CN116023474A - 抗腺病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段及其核酸分子与应用 - Google Patents
抗腺病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段及其核酸分子与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了抗腺病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段及其核酸分子与应用。本发明所要解决的技术问题是如何抑制腺病毒,如人55型腺病毒。本发明提供了抗腺病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段含有HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3这6个互补决定区;HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次为序列2的第26‑33位、第51‑58位、第97‑112位所示;LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次为序列2的第27‑38位、第56‑58位、第95‑103位所示。本发明的抗腺病毒的单克隆抗体可以有效抑制腺病毒HAdV55的感染。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗腺病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段及其核酸分子与应用。
背景技术
人腺病毒是一种双链DNA病毒,属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属;该病毒为20面体结构,外无包膜,基因组全长约36kb,基因组DNA与病毒结构蛋白结合组成病毒核心,外被衣壳,该衣壳由252个壳粒组成,其中240个为六邻体蛋白,12个五邻体蛋白,直径大约70~90nm。
目前已发现的腺病毒有A-G共7个亚群,67个不同的血清型,其中能感染人并致病的有55个亚型。腺病毒感染人最常见的是感染呼吸道并引发呼吸系统疾病,此外部分病毒还可以引起泌尿和胃肠等系统感染,研究表明能引起呼吸道感染的腺病毒有A、C、E和B1组,其中主要是B1亚组,B2亚组可感染人的泌尿系统,F、D组分别可感染人的胃肠系统和结膜系统。目前已知世界上引起呼吸道感染的腺病毒有B1亚组的1、2、3、4、7、14和55型,其中3型、4型、7型、14型和55型为最常见的引起暴发疫情的型别。腺病毒感染人体也可诱发较强的体液免疫反应,产生特异性抗体和中和抗体,不仅可以中和病毒,清除感染,而且体内产生的抗体可以维持相当长的时间:已有研究证明人感染腺病毒后一般不会再次感染同型腺病毒,这种免疫保护可达10年以上,而其中起作用的也是腺病毒感染过程诱导机体产生的中和抗体,另外母亲感染产生的的抗体也能保护婴儿免受严重的腺病毒感染。
目前世界上尚没有针对腺病毒的特异性治疗药物用于临床,药物研发也多限于化药——抗DNA病毒的核苷类似物,而针对腺病毒的特异性生物药还是空白。因此腺病毒中和抗体可以作为一种有效而特异的抗腺病毒治疗手段,研究腺病毒中和抗体应该是未来腺病毒感染治疗的一个重要发展方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制腺病毒,如人55型腺病毒。
为了解决以上技术问题,本发明首先提供了抗腺病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明所提供的抗腺病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区;上述重链可变区包括三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3;上述轻链可变区包括三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3;
上述HCDR1的氨基酸序列为序列2的第26-33位,
上述HCDR2的氨基酸序列为序列2的第51-58位,
上述HCDR3的氨基酸序列为序列2的第97-112位,
上述LCDR1的氨基酸序列为序列4的第27-38位,
上述LCDR2的氨基酸序列为序列4的第56-58位,
上述LCDR3的氨基酸序列为序列4的第95-103位。
上述抗体可为全长抗体。上述抗原结合片段可为Fab片段、Fv片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体(ScFv)、纳米抗体(单域抗体)或最小识别单位(MRU)。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段,其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。上述抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常,当基于摩尔来表示活性时,上述抗原结合片段保留至少10%的母体结合活性。具体地,上述抗原结合片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。
术语“Fab片段”是由重链Fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体,仅含一个抗原结合位点。上述重链Fd指Fab中约1/2的H链部分(约含225个氨基酸残基,包括VH、CH1和部分铰链区)。
术语“Fv片段”是指可分别构建含有VH和VL基因的载体,共转染细胞,使之分别表达,再组装成功能性Fv抗体;也可在载体中的VH和VL之间设置终止密码,分别表达两个小分子蛋白片段,再通过非共价键结合而形成Fv抗体(Fv片段)。
术语“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分,由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
术语“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链,由此在两条重链间形成链间二硫键。因此,F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
术语“单链抗体(ScFv)”是指由轻链可变区和重链可变区连接得到的多肽。该多肽能自发折叠成天然构像,保持Fv的特异性和亲和力。
术语“纳米抗体(单域抗体)”是指将抗体重链V区通过基因工程方法表达,获得仅含VH片段的抗体。单域抗体与抗原结合的能力及其稳定性,与完全抗体基本一致。
术语“最小识别单位(MRU)”是指仅含可变区中单一CDR结构,分子质量仅为完整抗体的1%左右,可结合相应抗原。
上述单克隆抗体可为上述单链抗体的融合抗体。
上述的单克隆抗体或其抗原结合片段中,上述重链可变区的氨基酸序列可为序列6,上述轻链可变区的氨基酸序列可为序列8。
在本发明的一个具体实施方式中,提供了名称为h55Ab9-8的人源化单克隆抗体。h55Ab9-8的重链可变区的氨基酸序列为序列6,轻链可变区的氨基酸序列为序列8。
上述的单克隆抗体或其抗原结合片段中,上述重链可变区的氨基酸序列可为序列2,上述轻链可变区的氨基酸序列可为序列4。
在本发明的一个具体实施方式中,提供了名称为55Ab9-8的人鼠嵌合单克隆抗体。h55Ab9-8的重链可变区的氨基酸序列为序列2,轻链可变区的氨基酸序列为序列4。
本发明还提供编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
上述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA;上述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
上述核酸分子可为编码上述的单克隆抗体或其抗原结合片段的基因。
上述基因可为含有上述HCDR1的编码基因、上述HCDR2的编码基因、上述HCDR3的编码基因、上述LCDR1的编码基因、上述LCDR2的编码基因和上述LCDR3的编码基因的DNA分子,上述DNA分子可为A)或B):
A)上述HCDR1的编码基因为序列5的第76-99位核苷酸,上述HCDR2的编码基因为序列5的第151-174位核苷酸,上述HCDR3的编码基因为序列5的第289-336位核苷酸,上述LCDR1的编码基因为序列7的第79-114位核苷酸,上述LCDR2的编码基因为序列7的第166-174位核苷酸,上述LCDR3的编码基因为序列7的第283-309位核苷酸;
B)上述HCDR1的编码基因为序列1的第76-99位核苷酸,上述HCDR2的编码基因为序列1的第151-174位核苷酸,上述HCDR3的编码基因为序列1的第289-336位核苷酸,上述LCDR1的编码基因为序列3的第79-114位核苷酸,上述LCDR2的编码基因为序列3的第166-174位核苷酸,上述LCDR3的编码基因为序列3的第283-309位核苷酸。
上述基因可为C)或D)的DNA分子:
C)编码上述重链可变区的基因和编码上述轻链可变区的基因,编码上述重链可变区的基因的核苷酸序列是序列5,编码上述轻链可变区的基因的核苷酸序列是序列7;
D)编码上述重链可变区的基因和编码上述轻链可变区的基因,编码上述重链可变区的基因的核苷酸序列是序列1,编码上述轻链可变区的基因的核苷酸序列是序列3。
上述A)和C)的DNA分子为h55Ab9-8的编码基因。上述B)和D)的DNA分子为55Ab9-8的编码基因。
本发明还提供了上述核酸分子相关的生物材料。
本发明所提供的生物材料可为下述任一种:
B1)含有任一上述核酸分子的表达盒;
B2)含有B1)上述表达盒的重组载体;
B3)含有上述核酸分子的重组微生物;
B4)含有B1)上述表达盒的重组微生物;
B5)含有B2)上述重组载体的重组微生物;
B6)含有上述核酸分子的转基因动物细胞系;
B7)含有B1)上述表达盒的转基因动物细胞系;
B8)含有B2)上述重组载体的转基因动物细胞系。
上述生物材料中,上述表达盒,是指能够在宿主细胞中表达上述单克隆抗体或其抗原结合的DNA,该DNA不但可包括启动上述单克隆抗体或其抗原结合片段基因转录的启动子,还可包括终止上述单克隆抗体或其抗原结合片段基因转录的终止子。进一步,上述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的表达载体构建含有上述单克隆抗体基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中,上述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中,上述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述生物材料中,上述转基因动物细胞系可为非繁殖材料。上述动物细胞系不为生殖细胞或受精卵或胚胎干细胞。
本发明保护任一上述的单克隆抗体或其抗原结合片段或任一上述的核酸分子的用途,上述用途为(e1)和/或(e2)
(e1)上述的单克隆抗体或其抗原结合片段或任一上述的核酸分子在制备腺病毒抑制剂中的用途,
(e2)上述的单克隆抗体或其抗原结合片段或任一上述的核酸分子在制备预防和/或治疗腺病毒感染引起的疾病的药物中的用途。
本发明还保护产品。上述产品可为腺病毒抑制剂、或预防和/或治疗腺病毒感染引起的疾病的药物,上述产品含有任一上述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
上述腺病毒可为人腺病毒;上述人腺病毒可为人55型腺病毒。
上述腺病毒抑制剂可中和上述腺病毒。上述腺病毒抑制剂可抑制上述腺病毒感染动物或人。
在实际应用中,可以将本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段作为药物直接给予病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人,以达到治疗和/或预防HIV感染的目的。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型,包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。其中,栓剂可为阴道栓剂,也可以是阴道环,也可以是适于阴道应用的药膏、乳霜或凝胶。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等;湿润剂与粘合剂,如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等;崩解剂,例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等;崩解抑制剂,例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等;吸收促进剂,例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等;润滑剂,例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片,例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片,或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等;粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等;崩解剂,如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂,如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂,可以使用本领域常用的所有稀释剂,例如,水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外,为了制备等渗注射液,可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油,此外,还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外,如需要,也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
使用上述剂型可以经注射给药,包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等;腔道给药,如经直肠、阴道和舌下;呼吸道给药,如经鼻腔;粘膜给药。
实验证明,55Ab9-8抗体与人55型腺病毒的结合半数有效浓度(EC50)为0.0098nM(结果如图4所示);55Ab9-8抗体对HAdV55的半数最大抑制浓度(IC50)为0.067nM(结果如图5所示);h55Ab9-8抗体与HAdV55的结合半数有效浓度(EC50)为0.0702nM(结果如图6所示);h55Ab9-8对HAdV55的半数最大抑制浓度(IC50)为0.3886nM(结果如图7所示)。结果表明本发明制备单克隆抗体55Ab9-8和单克隆抗体h55Ab9-8可以有效抑制腺病毒HAdV55的感染。
附图说明
图1为小鼠血清中抗人55型腺病毒特异性抗体检测。
图2为纯化后55Ab9-8的SDS-PAGE电泳检测。
图3为纯化后人55型腺病毒的SDS-PAGE电泳检测。
图4为抗体55Ab9-8与人55型腺病毒的结合活性。
图5为抗体55Ab9-8抗人55型腺病毒感染的药效。
图6为人源化抗体h55Ab9-8与人55型腺病毒的结合活性。
图7为人源化抗体h55Ab9-8抗人55型腺病毒感染的药效。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
下述实施例中的HAdV55病毒为人55型腺病毒(简称55型腺病毒)记载于博士论文:基于多组学的人55型腺病毒与宿主相互作用研究,王凯英,2021;公众按照国家生物安全的有关规定可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。
下述实施例中所涉及的序列如表1。
表1.单克隆抗体的相关序列
实施例1、抗体的发现
一、小鼠免疫及多克隆抗体的制备
1、免疫:4-6周龄的SPF级雌性Balb/c小鼠随机分组,每组2只。纯化的HAdV55灭活病毒颗粒(实施例3步骤一制备)加入1/10体积铝佐剂(Bioss,C5084),充分乳化混匀,每只小鼠肌肉内注射100μl(含25ug病毒颗粒),设置未免疫小鼠作为空白对照组;间隔2周用同样剂量和方法进行免疫,共免疫4次。
2、55型腺病毒抗血清的制备:最后一次免疫两周后进行采血,4℃放置过夜后5,000rpm离心30min,将血清转移至EP管中,56℃、30min进行补体灭活,即为55型腺病毒抗血清,分装冻存于-80℃冰箱备用。
3、血清中抗体滴度检测:
(1)取实施例3中制备的HAdV55灭活病毒(200ng),补碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)至100μL,按每孔100μL加入到酶标板(Corning,货号:9018)中,4℃包被过夜。
(2)完成上述步骤后,取所述酶标板,PBST洗板3次,加入含有2%(质量百分含量)BSA的PBS封闭液,37℃孵育2小时。
(3)完成上述步骤后,取所述酶标板,弃去封闭液,加入稀释好的小鼠血清100μL/孔(小鼠血清用2%BSA进行4倍梯度稀释,稀释倍数分别为100、400、1600、6400、25600、102400、409600、1638400),37℃孵育90min,然后PBST洗板3次。
(4)完成上述步骤后,取所述酶标板,每孔加入100μL的1:4000倍稀释HRP标记的抗人IgG抗体(中杉金桥,货号ZB-2304),37℃孵育45min,PBST洗板3次。
(5)完成上述步骤后,取所述酶标板,每孔加入50μL OPD底物显色液,室温下孵育10分钟。
(6)完成上述步骤后,取所述酶标板,每孔加入50μL 1M硫酸溶液终止酶联反应。
(7)酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。
结果如图1所示。图中,横坐标为血清的稀释度,纵坐标为光密度值。分析显示与免疫前的小鼠血清样品相比,免疫后的血清对HAdV55结合显示出有效且特异性的结合活性,证实产生特异性抗体。
二、免疫库的制备
末次免疫后2周,小鼠处死取脾,分离脾细胞,利用细胞总RNA提取试剂盒(天根,DP430),将分离的脾细胞进行总RNA的提取。以提取的总RNA为模板,利用第一链cDNA合成试剂盒(Thermo scientific,K1621)分别合成重链可变区和轻链可变区,反转录引物采取基因特异性引物,引物配对区分别位于抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区,具体序列分别为PmCGR:5’-TGCATTTGAACTCCTTGCC-3’和PmCKR:5’-CCATCAATCTTCCACTTGA C-3’。将合成好的cDNA立即存放于-70℃保存备用。然后以反转录得到的cDNA为模板,参考文献(Journal ofImmunological Methods,201(1997),35–55)合成引物,并利用PCR分别扩增鼠抗体重链可变区和轻链可变区,然后利用重叠延伸PCR技术,构建单链抗体(scFv)。最后将制备的小鼠单链抗体基因克隆至载体pADSCFV-S载体(参见发明专利201510097117.0),构建scFv库。此抗体库的库容达到2×108,正确率为92%。
二、抗人55型腺病毒小鼠单链抗体库的筛选
以纯化的HAdV55灭活病毒颗粒(实施例3步骤一制备)为抗原,利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示:通用实验指南/(美)克拉克森(Clackson,T)(美)洛曼(Lowman,H.B.)编;马岚等译。化学工业出版社,2008.5)筛选上述构建的小鼠单链抗体噬菌体库,共进行三轮筛选,最终获得能特异性结合HAdV55灭活病毒颗粒的单链抗体克隆55Ab9-8。其重链可变区的氨基酸序列为序列2自N端起的第1-123位(自N端第26-33位氨基酸残基组成HCDR1,第51-58位氨基酸残基组成HCDR2,第97-112位氨基酸残基组成HCDR3),对应的编码基因的核苷酸序列为序列1自5’端起的第1-369位。55Ab9-8抗体的轻链可变区的氨基酸序列为序列4自N端起的第1-113位(其中,自N端第27-38位氨基酸残基组成LCDR1,第56-58位氨基酸残基组成LCDR2,第95-103位氨基酸残基组成LCDR3),对应的编码基因的核苷酸序列为序列3自5’端起的第1-339位。
实施例2、55Ab9-8抗体的制备
一、重组质粒的构建
1、将pcDNA3.1(+)(Invitrogen,V79020)的HindIII和BamH I识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列1的DNA分子(55Ab9-8抗体的重链基因),保持pcDNA3.1(+)载体的其它核苷酸不变,得到含有重链基因的重组表达载体pcDNA-9-8H(已经测序验证)。
pcDNA-9-8H含有核苷酸序列是序列1的单克隆抗体55Ab9-8抗体的重链基因,可变区(VH)的编码基因的核苷酸序列是序列1的第1-369位核苷酸,含有HCDR1的编码基因、HCDR2的编码基因和HCDR3的编码基因,HCDR1的编码基因为序列1的第76-99位核苷酸,HCDR2的编码基因为序列1的第151-174位核苷酸,HCDR3的编码基因为序列1的第289-336位核苷酸;第370-666位核苷酸编码CH1,第667-711位核苷酸编码Hinge,第712-1041位核苷酸编码CH2,第1042-1359位核苷酸编码CH3,第1360-1362位核苷酸为终止密码子。
pcDNA-9-8H表达氨基酸序列为序列2的单克隆抗体55Ab9-8抗体的重链,重链可变区的氨基酸序列为序列2的第1-123位,重链可变区包括三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3;HCDR1的氨基酸序列为序列2的第26-33位,HCDR2的氨基酸序列为序列2的第51-58位,HCDR3的氨基酸序列为序列2的第97-112位,第124-222位氨基酸残基组成重链恒定区CH1,第223-237位氨基酸残基组成重链铰链区Hinge,第238-347位氨基酸残基组成重链恒定区CH2,第348-453位氨基酸残基组成重链恒定区CH3。
2、将pcDNA3.1(+)(Invitrogen,V79020)的HindIII和BamH I识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列3的DNA分子(55Ab9-8抗体的轻链可变区基因),保持pcDNA3.1(+)的其它核苷酸不变,得到含有轻链基因的重组表达载体pcDNA-9-8K(已经测序验证)。
pcDNA-9-8K含有核苷酸序列是含有核苷酸序列是序列3的单克隆抗体55Ab9-8抗体的轻链基因,轻链可变区(VL)的编码基因的核苷酸序列是序列3的第1-339位,含有LCDR1的编码基因、LCDR2的编码基因和LCDR3的编码基因,LCDR1的编码基因为序列3的第79-114位核苷酸,LCDR2的编码基因为序列3的第166-174位核苷酸,LCDR3的编码基因为序列3的第283-309位核苷酸,第348-654位核苷酸编码轻链恒定区CL,第655-657位核苷酸为终止密码子。
pcDNA-9-8K表达氨基酸序列为序列4的单克隆抗体55Ab9-8抗体的轻链,轻链可变区的氨基酸序列为序列4的第1-113位,轻链可变区包括三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3;LCDR1的氨基酸序列为序列4的第27-38位,所述LCDR2的氨基酸序列为序列4的第56-58位,所述LCDR3的氨基酸序列为序列4的95-103位,第117-218位氨基酸残基组成轻链恒定区CL。
上述CDR是根据Kabat编号系统定义的序列。
二、55Ab9-8抗体的制备
1、转染前一天将FreeStyleTM HEK 293-F细胞(Invitrogen公司,货号:R79007)调整至浓度为1.0×106个/mL,接种至培养瓶中,37℃、5%CO2、125rpm细胞摇床中震荡培养24h。
2、完成步骤1后,转染当天,取所述培养瓶,将转染复合物加至培养瓶中,37℃、5%CO2、125rpm细胞摇床中震荡培养,48小时开始监测细胞活度,在细胞活度降到80-85%时1,000rpm离心10min收集培养上清。
转染复合物:将24μL的FectoPRO转染试剂稀释于3mL FreeStyle 293培养基(Gibco12338-018),轻轻混匀,加入步骤一制备的pcDNA-9-8H 12μg,pcDNA-9-8K12μg,混匀后室温放置10min。
3、完成步骤2后,将上清用0.45μm滤膜过滤以去除杂质,加入10×PB调节离子浓度与结合缓冲液相近;用AKTA纯化系统(GE,AKTA EXPLORER)进行抗体纯化,在AKTA纯化仪器中安装HiTrap MabSelect Xtra纯化柱,设定相应系统参数,用结合缓冲液平衡纯化柱并上样,随后继续平衡,然后用柠檬酸溶液(pH3.0)冲洗预装柱以洗脱抗体蛋白,UV280达到100时开始收集,UV280降至100时结束收集,并将缓冲液置换为柠檬酸盐溶液(pH6.0),得到55Ab9-8抗体溶液。
4、取步骤3纯化的抗体溶液,SDS-PAGE电泳检测抗体表达,结果表明55Ab9-8抗体分子量大小与预期一致(图2):左侧图片是非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(非还原性SDS-PAGE),左起第2泳道是全长单克隆抗体,其分子量约为150千道尔顿;右侧图片是还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(还原性SDS-PAGE),左起第4泳道两个条带分别为轻链和重链,其分子量分别为25千道尔顿和50千道尔顿;M为蛋白质Marker。取样用NanoDrop紫外分光光度计(ThermoScientific)测定蛋白浓度,经检测蛋白浓度为0.65mg/mL。
实施例3、55Ab9-8抗体的结合能力检测
一、人55型腺病毒病毒原液、浓缩液与灭活病毒的制备
1、腺病毒病毒液制备
腺病毒培养:常规DMEM+10%(体积百分含量)FBS培养基培养A549细胞(北京协和细胞资源中心,货号:25),接种病毒前一天将A549细胞传代于75cm2细胞瓶中,使第二天接种病毒时细胞密度达到75%-90%;接种当天,缓慢吸出培养瓶内的细胞培养基,加入5mLDMEM轻轻冲洗细胞后弃去,另加入3mL DMEM+2%(体积百分含量)FBS;用微量移液器吸取HAdV55病毒于细胞瓶中,按MOI≈0.001进行感染,均匀晃动瓶子数次使病毒分散均匀,置于37℃,5%CO2的培养箱中吸附2h,期间每隔30min左右晃动培养瓶一次;吸附完成后,弃掉病毒培养液,重新加入15mL新的DMEM+2%(体积百分含量)FBS,然后将细胞瓶放置在37℃,5%CO2的培养箱中继续培养;每日观察细胞病变情况(病毒感染增殖后会出现细胞病变,表现为细胞皱缩、脱落等特征);当75%-100%细胞出现病变时收获病毒培养物,-80℃冻融2次,4,000rpm离心5min去除细胞碎片,收集上清分装后保存于-80℃,即为HAdV55病毒原液。
2、腺病毒滴度测定
实验前一天取生长状态良好的A549细胞,胰酶消化后DMEM+10%(体积百分含量)FBS调细胞密度至3×105/mL,接种于96孔细胞培养板,每孔100μL,37℃、5% CO2培养;实验当天取出96孔板,弃培养基,无血清培养基洗一遍,加入DMEM+2%(体积百分含量)FBS,100μL/孔;然后用无血清培养基10倍梯度稀释待测的HAdV55病毒液,10-1~10-8共8个梯度,稀释好的病毒按照10μL/孔加入备好的96孔板中,每个稀释梯度8孔,同时设置空白对照组,操作完成细胞置于37℃、5% CO2的培养箱中培养观察,7天后计数各孔细胞死亡情况,根据下面公式计算病毒原液的TCID50。
距离比例=(高于50%病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数),
LgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数。
经检测和计算,本研究中所用HAdV55病毒原液的病毒滴度=4.36×107TCID50/mL,病毒浓缩液的病毒滴度=2.7×109TCID50/mL。
3、腺病毒的灭活与纯化
取HAdV55病毒原液转移至500mL样品瓶,用碳酸氢钠调pH至7.6,然后按照1:2000的比例加入β-丙内酯,边加边搅拌,充分混匀后,4℃继续搅拌灭活,24小时后再次调pH至7.6,按照1:2000的比例补加β-丙内酯,4℃继续搅拌灭活24小时,取不少于1‰体积的样品37℃水浴水解4小时(中间观察到样品颜色变黄时用碳酸氢钠调整pH至7.0左右),水解结束,取前一天传至25cm2细胞瓶的A549细胞,按照1mL样品接种1瓶25cm2 A549细胞的比例接种(不足1mL按1mL计算),同时设置接种未灭活病毒的细胞及未处置空细胞作为对照,置于37℃、5% CO2的培养箱中培养观察,7天后盲传至新的A549细胞,继续观察,如此盲传3代,接种未灭活病毒样品细胞病变而灭活实验组细胞与空白细胞均不病变者,判定为灭活检测结果可信,灭活完全,否则为灭活不完全,需要重新灭活、检测。
经灭活检测证实灭活完全的病毒原液,4,000rpm离心10分钟去除细胞碎片,用PBS缓冲液平衡Sepharose 4Fast Flow凝胶柱并上样,随后用PBS洗脱,第一个洗脱峰即为目的病毒峰,收集该洗脱峰,然后在Amicon-Ultra-15超滤管(50kD)中加入12.5mL重密度氯化铯溶液(42.23g氯化铯+57.77mL10mM Tris-HCL(pH 7.9-8)),再缓慢加入12.5mL轻密度氯化铯溶液(22.39g氯化铯+77.61mL10mM Tris-HCL(pH 7.9-8)),再加入15mL病毒悬浮液,配平,放于超速离心机(Beckman L100-XP)中,25,000rpm,4℃离心2小时。收集在轻密度和重密度氯化铯溶液之间的条带,PBS透析,过滤除菌得到HAdV55灭活病毒。
4、腺病毒浓缩液的制备:将步骤3获得的HAdV55灭活病毒转入截留分子量为50kD的超滤管(MILLIPORE,货号UFC805008),4,000rpm离心至体积减少至初始体积的1/30,收集截留液,分装后保存于-80℃,即为HAdV55病毒浓缩液。取样进行常规还原性SDS-PAGE检测。SDS-PAGE结果见图3,左起第2泳道是步骤3所获得的HAdV55灭活病毒,左起第3泳道是步骤4所获得的HAdV55病毒浓缩液;M为蛋白质Marker。
二、55Ab9-8抗体的抗原结合能力分析
实验重复三次,每次重复实验如下:
1、取步骤一的4中制备的HAdV55灭活病毒(200ng),补碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)至100μL,按每孔100ul加入到酶标板(Corning,货号:9018)中,4℃包被过夜。
2、完成上述步骤后,取所述酶标板,PBST洗板3次,加入含有2%(质量百分含量)BSA的PBS封闭液,37℃孵育2小时。
3、完成上述步骤后,取所述酶标板,弃去封闭液,每孔加入100μL按照2倍等比稀释的实施例2的55Ab9-8抗体液(起始浓度10μg/mL,用DMEM培养基进行稀释),一共设置24个梯度,每个梯度设2孔,37℃孵育90min,然后PBST洗板6次。
4、完成上述步骤后,取所述酶标板,每孔加入100μL的1:4000倍稀释HRP标记的抗人IgG抗体(中杉金桥,货号ZB-2304),37℃孵育45min,PBST洗板3次。
5、完成上述步骤后,取所述酶标板,每孔加入50μL OPD底物显色液,室温下孵育10分钟。
6、完成上述步骤后,取所述酶标板,每孔加入50μL 1M硫酸溶液终止酶联反应。
7、酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。图4中的OD492-630=492nm波长吸光值-630nm波长吸光值。半最大效应浓度(EC50)指在抗体低浓度和高浓度时有明显的上下平台期,上平台期信号值的一半对应的抗体浓度,测得OD492-630值后根据以下公式即可计算得到EC50值。
y为检测到的OD492-630值,min和max分别为观察到的最小值和最大值,Hill Slope指的是曲线最大斜率的绝对值(即曲线中点)。
结果如图4所示,55Ab9-8抗体与人55型腺病毒的结合半数有效浓度(EC50)为0.0098nM。
实施例4、抗人55型腺病毒感染的药效
实验重复三次,每次重复实验如下:
1、实验前一天取生长状态良好的A549的细胞,胰酶消化,DMEM+10%(体积百分含量)FBS调细胞密度至3×105/mL,接种于96孔细胞培养板,每孔100μL,37℃5% CO2培养。
2、完成步骤1后,实验当天取出96孔板,弃培养基,无血清培养基洗一遍,加入DMEM+2%(体积百分含量)FBS,每孔100μL;然后分组进行如下操作:
实验组(55Ab9-8):将实施例2制备的55Ab9-8抗体用无血清培养基稀释,得到含有不同浓度(起始浓度为100μg/mL,按照2倍等比稀释,一共设置22个梯度)55Ab9-8抗体的待测抗体溶液,每个梯度设2孔;将待测抗体溶液与实施例3步骤一的1中制备的HAdV55病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103TCID50/mL)按照体积比1:1混合,37℃孵育1.5h后加至孔内,100μL/孔,继续置于37℃,5% CO2的培养箱中孵育1h。
阳性抗体对照组:将抗人55型腺病毒小鼠血清(实施例1制备)用无血清培养基稀释,进行2倍的倍比稀释,共22个稀释度,将待测抗体溶液与与实施例3步骤一的1中制备的HAdV55病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103TCID50/mL)按照体积比1:1混合,37℃孵育1.5h后加至孔内,100μL/孔,继续置于37℃,5% CO2的培养箱中孵育1h。
无关抗体对照组:将无关抗体(记载于发明专利CN102993305B)用无血清培养基稀释,得到含有不同浓度(起始浓度为100μg/mL,按照2倍等比稀释,一共设置22个梯度)Anti-EGFR抗体的待测抗体溶液;将待测抗体溶液与实施例2步骤一的1中制备的HAdV55病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103TCID50/mL)按照体积比1:1混合,37℃孵育1.5h后加至孔内,100μL/孔,继续置于37℃,5% CO2的培养箱中孵育1h。
空细胞对照组(CELL):无血清培养基,37℃孵育1.5h后加至孔内,100μL/孔,继续置于37℃,5% CO2的培养箱中孵育1h。
病毒组(VIRUS):将无血清培养基与实施例3步骤一的1中制备的HAdV55病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103TCID50/mL)按照体积比1:1混合,37℃孵育1.5h后加至孔内,100μL/孔,继续置于37℃,5% CO2的培养箱中孵育1h。
完成步骤2后,取96孔板,弃上清,加入DMEM+2%(体积百分含量)FBS培养基(100μL/孔),37℃,5% CO2继续培养1周,直至细胞出现明显病变;37℃培养箱里孵育(至少1小时)后换为2% FBS-DMEM放回孵箱继续培养,每日观察细胞变化。在出现典型CPE后用无菌PBS洗涤前述96孔细胞培养板两次后,按100μL/孔加入DMEM培养基(含10% FBS,10% CCK8试剂),37℃细胞孵箱培养1-2h,酶标仪测定450nm波长吸光值,计算各组抗体对于细胞病变的抑制率(%)=(抗体与病毒混合孵育实验组的450nm波长吸光值-病毒组的450nm波长吸光值)/(空细胞对照组的450nm波长吸光值-病毒组的450nm波长吸光值)×100%。利用检测到的OD450nm数据计算抑制率,然后再以浓度取10的对数为横坐标,以抑制率对应的几率值作为纵坐标,求出每个试验浓度的回归方程和相关系数R,以抑制率为50%时对应的几率值求出IC50值。
结果如图5所示,55Ab9-8抗体对HAdV55的半数最大抑制浓度(IC50)为0.067nM。
实施例5、55Ab9-8人源化改造及检测
一、55Ab9-8人源化改造
将55Ab9-8抗体进行人源化改造,得到一个人源化版本的抗体重链和一个人源化版本的抗体轻链,获得抗体轻链和两个重链分别配对,得到h55Ab9-8抗体。
h55Ab9-8抗体的重链的氨基酸序列是序列6,重链可变区的氨基酸序列为序列6的第1-123位,重链可变区包括三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3;HCDR1的氨基酸序列为序列6的第26-33位,HCDR2的氨基酸序列为序列6的第51-58位,HCDR3的氨基酸序列为序列6的第97-112位,第124-222位氨基酸残基组成重链恒定区CH1,第223-237位氨基酸残基组成重链铰链区Hinge,第238-347位氨基酸残基组成重链恒定区CH2,第348-453位氨基酸残基组成重链恒定区CH3。
h55Ab9-8抗体的轻链可变区的氨基酸是序列8,轻链可变区的氨基酸序列为序列8的第1-113位,轻链可变区包括三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3;LCDR1的氨基酸序列为序列8的第27-38位,所述LCDR2的氨基酸序列为序列8的第56-58位,所述LCDR3的氨基酸序列为序列8的95-103位,第117-218位氨基酸残基组成轻链恒定区CL。
二、h55Ab9-8重组质粒的构建
1、将pcDNA3.1(+)(Invitrogen,V79020)的HindIII和BamH I识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列5的DNA分子(h55Ab9-8抗体的重链基因),保持pcDNA3.1(+)的其它核苷酸不变,得到含有重链基因的重组表达载体pcDNA-9-8H2(已经测序验证)。
pcDNA-9-8H2含有核苷酸序列是序列5的单克隆抗体h55Ab9-8抗体的重链基因,可变区(VH)的编码基因的核苷酸序列是序列5的第1-369位核苷酸,含有HCDR1的编码基因、HCDR2的编码基因和HCDR3的编码基因,HCDR1的编码基因为序列5的第76-99位核苷酸,HCDR2的编码基因为序列5的第151-174位核苷酸,HCDR3的编码基因为序列5的第289-336位核苷酸;第370-666位核苷酸编码CH1,第667-711位核苷酸编码Hinge,第712-1041位核苷酸编码CH2,第1042-1359位核苷酸编码CH3,第1360-1362位核苷酸为终止密码子。
pcDNA-9-8H2表达氨基酸为序列6的单克隆抗体h55Ab9-8抗体的重链,重链可变区的氨基酸序列为序列6的第1-123位,重链可变区包括三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3;HCDR1的氨基酸序列为序列6的第26-33位,HCDR2的氨基酸序列为序列6的第51-58位,HCDR3的氨基酸序列为序列6的第97-112位,第124-222位氨基酸残基组成重链恒定区CH1,第223-237位氨基酸残基组成重链铰链区Hinge,第238-347位氨基酸残基组成重链恒定区CH2,第348-453位氨基酸残基组成重链恒定区CH3。
2、将pcDNA3.1(+)(Invitrogen,V79020)的HindIII和BamH I识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列7的DNA分子(h55Ab9-8抗体的轻链基因),保持pcDNA3.1(+)的其它核苷酸不变,得到含有轻链基因的重组表达载体pcDNA-9-8K2(已经测序验证)。
pcDNA-9-8K2含有核苷酸序列是含有核苷酸序列是序列7的单克隆抗体55Ab9-8抗体的轻链基因,轻链可变区(VL)的编码基因的核苷酸序列是序列7的第1-339位,含有LCDR1的编码基因、LCDR2的编码基因和LCDR3的编码基因,LCDR1的编码基因为序列7的第79-114位核苷酸,LCDR2的编码基因为序列7的第166-174位核苷酸,LCDR3的编码基因为序列7的第283-309位核苷酸,第348-654位核苷酸编码轻链恒定区CL,第655-657位核苷酸为终止密码子。
pcDNA-9-8K2表达氨基酸序列为序列8的单克隆抗体55Ab9-8抗体的轻链,轻链可变区的氨基酸序列为序列8的第1-113位,轻链可变区包括三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3;LCDR1的氨基酸序列为序列8的第27-38位,所述LCDR2的氨基酸序列为序列8的第56-58位,所述LCDR3的氨基酸序列为序列8的95-103位,第117-218位氨基酸残基组成轻链恒定区CL。
上述CDR是根据Kabat编号系统定义的序列。
三、h55Ab9-8抗体的制备
参照实施例2的步骤二制备得到h55Ab9-8抗体溶液。参照实施例3对h55Ab9-8与抗原HAdV55的结合活性进行检测,结果如图6所示,h55Ab9-8抗体与HAdV55的结合半数有效浓度(EC50)为0.0702nM。
四、h55Ab9-8抗体抗人55型腺病毒感染的药效
参照实施例4的方法进行检测h55Ab9-8抗体对HAdV55的半数最大抑制浓度(IC50)。结果如图7所示。结果表明本发明制备抗体h55Ab9-8可以有效抑制HAdV55的感染,其IC50=0.3886nM。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.抗腺病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段,所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区;所述重链可变区包括三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包括三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3;
所述HCDR1的氨基酸序列为序列2的第26-33位,
所述HCDR2的氨基酸序列为序列2的第51-58位,
所述HCDR3的氨基酸序列为序列2的第97-112位,
所述LCDR1的氨基酸序列为序列4的第27-38位,
所述LCDR2的氨基酸序列为序列4的第56-58位,
所述LCDR3的氨基酸序列为序列4的95-103位。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于:所述重链可变区的氨基酸序列为序列6,所述轻链可变区的氨基酸序列为序列8。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于:所述重链可变区的氨基酸序列为序列2,所述轻链可变区的氨基酸序列为序列4。
4.编码权利要求1、2或3所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
5.如权利要求4所述的核酸分子,其特征在于:所述核酸分子为编码权利要求1-3中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的基因。
6.根据权利要求5所述的核酸分子,其特征在于:所述基因为含有所述HCDR1的编码基因、所述HCDR2的编码基因、所述HCDR3的编码基因、所述LCDR1的编码基因、所述LCDR2的编码基因和所述LCDR3的编码基因的DNA分子,所述DNA分子为A)或B):
A)所述HCDR1的编码基因为序列5的第76-99位核苷酸,所述HCDR2的编码基因为序列5的第151-174位核苷酸,所述HCDR3的编码基因为序列5的第289-336位核苷酸,所述LCDR1的编码基因为序列7的第79-114位核苷酸,所述LCDR2的编码基因为序列7的第166-174位核苷酸,所述LCDR3的编码基因为序列7的第283-309位核苷酸;
B)所述HCDR1的编码基因为序列1的第76-99位核苷酸,所述HCDR2的编码基因为序列1的第151-174位核苷酸,所述HCDR3的编码基因为序列1的第289-336位核苷酸,所述LCDR1的编码基因为序列3的第79-114位核苷酸,所述LCDR2的编码基因为序列3的第166-174位核苷酸,所述LCDR3的编码基因为序列3的第283-309位核苷酸。
7.根据权利要求5所述的核酸分子,其特征在于:所述基因为C)或D)的DNA分子:
C)编码所述重链可变区的基因和编码所述轻链可变区的基因,编码所述重链可变区的基因的核苷酸序列是序列5,编码所述轻链可变区的基因的核苷酸序列是序列7;
D)编码所述重链可变区的基因和编码所述轻链可变区的基因,编码所述重链可变区的基因的核苷酸序列是序列1,编码所述轻链可变区的基因的核苷酸序列是序列3。
8.生物材料,所述生物材料为下述任一种:
B1)含有权利要求4-7中任一所述核酸分子的表达盒;
B2)含有B1)所述表达盒的重组载体;
B3)含有权利要求4-7中任一所述核酸分子的重组微生物;
B4)含有B1)所述表达盒的重组微生物;
B5)含有B2)所述重组载体的重组微生物;
B6)含有权利要求4-7中任一所述核酸分子的转基因动物细胞系;
B7)含有B1)所述表达盒的转基因动物细胞系;
B11)含有B2)所述重组载体的转基因动物细胞系。
9.权利要求1-3中任一所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求4-7中任一所述的核酸分子的用途,所述用途为(e1)和/或(e2):
(e1)权利要求1-3中任一所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求4-7中任一所述的核酸分子在制备腺病毒抑制剂中的用途,
(e2)权利要求1-3中任一所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求4-7中任一所述的核酸分子在制备预防和/或治疗腺病毒感染引起的疾病的药物中的用途。
10.产品,所述产品为腺病毒抑制剂、或预防和/或治疗腺病毒感染引起的疾病的药物,所述产品含有权利要求1-3中任一所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
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