함하고, 여기서
i. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥에서 뉴클레오티드 반대편인 위치 n+1에 위치하고, 그와 쌍을 이루며;
ii. 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드(위치 n-1)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있고, 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이거나, 또는 현재 합성 사이클의 단계 (6)의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이며;
iii. 지지 가닥의 위치 n에 있는 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드와 쌍을 이루고, 다음 합성 사이클의 단계 (6)에서 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드임.
바로 상기 기재된 바와 같은 방법의 변형에서, 단계 (1)에서, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+2에 위치하고, 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에는 위치 n+2에 위치한 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 제공된다. 대안적으로, 단계 (1)에서, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+2+x에 위치하고, 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에는 위치 n+2+x(여기서, x는 1 내지 10 또는 그 이상의 정수임)에 위치한 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 제공된다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 소정의 서열의 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 뉴클레오티드는, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드와 상보적인, 바람직하게는 자연적으로 상보적인 뉴클레오티드일 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 단계 (1)/(6)은 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 합성 가닥은 헬퍼 가닥 부분 없이 제공된다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 임의의 하나 이상의 합성 사이클에서, 또는 모든 합성 사이클에서, 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드를 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계 후 및 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드를 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥에 혼입하는 단계 전, 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거될 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분은 하기에 의해, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거될 수 있다: (i) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 약 80℃ 내지 약 95℃의 온도로 가열하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 헬퍼 가닥 부분을 분리시킴, (ii) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 8M 우레아와 같은 우레아 용액으로 처리하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 헬퍼 가닥 부분을 분리시킴, (iii) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 100% 포름아미드와 같은 포름아미드 또는 포름아미드 용액으로 처리하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 헬퍼 가닥 부분을 분리시킴, 또는 (iv) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 헬퍼 가닥 부분의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 영역을 포함하는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자와 접촉시켜, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 헬퍼 가닥 부분의 하이브리드화를 경쟁적으로 저해시킴.
범용 뉴클레오티드가 위치 n을 점유하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 위치 n과 n-1 사이에서 절단되는 본원에서 상기에 기재된 임의의 상기와 같은 방법에서, 각각의 절단 단계는 범용 뉴클레오티드를 제거하여 무(無)염기 부위를 형성하는 것을 포함하는 제1 단계, 및 무염기 부위에서 지지 가닥을 절단하는 것을 포함하는 제2 단계를 포함할 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 제1 단계는 뉴클레오티드 절단 효소를 이용하여 수행될 수 있다. 뉴클레오티드 절단 효소는 3-메틸아데닌 DNA 글리코실라아제 효소일 수 있다. 뉴클레오티드 절단 효소는 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라아제(hAAG)일 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 제2 단계는 염기인 화학물질을 이용하여 수행될 수 있다. 염기는 NaOH일 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 제2 단계는 무염기 부위 절단 활성을 갖는 유기 화학물질을 이용하여 수행될 수 있다. 유기 화학물질은 N,N'-디메틸에틸렌디아민일 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 제2 단계는 엔도뉴클레아제 VIII와 같은 무염기 부위 리아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 수행될 수 있다.
범용 뉴클레오티드가 위치 n+1을 점유하고 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 위치 n과 n-1 사이에서 절단되는 본원에서 상기에 기재된 임의의 상기와 같은 방법에서, 또는 범용 뉴클레오티드가 위치 n을 점유하고 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 위치 n-1과 n-2 사이에서 절단되는 본원에서 상기에 기재된 임의의 상기와 같은 방법에서, 절단 단계는 효소를 이용하여 지지 가닥을 절단하는 것을 포함할 수 있다. 효소는 프라이머 가닥 부분과 가까운 방향으로 범용 뉴클레오티드 다음에 있는 뉴클레오티드 이후의 지지 가닥을 절단하여, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 합성 가닥에 돌출 말단을 생성할 수 있다. 이러한 효소는 엔도뉴클레아제 V일 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 두 가닥은 모두 DNA 가닥일 수 있다. 합성 가닥 및 지지 가닥은 DNA 가닥일 수 있다. 이러한 경우, 혼입된 뉴클레오티드는 바람직하게는dNTP, 바람직하게는 가역적 종결자기를 포함하는 dNTP이다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 가역적 종결자기를 포함하는 혼입된 뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상 또는 모두는 3'-O-알릴-dNTP 또는 3'-O-아지도메틸-dNTP를 포함할 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 제1 가닥은 DNA 가닥일 수 있고, 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 제2 가닥은 RNA 가닥일 수 있다. 합성 가닥은 RNA 가닥일 수 있고, 지지 가닥은 DNA 가닥일 수 있다. 이러한 경우, 혼입된 뉴클레오티드는 바람직하게는NTP, 바람직하게는 가역적 종결자기를 포함하는 NTP이다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 가역적 종결자기를 포함하는 혼입된 뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상 또는 모두는 3'-O-알릴-NTP 또는 3'-O-아지도메틸-NTP일 수 있다.
DNA를 포함하는 합성 가닥에의 뉴클레오티드의 혼입, 예를 들어 하나 이상의 dNTP의 혼입을 포함하는 본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 효소는 폴리머라아제, 바람직하게는 DNA 폴리머라아제, 더욱 바람직하게는 변형되지 않은 폴리머라아제와 비교하여 가역적 종결자기를 포함하는 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 변형된 DNA 폴리머라아제일 수 있다. 폴리머라아제는 써모코커스(Thermococcus) 종 9°N, 바람직하게는 종 9°N-7로부터의 천연 DNA 폴리머라아제의 변이체일 수 있다.
RNA를 포함하는 합성 가닥에의 뉴클레오티드의 혼입, 예를 들어 하나 이상의 NTP의 혼입을 포함하는 본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 효소는 폴리머라아제, 바람직하게는 T3 또는 T7 RNA 폴리머라아제와 같은 RNA 폴리머라아제, 더욱 바람직하게는 변형되지 않은 폴리머라아제와 비교하여 가역적 종결자기를 포함하는 NTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 변형된 RNA 폴리머라아제일 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 제1 가닥은 DNA 가닥일 수 있고, 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 제2 가닥은 RNA 가닥일 수 있다. 대안적으로, 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 제1 가닥은 RNA 가닥일 수 있고, 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 제2 가닥은 DNA 가닥일 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 단계는, 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 이용하여 수행될 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드를 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계는, 바람직하게는 리가아제 효소를 이용하여 수행될 수 있다. 리가아제 효소는 T3 DNA 리가아제 또는 T4 DNA 리가아제일 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 단계 (1) 및/또는 단계 (6)에서, 헬퍼 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은 헤어핀 루프(hairpin loop)에 의해 연결될 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 단계 (1)에서, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은 헤어핀 루프에 의해 연결될 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 단계 (1) 및/또는 단계 (6)에서,
a) 헬퍼 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은 헤어핀 루프에 의해 연결될 수 있고;
b) 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은 헤어핀 루프에 의해 연결될 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나, 또는 그 이상 또는 전부는, 돌출 말단의 반대편 말단에서 지지 가닥과 헬퍼 가닥을 연결하는 헤어핀 루프를 포함하는 단일 분자로서 제공될 수 있다. 본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 각 합성 사이클의 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 각각 돌출 말단의 반대편 말단에서 지지 가닥과 헬퍼 가닥을 연결하는 헤어핀 루프를 포함하는 단일 분자로서 제공될 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 단계 (1)에서, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은 공통 표면에 테더링될 수 있다. 프라이머 가닥 부분 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은 각각 절단 가능한 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 링커는 합성 후 표면으로부터 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위해 절단될 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 단계 (1)에서, 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은 헤어핀 루프에 의해 연결될 수 있으며, 상기 헤어핀 루프는 표면에 테더링된다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 헤어핀 루프는 절단 가능한 링커를 통해 표면에 테더링될 수 있으며, 여기서 링커는 합성 후 표면으로부터 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위해 절단될 수 있다. 절단 가능한 링커는 UV 절단 가능한 링커일 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 폴리뉴클레오티드가 부착되는 표면은 미립자의 표면 또는 평면 표면일 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 폴리뉴클레오티드가 부착되는 표면은 겔을 포함할 수 있다. 표면은 약 2% 폴리아크릴아미드와 같은 폴리아크릴아미드 표면, 바람직하게는 유리와 같은 고체 지지체에 결합된 폴리아크릴아미드 표면을 포함한다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은 하나 이상의 공유 결합을 통해 공통 표면에 테더링될 수 있다. 하나 이상의 공유 결합은 공통 표면 상의 관능기와 스캐폴드 분자 상의 관능기 사이에 형성될 수 있으며, 여기서 스캐폴드 분자 상의 관능기는 아민기, 티올기, 티오포스페이트기 또는 티오아미드기일 수 있다. 공통 표면 상의 관능기는 브로모아세틸기일 수 있고, 선택적으로, 브로모아세틸기가 N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아미드(BRAPA)를 사용하여 유도된 폴리아크릴아미드 표면 상에 제공된다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 소정의 서열의 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 단계는, 절단 단계 전 또는 라이게이션 단계 전에 수행될 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 본원에서 상기에 기재된 임의의 합성 사이클과 관련된 반응은, 미세유체 시스템 내에서 액적으로 수행될 수 있다. 미세유체 시스템은 전기습윤 시스템일 수 있다. 미세유체 시스템은 유전체 상의 전기습윤 시스템(electrowetting-on-dielectric system, EWOD)일 수 있다.
관련 양태에서, 본 발명은 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법에서의 범용 뉴클레오티드의 용도로서, 범용 뉴클레오티드가 합성의 각 사이클 동안 폴리뉴클레오티드 절단 부위를 형성하는 데 사용되고, 각 합성 사이클에서 상기 용도가 하기를 포함하는, 범용 뉴클레오티드의 용도를 추가로 제공한다: 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 여기서 합성 가닥은 프라이머 가닥 부분을 포함하고 단일 가닥 절단부에 의해 프라이머 가닥 부분으로부터 분리된 헬퍼 가닥 부분을 선택적으로 포함하고, 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥에 제공됨; 가역적 종결자기를 포함하는 소정의 서열의 신규한 뉴클레오티드를, 폴리머라아제에 의해 합성 가닥에 혼입시키는 단계, 여기서 신규한 뉴클레오티드는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절단 부위를 한정하도록 범용 뉴클레오티드와 근접한 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에서의 위치를 점유함; 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단 부위에서 절단하여, 그 결과 범용 뉴클레오티드가 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거되고, 절단된 말단이 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 생성되고, 돌출 말단부가 신규한 뉴클레오티드를 포함하는 합성 가닥에 생성되는 단계, 여기서 절단된 말단부가 지지 가닥 및 그에 하이브리드화된 헬퍼 가닥을 갖는 라이게이션 폴리뉴클레오티드에 대한 라이게이션 수용체 부위로서 작용하고, 지지 가닥은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥의 신규한 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 뉴클레오티드를 포함하며, 합성의 다음 사이클에 사용하기 위한 신규한 범용 뉴클레오티드를 추가로 포함함. 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 합성 방법에서의 범용 뉴클레오티드의 상기와 같은 용도는, 본원에서 상기에 정의 및 기재된 임의의 특정 방법을 사용하여 구현될 수 있다.
관련 양태에서, 본 발명은 소정의 뉴클레오티드로 폴리뉴클레오티드 분자의 합성 가닥을 연장시키는 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다: 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 여기서 합성 가닥은 프라이머 가닥 부분을 포함하고 단일 가닥 절단부에 의해 프라이머 가닥 부분으로부터 분리된 헬퍼 가닥 부분을 선택적으로 포함하고, 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥에 제공됨; 가역적 종결자기를 포함하는 소정의 뉴클레오티드를 폴리머라아제에 의해 합성 가닥에 혼입시키는 단계, 여기서 소정의 뉴클레오티드는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절단 부위를 한정하도록 범용 뉴클레오티드와 근접한 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에서의 위치를 점유함; 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단 부위에서 절단하여, 그 결과 범용 뉴클레오티드가 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거되고, 절단된 말단부가 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 생성되고, 돌출 말단부가 소정의 뉴클레오티드를 포함하는 합성 가닥에 생성되는 단계; 여기서 절단된 말단부가 지지 가닥 및 그에 하이브리드화된 헬퍼 가닥을 갖는 라이게이션 폴리뉴클레오티드에 대한 라이게이션 수용체 부위로서 작용하고, 지지 가닥은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥에서 소정의 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 뉴클레오티드를 포함하며, 합성의 다음 사이클에 사용하기 위한 신규한 범용 뉴클레오티드를 추가로 포함함. 소정의 뉴클레오티드로 폴리뉴클레오티드 분자의 합성 가닥을 연장시키는 임의의 상기와 같은 방법에서, 상기 방법은 본원에서 상기에 정의 및 기재된 임의의 특정 방법을 사용하여 구현될 수 있다.
관련 양태에서, 본 발명은 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법으로서, 합성의 사이클을 포함하며, 각 합성 사이클이 하기를 포함하는 방법을 추가로 제공한다: 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 여기서 합성 가닥은 프라이머 가닥 부분을 포함하고 단일 가닥 절단부에 의해 프라이머 가닥 부분으로부터 분리된 헬퍼 가닥 부분을 선택적으로 포함하고, 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥에 제공됨; 가역적 종결자기를 포함하는 소정의 서열의 신규한 뉴클레오티드를, 폴리머라아제에 의해 합성 가닥에 혼입시키는 단계, 여기서 신규한 뉴클레오티드는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절단 부위를 한정하도록 범용 뉴클레오티드와 근접한 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에서의 위치를 점유하는 단계; 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단 부위에서 절단하여, 그 결과 범용 뉴클레오티드가 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거되고, 절단된 말단부가 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 생성되고, 돌출 말단부가 소정의 뉴클레오티드를 포함하는 합성 가닥에 생성되는 단계; 지지 가닥 및 그에 하이브리드화된 헬퍼 가닥을 갖는 라이게이션 폴리뉴클레오티드를 절단된 말단부에 라이게이션하는 단계, 여기서 상기 지지 가닥은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥의 신규한 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 뉴클레오티드를 포함하고, 합성의 다음 사이클에 사용하기 위한 신규한 범용 뉴클레오티드를 추가로 포함함; 절단 또는 라이게이션 단계 후 신규한 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하여, 다음 합성 사이클에서 사용하기 위한 신규한 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계; 및 라이게이션 단계 후 및 다음 사이클의 혼입 단계 전 헬퍼 가닥을 제거하는 선택적인 단계. 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 합성하는 임의의 상기와 같은 방법에서, 상기 방법은 본원에서 상기에 정의 및 기재된 임의의 특정 방법을 사용하여 구현될 수 있다.
관련 양태에서, 본 발명은 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 합성 사이클 동안, 범용 뉴클레오티드를 포함하는 라이게이션 폴리뉴클레오티드를 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 시험관내 방법으로서, 상기 합성 사이클 동안, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드가 소정의 뉴클레오티드 및 그에 대한 파트너를 이용하여 연장되며, 하기 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다: 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 합성 가닥은 프라이머 가닥 부분을 포함하며 단일 가닥 절단부에 의해 프라이머 가닥 부분으로부터 분리된 헬퍼 가닥 부분을 선택적으로 포함하고, 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥에 제공되는 단계; 가역적 종결자기를 포함하는 소정의 서열의 신규한 뉴클레오티드를, 폴리머라아제에 의해 합성 가닥에 혼입시키는 단계로서, 신규한 뉴클레오티드는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절단 부위를 한정하도록 범용 뉴클레오티드와 근접한 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에서의 위치를 점유하는 단계; 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단 부위에서 절단하여, 그 결과 범용 뉴클레오티드가 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거되고, 절단된 말단부가 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 생성되고, 돌출 말단부가 신규한 뉴클레오티드를 포함하는 합성 가닥에 생성되는 단계; 지지 가닥 및 그에 하이브리드화된 헬퍼 가닥을 갖는 라이게이션 폴리뉴클레오티드를 절단된 말단부에 라이게이션하는 단계로서, 지지 가닥은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥의 신규한 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 뉴클레오티드를 포함하고, 합성의 다음 사이클에 사용하기 위한 신규한 범용 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 단계; 절단 또는 라이게이션 단계 후 신규한 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하여, 다음 합성 사이클에서 사용하기 위한 신규한 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계; 및 선택적인 것으로서, 라이게이션 단계 후 및 다음 사이클의 혼입 단계 전 헬퍼 가닥을 제거하는 단계. 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 합성 사이클 동안, 범용 뉴클레오티드를 포함하는 라이게이션 폴리뉴클레오티드를, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 임의의 상기와 같은 방법에서, 상기 방법은 본원에서 상기에 정의 및 기재된 임의의 특정 방법을 사용하여 구현될 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 합성 후, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 가닥은 소정의 서열을 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해 분리될 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에서, 합성 후, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 이의 영역은, 바람직하게는 PCR에 의해 증폭된다.
본 발명은 또한 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 어셈블리하는 방법으로서, 소정의 서열을 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 및 소정의 서열을 갖는 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위해 본원에서 상기에 기재된 임의의 합성 방법을 수행하는 단계, 및 제1 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드를 함께 결합하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 제1 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 상이한 소정의 서열을 포함할 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드는 먼저 절단되어 호환 가능한 말단을 형성하고, 예를 들어 라이게이션에 의해 함께 결합될 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드는 절단 부위에서 제한 효소에 의해 절단되어 호환 가능한 말단을 생성할 수 있다.
본원에서 상기에 기재된 바와 같은 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 합성하는 임의의 시험관내 방법, 및/또는 본원에서 상기에 기재된 바와 같은 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 어셈블리하는 임의의 시험관내 방법은, 미세유체 시스템 내에서 액적으로 수행될 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 어셈블리 방법은 소정의 서열을 갖는 제1 합성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 액적, 및 소정의 서열을 갖는 부가적인 하나 이상의 합성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 액적을 제공하는 것을 포함하는 어셈블리 단계로서, 여기서 액적이 서로 접촉하게 되고, 합성된 폴리뉴클레오티드가 함께 결합되어 제1 및 부가적인 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 어셈블리하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 합성 단계는, 각 액적이 합성 사이클의 단계에 상응하는 반응 시약을 포함하는 다수의 액적을 제공하고, 합성 사이클의 단계에 따라 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 액적을 순차적으로 전달함으로써 수행될 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 액적의 전달 후 및 다음 액적의 전달 전, 과량의 반응 시약을 제거하기 위해 세척 단계가 수행될 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 미세유체 시스템은 전기습윤 시스템일 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 미세유체 시스템은 유전체 상의 전기습윤 시스템(EWOD)일 수 있다. 임의의 상기와 같은 방법에서, 합성 및 어셈블리 단계는 동일한 시스템 내에서 수행될 수 있다.
본 발명은 부가적으로 본원에서 상기에 기재된 임의의 합성 및/또는 어셈블리 방법을 수행하기 위한 폴리뉴클레오티드 합성 시스템으로서, (a) 각 반응 영역이 적어도 하나의 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 다수의 반응 영역; 및 (b) 반응 시약을 반응 영역에 전달하기 위한 수단을 포함하고; (c) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 절단하기 위한 수단을 선택적으로 포함하는 시스템을 제공한다. 이러한 시스템은 반응 시약을 액적으로 제공하기 위한 수단, 합성 사이클에 따라 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 액적을 전달하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에서 상기에 기재된 임의의 시스템과 함께 사용하기 위한 것이며 본원에서 상기에 기재된 임의의 합성 방법을 수행하기 위한 키트로서, 합성 사이클의 단계에 상응하는 반응 시약의 부피를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이(microarray)의 제조 방법으로서, 마이크로어레이는 다수의 반응 영역을 포함하고, 각 영역은 소정의 서열을 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
a) 하나 이상의 이중 가닥 앵커(anchor) 또는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 다수의 반응 영역을 포함하는 표면을 제공하는 단계, 및
b) 각 반응 영역에서 본원에서 상기에 기재된 임의의 방법에 따라 합성 사이클을 수행하여, 각 영역에서 소정의 서열을 갖는 하나 이상의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 합성하는 단계.
이러한 방법에서, 합성 후, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 가닥은 분리되어, 각 영역이 소정의 서열을 갖는 하나 이상의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 67 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 뉴클레오티드 분자 작제물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 67 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 뉴클레오티드 분자 작제물로서, 서열번호 1 내지 67 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 각각의 폴리뉴클레오티드 서열이, 존재하는 경우, 도면에 제시된 각각의 변형(들)뿐만 아니라 본원에 기재된 말단 변형으로 변형된 뉴클레오티드 분자 작제물에 관한 것이다.
본원에 제시되고 하기에 기재되는 관련 도면은, 본 발명의 방법을 사용하는 합성 사이클의 단계 중 일부 또는 전부뿐만 아니라, 방법의 양태를 수행하기 위한 수단, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 표면, 표면 부착 화학, 링커 등을 나타낸다. 이러한 도면뿐만 아니라 그에 대한 설명, 및 모든 관련 방법, 시약 및 프로토콜은 단지 예시를 위해 제시된 것으로, 제한으로서 해석되어서는 안된다.
예를 들어 도 1, 2, 3a, 3b, 3c, 6a, 7a, 8a 등과 같은 관련 도면은, 뉴클레오티드(예를 들어, 가역적 종결자기를 포함하는 뉴클레오티드)의 혼입, 절단(예를 들어, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제1 부분 및 제2 부분으로 절단하는 것으로, 제1 부분은 범용 뉴클레오티드를 포함하고, 제2 부분은 혼입된 뉴클레오티드를 포함함), 라이게이션(예를 들어, 단일 가닥 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 작제물를 혼입된 뉴클레오티드를 포함하는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제2 부분에 라이게이션하는 것으로, 단일 가닥 부분은 혼입된 뉴클레오티드에 상보적인 파트너 뉴클레오티드를 포함함) 및 탈보호(예를 들어, 혼입된 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거함)를 포함하는 합성 사이클의 단계 중 일부 또는 전부를 나타낸다.
도 1. 예시적인 방법 버전 1의 개략도.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제공, 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 사이클을 포함하는, 예시적인 방법 버전 1에 따른 제1 합성 사이클을 나타내는 개략도. 개략도는 제1 합성 사이클에서의 티민 뉴클레오티드의 혼입(101, 102) 및 파트너 아데닌 뉴클레오티드 반대편에서의 이의 짝짓기(104)뿐만 아니라, 다음 합성 사이클에 사용하기 위한 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제공(106)을 나타낸다. 이러한 쌍은 단지 예시의 목적으로 제시된 것으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 이는 요구되는 소정의 서열에 따른 임의의 쌍일 수 있다. 뉴클레오티드 Z는 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드 X는 임의의 적절한 뉴클레오티드일 수 있다. 도면은 또한 제2 합성 사이클에 상응하는 참조 부호를 나타낸다.
도 2. 예시적인 방법 버전 2의 개략도.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제공, 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 사이클을 포함하는, 예시적인 방법 버전 2에 따른 제1 합성 사이클을 나타내는 개략도. 개략도는 제1 합성 사이클에서의 티민 뉴클레오티드의 혼입(201, 202) 및 대응 파트너 아데닌 뉴클레오티드 반대편에서의 이의 짝짓기(204)뿐만 아니라, 다음 합성 사이클에서 시토신과 쌍을 이루는 구아닌을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제공(206)을 나타낸다. 이러한 쌍은 단지 예시의 목적으로 제시된 것으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 이는 요구되는 소정의 서열에 따른 임의의 쌍일 수 있다. 뉴클레오티드 Z는 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드 X는 임의의 적절한 뉴클레오티드일 수 있다. 도면은 또한 제2 합성 사이클에 상응하는 참조 부호를 나타낸다.
도 3a. 예시적인 방법 버전 3의 개략도.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제공, 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 사이클을 포함하는, 예시적인 방법 버전 3에 따른 제1 합성 사이클을 나타내는 개략도. 개략도는 제1 합성 사이클에서의 티민 뉴클레오티드의 혼입(301, 302) 및 파트너 아데닌 뉴클레오티드 반대편에서의 이의 짝짓기의 혼입(304)뿐만 아니라, 다음 합성 사이클에 사용하기 위한 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제공(306)을 나타낸다. 이러한 쌍은 단지 예시의 목적으로 제시된 것으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 이는 요구되는 소정의 서열에 따른 임의의 쌍일 수 있다. 개략도는 또한 소정의 서열의 일부가 아닌, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 구성요소로서 시토신-구아닌 쌍을 나타낸다. 이러한 쌍은 단지 예시의 목적으로 제시된 것으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 이는 임의의 쌍일 수 있다. 뉴클레오티드 Z는 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드 X는 임의의 적절한 뉴클레오티드일 수 있다.
도 3b. 예시적인 방법 버전 4의 개략도.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제공, 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 사이클을 포함하는, 예시적인 방법 버전 4에 따른 제1 합성 사이클을 나타내는 개략도. 개략도는 제1 합성 사이클에서의 티민 뉴클레오티드의 혼입(401, 402) 및 파트너 아데닌 뉴클레오티드 반대편에서의 이의 짝짓기(404)뿐만 아니라, 다음 합성 사이클에서 시토신과 쌍을 이루는 구아닌을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제공(406)을 나타낸다. 이러한 쌍은 단지 예시의 목적으로 제시된 것으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 이는 요구되는 소정의 서열에 따른 임의의 쌍일 수 있다. 뉴클레오티드 X, Y 및 Z는 임의의 뉴클레오티드일 수 있다.
도 3c. 예시적인 방법 버전 5의 개략도.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제공, 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 사이클을 포함하는, 예시적인 방법 버전 5에 따른 제1 합성 사이클을 나타내는 개략도. 개략도는 제1 합성 사이클에서의 티민 뉴클레오티드의 혼입(501, 502) 및 파트너 아데닌 뉴클레오티드 반대편에서의 이의 짝짓기(504)뿐만 아니라, 다음 합성 사이클에서 시토신과 쌍을 이루는 구아닌을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 제공(506)을 나타낸다. 개략도는 또한 소정의 서열의 일부가 아닌, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 구성요소로서 시토신-구아닌 쌍(위치 n-2)을 나타낸다. 이러한 쌍은 단지 예시의 목적으로 제시된 것으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 이는 요구되는 소정의 서열에 따른 임의의 쌍일 수 있다. 뉴클레오티드 X, Y 및 Z는 임의의 뉴클레오티드일 수 있다.
도 4. 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 표면 고정화를 나타내는 개략도.
개략도(도4a 내지 도 4h)는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 및 표면에 대한 이의 고정화의 가능한 예시적인 헤어핀 루프 구성을 나타낸다.
개략도(도 4i 및 도 4j)는 표면에 폴리뉴클레오티드를 부착시키는 표면 화학의 예시를 나타낸다. 예시는 두 개의 가닥이 모두 헤어핀을 통해 연결된 이중 가닥 구현예를 나타내지만, 연결되지 않은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 두 개의 가닥을 부착시키는 데에도 동일한 화학이 사용될 수 있다.
도 5. 헬퍼 가닥의 부재 - 혼입.
a) 점선 박스로 강조된 혼입 단계를 나타내는 개략도.
b) 이노신 반대편에 3'-O-변형된-dTTP의 혼입을 위한 DNA 폴리머라아제의 평가. 도면은 50℃에서 Mn2 + 이온의 존재 하에서, 다양한 DNA 폴리머라아제(Bst, Deep Vent(Exo-), Therminator I 및 Therminator IX)에 의한 3'-O-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 1: Bst DNA 폴리머라아제를 사용한 3'-O-알릴-dTTP의 혼입. 레인 2: Bst DNA 폴리머라아제를 사용한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 3: Deep vent(exo-) DNA 폴리머라아제를 사용한 3'-O-알릴-dTTP의 혼입. 레인 4: Deep vent(exo-) DNA 폴리머라아제를 사용한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 5: Therminator I DNA 폴리머라아제를 사용한 3'-O-알릴-dTTP의 혼입. 레인 6: Therminator I DNA 폴리머라아제를 사용한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 7: Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용한 3'-O-알릴-dTTP의 혼입. 레인 8: Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입.
c) 이노신 반대편에 3'-O-변형된-dTTP의 혼입을 위한 DNA 폴리머라아제의 평가. 다양한 DNA 폴리머라아제를 사용한 혼입 결과.
d) Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용한 혼입에 대한 온도의 평가. 도면은 다양한 온도에서 Mn2 + 이온의 존재 하에서, Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용하여 이노신 반대편에서의 3'-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 1: 37℃에서 3'-O-알릴-dTTP의 혼입. 레인 2: 37℃에서 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 3: 50℃에서 3'-O-알릴-dTTP의 혼입. 레인 4: 50℃에서 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 5: 65℃에서 3'-O-알릴-dTTP의 혼입. 레인 6: 65℃에서 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입.
e) Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용한 혼입에 대한 온도의 평가. 상이한 온도에서 수행된 혼입 결과.
f) Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용한 혼입에 대한 Mn2 + 존재의 평가. 도면은 65℃에서 이노신 반대편에서의 3'-O-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 S: 표준. 레인 1: Mn2 + 이온의 부재 하에서의 3'-O-알릴-dTTP의 혼입. 레인 2: Mn2 + 이온의 부재 하에서의 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 3: Mn2 + 이온의 존재 하에서의 3'-O-알릴-dTTP의 혼입. 레인 4: Mn2 + 이온의 존재 하에서의 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입.
g) Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용한 혼입에 대한 Mn2 + 존재의 평가. Mn2 + 이온의 존재 및 부재 하에서의 혼입 결과.
h) 혼입 단계의 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 6. 헬퍼 가닥의 존재 - 절단.
a) 헬퍼 가닥의 부재 하에서 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드 가닥의 절단을 나타내는 개략도. 절단 단계는 점선 박스로 강조됨.
b) 각각 37℃ 및 실온 24℃에서, hAAG 및 0.2M NaOH(강염기)를 이용한 올리고뉴클레오티드의 절단을 나타내는 겔. 레인 1. 출발 올리고뉴클레오티드. 두 개의 전장 가닥을 모두 함유하는 양성 대조군인 레인 2는, 90% : 10%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 높은 수율을 나타냈다. 헬퍼 가닥의 부재 하에서의 절단 반응을 포함하는 레인 3은, 10% : 90%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 낮은 %수율을 나타냈다.
c) 37℃에서 hAAG 및 Endo VIII을 이용한 올리고뉴클레오티드의 절단을 나타내는 겔. 두 개의 전장 가닥을 모두 함유하는 양성 대조군인 레인 2는, 약 90% : 10%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 높은 수율을 나타냈다. 헬퍼 가닥의 부재 하에서의 절단 반응을 포함하는 레인 3은, 약 7% : 93%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 낮은 %수율을 나타냈다.
d) hAAG/Endo VIII 및 hAAG/화학 염기를 이용한 올리고뉴클레오티드 절단의 개요.
e) 절단 단계의 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 7. 헬퍼 가닥의 부재 - 라이게이션 .
a) 헬퍼 가닥의 부재 하에서 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드 가닥의 라이게이션을 나타내는 개략도. 점선 박스로 강조된 라이게이션 단계.
b) 실온(24℃)에서 헬퍼 가닥의 부재 하에서, Quick T4 DNA 리가아제를 이용한 올리고뉴클레오티드의 라이게이션을 나타내는 겔. 레인 1은 36량체 TAMRA 단일 가닥 올리고와 18량체 TAMRA 단일 가닥 올리고의 혼합물을 함유하였다. 이러한 올리고는 참조 밴드(reference band)를 제공하였다.
c) 라이게이션 단계의 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 8. 헬퍼 가닥을 이용한 버전 1 화학 - 혼입.
a) 점선 박스로 강조된 혼입 단계를 나타내는 개략도.
b) 혼입 단계의 연구에 적용 가능한 올리고뉴클레오티드.
도 9. 헬퍼 가닥을 이용한 버전 1 화학 - 절단.
a) 헬퍼 가닥의 부재 하에서 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드 가닥의 절단을 나타내는 개략도. 절단 단계는 점선 박스로 강조됨.
b) 각각 37℃ 및 실온 24℃에서, hAAG 및 0.2M NaOH(강염기)를 이용한 올리고뉴클레오티드의 절단을 나타내는 겔. 레인 1. 출발 올리고뉴클레오티드. 두 개의 전장 가닥을 모두 함유하는 양성 대조군인 레인 2는, 90% : 10%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 높은 수율을 나타냈다. 헬퍼 가닥의 부재 하에서의 절단 반응을 포함하는 레인 3은, 10% : 90%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 낮은 %수율을 나타냈다. 헬퍼 가닥을 이용한 절단 반응을 포함하는 레인 4는, 50% : 50%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 동등한 비율을 나타냈다.
c) 무염기 부위의 절단에 대한 엔도뉴클레아제 VIII의 평가. 겔은 37℃에서 hAAG 및 Endo VIII를 이용한 올리고뉴클레오티드의 절단을 나타낸다. 두 개의 전장 가닥을 모두 함유하는 양성 대조군인 레인 2는, 약 90% : 10%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 높은 수율을 나타냈다. 헬퍼 가닥의 부재 하에서의 절단 반응을 포함하는 레인 3은, 약 7% : 93%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 낮은 %수율을 나타냈다. 헬퍼 가닥을 이용한 절단 반응을 포함하는 레인 4는, 10% : 90%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 낮은 %수율을 나타냈다.
d) 무염기 부위의 절단에 대한 N,N'-디메틸에틸렌디아민의 평가. 겔은 37℃에서 hAAG 및 100mM N,N'-디메틸에틸렌디아민을 이용한 올리고뉴클레오티드의 절단을 나타낸다. 레인 1. 출발 올리고뉴클레오티드. 두 개의 전장 가닥을 모두 함유하는 양성 대조군인 레인 2는, 100% 절단된 DNA를 나타냈다. 헬퍼 가닥을 이용한 절단 반응을 포함하는 레인 3은, 90% : 10%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 높은 %수율을 나타냈다.
e) hAAG/Endo VIII, hAAG/화학 염기 및 hAAG/대안적인 화학 염기를 이용한 올리고뉴클레오티드 절단의 개요.
f) 절단 단계의 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 10. 헬퍼 가닥을 이용한 버전 1 화학 - 라이게이션 .
a) 헬퍼 가닥의 존재 하에서 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드 가닥의 라이게이션을 나타내는 개략도. 점선 박스로 강조된 라이게이션 단계.
b) 실온(24℃)에서 헬퍼 가닥의 존재 하에서, Quick T4 DNA 리가아제를 이용한 올리고뉴클레오티드의 라이게이션을 나타내는 겔. 레인 1은 36량체 TAMRA 단일 가닥 올리고와 18량체 TAMRA 단일 가닥 올리고의 혼합물을 함유하였다. 이러한 올리고는 참조 밴드를 제공하였다. 레인 2에서, 20분 후 예상 밴드 크기 36량체의 관찰 가능한 라이게이션 생성물이 존재하였다.
c) 실온(24℃)에서 헬퍼 가닥의 존재 하에서 밤새 인큐베이션 후, Quick T4 DNA 리가아제를 이용한 올리고뉴클레오티드의 라이게이션을 나타내는 겔. 레인 1은 36량체 TAMRA 단일 가닥 올리고와 18량체 TAMRA 단일 가닥 올리고의 혼합물을 함유하였다. 이러한 올리고는 참조 밴드를 제공하였다. 레인 2에서, 예상 밴드 크기 36량체의 관찰 가능한 완전히 라이게이션된 생성물이 존재하였다.
d) 라이게이션 단계의 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 11. 헬퍼 가닥을 이용한 버전 2 화학 - 혼입.
a) 주황색 점선 박스로 강조된 혼입 단계를 나타내는 개략도.
b) 27℃에서 Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔. 레인 1: 출발 물질. 레인 2: 1분 후 혼입, 전환율 5%. 레인 3: 2분 후 혼입, 전환율 10%. 레인 4: 5분 후 혼입, 전환율 20%. 레인 5: 10분 후 혼입, 전환율 30%. 레인 6: 20분 후 혼입, 전환율 35%.
c) 도면은 37℃에서 Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 1: 출발 물질. 레인 2: 1분 후 혼입, 전환율 30%. 레인 3: 2분 후 혼입, 전환율 60%. 레인 4: 5분 후 혼입, 전환율 90%. 레인 5: 10분 후 혼입, 전환율 90%. 레인 6: 20분 후 혼입, 전환율 90%.
d) 47℃에서 Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔. 레인 1: 출발 물질. 레인 2: 1분 후 혼입, 전환율 30%. 레인 3: 2분 후 혼입, 전환율 65%. 레인 4: 5분 후 혼입, 전환율 90%. 레인 5: 10분 후 혼입, 전환율 90%. 레인 6: 20분 후 혼입, 전환율 90%.
e) 27℃에서 Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔. 레인 1: 출발 물질. 레인 2: 1분 후 혼입, 전환율 70%. 레인 3: 2분 후 혼입, 전환율 85%. 레인 4: 5분 후 혼입, 전환율 92%. 레인 5: 10분 후 혼입, 전환율 96%. 레인 6: 20분 후 혼입, 전환율 96%.
f) 37℃에서 Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔. 레인 1: 출발 물질. 레인 2: 1분 후 혼입, 전환율 85%. 레인 3: 2분 후 혼입, 전환율 95%. 레인 4: 5분 후 혼입, 전환율 96%. 레인 5: 10분 후 혼입, 전환율 96%. 레인 6: 20분 후 혼입, 전환율 96%.
g) 47℃에서 Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔. 레인 1: 출발 물질. 레인 2: 1분 후 혼입, 전환율 85%. 레인 3: 2분 후 혼입, 전환율 90%. 레인 4: 5분 후 혼입, 전환율 96%. 레인 5: 10분 후 혼입, 전환율 96%. 레인 6: 20분 후 혼입, 전환율 96%.
h) 다양한 온도 및 Mn2 + 이온의 존재 하에서의 3'-O-아지도메틸-dTTP 혼입의 개요.
i) 37℃에서 Mn2 +의 존재 하에서, Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한, 상보적 염기 반대편에의 3'-O-변형된-dNTP의 혼입 결과를 나타내는 겔. 레인 1: 출발 물질. 레인 2: 5분 동안 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 3: 5분 동안 3'-O-아지도메틸-dATP의 혼입. 레인 4: 5분 동안 3'-O-아지도메틸-dCTP의 혼입. 레인 5: 5분 동안 3'-O-아지도메틸-dGTP의 혼입.
j) 혼입 단계의 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 12. 헬퍼 가닥을 이용한 버전 2 화학 - 절단.
a) 헬퍼 가닥의 존재 하에서 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드 가닥의 절단을 나타내는 개략도. 절단 단계는 주황색 점선 박스로 강조됨.
b) 겔은 37℃에서 Endo V를 이용한 올리고뉴클레오티드의 절단을 나타낸다. 레인 1. 출발 올리고뉴클레오티드. 두 개의 전장 가닥을 모두 함유하는 양성 대조군인 레인 2는, 80% : 20%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 수율을 나타냈다. 헬퍼 가닥의 부재 하에서의 절단 반응을 포함하는 레인 3은, 99% 초과의 절단된 DNA의 매우 높은 수율을 나타냈다. 헬퍼 가닥을 이용한 절단 반응을 포함하는 레인 4는, 또한 99% 초과의 DNA 절단 수율을 나타냈다.
c) 엔도뉴클레아제 V를 이용한 절단 연구의 개요.
d) 절단 단계의 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 13. 헬퍼 가닥을 이용한 버전 2 화학 - 라이게이션 .
a) 헬퍼 가닥의 부재 하에서 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드 가닥의 라이게이션을 나타내는 개략도. 주황색 점선 박스로 강조된 라이게이션 단계.
b) 라이게이션 단계의 연구를 위한 올리고뉴클레오티드.
도 14. 헬퍼 가닥을 이용한 버전 2 화학 - 탈보호 .
a) 주황색 점선 박스로 강조된 탈보호 단계를 나타내는 개략도.
b) 도면은 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입 후, 50mM TCEP에 의한 3'-O-아지도메틸기 탈보호의 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 1: 출발 프라이머.
레인 2: Mn2 + 존재 하에서의 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 3: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 2의 생성물의 연장. 레인 4: 50 mM TCEP에 의한 레인 2의 생성물(0.5 μM)의 탈보호. 레인 5: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 4의 생성물의 연장.
c) 도면은 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입 후, 300mM TCEP에 의한 3'-O-아지도메틸기 탈보호의 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 1: 출발 프라이머. 레인 2: Mn2+ 존재 하에서의 3-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 3: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 2의 생성물의 연장. 레인 4: 300mM TCEP에 의한 레인 2의 생성물(0.5 μM)의 탈보호. 레인 5: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 4의 생성물의 연장.
d) 도면은 3'-O-아지도메틸-dCTP의 혼입 후, 50mM TCEP에 의한 3'-O-아지도메틸기 탈보호의 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 1: 출발 프라이머. 레인 2: Mn2+ 존재 하에서의 3-O-아지도메틸-dCTP의 혼입. 레인 3: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 2의 생성물의 연장. 레인 4: 300mM TCEP에 의한 레인 2의 생성물(0.5 μM)의 탈보호. 레인 5: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 4의 생성물의 연장.
e) 도면은 3'-O-아지도메틸-dCTP의 혼입 후, 300mM TCEP에 의한 3'-O-아지도메틸기 탈보호의 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 1: 출발 프라이머.
레인 2: Mn2 + 존재 하에서의 3-O-아지도메틸-dCTP의 혼입. 레인 3: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 1의 생성물의 연장. 레인 4: 300mM TCEP에 의한 레인 1의 생성물(0.5 μM)의 탈보호. 레인 5: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 3의 생성물의 연장.
f) 도면은 3'-O-아지도메틸-dATP의 혼입 후, 300mM TCEP에 의한 3'-O-아지도메틸기 탈보호의 결과를 나타내는 겔을 도시한다.
레인 1: 출발 프라이머.
레인 2: Mn2 + 존재 하에서의 3-O-아지도메틸-dATP의 혼입. 레인 3: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 2의 생성물의 연장. 레인 4: 300mM TCEP에 의한 레인 2의 생성물(0.5 μM)의 탈보호. 레인 5: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 4의 생성물의 연장.
g) 도면은 3'-O-아지도메틸-dGTP의 혼입 후, 300mM TCEP에 의한 3'-O-아지도메틸기 탈보호의 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 1: 출발 프라이머.
레인 2: Mn2 + 존재 하에서의 3-O-아지도메틸-dGTP의 혼입. 레인 3: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 2의 생성물의 연장. 레인 4: 300mM TCEP에 의한 레인 2의 생성물(0.5 μM)의 탈보호. 레인 5: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 4의 생성물의 연장.
h) 0.2 μM DNA에 대한 TCEP에 의한 탈보호의 효율.
i) 절단 단계의 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 15. 이중 헤어핀 모델을 이용한 버전 2 화학 - 혼입.
a) 점선 박스로 강조된 혼입 단계를 나타내는 개략도.
b) 3'-O-변형된-dTTP의 이의 천연 대응물 반대편에의 혼입을 위한 DNA 폴리머라아제의 평가. 도면은 37℃에서 Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 1: 출발 물질. 레인 2: 천연 dNTP 혼합물의 혼입. 레인 3: Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 4: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 3의 생성물의 연장.
c) 3'-O-변형된-dTTP의 이의 천연 대응물 반대편에의 혼입을 위한 DNA 폴리머라아제의 평가. 혼입 단계의 연구에 적용 가능한 올리고뉴클레오티드.
도 16. 이중 헤어핀 모델을 이용한 버전 2 화학 - 절단.
a) 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 절단을 나타내는 개략도. 절단 단계는 점선 박스로 강조됨.
b) 37℃에서 Endo V를 이용한 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 절단을 나타내는 겔. 레인 1. 출발 헤어핀 올리고뉴클레오티드. 5분 후 절단된 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 레인 2는, 약 98%의 비율로 소화된 DNA의 높은 수율을 나타냈다. 10분 후 절단된 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 레인 3은, 약 99%의 비율로 소화된 DNA의 높은 수율을 나타냈다. 30분 후 절단된 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 레인 4는, 약 99%의 비율로 소화된 DNA의 높은 수율을 나타냈고, 1시간 후 절단된 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 레인 5에서는, 약 99%의 비율로 소화된 DNA의 높은 수율을 나타냈다.
c) 절단 단계의 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 17. 이중 헤어핀 모델을 이용한 버전 2 화학 ?? 라이게이션 .
a) 하이브리드화된 헤어핀의의 라이게이션을 나타내는 겔. 점선 박스로 강조된 라이게이션 단계.
b) 겔은 실온(24℃)에서 헬퍼 가닥의 존재 하에서, 블런트(Blunt)/TA DNA 리가아제를 이용한 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 라이게이션을 나타낸다. 레인 1은 출발 헤어핀 올리고뉴클레오티드를 함유하였다. 1분 후 라이게이션된 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 레인 2는, 약 85%의 비율로 라이게이션된 DNA 생성물의 높은 수율을 나타냈다. 2분 후 라이게이션된 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 레인 3은, 약 85%의 비율로 소화된 DNA의 높은 수율을 나타냈다. 3분 후 라이게이션된 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 레인 4는, 약 85%의 비율로 라이게이션된 DNA 생성물의 높은 수율을 나타냈다. 4분 후 라이게이션된 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 레인 5는, 약 >85%의 비율로 라이게이션된 DNA 생성물의 높은 수율을 나타냈다.
c) 라이게이션 단계의 연구에 사용된 헤어핀 올리고뉴클레오티드.
도 18. 버전 2 화학 - 이중 헤어핀 모델에 대한 완전한 사이클 .
a) 효소적 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호 단계를 포함하는 완전한 사이클을 나타내는 개략도.
b) 3'-O-변형된-dTTP의 이의 천연 대응물 반대편에의 혼입을 위한 DNA 폴리머라아제의 평가. 도면은 37℃에서 Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-변형된-dTTP의 혼입 결과를 나타내는 겔을 도시한다. 레인 1: 출발 물질. 레인 2: Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입. 레인 3: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 2의 생성물의 연장. 레인 4: 엔도뉴클레아제 V에 의한 레인 2의 생성물의 절단. 레인 5: 블런트 TA 리가아제 키트에 의한 레인 4의 생성물의 라이게이션.
c) 혼입 단계의 연구에 적용 가능한 올리고뉴클레오티드.
도 19. 버전 2 화학 - 헬퍼 가닥을 사용한 단일 헤어핀 모델에 대한 완전한 사이클 .
a) 효소적 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호 단계를 포함하는 완전한 사이클을 나타내는 개략도.
b) 혼입 단계의 연구에 적용 가능한 올리고뉴클레오티드.
도 20. 버전 3 화학 - 이중 헤어핀 모델에 대한 완전한 사이클 .
a) 효소적 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호 단계를 포함하는 완전한 사이클을 나타내는 개략도.
b) 혼입 단계의 연구에 적용 가능한 올리고뉴클레오티드.
도 21. 버전 2 화학 - 이중 헤어핀 모델에 대한 완전한 2 -사이클.
a) 효소적 혼입, 탈보호, 절단 및 라이게이션 단계를 포함하는 제1 완전 사이클을 나타내는 개략도.
b) 제1 완전 사이클 후, 효소적 혼입, 탈보호, 절단 및 라이게이션 단계를 포함하는 제2 완전 사이클을 나타내는 개략도.
c) 도면은 혼입, 탈보호, 절단 및 라이게이션 단계를 포함하는 완전한 2-사이클 실험을 나타내는 겔을 도시한다.
레인 1. 출발 물질.
레인 2. 천연 dNTP를 이용한 출발 물질의 연장.
레인 3. Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입.
레인 4. 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 3의 생성물의 연장.
레인 5. TCEP에 의한 레인 3의 생성물의 탈보호.
레인 6. 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 5의 생성물의 연장.
레인 7. 엔도뉴클레아제 V에 의한 레인 5의 생성물의 절단.
레인 8. 블런트 TA 리가아제 키트에 의한 레인 7의 생성물의 라이게이션.
레인 9. 람다 엑소뉴클레아제에 의한 레인 8의 생성물의 절단.
레인 10. 제2 사이클을 위한 출발 물질 - 레인 9에서와 동일한 물질.
레인 11. Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입.
레인 12. 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 11의 생성물의 연장.
레인 13. TCEP에 의한 레인 11의 생성물의 탈보호.
레인 14. 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 13의 생성물의 연장.
레인 15. 엔도뉴클레아제 V에 의한 레인 13의 생성물의 절단.
레인 16. 블런트 TA 리가아제 키트에 의한 레인 15의 생성물의 라이게이션.
d) 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 22.
본원에 기재된 방법에 따라 합성된 바와 같은, 소정의 서열의 폴리뉴클레오티드의 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터의 방출 메커니즘을 나타내는 예.
도 23.
본 발명에 따른 RNA 합성을 위한 예시적인 방법의 개략도. 예시적인 방법은 헬퍼 가닥의 부재 하에서의 합성을 나타낸다.
도 24.
본 발명에 따른 RNA 합성을 위한 예시적인 방법의 개략도. 예시적인 방법은 헬퍼 가닥의 존재 하에서의 합성을 나타낸다.
도 25.
본 발명에 따른 RNA 합성을 위한 예시적인 방법의 개략도. 예시적인 방법은 헬퍼 가닥의 존재 하에서의 합성을 나타낸다.
도 26.
혼입 단계 전 헬퍼 가닥을 변성시키는 단계를 포함하는, 단일 헤어핀 모델을 이용한 합성 방법 버전 2에 따른, DNA의 합성을 위한 예시적인 방법의 제1 완전 사이클의 개략도.
도 27.
혼입 단계 전 헬퍼 가닥을 변성시키는 단계를 포함하는, 단일 헤어핀 모델을 이용한 합성 방법 버전 2에 따른, DNA의 합성을 위한 예시적인 방법의 제2 완전 사이클의 개략도.
도 28.
혼입 단계 전 헬퍼 가닥을 변성시키는 단계를 포함하는, 단일 헤어핀 모델을 이용한 합성 방법 버전 2에 따른, DNA의 합성을 위한 예시적인 방법의 제3 완전 사이클의 개략도.
도 29.
실시예 9에 상세화된 실험에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 30.
실시예 9에 상세화된 바와 같은 완전한 3-사이클 실험에 상응하는 반응 생성물을 나타내는 겔.
도면은 혼입, 차단해제(deblock), 절단 및 라이게이션 단계를 포함하는 완전한 3-사이클 실험의 결과를 나타내는 겔을 도시한다.
레인 1: 출발 물질.
레인 2. 천연 dNTP를 이용한 출발 물질의 연장.
레인 3: Therminator X DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입.
레인 4: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 3의 생성물의 연장.
레인 5: TCEP에 의한 레인 3의 생성물의 차단해제.
레인 6: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 5의 생성물의 연장.
레인 7: 엔도뉴클레아제 V에 의한 레인 5의 생성물의 절단.
레인 8: T3 DNA 리가아제에 의한 레인 7의 생성물의 라이게이션.
레인 9: 제2 사이클을 위한 출발 물질 - 레인 9에서와 동일한 물질.
레인 10: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 9의 생성물의 연장.
레인 11: Therminator X DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입.
레인 12: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 11의 생성물의 연장.
레인 13: TCEP에 의한 레인 11의 생성물의 차단해제.
레인 14: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 13의 생성물의 연장.
레인 15: 엔도뉴클레아제 V에 의한 레인 13의 생성물의 절단.
레인 16: T3 DNA 리가아제에 의한 레인 15의 생성물의 라이게이션.
레인 17: 제3 사이클을 위한 출발 물질 - 레인 16에서와 동일한 물질.
레인 18: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 17의 생성물의 연장.
레인 19: Therminator X DNA 폴리머라아제에 의한 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입.
레인 20: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 19의 생성물의 연장.
레인 21: TCEP에 의한 레인 19의 생성물의 차단해제.
레인 22: 전부 천연 dNTP의 첨가에 의한 레인 21의 생성물의 연장.
레인 23: 엔도뉴클레아제 V에 의한 레인 21의 생성물의 절단.
레인 24: T3 DNA 리가아제에 의한 레인 23의 생성물의 라이게이션.
도 31.
FITC-PEG-SH 및 FITC-PEG-COOH에 노출된, 상이한 양의 BRAPA가 첨가된 폴리아크릴아미드 겔 표면으로부터의 형광 신호.
도 32.
FITC-PEG-SH 및 FITC-PEG-COOH에 노출된, 상이한 양의 BRAPA가 첨가된 폴리아크릴아미드 겔 표면 상에서 플루오레세인 채널로부터 측정된 형광 신호.
도 33.
(a) 상이한 샘플 상에 고정된 링커 포함 헤어핀 DNA의 서열을 나타냄.
(b) 상이한 샘플 상에 고정된 링커 미포함 헤어핀 DNA의 서열을 나타냄.
도 34.
브로모아세틸 관능화된 폴리아크릴아미드 표면 상에 고정된 링커 포함 및 미포함 헤어핀 DNA 올리고머로부터의 형광 신호.
도 35.
브로모아세틸 관능화된 폴리아크릴아미드 표면 상에 고정된 링커 포함 및 미포함 헤어핀 DNA 올리고머로부터 측정된 형광.
도 36.
트리포스페이트의 혼입 후, 브로모아세틸 관능화된 폴리아크릴아미드 표면 상에 고정된 링커 포함 및 미포함 헤어핀 DNA 올리고머로부터의 형광 신호.
도 37.
트리포스페이트의 혼입 후, 브로모아세틸 관능화된 폴리아크릴아미드 표면 상에 고정된 링커 포함 및 미포함 헤어핀 DNA 올리고머로부터 측정된 형광.
도 38.
(a) 실시예 12에 상세화된 바와 같은 각 반응 단계에 대한 실험 개요 및 결과.
(b) 실시예 12에 상세화된 실험에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 39.
절단 반응 전후 헤어핀 DNA 올리고머로부터의 형광 신호를 나타낸다(실시예 12).
도 40.
절단 반응 전후 헤어핀 DNA 올리고머로부터 측정된 형광 신호를 나타낸다(실시예 12).
도 41.
라이게이션 반응을 위한 상보적인 '헬퍼' 가닥 및 이노신-함유 가닥에 대한 서열을 나타낸다(실시예 12).
도 42.
라이게이션 반응의 모니터링에 상응하는 헤어핀 DNA 올리고머로부터의 형광 신호에 관한 결과(실시예 12).
도 43.
라이게이션 반응의 모니터링에 상응하는 헤어핀 DNA 올리고머로부터 측정된 형광에 관한 결과(실시예 12).
도면의 해석.
도 4, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 11a, 12a, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 21b, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및 28에 도시된 구조는, 도 1, 2 및 3a에 도시된 구조와 일관되게 해석되어야 한다. 따라서, 이러한 도면에서, 이중 가닥 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자의 각 좌측 가닥은 지지 가닥(도 1, 2 및 3a에서 가닥 "a"에 상응함)에 관한 것이고; 이중 가닥 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자의 각 우측 가닥은 합성 가닥(도 1, 2 및 3a에서 가닥 "b"에 상응함)에 관한 것이며; 모든 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자는 프라이머 가닥 부분(도 1, 2 및 3a에서 가닥 "b"의 실선 및 점선에 상응함)을 포함하는 가닥에 해당하는 하부 합성 가닥을 포함하고; 특정 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어 도 8a 및 16a에서)는, 신규한 뉴클레오티드의 혼입 전, 헬퍼 가닥 부분(도 1, 2 및 3a에서 가닥 "b"의 파선에 상응함)을 포함하는 가닥에 해당하는 상부 합성 가닥을 갖는 것으로 제시되어 있고; 특정 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어 도 5a, 6a 및 7a에서)는 헬퍼 가닥 부분이 없는 것으로(도 1, 2 및 3a에서 가닥 "b"의 파선의 부재에 상응함) 제시되어 있으며; 특정 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어 도 26, 27 및 28에서)는, 라이게이션 단계 후, 헬퍼 가닥 부분(도 1, 2 및 3a에서 가닥 "b"의 파선에 상응함)을 포함하는 가닥에 해당하는 상부 합성 가닥을 갖는 것으로 제시되어 있으며, 여기서 헬퍼 가닥에 부분은 다음 합성 사이클에서 신규한 뉴클레오티드의 혼입 전 제거된다.
또한, 이러한 도면에서, 관련되는 경우, 각각의 신규한 뉴클레오티드는 rtNTP로 표지되고, 작은 원형 구조(도 1, 2 및 3a에서 작은 삼각형 구조에 상응함)로서 도시된 가역적 종결자기와 함께 혼입되는 것으로 나타나 있으며, 말단 포스페이트기는 "p"로 표지되어 있고, 작은 타원형 구조로 도시되어 있다.
도 4c, 4d, 4g, 4h, 15a, 16a, 17a, 18a, 20a, 21a, 21b 및 22는, 헬퍼 가닥 부분을 포함하는 가닥 및 지지 가닥이 헤어핀 루프에 의해 연결된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자를 나타낸다. 도 4b, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 21b, 22, 26, 27 및 28은, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 가닥 및 지지 가닥이 헤어핀 루프에 의해 연결된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자를 나타낸다.
도 20a 및 21a와 같은 도면은, 헬퍼 가닥 부분을 포함하는 가닥(상부 우측 가닥) 및 지지 가닥(상부 좌측 가닥)은 헤어핀 루프에 의해 연결되어 있고, 동일한 분자에서, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 가닥(하부 우측 가닥) 및 지지 가닥(하부 좌측 가닥)은 헤어핀 루프에 의해 연결된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자를 나타낸다.
본 발명은 소정의 뉴클레오티드 서열에 따른 폴리뉴클레오티드 분자의 신규한 합성 방법을 제공한다. 합성된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 DNA이고, 바람직하게는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자이다. 본 발명은 기존 합성 방법과 비교하여 이점을 제공한다. 예를 들어, 모든 반응 단계는 온건한 pH의 수성 조건에서 수행될 수 있고, 광범위한 보호 및 탈보호 절차는 요구되지 않는다. 나아가, 합성은 소정의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 기존 주형 가닥의 카피에 의존하지 않는다.
본 발명자들은 본원에 정의된 바와 같은 범용 뉴클레오티드의 사용이, 합성의 각 사이클 동안 새롭게 혼입된 뉴클레오티드가 그의 목적하는 파트너 뉴클레오티드와 정확하게 쌍을 이룰 수 있게 한다고 판단하였다. 범용 뉴클레오티드의 사용은 신규한 합성 영역 내 절단 부위의 생성을 가능하게 하며, 이는 절단 및 합성의 반복 사이클을 용이하게 한다. 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 및 이와 같이 합성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 보다 큰 단편을 어셈블리하기 위한 다목적 방법을 제공한다.
본 발명의 합성 방법의 특정 구현예는 5가지 방법 버전을 포함하는 예시적인 방법을 참조로 본원에 보다 일반적으로 상세하게 기재될 것이다. 방법 버전은 또한 실시예에 특히 상세하게 기재되어 있다. 5가지 방법 버전을 포함하는 모든 예시적인 방법은 본 발명을 제한하고자 하는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 발명은, 각 사이클에서, 제1 폴리뉴클레오티드 가닥이 소정의 서열의 뉴클레오티드의 혼입에 의해 연장된 후, 제1 가닥에 하이브리드화된 제2 폴리뉴클레오티드 가닥이 뉴클레오티드의 혼입에 의해 연장되어 제1 가닥의 혼입된 뉴클레오티드와 뉴클레오티드 쌍을 형성하는 합성의 사이클을 수행하는 것을 포함하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관내 합성 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 DNA의 합성을 위한 것이다. 본원에 기재된 특정 방법은 본 발명의 구현예로서 제공된다.
반응 조건
하나의 양태에서, 본 발명은 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 합성 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 합성 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 합성은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 하이브리드화에 적합한 조건 하에서 수행된다. 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 뉴클레오티드와 상보적 뉴클레오티드의 하이브리드화를 가능하게 하는 조건 하에서 시약과 접촉된다. 하이브리드화를 가능하게 하는 조건은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press]; 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York(1995)] 참조).
폴리뉴클레오티드에의 뉴클레오티드의 혼입은 적합한 조건 하에서, 예를 들어 적합한 온도(예를 들어, 약 65℃)에서 적합한 완충액의 존재 하에서, 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 3'-O-변형된-dNTP)를 혼입시키기 위해 폴리머라아제(예를 들어, Therminator IX 폴리머라아제)를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 완충액은 2 mM Tris-HCl, 1 mM(NH4)2SO4 , 1 mM KCl, 0.2 mM MgSO4 및 0.01% Triton® X-100을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 절단은 적합한 조건 하에서, 예를 들어 효소에 적합한 온도(예를 들어, 37℃)에서 적합한 완충액의 존재 하에서, 폴리뉴클레오티드 절단 효소(예를 들어, 엔도뉴클레아제)를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 완충액은 5 mM 포타슘 아세테이트, 2 mM Tris-아세테이트, 1 mM 마그네슘 아세테이트 및 0.1 mM DTT를 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 라이게이션은 적합한 조건 하에서, 예를 들어 효소에 적합한 온도(예를 들어, 실온)에서 적합한 완충액의 존재 하에서, 리가아제(예를 들어, T4 DNA 리가아제)를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 완충액은 4.4 mM Tris-HCl, 7mM MgCl2, 0.7mM 디티오트레이톨, 0.7mM ATP, 5% 폴리에틸렌 글리콜(PEG6000)을 포함할 수 있다.
탈보호는 적합한 조건 하에서, 예를 들어 환원제(예를 들어, TCEP)를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 탈보호는 Tris 완충액(예를 들어, 300mM의 최종 농도로) 중에서 TCEP를 사용하여 수행될 수 있다.
앵커 폴리뉴클레오티드 및 스캐폴드 폴리뉴클레오티드
소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 표면에 부착될 수 있거나 부착될 가능성이 있는, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로서 본원에서 지칭되는 기존 폴리뉴클레오티드에의, 소정의 뉴클레오티드의 혼입에 의한, 본 발명의 방법에 의해 합성된다. 본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 새롭게 합성된 폴리뉴클레오티드를 수용하기 위한 지지 구조를 형성하며, 본원의 설명으로부터 명백할 수 있는 바와 같이, 종래의 합성 방법과 같이 카피되는 기존 주형 가닥을 포함하지 않는다. 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드가 표면에 부착되는 경우, 앵커 폴리뉴클레오티드로서 지칭될 수 있다. 앵커 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 표면에 부착시키는 표면 부착 화학은, 본원에 보다 상세하게 기재된다.
하나의 구현예에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 상보적 지지 가닥에 하이브리드화된 합성 가닥을 포함한다. 합성 가닥은 단일 가닥 절단부 또는 "닉(nick)"에 의해 분리된 폴리머라아제 프라이머 가닥 부분 및 선택적으로 헬퍼 가닥 부분을 포함한다(예를 들어 도 1 내지 도 3a). 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분 및 헬퍼 가닥 부분은 모두 상보적 지지 가닥에 하이브리드화되어 제공될 수 있다. 대안적으로, 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분은 별도로 제공될 수 있다. 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분이 먼저 제공되고, 이어서 지지 가닥 및 헬퍼 가닥이 제공될 수 있다. 대안적으로, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 구성요소는 별도로 제공될 수 있다. 예를 들어, 지지 가닥이 먼저 제공되고, 이어서 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분, 다음에 헬퍼 가닥이 제공될 수 있다. 지지 가닥이 먼저 제공되고, 이어서 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분, 다음에 프라이머 가닥이 제공될 수 있다. 헬퍼 가닥 부분은 절단 단계 전에 제공될 수 있다. 헬퍼 가닥 부분은 신규한 소정의 뉴클레오티드의 혼입 전 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 생략될 수 있다. 헬퍼 가닥 부분은 신규한 소정의 뉴클레오티드의 혼입 전, 예를 들어 본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이 변성에 의해, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거될 수 있다. 적합한 조건에서 구성요소의 혼합 시, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 개별 구성요소의 하이브리드화 시에 형성된다.
신규한 합성은 단일 가닥 절단부 부위에서 폴리머라아제에 의해 개시된다. 따라서, 폴리머라아제는 단일 가닥 절단부 부위에서 프라이머 가닥 부분의 말단 뉴클레오티드를 연장시키는 작용을 할 것이다. 합성 가닥의 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분과 프라이머 가닥 부분 사이의 단일 가닥 절단부 또는 "닉"은, 전형적으로 합성 가닥의 양쪽 부분을 지지 가닥과의 하이브리드화 후 정렬되는 개별 분자로서 제공함으로써 달성된다. 단일 가닥 절단부 부위에서 헬퍼 가닥의(5') 말단 뉴클레오티드는 전형적으로 포스페이트기가 결여된 것으로 제공된다. 말단 포스페이트기의 결여는, 헬퍼 가닥 부분의 말단 뉴클레오티드가 단일 가닥 절단부 부위에서 프라이머 가닥 부분의 말단 뉴클레오티드와 라이게이션되는 것을 방지함으로써, 단일 가닥 절단부를 유지한다. 단일 가닥 절단부의 생성 및 유지는 다른 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 헬퍼 가닥 부분의 말단 뉴클레오티드에는 프라이머 가닥 부분과의 라이게이션을 방지하는 적합한 차단기가 제공될 수 있다. 바람직하게는, 헬퍼 가닥은 단일 가닥 절단부 부위에서 말단 포스페이트기가 결여된 것으로 제공된다.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 인접한 말단에 연결되지 않은 지지 및 합성 가닥이 각각 제공될 수 있다. 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 인접한 말단에서, 예컨대 헤어핀 루프를 통해, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 양쪽 말단에 연결된 지지 및 합성 가닥이 모두 제공될 수 있다. 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 한쪽 말단에서 헤어핀 루프를 통해, 또는 임의의 다른 적합한 링커를 통해 인접한 말단에서 연결된 지지체 및 합성 가닥이 모두 제공될 수 있다.
헤어핀을 갖거나 갖지 않는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는, 본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이 고체 지지체 또는 표면에 고정될 수 있다(도 4 참조).
용어 "헤어핀" 또는 "헤어핀 루프"는, 현재 기술 분야에서 통상적으로 사용된다. 용어 "헤어핀 루프"는 또한 "스템 루프(stem loop)"로서 지칭된다. 이러한 용어는 폴리뉴클레오티드 분자의 하나의 가닥이 분자내 염기 짝짓기로 인해 동일한 가닥의 또 다른 섹션과 하이브리드화되는 경우 형성되는, 짝지어지지 않은 핵염기의 루프를 포함하는 폴리뉴클레오티드 내 2차 구조 영역을 나타낸다. 따라서, 헤어핀은 U자형 구조와 유사할 수 있다. 이러한 구조의 예는 도 4에 제시되어 있다.
뉴클레오티드 및 범용 뉴클레오티드
본원에 기재된 임의의 방법에 의해 합성 폴리뉴클레오티드에 혼입될 수 있는 뉴클레오티드는, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 및 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 및 변형된 뉴클레오티드는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 합성 폴리뉴클레오티드에 혼입될 수 있다.
본원에 정의 및 기재된 본 발명의 임의의 합성 방법에서, 뉴클레오티드는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 가역적 종결자기를 포함하는 뉴클레오티드로서 혼입된다.
뉴클레오티드는 천연 핵염기 또는 비(非)천연 핵염기를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 천연 핵염기, 당 및 포스페이트기를 함유할 수 있다. 천연 핵염기는 아데노신(A), 티민(T), 우라실(U), 구아닌(G) 및 시토신(C)을 포함한다. 뉴클레오티드의 구성요소 중 하나는 추가로 변형될 수 있다.
뉴클레오티드 유사체는 염기, 당 또는 포스페이트 또는 이들의 조합에서 구조적으로 변형되고, 올리고뉴클레오티드 가닥에의 혼입을 위한 기질로서 폴리머라아제 효소에 여전히 허용 가능한 뉴클레오티드이다.
비천연 핵염기는 표적 폴리뉴클레오티드 내 모든 핵염기에 어느 정도 결합, 예를 들어 수소 결합하는 것일 수 있다. 비천연 핵염기는 바람직하게는 뉴클레오시드 아데노신(A), 티민(T), 우라실(U), 구아닌(G) 및 시토신(C)을 포함하는 뉴클레오티드에 어느 정도 결합, 예를 들어 수소 결합하는 것일 수 있다.
비천연 뉴클레오티드는 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA) 및 비잠금 핵산(UNA), 브릿지된 핵산(BNA) 또는 모르폴리노, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트일 수 있다.
비천연 뉴클레오티드는 변형된 당 및/또는 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 변형된 당은, 비제한적으로, 2'-O-메틸리보오스 당을 포함한다. 변형된 핵염기는, 비제한적으로, 메틸화된 핵염기를 포함한다. 핵염기의 메틸화는 마이크로RNA와 같은 다른 요소 및 유전자의 발현을 변경시키는 능력을 갖는 후생적 변형의 인식된 형태이다. 핵염기의 메틸화는 CpG 모티프로 이루어지는 디뉴클레오티드가 대부분인 개별 유전자좌에서 일어나지만, CHH 모티프(여기서, H는 A, C 또는 T임)에서 일어날 수도 있다. 전형적으로, 메틸화 동안, 메틸기는 시토신 염기의 5번째 탄소에 첨가되어 메틸시토신을 생성한다. 따라서, 변형된 핵염기는, 비제한적으로, 5-메틸시토신을 포함한다.
소정의 서열의 뉴클레오티드는 파트너 뉴클레오티드 반대편에 혼입되어, 뉴클레오티드 쌍을 형성할 수 있다. 파트너 뉴클레오티드는 상보적 뉴클레오티드일 수 있다. 상보적 뉴클레오티드는 소정의 서열의 뉴클레오티드에 어느 정도 결합, 예를 들어 수소 결합할 수 있는 뉴클레오티드이다.
전형적으로, 소정의 서열의 뉴클레오티드는 자연적으로 상보적인 파트너 핵염기 반대편의 폴리뉴클레오티드에 혼입된다. 따라서, 아데노신은 티민 반대편에 혼입될 수 있으며, 그 반대의 경우도 가능하다. 구아닌은 시토신 반대편에 혼입될 수 있으며, 그 반대의 경우도 가능하다. 대안적으로, 소정의 서열의 뉴클레오티드는 이에 어느 정도 결합, 예를 들어 수소 결합하게 되는, 파트너 핵염기 반대편에 혼입될 수 있다.
대안적으로, 파트너 뉴클레오티드는 비(非)상보적 뉴클레오티드일 수 있다. 비상보적 뉴클레오티드는 소정의 서열의 뉴클레오티드에 결합, 예를 들어 수소 결합할 수 없는 뉴클레오티드이다. 따라서, 합성된 폴리뉴클레오티드 전체가 이중 가닥이고, 여기서 제1 가닥이 하이브리드화에 의해 제2 가닥에 부착되는 경우, 소정의 서열의 뉴클레오티드는 파트너 뉴클레오티드 반대편에 혼입되어 미스매치(mismatch)를 형성할 수 있다.
용어 "반대편(opposite)"은, 핵산 생화학의 분야에서 통상적으로 사용되는 용어, 및 특히 전형적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 짝짓기와 관련된 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 서열 5'-ACGA-3'의 제1 핵산 분자는 서열 5'-TCGT-3'의 제2 핵산 분자와 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있으며, 여기서 제1 분자의 G는 제2 분자의 C 반대편에 위치할 것이고, 이와 수소 결합할 것이다. 서열 5'-ATGA-3'의 제1 핵산 분자는 서열 5'-TCGT-3'의 제2 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있으며, 여기서 제1 분자의 T는 제2 분자의 G와 미스매치되지만, 여전히 그와 반대편에 위치하며, 파트너 뉴클레오티드로서 작용할 것이다. 이러한 원리는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 파트너 쌍을 포함하여, 본원에 개시된 임의의 뉴클레오티드 파트너 쌍 관계에 적용된다.
본원에 기재된 모든 방법에서, 지지 가닥에서의 위치 및 합성 가닥에서의 반대편 위치에는, 위치 번호 "n"이 부여된다. 이러한 위치는, 임의의 주어진 합성 사이클에서, 단계 (2)에서의 혼입 시, 소정의 서열의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서의 뉴클레오티드의 위치를 나타낸다. 이는 또한, 단계 (6)에서 다음 합성 사이클에서의 혼입 시, 소정의 서열의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드에 의해 점유되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인, 단계 (4)에서 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서의 위치를 나타낸다. 지지 가닥에서의 위치 및 합성 가닥에서의 반대편 위치는 모두 위치 n으로 나타낼 수 있다. 참고로, 도 1, 2, 3a, 3b 및 3c를 참조한다.
범용 뉴클레오티드의 배치와 대하여, 소정의 서열의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드 및 그의 파트너의 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에서의 위치 지정에 관한 용어 "에 근접하여"는, 본 발명의 맥락에서 용어의 일반적인 사용과 관련하여 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 기재된 방법 버전 1과 같은 방법에서, 소정의 서열의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드(위치 "n"을 점유함)가 초기에 범용 뉴클레오티드를 그의 파트너(따라서, 또한 위치 n을 점유함)로서 갖는 경우, 새롭게 혼입된 뉴클레오티드는 상기 기재된 바와 같이 범용 뉴클레오티드 "반대편"에 위치한다. 이는, 범용 뉴클레오티드에 근접하여 위치한 새롭게 혼입된 뉴클레오티드의 하나의 예이다. 대안적으로, 소정의 서열의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드(위치 n을 점유함)는 초기에 상이한 뉴클레오티드를 그의 파트너로서 가질 수 있으며, 범용 뉴클레오티드는 본원에 기재된 방법 버전 2에서와 같이, 위치 n+1과 같은 상이한 위치를 점유할 수 있다. 이러한 경우, 새롭게 혼입된 뉴클레오티드는 범용 뉴클레오티드 반대편이 아닌, 범용 뉴클레오티드에 근접하여 위치한다. 대안적인 방법에서, 범용 뉴클레오티드는 위치 n을 점차적으로 하나의 위치만큼 제거하여, 예를 들어 n+2, n+3, n+3+x(여기서, x는 1 내지 10 또는 그 이상의 정수임) 등의 위치를 점유할 수 있다. 상기와 같은 대안적인 방법에서, 새롭게 혼입된 뉴클레오티드는, 범용 뉴클레오티드에 의해 한정된 절단 부위가 생성될 수 있고, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 후속 라이게이션을 가능하게 하는 본원에 기재된 돌출 구조가 절단 시 생성될 수 있는 한, 여전히 범용 뉴클레오티드에 근접하여 위치한다.
뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체는 바람직하게는 뉴클레오시드 트리포스페이트로서 제공될 수 있다. 따라서, DNA 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위한 본 발명의 임의의 방법에서, 뉴클레오티드는, 예를 들어 DNA 폴리머라아제 효소의 작용을 통해 2'-데옥시리보뉴클레오시드-5'-O-트리포스페이트(dNTP)로부터 혼입될 수 있다. RNA 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위한 본 발명의 임의의 방법에서, 뉴클레오티드는, 예를 들어 RNA 폴리머라아제 효소의 작용을 통해 리보뉴클레오시드-5'-O-트리포스페이트(NTP)로부터 혼입될 수 있다. 트리포스페이트는 테트라포스페이트 또는 펜타포스페이트(일반적으로 올리고포스페이트)로 치환될 수 있다. 이러한 올리고포스페이트는 다른 알킬 또는 아실기로 치환될 수 있다:
Figure pct00001
본 발명의 방법은 범용 뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 범용 뉴클레오티드는 합성의 각 사이클 동안 새롭게 혼입된 뉴클레오티드가 그의 목적하는 파트너 뉴클레오티드와 정확하게 쌍을 이루는 것을 용이하게 하기 위해, 스캐폴드 분자의 지지 가닥의 구성요소로서 사용될 수 있다. 범용 뉴클레오티드는 또한 목적하는 경우, 소정의 뉴클레오티드 서열의 구성요소로서 합성 가닥에 혼입될 수 있다.
범용 뉴클레오티드는, 핵염기가 소정의 서열의 임의의 뉴클레오티드의 핵염기에 어느 정도 결합, 예를 들어 수소 결합하게 되는 뉴클레오티드이다. 범용 뉴클레오티드는, 바람직하게는 뉴클레오시드 아데노신(A), 티민(T), 우라실(U), 구아닌(G) 및 시토신(C)을 포함하는 뉴클레오티드에 어느 정도 결합, 예를 들어 수소 결합하게 되는 뉴클레오티드이다. 범용 뉴클레오티드는 다른 것들보다 일부 뉴클레오티드에 보다 강하게 결합할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오시드, 2'-데옥시이노신을 포함하는 범용 뉴클레오티드(I)는, I-C > I-A > I-G 대략 = I-T의 짝짓기 우선 순위를 나타낼 것이다.
가능한 범용 뉴클레오티드의 예는, 이노신 또는 니트로인돌이다. 범용 뉴클레오티드는 바람직하게는 하기 핵염기 중 하나를 포함한다: 히포잔틴, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌, 6-니트로인돌, 3-니트로피롤, 니트로이미다졸, 4-니트로피라졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 5-니트로인다졸, 4-아미노벤즈이미다졸 또는 페닐(C6-방향족 고리). 범용 뉴클레오티드는 더욱 바람직하게는 하기 뉴클레오시드 중 하나를 포함한다: 2'-데옥시이노신, 이노신, 7-데아자-2'-데옥시이노신, 7-데아자-이노신, 2-아자-데옥시이노신, 2-아자-이노신, 4-니트로인돌 2'-데옥시리보뉴클레오시드, 4-니트로인돌 리보뉴클레오시드, 5-니트로인돌 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 5-니트로인돌 리보뉴클레오시드, 6-니트로인돌 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 6-니트로인돌 리보뉴클레오시드, 3-니트로피롤 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 3-니트로피롤 리보뉴클레오시드, 히포잔틴의 비(非)시클릭 당 유사체, 니트로이미다졸 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 니트로이미다졸 리보뉴클레오시드, 4-니트로피라졸 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 4-니트로피라졸 리보뉴클레오시드, 4-니트로벤즈이미다졸 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 4-니트로벤즈이미다졸 리보뉴클레오시드, 5-니트로인다졸 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 5-니트로인다졸 리보뉴클레오시드, 4-아미노벤즈이미다졸 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 4-아미노벤즈이미다졸 리보뉴클레오시드, 페닐 C-리보뉴클레오시드 또는 페닐 C-2'-데옥시리보실 뉴클레오시드.
범용 염기의 일부 예가 하기에 제시된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
광- 및 효소적으로-절단 가능한 염기를 비롯한, 절단 가능한 염기를 포함하는 범용 뉴클레오티드가 또한 사용될 수 있으며, 이들의 일부 예가 하기에 제시된다.
광절단 가능한 염기:
Figure pct00006
엔도뉴클레아제 III에 의해 절단 가능한 염기 유사체:
Figure pct00007
Figure pct00008
포름아미도피리미딘 DNA 글리코실라아제(Fpg)에 의해 절단 가능한 염기 유사체:
Figure pct00009
Figure pct00010
8-옥소구아닌 DNA 글리코실라아제(hOGG1)에 의해 절단 가능한 염기 유사체:
Figure pct00011
hNeil1에 의해 절단 가능한 염기 유사체:
Figure pct00012
티민 DNA 글리코실라아제(TDG)에 의해 절단 가능한 염기 유사체:
Figure pct00013
인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라아제(hAAG)에 의해 절단 가능한 염기 유사체:
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
우라실 DNA 글리코실라아제에 의해 절단 가능한 염기:
Figure pct00017
인간 단일-가닥-선택적 단관능성 우라실-DNA 글리코실라아제(SMUG1)에 의해 절단 가능한 염기:
Figure pct00018
5-메틸시토신 DNA 글리코실라아제(ROS1)에 의해 절단 가능한 염기:
Figure pct00019
(문헌[S. S. David, S. D. Williams Chemical reviews 1998, 98, 1221-1262] 및 문헌[M. I. Ponferrada-Marin, T. Roldan-Arjona, R. R. Ariza, Nucleic Acids Res 2009 ,37, 4264-4274] 참조).
스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 방법에서, 범용 뉴클레오티드는 가장 바람직하게는 2'-데옥시이노신을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 합성 방법을 사용하여 혼입될 수 있는 후생적 염기의 예에는, 하기가 포함된다:
Figure pct00020
본원에 기재된 임의의 합성 방법을 사용하여 혼입될 수 있는 변형된 염기의 예에는, 하기가 포함된다:
Figure pct00021
본원에 기재된 임의의 합성 방법을 사용하여 혼입될 수 있는 할로겐화 염기의 예에는, 하기가 포함된다:
Figure pct00022
식 중, R1은 F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, 형광 표지, 아미노프로파르길, 아미노알릴임.
본원에 기재된 임의의 합성 방법을 사용하여 혼입될 수 있는, 예를 들어 부착/링커 화학에서 유용할 수 있는 아미노-변형된 염기의 예에는, 하기가 포함된다:
Figure pct00023
Figure pct00024
여기서, 염기는 알킨 또는 알켄 링커를 갖는 A, T, G 또는 C임.
본원에 기재된 임의의 합성 방법을 사용하여 혼입될 수 있는, 예를 들어 클릭(click) 화학에 유용할 수 있는 변형된 염기의 예에는, 하기가 포함된다:
Figure pct00025
본원에 기재된 임의의 합성 방법을 사용하여 혼입될 수 있는 비오틴-변형된 염기의 예에는, 하기가 포함된다:
Figure pct00026
여기서, 염기는 알킨 또는 알켄 링커를 갖는 A, T, G 또는 C임.
본원에 기재된 임의의 합성 방법을 사용하여 혼입될 수 있는, 형광단 및 소광제(quencher)를 갖는 염기의 예에는, 하기가 포함된다:
Figure pct00027
뉴클레오티드 혼입 효소
임의의 적합한 효소가 본원에 기재된 방법을 사용하여 소정의 뉴클레오티드를 혼입시키는 데 이용될 수 있다. 따라서, 폴리머라아제의 사용을 언급하는 본원에 정의 및 기재된 모든 방법에서, 폴리머라아제는 본 발명의 방법의 맥락에서 폴리머라아제와 동일한 기능을 수행할 수 있는 또 다른 효소로 치환될 수 있다.
바람직하게는, 폴리머라아제 효소는 본원에 기재된 방법에 이용될 수 있다. 폴리머라아제 효소는 변형된 뉴클레오티드, 특히 본원에 기재된 바와 같이 부착된 가역적 종결자기를 갖는 뉴클레오티드를 혼입시키는 능력을 기반으로 선택될 수 있다. 본원에 기재된 예시적인 방법에서, DNA에 작용하는 모든 폴리머라아제는 3' → 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않아야 한다. 바람직하게는, 폴리머라아제는 가닥 변위 활성을 가질 것이다.
따라서, 바람직하게는, 폴리머라아제는 변형되지 않은 폴리머라아제와 비교하여 가역적 종결자기를 포함하는 뉴클레오티드를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 변형된 폴리머라아제이다. 폴리머라아제는, 더욱 바람직하게는 써모코커스 종 9°N, 바람직하게는 종 9°N-7로부터의 천연 DNA 폴리머라아제의 유전자 조작된 변이체이다. 변형된 폴리머라아제의 하나의 이러한 예는, New England BioLabs로부터 입수 가능한 Therminator IX DNA 폴리머라아제이다. 이러한 효소는 3'-O-변형된 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는다.
본 발명의 임의의 방법에서 가역적 종결자 dNTP의 혼입에 사용될 수 있는 다른 폴리머라아제의 예는, Deep Vent(exo-), Vent (Exo-), 9oN DNA 폴리머라아제, Therminator DNA 폴리머라아제, Therminator IX DNA 폴리머라아제, Klenow 단편(Exo-), Bst DNA 폴리머라아제, Bsu DNA 폴리머라아제, Sulfolobus DNA 폴리머라아제 I 및Taq 폴리머라아제이다.
본 발명의 임의의 방법에서 가역적 종결자 NTP의 혼입에 사용될 수 있는 다른 폴리머라아제의 예는, T3 RNA 폴리머라아제, T7 RNA 폴리머라아제 및 SP6 RNA 폴리머라아제이다.
가역적 차단기
본원에 정의 및 기재된 모든 방법은 가역적 차단기 또는 가역적 종결자기를 언급한다. 이러한 기는 주어진 합성 사이클에서 효소에 의한 추가 연장을 방지하도록 작용하여, 소정의 서열의 뉴클레오티드만이 합성 가닥을 연장하는 데 제어 가능하게 사용될 수 있고, 따라서 비특이적 뉴클레오티드 혼입이 방지된다. 이러한 효과를 달성하는 임의의 기능은, 본원에 정의 및 기재된 임의의 방법에 사용될 수 있다. 뉴클레오티드에 부착된 가역적 차단기/가역적 종결자기 및 차단해제 단계가, 이러한 효과를 달성하기 위한 바람직한 수단이다. 하지만, 이러한 효과는 적절한 경우 대안적인 수단에 의해 달성될 수 있다.
임의의 적합한 가역적 차단기는 주어진 사이클에서 뉴클레오티드의 혼입 후 효소에 의한 추가 연장을 방지하고, 사이클 당 하나의 뉴클레오티드 혼입으로 제한하기 위해, 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 본 발명의 임의의 방법에서, 가역적 차단기는 바람직하게는 폴리머라아제 효소에 의해 추가 연장을 방지하는 작용을 하는 가역적 종결자기다. 가역적 종결자의 예가 하기에 제공된다.
프로파르길 가역적 종결자:
Figure pct00028
알릴 가역적 종결자:
Figure pct00029
시클로옥텐 가역적 종결자:
Figure pct00030
시아노에틸 가역적 종결자:
Figure pct00031
니트로벤질 가역적 종결자:
Figure pct00032
디술피드 가역적 종결자:
Figure pct00033
아지도메틸 가역적 종결자:
Figure pct00034
아미노알콕시 가역적 종결자:
Figure pct00035
염기에 부착된 부피가 큰 기(bulky group)를 갖는 뉴클레오시드 트리포스페이트는 3'-히드록시기 상의 가역적 종결자기에 대한 대체물로서 작용할 수 있으며, 추가 혼입을 차단할 수 있다. 이러한 기는 천연 뉴클레오티드를 생성하는 TCEP 또는 DTT에 의해 탈보호될 수 있다.
Figure pct00036
본 발명의 임의의 방법에 따라 DNA 폴리뉴클레오티드를 합성하는 경우, 바람직한 변형된 뉴클레오시드는 3'-O-변형된-2'-데옥시리보뉴클레오시드-5'-O-트리포스페이트이다. 본 발명의 임의의 방법에 따라 RNA 폴리뉴클레오티드를 합성하는 경우, 바람직한 변형된 뉴클레오시드는 3'-O-변형된-리보뉴클레오시드-5'-O-트리포스페이트이다.
바람직한 변형된 dNTP는, 3'-O-알릴-dNTP 및 3'-O-아지도메틸-dNTP인 변형된 dNTP이다.
3'-O-알릴-dNTP가 하기에 제시된다.
Figure pct00037
Figure pct00038
3'-O-아지도메틸-dNTP가 하기에 제시된다:
Figure pct00039
Figure pct00040
본원에 기재 및 정의된 본 발명의 방법은 탈보호 또는 차단해제 단계를 언급할 수 있다. 이러한 단계는 효소/폴리머라아제에 의한 추가 연장을 억제하기 위해, 임의의 적합한 수단에 의해, 또는 다르게는 차단/종결자기의 기능을 역전시킴으로써 가역적 차단기(예를 들어 가역적 종결자기)를 제거하는 것을 포함한다.
임의의 적합한 시약이 탈보호 단계에서 가역적 종결자기를 제거하는 데 사용될 수 있다.
바람직한 탈보호 시약은 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP)이다. TCEP는 혼입 후 3'-O-알릴-뉴클레오티드(Pd0와 함께) 및 3'-O-아지도메틸-뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 데 사용될 수 있다.
탈보호 시약의 예가 하기에 제공된다:
프로파르길 가역적 종결자:
Pd 촉매 - Na2PdCl4, PdCl2에 의한 처리.
예를 들어 트리페닐포스핀-3,3′,3′′- 트리술폰산 트리소듐 염과 같은 리간드가 사용될 수 있다.
알릴 가역적 종결자:
Pd 촉매 - Na2PdCl4, PdCl2에 의한 처리.
예를 들어 트리페닐포스핀-3,3′,3′′- 트리술폰산 트리소듐 염과 같은 리간드가 사용될 수 있다.
아지도메틸 가역적 종결자:
티올(메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨), 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 - TCEP에 의한 처리.
시아노에틸 가역적 종결자:
플루오라이드 - 암모늄 플루오라이드, 테트라부틸암모늄 플루오라이드(TBAF)에 의한 처리.
니트로벤질 가역적 종결자:
UV 광에의 노출
디술피드 가역적 종결자:
티올(메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨), 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 - TCEP에 의한 처리.
아미노알콕시 가역적 종결자:
니트라이트(NO2 -, HNO2)에 의한 처리, pH = 5.5
가역적 차단기(예를 들어, 가역적 종결자기)는, 혼입 단계로부터의 원치않는 시약이 가역적 종결자기의 제거 후 추가 혼입을 방지하기 위해 제거되는 한, 혼입 단계 직후 및 절단 단계 전에 수행되는 단계에 의해 제거될 수 있다. 가역적 차단기(예를 들어, 가역적 종결자기)는 절단 단계 직후 및 라이게이션 단계 전에 수행되는 단계에 의해 제거될 수 있다. 가역적 차단기(예를 들어, 가역적 종결자기)는 라이게이션 단계 직후 수행되는 단계에 의해 제거될 수 있다.
합성 폴리뉴클레오티드
본원에 기재된 방법에 따라 합성된 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 합성된 폴리뉴클레오티드는 전체적으로 제1 가닥이 하이브리드화에 의해 제2 가닥에 부착된 이중 가닥이다. 제1 가닥이 전부 하이브리드화에 의해 제2 가닥에 부착된다면, 미스매치 및 비(非)하이브리드화 영역은 용인될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 따라 합성된 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로서 보유될 수 있다. 대안적으로, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 2개의 가닥은 분리되어, 소정의 서열을 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 2개의 가닥의 분리를 가능하게 하는 조건(용융)은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press]; 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York(1995)] 참조).
본원에 기재된 방법에 따라 합성된 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 합성 후 증폭될 수 있다. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 임의의 영역이 증폭될 수 있다. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 임의의 영역은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 임의의 영역과 함께 증폭될 수 있다. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 증폭을 가능하게 하는 조건은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press]; 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York(1995)] 참조). 따라서, 본원에 기재된 임의의 합성 방법은, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 이의 임의의 영역이 상기 기재된 바와 같이 증폭되는, 증폭 단계를 추가로 포함할 수 있다. 증폭은 임의의 적합한 방법, 예컨대 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 폴리머라아제 나선형 반응(PSR), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 자기부양 서열 복제(self-sustained sequence replication, 3SR), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification, RCA), 가닥 변위 증폭(SDA), 다중 변위 증폭(MDA), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 헬리카아제 의존 증폭(HDA), 분파 증폭법(ramification amplification method, RAM) 등에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 증폭은 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행된다.
본원에 기재된 방법에 따라 합성된 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 450개 또는 적어도 500개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 100개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍, 약 10 내지 약 200개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍, 약 10개 내지 약 300개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍, 약 10개 내지 약 400개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 및 약 10개 내지 약 500개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 약 1000개 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍, 약 5000개 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 길이, 또는 약 100000개 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 길이까지 일 수 있다.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 절단
라이게이션 전 절단 단계 및 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 존재가 요구되는 방법에서, 절단 단계를 수행하기 위한 시약의 선택은 이용되는 특정한 방법에 따라 달라질 것이다. 절단 부위는 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드의 특정한 위치, 및 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 내 단일- 또는 이중-뉴클레오티드 돌출부에 대한 요건에 의해 한정된다. 따라서, 목적하는 절단 부위의 구성 및 적절한 절단 시약의 선택은, 본원에 기재된 예시적인 방법을 참조로 쉽게 명백해질 수 있는 바와 같이, 본 방법에 이용되는 특정한 화학물질에 따라 달라질 것이다.
변형된 염기를 인식하는DNA 절단 효소의 일부 예가 하기 표에 제시된다:
Figure pct00041
Figure pct00042
라이게이션 폴리뉴클레오티드
절단 후 라이게이션 단계 및 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 존재가 요구되는 방법에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 구성 및 구조의 선택 또한 이용되는 특정 방법에 따라 달라질 것이다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 지지 가닥 및 본원에 기재된 바와 같은 헬퍼 가닥을 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드에 사용되는 지지 가닥 및 헬퍼 가닥은 초기 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 작제물에 사용되는 것과 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션 말단의 지지 가닥의 단일- 또는 이중-뉴클레오티드 돌출부의 요건은, 이용되는 방법에 따라 달라질 것이다. 적절한 구조체가 본원에 기재된 예시적인 방법을 참조로 용이하게 달성될 수 있다.
라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션 말단에는 전형적으로 돌출부에 인접한 헬퍼 가닥에 비(非)포스포릴화 말단 뉴클레오티드가 제공된다. 이는 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분에 대한 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분의 라이게이션을 방지하여, 합성 가닥에 단일 가닥 절단부를 유지한다. 합성 가닥에서의 라이게이션을 방지하기 위한 대안적인 수단이 이용될 수 있다. 예를 들어, 차단 모이어티가 헬퍼 가닥에서 말단 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 나아가, 헬퍼 가닥은 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 다음 합성 사이클에서 다음 소정의 뉴클레오티드의 혼입 전, 예를 들어 변성에 의해 스캐폴드 분자로부터 제거될 수 있다.
라이게이션
라이게이션 단계를 포함하는 본 발명의 방법에서, 라이게이션은 임의의 적합한 수단을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직하게는, 라이게이션 단계는 리가아제 효소에 수행될 것이다. 리가아제는 단일 염기 돌출 기질에 대한 향상된 활성을 갖는 변형된 리가아제일 수 있다. 리가아제는 T3 DNA 리가아제 또는T4 DNA 리가아제일 수 있다. 리가아제는 블런트 TA 리가아제일 수 있다. 예를 들어, 블런트 TA 리가아제는 New England BioLabs(NEB)로부터 입수 가능하다. 이는, T4 DNA 리가아제, 라이게이션 인핸서(enhancer), 및 특히 블런트 말단 및 단일 염기 돌출 기질 둘 모두의 라이게이션 및 변형을 개선시키기 위해 제형화된 최적화된 반응 완충액의 즉시 사용 가능한 마스터 믹스 용액(ready-to-use master mix solution)이다. 단일 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 라이게이션(결합)을 위한 분자, 효소, 화학물질 및 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
고체상 합성
본 발명의 합성 방법에 따라 제조된 합성 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 고체상 또는 가역적 고체상 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 이러한 기술이 당업계에 공지되어 있으며, 사용될 수 있다. 소정의 서열의 신규한 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 합성을 개시하기 전, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 표면, 예를 들어 유리, 겔-기반 재료와 같은 평면 표면, 또는 비드 또는 관능화된 양자점과 같은 미립자의 표면에 고정될 수 있다. 표면을 포함하는 재료는 그 자체가 기질에 결합될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 폴리아크릴아미드와 같은 겔-기반 재료에 고정될 수 있으며, 여기서 겔-기반 재료는 유리와 같은 지지 기질에 결합된다.
폴리뉴클레오티드는 직접적으로 또는 간접적으로 표면에 고정 또는 테더링될 수 있다. 예를 들어, 이는 화학 결합에 의해 표면에 직접 부착될 수 있다. 이는 하기 기재되는 바와 같은, 예를 들어 SPRI 또는 전기습윤 시스템에서와 같이 미립자 또는 비드의 표면과 같은 중간 표면을 통해 표면에 간접적으로 테더링될 수 있다. 이어서, 새롭게 합성된 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드가 고정되는 동안, 합성 사이클이 개시되고 완료될 수 있다.
이러한 방법에서, 이중 가닥 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 소정의 서열의 제1 뉴클레오티드의 혼입 전 표면에 고정될 수 있다. 따라서, 이러한 고정된 이중 가닥 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 합성 동안 및 후에 소정의 서열의 이중 가닥 폴리 뉴클레오티드를 표면에 테더링하는 앵커로서 작용할 수 있다.
이러한 이중 가닥 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드 중 하나의 가닥만이 분자의 동일한 말단에서 표면에 고정될 수 있다. 대안적으로, 이중 가닥 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 양 가닥이 각각 분자의 동일한 말단에서 표면에 고정될 수 있다. 이중 가닥 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는, 예컨대 신규한 합성의 개시 부위 반대면 말단에 있는 헤어핀 루프를 통해 인접한 말단에 연결된 각각의 가닥이 제공될 수 있으며, 연결된 말단은 표면에 고정될 수 있다(예를 들어, 도 4에 도식적으로 도시된 바와 같음).
본원에 기재된 바와 같은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 소정의 서열의 제1 뉴클레오티드의 혼입 전에 표면에 부착될 수 있다. 따라서, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은 모두, 도 4a 및 도 4c에 도시된 바와 같이 표면에 별도로 부착될 수 있다. 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은, 예를 들어 신규한 합성의 개시 부위 반대면 말단에서 헤어핀 루프를 통해 인접한 말단에 연결될 수 있으며, 연결된 말단은 도 4b 및 도 4d에 도시된 바와 같이 표면에 테더링될 수 있다. 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분 중 어느 것은, 도 4e 내지 도 4h에 도시된 바와 같이, 표면에 별도로 부착될 수 있다. 바람직하게는, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은 표면에 부착된다.
평면 표면 상에서의 고체상 합성
소정의 서열의 신규한 이중 가닥 폴리 뉴클레오티드의 합성을 개시하기 전, 합성 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드가 본원에 기재된 것들을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 합성되고, 표면에 테더링될 수 있다.
사전 형성된 폴리뉴클레오티드는 평면 표면에 부착된 핵산 마이크로어레이를 생성하는 데 통상적으로 이용되는 방법에 의해 표면에 테더링될 수 있다. 예를 들어, 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 생성된 후, 평면 표면 상에 스폿팅 또는 프린팅될 수 있다. 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 접촉 프린팅 기술을 사용하여 표면 상에 침착될 수 있다. 예를 들어, 고체 또는 중공 팁(tip) 또는 핀(pin)이 사전 형성된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 용액에 침지되고, 평면 표면과 접촉될 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드는 마이크로-스탬프 상에 흡착된 후, 물리적 접촉에 의해 평면 표면으로 이송될 수 있다. 비접촉 프린팅 기술에는, 사전 형성된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 나노리터 이하 크기의 미세액적이 잉크젯 및 버블젯 프린팅에서 사용되는 것과 유사한 방법을 사용하여 프린팅 팁으로부터 방출될 수 있는, 열 프린팅 또는 압전 프린팅이 포함된다.
단일 가닥 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 마이크로어레이를 생성하는 데 이용되는 소위 "온-칩(on-chip)" 방법을 사용하여 평면 표면에 직접 합성될 수 있다. 따라서, 이러한 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 사전 형성된 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 고정시키는 부착 부위로서 작용할 수 있다.
단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위한 온-칩 기술은 포토리소그래피 마스크를 통해 유도된 UV 광을 사용하여, 신규한 보호된 뉴클레오티드의 후속 혼입을 가능하게 하는 보호된 뉴클레오티드를 선택적으로 활성화시키는 것을 포함하는, 포토리소그래피를 포함한다. UV-매개 탈보호 및 선결된 뉴클레오티드 커플링의 사이클은 목적하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 제자리 생성을 가능하게 한다. 포토리소그래피 마스크의 사용에 대한 대안으로서, 올리고뉴클레오티드는 목적하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위한 커플링, 산화 및 탈보호의 사이클의 사용, 및 잉크젯 프린팅 기술을 사용한 핵염기의 순차적 침착에 의해 평면 표면 상에 생성될 수 있다(문헌[Kosuri and Church, Nature Methods, 2014, 11, 499-507] 참조).
하기 기재되는 바와 같은 가역적 고정화를 포함하는 방법을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 합성 방법에서, 표면은 임의의 적합한 재료로 제조될 수 있다. 전형적으로, 표면은 규소, 유리 또는 중합체 재료를 포함할 수 있다. 표면은 겔 표면, 예컨대 약 2% 폴리아크릴아미드와 같은 폴리아크릴아미드 표면을 포함하고, N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아미드(BRAPA)를 사용하여 유도된 폴리아크릴아미드 표면을 선택적으로 포함하며, 바람직하게는 유리와 같은 고체 지지체에 결합된 폴리아크릴아미드 표면을 포함할 수 있다.
가역적 고정화
소정의 서열을 갖는 합성 폴리뉴클레오티드는 가역적 고정화를 용이하게 하는 결합 표면 및 구조, 예컨대 미립자 및 비드를 사용하여 본 발명에 따라 합성될 수 있다. 고체상 가역적 고정화(SPRI) 방법 또는 변형된 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이용될 수 있다(예를 들어 문헌[DeAngelis M. M. et al. (1995) Solid-Phase Reversible Immobilization for the Isolation of PCR Products, Nucleic Acids Research, 23(22): 4742-4743] 참조).
표면은 상자성 비드와 같은 미립자 형태로 제공될 수 있다. 상자성 비드는 자기장의 영향 하에서 응집할 수 있다. 예를 들어, 상자성 표면에는, 하기 보다 상세하게 기재되는 바와 같이 적절한 부착 조건에서 핵산을 위한 결합 모이어티로서 작용하는, 화학 기, 예를 들어 카르복시기가 제공될 수 있다. 핵산은 적절한 용리 조건에서 이러한 표면으로부터 용리될 수 있다. 미립자 및 비드의 표면에는 UV-민감성 폴리카르보네이트가 제공될 수 있다. 핵산은 적합한 고정화 완충액의 존재 하에서 활성화된 표면에 결합될 수 있다.
미립자 및 비드는 반응 용액 내에서 자유롭게 이동할 수 있으며, 예를 들어 표면에 에칭된 마이크로웰(microwell) 또는 피트(pit) 내에 비드를 유지함으로써, 가역적으로 고정될 수 있다. 비드는, 예를 들어 비드에 부착된 독특한 핵산 "바코드(barcode)"의 사용 또는 색상 코딩(colour-coding)의 사용에 의해 어레이의 일부로서 편재될 수 있다.
따라서, 소정의 서열의 신규한 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 합성을 개시하기 전, 본 발명에 따른 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 합성된 후, 상기와 같은 결합 표면에 가역적으로 고정될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 합성되는 폴리뉴클레오티드는, 결합 표면에 가역적으로 고정되는 동안, 합성될 수 있다.
미세유체 기술 및 시스템
표면은 유전체 상의 전기습윤 시스템(EWOD)의 일부일 수 있다. EWOD 시스템은 미세액적의 형태로 매우 작은 액체 부피의 미세유체 조작을 용이하게 하는 유전체 코팅된 표면을 제공한다(예를 들어 [Chou, W-L., et al.(2015) Recent Advances in Applications of Droplet Microfluidics, Micromachines, 6: 1249-1271] 참조). 액적 부피는 전기습윤 기술에 의해 프로그램 가능하게 생성, 이동, 분획 및 온-칩 조합될 수 있다. 따라서, 전기습윤 시스템은 합성 동안 및 후에 폴리뉴클레오티드를 가역적으로 고정시키는 대안적인 수단을 제공한다.
소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 EWOD 표면 상에 고정되고, 각 사이클에서 요구되는 단계가 전기습윤 기술에 의해 용이하게 되는, 본원에 기재된 방법에 의해 고체상에서 합성될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호 단계가 요구되는 방법에서, 각 단계뿐만 아니라, 사용된 및 원치않는 시약을 제거하기 위해 임의의 요구되는 세척 단계에 요구되는 시약은, 전기습윤 기술을 통해 전기장의 영향 하에서 수송되는 미세액적의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 합성 방법에 사용될 수 있는 다른 미세유체 플랫폼이 이용 가능하다. 예를 들어, 핵산 조작에 통상적으로 이용되는 에멀젼-기반 미세액적 기술이 사용될 수 있다. 이러한 시스템에서, 미세액적은 2개의 비혼화성 유체, 전형적으로 물 및 오일을 혼합함으로써 생성된 에멀젼으로 형성된다. 에멀젼 미세액적은 미세유체 네트워크에서 프로그램 가능하게 생성, 이동, 분획 및 조합될 수 있다. 히드로겔 시스템이 또한 이용 가능하다. 본원에 기재된 임의의 합성 방법에서, 미세액적은 임의의 적합한 호환 가능한 시스템, 예컨대 상기 기재된 EWOD 시스템 및 다른 미세유체 시스템, 예를 들어 엘라스토머 재료를 포함하는 구성요소를 기반으로 하는 구조를 포함하는 미세유체 시스템으로 조작될 수 있다.
미세액적은, 본원의 합성 방법과 호환 가능한 한, 임의의 적합한 크기일 수 있다. 미세액적 크기는 이용되는 특정한 시스템 및 시스템의 관련 구조에 따라 달라질 것이다. 따라서, 크기는 적절하게 조정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 합성 방법에서, 액적 직경은 약 150nm 내지 약 5mm 범위일 수 있다. 1μM 미만의 액적 직경은 당업계에 공지된 수단에 의해, 예를 들어 [Ganan-Calvo et al. Nature Physics, 2007, 3, pp737-742]에 기재된 바와 같은 모세관 젯 방법을 포함하는 기술에 의해 확인될 수 있다.
표면 부착 화학
올리고뉴클레오티드는 전형적으로 화학적으로 부착될 수 있지만, 이는 또한 친화성 상호작용을 통하는 것과 같은 간접적인 수단에 의해 표면에 부착될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 비오틴으로 관능화되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 코팅된 표면에 결합될 수 있다.
표면(예를 들어 평면 표면), 미립자 및 비드 등에의 폴리뉴클레오티드의 고정화를 위해, 다양한 표면 부착 방법 및 화학이 이용 가능하다. 표면은 부착을 용이하게 하기 위해 관능화 또는 유도체화될 수 있다. 이러한 관능화는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 표면은 폴리히스티딘-태그(헥사히스티딘-태그, 6xHis-태그, His6 태그 또는 His-태그®), Ni-NTA, 스트렙타비딘, 비오틴, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드(예컨대 DNA, RNA, PNA, GNA, TNA 또는 LNA), 카르복실기, 4차 아민기, 티올기, 아지드기, 알킨기, DIBO, 지질, FLAG-태그(FLAG 옥타펩티드), 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 펩티드, 단백질, 항체 또는 항체 단편으로 관능화될 수 있다. 표면은 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합되는 분자 또는 기로 관능화될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 표면에 부착하는 데 적합한 화학의 일부 예가 도 4i 및 도 4j에 제시되어 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥 부분을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는, 하나 이상의 공유 결합을 통해 공통 표면에 테더링될 수 있다. 하나 이상의 공유 결합은 공통 표면 상의 관능기와 스캐폴드 분자 상의 관능기 사이에 형성될 수 있다. 스캐폴드 분자 상의 관능기는, 예를 들어 아민기, 티올기, 티오포스페이트기 또는 티오아미드기일 수 있다. 공통 표면 상의 관능기는 브로모아세틸기일 수 있고, 선택적으로, 브로모아세틸기가 N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아미드(BRAPA)를 사용하여 유도된 폴리아크릴아미드 표면 상에 제공된다.
본 발명의 임의의 방법에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 링커를 통해, 직접적으로 또는 간접적으로, 표면에 부착될 수 있다. 생체 적합성 및 친수성의 성질을 갖는 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다.
링커는 선형 링커 또는 분지형 링커일 수 있다
링커는 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬은 2 내지 약 2000개 이상의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬은 알킬렌기, 예를 들어 C2 내지 약 2000개 이상의 알킬렌기를 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬은 일반식 -(CH2)n-(식 중, n은 2 내지 약 2000 이상임)을 가질 수 있다. 탄화수소 사슬에는 하나 이상의 에스테르기(즉 -C(O)-O-) 또는 하나 이상의 아미드기(즉 -C(O)-N(H)-)가 선택적으로 개재될 수 있다.
하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 임의의 링커가 사용될 수 있다: PEG, 폴리아크릴아미드, 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리-2-메틸-2-옥사졸린(PMOXA), 쯔비티이온성(zwitterionic) 중합체, 예를 들어 폴리(카르복시베타인 메타크릴레이트)(PCBMA), 폴리[N-(3-술포프로필)-N-메타크릴옥시에틸-N,N 디메틸 암모늄 베타인](PSBMA), 글리코폴리머 및 폴리펩티드.
링커는 일반식 -(CH2-CH2-O)n-(식 중, n은 1 내지 약 600 이상임)을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
링커는 일반식 -[(CH2-CH2-O)n-PO2 --O]m-(식 중, n은 1 내지 약 600 이상이고, m은 1 내지 200 또는 그 이상일 수 있음)를 갖는 올리고에틸렌 글리콜-포스페이트 유닛을 포함할 수 있다.
임의의 상기 기재된 링커는 링커의 한쪽 말단에서 본원에 기재된 바와 같은 스캐폴드 분자에, 및 링커의 다른 쪽 말단에서 표면에 대한 공유결합 부착을 제공할 수 있는 제1 관능기에 부착될 수 있다. 제1 관능기는, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같은 아민기, 티올기, 티오포스페이트기 또는 티오아미드기일 수 있다. 표면은 제1 관능기와의 공유 결합을 제공하는 추가의 관능기로 관능화될 수 있다. 추가의 관능기는, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같은 2-브로모아세트아미도기일 수 있다. 선택적으로, 브로모아세틸기가 N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아미드(BRAPA)를 사용하여 유도된 폴리아크릴아미드 표면 상에 제공된다. 표면 상의 추가의 관능기는 브로모아세틸기일 수 있으며, 선택적으로, 브로모아세틸기가 N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아미드(BRAPA)를 사용하여 유도된 폴리아크릴아미드 표면 상에 제공되고, 제1 관능기는, 적절한 경우, 예를 들어 아민기, 티올기, 티오포스페이트기 또는 티오아미드기일 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 부착되는 표면은 겔을 포함할 수 있다. 표면은 약 2% 폴리아크릴아미드와 같은 폴리아크릴아미드 표면, 바람직하게는 유리와 같은 고체 지지체에 결합된 폴리아크릴아미드 표면을 포함한다.
본 발명의 임의의 방법에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 선택적으로, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입된 분지형 뉴클레오티드를 통해 링커에 부착될 수 있다. 임의의 적합한 분지형 뉴클레오티드는 임의의 적합한 호환 가능한 링커와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 합성 사이클을 개시하기 전, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입된 하나 이상의 분지형 뉴클레오티드를 이용하여 합성될 수 있다. 하나 이상의 분지형 뉴클레오티드가 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입되는 정확한 위치, 따라서 링커가 부착될 수 있는 위치는, 달라질 수 있으며, 목적에 따라 선택될 수 있다. 위치는, 예를 들어 지지 가닥 및/또는 합성 가닥의 말단, 또는 예를 들어 헤어핀 루프를 포함하는 구현예에서, 지지 가닥을 합성 가닥에 연결하는 루프 영역일 수 있다.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 동안, 하나 이상의 분지형 뉴클레오티드는 분지형 모이어티의 반응성기를 차단하는 차단기를 갖는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입될 수 있다. 이어서, 차단기는 링커의 분지형 모이어티, 또는 링커가 다중 유닛을 포함하는 경우, 링커의 제1 유닛(분자)에의 커플링 전, 제거(차단해제)될 수 있다.
스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 동안, 하나 이상의 분지형 뉴클레오티드는, 링커의 분지형 모이어티, 또는 링커가 다중 유닛을 포함하는 경우, 링커의 제1 유닛에 커플링하기 위한 후속 "클릭 화학" 반응에서의 사용에 적합한 기를 갖는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입될 수 있다. 이러한 기의 예는 아세틸렌기이다.
일부 비제한적인 예시적인 분지형 뉴클레오티드가 하기에 제시된다.
Figure pct00043
Figure pct00044
링커는 선택적으로, 예를 들어 Sp9 스페이서와 같은 하나 이상의 스페이서 분자(유닛)를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 스페이서 유닛은 분지형 뉴클레오티드에 부착된다.
링커는 제1 스페이서기에 부착된 하나 이상의 추가의 스페이서기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 다수의, 예를 들어 Sp9 스페이서기를 포함할 수 있다. 제1 스페이서기가 분지형 모이어티에 부착된 후, 하나 이상의 추가의 스페이서기가 순차적으로 첨가되어, 그 사이가 포스페이트기로 연결된 다수의 스페이서 유닛을 포함하는 스페이서 사슬을 연장시킨다.
분지형 뉴클레오티드에 부착된 제1 스페이서 유닛, 또는 분지형 뉴클레오티드에 이미 부착된 기존 스페이서 유닛에 부착되는 추가의 스페이서 유닛을 포함할 수 있는 스페이서 유닛(Sp3, Sp9 및 Sp13)의 일부 비제한적인 예가 하기에 제시된다.
Figure pct00045
Figure pct00046
링커는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 유닛을 포함할 수 있다.
링커는 다수의 유닛이 뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 도시된 구조에서, 용어 5''는 분지형 모이어티가 부착되는 뉴클레오티드의 5' 말단과 구별하기 위해 사용되며, 여기서 5'는 당업계에서 통상의 의미를 갖는다. 5''는, 이로부터 링커가 연장될 수 있는 뉴클레오티드 상의 위치를 의미하는 것으로 의도된다. 5'' 위치는 달라질 수 있다. 5'' 위치는 전형적으로 뉴클레오티드의 핵염기 내 위치이다. 핵염기 내 5'' 위치는, 상기 구조에 도시된 바와 같이 목적하는 분지형 모이어티의 성질에 따라 달라질 수 있다.
마이크로어레이
본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드 합성 방법이 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이를 제조하는 데 사용될 수 있다(Trevino, V. et al., Mol. Med. 2007 13, pp527-541). 따라서, 앵커 또는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 표면 상의 다수의 개별적으로 다룰 수 있는 반응 부위에 테더링될 수 있으며, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 마이크로어레이 상에서 제자리 합성될 수 있다.
합성 후, 각 반응 영역에서, 소정의 서열의 폴리뉴클레오티드에는 독특한 서열이 제공될 수 있다. 앵커 또는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 식별을 용이하게 하기 위한 바코드 서열이 제공될 수 있다.
소정의 서열의 폴리뉴클레오티드를 합성하는 방법 외에, 마이크로어레이 제조는 본원에 기재된 기술을 포함하는 본 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 앵커 또는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 것들을 포함하는 공지된 표면 부착 방법 및 화학을 사용하여 표면에 테더링될 수 있다.
소정의 서열의 폴리뉴클레오티드의 합성 후, 테더링되지 않은 말단으로부터 임의의 원치않는 폴리뉴클레오티드 서열을 제거하는 최종 절단 단계가 제공될 수 있다.
소정의 서열의 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 형태로 반응 부위에 제공될 수 있다. 대안적으로, 합성 후, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드가 분리되고, 반응 부위에 단일 가닥 폴리뉴클레오티드가 남도록 하나의 가닥이 제거될 수 있다. 이러한 공정을 용이하게 하기 위해 가닥의 선택적 테더링이 제공될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법에서, 합성 가닥은 표면에 테더링될 수 있고, 지지 가닥은 테더링되지 않을 수 있으며, 그 반대의 경우도 가능하다. 합성 가닥에는 절단 가능하지 않은 링커가 제공될 수 있고, 지지 가닥에는 절단 가능한 링커가 제공될 수 있으며, 그 반대의 경우도 가능하다. 가닥의 분리는 열 처리와 같은 전형적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
합성 폴리뉴클레오티드의 어셈블리
본원에 기재된 방법에 의해 합성되고 본원에 기재된 방법에 의해 선택적으로 증폭된 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 보다 큰 합성 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 하나 이상의 다른 폴리뉴클레오티드와 결합될 수 있다.
다수의 폴리뉴클레오티드의 결합은 당업계에 통상적으로 공지된 기술에 의해 달성될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 합성된 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드는 절단되어, 호환 가능한 말단, 이어서 라이게이션에 의해 함께 결합된 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 절단은 임의의 적합한 수단에 의해 달성될 수 있다. 전형적으로, 제한 효소 절단 부위는 폴리뉴클레오티드에서 생성될 수 있으며, 그 후 제한 효소가 사용되어 절단 단계를 수행함으로써, 임의의 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 합성된 폴리뉴클레오티드를 방출시킬 수 있다. 절단 부위는 앵커/스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 일부로 설계될 수 있다. 대안적으로, 절단 부위는 소정의 뉴클레오티드 서열의 일부로서 새롭게 합성된 폴리뉴클레오티드 내에 생성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 어셈블리는 바람직하게는 고체상 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 합성 후, 제1 폴리뉴클레오티드는 표면 고정화 부위에서 먼 적합한 위치에서 단일 절단에 적용될 수 있다. 따라서, 제1 폴리뉴클레오티드는 표면에 고정된 채로 유지될 것이며, 단일 절단은 또 다른 폴리뉴클레오티드에의 결합에 적합한 말단을 생성할 것이다. 부가적인 폴리뉴클레오티드는 각 말단에서 다른 폴리뉴클레오티드에의 결합을 위한 호환 가능한 말단을 생성하고, 동시에 표면 고정화로부터 부가적인 폴리뉴클레오티드를 방출하기 위해, 2개의 적합한 위치에서 절단에 적용될 수 있다. 부가적인 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드와 호환 가능하게 결합되어, 소정의 서열을 갖고, 또 다른 부가적인 폴리뉴클레오티드에의 결합을 위해 호환 가능한 말단을 갖는 보다 큰 고정된 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 따라서, 사전 선택된 절단된 합성 폴리뉴클레오티드의 결합을 위한 반복 사이클은 훨씬 긴 합성 폴리뉴클레오티드 분자를 생성할 수 있다. 부가적인 폴리뉴클레오티드의 결합 순서는 요구되는 소정의 서열에 의해 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 어셈블리 방법은 1 이상의 Mb 정도의 길이를 갖는 합성 폴리뉴클레오티드 분자의 생성을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 어셈블리 및/또는 합성 방법은 당업계에 공지된 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 전형적으로 액적의 형태로, 매우 적은 부피의 시약을 선택적으로 이동시키고, 분획하고, 어레이의 상이한 위치에서 다른 부피와 조합하는 것을 가능하게 하는 기술 및 장치가 이용 가능하다. 전기습윤 기술, 예컨대 유전체 상의 전기습윤(EWOD)이 상기 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 액적을 조작할 수 있는 본 발명에 이용될 수 있는 적합한 전기습윤 기술 및 시스템은, 예를 들어 US8653832, US8828336, US20140197028 및 US20140202863에 개시되어 있다.
고체상으로부터의 절단은 프라이머 가닥 부분 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분 중 하나 또는 둘 모두에 절단 가능한 링커를 제공함으로써 달성될 수 있다. 절단 가능한 링커는, 예를 들어 UV 절단 가능한 링커일 수 있다.
효소적 절단을 포함하는 절단 방법의 예가 도 22에 제시되어 있다. 개략도는 소정의 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 표면(검은색 다이아몬드 구조를 통해)에 부착된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 상부 및 하부 헤어핀을 포함한다. 각 경우에, 상부 헤어핀은 절단 부위를 한정하기 위해 범용 뉴클레오티드를 이용하는 절단 단계를 사용하여 절단될 수 있다. 하부 헤어핀은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로 조작되거나 또는 소정의 서열의 새롭게 합성된 폴리뉴클레오티드로 조작되는 부위를 통해 제한 엔도뉴클레아제에 의해 제거될 수 있다.
따라서, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 상기 기재된 바와 같이 전기습윤 표면에 고정되는 동안, 합성될 수 있다. 합성된 폴리뉴클레오티드는 전기습윤 표면으로부터 절단되고, 액적의 형태로 전기장의 영향 하에서 이동할 수 있다. 액적은 다른 절단된 합성된 폴리뉴클레오티드와의 라이게이션을 위해 절단된 합성된 폴리뉴클레오티드를 전달할 수 있는, 표면 상의 특정 반응 부위에서 조합될 수 있다. 이어서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 라이게이션에 의해 결합될 수 있다. 이러한 기술을 사용하여, 상이한 폴리뉴클레오티드 집단이 목적하는 소정의 서열에 따라 순서대로 합성 및 부착될 수 있다. 이러한 시스템을 사용하여, 완전 자동화된 폴리뉴클레오티드 합성 및 어셈블리 시스템이 설계될 수 있다. 상기 시스템은 목적하는 서열을 수용하고, 시약을 공급하고, 합성 사이클을 수행하고, 이어서 목적하는 소정의 서열에 따라 목적하는 폴리뉴클레오티드를 어셈블리하도록 프로그램화될 수 있다.
시스템 및 키트
본 발명은 또한 본원에 기재 및 정의된 임의의 합성 방법뿐만 아니라, 본원에 기재 및 정의된 임의의 후속 증폭 및 어셈블리 단계를 수행하기 위한 폴리뉴클레오티드 합성 시스템을 제공한다.
전형적으로, 합성 사이클 반응은 본원에 기재 및 정의된 수단에 의해 표면에 테더링되는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자에의 소정의 서열의 뉴클레오티드의 혼입에 의해 수행될 수 있다. 표면은 본원에 기재 및 정의된 바와 같은 임의의 적합한 표면일 수 있다.
하나의 구현예에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자에 소정의 서열의 뉴클레오티드를 혼입시키는 반응은, 반응 영역 내 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 상에서 임의의 합성 방법을 수행하는 것을 포함한다.
반응 영역은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자가 부착되고, 합성 방법을 수행하기 위한 시약이 전달될 수 있는 적합한 기질의 임의의 영역이다.
하나의 구현예에서, 반응 영역은 시약으로 처리될 수 있는 단일 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 표면의 단일 영역일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 반응 영역은 다수의 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 표면의 단일 영역일 수 있으며, 여기서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자는 서로 격리되어 시약으로 개별적으로 처리될 수 없다. 따라서, 이러한 구현예에서, 반응 영역 내 다수의 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자는 동일한 시약 및 조건에 노출됨으로써, 동일한 또는 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 폴리뉴클레오티드 분자를 유도할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재 및 정의된 임의의 합성 방법을 수행하기 위한 합성 시스템은, 각 반응 영역이 하나 이상의 부착된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하고, 각 반응 영역이 다른 반응 영역과 서로 격리되어 시약으로 개별적으로 처리될 수 있는 다수의 반응 영역을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은, 예를 들어 반응 영역이 기질, 전형적으로 평면 기질 상에 형성되는, 예를 들어 어레이의 형태로 구성될 수 있다.
단일 반응 영역을 포함하거나 다수의 반응 영역을 포함하는 기질을 갖는 시스템은, 예를 들어 EWOD 시스템 또는 미세유체 시스템, 및 시약을 반응 부위에 전달하도록 구성된 시스템 내에 포함될 수 있다. EWOD 및 미세유체 시스템은 본원에 보다 상세하게 기재된다. 예를 들어, EWOD 시스템은 전기적 제어 하에서 반응 부위(들)에 시약을 전달하도록 구성될 수 있다. 예를 들어 엘라스토머 또는 유사한 재료로 형성된 미세가공 구조를 포함하는 미세유체 시스템은, 유체 압력 및/또는 흡입 제어 하에서 또는 기계적 수단에 의해 반응 부위(들)에 시약을 전달하도록 구성될 수 있다. 시약은 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 시약 전달을 위한 도관으로서 작용하는 탄소 나노튜브를 통해 전달될 수 있다. 임의의 적합한 시스템이 고안될 수 있다.
EWOD, 미세유체 및 다른 시스템은 반응 부위에 임의의 다른 목적하는 시약, 예컨대 합성 후 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 절단하기 위한 효소, 및/또는 기질로부터 전체 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 방출시키는 링커를 절단하기 위한 시약 및/또는 합성 후 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 이의 임의의 영역 또는 부분을 증폭시키기 위한 시약, 및/또는 본 발명의 합성 방법에 따라 합성된 작은 폴리뉴클레오티드 분자로부터 보다 큰 폴리뉴클레오티드 분자를 어셈블리하기 위한 시약을 전달하도록 구성될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재 및 정의된 임의의 합성 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 본원에 기재 및 정의된 본 발명의 임의의 합성 및/또는 어셈블리 방법을 수행하기 위한 시약의 임의의 목적하는 조합을 함유할 수 있다. 예를 들어, 키트는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 반응 시약의 임의의 하나 이상의 부피(들), 본원에 기재 및 정의된 합성 사이클의 임의의 하나 이상의 단계에 상응하는 반응 시약의 부피(들), 가역적 차단기 또는 가역적 종결자기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 반응 시약의 부피(들), 합성 후 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 이의 영역 또는 부분을 증폭시키기 위한 반응 시약 부피(들), 본 발명의 합성 방법에 따라 합성된 작은 폴리뉴클레오티드 분자로부터 보다 큰 폴리뉴클레오티드 분자를 어셈블리하기 위한 반응 시약의 부피(들), 합성 후 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 절단하기 위한 반응 시약의 부피(들), 및 기질로부터 전체 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 방출시키기 위해 하나 이상의 링커를 절단하기 위한 반응 시약의 부피(들)을 포함할 수 있다.
예시적인 방법
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 분자를 합성하는 예시적인 방법이, 첨부된 청구항을 포함하여 본원에 기재되어 있다. 하기 설명에서의 참조 부호는 도 1, 도 2, 도 3a, 도 3b 및 도 3c에서의 부호에 해당한다.
하기 기재되는 각각의 예시적인 방법에서, 각 단계에서 기재된 구조는 적절한 경우 참조 부호의 도움으로 특정 도면을 참조로 언급될 수 있다. 하지만, 이러한 참조는 도면에 제시된 구조에 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 관련 구조의 설명은 예시된 바를 포함하여, 그 전체가 본원에 제공된 설명에 해당한다.
5가지 비제한적인 예시적인 방법, 방법 버전 1 내지 5가 하기에 기재된다(예를 들어, 각각 도 1 내지 도 3c 참조). 각각의 이러한 예시적인 방법의 단계 (1)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드(도 1 내지 도 3c 각각의 단계 1에 도시된 구조 참조)는, 상보적 지지 가닥(도 1 내지 도 3c 각각의 단계 1에 도시된 구조에서 "a" 로 표지된 가닥 참조)에 하이브리드화된 합성 가닥(도 1 내지 도 3c 각각의 단계 1에 도시된 구조에서 "b" 로 표지된 가닥 참조)을 포함하는 것으로 제공된다(101, 201, 301, 401, 501).
스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이며, 새롭게 합성된 합성 폴리뉴클레오티드의 영역을 수용하기 위한 지지 구조를 제공한다. 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 절단부 또는 "닉"에 의해 분리된 폴리머라아제 프라이머 가닥 부분(도 1 내지 도 3c 각각의 단계 1에 도시된 구조에서 "b" 로 표지된 가닥의 점선 부분 참조) 및 헬퍼 가닥 부분(도 1 내지 도 3c 각각의 단계 1에 도시된 구조에서 "b" 로 표지된 가닥의 파선 부분 참조)을 포함하는 합성 가닥을 포함한다. 본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 임의의 예시적인 방법 버전 1 내지 5 및 본원에 기재된 이의 변형에서, 헬퍼 가닥은 혼입 단계 (2) 전, 예를 들어 변성에 의해 제거될 수 있다. 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분 및 헬퍼 가닥 부분은 모두 상보적 지지 가닥에 하이브리드화된 것으로 제공된다. 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분은 폴리머라아제 효소에 의한 합성의 개시에서의 사용을 위한 프라이머 서열을 제공한다. 합성은 단일 가닥 절단부 부위에서 개시된다. 따라서, 폴리머라아제는 단일 가닥 절단부 부위에서 프라이머 가닥 부분의 말단 뉴클레오티드를 연장시키는 작용을 할 것이다. 따라서, 이러한 말단 뉴클레오티드는 전형적으로 5' → 3' 방향으로의 연장을 촉진시키는 폴리머라아제 효소에 의한 연장을 가능하게 하도록 프라이머 가닥 부분의 3' 말단을 한정할 것이다. 결과적으로 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 반대편 말단은 전형적으로 5' 말단을 한정할 것이며, 결과적으로 합성 가닥의 5' 말단에 인접한 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드는 전형적으로 지지 가닥의 3' 말단을 한정할 것이다.
단일 가닥 절단부 부위에 위치한 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분의 말단 뉴클레오티드는 전형적으로 헬퍼 가닥 부분의 5' 말단을 한정할 것이며, 결과적으로 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분 반대편 말단은 전형적으로 합성 가닥의 3' 말단을 한정할 것이다.
합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분과 프라이머 가닥 부분 사이의 단일 가닥 절단부 또는 "닉"은, 전형적으로 포스페이트기 없이 헬퍼 가닥의(5') 말단 뉴클레오티드를 제공함으로써 달성된다. 절단부는 전형적으로, (i) 지지 가닥; (ii) 비(非)포스포릴화된(5') 말단 뉴클레오티드를 갖는 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분; 및 (iii) 프라이머 서열을 포함하는 합성 가닥 부분을 포함하는 개별 구성요소로부터 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 어셈블리함으로써 달성된다. 적합한 조건에서 구성요소의 혼합 시, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 개별 구성요소의 하이브리드화 시에 형성된다.
방법의 단계 (2)에서, 소정의 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드는 폴리머라아제의 작용에 의해 합성 가닥에 혼입된다(102, 202, 302, 402, 502). 제1 뉴클레오티드에는 폴리머라아제에 의한 추가 연장을 방지하는 가역적 종결자기(도 1 내지 도 3c 각각의 단계 2에서 혼입된 뉴클레오티드의 작은 삼각형으로서 도시됨)가 제공된다. 따라서, 단계 (2)에서, 단일 뉴클레오티드만이 혼입된다.
임의의 적합한 가역적 종결자기를 포함하는 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 가역적 종결자기를 갖는 바람직한 뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 3'-O-알릴-dNTP 및/또는 3'-O-아지도메틸-dNTP이다.
5가지 방법 각각에서, 범용 뉴클레오티드(도 1 내지 도 3c 각각에 도시된 구조에서 "Un"으로 표지됨)는 소정의 서열의 뉴클레오티드의 혼입을 돕고/돕거나 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 절단(103, 203, 303, 403, 503)을 용이하게 하는 지지 가닥에 제공된다. 범용 뉴클레오티드의 역할은 하기 각 방법의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
합성 방법 버전 1
본 발명의 합성 방법의 제1 예시적인 버전에서, 신규한 뉴클레오티드는 지지 가닥에 위치한 범용 뉴클레오티드 반대편 이중 가닥 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입된다(도 1의 단계 1 및 2(101, 102)). 합성의 각 사이클에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 절단된다(도 1의 단계 3(103)). 새롭게 혼입된 뉴클레오티드를 포함하는 단일 뉴클레오티드 돌출부는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 생성된다(도 1의 하부의 중간에 도시된 구조 참조). 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 라이게이션 폴리뉴클레오티드(도 1의 하부의 좌측에 도시된 구조 참조)의 라이게이션은 파트너 뉴클레오티드를 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입시키고, 새롭게 혼입된 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 것을 가능하게 함으로써(도 1의 단계 4(104)), 합성 사이클을 완료한다.
본 발명의 합성 방법의 제1 예시적인 버전에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 바와 같이 단계 (1)에서 제공된다(101). 이러한 방법에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 단일 가닥 절단부 부위(도 1의 구조에서 "X"로 표지됨)에서 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드 반대편에 위치하며, 그와 쌍을 이룬다(도 1의 단계 1에 도시된 구조 참조).
단계 (2)에서, 소정의 서열의 제1 뉴클레오티드는 이의 혼입 시 범용 뉴클레오티드가 제1 뉴클레오티드와 쌍을 이루도록 범용 뉴클레오티드 반대편에 혼입된다(102). 따라서, 이러한 구성에서, 범용 뉴클레오티드는 도 1에 도시된 바와 같이(단계 3), 합성 가닥의 혼입된 제1 뉴클레오티드에 대하여 단계 (1) 및 (2)의 지지 가닥에서 위치 "n"에 위치한다.
연장 동안, 폴리머라아제는 헬퍼 가닥(존재하는 경우)에 "침입"하고, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드를 대체하는 작용을 할 것이다. 혼입된 제1 뉴클레오티드는 대체된 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드에 의해 이전에 점유된 위치를 점유할 것이다(도 1의 단계 3).
상기 방법의 단계 (3)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 절단 부위에서 절단된다(103). 절단 부위는 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된다. 절단은 제1 뉴클레오티드를 포함하는 돌출 말단을 합성 가닥에 제공하기 위해 지지 가닥을 절단하는 것을 포함한다. 절단은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 이중 가닥 절단부를 생성한다. 이러한 예시적인 방법에서, 합성 가닥에는 이미 단일 가닥 절단부 또는 "닉"이 제공되어 있기 때문에, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 이중 가닥 절단부를 제공하기 위해서는 지지 가닥의 절단만이 필요하다.
이러한 예시적인 방법 버전에서, 절단은 합성 가닥에 지지 가닥이 돌출해 있는 돌출부를 생성한다. 절단 부위에서의 합성 가닥의 돌출 말단은 혼입된 제1 뉴클레오티드인 단일 비(非)하이브리드화된 뉴클레오티드만을 포함한다. 전형적으로, 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에서 지지 가닥의 5' 말단이 돌출해 있는 합성 가닥의 3' 말단을 한정할 것이다(도 1의 하부의 중간에 도시된 구조 참조).
이러한 방법에서, 범용 뉴클레오티드는 절단 단계 전 지지 가닥에서 위치 "n"을 점유한다. 범용 뉴클레오티드가 지지 가닥에서 위치 "n"을 점유할 때 이러한 단일 뉴클레오티드 돌출부를 수득하기 위해, 지지 가닥은 범용 뉴클레오티드에 대하여 특정한 위치에서 절단된다. 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 "n"과 "n-1" 사이에서 절단된다.
"n" 은, 주어진 사이클에서 혼입된 소정의 서열의 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 또는 점유되었던 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치를 의미한다. 따라서, 절단 단계에서, 지지 가닥에서 위치 "n"은, 해당 사이클에서 혼입된 소정의 서열의 뉴클레오티드, 즉 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분의 말단 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치 반대편이다. "n-1"은, 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 또는 점유되었던 위치에 대한, 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치를 의미한다(도 1의 단계 3에 도식적으로 제시된 바와 같은 위치 n-1에서 "z"로 표지된 뉴클레오티드). 따라서, 절단 단계에서, 지지 가닥에서 위치 "n-1" 은, 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치 반대편이다(도 1의 단계 3에 도시됨, 103).
뉴클레오티드 위치 n과 n-1 사이에서 지지 가닥의 절단 시, 범용 뉴클레오티드, 헬퍼 가닥, 및 헬퍼 가닥에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은, 남아있는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거되어(도 1의 하부의 우측에 도시된 구조 참조), 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 지지 가닥이 돌출해 있는 합성 가닥의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 단일 뉴클레오티드 돌출부를 생성한다.
포스페이트기는 돌출 부위에서 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드에 계속 부착되어야 한다(도 1의 하부 중간에 제시된 구조에 도시된 바와 같음). 이는, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 라이게이션 단계에서 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에 라이게이션될 수 있다는 것을 보장한다.
따라서, 방법 버전 1에서, 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥에서 위치 n을 점유하고, 지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n과 n-1 사이에서 절단된다.
바람직하게는, 지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n과 n-1 사이에서 포스포디에스테르 결합(헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로, 범용 뉴클레오티드의 위치에 대한 지지 가닥의 제1 포스포디에스테르 결합)의 절단에 의해 절단된다.
지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n과 n-1 사이에서 포스포디에스테르 결합 중 하나의 에스테르 결합의 절단에 의해 절단될 수 있다.
바람직하게는, 지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n에 대한 제1 에스테르 결합의 절단에 의해 절단된다. 이는 절단 위치에서 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에 말단 포스페이트기를 보유하는 효과를 가질 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 위치 n과 n-1 사이에서의 지지 가닥의 절단은, 효소의 작용에 의해 수행될 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 위치 n과 n-1 사이에서의 지지 가닥의 절단은, 2-단계 공정으로 수행될 수 있다.
제1 절단 단계는 지지 가닥으로부터 범용 뉴클레오티드를 제거하여, 위치 n에 무염기 부위를 형성하는 것을 포함할 수 있고, 제2 절단 단계는 위치 n과 n-1 사이의 무염기 부위에서 지지 가닥을 절단하는 것을 포함할 수 있다.
지지 가닥에서 위치 n을 점유하는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 지지 가닥을 절단하는 하나의 메커니즘은, 실시예 2에 기재되어 있다. 기재된 메커니즘은 예시적이며, 상기 기재된 단일 뉴클레오티드 돌출부가 달성되는 한 다른 메커니즘이 이용될 수 있다.
제1 절단 단계에서, 범용 뉴클레오티드는 당-포스페이트 백본을 온전히 유지하면서, 지지 가닥으로부터 제거된다. 이는, 특히 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로부터 단일 범용 뉴클레오티드를 제거할 수 있는 효소의 작용에 의해 달성될 수 있다. 예시된 방법에서, 범용 뉴클레오티드는 이노신이며, 이노신은 효소의 작용에 의해 지지 가닥으로부터 절단되어, 무염기 부위를 형성한다. 예시적인 방법에서, 효소는 3-메틸아데닌 DNA 글리코실라아제 효소, 특히 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라아제(hAAG)이다. 무염기 부위가 형성되는 한, 다른 효소, 분자 또는 화학물질이 사용될 수 있다.
제2 절단 단계에서, 지지 가닥은 단일 가닥 절단부를 생성함으로써 무염기 부위에서 절단된다. 예시적인 방법에서, 지지 가닥은 염기인 화학물질, 예컨대 NaOH의 작용에 의해 절단된다. 대안적으로, N,N'-디메틸에틸렌디아민과 같은 유기 화학물질이 사용될 수 있다. 대안적으로, 무염기 부위 리아제 활성을 갖는 효소, 예컨대 엔도뉴클레아제 VIII가 사용될 수 있다. 지지 가닥이 기재된 바와 같이 무염기 부위에서 절단되는 한, 다른 효소, 분자 또는 화학물질이 사용될 수 있다.
따라서, 범용 뉴클레오티드가 지지 가닥의 위치 n에 있고, 지지 가닥이 위치 n과 n-1 사이에서 절단되는 구현예에서, 제1 절단 단계는 뉴클레오티드 절단 효소를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 효소의 예는, 3-메틸아데닌 DNA 글리코실라아제 효소, 예컨대 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라아제(hAAG)이다. 제2 절단 단계는 염기인 화학물질, 예컨대 NaOH를 이용하여 수행될 수 있다. 제2 단계는 무염기 부위 절단 활성을 갖는 유기 화학물질, 예컨대 N,N'-디메틸에틸렌디아민을 이용하여 수행될 수 있다. 제2 단계는 무염기 부위 리아제 활성을 갖는 효소, 예컨대 엔도뉴클레아제 VIII를 이용하여 수행될 수 있다.
상기 방법의 단계 (4)에서, 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션된다(104). 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 지지 가닥 및 헬퍼 가닥을 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드, 및 소정의 서열의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 단일 돌출 뉴클레오티드를 포함하는 상보적 라이게이션 말단을 추가로 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 돌출부에 인접한 헬퍼 가닥에 포스페이트기가 결여된 말단 뉴클레오티드를 추가로 포함한다(도 1의 하부 좌측에 도시된 구조에서 "X"로 표지된 위치 참조). 상보적 라이게이션 말단은 적합한 라이게이션 조건에 적용되는 경우, 단계 (3)의 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 돌출 말단과 호환 가능하게 결합하도록 구성된다. 지지 가닥의 라이게이션 시, 제1 뉴클레오티드는 그의 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루게 된다.
따라서, 이러한 예시적인 방법의 단계 (4)에서(104), 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에서, 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이룬다. 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드 다음에 위치한다(위치 n). 라이게이션 폴리뉴클레오티드에서 위치 n은, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션 말단이 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션되는 경우, 범용 뉴클레오티드가 도 1에 도시된 바와 같이(106, 107), 단계 (6)에서, 즉 다음 합성 사이클에서 혼입되는 다음 뉴클레오티드와 쌍을 이루도록 지지 가닥에 위치하게 되는 것을 의미한다. 단계 (4)의 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에서, 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드는 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이며, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있다.
라이게이션 폴리뉴클레오티드에서, 헬퍼 가닥은 돌출부에 인접한 말단 뉴클레오티드가 포스페이트기가 결여된 것으로 제공된다. 전형적으로, 상기 기재된 바와 같이, 헬퍼 가닥의 이러한 비포스포릴화된 말단 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 5' 말단을 한정할 것이다.
단계 (4)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥 및 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 라이게이션 시(104), 합성 가닥의 제1 뉴클레오티드는 지지 가닥의 그의 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이룬다.
지지 가닥의 라이게이션은 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 라이게이션은 합성 가닥, 즉 프라이머 가닥 부분의 제1 뉴클레오티드와, 제1 뉴클레오티드에 인접한 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드 사이에 단일 가닥 절단부를 유지하면서, 지지 가닥의 결합만 유도할 것이다.
라이게이션은 전형적으로 리가아제 활성을 갖는 효소에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 라이게이션은 T3 DNA 리가아제 또는 T4 DNA 리가아제를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 효소의 사용은, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 말단 포스페이트기의 부재로 인해 리가아제에 대한 기질로서 작용할 수 없기 때문에, 합성 가닥에 단일 가닥 절단부를 유지할 것이다.
절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션은, 제1 합성 사이클을 완결시키고, 그 결과 단계 (1)의 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는, 소정의 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드가 그의 파트너 뉴클레오티드 반대편 폴리뉴클레오티드에 혼입되는 것을 제외하고, 효과적으로 재구성된다. 이러한 예시적인 방법에서, 주어진 합성 사이클의 종결 시, 합성 사이클 동안, 범용 뉴클레오티드는 이전 사이클에서 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 n+1을 점유할 것이다. 동시에, 주어진 합성 사이클의 종결 시, 범용 뉴클레오티드는 다음 사이클에서 혼입되는 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 n을 점유할 것이다. 따라서, 주어진 합성 사이클의 종결 시, 다음 합성 사이클에 사용하기 위한 변형된 스캐폴드 분자가 제공되고(106), 여기서 범용 뉴클레오티드는 다음 합성 사이클에서 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드의 혼입 및 지지 가닥의 절단을 용이하게 하기 위해, 다시 한번 지지 가닥에 위치한다.
본 발명의 이러한 예시적인 방법 버전뿐만 아니라, 버전 2 및 3에서, 다음 뉴클레오티드가 다음 합성 사이클에 혼입되는 것을 가능하게 하기 위해, 가역적 종결자기는 제1 뉴클레오티드로부터 제거되어야 한다(탈보호 단계 (105)). 이는 제1 사이클의 다양한 단계에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 이는 도 1의 단계 5에 제시된 바와 같이(105), 라이게이션 단계 (4) 후, 방법의 단계 (5)로서 수행될 것이다. 하지만, 탈보호 단계는 신규한 뉴클레오티드의 혼입 후 임의의 단계에서 수행될 수 있다. 탈보호 단계가 수행되는 단계에 관계없이, 폴리머라아제 및 잔류 비혼입된 제1 뉴클레오티드가 제1 뉴클레오티드의 다중 혼입을 방지하기 위해 먼저 제거되어야 한다. 폴리머라아제 및 비혼입된 제1 뉴클레오티드는 바람직하게는 절단 단계 (단계 (3)) 전에 제거된다. 따라서, 제1 뉴클레오티드로부터의 가역적 종결자기의 제거는, 절단 단계 (단계 (3)) 전, 라이게이션 단계 (단계 (4)) 전, 또는 라이게이션 단계 후(단계 (5)로서) 수행될 수 있다.
제1 뉴클레오티드로부터의 가역적 종결자기의 제거는 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 제거는 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP)과 같은 화학물질의 사용에 의해 수행될 수 있다.
방법 버전 1에서, 제2 및 후속 합성 사이클은 제1 합성 사이클에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
따라서, 단계 (6)에서, 다음 합성 사이클을 위해 제공된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드(106)는 제1 합성 사이클의 라이게이션 단계 (4) 및 탈보호 단계 (5)의 생성물이다. 단계 (6)에서, 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드는 제1 사이클 단계 (2)에 대하여 상기 기재된 바와 같이, 폴리머라아제의 작용에 의해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥에 혼입된다(107). 다음 뉴클레오티드 또한 폴리머라아제에 의한 해당 사이클에서의 추가 연장을 방지하는 가역적 종결자기를 포함한다. 헬퍼 가닥은 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 선택적으로, 혼입 단계 (6) 전에 제거될 수 있다.
방법 버전 1의 제1 합성 사이클의 단계 (2)에서와 같이, 단계 (6)에서, 다음 뉴클레오티드는 이의 혼입 시 다음 뉴클레오티드와 쌍이 이루도록 지지 가닥에 위치한 범용 뉴클레오티드 반대편에 혼입된다. 이러한 구성에서, 범용 뉴클레오티드는 합성 가닥에 혼입된 다음 뉴클레오티드에 대하여 위치 "n"에 다시 위치한다. 나아가, 제1 합성 사이클에 대하여 상기 기재된 바와 같이, 다음 합성 사이클의 단계 (6)에서, 범용 뉴클레오티드는 이전 사이클의 단계 (2)에서 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드에 점유된 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 "n+1"을 점유할 것이다. 이는, 이전 합성 사이클의 라이게이션 폴리뉴클레오티드에서, 범용 뉴클레오티드가 헬퍼 가닥의 말단 비포스포릴화된 뉴클레오티드 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이루기 때문에 달성된다.
단계 (7)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정되는 절단 부위에서 절단된다(108). 절단은 합성 가닥에 돌출부의 말단 뉴클레오티드로서 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드를 포함하는 단일 뉴클레오티드 돌출 말단을 제공하기 위해, 지지 가닥을 절단하고, 범용 뉴클레오티드를 제거하는 것을 포함한다. 합성 가닥의 단일 뉴클레오티드 돌출부는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있다. 절단 단계는 제1 사이클의 단계 (3)에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
다음 사이클의 단계 (8)에서, 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션된다(109). 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 지지 가닥 및 헬퍼 가닥을 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 단일 돌출 뉴클레오티드 및 범용 뉴클레오티드를 지지 가닥에 포함하는 상보적 라이게이션 말단을 추가로 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 돌출부에 인접한 헬퍼 가닥에 포스페이트기가 결여된 말단 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 상보적 라이게이션 말단은 적합한 라이게이션 조건에 적용되는 경우, 단계 (7)의 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 생성물의 돌출 말단과 호환 가능하게 결합하도록 구성된다. 지지 가닥의 라이게이션 시, 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드는 그의 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루게 된다.
다음 및 후속 합성 사이클의 단계 (8)의 라이게이션 폴리뉴클레오티드가 구성될 수 있고, 라이게이션 단계가 제1 합성 사이클의 단계 (4)에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
따라서, 단계 (8)에서, 라이게이션 시(109), 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이룬다. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 다음 사이클에서 혼입되는 다음 뉴클레오티드에 대하여 위치 "n"에 위치한다. 나아가, 상기 기재된 바와 같이, 단계 (8) 후, 범용 뉴클레오티드는 단계 (6)의 시작 전 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 "n+1"을 점유할 것이다.
다음 및 후속 사이클에서 가역적 종결자기의 탈보호(110)는 제1 합성 사이클에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
합성 사이클은 소정의 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 합성하는 데 필요한 만큼 반복된다.
합성 방법 버전 2
본 발명의 합성 방법의 제2 예시적인 버전에서, 신규한 뉴클레오티드는 지지 가닥에 위치한 범용 뉴클레오티드 반대편 이중 가닥 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입된다(도 2의 단계 1 및 2(201, 202)). 합성의 각 사이클에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 절단된다(도 2의 단계 3(203)). 새롭게 혼입된 뉴클레오티드를 포함하는 단일 뉴클레오티드 돌출부는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 생성된다(도 2의 하부의 중간에 도시된 구조 참조).
절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션(204)은, 파트너 뉴클레오티드를 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입시키고, 새롭게 혼입된 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 것을 가능하게 함으로써, 완전한 합성 사이클을 완료한다. 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 라이게이션 폴리뉴클레오티드(도 2의 하부 좌측에 도시된 구조 참조)의 라이게이션(204)은 또한 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 다음 사이클에서 혼입되는 다음 뉴클레오티드와 쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드를 혼입시킨다(도 2의 단계 4).
본 발명의 합성 방법의 제2 예시적인 버전에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 바와 같이 단계 (1)에서 제공된다(201). 이러한 방법에서, 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드와 쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에 제공되고, 단일 가닥 절단부 부위에서 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드 반대편에 위치하며, 그와 쌍을 이룬다. 상보적 뉴클레오티드는 도 2의 단계 1에 도시된 바와 같이 합성 가닥의 혼입된 제1 뉴클레오티드에 대하여 지지 가닥에서 위치 "n"에 위치한다.
단계 (2)에서, 소정의 서열의 제1 뉴클레오티드는 이의 혼입 시 상보적 뉴클레오티드가 제1 뉴클레오티드와 쌍을 이루도록, 상보적 뉴클레오티드 반대편에 혼입된다(202).
합성 방법의 제2 버전의 단계 (1)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드가 제공된다. 이러한 방법에서, 범용 뉴클레오티드는 단일 가닥 절단부 부위에서, 즉 전형적으로 헬퍼 가닥의 5' 말단에서, 헬퍼 가닥에서의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드 반대편 지지 가닥에 위치하고(위치 "n+1"), 그와 쌍을 이룬다(도 2의 단계 1에 도시된 구조 참조).
연장 동안, 폴리머라아제는 헬퍼 가닥(존재하는 경우)에 "침입"하고, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드를 대체하는 작용을 할 것이며, 혼입된 제1 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 대체된 말단 뉴클레오티드에 의해 이전에 점유된 위치를 점유할 것이다. 제1 뉴클레오티드의 혼입 후, 범용 뉴클레오티드는 도 2의 단계 3의 구조에 도시된 바와 같이, 단일 가닥 절단부 부위에서 합성 가닥의 제1 뉴클레오티드에 대하여 지지 가닥에서 위치 "n+1"에 위치할 것이다.
상기 방법의 단계 (3)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 절단 부위에서 절단된다(203). 절단 부위는 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된다. 절단은 합성 가닥에 소정의 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 돌출 말단을 제공하기 위해, 지지 가닥을 절단하는 것을 포함한다. 절단은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 이중 가닥 절단부를 생성한다. 합성 가닥에는 단일 가닥 절단부 또는 "닉"이 이미 제공되어 있기 때문에, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 이중 가닥 절단부를 제공하기 위해서는 지지 가닥의 절단만이 필요하다.
이러한 예시적인 방법 버전에서, 절단은 합성 가닥에 지지 가닥이 돌출해 있는 돌출부를 생성한다. 합성 가닥의 돌출 말단은 혼입된 제1 뉴클레오티드인 단일 비하이브리드화된 뉴클레오티드만을 포함한다. 전형적으로, 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드는 도 2의 하부 중간에 제시된 구조에 도시된 바와 같이, 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에서 지지 가닥의 5' 말단이 돌출해 있는 합성 가닥의 3' 말단을 한정할 것이다.
이러한 방법에서, 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥에서 위치 "n+1"을 점유한다. 범용 뉴클레오티드가 지지 가닥에서 위치 "n+1"을 점유할 때 이러한 단일 뉴클레오티드 돌출부를 수득하기 위해, 지지 가닥은 단계 3에서 뉴클레오티드 위치 "n"과"n-1"사이에서 절단된다.
예시적인 방법 버전 2에서, "n"은, 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대하여 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치인, 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치를 의미한다. 따라서, 절단 단계에서, 지지 가닥에서의 위치 "n"은, 해당 사이클에서 혼입된 소정의 서열의 뉴클레오티드, 즉 프라이머 가닥에 근접한/합성 가닥의 프라이머 가닥 부분의 말단 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치 반대편이다. "n-1"은, 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대한, 지지 가닥의 제2 뉴클레오티드(도 2에서 "z"로 표지된 뉴클레오티드) 위치를 의미한다. 따라서, 절단 단계에서, 지지 가닥에서 위치 "n-1" 은, 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치 반대편이다. 이러한 구성에서, 범용 뉴클레오티드는 위치 "n+1"을 점유한다. 이러한 방법에서, 위치 "n+1"에서의 범용 뉴클레오티드는, 닉에 대하여 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분에서 끝에서 두 번째 뉴클레오티드 반대편이다(도 2의 단계 3에 도시된 바와 같음).
지지 가닥의 절단 시(203), 범용 뉴클레오티드, 헬퍼 가닥(존재하는 경우) 및 헬퍼 가닥에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은, 남아있는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거되어(도 2의 하부의 우측에 도시된 구조 참조), 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 지지 가닥이 돌출해 있는 합성 가닥의 소정의 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 단일 뉴클레오티드 돌출부를 생성한다(도 2의 하부 중간에 도시된 구조 참조).
포스페이트기는 돌출 부위에서 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드에 계속 부착되어야 한다(도 2의 하부 중간에 제시된 구조에 도시된 바와 같음). 이는, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 라이게이션 단계에서 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에 라이게이션될 수 있다는 것을 보장한다.
따라서, 방법 버전 2에서, 지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n과 n-1 사이에서 절단된다.
바람직하게는, 지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n과 n-1 사이에서 포스포디에스테르 결합(헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로, 범용 뉴클레오티드의 위치 n+1에 대한 지지 가닥의 제2 포스포디에스테르 결합)의 절단에 의해 절단된다.
지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n과 n-1 사이에서 포스포디에스테르 결합 중 하나의 에스테르 결합의 절단에 의해 절단될 수 있다.
바람직하게는, 지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n에 대한 제1 에스테르 결합의 절단에 의해 절단된다. 이는, 절단 위치에서 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에 말단 포스페이트기를 보유하는 효과를 가질 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 위치 n과 n-1 사이에서의 지지 가닥의 절단은, 엔도뉴클레아제 V와 같은 효소의 작용에 의해 수행될 수 있다.
지지 가닥에서 위치 n+1을 점유하는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 위치 n과 n-1 사이에서 지지 가닥을 절단하는 메커니즘은, 실시예 3에 기재되어 있다. 기재된 메커니즘은 예시적이며, 상기 기재된 단일 뉴클레오티드 돌출부가 달성되는 한 다른 메커니즘이 이용될 수 있다.
이러한 예시적인 메커니즘에서, 엔도뉴클레아제 효소가 이용된다. 예시적인 방법에서, 효소는 엔도뉴클레아제 V이다. 상기 기재된 단일 뉴클레오티드 돌출부가 형성되는 한, 다른 효소, 분자 또는 화학물질이 사용될 수 있다.
상기 방법의 단계 (4)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션된다(204). 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 지지 가닥 및 헬퍼 가닥을 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 돌출 뉴클레오티드 및 범용 뉴클레오티드를 지지 가닥에 포함하는 상보적 라이게이션 말단을 추가로 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 돌출부에 인접한 헬퍼 가닥에 포스페이트기가 결여된 말단 뉴클레오티드를 추가로 포함한다(도 2의 하부 좌측에 도시된 구조 참조). 상보적 라이게이션 말단은 적합한 라이게이션 조건에 적용되는 경우, 단계 (3)의 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 돌출 말단과 호환 가능하게 결합하도록 구성된다. 지지 가닥의 라이게이션 시, 제1 뉴클레오티드는 그의 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루게 된다.
이러한 방법에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 단일 가닥 절단부 부위의 부위에서 헬퍼 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드 반대편 상보적 라이게이션 말단에 위치하고, 그에 하이브리드화된다. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 단계 (6), 즉 도 2에 개략적으로 도시된 바와 같이 다음 합성 사이클에서 합성 가닥에 혼입되는 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드에 대하여 라이게이션 폴리뉴클레오티드에서 위치 "n+1"에 위치한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에서, 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드는 단계 (6)의 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이고, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드와 쌍을 이룬다. 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드는 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이다. 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있다.
라이게이션 폴리뉴클레오티드에서, 헬퍼 가닥은 돌출부에 인접한 말단 뉴클레오티드가 포스페이트기가 결여된 것으로 제공된다. 전형적으로, 상기 기재된 바와 같이, 헬퍼 가닥의 이러한 비포스포릴화된 말단 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 5' 말단을 한정할 것이다.
단계 (4)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥 및 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 라이게이션 시(204), 합성 가닥의 제1 뉴클레오티드는 지지 가닥의 그의 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루게 된다.
지지 가닥의 라이게이션은 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 라이게이션은 합성 가닥, 즉 프라이머 가닥 부분의 제1 뉴클레오티드와, 제1 뉴클레오티드에 인접한 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드 사이에 단일 가닥 절단부를 유지하면서, 지지 가닥의 결합만 유도할 것이다.
방법 버전 1에서와 같이, 방법 버전 2에서의 라이게이션은 전형적으로 리가아제 활성을 갖는 효소에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 라이게이션은 T3 DNA 리가아제 또는 T4 DNA 리가아제를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 효소의 사용은, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 말단 포스페이트기의 부재로 인해 리가아제에 대한 기질로서 작용할 수 없기 때문에, 합성 가닥에 단일 가닥 절단부를 유지할 것이다.
절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션은, 도 2에 도시된 바와 같이(단계 4), 제1 합성 사이클을 완결시키고, 그 결과 단계 (1)의 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는, 소정의 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드가 그의 파트너 뉴클레오티드 반대편 폴리뉴클레오티드에 혼입되고, 다음 합성 사이클에서 혼입되는 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 뉴클레오티드가 지지 가닥에 위치하고, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 것을 제외하고, 효과적으로 재구성된다. 예시적인 방법 버전 1에서와 같이, 예시적인 방법 버전 2에서, 주어진 합성 사이클의 종결 시, 합성 사이클 동안, 범용 뉴클레오티드는 이전 사이클에서 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 n+1을 점유할 것이다. 동시에, 주어진 합성 사이클의 종결 시, 범용 뉴클레오티드는 또한 다음 사이클에서 혼입되는 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 n+1을 점유할 것이다. 따라서, 주어진 합성 사이클의 종결 시, 다음 합성 사이클에 사용하기 위한 변형된 스캐폴드 분자가 제공되고(206), 여기서 범용 뉴클레오티드는 다음 합성 사이클에서 지지 가닥의 절단을 용이하게 하기 위해 다시 한번 지지 가닥에 위치한다.
다음 뉴클레오티드가 다음 합성 사이클에서 혼입되는 것을 가능하게 하기 위해, 가역적 종결자기는 제1 뉴클레오티드로부터 제거되어야 한다(탈보호 단계 (205)). 이는 방법 버전 1에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
예시적인 방법 버전 2에서, 제2 및 후속 합성 사이클은 제1 합성 사이클에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
따라서, 단계 (6)에서, 다음 합성 사이클을 위해 제공된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드(206)는, 예를 들어 제1 합성 사이클(205)의 라이게이션 단계 (4) 및 탈보호 단계 (5)의 생성물이다. 단계 (6)에서, 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드는 제1 사이클 단계 (2)에 대하여 상기 기재된 바와 같이, 폴리머라아제의 작용에 의해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥에 혼입된다(207). 다음 뉴클레오티드 또한 폴리머라아제에 의한 해당 사이클에서의 추가 연장을 방지하는 가역적 종결자기를 포함한다.
예시적인 방법 버전 2의 제1 합성 사이클의 단계 (2)에서와 같이, 단계 (6)에서, 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드는 이의 혼입 시 다음 뉴클레오티드와 쌍이 이루도록 지지 가닥에 위치한 그의 파트너 뉴클레오티드 반대편에 혼입된다(207). 이러한 구성에서, 범용 뉴클레오티드는 합성 가닥에 혼입된 다음 뉴클레오티드에 대하여 위치 "n+1"에 위치한다. 나아가, 제1 합성 사이클에 대하여 상기 기재된 바와 같이, 다음 합성 사이클의 단계 (6)에서, 범용 뉴클레오티드는 이전 사이클의 단계 (2)에서 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드에 점유된 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 "n+1"을 점유할 것이다. 이는, 이전 합성 사이클의 라이게이션 폴리뉴클레오티드에서, 범용 뉴클레오티드가 헬퍼 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이루기 때문에 달성된다.
단계 (7)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정되는 절단 부위에서 절단된다(208). 절단은 남아있는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 돌출부의 말단 뉴클레오티드로서 다음 뉴클레오티드를 포함하는 단일 뉴클레오티드 돌출 말단을 합성 가닥에 제공하기 위해, 지지 가닥을 절단하고, 범용 뉴클레오티드를 제거하는 것을 포함한다. 합성 가닥의 단일 뉴클레오티드 돌출부는 남아있는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있다. 절단 단계는 제1 사이클의 단계 (3)에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
다음 사이클의 단계 (8)에서, 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션된다(209). 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 지지 가닥 및 헬퍼 가닥을 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 단일 돌출 뉴클레오티드 및 범용 뉴클레오티드를 지지 가닥에 포함하는 상보적 라이게이션 말단을 추가로 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 돌출부에 인접한 헬퍼 가닥에 포스페이트기가 결여된 말단 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 상보적 라이게이션 말단은 적합한 라이게이션 조건에 적용되는 경우, 단계 (7)의 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 생성물의 돌출 말단과 호환 가능하게 결합하도록 구성된다. 지지 가닥의 라이게이션 시, 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드는 그의 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루게 된다.
다음 및 후속 합성 사이클의 단계 (8)의 라이게이션 폴리뉴클레오티드가 구성될 수 있고, 라이게이션 단계가 제1 합성 사이클의 단계 (4)에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
따라서, 단계 (8)에서, 라이게이션 시(209), 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이룬다. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 다음 사이클에서 혼입되는 다음 뉴클레오티드에 대하여 위치 "n+1"에 위치한다. 나아가, 상기 기재된 바와 같이, 단계 (8) 후, 범용 뉴클레오티드는 단계 (6)의 시작 전 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 "n+1"을 점유할 것이다.
다음 및 후속 사이클에서 가역적 종결자기의 탈보호(210)는 제1 합성 사이클에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
합성 사이클은 소정의 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 합성하는 데 필요한 만큼 반복된다.
합성 방법 버전 3
본 발명의 합성 방법의 제3 예시적인 버전에서, 신규한 뉴클레오티드는 지지 가닥에 위치한 범용 뉴클레오티드 반대편 이중 가닥 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입된다(도 3a의 단계 1 및 2(301, 302)). 합성의 각 사이클에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 절단된다(도 3a의 단계 3(303)). 새롭게 혼입된 뉴클레오티드를 포함하는 이중 뉴클레오티드 돌출부는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 생성된다(도 3a의 하부의 중간에 도시된 구조 참조). 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션(도 3a의 하부의 좌측에 도시된 구조 참조)은, 파트너 뉴클레오티드를 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입시키고, 새롭게 혼입된 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 것을 가능하게 함으로써(도 3a의 단계 4(304)), 합성 사이클을 완료한다.
본 발명의 합성 방법의 제3 예시적인 버전에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 바와 같이 단계 (1)에서 제공된다(301). 이러한 방법에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 단일 가닥 절단부 부위에서 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이룬다(도 3a의 단계 1에 도시된 구조 참조).
단계 (2)에서, 제1 뉴클레오티드는 이의 혼입 시 제1 뉴클레오티드와 쌍을 이루도록 지지 가닥에 위치한 범용 뉴클레오티드 반대편에 혼입된다(302). 이러한 구성에서, 범용 뉴클레오티드는, 도 3a에 도시된 바와 같이 합성 가닥의 혼입된 제1 뉴클레오티드에 대하여 위치 "n"에 위치한다(단계 3).
연장 동안, 폴리머라아제는 헬퍼 가닥(존재하는 경우)에 "침입"하고, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드를 대체하는 작용을 할 것이다. 혼입된 제1 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 대체된 말단 뉴클레오티드에 의해 이전에 점유된 위치를 점유할 것이다(도 3a의 단계 3).
상기 방법의 단계 (3)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 절단 부위에서 절단된다(303). 절단 부위는 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된다. 절단은 제1 뉴클레오티드를 포함하는 돌출 말단을 합성 가닥에 제공하기 위해 지지 가닥을 절단하는 것을 포함한다. 절단은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 이중 가닥 절단부를 생성한다. 합성 가닥에는 단일 가닥 절단부 또는 "닉"이 이미 제공되어 있기 때문에, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 이중 가닥 절단부를 제공하기 위해서는 지지 가닥의 절단만이 필요하다.
이러한 예시적인 방법 버전에서, 절단은 합성 가닥에 지지 가닥이 돌출해 있는 돌출부를 생성한다. 합성 가닥의 돌출 말단은 2개의 비하이브리드화된 뉴클레오티드를 포함한다. 제1 돌출 비하이브리드화된 뉴클레오티드는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥의 말단 뉴클레오티드이고, 소정의 뉴클레오티드 서열의 혼입된 제1 뉴클레오티드다. 제2 비하이브리드화된 뉴클레오티는 합성 가닥의 제1 뉴클레오티드 다음의 뉴클레오티드이다. 전형적으로, 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에서 지지 가닥의 5' 말단이 돌출해 있는 합성 가닥의 3' 말단을 한정할 것이다(도 3a의 하부 중간에 도시된 구조 참조).
이러한 방법에서, 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥에서 위치 "n"을 점유한다. 범용 뉴클레오티드가 지지 가닥에서 위치 "n"을 점유할 때 이러한 이중 뉴클레오티드 돌출부를 수득하기 위해, 지지 가닥은 위치 "n-1"과 "n-2"사이에서 절단된다.
"n" 은, 주어진 사이클에서 혼입된 소정의 서열의 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치를 의미한다. 따라서, 절단 단계에서, 지지 가닥에서 위치 "n"은, 주어진 사이클에서 혼입된 소정의 서열의 뉴클레오티드, 즉 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분의 말단 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치 반대편이다. "n-1"은, 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대한, 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치를 의미한다. 따라서, 절단 단계에서, 지지 가닥에서 위치 "n-1" 은, 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치 반대편이다. "n-2"는, 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대한, 지지 가닥의 제2 뉴클레오티드 위치를 의미한다(도 3a의 단계 3에 도시된 바와 같음(303)).
따라서, 지지 가닥의 절단 시, 범용 뉴클레오티드, 헬퍼 가닥(존재하는 경우), 및 헬퍼 가닥에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분은, 남아있는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거되어(도 3a의 하부의 우측에 도시된 구조 참조), 남아있는 지지 가닥이 돌출해 있는 합성 가닥의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 이중 뉴클레오티드 돌출부를 생성한다.
포스페이트기는 돌출 부위에서 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드에 계속 부착되어야 한다(도 3a의 하부 중간에 제시된 구조에 도시된 바와 같음). 이는, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 라이게이션 단계에서 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에 라이게이션될 수 있다는 것을 보장한다.
따라서, 지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n-1과 n-2 사이에서 절단된다.
바람직하게는, 지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n-1과 n-2 사이에서 포스포디에스테르 결합(헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로, 범용 뉴클레오티드의 위치에 대한 지지 가닥의 제2 포스포디에스테르 결합)의 절단에 의해 절단된다.
지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n-1과 n-2 사이에서 포스포디에스테르 결합 중 하나의 에스테르 결합의 절단에 의해 절단될 수 있다.
바람직하게는, 지지 가닥은 뉴클레오티드 위치 n-1에 대한 제1 에스테르 결합의 절단에 의해 절단된다. 이는 절단 위치에서 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에 말단 포스페이트기를 보유하는 효과를 가질 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 위치 n-1과 n-2 사이에서의 지지 가닥의 절단은, 엔도뉴클레아제 V와 같은 효소의 작용에 의해 수행될 수 있다.
이중 뉴클레오티드 돌출부를 생성하기 위해, 지지 가닥에서 위치 n을 점유하는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 지지 가닥을 절단하는 메커니즘은, 실시예 7에 기재되어 있다. 기재된 메커니즘은 예시적이며, 상기 기재된 이중 뉴클레오티드 돌출부가 달성되는 한 다른 메커니즘이 이용될 수 있다.
이러한 예시적인 메커니즘에서, 엔도뉴클레아제 효소가 이용된다. 예시적인 방법에서, 효소는 엔도뉴클레아제 V이다. 상기 기재된 단일 뉴클레오티드 돌출부가 형성되는 한, 다른 효소, 분자 또는 화학물질이 사용될 수 있다.
상기 방법의 단계 (4)에서, 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션된다(304). 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 지지 가닥 및 헬퍼 가닥을 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 돌출 뉴클레오티드 및 범용 뉴클레오티드를 지지 가닥에 포함하는 상보적 라이게이션 말단을 추가로 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 돌출부에 인접한 헬퍼 가닥에 포스페이트기가 결여된 말단 뉴클레오티드를 추가로 포함한다(도 3a의 하부 좌측에 도시된 구조 참조). 상보적 라이게이션 말단은 적합한 라이게이션 조건에 적용되는 경우, 단계 (3)의 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 돌출 말단과 호환 가능하게 결합하도록 구성된다. 지지 가닥의 라이게이션 시, 제1 뉴클레오티드는 그의 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루게 된다.
이러한 방법에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 단일 가닥 절단부 부위에서 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드 반대편 상보적 라이게이션 말단에 위치하며, 그와 쌍을 이룬다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는, 도 3a에 도식적으로 도시된 바와 같이, 단계 (6), 즉 다음 합성 사이클에서 합성 가닥에 혼입되는 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드에 대하여 위치 "n"에 위치한다. 라이게이션에서 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에서, 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드는 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이며, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있다.
라이게이션 폴리뉴클레오티드에서, 헬퍼 가닥은 돌출부에 인접한 말단 뉴클레오티드가 포스페이트기가 결여된 것으로 제공된다. 전형적으로, 상기 기재된 바와 같이, 헬퍼 가닥의 이러한 비포스포릴화된 말단 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 5' 말단을 한정할 것이다.
단계 (4)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥 및 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 라이게이션 시(304), 합성 가닥의 소정의 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드는 지지 가닥의 그의 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이룬다.
라이게이션은 전형적으로 리가아제 활성을 갖는 효소에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 라이게이션은 T3 DNA 리가아제 또는 T4 DNA 리가아제를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 효소의 사용은, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 말단 포스페이트기의 부재로 인해 리가아제에 대한 기질로서 작용할 수 없기 때문에, 합성 가닥에 단일 가닥 절단부를 유지할 것이다.
절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션은, 제1 합성 사이클을 완결시키고, 그 결과 단계 (1)의 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는, 소정의 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드가 그의 파트너 뉴클레오티드 반대편 폴리뉴클레오티드에 혼입되는 것을 제외하고, 효과적으로 재구성된다.
방법 버전 1 및 2에서와 같이, 방법 버전 3에서의 라이게이션은 전형적으로 리가아제 활성을 갖는 효소에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 라이게이션은 T3 DNA 리가아제 또는 T4 DNA 리가아제를 이용하여 수행될 수 있다. 리가아제 효소의 사용은, 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 말단 포스페이트기의 부재로 인해 리가아제에 대한 기질로서 작용할 수 없기 때문에, 합성 가닥에 단일 가닥 절단부를 유지할 것이다.
절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션은, 제1 합성 사이클을 완결시키고, 그 결과 단계 (1)의 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는, 도 3a에 도시된 바와 같이, 소정의 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드가 그의 파트너 뉴클레오티드 반대편 폴리뉴클레오티드에 혼입되는 것을 제외하고, 효과적으로 재구성된다. 예시적인 방법 버전 1 및 2에서와 같이, 예시적인 방법 버전 3에서, 주어진 합성 사이클의 종결 시, 합성 사이클 동안, 범용 뉴클레오티드는 이전 사이클에서 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 n+1을 점유할 것이다. 동시에, 예시적인 방법 버전 1에서와 같이, 주어진 합성 사이클의 종결 시, 범용 뉴클레오티드는 또한 다음 사이클에서 혼입되는 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 n을 점유할 것이다. 따라서, 주어진 합성 사이클의 종결 시, 다음 합성 사이클에 사용하기 위한 변형된 스캐폴드 분자가 제공되고(306), 여기서 범용 뉴클레오티드는 다음 합성 사이클에서 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드의 혼입 및 지지 가닥의 절단을 용이하게 하기 위해, 다시 한번 지지 가닥에 위치한다.
소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드가 다음 합성 사이클에서 혼입되는 것을 가능하게 하기 위해, 가역적 종결자기는 제1 뉴클레오티드로부터 제거되어야 한다(탈보호 단계 (305)). 이는 방법 버전 1에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
예시적인 방법 버전 3에서, 제2 및 후속 합성 사이클은 제1 합성 사이클에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
따라서, 단계 (6)에서, 다음 합성 사이클을 위해 제공된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드(306)는, 예를 들어 제1 합성 사이클의 라이게이션 단계 (4) 및 탈보호 단계, 예를 들어 단계 (5)의 생성물이다. 단계 (6)에서, 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드는 제1 사이클 단계 (2)에 대하여 상기 기재된 바와 같이, 폴리머라아제의 작용에 의해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥에 혼입된다(307). 다음 뉴클레오티드 또한 폴리머라아제에 의한 해당 사이클에서의 추가 연장을 방지하는 가역적 종결자기를 포함한다.
예시적인 방법 버전 3의 제1 합성 사이클의 단계 (2)에서와 같이, 단계 (6)에서, 다음 뉴클레오티드는 이의 혼입 시 다음 뉴클레오티드와 쌍이 이루도록 지지 가닥에 위치한 범용 뉴클레오티드 반대편에 혼입된다. 이러한 구성에서, 범용 뉴클레오티드는 합성 가닥에 혼입된 다음 뉴클레오티드에 대하여 위치 "n"에 위치한다. 나아가, 제1 합성 사이클에 대하여 상기 기재된 바와 같이, 다음 합성 사이클의 단계 (6)에서, 범용 뉴클레오티드는 이전 사이클의 단계 (2)에서 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드에 점유된 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 "n+1"을 점유할 것이다. 이는, 이전 합성 사이클의 라이게이션 폴리뉴클레오티드에서, 범용 뉴클레오티드가 헬퍼 가닥의 말단 비포스포릴화된 뉴클레오티드 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이루기 때문에 달성된다.
단계 (7)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드는 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정되는 절단 부위에서 절단된다(308). 절단은 남아있는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 돌출부의 말단 뉴클레오티드로서 다음 뉴클레오티드를 포함하는 이중 뉴클레오티드 돌출 말단을 합성 가닥에 제공하기 위해, 지지 가닥을 절단하고, 범용 뉴클레오티드를 제거하는 것을 포함한다. 합성 가닥의 이중 뉴클레오티드 돌출부는 남아있는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있다. 절단 단계는 제1 사이클의 단계 (3)에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
다음 사이클의 단계 (8)에서, 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션된다(309). 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 지지 가닥 및 헬퍼 가닥을 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 돌출 뉴클레오티드 및 범용 뉴클레오티를 지지 가닥에 포함하는 상보적 라이게이션 말단을 추가로 포함한다. 라이게이션 폴리뉴클레오티드는 돌출부에 인접한 헬퍼 가닥에 포스페이트기가 결여된 말단 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 상보적 라이게이션 말단은 적합한 라이게이션 조건에 적용되는 경우, 단계 (7)의 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 생성물의 돌출 말단과 호환 가능하게 결합하도록 구성된다. 지지 가닥의 라이게이션 시, 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드는 그의 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루게 됨으로써, 추가 합성 사이클이 완결된다.
다음 및 후속 합성 사이클의 단계 (8)의 라이게이션 폴리뉴클레오티드가 구성될 수 있고, 라이게이션 단계가 제1 합성 사이클의 단계 (4)에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
따라서, 단계 (8)에서, 라이게이션 시(309), 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이룬다. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 제1 합성 사이클에 대하여 상기 기재된 바와 같이, 다음 뉴클레오티드에 대하여 위치 "n"에 위치한다. 나아가, 상기 기재된 바와 같이, 단계 (8) 후, 범용 뉴클레오티드는 단계 (6)의 시작 전 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대하여 지지 가닥에서 위치 "n+1"을 점유할 것이다.
다음 및 후속 사이클에서 가역적 종결자기의 탈보호(310)는 제1 합성 사이클에 대하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
합성 사이클은 소정의 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 합성하는 데 필요한 만큼 반복된다.
합성 방법 버전 4
합성 방법 버전 4는 합성 방법 버전 2의 변형이다. 따라서, 합성 방법 버전 2에서와 같이, 합성 방법 버전 4에서, 새롭게 혼입된 소정의 뉴클레오티드는 단계 (2)/(6) 동안 위치 n에서 지지 가닥의 파트너 뉴클레오티드 반대편 합성 가닥에 혼입되고, 지지 가닥은 절단된 단계 (3)/(7) 동안 위치 n과 n-1 사이에서 절단된다. 범용 뉴클레오티드가 위치 n+1을 점유하는 합성 방법 버전 2와 달리, 합성 방법 버전 4에서, 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로 위치 n+2를 점유한다. 따라서, 이러한 차이를 고려하여, 합성 방법 버전 4는 방법 버전 2에 관한 상기 기재의 맥락에서 도 3b 및 그의 설명을 참조로 기재될 수 있다. 각 변형 방법에서, 지지 가닥이 단계 (3)/(7) 동안 위치 n과 n-1 사이에서 절단되고, 범용 뉴클레오티드는 위치 n+3 또는 위치 n+3+x(여기서, x는 1 내지 10 또는 그 이상의 정수임)과 같이, 각각 위치 n+2 로부터 하나의 위치가 추가로 제거된 위치를 지지 가닥에서 점차적으로 점유하는, 이러한 방법의 추가 변형이 고안된다.
따라서, 본 발명은 또한 본원에서 상기에 기재된 바와 같이 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관내 합성 방법으로서, 하기 합성의 사이클을 수행하는 것을 포함하는 방법을 제공한다:
a) 단계 (1)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 지지 가닥에 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 뉴클레오티드(위치 n)가 제공되고, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+2에 위치하고;
b) 단계 (2)/(6)에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 지지 가닥의 파트너 뉴클레오티드의 반대편 위치(위치 n)에서 합성 가닥에 혼입되고, 그 결과 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루며;
c) 단계 (3)/(7)에서, 지지 가닥은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드로부터 제2 뉴클레오티드(위치 n)와 제3 뉴클레오티드(위치 n-1) 사이의 위치에서 절단되고, 여기서 절단은 범용 뉴클레오티드를 제거하고, 지지 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 단일 뉴클레오티드 돌출부를 생성하며;
d) 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단은 단일 뉴클레오티드 돌출부를 포함하고, 여기서
i. 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥에서의 뉴클레오티드 반대편인 지지 가닥에서 위치 n+2에 위치하고, 그와 쌍을 이루며;
ii. 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드와 쌍을 이루고, 다음 합성 사이클의 단계 (6)에서 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드(위치 n)이며;
iii. 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드(위치 n-1)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있고, 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이거나, 또는 현재 합성 사이클의 단계 (6)의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드임.
바로 상기 기재된 바와 같은 방법의 변형에서, 단계 (1)에서, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+3에 위치하고, 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에는 위치 n+3에 위치한 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 제공된다. 대안적으로, 단계 (1)에서, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+3+x에 위치하고, 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에는 위치 n+3+x(여기서, x는 1 내지 10 또는 그 이상의 정수임)에 위치한 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 제공된다.
방법 버전 2에서와 같이, 방법 버전 4 및 이의 변형에서, 헬퍼 가닥 부분은 신규한 소정의 뉴클레오티드의 혼입 전 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 생략될 수 있다. 헬퍼 가닥 부분은 신규한 소정의 뉴클레오티드의 혼입 전, 본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 예를 들어 변성에 의해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거될 수 있다.
합성 방법 버전 5
합성 방법 버전 5는 합성 방법 버전 3의 변형이다. 따라서, 합성 방법 버전 3에서와 같이, 합성 방법 버전 4에서, 새롭게 혼입된 소정의 뉴클레오티드는 단계 (2)/(6) 동안 위치 n에서 지지 가닥의 파트너 범용 뉴클레오티드 반대편 합성 가닥에 혼입되고, 지지 가닥은 절단된 단계 (3)/(7) 동안 위치 n-1과 n-2 사이에서 절단된다. 범용 뉴클레오티드가 위치 n을 점유하는 합성 방법 버전 3과 달리, 합성 방법 버전 5에서, 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로 위치 n+1을 점유한다. 따라서, 이러한 차이를 고려하여, 합성 방법 버전 5는 방법 버전 3에 관한 상기 기재의 맥락에서 도 3c 및 그의 설명을 참조로 기재될 수 있다. 각 변형 방법에서, 지지 가닥이 단계 (3)/(7) 동안 위치 n-1과 n-2 사이에서 절단되고, 범용 뉴클레오티드는 위치 n+2 또는 위치 n+2+x(여기서, x는 1 내지 10 또는 그 이상의 정수임)과 같이, 각각 위치 n+1로부터 하나의 위치가 추가로 제거된 지지 가닥에서의 위치를 점차적으로 점유하는, 이러한 방법의 추가 변형이 고안된다.
따라서, 본 발명은 또한 본원에서 상기에 기재된 바와 같이 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관내 합성 방법으로서, 하기 합성의 사이클을 수행하는 것을 포함하는 방법을 제공한다:
a) 단계 (1)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 지지 가닥에 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 뉴클레오티드(위치 n)가 제공되고, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+1에 위치하며;
b) 단계 (2)/(6)에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 지지 가닥의 파트너 뉴클레오티드의 반대편 위치(위치 n)에서 합성 가닥에 혼입되고, 그 결과 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루며;
c) 단계 (3)/(7)에서, 지지 가닥은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드로부터 제2 뉴클레오티드(위치 n-1)와 제3 뉴클레오티드(위치 n-2) 사이의 위치에서 절단되고, 여기서 절단은 범용 뉴클레오티드를 제거하고, 지지 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 이중 뉴클레오티드 돌출부를 생성하며;
d) 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단은 이중 뉴클레오티드 돌출부를 포함하고, 여기서
i. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥에서 뉴클레오티드 반대편 위치 n+1에 위치하고, 그와 쌍을 이루며;
ii. 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드(위치 n-1)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있고, 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이거나, 또는 현재 합성 사이클의 단계 (6)의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이며;
iii. 지지 가닥의 위치 n에 있는 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드와 쌍을 이루고, 다음 합성 사이클의 단계 (6)에서 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드임.
바로 상기 기재된 바와 같은 방법의 변형에서, 단계 (1)에서, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+2에 위치하고, 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에는 위치 n+2에 위치한 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 제공된다. 대안적으로, 단계 (1)에서, 지지 가닥에서 범용 뉴클레오티드는 (헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로) 위치 n+2+x에 위치하고, 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단에는 위치 n+2+x(여기서, x는 1 내지 10 또는 그 이상의 정수임)에 위치한 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 제공된다.
방법 버전 3에서와 같이, 방법 버전 5 및 이의 변형에서, 헬퍼 가닥 부분은 신규한 소정의 뉴클레오티드의 혼입 전 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 생략될 수 있다. 헬퍼 가닥 부분은 신규한 소정의 뉴클레오티드의 혼입 전, 본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 예를 들어 변성에 의해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거될 수 있다.
합성 가닥
비제한적으로, 상기 기재된 바와 같은 방법 버전 1, 2 및 3을 포함하는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 합성 방법에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 합성 가닥이 제공된다. 합성 사이클 동안, 소정의 서열의 신규한 뉴클레오티드가 각각 합성 가닥에 혼입된다. 폴리머라아제 효소는 각각의 신규한 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체/유도체 또는 비(非)뉴클레오티드의 혼입을 촉진시키는 데 사용될 수 있다. 합성 가닥은 프라이머 가닥 부분을 포함하고, 바람직하게는 헬퍼 가닥 부분을 포함한다.
헬퍼 가닥
헬퍼 가닥은 절단 단계에서 절단 효소(들)의 결합을 용이하게 하기 위해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 제공된다. 헬퍼 가닥은, 필요한 경우, 절단 단계에서 절단 효소(들)의 결합을 보장하고, 라이게이션 단계에서 라이게이션을 보장하는 대안적인 수단이 제공된다면, 생략될 수 있다. 바람직한 본 발명의 방법에서, 합성 가닥에는 헬퍼 가닥이 제공된다.
헬퍼 가닥이 절단 단계에서 절단 효소(들)의 결합을 용이하게 하는 데 적합하다면, 헬퍼 가닥의 길이, 서열 및 구조의 파라미터에 대한 특별한 요건은 존재하지 않는다.
헬퍼 가닥은 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체/유도체 및/또는 비뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 헬퍼 가닥의 서열의 영역 내에서, 지지 가닥과의 미스매치는 회피되어야 하고, GC- 및 AT-풍부 영역은 회피되어야 하며, 또한 헤어핀 또는 벌지(bulge)와 같은 2차 구조의 영역은 회피되어야 한다.
헬퍼 가닥의 길이는 10개 이상의 염기일 수 있다. 선택적으로, 헬퍼 가닥의 길이는 15개 이상의 염기, 바람직하게는 30개 이상의 염기일 수 있다. 하지만, 헬퍼 가닥이 절단 및/또는 라이게이션을 용이하게 할 수 있다면, 헬퍼 가닥의 길이는 달라질 수 있다.
헬퍼 가닥은 지지 가닥의 상응하는 영역에 하이브리드화되어야 한다. 헬퍼 가닥이 절단 단계에서 절단 효소(들)의 결합 및/또는 라이게이션 단계에서 리가아제 효소의 결합을 용이하게 할 수 있다면, 헬퍼 가닥 전체가 지지 가닥의 상응하는 영역에 하이브리드화되는 것이 필수적인 것은 아니다. 따라서, 헬퍼 가닥과 지지 가닥의 상응하는 영역의 미스매치는 용인될 수 있다. 헬퍼 가닥은 지지 가닥의 상응하는 영역보다 길 수 있다. 지지 가닥은 프라이머 가닥에서 먼 방향으로 헬퍼 가닥에 상응하는 영역을 넘어 연장될 수 있다. 헬퍼 가닥은, 예를 들어 헤어핀을 통해 지지 가닥의 상응하는 영역에 연결될 수 있다.
헬퍼 가닥은 바람직하게는, 닉 부위에서의 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 닉 부위에서의 프라이머 가닥의 말단 뉴클레오티드에 대하여 합성 가닥에서 다음 순차 뉴클레오티드 위치를 점유하도록, 지지 가닥에 하이브리드화된다. 따라서, 이러한 구성에서, 헬퍼 가닥과 프라이머 가닥 사이에는 뉴클레오티드 위치 갭(gap)이 존재하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 헬퍼 가닥과 프라이머 가닥은 단일 가닥 절단부 또는 닉의 존재로 인해 물리적으로 분리될 것이다. 바람직하게는, 닉 부위에서의 헬퍼 가닥의 말단 핵염기는 지지 가닥의 그의 파트너 뉴클레오티드에 하이브리드화된다.
범용 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 헬퍼 가닥의 뉴클레오티드는, 임의의 적합한 뉴클레오티드일 수 있다. 바람직하게는, 분자의 나선 구조를 왜곡시킬 수 있는 짝짓기는 회피되어야 한다. 바람직하게는, 시토신은 범용 뉴클레오티드에 대한 파트너로서 작용한다. 특히 바람직한 구현예에서, 범용 뉴클레오티드는 이노신, 또는 이의 유사체, 변이체 또는 유도체이고, 헬퍼 가닥의 범용 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드는 시토신이다.
헬퍼 가닥의 제거
예시적인 방법 버전 1, 2 및 3을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 합성 방법에서, 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계 (1)에서(즉 제1 사이클에서)(101, 106, 201, 206, 301, 306), 합성 가닥은 헬퍼 가닥 없이 제공될 수 있다. 이는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 폴리머라아제의 결합을 개선시킬 수 있다.
나아가, 임의의 하나 이상의 합성 사이클에서, 또는 모든 합성 사이클에서, 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드를 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계 후, 및 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드를 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥에 혼입하는 단계 전, 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분은 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거될 수 있다. 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분은, 비제한적으로, 하기를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거될 수 있다: (i) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 약 80℃ 내지 약 95℃의 온도로 가열하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 헬퍼 가닥 부분을 분리시킴, (ii) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 8M 우레아와 같은 우레아 용액으로 처리하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 헬퍼 가닥 부분을 분리시킴, (iii) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 100% 포름아미드와 같은 포름아미드 또는 포름아미드 용액으로 처리하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로 헬퍼 가닥 부분을 분리시킴, 또는 (iv) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를, 헬퍼 가닥 부분의 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열의 영역을 포함하는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자와 접촉시켜, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 헬퍼 가닥 부분의 하이브리드화를 경쟁적으로 저해시킴.
이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드를 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계 후, 및 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드를 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥에 혼입하는 단계 전, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 헬퍼 가닥에 부분이 제거되는 방법에서, 절단 단계는 헬퍼 가닥에 의해 제공되는 이중 가닥의 부재 하에서 지지 가닥을 절단하는 것을 포함할 것이다. 본원에 개시된 임의의 적합한 효소로부터 선택되는 바와 같은 임의의 적합한 효소가 상기와 같은 절단 단계를 수행하기 위해 선택될 수 있다.
프라이머 가닥
프라이머 가닥은 충분한 길이를 가져야 하며, 폴리머라아제 효소가 합성을 개시하는 것, 즉 닉 부위에서 프라이머 가닥의 말단에 신규한 뉴클레오티드의 혼입을 촉진시키는 것을 가능하게 하는 데 적합하도록 서열 및 구조를 가져야 한다.
프라이머 가닥은 신규한 폴리뉴클레오티드 합성을 프라이밍하도록 작용할 수 있는 서열을 영역을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 1 내지 도 3에 각각 도시된 구조에서 점선으로 제시됨). 프라이머 가닥은 신규한 폴리뉴클레오티드 합성을 프라이밍하도록 작용할 수 있는 서열을 영역으로 이루어질 수 있으므로, 프라이머 가닥은 전부 신규한 폴리뉴클레오티드 합성을 프라이밍하도록 작용할 수 있는 서열일 수 있다.
프라이머 가닥이 신규한 폴리뉴클레오티드 합성을 프라이밍하는 데 적합하다면, 프라이머 가닥의 길이, 서열 및 구조의 파라미터에 대한 특별한 요건은 없다.
프라이머 가닥은 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체/유도체 및/또는 비뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
당업자는 신규한 폴리뉴클레오티드 합성을 프라이밍할 수 있는 프라이머 가닥을 용이하게 구성할 수 있다. 따라서, 신규한 폴리뉴클레오티드 합성을 프라이밍하도록 작용할 수 있는 프라이머 가닥의 서열 영역 내에서, 지지 가닥과의 미스매치는 회피되어야 하고, GC- 및 AT-풍부 영역은 회피되어야 하며, 또한 헤어핀 또는 벌지와 같은 2차 구조의 영역은 회피되어야 한다.
신규한 폴리뉴클레오티드 합성을 프라이밍하도록 작용할 수 있는 프라이머 가닥의 서열 영역의 길이는, 사용되는 폴리머라아제 효소 및 선호에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 영역의 길이는 7개 이상의 염기, 8개 이상의 염기, 9개 이상의 염기 또는 10개 이상의 염기일 수 있다. 선택적으로, 이러한 영역의 길이는 15개 이상의 염기, 바람직하게는30개 이상의 염기일 수 있다.
프라이머 가닥은 지지 가닥의 상응하는 영역에 하이브리드화되어야 한다. 프라이머 가닥이 신규한 폴리뉴클레오티드 합성을 프라이밍할 수 있다면, 프라이머 가닥 전체가 지지 가닥의 상응하는 영역에 하이브리드화될 필요는 없다. 따라서, 프라이머 가닥과 지지 가닥의 상응하는 영역 간 미스매치는 어느 정도 용인될 수 있다. 바람직하게는, 신규한 폴리뉴클레오티드 합성을 프라이밍하도록 작용할 수 있는 프라이머 가닥의 서열 영역은, 지지 가닥의 상응하는 핵염기에 상보적인 핵염기를 포함해야 한다.
프라이머 가닥은 지지 가닥의 상응하는 영역보다 길 수 있다. 지지 가닥은 헬퍼 가닥에서 먼 방향으로 프라이머 가닥에 상응하는 영역을 넘어서 연장될 수 있다. 프라이머 가닥은, 예를 들어 헤어핀을 통해 지지 가닥의 상응하는 영역에 연결될 수 있다.
지지 가닥
상기 기재된 바와 같이, 비제한적으로, 예시적인 방법 버전 1, 2 및 3을 포함하는 본 발명의 방법에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 지지 가닥이 제공된다. 지지 가닥은 합성 가닥에 하이브리드화된다. 상기 기재된 바와 같이, 지지 가닥이 프라이머 가닥 부분, 및 포함되는 경우, 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분과 호환 가능하다면, 지지 가닥의 길이, 서열 및 구조의 파라미터에 대한 특별한 요건은 없다.
RNA 합성
DNA 합성에 대하여 기재된 방법은 RNA의 합성을 위해 조정될 수 있다. 하나의 조정에서, 방법 버전 1 내지 3에 대하여 기재된 합성 단계가 조정될 수 있다. 따라서, 방법 버전 1 내지 3 각각에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥은 상기 기재된 바와 같은 DNA 가닥이다. 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분은 RNA 가닥이다. 헬퍼 가닥은, 존재하는 경우, 바람직하게는 RNA 가닥이다. 헬퍼 가닥은, 존재하는 경우, DNA 가닥일 수 있다.
뉴클레오티드는 상기 기재된 바와 같이, 가역적 종결자기를 포함하도록 변형될 수 있는 리보뉴클레오시드-5'-O-트리포스페이트(NTP)로부터 혼입될 수 있다. 바람직하게는, 3'-O-변형된-리보뉴클레오시드-5'-O- 트리포스페이트가 사용된다. 변형된 뉴클레오티드는 RNA 폴리머라아제의 작용에 의해 혼입된다.
따라서, 방법 버전 1 내지 3에 관한 상기 설명은, 기재된 바와 같이 조정되는 것을 제외하고, RNA 합성에 준용하여 적용될 수 있다. 방법 버전 1 및 2에 관한 예시적인 조정된 반응 개략도는 도 23 내지 도 25에 제시되어 있다. 방법 버전 3은 동일한 방식으로 조정될 수 있다. RNA 합성을 위해 조정된 임의의 방법에서, 지지 가닥, 프라이머 가닥, 헬퍼 가닥, 라이게이션 폴리뉴클레오티드 및 범용 뉴클레오티드의 상기 설명은, 기재된 바와 같이 조정되는 것을 제외하고, 준용하여 적용될 수 있다. 범용 뉴클레오티드를 포함하는 지지 가닥이 DNA 가닥이기 때문에, 상기 기재된 바와 같은 절단 단계 및 절단 위치가 준용하여 적용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, SplintR DNA 리가아제가 라이게이션 단계에서 사용된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 합성 방법의 특정 구현예뿐만 아니라, 그러한 방법에 사용되는 예시적인 작제물을 예시한다. 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1. 헬퍼 가닥의 부재 하에서의 합성.
본 실시예는 부분 이중 가닥 DNA 상에의 3'-O-변형된 dNTP의 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 4 개의 단계를 사용하며, 이때 제1 단계가 범용 뉴클레오티드, 이의 특별한 경우 이노신의 반대편에서 일어나는, 폴리뉴클레오티드의 합성을 기재한다.
단계1 : 혼입
제1 단계는 DNA 폴리머라아제에 의한 효소적 혼입에 의한 올리고뉴클레오티드에의 3'-O-보호된 단일 뉴클레오티드의 제어된 첨가를 기재한다(도 5a).
재료 및 방법
재료
1. 3'-O-변형된 dNTP는 Jian Wu의 박사 논문［Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis, Columbia University, 2008]에 기재된 프로토콜에 따라 자체적으로 합성하였다. 합성에 대한 프로토콜은 또한 특허 출원 공보[J. William Efcavitch, Juliesta E. Sylvester, Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis, Molecular Assemblies US2016/0108382A1]에 기재되어 있다.
2. 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma-Aldrich로부터 입수하였다(도 5h). 스톡(stock) 용액은 100 μM의 농도로 제조하였다.
3. 3-O-변형된 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 New England BioLabs에서 제작된 Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용하였다. 하지만, 변형된 dNTP를 혼입시킬 수 있는 임의의 DNA 폴리머라아제가 사용될 수 있었다.
2가지 유형의 가역적 종결자를 시험하였다:
Figure pct00047
방법
1. 2 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs)을, 1.5ml 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 12.25 ㎕의 멸균 탈이온수(ELGA VEOLIA)와 혼합하였다.
2. 0.5 ㎕의 10 μM 프라이머(합성된 가닥)(5 pmol, 1 당량)(서열번호 1, 도 5h) 및 0.75 ㎕의 10 μM 주형(지지 가닥)(6 pmol, 1.5 당량)(서열번호 2, 도 5h)을, 반응 혼합물에 첨가하였다.
3. 3'-O-변형된-dTTP(100 μM, 2 ㎕) 및 MnCl2(40 mM, 1 ㎕)를 첨가하였다.
4. 이어서, 1.5 ㎕의 Therminator IX DNA 폴리머라아제(15 U, New England BioLabs)를 첨가하였다. 하지만, 변형된 dNTP를 혼입시킬 수 있는 임의의 DNA 폴리머라아제가 사용될 수 있었다.
5. 반응액을 65℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
6. TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 중단시켰다.
7. 반응액을 TBE 완충액을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔(15%) 상에서 분리하고, ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad)으로 가시화하였다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 반응 혼합물을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브 내 5 ㎕의 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)에 첨가하고, 열 ThermoMixer(Eppendorf)를 사용하여 5분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, 5 ㎕의 샘플을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(X-cell sure lock module)(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 겔을 가시화하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
결과
New England BioLabs에서 맞춤 제작된 Therminator IX DNA 폴리머라아제는, 범용 뉴클레오티드, 예를 들어 이노신 반대편에 3'-O-변형된-dNTP를 혼입시킬 수 있는 효율적인 DNA 폴리머라아제이다(도 5b 내지 도 5c).
이노신 반대편에서의 효율적인 혼입은 65℃에서 일어났다(도 5d 내지 도 5e).
이노신 반대편에서의 3'-O-변형된-dTTP의 혼입은 Mn2 + 이온의 존재를 필요로 한다(도 5f 내지 도 5g). 성공적인 전환은 도 5c, 도 5e, 도 5g 및 도 5h에 볼드체로 표시되어 있다.
결론
이노신 반대편에서의 3'-O-변형된-dTTP의 혼입은, New England BioLabs에서 맞춤 제작된 Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용하여, Mn2 + 이온의 존재 하에서 및 65℃의 온도에서 특히 높은 효율로 달성될 수 있다.
단계2 : 절단
제2 단계는 hAAG/Endo VIII 또는 hAAG/화학 염기를 이용한 2-단계 폴리뉴클레오티드의 절단을 기재한다(도 6a).
재료 및 방법
재료
1. 실시예 1에서 사용한 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma Aldrich에서 합성하였다(서열에 대해서는 도 6e의 표 참조).
2. 올리고뉴클레오티드를 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 사용하여 100uM의 스톡 농도로 희석하였다.
방법
올리고뉴클레오티드에 대한 절단 반응은 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 피펫(Gilson)을 사용하여, 41㎕ 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 1.5ml 에펜도르프 튜브로 옮겼다.
2. 이어서, 5㎕의 10X ThermoPol® 반응 완충액 NEB(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton® X-100, pH 8.8)을 상기 에펜도르프 튜브에 첨가하였다.
3. 각각의 올리고뉴클레오티드 1㎕(도 6e); 주형(서열번호 3) 또는 임의의 형광 태깅된 긴 올리고 가닥, T를 갖는 프라이머(서열번호 4) 및 대조군(서열번호 5)을 모두 5pmol로 상기 튜브에 첨가하였다.
4. 1㎕의 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라아제(hAAG) NEB(10유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
5. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
6. 전형적으로, 인큐베이션 시간이 경과한 후, 효소 열 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 반응을 종결시켰다.
주위 조건 하에서의 정제. 샘플 혼합물을 하기 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다:
1. 500 ㎕의 완충액 PNI QIAGEN(5M 구아니디늄 클로라이드)을 샘플에 첨가하고, 피펫으로 조심스럽게 재현탁시켜 혼합하였다.
2. 혼합물을 QIAquick 스핀 컬럼(QIAGEN)으로 옮기고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
3. 원심분리 후, 통과액(flow-through)을 제거하고, 750 ㎕의 완충액 PE QIAGEN(10mM Tris-HCl pH 7.5 및 80% 에탄올)을 스핀 컬럼에 첨가하고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
4. 통과액을 제거하고, 스핀 컬럼을 13000 rpm에서 추가 1분 동안 원심분리하여, 잔류 PE 완충액을 제거하였다.
5. 이어서, 스핀 컬럼을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브에 위치시켰다.
6. DNA 용리를 위해, 50 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 컬럼 막 중앙에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 정치시켰다.
7. 이어서, 튜브를 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 용리된 DNA 농도를 측정하고, 후속 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대(pedestal)에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는(lint-free) 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
생성된 무염기 부위의 절단을 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 2 ㎕(10-100ng/㎕) DNA를 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브에 첨가하였다.
2. 40 ㎕(0.2M) NaOH 또는 1.5 ㎕ Endo VIII NEB(10유닛/㎕) 및 5 ㎕ 10X 반응 완충액 NEB(10 mM Tris-HCl, 75 mM NaCl, 1 mM EDTA, 25℃에서 pH 8)를 또한 상기 튜브에 첨가하고, 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13000 rpm에서 5초 동안 원심분리하였다.
3. 수득한 혼합물은 NaOH 처리된 샘플의 경우 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 반면, Endo VIII 반응 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
4. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응 혼합물을 상기 개략된 정제 프로토콜의 단계 1 내지 7을 사용하여 정제하였다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 DNA 및 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 열 써모블록(heat thermoblock)(Eppendorf)을 사용하여 2분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, DNA 혼합물을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. 겔에서 DNA의 검출 및 가시화는 Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 수행하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
결과 및 결론
헬퍼 가닥의 부재 하에서의 절단 반응은 약 7% : 93%의 절단된 DNA 대 절단되지 않은 DNA 비의 낮은 %수율을 나타냈다(도 6b 내지 도 6d).
절단 결과는, 이러한 특정 실시예에서, 사용된 특정 시약에 기초하여, 양성 대조군과 비교하여 헬퍼 가닥의 부재 하에서는 절단된 DNA의 낮은 수율이 수득됨을 나타냈다. 또한, 무염기 부위의 절단을 위한 화학 염기의 사용은 EndoVIII 절단과 비교하여 시간 소모가 적었다.
단계 3: 라이게이션
제3 단계는 헬퍼 가닥의 부재 하에서 DNA 리가아제를 이용한 폴리뉴클레오티드의 라이게이션을 기재한다. 도식화된 예시는 도 7에 제시되어 있다.
재료 및 방법
재료
1. 실시예 1에서 사용한 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma Aldrich에서 합성하였다(서열에 대해서는 도 7c의 표 참조).
2. 올리고뉴클레오티드를 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 사용하여 100uM의 스톡 농도로 희석하였다.
방법
올리고뉴클레오티드에 대한 라이게이션 반응을 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 피펫(Gilson)을 사용하여 16㎕ 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 1.5ml 에펜도르프 튜브로 옮겼다.
2. 이어서, 10㎕의 2X Quick 라이게이션 반응 완충액 NEB(132 mM Tris-HCl, 20mM MgCl2, 2mM 디티오트레이톨, 2mM ATP, 15% 폴리에틸렌 글리콜(PEG6000) 및 25℃에서 pH 7.6)를 상기 에펜도르프 튜브에 첨가하였다.
3. 각각의 올리고뉴클레오티드 1㎕(도 7c); TAMRA 또는 임의의 형광 태깅된 포스페이트 가닥(서열번호 7), T를 갖는 프라이머(서열번호 8) 및 이노신 가닥(서열번호 9)을, 모두 5 pmol로, 상기 튜브에 첨가하였다.
4. 1㎕의 Quick T4 DNA 리가아제 NEB(400유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
5. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
6. 전형적으로, 인큐베이션 시간이 경과한 후, TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 종결시켰다.
7. 반응 혼합물을 상기 기재된 바와 같은 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하고, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
5. 폴리아크릴아미드 겔 상에서 DNA 정제를 수행하고, 상기 기재된 단계 5 내지 8에서의 절차에 따라 가시화하였다. 도입된 조건 또는 시약에는 변화가 없었다.
결과 및 결론
이러한 특정 실시예에서, 사용된 특정 시약에 기초하여, 헬퍼 가닥의 부재 하에서 실온(24℃)에서, DNA 리가아제, 이의 특별한 경우 신속 T4 DNA 리가아제를 이용한 올리고뉴클레오티드의 라이게이션은, 라이게이션 생성물의 양을 감소시켰다(도 7b).
실시예 2. 헬퍼 가닥을 이용한 버전 1 화학.
본 실시예는 닉 부위로부터의 3'-O-변형된 dNTP의 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 4 개의 단계를 사용하며, 이때 제1 단계가 범용 뉴클레오티드, 이의 특별한 경우 이노신의 반대편에서 일어나는, 폴리뉴클레오티드의 합성을 기재한다.
상기 방법은 라이게이션 및 절단 단계의 효율을 개선시키는 헬퍼 가닥을 사용한다.
단계1 : 혼입
제1 단계는 DNA 폴리머라아제를 사용하는 효소적 혼입에 의한 올리고뉴클레오티드에의 3'-O-보호된 단일 뉴클레오티드의 제어된 첨가를 기재한다(도 8a).
재료 및 방법
재료
1. 3'-O-변형된 dNTP는 Jian Wu의 박사 논문[Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis. Columbia University, 2008]에 기재된 프로토콜에 따라 자체적으로 합성하였다. 합성에 대한 프로토콜은 또한 특허 출원 공보[J. William Efcavitch, Juliesta E. Sylvester, Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis, Molecular Assemblies US2016/0108382A1]에 기재되어 있다.
2. 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma-Aldrich로부터 입수하였다. 스톡 용액은 100 μM의 농도로 제조하였다. 올리고뉴클레오티드는 도 8b에 제시되어 있다.
3. 3-O-변형된 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 New England BioLabs에서 제작된 Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용하였다.
2가지 유형의 가역적 종결자를 시험하였다:
Figure pct00048
방법
1. 2 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs)을, 1.5ml 에펜도르프 튜브에서 10.25 ㎕의 멸균 탈이온수(ELGA VEOLIA)와 혼합하였다.
2. 0.5 ㎕의 10 μM 프라이머(5 pmol, 1 당량)(서열번호 10, 도 8b의 표), 0.75 ㎕의 10 μM 주형(6 pmol, 1.5당량)(서열번호 11, 도 8b의 표), 2 ㎕의 10 μM 헬퍼 가닥(서열번호 12, 도 8b의 표)을, 반응 혼합물에 첨가하였다.
3. 3'-O-변형된-dTTP(100 μM, 2 ㎕) 및 MnCl2(40 mM, 1 ㎕)를 첨가하였다.
4. 이어서, 1.5 ㎕의 Therminator IX DNA 폴리머라아제(15 U, New England BioLabs)를 첨가하였다.
5. 반응액을 65℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
6. TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 중단시켰다.
7. 반응액을 TBE 완충액을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔(15%) 상에서 분리하고, ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad)으로 가시화하였다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 반응 혼합물을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브 내 5 ㎕의 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)에 첨가하고, 열 ThermoMixer(Eppendorf)를 사용하여 5분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, 5 ㎕의 샘플을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 겔을 가시화하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
혼입 단계는 상기 기재된 프로토콜에 따라 연구할 수 있다.
단계 2: 절단
제2 단계는 hAAG/Endo VIII 또는 hAAG/화학 염기(x2)를 이용한 2-단계 폴리뉴클레오티드의 절단을 기재한다(도 9a).
재료 및 방법
재료
1. 실시예 2에서 사용한 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma Aldrich에서 합성하였다(서열에 대해서는 도 9f 참조).
2. 올리고뉴클레오티드를 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 사용하여 100uM의 스톡 농도로 희석하였다.
방법
올리고뉴클레오티드에 대한 절단 반응은 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 피펫(Gilson)을 사용하여 41㎕ 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 옮겼다.
2. 이어서, 5㎕의 10X ThermoPol® 반응 완충액 NEB(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton® X-100, pH 8.8)를 상기 에펜도르프 튜브에 첨가하였다.
3. 각각의 올리고뉴클레오티드 1㎕(도 9f); 주형(서열번호 13) 또는 임의의 형광 태깅된 긴 올리고 가닥, T를 갖는 프라이머(서열번호 14), 대조군(서열번호 15) 및 헬퍼 가닥(서열번호 16)을, 모두 5 pmol로, 상기 튜브에 첨가하였다.
4. 1㎕의 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라아제(hAAG) NEB(10 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
5. 대안적인 염기를 사용한 반응에서, 1㎕의 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라아제(hAAG) NEB(100 유닛/㎕)를 첨가하였다.
6. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
7. 전형적으로, 인큐베이션 시간이 경과한 후, 효소 열 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 반응을 종결시켰다.
주위 조건 하에서의 정제. 샘플 혼합물을 하기 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다:
1. 500 ㎕의 완충액 PNI QIAGEN(5M 구아니디늄 클로라이드)을 샘플에 첨가하고, 피펫으로 조심스럽게 재현탁시켜 혼합하였다.
2. 혼합물을 QIAquick 스핀 컬럼(QIAGEN)으로 옮기고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
3. 원심분리 후, 통과액을 제거하고, 750 ㎕의 완충액 PE QIAGEN(10mM Tris-HCl pH 7.5 및 80% 에탄올)을 스핀 컬럼에 첨가하고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
4. 통과액을 제거하고, 스핀 컬럼을 13000 rpm에서 추가 1분 동안 원심분리하여, 잔류 PE 완충액을 제거하였다.
5. 이어서, 스핀 컬럼을 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 위치시켰다.
6. DNA 용리를 위해, 50 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 컬럼 막 중앙에 첨가하고, 실온에서 1분 동안 정치시켰다.
7. 이어서, 튜브를 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 용리된 DNA 농도를 측정하고, 후속 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
생성된 무염기 부위의 절단은 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 2 ㎕(10-100ng/㎕) DNA를 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브에 첨가하였다.
2. 40 ㎕(0.2M) NaOH 또는 1.5 ㎕ Endo VIII NEB(10유닛/㎕) 및 5 ㎕ 10X 반응 완충액 NEB(10 mM Tris-HCl, 75 mM NaCl, 1 mM EDTA, 25℃에서 pH 8)를 또한 상기 튜브에 첨가하고, 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13000 rpm에서 5초 동안 원심분리하였다.
3. 수득한 혼합물은 0.2 M NaOH 처리된 샘플의 경우 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 반면, Endo VIII 반응 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
4. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응 혼합물을 상기 기재된 바와 같은 정제 프로토콜의 단계 1 내지 7을 사용하여 정제하였다.
대안적인 염기 화학물질을 사용한 생성된 무염기 부위의 절단은 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 1 ㎕(10-100 ng/㎕) DNA를 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 이어서, 실온에서 아세트산 용액(Sigma)(99.8%)을 이용하여 pH 7.4로 완충된 2 ㎕의 N,N' 디메틸에틸렌디아민(Sigma)(100mM)을, 상기 튜브에 첨가하였다.
2. 20 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 튜브에 첨가하고, 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13000 rpm에서 5초 동안 원심분리하였다.
3. 수득한 혼합물을 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
4. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응 혼합물을 상기 기재된 정제 프로토콜의 단계 1 내지 7을 사용하여 정제하였다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 DNA 및 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 열 써모블록(Eppendorf)을 사용하여 2분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, DNA 혼합물을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. 겔에서 DNA의 검출 및 가시화는 Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 수행하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
결과
hAAG DNA 글리코실라아제에 의한 범용 뉴클레오티드, 이의 특별한 경우 이노신을 포함하는 절단 부위에서의 절단 효율은, 헬퍼 가닥의 부재 하 10%에서 헬퍼 가닥의 존재 하 50%로 유의하게 증가하였다(도 9b). hAAG 및 엔도뉴클레아제 VIII는 hAAG 및 NaOH(50%)보다 낮은 효율(10%)로 이노신을 절단한다. 0.2M NaOH을 사용한 화학적 절단은, 닉이 있는(nicked) DNA를 사용한 기재된 시스템에서의 엔도뉴클레아제 VIII보다 AP 부위의 절단에 바람직한 것으로 나타났다(도 9c). 중성pH에서의 온건한 N,N'-디메틸에틸렌디아민은 0.2M NaOH 만큼 무염기 부위를 절단하는 데 높은 효율을 가지므로, 엔도뉴클레아제 VIII 및 NaOH와 비교하여 바람직하다(도 9d 내지 도 9e).
결론
3가지 방법으로 이노신을 함유한 DNA의 절단을 평가하였다. 하나의 완전한 효소적 방법 - hAAG/엔도뉴클레아제 VIII, 및 화학적 및 효소적 절단을 조합한 2개의 방법 - hAAG/NaOH 및 hAAG/디메틸에틸아민을, 실시예 2에서의 DNA 절단에 대해 연구하였다.
hAAG/NaOH 결과는, 헬퍼 가닥의 부재(10%)와 비교하여 헬퍼 가닥의 존재 하에서 절단된 DNA(50%)의 효율이 훨씬 높다는 것을 나타냈다. 이러한 특정 실시예에, 사용된 특정 시약에 기초하여, 헬퍼 가닥은 DNA 절단 수율을 증가시킨다.
NaOH에 대한 대체물로서 엔도뉴클레아제 VIII을 사용한 효소적 절단은 헬퍼 가닥의 존재 하에서 NaOH(50%)와 비교하여 덜 효율적이었다(10%).
대안적인 온건한 화학 염기 N,N'-디메틸에틸렌디아민을 포함시키는 것은 NaOH 만큼 효율적인 AP 부위의 높은 절단 효율을 유도하였고, 10x hAAG 효소의 첨가와 함께인 것은 절단된 DNA에 대한 유의한 증가를 유도하였다(도 9e 참조).
단계 3: 라이게이션
제3 단계는, 헬퍼 가닥의 존재 하에서 DNA 리가아제를 이용한 폴리뉴클레오티드의 라이게이션을 기재한다. 도식화된 예시는 도 10a에 제시되어 있다.
재료 및 방법
재료
1. 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma-Aldrich에서 합성하였다(서열에 대해서는 도 10d 참조).
2. 올리고뉴클레오티드를 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 사용하여 100uM의 스톡 농도로 희석하였다.
방법
올리고뉴클레오티드에 대한 라이게이션 반응을 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 피펫(Gilson)을 사용하여 16㎕ 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 옮겼다.
2. 이어서, 10㎕의 2X 신속 라이게이션 반응 완충액 NEB(132 mM Tris-HCl, 20mM MgCl2, 2mM 디티오트레이톨, 2mM ATP, 15% 폴리에틸렌 글리콜(PEG6000) 및 25℃에서 pH 7.6)를, 상기 에펜도르프 튜브에 첨가하였다.
3. 각각의 올리고뉴클레오티드 1㎕(도 10d); TAMRA 또는 임의의 형광 태깅된 포스페이트 가닥(서열번호 18), T를 갖는 프라이머(서열번호 19) 및 이노신 가닥(서열번호 20) 및 헬퍼 가닥(서열번호 21)을, 모두 5 pmol로, 상기 튜브에 첨가하였다.
4. 1㎕의 신속 T4 DNA 리가아제 NEB(400 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
5. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
6. 전형적으로, 인큐베이션 시간이 경과한 후, TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 종결시켰다.
7. 반응 혼합물을 상기 기재된 바와 같은 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
5. 폴리아크릴아미드 겔 상에서 DNA 정제를 수행하고, 상기 단계 5 내지 8에서의 절차에 따라 가시화하였다. 도입된 조건 또는 시약에는 변화가 없었다.
결과 및 결론
이러한 특정 실시예에서, 사용된 특정 시약에 기초하여, 헬퍼 가닥의 부재 하에서는 감소된 라이게이션 활성이 관찰되었지만(도 10b), 헬퍼 가닥의 존재 하에서 라이게이션은 높은 효율로 진행되었고(도 10c), 생성물은 높은 수율로 형성되었다.
실시예 3. 헬퍼 가닥을 이용한 버전 2 화학.
본 실시예는 부분 이중 가닥 DNA 상에의 3'-O- 변형된 dNTP의 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 4 개의 단계를 사용하며, 이때 혼입의 제1 단계가 범용 뉴클레오티드, 이의 특별한 경우 이노신에 인접한 지지 가닥에 위치한 자연적으로 상보적인 뉴클레오티드의 반대편에서 일어나는, 폴리뉴클레오티드의 합성을 기재한다.
단계1 : 혼입
재료 및 방법
재료
제1 단계는 DNA 폴리머라아제에 의한 효소적 혼입에 의한 올리고뉴클레오티드에의 3'-O-보호된 단일 뉴클레오티드의 제어된 첨가를 기재한다(도 11a).
1. 3'-O-변형된 dNTP는 Jian Wu의 박사 논문[Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis. Columbia University, 2008]에 기재된 프로토콜에 따라 자체적으로 합성하였다. 합성에 대한 프로토콜은 또한 특허 출원 공보[J. William Efcavitch, Juliesta E. Sylvester, Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis, Molecular Assemblies US2016/0108382A1]에 기재되어 있다.
2. 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma-Aldrich로부터 입수하였다(도 11j). 스톡 용액은 100 μM의 농도로 제조하였다.
3. 3-O-변형된 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 New England BioLabs에서 제작된 Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용하였다.
모든 dNTP의 3'-O-아지도메틸 가역적 종결자를 혼입에 대하여 독립적으로 시험하였다:
Figure pct00049
Figure pct00050
방법
1. 2 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs)을 1.5ml 에펜도르프 튜브에서 12.25 ㎕의 멸균 탈이온수(ELGA VEOLIA)와 혼합하였다.
2. 0.5 ㎕의 10 μM 프라이머(5 pmol, 1 당량)(서열번호 22, 도 11j) 및 0.75 ㎕의 10 μM 주형-A/G/T/C(6 pmol, 1.5 당량)(서열번호 23 내지 26, 도 11j) 및 1 ㎕의 10 μM 헬퍼 가닥-T/C/A/G(10 pmol, 2 당량)(서열번호 27 내지 30, 도 11j)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
3. 3'-O-변형된-dTTP/dCTP/dATP/dGTP(100 μM, 2 ㎕) 및 MnCl2(40 mM, 1 ㎕)를 첨가하였다.
4. 이어서, 1.5 ㎕의 Therminator IX DNA 폴리머라아제(15 U, New England BioLabs)를 첨가하였다.
5. 반응액을 65℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
6. TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 중단시켰다.
7. 반응액을 TBE 완충액을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔(15%) 상에서 분리하고, ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad)으로 가시화하였다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 반응 혼합물을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브 내 5 ㎕의 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)에 첨가하고, 열 ThermoMixer(Eppendorf)를 사용하여 5분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, 5 ㎕의 샘플을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 겔을 가시화하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
결과 및 결론
Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용한 3-O-아지도메틸-dTTP의 혼입에 대한 온도 평가에 대하여, 결과는 라이게이션을 위한 헬퍼 가닥의 존재 하에서 3'-O-아지도메틸-dTTP의 혼입은 5분 후 90%가 됨을 나타낸다.
프라이머의 10%는 37℃ 및 47℃에서 20분 후 연장되지 않은 채로 남아있었다.
2mM Mn2 + 이온 및 37℃의 온도에서의 Therminator IX DNA 폴리머라아제는, (이전 사이클로부터의 라이게이션 단계로부터의) 헬퍼 가닥의 존재 하에서 높은 효율로 DNA의 상보적 염기 반대편에서의 3'-O-변형된-dNTP의 혼입을 위한 양호한 조건을 제공한다.
단계 2: 절단
제2 단계는 엔도뉴클레아제 V를 이용한 1-단계 폴리뉴클레오티드의 절단을 기재한다(도 12a).
재료 및 방법
재료
1. 실시예 3에서 사용한 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma Aldrich에서 합성하였다(서열에 대해서는 도 12d의 표 참조).
2. 올리고뉴클레오티드를 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 사용하여 100uM의 스톡 농도로 희석하였다.
방법
올리고뉴클레오티드에 대한 절단 반응은 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 피펫(Gilson)을 사용하여 41 ㎕ 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 옮겼다.
2. 이어서, 5㎕의 10X Reaction buffer® NEB(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)를, 상기 에펜도르프 튜브에 첨가하였다.
3. 각각의 올리고뉴클레오티드 1㎕(도 12d); 주형(서열번호 31) 또는 임의의 형광 태깅된 긴 올리고 가닥, T를 갖는 프라이머(서열번호 32) 및 대조군(서열번호 33) 및 헬퍼 가닥(서열번호 34)을, 모두 5pmol로, 상기 튜브에 첨가하였다.
4. 1㎕의 인간 엔도뉴클레아제 V(Endo V) NEB(10 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
5. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
6. 전형적으로, 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응을 효소적 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 종결시켰다.
샘플 혼합물을 하기 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다:
1. 500 ㎕의 완충액 PNI QIAGEN(5M 구아니디늄 클로라이드)을 샘플에 첨가하고, 피펫으로 조심스럽게 재현탁시켜 혼합하였다.
2. 혼합물을 QIAquick 스핀 컬럼(QIAGEN)으로 옮기고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
3. 원심분리 후, 통과액을 제거하고, 750 ㎕의 완충액 PE QIAGEN(10mM Tris-HCl pH 7.5 및 80% 에탄올)을 스핀 컬럼에 첨가하고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
4. 통과액을 제거하고, 스핀 컬럼을 13000 rpm에서 추가 1분 동안 원심분리하여, 잔류 PE 완충액을 제거하였다.
5. 스핀 컬럼을 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 위치시켰다.
6. DNA 용리를 위해, 50 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 컬럼 막 중앙에 첨가하고, 실온에서 1분 동안 정치시켰다.
7. 이어서, 튜브를 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 용리된 DNA 농도를 측정하고, 후속 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 DNA 및 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 열 써모블록(Eppendorf)을 사용하여 2분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, DNA 혼합물을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. 겔에서 DNA의 검출 및 가시화는 Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 수행하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
결과 및 결론
실시예 3으로부터의 절단 결과는, 헬퍼 가닥의 존재 또는 부재 하에서 엔도뉴클레아제 V를 이용하여 절단된 DNA의 유의하게 높은 효율이 수득될 수 있었음을 나타냈다(도 12c).
단계 3: 라이게이션
제3 단계는, 헬퍼 가닥의 존재 하에서 DNA 리가아제를 이용한 폴리뉴클레오티드의 라이게이션을 기재한다. 도식화된 예시는 도 13a에 제시되어 있다.
재료 및 방법
재료
1. 실시예 3에서 사용한 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma Aldrich에서 합성하였다(서열에 대해서는 도 13b의 표 참조).
2. 올리고뉴클레오티드를 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 사용하여 100uM의 스톡 농도로 희석하였다.
방법
올리고뉴클레오티드에 대한 라이게이션 반응을 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 피펫(Gilson)을 사용하여 16 ㎕ 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 1.5ml 에펜도르프 튜브에 옮겼다.
2. 이어서, 10 ㎕의 2X 신속 라이게이션 반응 완충액 NEB(132 mM Tris-HCl, 20mM MgCl2, 2mM 디티오트레이톨, 2mM ATP, 15% 폴리에틸렌 글리콜(PEG6000) 및 25℃에서 pH 7.6)를, 상기 에펜도르프 튜브에 첨가하였다.
3. 각각의 올리고뉴클레오티드 1 ㎕(도 13b); TAMRA 또는 임의의 형광 태깅된 포스페이트 가닥(서열번호 35), T를 갖는 프라이머(서열번호 36) 및 이노신 가닥(서열번호 37) 및 헬퍼 가닥(서열번호 38)을, 모두5 pmol의 양으로, 상기 튜브에 첨가하였다.
4. 1 ㎕의 신속 T4 DNA 리가아제 NEB(400유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
5. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
6. 전형적으로, 인큐베이션 시간이 경과한 후, TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 종결시켰다.
7. 반응 혼합물을 상기 기재된 바와 같은 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
5. 폴리아크릴아미드 겔 상에서 DNA 정제를 수행하고, 상기 기재된 단계 5 내지 8에서의 절차에 따라 가시화하였다. 도입된 조건 또는 시약에는 변화가 없었다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 DNA 및 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 열 써모블록(Eppendorf)을 사용하여 2분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, DNA 혼합물을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. 겔에서 DNA의 검출 및 가시화는 Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 수행하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
단계 4: 탈보호
Therminator IX DNA 폴리머라아제에 의한 3ㅄ-O-아지도메틸-dNTP의 혼입에 의해 DNA에 도입된 3ㅄ-O-아지도메틸기를 갖는 DNA 모델에서 탈보호 단계 (도 14a)를 연구하였다. 탈보호를 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP)으로 수행하고, 모든 천연 dNTP의 혼합물이 정제된 탈보호된 DNA의 용액에 첨가될 때의 연장 반응으로 모니터링하였다.
재료 및 방법
재료
1. 실시예 3에서 사용한 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma Aldrich에서 합성하였다(서열에 대해서는 도 14i 참조).
2. 올리고뉴클레오티드를 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 사용하여 100uM의 스톡 농도로 희석하였다.
3. 효소는 New England BioLabs에서 구입하였다.
방법
1. 2 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs)를, 1.5 ml 에펜도르프 튜브에서12.25 ㎕의 멸균 탈이온수(ELGA VEOLIA)와 혼합하였다.
2. 1 ㎕의 10 μM 프라이머(10 pmol, 1 당량)(서열번호 39, 도 14i) 및 10 μM 주형-A/G/T/C 중 어느 하나 1.5 ㎕(15 pmol, 1.5 당량)(서열번호 40 내지 43, 도 14i)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
3. 3'-O-변형된-dTTP/dCTP/dATP/dGTP(100 μM, 2 ㎕) 및 MnCl2(40mM, 1 ㎕)를 첨가하였다.
4. 이어서, 1.5 ㎕의 Therminator IX DNA 폴리머라아제(15 U, New England BioLabs)를 첨가하였다.
5. 반응액을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
6. 4 ㎕의 샘플을 취하고, 0.5 ul의 5mM dNTP 혼합물과 혼합하고, 대조군 반응을 위해 10분 동안 반응시켰다.
7. 1M TRIS 완충액(pH 7.4) 중 500 mM TCEP 40 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시켰다.
8. 반응 혼합물을 20 ㎕의 1x Thermopol® 완충액으로 용리하는 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
9. 1 ㎕의 5mM dNTP 혼합물 및 1 ㎕의 DeepVent(exo-) DNA 폴리머라아제를 정제된 반응 혼합물에 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다.
10. TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 중단시켰다.
11. 반응액을 TBE 완충액을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔(15%) 상에서 분리하고, ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad)으로 가시화하였다.
결과 및 결론
50mM TCEP는 0.2 μM DNA 모델에서 높은 효율로 3'-O-아지도메틸기를 절단하는 데 충분하지 않았다(도 14h). 대조적으로, 300mM TCEP는 0.2 μM DNA 모델에서 95% 효율로 3'-O-아지도메틸기를 성공적으로 절단하였다(도 14h).
실시예 4. 이중 헤어핀 모델을 이용한 버전 2 화학.
본 실시예는 닉 부위로부터의 3'-O- 변형된 dNTP의 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 4개의 단계를 사용하며, 제1 단계가 범용 뉴클레오티드, 이의 특별한 경우 이노신에 인접한 지지 가닥에 위치한 자연적으로 상보적인 뉴클레오티드의 반대편에서 일어나는, 2-헤어핀 모델에 대한 폴리뉴클레오티드의 합성을 기재한다.
단계1 : 혼입
제1 단계는 DNA 폴리머라아제에 의한 효소적 혼입에 의한 올리고뉴클레오티드에의 3'-O-보호된 단일 뉴클레오티드의 제어된 첨가를 기재한다(도 15a).
재료 및 방법
재료
1. 3'-O-변형된 dNTP는 Jian Wu의 박사 논문[Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis. Columbia University, 2008]에 기재된 프로토콜에 따라 자체적으로 합성하였다. 합성에 대한 프로토콜은 또한 특허 출원 공보[J. William Efcavitch, Juliesta E. Sylvester, Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis, Molecular Assemblies US2016/0108382A1]에 기재되어 있다.
2. 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma-Aldrich로부터 입수하였다(도 15c). 스톡 용액은 100 μM의 농도로 제조하였다.
3. 3-O-변형된 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 New England BioLabs에서 제작된 Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용하였다.
3'-O-아지도메틸-dTTP를 혼입에 대하여 시험하였다:
Figure pct00051
방법
1. 2 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs)을, 1.5ml 에펜도르프 튜브에서 10.25 ㎕의 멸균 탈이온수(ELGA VEOLIA)와 혼합하였다.
2. 0.5 ㎕의 10 μM 헤어핀 올리고뉴클레오티드(5 pmol, 1 당량)(서열번호 44, 도 15c)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
3. 3'-O-변형된-dTTP(100 μM, 2 ㎕) 및 MnCl2(40 mM, 1 ㎕)를 첨가하였다.
4. 이어서, 1.5 ㎕의 Therminator IX DNA 폴리머라아제(15 U, New England BioLabs)를 첨가하였다.
5. 반응액을 65℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
6. TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 중단시켰다.
7. 반응액을 TBE 완충액을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔(15%) 상에서 분리하고, ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad)으로 가시화하였다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 반응 혼합물을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브 내 5 ㎕의 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)에 첨가하고, 열 ThermoMixer(Eppendorf)를 사용하여 5분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, 5 ㎕의 샘플을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 겔을 가시화하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
결과
DNA 폴리머라아제는 헤어핀 작제물에서 이의 자연적으로 상보적인 염기 반대편에 3'-O-변형된-dTTP를 혼입시킨다.
단계2 : 절단
제2 단계는 특별한 경우 엔도뉴클레아제 V를 이용한, 헤어핀 모델의 1-단계 절단을 기재한다(도 16a).
재료 및 방법
재료
1. 실시예 4에서 사용한 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma Aldrich에서 합성하였다(서열에 대해서는 도 16c의 표 참조).
2. 올리고뉴클레오티드를 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 사용하여 100uM의 스톡 농도로 희석하였다.
방법
헤어핀 올리고뉴클레오티드에 대한 절단 반응은 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 피펫(Gilson)을 사용하여 43㎕ 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 1.5ml 에펜도르프 튜브에 옮겼다.
2. 이어서, 5㎕의 10X Reaction buffer® NEB(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)를, 상기 에펜도르프 튜브에 첨가하였다.
3. 5pmol의 양을 갖는 1㎕의 헤어핀 올리고뉴클레오티드(서열번호 45, 도 16c)를 상기 튜브에 첨가하였다.
4. 1㎕의 인간 엔도뉴클레아제 V(Endo V) NEB(30 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
5. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
6. 전형적으로, 인큐베이션 시간이 경과한 후, 효소 열 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 반응을 종결시켰다.
샘플 혼합물을 하기 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다:
1. 500 ㎕의 완충액 PNI QIAGEN(5M 구아니디늄 클로라이드)을 샘플에 첨가하고, 피펫으로 조심스럽게 재현탁시켜 혼합하였다.
2. 혼합물을 QIAquick 스핀 컬럼(QIAGEN)으로 옮기고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
3. 원심분리 후, 통과액을 제거하고, 750 ㎕의 완충액 PE QIAGEN(10mM Tris-HCl pH 7.5 및 80% 에탄올)을 스핀 컬럼에 첨가하고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
4. 통과액을 제거하고, 스핀 컬럼을 13000 rpm에서 추가 1분 동안 원심분리하여, 잔류 PE 완충액을 제거하였다.
5. 이어서, 스핀 컬럼을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브에 위치시켰다.
6. DNA 용리를 위해, 50 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 컬럼 막 중앙에 첨가하고, 실온에서 1분 동안 정치시켰다.
7. 이어서, 튜브를 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 용리된 DNA 농도를 측정하고, 후속 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 DNA 및 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 열 ThermoMixer(Eppendorf)를 사용하여 2분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, DNA 혼합물을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. 겔에서 DNA의 검출 및 가시화는 Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 수행하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
결과 및 결론
실시예 4로부터의 절단 결과는, 37℃에서 엔도뉴클레아제 V를 이용하여 소화된 헤어핀 DNA의 유의하게 높은 효율이 수득되었음을 나타냈다(도 16b).
단계 3: 라이게이션
제3 단계는 DNA 리가아제를 이용한 헤어핀 모델의 라이게이션을 기재한다. 도식화된 예시는 도 17a에 제시되어 있다.
재료 및 방법
재료
1. 실시예 4에서 사용한 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma Aldrich에서 합성하였다(서열에 대해서는 도 17c의 표 참조).
2. 올리고뉴클레오티드를 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 사용하여 100uM의 스톡 농도로 희석하였다.
방법
올리고뉴클레오티드에 대한 라이게이션 반응을 하기 절차를 사용하여 수행하였다:
1. 피펫(Gilson)을 사용하여 TAMRA 또는 임의의 형광 태깅된 포스페이트 헤어핀 올리고(서열번호 46) 1㎕(5pmol)를 1.5ml 에펜도르프 튜브에 옮겼다.
2. 이어서, 15㎕(100pmol)의 이노신-함유 헤어핀 작제물(서열번호 47)을 상기 튜브에 첨가하고, 3초 동안 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하였다.
3. 40㎕의 블런트/TA DNA 리가아제 NEB(180 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
4. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
5. 전형적으로, 인큐베이션 시간이 경과한 후, TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 종결시켰다.
6. 반응 혼합물을 상기 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
5. 폴리아크릴아미드 겔 상에서 DNA 정제를 수행하고, 상기 기재된 바와 같은 단계 5 내지 8에서의 절차에 따라 가시화하였다. 도입된 조건 또는 시약에는 변화가 없었다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화.
1. 5 ㎕의 DNA 및 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 열 ThermoMixer(Eppendorf)를 사용하여 2분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, DNA 혼합물을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. 겔에서 DNA의 검출 및 가시화는 Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 수행하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
결과
실온(24℃)에서 헬퍼 가닥의 존재 하에서 블런트/TA DNA 리가아제를 이용한 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 라이게이션은, 라이게이션된 생성물의 높은 수율을 유도하였다. 1분 후 라이게이션된 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 약 85%의 비율로 라이게이션된 DNA 생성물의 높은 수율을 나타냈다. 2분 후 라이게이션된 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 약 85%의 비율로 라이게이션된 DNA의 높은 수율을 나타냈다. 3분 후 라이게이션된 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 약 85%의 비율로 라이게이션된 DNA 생성물의 높은 수율을 나타냈다. 4분 후 라이게이션된 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 약 >85%의 비율로 라이게이션된 DNA 생성물의 높은 수율을 나타냈다(도 17b).
실시예 5. 버전 2 화학 - 이중 헤어핀 모델에 대한 완전한 사이클 .
본 실시예는 닉 부위로부터의 3'-O-변형된 dNTP의 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 4개의 단계를 사용하며, 이때 제1 단계가 범용 뉴클레오티드, 이의 특별한 경우 이노신에 인접한 지지 가닥에 위치한 자연적으로 상보적인 뉴클레오티드의 반대편에서 일어나는, 이중 헤어핀 모델에 대한 폴리뉴클레오티드의 합성을 기재한다. 헤어핀 중 하나의 말단은 부착 앵커로서 작용한다.
상기 방법은 DNA 폴리머라아제에 의한 효소적 혼입에 의한 올리고뉴클레오티드에의 3'-O-보호된 단일 뉴클레오티드의 제어된 첨가로 시작한 후, 이노신 절단, 라이게이션 및 탈보호가 이어진다(도 18a).
재료 및 방법
재료
1. 3'-O-변형된 dNTP는 Jian Wu의 박사 논문[Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis. Columbia University, 2008]에 기재된 프로토콜에 따라 자체적으로 합성하였다. 합성에 대한 프로토콜은 또한 특허 출원 공보[J. William Efcavitch, Juliesta E. Sylvester, Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis, Molecular Assemblies US2016/0108382A1]에 기재되어 있다.
2. 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma-Aldrich로부터 입수하였다(도 18c). 스톡 용액은 100 μM의 농도로 제조하였다.
3. 3-O-변형된 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 New England BioLabs에서 제작된 Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용하였다.
3'-O-아지도메틸-dTTP를 혼입에 대하여 시험하였다:
Figure pct00052
방법
1. 2 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs)을 1.5ml 에펜도르프 튜브에서 12.5 ㎕의 멸균 탈이온수(ELGA VEOLIA)와 혼합하였다.
2. 2 ㎕의 10 μM 이중 헤어핀 모델 올리고뉴클레오티드(20 pmol, 1 당량)(서열번호 48, 도 18c)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
3. 3'-O-변형된-dTTP(100 μM, 2 ㎕) 및 MnCl2(40 mM, 1 ㎕)를 첨가하였다.
4. 이어서, 1.5 ㎕의 Therminator IX DNA 폴리머라아제(15 U, New England BioLabs)를 첨가하였다.
5. 반응액을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
6. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물을 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
7. 반응 혼합물을 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
8. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
9. 1㎕의 인간 엔도뉴클레아제 V(Endo V) NEB(30 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
10. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
11. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응을 효소적 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 종결시켰다.
12. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, TBE 완충액을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔(15%) 상에서 분석하고, ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad)으로 가시화하였다.
13. 반응 혼합물을 상기 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
14. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
15. 라이게이션을 위해 100 μM 가닥 10 ㎕(1 nmol)(서열번호 49, 도 18c)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
16. 40㎕의 블런트/TA DNA 리가아제 NEB(180 유닛/㎕)를 정제된 DNA 샘플에 첨가하였다.
17. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
18. 1M TRIS 완충액(pH 7.4) 중 500 mM TCEP 40 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시켰다.
19. 반응 혼합물을 20 ㎕의 1x Thermopol® 완충액으로 용리하는 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 반응 혼합물을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브 내 5 ㎕의 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)에 첨가하고, 열 ThermoMixer(Eppendorf)를 사용하여 5분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, 5 ㎕의 샘플을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 겔을 가시화하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
5. 폴리아크릴아미드 겔 상에서 DNA 정제를 수행하고, 섹션 2의 단계 5 내지 8의 절차에 따라 가시화하였다. 도입된 조건 또는 시약에는 변화가 없었다.
샘플 혼합물을 하기 개략된 프로토콜을 사용하여 각 단계 후에 정제하였다:
1. 500 ㎕의 완충액 PNI QIAGEN(5M 구아니디늄 클로라이드)을 샘플에 첨가하고, 피펫으로 조심스럽게 재현탁시켜 혼합하였다.
2. 혼합물을 QIAquick 스핀 컬럼(QIAGEN)으로 옮기고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
3. 원심분리 후, 통과액을 제거하고, 750 ㎕의 완충액 PE QIAGEN(10mM Tris-HCl pH 7.5 및 80% 에탄올)을 스핀 컬럼에 첨가하고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
4. 통과액을 제거하고, 스핀 컬럼을 13000 rpm에서 추가 1분 동안 원심분리하여, 잔류 PE 완충액을 제거하였다.
5. 스핀 컬럼을 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 위치시켰다.
6. DNA 용리를 위해, 반응에 적절한 완충액 20 ㎕를 컬럼 막 중앙에 첨가하고, 실온에서 1분 동안 정치시켰다.
7. 이어서, 튜브를 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 용리된 DNA 농도를 측정하고, 후속 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.
결과
DNA 폴리머라아제는 이중 헤어핀 작제물에서 이의 자연적으로 상보적인 염기 반대편에 3'-O-변형된-dTTP를 혼입시킨다(도 18b).
실시예 6. 버전 2 화학 - 헬퍼 가닥을 사용한 단일 헤어핀 모델에 대한 완전한 사이클 .
본 실시예는 닉 부위로부터의 3'-O-변형된 dNTP의 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 4개의 단계를 사용하며, 이때 제1 단계가 자연적으로 상보적인 염기의 반대편에서 일어나는, 단일 헤어핀 모델에 대한 폴리뉴클레오티드의 합성을 기재한다. 상기 DNA 합성은 공정에서 헬퍼 가닥을 사용한다.
상기 방법은 DNA 폴리머라아제에 의한 효소적 혼입에 의한 올리고뉴클레오티드에의 3'-O-보호된 단일 뉴클레오티드의 제어된 첨가로 시작한 후, 이노신 절단, 라이게이션 및 탈보호가 이어진다(도 19a).
재료 및 방법
재료
1. 3'-O-변형된 dNTP는 Jian Wu의 박사 논문[Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis. Columbia University, 2008]에 기재된 프로토콜에 따라 자체적으로 합성하였다. 합성에 대한 프로토콜은 또한 특허 출원 공보[J. William Efcavitch, Juliesta E. Sylvester, Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis, Molecular Assemblies US2016/0108382A1]에 기재되어 있다.
2. 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma-Aldrich로부터 입수하였다(도 19b). 스톡 용액은 100 μM의 농도로 제조하였다.
3. 3-O-변형된 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 New England BioLabs에서 제작된 Therminator IX DNA 폴리머라아제를 사용하였다.
3'-O-아지도메틸-dTTP를 혼입에 대하여 시험하였다:
Figure pct00053
방법
1. 2 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs)을 1.5ml 에펜도르프 튜브에서 12.5 ㎕의 멸균 탈이온수(ELGA VEOLIA)와 혼합하였다.
2. 2 ㎕의 10 μM 단일 헤어핀 모델 올리고뉴클레오티드(20 pmol, 1 당량)(서열번호 50, 도 19b) 및 헬퍼 가닥(30 pmol, 1.5 당량)(서열번호 51, 도 19b)을, 반응 혼합물에 첨가하였다.
3. 3'-O-변형된-dTTP(100 μM, 2 ㎕) 및 MnCl2(40 mM, 1 ㎕)를 첨가하였다.
4. 이어서, 1.5 ㎕의 Therminator IX DNA 폴리머라아제(15 U, New England BioLabs)를 첨가하였다.
5. 반응액을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
6. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물을 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
7. 반응 혼합물을 상기 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
8. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
9. 1㎕의 인간 엔도뉴클레아제 V(Endo V) NEB(30유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
10. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
11. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응을 효소적 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 종결시켰다.
12. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, TBE 완충액을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔(15%) 상에서 분석하고, ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad)으로 가시화하였다.
13. 반응 혼합물을 상기 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
14. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
15. 라이게이션을 위한 100 μM 가닥 10 ㎕(1 nmol)(서열번호 52, 도 19b) 및 라이게이션을 위한 100 μM 헬퍼 가닥 10 ㎕(1 nmol)(서열번호 53, 도 19b)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
16. 40㎕의 블런트/TA DNA 리가아제 NEB(180 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
17. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
18. 1M TRIS 완충액(pH 7.4) 중 500 mM TCEP 40 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시켰다.
19. 반응 혼합물을 20 ㎕의 1x Thermopol® 완충액으로 용리하는 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
20. 전형적으로, 인큐베이션 시간이 경과한 후, TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 종결시켰다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 반응 혼합물을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브 내 5 ㎕의 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)에 첨가하고, 열 ThermoMixer(Eppendorf)를 사용하여 5분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, 5 ㎕의 샘플을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 겔을 가시화하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
5. 폴리아크릴아미드 겔 상에서 DNA 정제를 수행하고, 단계 5 내지 8에 상기 기재된 절차에 따라 가시화하였다. 도입된 조건 또는 시약에는 변화가 없었다.
샘플 혼합물을 하기 개략된 프로토콜을 사용하여 각 단계 후에 정제하였다:
1. 500 ㎕의 완충액 PNI QIAGEN(5M 구아니디늄 클로라이드)을 샘플에 첨가하고, 피펫으로 조심스럽게 재현탁시켜 혼합하였다.
2. 혼합물을 QIAquick 스핀 컬럼(QIAGEN)으로 옮기고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
3. 원심분리 후, 통과액을 제거하고, 750 ㎕의 완충액 PE QIAGEN(10mM Tris-HCl pH 7.5 및 80% 에탄올)을 스핀 컬럼에 첨가하고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
4. 통과액을 제거하고, 스핀 컬럼을 13000 rpm에서 추가 1분 동안 원심분리하여, 잔류 PE 완충액을 제거하였다.
5. 이어서, 스핀 컬럼을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브에 위치시켰다.
6. DNA 용리를 위해, 반응에 적절한 완충액 20 ㎕를 컬럼 막 중앙에 첨가하고, 실온에서 1분 동안 정치시켰다.
7. 이어서, 튜브를 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 용리된 DNA 농도를 측정하고, 후속 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.
실시예 7. 버전 3 화학 - 이중 헤어핀 모델에 대한 완전한 사이클 .
본 실시예는 닉 부위로부터의 3'-O-변형된 dNTP의 혼입, 절단, 라이게이션 및 탈보호의 4개의 단계를 사용하며, 이때 제1 단계가 범용 뉴클레오티드, 이의 특별한 경우 이노신 염기의 반대편에서 일어나는, 이중 헤어핀 작제물 모델에 대한 폴리뉴클레오티드의 합성을 기재한다.
상기 방법은 DNA 폴리머라아제에 의한 효소적 혼입에 의한 올리고뉴클레오티드에의 3'-O-보호된 단일 뉴클레오티드의 제어된 첨가로 시작한 후, 이노신 절단, 라이게이션 및 탈보호가 이어진다(도 20a).
재료 및 방법
재료
1. 3'-O-변형된 dNTP는 Jian Wu의 박사 논문［Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis. Columbia University, 2008]에 기재된 프로토콜에 따라 자체적으로 합성하였다. 합성에 대한 프로토콜은 또한 특허 출원 공보[J. William Efcavitch, Juliesta E. Sylvester, Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis, Molecular Assemblies US2016/0108382A1]에 기재되어 있다.
2. 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma-Aldrich로부터 입수하였다(도 20b). 스톡 용액은 100 μM의 농도로 제조하였다.
3. New England BioLabs에서 제작된 Therminator IX DNA 폴리머라아제는 3-O-변형된 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는다.
3'-O-아지도메틸-dTTP를 혼입에 대하여 시험하였다:
Figure pct00054
방법
1. 2 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs)를 1.5ml 에펜도르프 튜브에서 12.5 ㎕의 멸균 탈이온수(ELGA VEOLIA)와 혼합하였다.
2. 2 ㎕의 10 μM 이중 헤어핀 모델 올리고뉴클레오티드(20 pmol, 1 당량)(서열번호 54, 도 20b)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
3. 3'-O-변형된-dTTP(100 μM, 2 ㎕) 및 MnCl2(40 mM, 1 ㎕)를 첨가하였다.
4. 이어서, 1.5 ㎕의 Therminator IX DNA 폴리머라아제(15 U, New England BioLabs)를 첨가하였다.
5. 반응액을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
6. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물을 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
7. 반응 혼합물을 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
8. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
9. 1㎕의 인간 엔도뉴클레아제 V(Endo V) NEB(30유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
10. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
11. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응을 효소적 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 종결시켰다.
12. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, TBE 완충액을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔(15%) 상에서 분석하고, ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad)으로 가시화하였다.
13. 반응 혼합물을 상기 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
14. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
15. 라이게이션을 위한 100 μM 가닥 10 ㎕(1 nmol)(서열번호 55, 도 20b)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
16. 40㎕의 블런트/TA DNA 리가아제 NEB(180 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
17. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
18. 1M TRIS 완충액(pH 7.4) 중 500 mM TCEP 40 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시켰다.
19. 반응 혼합물을 20 ㎕의 1x Thermopol® 완충액으로 용리하는 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
20. 전형적으로, 인큐베이션 시간이 경과한 후, TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 종결시켰다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 반응 혼합물을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브 내 5 ㎕의 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)에 첨가하고, 열 ThermoMixer(Eppendorf)를 사용하여 5분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, 5 ㎕의 샘플을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건에서 전기영동을 수행하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 겔을 가시화하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
5. 폴리아크릴아미드 겔 상에서 DNA 정제를 수행하고, 섹션 2의 단계 5 내지 8의 절차에 따라 가시화하였다. 도입된 조건 또는 시약에는 변화가 없었다.
샘플 혼합물을 하기 개략된 프로토콜을 사용하여 각 단계 후에 정제하였다:
1. 500 ㎕의 완충액 PNI QIAGEN(5M 구아니디늄 클로라이드)을 샘플에 첨가하고, 피펫으로 조심스럽게 재현탁시켜 혼합하였다.
2. 혼합물을 QIAquick 스핀 컬럼(QIAGEN)으로 옮기고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
3. 원심분리 후, 통과액을 제거하고, 750 ㎕의 완충액 PE QIAGEN(10mM Tris-HCl pH 7.5 및 80% 에탄올)을 스핀 컬럼에 첨가하고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
4. 통과액을 제거하고, 스핀 컬럼을 13000 rpm에서 추가 1분 동안 원심분리하여, 잔류 PE 완충액을 제거하였다.
5. 이어서, 스핀 컬럼을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브에 위치시켰다.
6. DNA 용리를 위해, 반응에 적절한 완충액 20 ㎕를 컬럼 막 중앙에 첨가하고, 실온에서 1분 동안 정치시켰다.
7. 이어서, 튜브를 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 용리된 DNA 농도를 측정하고, 후속 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.
실시예 8. 버전 2 화학 - 이중-헤어핀 모델에 대한 완전한 2 -사이클 실험.
본 실시예는 닉 부위로부터의 3'-O-변형된 dNTP의 혼입, 탈보호, 절단 및 라이게이션의 4개의 단계를 사용하며, 이때 제1 단계가 상보적 염기의 반대편에서 일어나는, 이중 헤어핀 모델에 대한 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 완전한 2-사이클 실험을 기재한다.
상기 방법은 도 21a에 제시된 제1 사이클에 대한 반응 개략도에 도시된 바와 같이, DNA 폴리머라아제에 의한 효소적 혼입에 의한 올리고뉴클레오티드에의 3'-O-보호된 단일 뉴클레오티드의 제어된 첨가로 시작한 후, 탈보호, 이노신 절단 및 라이게이션이 이어진다. 도 21b는 제2 사이클에 대한 반응 개략도를 나타낸다.
재료 및 방법
재료
1. 3'-O-변형된 dNTP는 Jian Wu의 박사 논문[Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis. Columbia University, 2008]에 기재된 프로토콜에 따라 자체적으로 합성하였다. 합성에 대한 프로토콜은 또한 특허 출원 공보[J. William Efcavitch, Juliesta E. Sylvester, Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis, Molecular Assemblies US2016/0108382A1]에 기재되어 있다.
2. 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Sigma-Aldrich로부터 입수하였다(도 21d). 스톡 용액은 100 μM의 농도로 제조하였다.
3. New England BioLabs에서 제작된 Therminator IX DNA 폴리머라아제는 3-O-변형된 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는다.
3'-O-아지도메틸-dTTP 및 3'-O-아지도메틸-dCTP를 혼입에 대하여 시험하였다:
Figure pct00055
방법
제1 사이클:
1. 2 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs)을 1.5ml 에펜도르프 튜브에서 12.5 ㎕의 멸균 탈이온수(ELGA VEOLIA)와 혼합하였다.
2. 2 ㎕의 10 μM 이중 헤어핀 모델 올리고뉴클레오티드(20 pmol, 1 당량)(서열번호 56, 도 21d)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
3. 3'-O-변형된-dTTP(100 μM, 2 ㎕) 및 MnCl2(40 mM, 1 ㎕)를 첨가하였다.
4. 이어서, 1.5 ㎕의 Therminator IX DNA 폴리머라아제(15 U, New England BioLabs)를 첨가하였다.
5. 반응액을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
6. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물을 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
7. 1M TRIS 완충액(pH 7.4) 중 500 mM TCEP 40 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시켰다.
8. 반응 혼합물을 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
9. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
10. 1㎕의 인간 엔도뉴클레아제 V(Endo V) NEB(30유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
11. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
12 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응을 효소적 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 종결시켰다.
13 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, TBE 완충액을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔(15%) 상에서 분석하고, ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad)으로 가시화하였다.
14. 반응 혼합물을 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트로 정제하였다.
15. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
16. 라이게이션을 위한 100 μM 가닥 10 ㎕(1 nmol)(서열번호 57, 도 21d)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
17. 40㎕의 블런트/TA DNA 리가아제 NEB(180 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
18. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
19. 반응 혼합물을 정제 단계 1 내지 5에 개략된 프로토콜을 사용하여 스트렙타비딘 자성 비드 키트로 정제하였다.
20. 라이게이션되지 않은 올리고뉴클레오티드를 람다 엑소뉴클레아제로 소화시켰다.
21. 반응 혼합물을 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트로 정제하였다.
22. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
제2 사이클:
23. 3'-O-변형된-dCTP(100 μM, 2 ㎕) 및 MnCl2(40 mM, 1 ㎕)를 첨가하였다.
24. 이어서, 1.5 ㎕의 Therminator IX DNA 폴리머라아제(15 U, New England BioLabs)를 첨가하였다.
25. 반응액을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
26. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물을 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
27. 1M TRIS 완충액(pH 7.4) 중 500 mM TCEP 40 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시켰다.
28. 반응 혼합물을 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
29. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
30. 1㎕의 인간 엔도뉴클레아제 V(Endo V) NEB(30유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
31. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
32. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응을 효소적 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 종결시켰다.
33. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, TBE 완충액을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔(15%) 상에서 분석하고, ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad)으로 가시화하였다.
34. 반응 혼합물을 정제 단계 1 내지 7에 개략된 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
35. DNA 샘플을 20 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
36. 라이게이션을 위한 100 μM 가닥 10 ㎕(1 nmol)(서열번호 58, 도 21d)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
37. 40㎕의 블런트/TA DNA 리가아제 NEB(180 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하였다.
38. 이어서, 반응 혼합물을 피펫으로 재현탁시켜 조심스럽게 혼합하고, 13,000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
39. 인큐베이션 시간이 경과한 후, TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)을 첨가하여 반응을 종결시켰다.
겔 전기영동 및 DNA 가시화:
1. 5 ㎕의 반응 혼합물을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브 내 5 ㎕의 TBE-우레아 샘플 완충액(Novex)에 첨가하고, 열 ThermoMixer(Eppendorf)를 사용하여 5분 동안 95℃로 가열하였다.
2. 이어서, 5 ㎕의 샘플을 예열된 1X TBE 완충액 Thermo Scientific(89mM Tris, 89mM 붕산 및 2mM EDTA)이 함유된 15% TBE-우레아 겔 1.0 mm x 10 웰(Invitrogen)의 웰에 로딩하였다.
3. X-셀 확실 잠금 모듈(Novex)을 제자리에 고정시키고, 하기 조건을 적용하여 전기영동에 적용하였다: 260V, 90 Amp, 실온에서 40분.
4. Cy3 LEDS를 사용하여 ChemiDoc MP(BioRad)로 겔을 가시화하였다. 가시화 및 분석은 Image lab 2.0 플랫폼 상에서 수행하였다.
정제된 DNA 농도 측정은 하기 프로토콜을 사용하여 결정하였다:
1. 2 ㎕의 멸균 증류수(ELGA VEOLIA)를 받침대에 첨가하여 NanoDrop one(Thermo Scientific)을 평형화시켰다.
2. 평형화 후, 보풀이 없는 렌즈 세척 티슈(Whatman)를 사용하여 물을 조심스럽게 닦아 내었다.
3. 2 ㎕의 완충액 EB QIAGEN(10mM Tris.CL, pH 8.5)을 첨가하여 NanoDrop one을 블랭크화하였다. 이어서, 블랭크화 후, 단계 2를 반복하였다.
4. 2 ㎕의 샘플을 받침대에 첨가하고, 터치 스크린 상의 측정 아이콘을 선택하여 DNA 농도를 측정하였다.
샘플 혼합물을 하기 개략된 프로토콜을 사용하여 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트로 정제하였다:
1. 500 ㎕의 완충액 PNI QIAGEN(5M 구아니디늄 클로라이드)을 샘플에 첨가하고, 피펫으로 조심스럽게 재현탁시켜 혼합하였다.
2. 혼합물을 QIAquick 스핀 컬럼(QIAGEN)으로 옮기고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
3. 원심분리 후, 통과액을 제거하고, 750 ㎕의 완충액 PE QIAGEN(10mM Tris-HCl pH 7.5 및 80% 에탄올)을 스핀 컬럼에 첨가하고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
4. 과액을 제거하고, 스핀 컬럼을 13000 rpm에서 추가 1분 동안 원심분리하여, 잔류 PE 완충액을 제거하였다.
5. 이어서, 스핀 컬럼을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브에 위치시켰다.
6. DNA 용리를 위해, 반응에 적절한 완충액 20 ㎕를 컬럼 막 중앙에 첨가하고, 실온에서 1분 동안 정치시켰다.
7. 이어서, 튜브를 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
라이게이션 단계 후, 샘플 혼합물을 하기 개략된 프로토콜을 통해 스트렙타비딘 자성 비드를 사용하여 정제하였다:
1. 100 ㎕의 스트렙타비딘 자성 비드(New England BioLabs)를 200 ㎕의 결합 완충액(20mM Tris, 500 mM NaCl, pH = 7.4)으로 3회 세척하였다.
2. 라이게이션 단계 후, 반응 혼합물을 10배 부피의 결합 완충액(20mM Tris, 500 mM NaCl, pH = 7.4)과 혼합하고, 스트렙타비딘 자성 비드와 함께 20 ℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
3. 스트렙타비딘 자성 비드를 200 ㎕의 결합 완충액(20mM Tris, 500 mM NaCl, pH = 7.4)으로 3회 세척하였다.
4. 스트렙타비딘 자성 비드를 탈이온수로 3회 세척하였다.
5. 올리고뉴클레오티드를 40 ㎕의 탈이온수로 3분 동안 95℃로 가열하여 용리하였다.
도 21c에 제시된 결과는 본 발명의 예시적인 방법을 사용하여 2개의 완전한 합성 사이클을 수행하는 것을 입증한다.
실시예 9. 버전 2 화학 - 단일 헤어핀 모델에 대한 완전한 3 -사이클 실험.
본 실시예는 닉 부위로부터의 3'-O-변형된 dNTP의 혼입, 탈보호, 절단, 라이게이션 및 변성 단계의 5개의 단계를 사용하며, 이때 제1 단계가 상보적 염기의 반대편에서 일어나는, 이중 헤어핀 모델에 대한 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 완전한 3-사이클 실험을 기재한다.
상기 방법의 예시적인 개략도는 도 26, 27 및 28에 제시되어 있다.
상기 방법은 DNA 폴리머라아제에 의한 효소적 혼입에 의한 올리고뉴클레오티드에의 3'-O-보호된 단일 뉴클레오티드의 제어된 첨가로 시작한 후, 탈보호, 절단, 라이게이션 및 헬퍼 가닥의 변성이 이어진다. 도 26은, 효소적 혼입, 탈보호, 절단, 라이게이션 및 변성 단계를 포함하는 제1 완전 사이클을 나타낸다. 이러한 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 T 뉴클레오티드에 의해 연장된다. 도 27은, 효소적 혼입, 탈보호, 절단, 라이게이션 단계 및 변성 단계를 포함하는 제1 사이클 이후의 제2 완전 사이클을 나타낸다. 이러한 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 T 뉴클레오티드에 의해 연장된다. 도 28은, 효소적 혼입, 탈보호, 절단, 라이게이션 및 변성 단계를 포함하는 제2 사이클 이후의 제3 완전 사이클을 나타낸다. 이러한 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 T 뉴클레오티드에 의해 연장된다.
재료 및 방법
재료
1. 3'-O-변형된 dNTP는 Jian Wu의 박사 논문［Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis, Columbia University, 2008]에 기재된 프로토콜에 따라 자체적으로 합성하였다. 합성에 대한 프로토콜은 또한 특허 출원 공보[J. William Efcavitch, Juliesta E. Sylvester, Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis, Molecular Assemblies US2016/0108382A1]에 기재되어 있다.
2. 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 설계하고, Integrated DNA Technologies, Sigma-Aldrich로부터 수득하였다(도 29). 스톡 용액은 100 μM의 농도로 제조하였다.
3. 3-O-변형된 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 New England BioLabs에서 제작된 Therminator X DNA 폴리머라아제를 사용하였다. 변형된 dNTP를 혼입시킬 수 있는 임의의 DNA 폴리머라아제 또는 다른 효소가 대안적으로 사용될 수 있었다.
3'-O-아지도메틸-dTTP를 혼입을 위해 사용하였다:
Figure pct00056
방법
제1 사이클:
1. 20 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs) 및 MnCl2 용액(10 ㎕의 40 mM)을, 1.5ml 에펜도르프 튜브에서 139 ㎕의 멸균 탈이온수(ELGA VEOLIA)와 혼합하였다.
2. 20 ㎕의 100 μM 단일 헤어핀 모델 올리고뉴클레오티드(2 nmol, 1 당량)(서열번호 59, 도 29)를 반응 혼합물에 첨가하였다.
3. 분취액(4 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물(4mM) 및 0.5 ㎕의 Bst DNA 폴리머라아제 및 0.5 ㎕의 Sulfolobus DNA 폴리머라아제 IV를 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
4. 3'-O-변형된-dTTP(2 mM, 10 ㎕)를 첨가하였다.
5. 이어서, 5 ㎕의 Therminator X DNA 폴리머라아제(50 U, New England BioLabs)를 첨가하였다. 하지만, 변형된 dNTP를 혼입시킬 수 있는 임의의 DNA 폴리머라아제 또는 다른 효소가 대안적으로 사용될 수 있었다.
6. 반응액을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
7. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
8. DNA 샘플을 200 ㎕의 TE 완충액으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
9. 분취액(4 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물(4mM) 및 0.5 ㎕의 Bst DNA 폴리머라아제 및 0.5 ㎕의 Sulfolobus DNA 폴리머라아제 IV를 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
10. 400 ㎕의 500 mM TCEP를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시켰다.
11. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
12. DNA 샘플을 150 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
13. 분취액(4 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물(4mM) 및 0.5 ㎕의 Bst DNA 폴리머라아제 및 0.5 ㎕의 Sulfolobus DNA 폴리머라아제 IV를 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
14. 5 ㎕의 인간 엔도뉴클레아제 V(Endo V) NEB(30유닛/㎕)를 첨가하여 용리시키고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 임의의 적합한 대안적인 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있었다.
15. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응을 효소적 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 종결시켰다.
16. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하였다.
17. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
18. DNA 샘플을 100 ㎕의 T3 DNA 리가아제 완충액(2배 농축)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
19. 라이게이션을 위한 100 μM 이노신 가닥 20 ㎕(2 nmol) 및 라이게이션을 위한 100 μM 헬퍼 가닥 20 ㎕(2 nmol)(서열번호 60, 51, 도 29), 및 40 ㎕의 물을 반응 혼합물에 첨가하였다.
20. 20 ㎕의 T3 DNA 리가아제 NEB(3000 유닛/㎕)를 상기 튜브(이는 임의의 DNA 라이게이션 효소를 포함할 수 있음)에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
반응 혼합물을 정제 단계 73 내지 78에 개략된 변성 단계를 포함하는 스트렙타비딘 자성 비드 키트에 대한 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
21. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
22. DNA 샘플을 100 ㎕의 TE 완충액으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
제2 사이클:
23. 15 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs), MnCl2 용액(7.5 ㎕의 40 mM) 및 19 ㎕의 탈이온수를 첨가하였다.
24. 분취액(4 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물(4mM) 및 0.5 ㎕의 Bst DNA 폴리머라아제 및 0.5 ㎕의 Sulfolobus DNA 폴리머라아제 IV를 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
25. 3'-O-변형된-dTTP(2 mM, 7.5 ㎕)를 첨가하였다.
26. 이어서, 5 ㎕의 Therminator X DNA 폴리머라아제(50 U, New England BioLabs)를 첨가하였다. 변형된 dNTP를 혼입시킬 수 있는 임의의 DNA 폴리머라아제가 사용될 수 있었다.
27. 반응액을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
28. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
29. DNA 샘플을 100 ㎕의 TE 완충액으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
30. 분취액(4 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물(4mM) 및 0.5 ㎕의 Bst DNA 폴리머라아제 및 0.5 ㎕의 Sulfolobus DNA 폴리머라아제 IV를 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
31. 200 ㎕의 500 mM TCEP를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시켰다.
32. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
33. NA 샘플을 100 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
34. 분취액(4 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물(4mM) 및 0.5 ㎕의 Bst DNA 폴리머라아제 및 0.5 ㎕의 Sulfolobus DNA 폴리머라아제 IV를 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
35. 5 ㎕의 인간 엔도뉴클레아제 V(Endo V) NEB(30유닛/㎕)를 첨가하여 용리시키고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 임의의 적합한 대안적인 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있었다.
36. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응을 효소적 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 종결시켰다.
37. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하였다.
38. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
39. DNA 샘플을 60 ㎕의 T3 DNA 리가아제 완충액(2배 농축)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
40. 라이게이션을 위한 100 μM 이노신 가닥 20 ㎕(2 nmol) 및 라이게이션을 위한 100 μM 헬퍼 가닥 20 ㎕(2 nmol)(서열번호 60, 51, 도 29), 및 10 ㎕의 탈이온수를 반응 혼합물에 첨가하였다.
41. 10 ㎕의 T3 DNA 리가아제 NEB(3000 유닛/㎕)를 상기 튜브에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 임의의 적합한 DNA 리가아제가 사용될 수 있었다.
42. 반응 혼합물을 정제 단계 73 내지 78에 개략된 변성 단계를 포함하는 스트렙타비딘 자성 비드 키트에 대한 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
43. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
44. DNA 샘플을 46 ㎕의 TE 완충액으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다
제3 사이클:
45. 6 ㎕의 10x Thermopol® 완충액(20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton® X-100, pH 8.8, New England BioLabs), MnCl2 용액(40 mM, 3 ㎕)을 첨가하였다.
46. 분취액(4 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물(4mM) 및 0.5 ㎕의 Bst DNA 폴리머라아제 및 0.5 ㎕의 Sulfolobus DNA 폴리머라아제 IV를 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
47. 3'-O-변형된-dTTP(200 μM, 6 ㎕)를 첨가하였다.
48. 이어서, 3 ㎕의 Therminator X DNA 폴리머라아제(30 U, New England BioLabs)를 첨가하였다. 변형된 dNTP를 혼입시킬 수 있는 임의의 DNA 폴리머라아제 또는 다른 효소가 대안적으로 사용될 수 있었다.
49. 반응액을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
50. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
51. DNA 샘플을 50 ㎕의 TE 완충액으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
52. 분취액(4 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물(4mM) 및 0.5 ㎕의 Bst DNA 폴리머라아제 및 0.5 ㎕의 Sulfolobus DNA 폴리머라아제 IV를 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
53. 100 ㎕의 500 mM TCEP를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시켰다.
54. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
55. DNA 샘플을 49 ㎕의 NEB Reaction buffer®(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9)으로 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
56. 분취액(4 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 0.5 ㎕의 천연 dNTP 혼합물(4mM) 및 0.5 ㎕의 Bst DNA 폴리머라아제 및 0.5 ㎕의 Sulfolobus DNA 폴리머라아제 IV를 첨가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응액을 겔 전기영동으로 분석하였다.
57. 5 ㎕의 인간 엔도뉴클레아제 V(Endo V) NEB(30유닛/㎕)를 첨가하여 용리시키고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 임의의 적합한 대안적인 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있었다.
58. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 반응을 효소적 불활성화(즉 65℃에서 20분)에 의해 종결시켰다.
59. 분취액(5 ㎕)을 반응 혼합물에서 취하고, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하였다.
60. 반응 혼합물을 정제 단계 66 내지 72에 개략된 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다.
61. NA 샘플을 30 ㎕의 T3 DNA 리가아제 완충액(2배 농축)으로 깨끗한 에펜도르프 튜브에 용리하였다.
62. 라이게이션을 위한 100 μM 이노신 가닥 10 ㎕(2 nmol), 라이게이션을 위한 100 μM 헬퍼 가닥 10 ㎕(2 nmol)(서열번호 60, 51, 도 29) 및 5 ㎕의 물을 반응 혼합물에 첨가하였다.
63. 5 ㎕의 T3 DNA 리가아제 NEB(3000 유닛/㎕)를 상기 튜브 (이는 임의의 DNA 라이게이션 효소를 포함할 수 있음)에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
64. 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분석하였다.
혼입, 차단해제 및 절단 단계 후, 하기 개략된 프로토콜을 사용한 QIAGEN 뉴클레오티드 제거 키트에 의한 반응 혼합물의 정제:
65. 10배 부피의 완충액 PNI QIAGEN(5M 구아니디늄 클로라이드)을 샘플에 첨가하고, 피펫으로 조심스럽게 재현탁시켜 혼합하였다.
66. 혼합물을 QIAquick 스핀 컬럼(QIAGEN)으로 옮기고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
67. 원심분리 후, 통과액을 제거하고, 750 ㎕의 완충액 PE QIAGEN(10mM Tris-HCl pH 7.5 및 80% 에탄올)을 스핀 컬럼에 첨가하고, 6000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
68. 통과액을 제거하고, 스핀 컬럼을 13000 rpm에서 추가 1분 동안 원심분리하여, 잔류 PE 완충액을 제거하였다.
69. 이어서, 스핀 컬럼을 멸균 1.5ml 에펜도르프 튜브에 위치시켰다.
70. DNA 용리를 위해, 반응에 적절한 완충액 20-200 ㎕를 컬럼 막 중앙에 첨가하고, 실온에서 1분 동안 정치시켰다.
71. 이어서, 튜브를 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.
변성 단계를 포함하는 스트렙타비딘 자성 비드를 사용한 라이게이션 단계 후 반응액의 정제는, 하기 개략된 프로토콜을 통해 수행하였다:
72. 100 ㎕의 스트렙타비딘 자성 비드(New England BioLabs)를 200 ㎕의 결합 완충액(20mM Tris, 500 mM NaCl, pH = 7.4)으로 3회 세척하였다.
73. 라이게이션 단계 후 반응 혼합물을 10배 부피의 결합 완충액(20mM Tris, 500 mM NaCl, pH = 7.4)과 혼합하고, 스트렙타비딘 자성 비드와 함께 20℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
74. 스트렙타비딘 자성 비드를 200 ㎕의 결합 완충액(20mM Tris, 500 mM NaCl, pH = 7.4)으로 3회 세척하였다.
75. 헬퍼 가닥을 제거하기 위해, 스트렙타비딘 자성 비드를 200 ㎕의 결합 완충액(20mM Tris, 500 mM NaCl, pH = 7.4) 중에서 80℃로 가열하고, 자석을 위치시키고, 상청액을 신속하게 제거하였다.
76. 스트렙타비딘 자성 비드를 탈이온수로 3회 세척하였다.
77. 올리고뉴클레오티드를 50 내지 100 ㎕의 탈이온수로 3분 동안 95℃로 가열하여 용리하였다.
결과 및 결론
도 30은, 혼입, 차단해제, 절단 및 라이게이션 단계를 포함하는 완전한 3-사이클 실험에 상응하는 반응 생성물을 나타내는 겔을 도시한다. 결과는, 본 발명의 예시적인 방법을 사용한 3개의 완전한 합성 사이클의 성능을 입증한다.
실시예 10. 폴리아크릴아미드 표면의 유도체화 및 분자의 후속 고정화.
본 실시예는 N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아미드(BRAPA)를 사용한 폴리아크릴아미드 표면 상에의 브로모아세틸기의 제시, 및 브로모아세틸기에의 공유결합 커플링에 의한 티올화 분자의 후속 표면 고정화를 기재한다.
재료 및 방법
유리 현미경 슬라이드 및 커버슬립을 아세톤, 에탄올 및 물에서 순차적으로 각각 10분 동안 초음파로 세정하고, 아르곤으로 건조시켰다. 깨끗한 유리 커버슬립을 폴리스티렌 페트리 디쉬에서 증기상의 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란으로 실란화하고, 에탄올에서 2회 초음파처리하고, Ar로 건조시켰다(이하 '플루오르화 커버슬립'). 유리 현미경 슬라이드 상에, 4% 아크릴아미드/N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(19:1) 용액을, N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아미드(BRAPA)가 0, 0.1, 0.2 및 0.3%(w/v)로 첨가된 10 ㎕의 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 및 100 ㎕의 10%(w/v) 암모늄 퍼술페이트(APS)와 혼합하고, 4 mm 직경 고무 가스켓에 신속하게 분배한 후, 아크릴아미드 용액을 향하는 면이 플루오르화된 플루오르화 커버슬립으로 샌드위치하고, 10분 동안 중합하였다. 10분 후, 표면을 탈이온수 중에 침지시켜 총 4시간 동안 침지시킨 채로 두고, 그 시간 동안 플루오르화 커버슬립을 조심스럽게 제거하였다. 중합된 폴리아크릴아미드 표면을 아르곤으로 건조시켰다.
이어서, 폴리아크릴아미드 표면을 티올화 폴리에틸렌 글리콜(1kDa) 플루오레세인(FITC-PEG-SH), 및 음성 대조군으로서 카르복실화 폴리에틸렌 글리콜(1 kDa) 플루오레세인(FITC-PEG-COOH)을 소듐 포스페이트 완충액(10mM, pH 8) 중에서 1시간 동안 노출시키고, 이어서 소듐 포스페이트 완충액(10mM, pH 7), 및 0.05% Tween20/0.5M NaCl을 함유하는 동일한 완충액으로 순차적으로 세척하여, 비특이적으로 흡착된 티올화 및 카르복시화 형광단을 제거하였다. 이어서, 표면을 플루오레세인 채널에서 ChemiDoc(Bio-Rad)로 이미지화하였다.
결과 및 결론
도 31은 형광 신호를 나타내고, 도 32는 FITC-PEG-SH 및 FITC-PEG-COOH에 노출된 상이한 양의 BRAPA가 첨가된 폴리아크릴아미드 겔 표면으로부터 측정된 형광을 나타낸다. 플루오레세인의 고정화는, 카르복실화 플루오레세인의 비특이적 흡착이 0에 근접하는, BRAPA 및 오로지 티올화 플루오레세인이 첨가된 폴리아크릴아미드 표면에서만 성공적이었다.
BRAPA 미포함(BRAPA 0%) 폴리아크릴아미드 표면, 및 BRAPA와 카르복실화 분자(FITC-PEG-COOH)를 함유하는 폴리아크릴아미드 표면과 비교하여, BRAPA(BRAPA 0.1, 0.2 및 0.3%) 및 오로지 티올화 분자(FITC-PEG-SH)를 함유하는 폴리아크릴아미드 표면으로부터 유의하게 높은 양성 형광 신호가 관찰되었다. 결과는, 특이적 공유결합 커플링이 표면으로부터의 브로모아세틸 모이어티와 플루오레세인 태깅된 분자로부터의 티올 모이어티 사이에서 일어났음을 나타낸다.
결과는, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 지지 가닥 및 합성 가닥을 포함하는 분자와 같은 분자가, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 합성 반응에 적합한 표면 기질 상에 용이하게 고정될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 11. 헤어핀 DNA 올리고머의 표면 고정화 및 형광 표지된 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 후속 혼입.
본 실시예는 하기를 기재한다:
(1) 얇은 폴리아크릴아미드 표면 상에의 브로모아세틸기의 제시 방법;
(2) 링커 존재 유무 하에서의 티오포스페이트 관능화된 헤어핀 DNA의 공유결합 커플링을 통한 헤어핀 DNA의 후속 고정화; 및
(3) 헤어핀 DNA로의 2'-데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)의 혼입.
상기 방법은 사실상 임의의 유형의 재료 표면(예를 들어 금속, 중합체 등)에 적합하다.
(1): 브로모아세틸 관능화된 얇은 폴리아크릴아미드 표면 상에서의 제작
재료 및 방법
유리 현미경 슬라이드를 먼저 순수한(neat) Decon 90(30 분), 물(30 분), 1M NaOH(15 분), 물(30 분), 0.1M HCl(15 분), 물(30 분) 중에서 초음파로 세정하고, 최종적으로 아르곤으로 건조시켰다.
50 ml의 물 중에 1 g의 아크릴아미드 단량체를 용해시켜, 먼저 2%(w/v) 아크릴아미드 단량체 용액을 제조하였다. 아크릴아미드 단량체 용액을 15분 동안 볼텍싱 및 탈기하였다. N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아미드(BRAPA, 82.5 mg)를 825 ㎕의 DMF 중에 용해시키고, 아크릴아미드 단량체 용액에 첨가하고, 추가로 볼텍싱하였다. 최종적으로, 1 ml의 5%(w/v) 포타슘 퍼술페이트(KPS) 및 115 ㎕의 순수한 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 아크릴아미드 용액에 첨가하고, 볼텍싱하고, 깨끗한 유리 현미경 슬라이드를 이러한 아크릴아미드 중합 혼합물에 90분 동안 노출시켰다. 90분 후, 표면을 탈이온수로 세척하고, 아르곤으로 건조시켰다. 이러한 표면을 본 실시예에서 이하 'BRAPA 변형된 표면'으로 지칭할 것이다. 음성 대조군으로서, BRAPA 미포함 폴리아크릴아미드 표면을 또한, 아크릴아미드 단량체 용액에의 BRAPA 용액의 첨가를 제외하고, 상기 기재된 바와 같은 유사한 방식으로 제조하였다. 이러한 표면을 본 실시예에서 이하 'BRAPA 대조군 표면'으로 지칭할 것이다.
(2): 폴리아크릴아미드 표면 상에의 티오포스페이트 관능화된 헤어핀 DNA의 공유결합 커플링
재료 및 방법
직경 4 mm의 원형 개구부를 갖는 고무 가스켓을 BRAPA 변형된 및 BRAPA 대조군 표면 상에 위치시키고 고정시켰다. 표면을 먼저 소듐 포스페이트 완충액(10 mM, pH 7)으로 10분 동안 프라이밍하였다. 이어서, 완충액을 제거하고, 표면을 각각 1 μM 농도로 6개 및 단일 티오포스페이트로 변형된 링커의 존재 유무 하에서 5'-형광 표지된(Alexa 647) 헤어핀 DNA 올리고머에 노출시키고, 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. BRAPA 변형된 표면을 또한 대조군으로서 링커의 존재 유무 하에서, 티오포스페이트의 부재 하에서, DNA 올리고머와 함께 인큐베이션하였다(본 실시예에서 이하 '올리고머 대조군 표면'으로 지칭됨). 인큐베이션 후, 표면을 소듐 포스페이트(100 mM, pH 7)로, 이어서 Tris-EDTA 완충액(10mM Tris, 10mM EDTA, pH 8)으로, 최종적으로 물로 헹구었다. 임의의 비특이적으로 흡착된 DNA 올리고머를 제거하기 위해, 표면을 1M 소듐 클로라이드 및 0.05%(v/v) Tween20을 함유하는 물로 세척하고, 물로 세척하고, 아르곤으로 건조시켰다. 표면을 Alexa 647 채널에서 ChemiDoc 이미징 장치로 스캔하였다.
도 33a는, 상이한 샘플 상에 고정된 링커 부재 하의 헤어핀 DNA의 서열을 나타낸다. 도 33b는, 상이한 샘플 상에 고정된 링커 존재 하의 헤어핀 DNA의 서열을 나타낸다.
결과
결과는 도 34 및 도 35에 제시되어 있다. 도 34는, BRAPA 또는 올리고머 대조군이 아닌, 브로모아세틸 관능화된 폴리아크릴아미드 표면 상에 고정된 링커의 존재 유무 하에서 헤어핀 DNA 올리고머에서 유래한 형광 신호를 나타낸다.
도 35는, 폴리아크릴아미드 표면 상에의 DNA 고정화 후 측정된 형광 강도를 나타낸다. 상기 도면은 다양한 폴리아크릴아미드 표면으로부터 수득 표면 형광 신호를 나타내며, 브로모아세틸 관능화된 폴리아크릴아미드 표면 상에의 DNA의 성공적인 공유결합 고정화로 인해, BRAPA 및 올리고머 대조군 표면과 비교하여((2)에 기재된 바와 같음), BRAPA 변형된 표면 상에 고정화된 헤어핀 DNA 올리고머로부터 유의하게 높은 신호가 수득되었음을 나타낸다.
결론
DNA로부터의 형광 신호는 BRAPA가 첨가된 BRAPA 변형된 표면에서만 현저하게 나타났으며, 이는 티오포스페이트 관능기를 통한 표면 상에의 DNA의 성공적인 공유결합 커플링을 나타낸다. 링커 부재 하의 DNA에 비해 링커 존재 하의 DNA로부터 균질하고 높은 신호가 수득되었다.
(3): 링커를 이용한 헤어핀 DNA 올리고머에의 트리포스페이트의 혼입
재료 및 방법
직경 9 mm의 원형 개구부를 갖는 고무 가스켓을 링커를 갖는 DNA 올리고머로 고정된 BRAPA 변형된 표면 상에 위치시키고, 혼입 완충액(50 mM TRIS pH 8, 1 mM EDTA, 6 mM MgSO4, 0.05% tween20 및 2 mM MnCl2)으로 10분 동안 프라이밍하였다. 이어서, 표면을 DNA 폴리머라아제(0.5U/㎕ Therminator X DNA 폴리머라아제) 및 트리포스페이트(20 μM Alexa 488 표지된 dUTP)를 함유하는 혼입 완충액에 노출시키고, 1시간 동안 인큐베이션하였다(본 실시예에서 이하 '폴리머라아제 표면'으로 지칭됨). 표면의 추가 세트를 또한 음성 대조군으로서 Therminator X DNA 폴리머라아제 미포함 혼입 완충액에 1시간 동안 노출시켰다(본 실시예에서 이하 '음성 표면'으로 지칭됨). 1시간 후, 두 가지 유형의 샘플을 모두 물로 세척하고, 이어서 1M 소듐 클로라이드 및 0.05%(v/v) Tween20을 함유하는 물에 노출시키고, 다시 물로 세척하였다. 표면으로부터의 형광 신호를 헤어핀 DNA(Alexa 647)의 존재 및 dUTP(Alexa 488)의 혼입 둘 모두에 대하여 모니터링하기 위해 Alexa 647 및 Alexa 488 채널에서 ChemiDoc을 사용하여 측정하였다.
결과
도 36은, Alexa 488-표지된 dUTP의 혼입 전후 Alexa 647 및 Alexa 488 채널로부터 검출된 형광 신호를 나타낸다. 혼입 전후 Alexa 647로부터의 변하지 않은 양성 신호는 표면 고정화된 헤어핀 DNA가 혼입 반응 동안 안정함을 나타내며, Alexa 488으로부터의 양성 신호는 혼입 반응 후 폴리머라아제 표면으로부터 관찰되었는데, 이는 폴리머라아제 존재에서만 dUTP의 성공적인 혼입을 나타낸다.
도 37은, (3)에 기재된 바와 같은 Alexa 488-표지된 dUTP의 혼입 전후 '폴리머라아제 표면' 및 '음성 표면'으로부터 수득된 Alexa 647(헤어핀 DNA) 및 Alexa 488(dUTP) 채널에서 측정된 형광 신호를 나타낸다. Alexa 488 형광 신호에서의 유의한 증가가 성공적인 혼입의 결과로서 혼입 반응 후 폴리머라아제 표면으로부터의 수득되었으며, 음성 표면으로부터의 신호는 폴리머라아제 부재로 인해 혼입 반응 후 동일하게 유지되었다. Alexa 647 채널에서의 형광 신호는 혼입 반응 후 사실상 변하지 않고 유지되었으며, 이는 표면 상에의 헤어핀 DNA의 존재를 나타낸다. 형광 신호에서의 약간의 감소는 2회차 광 노출로 인한 광표백 효과에서 기인한 것일 것이다.
결론
결과는, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 지지 가닥 및 합성 가닥을 포함하는 분자가, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 합성 반응에 적합한 표면 기질 상에 용이하게 고정될 수 있다는 것을 나타낸다. 나아가, 결과는, 이러한 분자가 신규한 dNTP의 혼입을 수용하여 합성 가닥을 연장시키는 동시에, 안정하게 기질에 부착된 채로 유지될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 12. 링커 및 티오포스페이트 공유결합 연결을 통한 유도체화된 표면에 고정화된 헤어핀 DNA 올리고머의 절단 및 라이게이션 .
본 실시예는 링커를 이용한 티오포스페이트 관능화된 헤어핀 DNA의 유도체화된 표면에의 공유결합 커플링, 이어서 절단 및 라이게이션 반응을 기재한다. 기질 제조 및 헤어핀 DNA의 커플링은 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하였다.
(1): 링커를 이용한 고정된 헤어핀 DNA 올리고머의 절단
재료 및 방법
헤어핀 DNA를 실시예 11에 기재된 바와 같이 표면 BRAPA 변형된 표면에 고정시켰다. 절단 및 라이게이션 반응에 대한 모든 실험 대조군을 포함하는 4개의 세트의 3중 표면을 제조하였다. 실험 조건은 도 38a에 기재되어 있다. 도 38b는, 상이한 샘플 상에 고정된 헤어핀 DNA의 서열을 나타낸다.
DNA 고정화 단계 후, 직경 9 mm의 원형 개구부를 갖는 고무 가스켓을, 5' 말단에서 Alexa 647 로 표지된 DNA로 고정시키고, 1X NEBuffer 4(50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, pH 7.9)로 10분 동안 프라이밍한 모든 표면 상에 위치시켰다. 샘플 D의 경우, 고정된 헤어핀 DNA는 이노신을 함유하지 않고, 이노신이 구아닌으로 대체된 것임을 유의해야 한다. 이어서, 모든 샘플을 1.5 U/㎕ 엔도뉴클레아제 V를 함유하는 NEBuffer 4(샘플 A, B 및 D) 또는 엔도뉴클레아제 V를 함유하지 않는 NEBuffer 4(샘플 C)에 1시간 동안 노출시켰다. 이어서, 모든 샘플을 1X T3 DNA 리가아제 완충액(66 mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1 mM ATP, 7.5% PEG6000, 1 mM DTT, pH 7.6), 1M 소듐 클로라이드 및 0.05%(v/v) Tween20을 함유하는 1X T3 DNA 리가아제 완충액으로 세척하고, 1X T3 DNA 리가아제 완충액으로 다시 세척하고, Alexa 647 채널에서 ChemiDoc 이미징 장치로 스캔하였다.
결과
도 39는, 절단 반응 전후 헤어핀 DNA 올리고머로부터의 형광 신호를 나타낸다.
도 40은, 상기 기재된 바와 같이 DNA 고정된 표면으로부터 수득된 절단 반응 전후 측정된 형광 신호를 나타낸다. 성공적인 절단 반응은 샘플 A 및 B에서만 관찰되었으며, 샘플 C 및 D의 경우에는 엔도뉴클레아제 V(샘플 C) 또는 서열 중 이노신(샘플 D)의 부재로 인해, 형광 신호가 거의 동일하게 유지되었다.
엔도뉴클레아제 V의 존재 하에서 DNA 가닥 내 이노신 부위에서의 성공적인 절단 반응의 결과로서, 샘플 A 및 B에서 형광 신호에서의 유의한 감소가 관찰되었다. 샘플 C 및 D의 경우, 엔도뉴클레아제 V의 부재 및 DNA 중 이노신의 결여는 각각, DNA 고정화 후 수득된 초기 신호와 거의 동일한 수준으로 형광 신호를 유지시켰다.
(2): 라이게이션 반응
재료 및 방법
(1)에 기재된 바와 같은 절단 반응 후, 샘플 A 및 B(도 38a에 기재된 바와 같음)를, 샘플 B에 대해서는 T3 DNA 리가아제의 부재 하에서, 및 샘플 A의 경우에는 T3 DNA 리가아제(250 U/㎕)의 존재 하에서, 및 음성 대조군으로서 MnCl2(2 mM), 5' 말단에서 Alexa 647로 표지된 이노신 가닥(16 μM) 및 상보적인 '헬퍼' 가닥(16 μM)(서열은 하기 도 41에 제시됨)을 함유하는 1X T3 DNA 리가아제 완충액에 노출시켰다. 샘플을 1시간 동안 각각의 용액에서 인큐베이션하였다. 1시간 후, 표면을 물로 세척하고, 이어서 1M 소듐 클로라이드 및 0.05%(v/v) Tween20을 함유하는 물에 노출시키고, 물로 다시 세척하였다. 표면으로부터의 형광 신호는 Alexa 647 채널에서 ChemiDoc를 사용하여 측정하였다. 도 41은 라이게이션 반응을 위한 이노신-함유 가닥 및 상보적 '헬퍼' 가닥에 대한 서열을 나타낸다.
결과
도 42는, 라이게이션 반응의 모니터링에 관한 결과를 나타낸다. 형광 신호를 라이게이션 반응 전후 Alexa 647 채널로부터 검출하였다. 라이게이션 후 Alexa 647 채널에서의 형광 신호의 증가는 T3 DNA 리가아제 포함 샘플 A에서만 수득되었으며, 샘플 B의 경우에는 T3 DNA 리가아제의 부재로 인해 형광 신호가 라이게이션 반응 후 동일한 수준으로 유지되었다.
도 43은, Alexa 647 형광 신호의 유의한 증가가 성공적인 라이게이션의 결과로서 샘플 A로부터 라이게이션 반응 후 수득되었음을 나타내며, 여기서 신호 수준은 도 40에 제시된 바와 같이 DNA 고정화 후 및 절단 반응 전 초기 신호 수준을 회복한다. 샘플 B로부터의 형광 신호는 T3 DNA 리가아제의 부재로 인해 라이게이션 반응 후 동일하게 유지되었다.
결론
이러한 실시예에서의 결과는, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 지지 가닥 및 합성 가닥을 포함하는 분자가, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 합성 반응에 적합한 표면 기질 상에 용이하게 고정될 수 있다는 것을 나타내는 동시에, 기질에 안정하게 부착된 채로 유지된다는 것을 나타낸다.
상기 실시예에서, 서열번호 1 내지 67에 제시된 모든 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 히드록실기를 갖는다. 서열번호 1 내지 67에 제시된 모든 올리고뉴클레오티드는, 서열번호 7, 서열번호 18 및 서열번호 35를 제외하고 5' 말단에 포스페이트기가 결여되어 있다.
개시된 방법 및 생성물의 상이한 적용이 당업계에서의 특정 요구에 따라 조정될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 제한하고자 하는 의도가 아님을 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바, 단수 형태의 표현은, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "라이게이션 폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 언급 등을 포함한다.
본원에 인용된 모든 출판물, 특허 및 특허출원은 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> OXFORD NANOPORE TECHNOLOGIES LIMITED <120> SYNTHESIS METHOD <130> N409129WO <140> <141> <150> GB 1700937.4 <151> 2017-01-19 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 gcgacaggtg actgcagc 18 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxyinosine <400> 2 cacatcacgt cgtagtcngc tgcagtcacc tgtcgc 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxyinosine <400> 3 cacatcacgt cgtagtcngc tgcagtcacc tgtcgc 36 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial 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5''-thiophosphate-Sp9-Sp9-Sp9-5-methylC <400> 65 agtcacgtcg tagtcnagct gcagtcacct gctgcttctt gcagcaggtg actgcagct 59 <210> 66 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (38)..(38) <223> 5''-thiophosphate-Sp9-Sp9-Sp9-5-methylC <400> 66 agtcacgtcg tagtcgagct gcagtcacct gctgcttctt gcagcaggtg actgcagct 59 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxyinosine <400> 67 agtcacgtcg tagtcnaa 18

Claims (89)

  1. 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법으로서,
    합성 사이클들을 수행하는 것을 포함하며,
    각 사이클에서, 제1 가닥이 소정의 서열의 뉴클레오티드의 혼입에 의해 연장되고, 제1 가닥에 하이브리드화된 제2 가닥이 뉴클레오티드의 혼입에 의해 연장됨으로써, 제1 가닥의 혼입된 뉴클레오티드와 뉴클레오티드 쌍을 형성하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 각 사이클이, 소정의 서열의 뉴클레오티드를 부착된 가역적 차단기(reversible blocking group)와 함께 혼입시킴에 의해 제1 가닥을 연장시킨 후 제2 가닥을 연장시키는 것을 포함하며, 상기 가역적 차단기는 제2 가닥이 연장되기 전 또는 후에 제거되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각 사이클에서, 뉴클레오티드가 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  4. 제3항에 있어서, 각 사이클이,
    (1) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    (2) 폴리머라아제에 의한 추가 연장을 방지하는 가역적 종결자기(reversible terminator group)를 포함하는 소정의 서열의 뉴클레오티드를, 폴리머라아제의 작용에 의해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 혼입시키는 단계;
    (3) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단 부위에서 절단하는 단계;
    (4) 소정의 서열의 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드를 포함하는 라이게이션(ligation) 폴리뉴클레오티드를, 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계로서, 라이게이션 시, 소정의 서열의 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 단계; 및
    (5) 소정의 서열의 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 단계를 포함하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단계 (1)이 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하며, 합성 가닥은 프라이머 가닥 부분을 포함하고, 지지 가닥은 범용(universal) 뉴클레오티드를 포함하며; 단계 (3)이 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단하는 단계를 포함하며, 여기서 절단이 지지 가닥을 절단하고, 범용 뉴클레오티드를 제거하는 것을 포함하며; 단계 (4)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드가 다음 사이클에서 사용하기 위한 절단 부위를 한정하는 범용 뉴클레오티드를 포함하는 지지 가닥을 포함하고, 라이게이션 폴리뉴클레오티드가 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에 라이게이션되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    (1) 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 합성 가닥은 단일 가닥 절단부(single-strand break)에 의해 분리된 프라이머 가닥 부분과 헬퍼 가닥 부분을 포함하고, 지지 가닥은 범용 뉴클레오티드를 포함하는 단계;
    (2) 폴리머라아제에 의한 추가 연장을 방지하는 가역적 종결자기를 포함하는 소정의 서열의 제1 뉴클레오티드를, 폴리머라아제의 작용에 의해 합성 가닥에 혼입시키는 단계;
    (3) 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단하는 단계로서, 여기서 절단은 합성 가닥에 제1 뉴클레오티드를 포함하는 돌출 말단(overhanging end)을 제공하기 위해 지지 가닥을 절단하고, 범용 뉴클레오티드를 제거하는 것을 포함하는, 단계;
    (4) 지지 가닥, 헬퍼 가닥 및 상보적 라이게이션 말단을 포함하는 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드를, 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계로서, 상기 라이게이션 말단은 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드, 및 헬퍼 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드를 포함하고, 헬퍼 가닥에 포스페이트기가 결여된 말단 뉴클레오티드를 포함하며, 지지 가닥의 라이게이션 시, 제1 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루는, 단계;
    (5) 제1 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 단계;
    (6) 폴리머라아제에 의한 추가 연장을 방지하는 가역적 종결자기를 포함하는 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드를, 폴리머라아제의 작용에 의해 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥에 혼입시키는 단계;
    (7) 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 의해 한정된 절단 부위에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 절단하는 단계로서, 여기서 절단은 합성 가닥에 다음 뉴클레오티드를 포함하는 돌출 말단을 제공하기 위해 지지 가닥을 절단하고, 범용 뉴클레오티드를 제거하는 것을 포함하는, 단계;
    (8) 지지 가닥, 헬퍼 가닥 및 상보적 라이게이션 말단을 포함하는 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드를, 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계로서, 상기 라이게이션 말단은 지지 가닥에 범용 뉴클레오티드, 및 헬퍼 가닥이 돌출해 있는 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드를 포함하고, 헬퍼 가닥에 포스페이트기가 결여된 말단 뉴클레오티드를 포함하며, 지지 가닥의 라이게이션 시, 다음 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루는, 단계;
    (9) 다음 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 단계; 및
    (10) 소정의 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해, 단계 (6) 내지 단계 (9)를 여러 번 반복하는 단계를 포함하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  7. 제5항 또는 제 6항에 있어서, 주어진 합성 사이클에서, 범용 뉴클레오티드가,
    (a) 단계 (1) 및 단계 (6)에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n을 점유하고, 여기서, 위치 n은 해당 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고;
    (b) 단계 (4) 및 단계 (8)에서 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n을 점유하고, 여기서, 위치 n은 다음 합성 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 다음 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고, 위치 n-1은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대한 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치이고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 단계 (3) 및 단계 (7)에서 위치 n과 n-1 사이에서 절단되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 주어진 합성 사이클에서, 범용 뉴클레오티드가,
    (a) 단계 (1) 및 단계 (6)에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n+1을 점유하고, 여기서, 위치 n은 해당 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고;
    (b) 단계 (4) 및 단계 (8)에서 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n+1을 점유하고, 여기서, 위치 n은 다음 합성 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 다음 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고; 위치 n-1은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 위치 n에 대한 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치이고; 위치 n+1은 헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로 위치 n에 대한 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치이고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 단계 (3) 및 단계 (7)에서 위치 n과 n-1 사이에서 절단되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서, 주어진 합성 사이클에서, 범용 뉴클레오티드가,
    (a) 단계 (1) 및 단계 (6)에서 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n을 점유하고, 여기서, 위치 n은 해당 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고;
    (b) 단계 (4) 및 단계 (8)에서 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥에서 위치 n을 점유하고, 여기서, 위치 n은 다음 합성 사이클에서의 혼입 시 소정의 서열의 다음 뉴클레오티드에 의해 점유되게 되는 합성 가닥에서의 위치 반대편인 지지 가닥에서의 뉴클레오티드 위치이고; 위치 n-1은 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 범용 뉴클레오티드에 의해 점유된 위치에 대한 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치이고; 위치 n-2는 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 위치 n-1에 대한 지지 가닥에서의 다음 뉴클레오티드 위치이고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥이 단계 (3) 및 단계 (7)에서 위치 n-1과 n-2 사이에서 절단되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    a) 단계 (1)/(6)에서, 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 단일 가닥 절단부에 인접한 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이루며(위치 n);
    b) 단계 (2)/(6)에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드의 반대편 위치(위치 n)에서 합성 가닥에 혼입되고, 그 결과 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 범용 뉴클레오티드와 쌍을 이루며;
    c) 단계 (3)/(7)에서, 지지 가닥이 범용 뉴클레오티드 위치(위치 n)와 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드 위치 다음의 뉴클레오티드(헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로, 위치 n-1) 사이의 위치에서 절단되고, 여기서 절단은 지지 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 단일 뉴클레오티드 돌출부를 생성하며;
    d) 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 라이게이션 말단이 단일 뉴클레오티드 돌출부를 포함하고, 여기서
    i. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고(위치 n), 그와 쌍을 이루며;
    ii. 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드 다음에 위치하고;
    iii. 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드(위치 n-1)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있고, 단계 (2)/(6)의 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  11. 제6항 또는 제8항에 있어서,
    a) 단계 (1)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에는 지지 가닥에 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인 뉴클레오티드(위치 n)가 제공되고, 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드 다음에 위치하며(헬퍼 가닥에서 가까운/프라이머 가닥에서 먼 방향으로, 위치 n+1);
    b) 단계 (2)/(6)에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 지지 가닥의 파트너 뉴클레오티드의 반대편 위치(위치 n)에서 합성 가닥에 혼입되고, 그 결과 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 파트너 뉴클레오티드와 쌍을 이루며;
    c) 단계 (3)/(7)에서, 지지 가닥이 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드로부터 제1 뉴클레오티드(위치 n)와 제2 뉴클레오티드(위치 n-1) 사이의 위치에서 절단되고, 여기서 절단이 범용 뉴클레오티드를 제거하고, 지지 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 단일 뉴클레오티드 돌출부를 생성하며;
    d) 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단이 단일 뉴클레오티드 돌출부를 포함하고, 여기서
    i. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고(위치 n+1), 그와 쌍을 이루며;
    ii. 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드 다음에 위치하고(위치 n);
    iii. 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드(위치 n)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드와 쌍을 이루고, 다음 합성 사이클의 단계 (6)에서 다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드이며;
    iv. 지지 가닥의 말단 뉴클레오티드(위치 n-1)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있고, 단계 (2)의 제1 뉴클레오티드의 파트너 뉴클레오티드이거나, 또는 현재 합성 사이클의 단계 (6)의 새롭게 혼입된 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  12. 제6항 또는 제9항에 있어서,
    a) 단계 (1)/(6)에서, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드가 단일 가닥 절단부에 인접한 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고, 그와 쌍을 이루며(위치 n);
    b) 단계 (2)/(6)에서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드의 반대편 위치에서 합성 가닥에 혼입되고, 그 결과 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드가 범용 뉴클레오티드와 쌍을 이루며;
    c) 단계 (3)/(7)에서, 지지 가닥이 헬퍼 가닥에서 먼/프라이머 가닥에서 가까운 방향으로 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드로부터 제1 뉴클레오티드(위치 n-1)와 제2 뉴클레오티드(위치 n-2) 사이의 위치에서 절단되고, 여기서 절단이 범용 뉴클레오티드를 제거하고, 지지 가닥이 돌출해 있는 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 이중 뉴클레오티드 돌출부를 생성하며;
    d) 단계 (4)/(8)에서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드의 상보적 라이게이션 말단이 이중 뉴클레오티드 돌출부를 포함하고, 여기서
    i. 지지 가닥의 범용 뉴클레오티드는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드의 반대편에 위치하고(위치 n), 그와 쌍을 이루며;
    ii. 범용 뉴클레오티드는 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드 다음에 위치하고;
    iii. 지지 가닥의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드(위치 n-1)는 헬퍼 가닥의 말단 뉴클레오티드가 돌출해 있고, 단계 (2)/(6)에서 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드에 대한 파트너 뉴클레오티드인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 서열의 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 뉴클레오티드가, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드와 상보적인, 바람직하게는 자연적으로 상보적인 뉴클레오티드인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1) 및/또는 단계 (6)이, 헬퍼 가닥 없이 제공되는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥을 포함하는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 하나 이상의 합성 사이클에서, 또는 모든 합성 사이클에서, 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드를 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계 후, 및 소정의 뉴클레오티드 서열의 다음 뉴클레오티드를 스캐폴드 폴리뉴클레오티드의 합성 가닥에 혼입시키는 단계 전, 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분이 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  16. 제15항에 있어서, 합성 가닥의 헬퍼 가닥 부분이, (i) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 약 80℃ 내지 약 95℃의 온도로 가열하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 헬퍼 가닥 부분을 분리하는 것, (ii) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 8M 우레아와 같은 우레아 용액으로 처리하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 헬퍼 가닥 부분을 분리하는 것, (iii) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 100% 포름아미드와 같은 포름아미드 또는 포름아미드 용액으로 처리하고, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 헬퍼 가닥 부분을 분리하는 것, 또는 (iv) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 헬퍼 가닥 부분의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 영역을 포함하는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자와 접촉시켜, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 대한 헬퍼 가닥 부분의 하이브리드화를 경쟁적으로 저해시키는 것에 의해, 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 제거되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  17. 제4항 내지 제7항, 제10항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 각 절단 단계가, 범용 뉴클레오티드를 제거하여 무(無)염기 부위를 형성하는 제1 단계, 및 무염기 부위에서 지지 가닥을 절단하는 것을 포함하는 제2 단계를 포함하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제1 단계가 뉴클레오티드 절단 효소(nucleotide-excising enzyme)를 이용하여 수행되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  19. 제18항에 있어서, 뉴클레오티드 절단 효소가 3-메틸아데닌 DNA 글리코실라아제 효소인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  20. 제19항에 있어서, 뉴클레오티드 절단 효소가 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라아제(hAAG)인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 단계가 염기인 화학물질을 이용하여 수행되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  22. 제21항에 있어서, 염기가 NaOH인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  23. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 단계가 무염기 부위 절단 활성을 갖는 유기 화학물질을 이용하여 수행되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  24. 제23항에 있어서, 유기 화학물질이 N,N'-디메틸에틸렌디아민인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  25. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 단계가 무염기 부위 리아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 수행되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  26. 제25항에 있어서, 효소가 엔도뉴클레아제 VIII인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  27. 제4항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 단계가 효소를 이용하여 지지 가닥을 절단하는 것을 포함하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  28. 제27항에 있어서, 효소가 범용 뉴클레오티드 다음에 있는 뉴클레오티드 이후의 지지 가닥을 절단하여, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드를 포함하는 합성 가닥에 돌출 말단을 생성하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  29. 제28항에 있어서, 효소가 엔도뉴클레아제 V인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양 가닥이 모두 DNA 가닥인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  31. 제5항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 가닥 및 지지 가닥이 DNA 가닥인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 혼입된 뉴클레오티드가 dNTP인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  33. 제32항에 있어서, 혼입된 뉴클레오티드가 가역적 종결자기를 포함하는 dNTP인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  34. 제33항에 있어서, 가역적 종결자기를 포함하는 혼입된 뉴클레오티드 중 하나 이상이 3'-O-알릴-dNTP인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  35. 제33항에 있어서, 가역적 종결자기를 포함하는 혼입된 뉴클레오티드 중 하나 이상이 3'-O-아지도메틸-dNTP인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  36. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 제1 가닥이 DNA 가닥이고, 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 제2 가닥이 RNA 가닥인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  37. 제1항 내지 제29항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 가닥이 RNA 가닥이고, 지지 가닥이 DNA 가닥인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  38. 제37항에 있어서, 혼입된 뉴클레오티드가 NTP인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  39. 제38항에 있어서, 혼입된 뉴클레오티드가 가역적 종결자기를 포함하는 NTP인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  40. 제39항에 있어서, 가역적 종결자기를 포함하는 혼입된 뉴클레오티드가 3'-O-알릴-NTP인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  41. 제39항에 있어서, 가역적 종결자기를 포함하는 혼입된 뉴클레오티드가 3'-O-아지도메틸-NTP인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  42. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라아제가 DNA 폴리머라아제, 바람직하게는 변형되지 않은 폴리머라아제와 비교하여 가역적 종결자기를 포함하는 dNTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 변형된 DNA 폴리머라아제인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  43. 제42항에 있어서, 폴리머라아제가 써모코커스(Thermococcus) 종 9°N, 바람직하게는 종 9°N-7로부터의 천연 DNA 폴리머라아제의 변이체인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  44. 제1항 내지 제29항 및 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라아제가 T3 또는 T7 RNA 폴리머라아제와 같은 RNA 폴리머라아제, 선택적으로 변형되지 않은 폴리머라아제와 비교하여 가역적 종결자기를 포함하는 NTP를 혼입시키는 향상된 능력을 갖는 변형된 RNA 폴리머라아제인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  45. 제3항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오티드/다음 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 단계가, 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 이용하여 수행되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  46. 제3항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 라이게이션 폴리뉴클레오티드를 절단된 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 단계가, 리가아제 효소를 이용하여 수행되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  47. 제46항에 있어서, 리가아제 효소가 T3 DNA 리가아제 또는 T4 DNA 리가아제인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  48. 제3항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1) 및/또는 단계 (6)에서, 헬퍼 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분이 헤어핀 루프(hairpin loop)에 의해 연결되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  49. 제3항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)에서, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분이 헤어핀 루프에 의해 연결되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  50. 제3항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1) 및/또는 단계 (6)에서,
    a) 헬퍼 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분이 헤어핀 루프에 의해 연결되고;
    b) 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분이 헤어핀 루프에 의해 연결되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  51. 제3항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 라이게이션 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가, 돌출 말단의 반대편 말단에서 지지 가닥과 헬퍼 가닥을 연결하는 헤어핀 루프를 포함하는 단일 분자로서 제공되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  52. 제3항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 각 합성 사이클의 라이게이션 폴리뉴클레오티드가, 돌출 말단의 반대편 말단에서 지지 가닥과 헬퍼 가닥을 연결하는 헤어핀 루프를 각각 포함하는 단일 분자로서 제공되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  53. 제3항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)에서, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분이 공통 표면에 테더링되는(tethered), 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  54. 제53항에 있어서, 프라이머 가닥 부분 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥 부분이 각각, 합성 후 표면으로부터 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위해 절단될 수 있는 절단 가능한 링커를 포함하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  55. 제3항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)에서, 합성 가닥의 프라이머 가닥 부분 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥 부분이, 표면에 테더링되는 헤어핀 루프에 의해 연결되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  56. 제55항에 있어서, 헤어핀 루프가 합성 후 표면으로부터 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위해 절단될 수 있는 절단 가능한 링커를 통해 표면에 테더링되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  57. 제54항 또는 제56항에 있어서, 절단 가능한 링커가 UV 절단 가능한 링커인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  58. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 표면이 미립자인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  59. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 표면이 평면 표면인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  60. 제59항에 있어서, 표면이 겔을 포함하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  61. 제60항에 있어서, 표면이 약 2% 폴리아크릴아미드와 같은 폴리아크릴아미드 표면, 바람직하게는 유리와 같은 고체 지지체에 결합된 폴리아크릴아미드 표면을 포함하는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  62. 제53항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 가닥 부분을 포함하는 합성 가닥 및 그에 하이브리드화된 지지 가닥의 부분이 하나 이상의 공유 결합을 통해 공통 표면에 테더링되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  63. 제62항에 있어서, 하나 이상의 공유 결합이 공통 표면 상의 관능기와 스캐폴드 분자 상의 관능기 사이에 형성되며, 스캐폴드 분자 상의 관능기는 아민기, 티올기, 티오포스페이트기 또는 티오아미드기인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  64. 제63항에 있어서, 공통 표면 상의 관능기가 브로모아세틸기이고, 선택적으로, 브로모아세틸기가 N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아미드(BRAPA)를 사용하여 유도된 폴리아크릴아미드 표면 상에 제공되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  65. 제3항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 서열의 뉴클레오티드로부터 가역적 종결자기를 제거하는 단계가, 절단 단계 전 또는 라이게이션 단계 전에 수행되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 사이클이 미세유체 시스템 내에서 액적으로 수행되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  67. 제66항에 있어서, 미세유체 시스템이 전기습윤 시스템인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  68. 제66항에 있어서, 미세유체 시스템이 유전체 상의 전기습윤 시스템(electrowetting-on-dielectric system, EWOD)인, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 후, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 가닥이 소정의 서열을 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해 분리되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 후, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 이의 영역이 바람직하게는 PCR에 의해 증폭되는, 소정의 서열을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 시험관내 합성 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하여 소정의 서열을 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 및 소정의 서열을 갖는 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드를 합성하는 단계, 및 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드를 함께 결합시키는 단계를 포함하는, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리(assembly) 방법.
  72. 제71항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥인, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  73. 제71항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥인, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드가 절단되어 호환 가능한 말단을 형성하고, 라이게이션에 의해 함께 결합되는, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  75. 제74항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드가 절단 부위에서 제한 효소에 의해 절단되는, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  76. 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 및/또는 어셈블리 단계가 미세유체 시스템 내에서 액적으로 수행되는, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  77. 제76항에 있어서, 어셈블리 단계가 소정의 서열을 갖는 제1 합성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 액적 및 소정의 서열을 갖는 부가적인 하나 이상의 합성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 액적을 제공하는 것을 포함하며, 여기서 액적이 서로 접촉하게 되고, 합성된 폴리뉴클레오티드가 함께 결합되어 제1 폴리뉴클레오티드 및 부가적인 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 어셈블리하는, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  78. 제77항에 있어서, 합성 단계가, 각 액적이 합성 사이클의 단계에 상응하는 반응 시약을 포함하는 다수의 액적을 제공하고, 합성 사이클의 단계에 따라 액적을 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 순차적으로 전달함으로써 수행되는, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  79. 제78항에 있어서, 액적의 전달 후 및 다음 액적의 전달 전, 과량의 반응 시약을 제거하기 위해 세척 단계가 수행되는, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 미세유체 시스템이 전기습윤 시스템인, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  81. 제80항에 있어서, 미세유체 시스템이 유전체 상의 전기습윤 시스템(EWOD)인, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 및 어셈블리 단계가 동일한 시스템 내에서 수행되는, 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 방법.
  83. 제1항 내지 제76항 및 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 폴리뉴클레오티드 합성 시스템으로서,
    (a) 각 반응 영역이 적어도 하나의 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 다수의 반응 영역;
    (b) 반응 시약을 반응 영역에 전달하기 위한 수단; 및
    선택적으로, (c) 스캐폴드 폴리뉴클레오티드로부터 합성된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 절단하기 위한 수단을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 합성 시스템.
  84. 제83항에 있어서, 반응 시약을 액적으로 제공하기 위한 수단, 및 합성 사이클에 따라 액적을 스캐폴드 폴리뉴클레오티드에 전달하기 위한 수단을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드 합성 시스템.
  85. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 것이며 제83항 또는 제84항의 시스템과 함께 사용하기 위한 것인 키트로서,
    합성 사이클의 단계에 상응하는 반응 시약의 부피를 포함하는, 키트.
  86. 각 반응 영역이 소정의 서열을 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 다수의 반응 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이(microarray)의 제조 방법으로서,
    a) 하나 이상의 이중 가닥 앵커 또는 스캐폴드 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 다수의 반응 영역을 포함하는 표면을 제공하는 단계, 및
    b) 각 반응 영역에서 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 방법에 따라 합성 사이클을 수행하여, 각 반응 영역에서 소정의 서열을 갖는 하나 이상의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 합성하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조 방법.
  87. 제86항에 있어서, 합성 후, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 가닥이 분리되어, 각 영역이 소정의 서열을 갖는 하나 이상의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이를 제공하는, 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조 방법.
  88. 서열번호 1 내지 67 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 뉴클레오티드 분자 작제물.
  89. 서열번호 1 내지 67 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 뉴클레오티드 분자 작제물로서,
    서열번호 1 내지 67 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 각각의 폴리뉴클레오티드 서열이, 존재하는 경우, 도면에 제시된 각각의 변형(들)로 변형되는, 뉴클레오티드 분자 작제물.
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