KR100274186B1 - 싸이모신-알파와 다른 싸이토킨이 융합된 융합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 싸이모신-알파와 다른 싸이토킨이 그 생리활성을 유지하는 형태로 융합된 융합 단백질을 제공하며 이는 두가지 단백질의 생리 활성효과를 동시에 나타내는 잇점이 있다.

Description

싸이모신-알파와 다른 싸이토킨이 융합된 융합 단백질

제1도는 합성한 싸이모신-알파가 사람 T 세포를 증식시키는 생리활성이 있는지를 시험한 결과이며,

제2도는 DTT 의 농도와 반응시간을 달리하여 인터페론-알파의 최적 부분환원을 시험한 결과를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인한 것이며,

제3도는 제2도의 SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 나타난 띠의 상대적 비율을 덴시토미터로 측정한 것이며,

제4도는 싸이모신-알파와 설포-SIAB 의 반응이 끝난 후 DEAE-고성능 액체 크로마토그래피를 수행한 결과이며,

제5도는 제4도의 1~5 까지의 피크들을 각각 부분환원시킨 인터페론-알파와 소량 반응시킨 것으로 1~5 는 제4도의 피크 1~5 를 나타낸 것이며,

제6도는 부분환원시킨 인터페론-알파와 SIAB-싸이모신-알파와의 최적반응 시간을 시험한 것으로 열의 표시는 반응시간(분)을 나타낸 것이며,

제7도는 부분환원시킨 인터페론-알파와 SIAB-싸이모신-알파의 반응이 끝난 후 DEAE-고성능 액체 크로마토그래피를 수행한 결과이며,

제8도는 제7도의 피크들을 비환원성 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 전개한 것으로서 M 은 분자량 표지이고, α는 천연형 인터페론-알파와 동일한 14.30 분의 피크이며, 1 은 26.35 분, 2 는 28.98 분, 3 은 21.30 분의 피크이고,

제9도는 융합 단백질에서 싸이모신-알파의 활성을 측정하기 위해 효소 면역 측정법을 실시한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 싸이모신-알파와 다른 싸이토킨이 융합된 융합 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 싸이모신-알파에 다른 싸이토킨을 그 생물학적 활성을 유지하는 형태로 융합시켜 제조한 새로운 형태의 싸이토킨에 관한 것이다.

싸이토킨 (cytosine)은 세포에서 분비되는 단백질 혹은 폴리펩티드로서 분비하는 세포 자체에 작용하기도 하며, 혹은 그 주위의 다른 세포에 작용하여 생리활성을 나타내기도 한다. 싸이토킨의 작용기작은 세포에 존재하는 수용체(receptor)와 작용한 후, 특정 시그널이 세포내로 전달됨으로써 일어난다. 현재까지 알려진 싸이토킨은 종류가 무척 많으며, 지금까지 발견된 많은 수의 싸이토킨들은 인체의 면역체계에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 실험실에서 입증된 싸이토킨의 기능을 살펴보면 인터루킨 1 은 T 세포를 활성화시키며, 인터루킨 2 는 T 세포의 성장에 관여하며, 인터루킨 3 은 조혈 모세포의 성장을 촉진하며, 인터페론-감마는 MHC 발현을 증대하며 또한 항-바이러스 활성도 가지고 있다. 이상에 열거한 싸이토킨들은 여지껏 발현된 많은 싸이토킨들의 극히 일부이며 많은 종류의 싸이토킨들이 임상적으로 효능성이 입증되어 현재 항암제 및 항바이러스제의 치료제로서 유용하게 쓰이 고 있다. 본 발명의 대상물질인 인터페론-알파와 싸이모신 알파도 마찬가지로 전자는 이미 광범위하게 항암 및 B 형, C 형 바이러스 치료제로서 임상 응용되고 있거니와 후자의 경우도 시험관에서 효능이 입증되었고, 동물실험에서도 항암 작용을 보여주고 있다.

인터페론은 1957년 아이작스 및 린덴만이 닭을 인플루엔자 A 바이러스로 감염 시켰을 때 바이러스의 번식을 억제하는 물질로서 발견되어 최초로 알려지게 되었다(Isaacs, K 및 Lindenmann, J., Proc. R. Soc. Lond. B 147, 258 (1957)). 인터페론-알파는 B-세포 분열 인자(mitogen), 외래 거대 분자, 바이러스 혹은 암세포 등에 의해 백혈구가 자극받았을 때 생성되는 것으로 현재까지 20 종 이상의 인터페론 유전자가 알려져 있다.

최근에는 유전자 재조합 방법에 의하여 재조합 사람 인터페론-알파의 대량 생산이 가능하여짐에 따라(Goedell, D.V. 등, 287, 411, (198O)) 여러가지 질환의 치료제로서 이용되고 있다. 현재 임상적으로 쓰이고 있는 인터페톤-알파는 알파 2a 와 알파 2b 의 형태가 있으며, 두 단백질 모두 165 개의 아미노산으로 구성되어 있다. 인터페톤 알파 2a 가 알파 2b 와 다른 점은 2a 의 경우 23 번째 아미노산이 라이신(lysine)이나, 2b 는 아르기닌(arginine)인 것이다. 그러나, 두 물질 모두 생리 활성의 특성에 대해서는 동일하다(Foon, K.A., Caner Res. 49, 1621(1989)).

싸이모신은 포유류의 흉선(thymus gland)에서 분비되는 폴리펩티드 호르몬의 일종으로 T-세포의 성장 및 분화를 촉진한다(Smith, E. L, 등, Principles of Biochemistry, McGraw-Hill, New York, (1983)). 싸이모신-알파는 싸이모신 호르몬의 일종으로 28 개의 아미노산으로 구성되어 있다(Goldstein, A.L. 등 US Patent No. 4079127). 천연형 싸이모신의 N-말단은 아세틸화 되어 있으나, 아세틸 그룹이 생리활성에 영향을 미치지는 않는 것으로 되어 있다(E. P. Publication No. O035454). 싸이모신-알파는 임상적으로 일차적 면역결핍(primary immunodeficiency) 환자의 세포 면역을 회복시키며 (Frasca, D. 등, Eur. J. Immu. 17, 727(1987)) 또한 NSCLC(Non Small Cell Lung Cancer) 환자들의 흉선의존성 면역(thymic dependent immunity)의 보강을 촉진시키는 효과(Schulof, R.S. 등, J. Biol. Response Modifiers 4, 147 (1985))가 입증되었다. 또한 최근에는 B 형 간염 의 치료에도 탁월한 효능을 보여 주고 있다(Mutchnick, M.G. 등, Hepatology 14, 409(1991)).

싸이모신-알파와 인터페론-알파의 병용투여에 의한 치료 효과는 파발리(C. Favalli)등에 의해 제시되었다(Cancer Immunol. Immunother. 20, 189 (1985)). 사이클로포스파마이드(cyclophospha-mide)로 처리된 쥐에서 싸이모신 알파와 인터페론의 병용 투여시 인터페론이나 싸이모신의 단독투여에 비하여 NK(natural killor) 세포활성이 상승되는 것을 관찰하여 보고한 바 있다. 더 나아가서, 게라시(E. Garaci) 등은 싸이모신-알파와 인터페론-알파의 병용 투여에 의해 루이스 폐암(Lewis lung carcinoma)을 가진 쥐의 암종이 괄목할만하게 사라지는 것을 관찰하였다(Cancer. Immunol. Immunother. 32, 154 (1990)).

따라서, 본 발명자들은 이상의 실험적 관찰을 근거로 싸이모신-알파와 다른 싸이토킨, 특히 인터페론-알파를 연결하여 싸이모신이 가지는 생리활성과 다른 싸이토킨이 갖는 생리활성을 모두 포함하는 융합 단백질을 만들고자 노력하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 융합 단백질을 사용하면 두 물질의 효과도 나타낼 수 있을 것이며 또한 두 물질을 단독으로 사용할 때 나타나는 단점, 예를 들면, 싸이모신과 같은 올리고 펜티드성 물질은 일반적으로 체내에 주입되면 체내 반감기가 짧아서 투여회수를 늘리거나 아니면 투여 용량을 증가시켜야 하는 단점을 보완할 수 있을 것으로 예상된다. 그 외에도 많은 잇점이 있을 수 있을 것이다.

그러므로, 본 발명의 목적은 싸이모신-알파와 다른 싸이토킨의 융합 단백질을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 실시예와 기타의 설명에서 다른 싸이토킨으로 인터페론 알파를 예로 들어 설명하고 있으나 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

싸이모신 알파와 다른 싸이토킨을 융합시켜서 싸이모신 알파의 성격도 가지고 다른 싸이토킨의 성격도 가지며, 또한 서로의 단점을 보완할 수 있는 그런 단백질이 만들어질 수 있음을 보여 주는 일례로서 인터페론 알파를 사용한 것일 따름이다.

이하 본 발명을 간단히 설명하면 다음과 같다.

싸이모신-알파와 인터페론-알파의 화학적 방법에 의한 연결은,

가) 화학적 합성에 의하여 싸이모신-알파를 합성하고

나) 인터페론-알파를 환원제를 이용하여 2 개의 다이설파이드 결합 중 1번, 98 번 하나를 선택적으로 절단한 뒤

다) 교차 결합 매체(cross-linking agent)를 이용하여 선택적으로 싸이모신 과 인터페론의 시스테인기를 연결함으로써 이루어진다.

싸이모신-알파는 공지의 아미노산 서열을 이용하여(Low et at. The Year in Hematology, pp 281-319, 1978) 표 1 에 나타난 바와같이 설계하고, 펩타이드 합성기(ABI 사, 미국, 모델 431A)를 이용하여 합성한다. 그러나 천연의 싸이모신-알파 또는 유전자 재조합 방법에 의해 생산된 싸이모신-알파를 사용할 수도 있다.

본 실험에 사용한 인터페론-알파는 대한민국 특허 출원 제 92-1155 호의 방법에 의하여 형질전환된 효모에서 정제된 재조합 사람 인터페론-알파를 사용하였 으나, 본 발명의 원리는 인터페론-알파와 상등성이 높은 인터페론-베타 등에도 적용될 수 있다.

또한, 인터페론은 사람 인터페론에 국한하지 않고, 모든 포유류의 인터페론에 적용할 수 있을 것이다. 더 나아가서 본 실험에서 사용한 화학적 교차결합 방법 은 인터페론에 국한하지 않고 천연 상태에서 시스테인을 포함하는 싸이토킨 및 유전자 조작을 통하여 비기능성 시스테인을 함유한 싸이토킨에 광범위하게 적용될 수 있다.

사용가능한 다른 싸이토킨으로는 인터페론 알파 외에, 인터페론 베타, 인터루킨 시리즈, 종양괴사인자 등이 있다.

또한, 본 발명에서는 싸이모신 알파와 인터페론을 연결하는 방법으로 화학적 교차결합 방식을 이용하였으나 일반적으로 보편화된 유전자 재조합 방법을 이용하여 싸이모신 알파와 인터페론을 접합시킬 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 실시예에 예시한 방법은 본 발명의 개념을 충족시키는 한 예일 뿐 본 발명의 근본원리에서 제안한 응용범위를 제한하지는 않는다.

본 발명에서 싸이모신-알파의 접합대상으로 사용한 인터페론 알파의 물성을 상세히 설명하면 다음과 같다. 인터페론-알파에는 2 개의 다이설파이드 결합이 있는데, 1 번의 시스테인기와 98 번의 시스테인기 사이에 다이설파이드 결합이 있으며, 29 번과 138 번의 시스테인기 사이에 또 다른 하나의 다이설파이드기가 연결되 어 있다. 유전자 재조합 인터페론-알파의 정제과정에서 2 개의 다이설파이드 결합을 천연형과 같이 이루도록 하는데는 고도의 기술이 필요하며, 단백질 재구성(refolding)을 통한 정제 과정시에 중간 부산물로서 29 번과 138 번의 다이설파이드기가 연결은 되었으나, 1 번과 98 번은 연결되지 않은 부분 산화형 인터페 론이 얻어진다.(대한민국 특허출원 제 92-1155 호). 부분산화형 인터페론-알파는 이미 여러 문헌을 통하여 입증되었듯이, 천연형 인터페론-알파와 생리활성 역가는 비슷하다(Wetzel, R., 등, J. Cell. Biochem. Suppl. 6, 89(1982)).

따라서, 싸이모신-알파를 부분산화형 인터페론-알파에 결합시켜 부분산화형의 생리활성 정도를 유지할 수 있다면 본 발명의 소기의 목적을 달성할 수 있을 것이다. 부분산화형 인터페론-알파 내에 존재하는 1 번과 98 번의 시스테인기 중 특히 1 번 시스테인기는 98 번 시스테인기에 비하여 화학적으로 더 반응력이 강하다(De Chiara, T. M. 등, Methods in Enzymol. 119, 403(1986)). 따라서, 부분산화형 인터페론-알파의 화학 반응(예를들면 다이설파이드 연결에 의한 이중체의 형성 혹은 화학적 교차 결합기에 의한 반응 등)은 거의 1 번 시스테인기에 의하여 일어난다. 싸이모신-알파와 결합한 경우도 예외는 아니다. 그러나 1 번 시스테인기에서의 반응이 완료되면 98 번 시스테인기에서도 반응이 일어날 수 있다. 본 발명 은 싸이모신-알파와 인터페론-알파의 교차결합 후에도 두 싸이토킨의 생리활성을 개별적으로 유지시켜야 그 목적이 달성될 수 있으므로, 인터페론-알파의 3 차원적 구조에 최소한의 변화를 일으키는 조건인 싸이모신과 인터페론이 1 대 1 의 몰비 로 반응하는 조건을 만들어 주는 것이 중요하다. 싸이모신-알파와 반응하는 다른 싸이토킨이 인터페론 이외의 것일 때에도 적정 조건을 찾는 것이 중요하다.

인터페론-알파의 성격상 싸이모신-알파와 인터페론의 반응은 동일 몰비로 이 루어져야 하지만 다른 싸이토킨의 경우는 그 싸이토킨의 성격에 따라(예를들면, 시스테인기는 몇개이며, 어느 정도의 부분 산화형이 천연형과 같은 활성을 가지느냐에 따라) 몰비는 달라져야 한다.

인터페론-알파의 부분 환원은 0.1~2.OmM 의 다이티오트 레이톨(DTT)을 처리하여 20~200 분간 반응시키는 것이 좋으며, 가장 바람직하게는 완전 환원형의 함량이 상대적으로 낮은, 즉 부분산화형 대 완전환원형의 비율이 높은 조건인 0.5mM 의 DTT 로 1OO 분간 인터페론-알파에 반응시키는 것이 좋다

교차 결합 매체로는 설포-SIAB(sulfo succinimidyl(4-iodoacetyl) amino benzoate; Pierce 사, 미국)를 사용한다. 먼저 싸이모신-알파와 설포-SIAB 를 반응시켜 컬럼을 이용하여 정제한 후 부분환원된 인터페론-알파를 가하고 37℃에서 10 분 내지 1 시간 동안, 바람직하게는 30 분간 반응시킨다. 반응액을 컬럼으로 확인하여 싸이모신-알파와 인터페톤-알파가 동몰비로 반응한 용출액을 모은다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

[참조예 1] 싸이모신-알파의 합성, 정제 및 생리 활성 확인

1-1) 싸이모신 알파의 합성 및 정제

싸이모신 알파는 펩타이드 합성기(ABI 사, 미국, 모델 431A)를 이용하여 합성 하였으며 아미노산 배열은 표 2 에 나타낸 바와 같다. 합성기에 사용된 각각의 아미노산은 t-Boc 기로 봉쇄된 아미노산 이었으며, 최종적으로 합성이 완료된 수지에서 합성된 펩타이드를 유리시키는데는 TFMSA(trifluoromethanesulfonic anhydride)가 사용되었다. 합성된 조 펩타이드는 C18-역상고압 크로마토그래피(벡크만사, 미국)을 이용하여 순수정제하였다.

정제된 싸이모신 알파는 아미노산 분석기(ABI 사, 미국, 모델 420A)를 이용하여 28 개의 아미노산으로 구성되어 있음을 확인하였으며, 아미노산 조성은 표 2에 나타낸 바와 같다.

1-2) 싸이모신-알파의 생리활성 확인

합성된 싸이모신-알파가 생리활성을 나타내는 물질인지를 확인하기 위하여 수행한 실험으로 싸이모신-알파가 사람 T 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 T 세포내에 [³H] 티미딘의 흡수된 양을 측정함으로써 DNA 합성 정도를 비교하였다. 먼저, 정상 성인 자원자의 정맥피로부터 쿠타브등의 방법(Kouttab, N. M. 등, Immunopharmacology 16, 97(1988))에 따라 T 세포를 분리하였다. 분리된 T 세포를 10% 우태아 혈청이 든 IMDM 배지(Isocove's modified dulbelco's medium; Difco, 미국)로 매 ㎖ 당 2×10⁶개의 세포가 들어가도록 현탁시켜 96 공 플레이트에 100㎕ 씩 분주하여 각 공마다 2×1O⁵개의 세포가 들어가게 하였다. 전체를 3 개 의 군으로 나누어 실험을 하였다. 1 군의 공에는 IMDM 을, 2 군의 공에는 40㎍/㎖ 농도로 PHA(Phytohemagglutinin; Sigma, 미국)를 녹인 IMDM 50㎕ 및 IMDM 을, 3 군의 공에는 PHA 를 40㎍/㎖ 농도로 녹인 IMDM 50㎕ 씩, 싸이모신-알파(최종 농도 1.O㎍/㎖) 및 IMDM 을 넣어 각 공의 최종 부피가 200㎕ 되도록 하였다. 여기서 PHA 는 T 세포를 자극시키기 위한 인자로 사용된 것이다. 이것을 37℃에서 5% 이산화탄소 및 95% 이상의 습도가 유지되는 조건에서 48 시간 배양한 뒤, 각 공마다 1μCi 의 [³H]티미딘(27Ci/mmol; Amersham, 영국)을 처리하여 동일한 조건에서 다시 16 시간 배양하였다.

배양 후 세포수확기(cell harvestor; Skatron, 미국)로 세포를 수확하여 세포내 DNA 에 함유된 [³H] 티미딘의 양을 액체신틸레이션 계수기(LKB, 스웨덴)로 측정하여 각 CPM 값을 비교한 결과를 제 1 도에 나타내었다. 제 1 도에서 가로축은 샘플군의 번호를 나타낸 것이고, 세로축은 각 샘플군의 CPM 값을 나타낸 것이며 PHA 만 처리했을 때의 CPM 값을 100% 로 잡았을 때의 상대적인 값을 막대 그래프의 상단에 나타내었다. 도면에서 보다시피 1.O㎍/㎖ 의 싸이모신-알파를 처리한 경우는 150% 로 50% 의 T 세포 증식이 더 일어난 것으로 나타났다. 따라서 실시예 1에서 만들어진 합성 싸이모신-알파는 생리활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

[참조예 2] 인터페론-알파의 부분환원 조건

재조합 인터페론 알파는 대한민국 특허 출원 제 92-1155 호의 방법에 의하여 형질전환된 효모를 배양한후 정제하였다. 인터페론-알파가 가지고 있는 2 개의 다이설파이드 결합이 환원제에 의해 환원되는 양상을 조사하기 위하여 인터페론-알파의 부분환원 실험을 수행하였다.

환원제로는 다이티오트레이톨(DTT)을 사용하였으며, DTT 의 농도와 반응시간 별로 다이설파이드 결합이 환원되는 정도를 실험하였다. 정제된 재조합 인터페론-알파를 2㎎/㎖ 의 농도로 완충용액 (10mM 인산화칼륨, 0.15M NaCl, pH 7.2)에 용해 시킨 후, 각각의 튜브에 다이티오트레이톨을 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 10mM 의 농도로 넣어준 후 30℃ 의 항온조에서 20, 60, 100 분 동안 각각 반응을 시켰다. 반응을 종결시키기 위하여 0.1M NaOH 에 용해된 요오도 아세트 아미드(iodoacetamide, 250mg/㎖)을 소량(전체 반응 부피의 10%) 가하였다. 인터페론 알파가 환원제에 의하여 환원된 정도를 알기 위하여 소디움도데실설페이트-폴리아크릴 아미드 젤 전기 영동(SDS-PAGE)을 수행하였다. 단, 전기영동시에 인터페론-알파를 함유하는 샘플완충액(sample buffer)에는 통상적으로 사용되는 환원제인 베타-머캅토 에탄올을 넣지 않았다. 제 2 도는 본 실험결과의 한 예를 나타내는 것이며, 각 열의 표시는 아래 표 3 과 같다.

환원된 인터페론과 비환원된 인터페론의 상대적인 비는 SDS-전기영동 젤을 염색한 후 덴시토미터(BioRad 사, 미국, model 620)를 이용하여 결정하였다. 제 2 도에서 보는 바와같이 인터페론-알파가 함유하는 2 개의 다이설파이드 결합중 하나만 환원된 부분 산화형과 2 개 다 환원된 환원형이 전기영동 젤에서 구분이 가능하도록 분리가 된다. 전기영동 젤에서 나타난 띠의 상대적인 비율을 그래프로 나타낸 것이 제 3 도이며, 검은 막대로 표시된 것이 부분산화형의 비율이다. 제 2 도와 제 3 도의 실험결과에 의하면 인터페론-알파를 1mM DTT 로 60 분간 반응시키는 경우 57% 의 부분 산화형을 얻을 수 있었다. 그러나, 교차 결합을 위한 실험 목적을 위해서는 완전 환원형의 함량이 절대적으로 적을수록 바람직하기 때문에 부분 산화형 대 완전 환원형의 비율이 높은 실험조건을 채택하는 것이 바람직하다. 따라서, 부분 산화형이 약 55% 이며 완전 환원형이 약 12% 가 생성되는 0.5mM DTT 로 100 분간 인터페론-알파을 반응시키는 조건을 채택하였다.

[실시예 1] 인터페론-알파와 싸이모신-알파의 교차 결합

단계 1) 싸이모신 알파와 교차 결합 시약과의 반응

싸이모신 알파의 N-말단 아미노기에 결합하는 시료는 설포-SIAB(sulfo succinimidyl(4-iodoacetyl) amino benzoate; Pierce 사, 미국)를 사용하였다. 싸이모신 알파와 설포-SIAB 의 몰비를 1:5 로 하여 100mM 소디움 보레이트(pH 7.6)에 녹인 후 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난후 용액을 20mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 7.0)으로 평형화 되어 있는 세파덱스 G-25(Pharmacia 사, 스웨덴 ) 칼럼에 투입하였다. 칼럼에서 용출되는 최초의 피크를 20mM Tris-HCl(pH 7.0)로 평형화 되어 있는 DEAE-고성능 액체 크로마토그래피 칼럼(DEAE-HPLC, Protein PAK, 10mm X 100mm; Waters사, 미국)에 투입하였다. 150mM NaCl 용액으로 칼럼을 세척한 후, 150mM 내지 350mM 농도까지의 NaCl 을 선형 구배 하였을 경우 여러 피크들이 용출되었다(제 4 도 참조). 상기와 같은 조건에서 싸이모신알파와 설포-SIAB 를 반응시키면 설포-SIAB 가 선별적으로 싸이모신 알파의 N-말단의 아미노기에 결합하나, 화학 반응에서 흔히 예상할 수 있는 비선택적 반응이 일어날 수 있다. 또, 설포-SIAB 만 있는 용액을 DEAE-고성능 액체 크로마토그래피 했을 때에도, 순수한 피크만 나오지는 않았다.

DEAE-고성능 액체 크로마토그래피 칼럼에서 용출되는 주 피크들을 참조예 2에서 얻은 부분 산화형 인터페론-알파와 결합시킨 후 비 환원(non-reducing) SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)으로 교차결합된 상태를 측정하였다. 제 5 도에서 표지한 각 열의 번호는 부분 산화형 인터페론-알파와 반응시킨 제 4 도의 피크를 나타낸 것이며, 가장 높은 반응성을 보인 3 번 분획인 설포-SIAB 가 싸이모신-알파에 연결된 SIAB-싸이모신 알파임이 확인되었다.

단계 2) SIAB-싸이모신 알파와 인터페론 알파의 교차 결합을 위한 최적 반응 시간 결정

1 번 및 98 번 다이설파이드 결합을 환원시킨 인터페론-알파에 SIAB-싸이모신 알파를 첨가하고 37℃에서 반응시키면서 10 분 단위로 요오도 아세트아미드를 소량(전체 부피의 10%) 첨가하여 반응을 정지시킨 후 비환원 SDS-PAGE 하여 반응 정도를 확인하였다(제 6도 참조). 제 6도에 나타낸 바와 같이 부분 산화형 인터페론-알파와 SIAB-싸이모신 알파는 섞자마자 반응이 시작되어서 30 분 경과하면 싸이모신 알파 1 개의 펩티드가 인터페론-알파의 시스테인기에 반응하는 것이 종료되며 그 이상의 시간에서는 나머지 하나의 시스테인기에 다른 1 개의 싸이모신 알파가 반응하는 것을 관찰할 수 있었다. 각 열의 표지는 반응 시간을 나타낸 것이다. 싸이모신 알파와 인터페론-알파의 교차결합 후에도 두 싸이토킨의 생리활성을 개별적으로 유지시키기 위해 인터페론-알파의 3 차원적 구조에 최소한의 변화를 일으키는 조건인 싸이모신과 인터페론이 1 대 1 의 몰비로 반응하는 조건을 선택하였다.

단계 3) 인터페론-알파와 싸이모신-알파의 교차 결합

싸이모신 알파의 몰수의 1/4 에 해당되는 인터페론-알파를 2mg/㎖ 의 농도로 완충용액 (10mM 인산화칼륨, 0.15M NaCl, pH 7.2)에 용해시킨 후, DTT 를 0.5mM 의 농도로 넣어준 후 30℃ 의 항온조에서 1OO 분 동안 반응을 시켰다. 여기에 정제한 SIAB-싸이모신-알파(제 4도의 분획 3)를 가하고 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 농축된 요오도 아세트아미드를 소량 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응이 끝난후 용액을 20mM 트리스-염산(pH 7.0)으로 평형화되어 있는 세파덱스 G-25 칼럼에서 크로마토그래피하여 나온 최초의 피크를 역시 20mM 트리스-염산(pH 7.0)으로 평형화되 어 있는 DEAE-고성능 액체 크로마토그래피 칼럼에 투입하였다. 칼럼을 150mM NaCl 용액으로 세척한 후 150mM 내지 450mM NaCl 농도로 선형구배하였다(제 7 도 참조). 칼럼에서 용출된 각 피크들을 비환원 SDS-PAGE 하여 교차결합된 상태를 확인하였다(제 8 도 참조).

이론적으로는 싸이모신 알파와 부분산화형 인터페론 알파의 교차결합 반응에 의하여 4 가지의 반응산물이 얻어질 수 있다. 4 가지 종류란 전혀 반응이 일어나지 않은 인터페론-알파, 인터페론-알파의 1 번, 98 번 시스테인기에 요오도 아세트 아미드가 결합된 상태, 싸이모신 알파의 한 분자가 인터페론 알파에 결합한 상태, 그리고 싸이모신 알파의 두 분자가 하나의 인터페론에 결합한 상태이다.

제 7 도에서 21.30 분(분획 1: 제 8 도의 3 레인)에 칼럼에서 용출된 피크는 싸이모신과 인터페론이 1:1 의 비로 결합한 물질과 요오도 아세트 아미드가 결합한 인터페론의 혼합 성분을 나타낸다. 28.99 분(분획 3: 제 8 도의 2 레인)에 칼럼에서 용출된 피크는 인터페론에 2 개의 싸이모신이 결합한 물질이었음을 확인하였고, 싸이모신-알파와 인터페론이 1:1 의 비율로 결합한 목적하는 융합 단백질은 26.35 분(분획 2: 제 8 도의 1 레인)에 용출됨을 확인하였다.

[항 바이러스 활성 측정]

인터페론의 항 바이러스 측정은 숫송아지 신장세포주(MDBK: ATCC CCL 22)와 수포성 구내염 바이러스(VSV; ATCC VR-158)를 이용하여 세포 병변 효과를 측정함으로써 결정할 수 있다(김순하 및 박순재, 한국 BRM 학회지, 2, 57(1992)참조). 상기 실시예 1에서 얻은 분획 2 및 분획 3 들의 바이러스 생리 활성도는 아래의 표 4 와 같다.

표 4에서 인터페론-알파는 박순재등(대한민국 특허출원 제 92-1155 호)의 방법에 의해 정제된 재조합 인터페론-알파를 사용하였으며, 항 바이러스 역가는 이미 공지된 인터페론의 역가와 차이가 없는 것이었다. 싸이모신 알파는 실험실에서 세포병변효과에 의한 항 바이러스 활성을 나타낸다는 보고가 아직 없었다. 따라서, 표 4 에서 싸이모신 알파의 경우 항 바이러스 활성이 없다는 결과는 이미 예측할 수 있었다.

표 4에서, 1, 98 Cys-인터페론 알파는 1 번과 98 번의 다이설파이드 결합이 끊어진 부분 산화형 인터페론 알파이다.

부분 산화형 인터페론 알파의 항 바이러스 비 역가는 인터페론-알파의 약 70% 에 달하며 본 실험의 결과는 이미 앞에서 서술된 공지의 결과(Wetzel, R., 등, J. Cell. Biochem., Suppl. 6, 89(1982))와도 일치한다.

표 4에서 싸이모신 알파와 인터페론 알파가 1 대 1 의 몰비로 연결된 단백질 (분획 2)의 항 바이러스 활성이 부분산화형 인터페론 알파와 실험 오차내에서 같다는 것은, 싸이모신이 결합을 해도 인터페론 알파의 구조가 거의 유지됨을 시사한다. 또한, 본 실험의 결과로 추정할 때 싸이모신 알파가 결합한 위치는 인터페론 알파가 수용체와 반응하는 위치가 아님을 알 수 있다.

이미 서술한 바와같이 분획 3 은 부분 산화된 인터페론 알파의 1 번 시스테인기와 98 번 시스테인기 각각의 위치에 싸이모신 알파가 결합된 것이다. 분획 3 의 경우 항 바이러스 활성은 분획 2 및 부분산화형 인터페론에 비하여 현저히 감소되는 것을 볼 수 있다. 이 실험결과는 분획 2 에서 싸이모신이 결합한 위치는 1 번 의 시스테인임을 간접적으로 입증한다. 1 번 시스테인이 98 번의 시스테인 보다 화학반응이 훨씬 더 잘 일어난다는 사실은 이미 서술한 바와같고, 98 번 시스테인은 인터페론의 수용체 결합 부위 근처에 존재하기 때문에 싸이모신과 같은 커다란 분자량의 올리고 펩타이드가 결합하면 인터페론 알파의 구조에 미치는 영향은 더 클수 있다.

[효소 면역 측정법]

싸이모신-알파와 인터페론-알파가 융합된 단백질의 경우 인터페론-알파가 세포 배양 상태에서 세포증식억제(cytostatic) 효과를 나타내므로 참조예 1에서 수행한 싸이모신-알파의 활성 측정 방법인 T 세포 증식 효과 측정은 수행하기 어렵다. 따라서, 융합 단백질에서 싸이모신-알파의 활성 측정은 싸이모신-알파의 항체 를 만들어서 융합되지 않은 싸이모신-알파를 표준액으로 하여 융합 단백질의 상대적인 활성을 결정하는 효소 면역 측정법을 사용하였다.

우선, 싸이모신-알파에 대한 항체를 얻기 위해 싸이모신-알파와 우혈청알부민(BSA, Bovine Serum Albumin; Sigcma 사, 미국)을 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride; Pierce 사, 미국)를 사용하여 융합시킨후 애쥬번트(adjuvant)와 1:1 의 비로 섞어 100㎍/㎖ 의 농도로 약 400g 무게의 기니아 피그(guinea pig)에 2 주 간격으로 3 번 주사한 다음 전체 혈청을 얻었으며, 이 항혈청을 이용하여 효소 면역 측정법을 수행하였다.

효소 면역 측정법에서 표준액으로는 싸이모신-알파와 PLL(Poly-L-Lysine)을 융합시킨 것을 사용하였으며, 싸이모신-알파의 농도를 0.24㎍/㎖(80nM) 되게 원액을 만든후 이 표준원액을 2ⁿ(n 은 0 이상의 정수)배로 연속 희석시켜 96 공 플레이 트에 코팅하였다. 융합 단백질 역시 시료 원액을 2ⁿ배로 연속 희석시켜 코팅하였으며, 1:1OO 으로 희석한 싸이모신-알파에 대한 항체와 1:3,000 으로 희석한 기니아 피그의 항체에 대한 항체로 순차적으로 반응시킨 후 기니아 피그의 항체에 대한 항체에 융합되어 있는 HRP(horse radish peroxidase)의 기질인 OPD(1,2-phenylenediamine)로 발색시킨 다음 490nm에서의 흡광도를 측정하였다.

제 9 도에서 보듯이 표준액의 희석 배수(Ds)의 log₂값을 x 축으로 하고, 490nm 에서의 흡광도를 y 축으로 하여 표준 곡선을 얻었으며, 이 표준곡선에 시료의 흡광도를 대입하여 시료원액을 2⁴배 희석한 것의 log₂Ds 값을 1.49, 2⁵배 희석 한 것의 log₂Ds 값을 1.92로 얻었다. 이 값을 표준액의 몰 농도로 환산하면 각각 28.47nM 과 21.16nM 이며, 시료 원액으로 환산한 평균값은 0.567μM 로서 융합 단백질의 분자량 21,000 을 대입하면 이는 11.91㎍/㎖ 이 된다.

이 값은 시료원액을 BCA 법으로 측정한 단백질 농도 10.15㎍/㎖ 과 거의 일치하며, 싸이모신-알파는 융합하기 전이나 융합한 후 동일한 면역학적 활성을 나타냄을 알 수 있다.

따라서, 본 실험 결과에 의하면 싸이모신과 인터페론 알파가 같은 몰 비율로 결합된 신규의 단백질의 경우 인터페론의 3 차원적 구조에 큰 영향을 미치지 않는 한, 인터페론 고유의 생리 활성 및 싸이모신 고유의 생리활성을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.

Claims (5)

1. 싸이모신-알파와 다른 싸이토킨의 시스테인 잔기가 화학적으로 교차 결합된, 싸이모신-알파와 다른 싸이토킨이 각각의 활성을 유지하는 융합 단백질.
2. 제1항에 있어서, 다른 싸이토킨이 인터페론-알파인 융합 단백질.
3. 제2항에 있어서, 인터페론-알파를 부분산화형으로 만들어서 융합시킨 융합 단백질.
4. 제3항에 있어서, 부분산화형은 천연형 인터페론-알파에 0.1~0.2 mM 다이티오트레이톨을 처리하여 20~200 분간 반응시켜 만들어짐을 특징으로하는 융합 단백질.
5. 제2항에 있어서, 싸이모신-알파와 인터페론-알파가 동일 몰비로 결합된 융합 단백질.