CN108283714A - 长效干扰素α缀合物的液体制剂 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及长效干扰素α缀合物的液体制剂。公开的是一种液体制剂，其中具有改善的体内持续时间和稳定性的长效INFα缀合物可长时间稳定储存。所述液体制剂包含稳定剂，所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂。由于不含人血清白蛋白和其他对身体有害的潜在因子，所以所述液体制剂没有病毒感染的问题，并且确保长效INFα缀合物优异的储存稳定性。

Description

长效干扰素α缀合物的液体制剂
本申请是申请日为2011年10月26日、申请号为“201180056378.8”、发明名称为“长效干扰素α缀合物的液体制剂”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/KR2011/008038的中国国家阶段申请。
技术领域
本发明涉及长效干扰素α缀合物的液体制剂，其包含药用有效量的干扰素α缀合物和不含白蛋白的稳定剂，所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂。
背景技术
在1957年，Isaacs和Lindenmann注意到当小鸡感染甲型流感病毒时干扰所述病毒的因子，发现了干扰素(Isaacs，K.和Lindenmann，J.，Proc.R.Soc.Lond.，B147，258-267(1957))。人干扰素是被称为细胞因子的蛋白质，其允许细胞之间的通讯从而可引发消灭病原体(如病毒)之免疫系统的保护性防御。根据释放所述干扰素的细胞类型，干扰素可被分类为干扰素α、干扰素β和干扰素γ(Kirchner，H.等，Tex.Rep.Biol.Med.，41，89-93(1981)：Stanton，G.J.等，Tex.Rep.Biol.Med.，41，84-88(1981))。即，干扰素α由B淋巴细胞释放，干扰素β由裸淋巴细胞(null lymphocyte)和巨噬细胞释放，而干扰素γ由T淋巴细胞在巨噬细胞帮助下释放。
报道称干扰素表现出抗病毒活性、抗癌活性、激活NK(自然杀伤)细胞和对髓细胞生长的协同抑制作用(Klimpel等，J.Immunol.，129，76-78(1982)；Fleischmann，W.R.等，J.Natl.Cancer Inst.，65，863-966(1980)；Weigent.等，Infec.Immun.，40，35-38(1980))。从那时起，大量研究发现除表现出抗病毒作用之外，干扰素还在细胞内基因的表达、结构和功能中充当调节因子，尤其是直接的抗增殖作用。此外，干扰素的一个功能是对抗由感染和多种肿瘤引起的多种疾病。
在暴露于分裂素、病毒或肿瘤细胞之后白细胞中产生干扰素α。迄今为止，已发现干扰素α的至少20种基因的多基因家族并且已知其编码大多数由165或166个氨基酸组成的多肽。
临床测试已证明重组人干扰素α在治疗多种实体瘤方面有效。特别地，已知干扰素α对膀胱癌、肾癌和AIDS相关卡波西式肉瘤(AIDS-associated kaposi's sarcoma)具有有效的治疗作用(Torti，F.M.，J.Clin.Oncol.，6，476-483(1988)；Vugrin，D.等，CancerTreat.Rep.，69，817-820(1985)；Rios，A.等，J.Clin.Oncol.，3，506-512(1985))。此外，最近的报道提到，干扰素α在治疗上适用于治疗丙型肝炎(Davis，G.G.等，N.Engl.J.Med.，321，1501-1506(1989))。基于这些新发现，干扰素α的治疗领域变得更广。
多肽(例如干扰素α)因其低稳定性而倾向于容易变性、被血液中的蛋白水解酶降解并且易于通过肾或肝。因此，需要频繁地向患者施用蛋白质药物(包含作为药物有效组分的多肽)以维持期望的血液水平浓度和效价。但是，蛋这种白质药物的频繁施用(大多数为注射形式)造成患者疼痛。
为了解决这些问题，进行了许多努力来改善蛋白质药物的血清稳定性并使血液中的药物在较长的时间内维持在高水平，从而使药物的药效最大化。为了在长效制剂中使用，必须将蛋白质药物配制成高稳定性的并且其效价维持在足够高的水平而不引起患者免疫应答。
稳定蛋白质并预防酶促降解和通过肾脏清除的常规方法是用具有高溶解度的聚合物(例如聚乙二醇(PEG))来对蛋白质药物表面进行化学修饰。通过与靶蛋白的特定区域或多个区域结合，PEG使蛋白质稳定并防止水解，而不引起严重的副作用(Sada等，J.Fermentation Bioengineering 71：137-139)。但是，尽管聚乙二醇化能够提高蛋白质稳定性，但其也存在问题，例如大大降低生理活性蛋白质的效价。此外，产量随着PEG的分子量的增加而降低，这是由于蛋白质的反应性降低。
用于改善生理活性蛋白质体内稳定性的另一种替代性策略是借助遗传重组技术将生理活性蛋白质的基因与编码具有高血清稳定性之蛋白质的基因连接起来，并且培养经重组基因转染的细胞以产生融合蛋白。例如，融合蛋白可这样制备：通过遗传重组将白蛋白(已知的在增强蛋白质稳定性方面最有效的蛋白质)或其片段与目的生理活性蛋白质缀合(PCT公开No.WO 93/15199和WO 93/15200、欧洲专利公开No.413,622)。
另一种方法是使用如美国专利No.5,045,312所述的免疫球蛋白，其中通过使用交联剂将人生长激素与牛血清白蛋白或鼠免疫球蛋白缀合。所述缀合物与未修饰的生长激素相比具有增强的活性。采用碳二亚胺或戊二醛作为交联剂。但是，与肽非特异性键合的这种低分子量交联剂不允许形成均一的缀合物，并且甚至在体内是有毒的。此外，该专利表明活性提高仅仅是由于与生长激素的化学偶联而发生。该专利的方法不能确保多种类型的多肽药物的活性增强，因此该专利甚至没有认识到与蛋白质稳定性相关的因素，例如持续时间、血液半衰期等。
由此，需要具有改善的体内持续时间和稳定性的长效蛋白质药物制剂。为了在长效药物制剂中使用，最近韩国专利No.10-0567902(Physiologically active polypeptideconjugate having improved in vivo durability)和10-0725315(Protein complexusing an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof)中提出了其中将生理活性多肽与非多肽聚合物和免疫球蛋白Fc区域共价连接的蛋白质缀合物。
为了将长效干扰素α缀合物应用于药物产品，必须维持其在体内的药效，同时抑制在储存和运输期间的物理化学变化，例如光、热或添加剂引起的变性、聚集、吸附或水解。与干扰素α多肽自身相比，长效干扰素α缀合物由于其体积和分子量增加更难以稳定化。
一般来说，蛋白质具有非常短的半衰期，并且当暴露于不合适的温度、水-空气界面、高压、物理/机械应力、有机溶剂、微生物污染等时，其发生变性，如单体聚集、聚集沉淀以及吸附到容器表面上。在变性后，蛋白质失去其固有的物理化学特性和生理活性。一旦变性，蛋白质几乎不能恢复其原有特性，因为变性是不可逆的。特别在蛋白质(例如干扰素α)以小至几百微克/注射的剂量施用的情况下，当它们丧失稳定性并因此吸附到容器表面上时，产生的损失相对较大。此外，在变性过程中吸附的蛋白质容易聚集，并且变性蛋白质的聚集体在施用到体内时，其充当抗原(与体内合成的蛋白质不同)。因此，蛋白质必须以足够稳定的形式施用。
已研究了许多方法以防止蛋白质在溶液中变性(John Geigert，J.ParenteralSci.Tech.，43(5)：220-224，1989；David Wong，Pharm.Tech.，October，34-48，1997；WeiWang.，Int.J.Pharm.，185：129-188，1999；Willem Norde，Adv.Colloid Interface Sci.，25：267-340，1986；Michelle et.al.，Int.J.Pharm.120：179-188，1995)。
为了实现稳定性的目标，使一些蛋白质药物经历冻干。但是，冻干产品不方便，因为它们必须重新溶解于注射用水中使用。此外，因为其生产过程包括冻干，所以需要在大容量冻干机中进行巨大投资。还有人提出通过使用喷雾干燥剂使蛋白质收缩(contraction)。但是，该方法由于产量低而并不经济有利。此外，喷雾干燥过程将蛋白质暴露于高温，因此对蛋白质稳定性具有负面影响。
作为克服该限制的替代方案，出现了稳定剂，当将其添加到蛋白质的溶液中时，可抑制蛋白质药物的物理化学变化并且维持体内药效，甚至在长时间储存之后也是如此。稳定剂有碳水化合物、氨基酸、蛋白质、表面活性剂、聚合物和盐。尤其是人血清白蛋白已被广泛用于稳定多种蛋白质药物，并且其在该方面的性能已得到证实(Edward Tarelli等，Biologicals，26：331-346)。
人血清白蛋白的典型纯化过程包括使生物污染物(如支原体、朊病毒(prion)、细菌和病毒)失活，或者筛选或检查一种或更多种生物污染物或病原体的存在。但是，总存在因生物污染物未完全除去或失活而使患者处于与其接触的风险。例如，筛选来自供体的人血液以检查它是否包含某些病毒。但是，该过程不总是可靠的。特别地，以非常小的数目存在的某些病毒不能被检测到。
此外，不同蛋白质由于其化学差异可逐渐失活，因为它们在储存期间经历不同的比率和条件。稳定剂对蛋白质储存期的作用因蛋白质而异。即，根据目的蛋白质的物理化学特性，不同稳定剂可以以不同比率使用。当同时使用时，不同稳定剂因其竞争和错误操作可引起相反作用。不同稳定剂组合也引发不同的作用，因为它们在储存期间引起蛋白质特征或浓度改变。因为每种稳定剂稳定活性的适用性与给定的浓度范围相关，所以在组合不同种类和浓度的不同稳定剂时必须注意。
特别地，对于具有改善的体内持续时间和稳定性的长效干扰素α缀合物来说，因为它们由生理活性肽干扰素α、非肽聚合物和免疫球蛋白片段Fc构成，所以其分子量和体积与普通干扰素α的相当不同。而且，因为生理活性肽干扰素α和免疫球蛋白片段Fc二者都是肽或蛋白质，所以它们必须同时稳定。
如上所述，不同蛋白质由于其化学差异可逐渐失活，因为它们在储存期间经历不同的比率和条件。此外，分别适用于肽或蛋白质的不同稳定剂在同时使用时，由于其竞争和错误操作可导致不良作用，而不是期望的作用。
因此，难以建立被设计成同时稳定干扰素α和免疫球蛋白Fc区域的用于长效干扰素α缀合物的稳定剂组合物。
发明内容
技术问题
在本发明之前，对开发能够长时间维持药效并且没有病毒感染的用于长效干扰素α缀合物的稳定液体制剂进行的集中和彻底研究产生了这样的发现：包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂的不含白蛋白的稳定剂赋予长效干扰素α缀合物增强的稳定性。
问题的解决方案
因此，本发明的一个目的是提供一种包含药用有效量的长效干扰素α缀合物和不含白蛋白的稳定剂的液体制剂，其中所述长效干扰素α缀合物中干扰素α与免疫球蛋白Fc区域共价连接，并且所述稳定剂由缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂构成。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备长效干扰素α缀合物的液体制剂的方法，其包括a)构建长效干扰素α缀合物；以及b)将步骤a)的长效干扰素α缀合物与不含白蛋白的稳定剂混合，所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂。
本发明的又一个目的是提供用于干扰素α与免疫球蛋白Fc区域缀合之长效干扰素α缀合物的稳定剂，其中所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂并且不含白蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种用于通过稳定剂稳定长效干扰素α缀合物的方法，其中所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂并且不合白蛋白，并且所述长效干扰素α缀合物具有与免疫球蛋白Fc区域共价连接的干扰素α。
发明的有利效果
因为不含人血清白蛋白和其他对身体有害的潜在因子，所以根据本发明的长效干扰素α缀合物的液体制剂没有病毒感染的问题。另外，所述液体制剂确保长效干扰素α缀合物优异的储存稳定性，其中干扰素α与免疫球蛋白Fc区域连接，并且与干扰素α的天然形式相比，其分子量更大且作用持续时间更长，因此比其他稳定剂在经济上更有利。
附图说明
图1是在4℃下储存6个月时间中使用RH-HPLC进行分析时，实施例6中建立的液体制剂(pH 5.5)中长效干扰素α缀合物稳定性的图。
具体实施方式
根据其一方面，本发明提供了包含药用有效量的长效干扰素α缀合物和不含白蛋白的稳定剂的液体制剂，其中所述长效干扰素α缀合物中干扰素α与免疫球蛋白Fc区域共价连接，并且所述稳定剂由缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂构成。
根据其另一方面，本发明提供了用于干扰素α与免疫球蛋白Fc区域缀合之长效干扰素α缀合物的稳定剂，其中所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂并且不含白蛋白。
根据其又一方面，本发明提供了一种用于通过稳定剂稳定长效干扰素α缀合物的方法，其中所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂并且不含白蛋白，并且所述长效干扰素α缀合物的干扰素α与免疫球蛋白Fc区域共价连接。
本文使用的术语“长效干扰素α缀合物旨在指蛋白质构建体，其包含生理活性寡肽(例如干扰素α(IFNα))、两端具有官能团的至少一种非肽聚合物和至少一种免疫球蛋白Fc区域，其中所述成分通过共价键共价连接在一起。
因此，本文所用术语“长效”指与天然形式的干扰素α相比延长的作用持续时间。术语“缀合物”指其中干扰素α通过非肽聚合物与免疫球蛋白Fc区域共价连接的构建体。
长效干扰素α缀合物是改进的蛋白质药物，其被设计成使固有生理活性的丧失最小化并且使体内持续时间最大提高。为了用于本发明，将干扰素α与免疫球蛋白Fc区域结合起来。
用于本发明的干扰素α可优选是人干扰素α。另外，所述干扰素α可以是天然INFα、天然INFα的衍生物或活性与天然INFα类似的多肽。即，本发明的干扰素α可包含野生型干扰素α氨基酸序列或其氨基酸序列突变体。本文使用的术语“氨基酸序列突变体”指由一个或更多个氨基酸残基的缺失、插入、保守或非保守性替换或其组合引起的与野生型不同的氨基酸序列。
所述干扰素α可以是来自人或动物的天然干扰素α，或者可以是来自转化细胞的重组干扰素α。优选是使用经转化的大肠杆菌制备的重组人干扰素α(HuIFNα)。除非其生物学活性显著偏离野生型的活性，否则通过氨基酸替换、缺失或插入形成的突变体也包括于干扰素α的范围内。
本文使用的术语“免疫球蛋白Fc区域”指缺少轻链和重链之可变区(重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1))的免疫球蛋白片段，即由重链的恒定区2和3(CH2和CH3)构成的片段。任选地，所述免疫球蛋白Fc区域可还包含铰链区。此外，本发明的免疫球蛋白Fc区域可以是延伸的Fc区域，其包含除重链恒定区2和3(CH2和CH3)之外的一部分或完整的重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，只要它显示出与典型Fc区域的作用基本上相同或比其优越的作用。此外，本发明的免疫球蛋白Fc区域可由缺少氨基酸序列之重要部分的CH2和/或CH3构成。
因此，本发明的免疫球蛋白Fc区域可由以下构成：1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，5)一种或更多种恒定结构域与免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合，或6)各个重链恒定区和轻链恒定区的二聚体。
此外，野生型Fc的氨基酸序列突变体可包括在本发明免疫球蛋白Fc区域的范围内。本文使用的术语“氨基酸序列突变体”指由一个或更多个氨基酸残基缺失、插入、保守或非保守性替换或其组合产生的与野生型不同的氨基酸序列。例如，IgG Fc第214至238、297至299、318至322或327至331位的氨基酸残基(已知对于连接是重要的)可用作适用于修饰的位点。
本发明可使用多种衍生物，例如通过除去二硫键位点、从天然Fc中除去几个N端氨基酸、或将甲硫氨酸添加到天然Fc N端制备的那些。此外，可消除补体结合位点(complement fixation site)(例如C1q结合位点)或ADCC位点以从天然Fc区域中除去效应功能。国际专利公开No.WO 97/34631和WO 96/32478中公开了制备免疫球蛋白Fc区域的氨基酸序列突变体的技术。
蛋白质或肽分子中不改变所述分子活性的氨基酸取代为本领域所公知(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最常见的取代发生在氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly之间。任选地，可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化和酰胺化修饰氨基酸。
上述Fc衍生物表现出与野生型生物学活性相同的生物学活性，但是其对热和pH的结构稳定性提高。
用于本发明的免疫球蛋白Fc区域可被糖基化为与天然形式相同的程度或比其更高或更少的程度，或者可以被去糖基化或无糖基化(aglycosylated)。可通过典型方法(例如通过使用化学方法、酶促方法或遗传工程方法)实现免疫球蛋白区域糖基化或去糖基化的提高或降低。本文中，在去糖基化时，免疫球蛋白Fc区域的补体(C1q)结合力显著降低并且具有降低的或没有抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性，因此它在体内不诱导不必要的免疫应答。在本上下文中，免疫球蛋白Fc区域的去糖基化或无糖基化更符合药物载体的目的。
本文使用的术语“去糖基化”旨在意指将糖从Fc区域中酶促除去。当术语“无糖基化”与Fc区域连起来使用时意指由原核生物(优选大肠杆菌)表达的不含糖的Fc区域。
为了在本发明中使用，免疫球蛋白Fc区域具有人免疫球蛋白Fc区域或其密切相关的类似物的氨基酸序列。Fc片段可以从分离自动物(包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠)的天然形式中得到。此外，免疫球蛋白Fc区域可以是来自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM或者由其组合或其杂合体制得的Fc区域。优选地，它来自在人血中最丰富的蛋白质IgG或IgM，并且最优选地来自已知增强配体结合蛋白的血清半衰期的IgG。本文中，免疫球蛋白Fc可以通过分离人或动物有机体的完整免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理它们而从天然免疫球蛋白中得到，或者，它可以是得自其经转化的动物细胞或微生物的重组体或衍生物。优选的是由大肠杆菌转化体生产的重组人免疫球蛋白Fc。
本文使用的术语“组合”意指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区域的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可由选自IgG Fc、IgAFc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的两种或更多种片段形成。
本文使用的术语“杂合体”意指编码不同来源的两种或更多种免疫球蛋白Fc区域的序列存在于单链免疫球蛋白Fc区域中。在本发明中，多种杂合体是可能的。即，结构域杂合体可由选自以下的一个至四个结构域构成：CH1、CH2、IgG Fc的CH3和CH4、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc，，并且可包含铰链区。
另一方面，IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型，并且本发明包括其组合和杂合体。优选的是IgG2和IgG4亚型，最优选的是很少具有效应功能(如CDC(补体依赖性细胞毒性))的IgG4Fc区域。作为本发明的药物载体，最优选的免疫球蛋白Fc区域是人IgG4来源的无糖基化Fc区域。
来源于人的Fc区域比非人来源Fc区域更优选，后者可在人体中充当抗原并引起不期望的免疫应答，如产生针对抗原的新抗体。
通过将干扰素α与免疫球蛋白Fc区域连接在一起来制备用于本发明的长效干扰素α缀合物。对此，干扰素α和免疫球蛋白Fc区域可通过非肽聚合物交联，或者可以使用重组技术形成融合蛋白。
如韩国专利No.10-0725315所公开的，可使用遗传重组技术制备用于本发明的长效干扰素α缀合物。
用于交联的非肽聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylated polyols)、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖(dextran)、聚乙烯基乙醚(polyvinyl ethyl ether)、可生物降解聚合物(如PLA(聚乳酸)、PLGA(聚乳酸-乙醇酸))、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸及其组合。最优选聚乙二醇。本领域公知的并且能够易于由本技术领域技术人员制备的其衍生物也包括于本发明的范围中。
根据本发明的长效干扰素α缀合物的液体制剂包含可药物接受量的长效干扰素α缀合物。
本文使用的术语“药用有效量”旨在指以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比来治疗疾病的药物组合物的足够量。有效量可根据多种因素而改变，所述因素包括治疗疾病的严重程度和类型、患者年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径、排泄速率、治疗期长度、与其他药物的共同施用以及医学和药物领域公知的其他参数。通常，干扰素α的药用有效量范围为每个一次性瓶30至200μg。用于本发明的长效干扰素α缀合物的浓度为约0.1至50μg/ml，优选约0.1至5.0μg/ml。
特别地，具有改善的体内持续时间和稳定性的长效干扰素α缀合物之分子量和体积与一般干扰素α的相当不同，因为它们由干扰素α和免疫球蛋白Fc区域构成。另外，因为生理活性肽干扰素α和免疫球蛋白Fc区域二者都是肽或蛋白质，所以它们必须被同时稳定。
为了满足该要求，根据本发明提供了稳定剂。本文使用的术语“稳定剂”旨在指允许长效干扰素α缀合物安全储存的物质。术语“稳定”旨在意指在储存条件下某时间段内活性成分的损失不高于预定的比例(通常最高10％)。当在5±3℃下储存2年、在25±2℃下6个月或在40±2℃下一至两周之后，长效干扰素α缀合物保留其原有活性的90％或更多(优选其原有活性的95％或更高)时，应理解为是稳定的。
对于例如长效干扰素α缀合物的蛋白质而言，其储存稳定性对于抑制干扰素α样抗原性物质的可能生成以及确保准确施用量是重要的。在储存期间，除非制剂中的长效干扰素α缀合物聚集或破裂并形成抗原性物质，否则可将约10％的干扰素α活性损失理解为是施用所允许的。
适用于赋予长效干扰素α缀合物稳定性的稳定剂包含缓冲剂、糖醇、等张剂和非离子型表面活性剂，并且任选地还包含甲硫氨酸。
稳定剂中的缓冲剂在使液体制剂的pH维持恒定中发挥作用以防止pH波动，从而稳定长效干扰素α缀合物。用于本发明的缓冲剂可包括可药物接受的pH缓冲剂，包括碱性盐(磷酸钠或磷酸钾、其氢盐或二氢盐)、柠檬酸钠/柠檬酸、乙酸钠/乙酸及其组合。
参照实施例部分，长效干扰素α缀合物的稳定性根据缓冲剂的pH值而改变。在柠檬酸盐缓冲剂，pH 5.5下检测到长效干扰素α缀合物的最高稳定性(实施例2)。
适用于本发明的是磷酸盐缓冲剂或柠檬酸缓冲剂，后者更优选。
柠檬酸盐缓冲剂中磷酸盐的浓度范围优选为5至100mM，并且更优选10至50mM。
缓冲剂优选pH为4.0至7.0，更优选pH为5.0至7.0，更更优选pH为5.2至7.0并且最优选pH为5.2至6.0。
糖醇是碳水化合物的衍生形式，其羰基(＝CO)被还原为羟基(-OH)。在本发明中，糖醇有助于长效干扰素α缀合物的稳定性。
在液体制剂中，糖醇优选以1至10％(w/v)的浓度，并且更优选以5％(w/v)的浓度使用。
糖醇可选自赤藓糖醇、半乳糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、核糖醇、麦芽糖醇、山梨糖醇、乳糖醇和甘露醇，优选甘露醇、山梨糖醇或其组合。
参照实施例部分，发现甘露醇在普通缓冲溶液条件下最高度地有助于长效干扰素α缀合物的稳定性(实施例1)。
等张剂不仅起到当液体制剂中的长效干扰素α缀合物进入体内时维持合适渗透压的作用，还起到进一步稳定液体制剂中长效干扰素α缀合物的作用。等张剂的实例包括水溶性无机盐。其中最优选的代表是氯化钠。
根据本发明的一个实施方案，将氯化钠用作等张剂提高了缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂存在下长效干扰素α缀合物的稳定性。由这些数据可理解，氯化钠作为等张剂与糖醇和非离子型表面活性剂一起对长效干扰素α缀合物的稳定性具有协同作用。
优选地，等张剂的浓度为约5至200mM，并且更优选约150mM。在该范围内，可根据组分的种类和量来调整等张剂的浓度，使得液体制剂是等张的。
现转到非离子型表面活性剂，其降低蛋白质溶液的表面张力以防止蛋白质被吸附到或聚集于疏水表面上。聚山梨酯(polysorbate)的非离子型表面活性剂和泊洛沙姆(poloxamer)的非离子型表面活性剂优选地适合用于本发明。它们可以单独或组合使用。更优选聚山梨酯的非离子型表面活性剂。其中有聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80，更优选聚山梨酯80。
参照实施例部分，观察到包含聚山梨酯80的长效干扰素α缀合物之液体制剂与包含泊洛沙姆188之液体制剂的稳定性相似或比其优越。此外，检测到包含0.02％聚山梨酯80的液体制剂比包含0.005％聚山梨酯80的液体制剂稳定性更高(实施例3)。
不建议使用高浓度的非离子型表面活性剂，因为如果非离子型表面活性剂以高浓度存在，则会干扰蛋白质测定，例如UV光谱法或等电聚焦法，使得难以准确评估蛋白质的浓度或稳定性。
因此，本发明的液体制剂可包含优选浓度为0.1％(w/v)或更低，更优选浓度为0.001至0.05％(w/v)并且最优选浓度为0.02％(w/v)的非离子型表面活性剂。
本发明的稳定剂还可包含甲硫氨酸。防止归因于溶液中蛋白质氧化产生的杂质，甲硫氨酸可进一步稳定目的蛋白质。甲硫氨酸可优选以基于制剂总体积的0.05％至0.1％(w/v)的浓度，更优选0.01％至0.1％(w/v)的浓度使用。
参照实施例部分，发现制剂中氧化的长效干扰素α缀合物的含量在甲硫氨酸不存在下随时间升高，但是在0.01％甲硫氨酸存在下保持相对恒定，表明包含甲硫氨酸的液体制剂可进一步稳定长效干扰素α缀合物(实施例5)。
此外，根据本发明的稳定剂优选不合白蛋白。因为从人血中制备，所以可作为蛋白质稳定剂的人血清白蛋白有被人来源的致病性病毒污染的可能性。明胶或牛血清白蛋白可在一些患者中引起疾病或引起变应反应。由于不含人来源或动物来源的血清白蛋白或异源蛋白质(如纯化明胶)，因此本发明的稳定剂没有病毒感染的问题。
此外，本发明的稳定剂可还包含糖或多元醇。还可以包含的提高长效干扰素α缀合物储存稳定性之糖的优选实例包括单糖(如甘露糖、葡萄糖、果糖和木糖)和多糖(如乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖和葡聚糖)。用于本发明的多元醇的实例包括丙二醇、低分子量的聚乙二醇、甘油和低分子量的聚丙二醇。它们可以单独或组合使用。
除了上述组分(包括缓冲剂、等张剂、糖醇、非离子型表面活性剂和甲硫氨酸)之外，本发明的液体制剂还可选择性地包含本领域已知的其他组分，只要它们不恶化本发明的作用。
根据其另一方面，本发明提供了一种用于制备长效干扰素α缀合物的液体制剂的方法，其包括a)构建长效干扰素α缀合物；和b)将步骤a)的长效干扰素α缀合物与稳定剂混合，所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂。
构建长效干扰素α缀合物的以上步骤a)可通过使干扰素α与免疫球蛋白Fc区域经由非肽聚合物交联或使干扰素α与免疫球蛋白Fc区域借助重组技术融合来进行。
干扰素α与免疫球蛋白Fc区域经由非肽聚合物的交联包括使在每个末端具有官能团的非肽聚合物与干扰素α和免疫球蛋白Fc区域反应以产生缀合物，所述缀合物中所述非肽聚合物在一端与干扰素α共价连接并且在另一端与免疫球蛋白Fc区域共价连接；以及分离所述缀合物。
三种组分之间的共价键可先后或同时形成。例如，当干扰素α和免疫球蛋白Fc区域分别与非肽聚合物的两端连接时，干扰素α或免疫球蛋白Fc区域可首先与非肽聚合物结合，然后剩余部分与聚合物结合。共价键的先后形成对于产生副产物数目最小的目标缀合物是有利的。
将步骤a)中构建的长效干扰素α缀合物与稳定剂混合以提供本发明的长效干扰素α缀合物的液体制剂，所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂。
优选地，稳定剂采用氯化钠作为等张剂，并且可还包含由甲硫氨酸、糖、多元醇及其组合组成的组分。
发明实施方案
通过以下实施例可更好地理解本发明，列出以下实施例以举例说明本发明，但不应理解为限制本发明。
[制备实施例1]制备长效干扰素α缀合物
<1-1>使用免疫球蛋白制备免疫球蛋白Fc区域
为了得到免疫球蛋白Fc区域，在37℃下用2mg木瓜蛋白酶(Sigma)将200mg 150kDa免疫球蛋白G(IgG，GreenCross，韩国)的10mM磷酸盐缓冲剂溶液处理2小时并缓慢搅拌。酶促反应之后，使用Superdex柱、蛋白A柱和阳离子交换柱的柱色谱分离由此形成的免疫球蛋白Fc区域。详细地，将反应逐滴加载到用10mM PBS(pH 7.3)平衡的Superdex200柱(Pharmacia)上，然后用相同缓冲剂以1mL/min的流速洗脱。未反应的免疫球蛋白(IgG)和F(ab')2在免疫球蛋白Fc区域之前被洗脱，从而可被除去，原因是其二者的分子量大于免疫球蛋白Fc区域。分子量与免疫球蛋白Fc区域类似的Fab使用蛋白A柱色谱过滤掉。在本上下文中，从Superdex 200柱中洗脱的免疫球蛋白Fc区域级分以5mL/min的流速加载到用20mMPBS(pH 7.0)平衡的蛋白A柱(Pharmacia)上，然后用足够量的相同缓冲剂清洗以除去未结合的蛋白质。使100mM柠檬酸钠(pH 3.0)缓冲剂流经该柱以洗脱纯的免疫球蛋白Fc区域。最终，在阳离子交换柱(polyCAT，PolyLC)上使用线性梯度(NaCl 0.15M→0.4M)的10mM乙酸盐缓冲剂(pH 4.5)进一步纯化从蛋白A柱上洗脱的该Fc级分。
<1-2>制备IFNα-PEG复合物
将ALD-PEG-ALD(Shearwater)(在其两端具有醛反应基的3.4-kDa聚乙二醇)与5mg/mL人干扰素α-2b(hIFNα-2b，Mw 20kDa)的100mM磷酸盐缓冲剂溶液以1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10或1∶20的IFNα∶PEG摩尔比混合。向该混合物中添加还原剂氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)至终浓度为20mM，并温和搅拌使其在4℃下反应3小时。为了得到其中PEG与IFNα氨基端选择性连接的1：1 IFNα-PEG复合物，使用柱(Pharmacia)使反应混合物经过尺寸排阻色谱。使用10mM磷酸钾缓冲剂(pH 0.6)作为洗脱液使IFNα-PEG复合物从柱中洗脱，同时除去未与PEG连接的IFNα，未反应的PEG和其中PEG与两个IFNα分子连接的二聚体副产物。将纯化的IFNα-PEG复合物浓缩至5mg/ml。表现出最有效反应性并且产生最少副产物(例如二聚体)的IFNα∶PEG的最佳反应摩尔比鉴定为1∶2.5至1∶5。
<1-3>构建IFNα-PEG-Fc缀合物
使<1-2>中制备的IFNα-PEG复合物与免疫球蛋白Fc区域的N端连接。对此，将<1-1>中制备的免疫球蛋白Fc区域(约53kDa)溶解于10mM磷酸盐缓冲剂中并与IFNα-PEG复合物以1∶1、1∶2、1∶4或1∶8的IFNα-PEG复合物∶Fc摩尔比混合。在将反应溶液的磷酸盐缓冲液浓度调节至100mM之后，将还原剂NaCNBH3添加至反应溶液中至终浓度为20mM并通过温和搅拌使其在4℃下反应20小时。表现出最有效反应性并且产生最少副产物(例如二聚体)的IFNα-PEG复合物∶Fc的最佳反应摩尔比鉴定为1∶2。
<1-4>分离并纯化IFNα-PEG-Fc缀合物
在<1-3>的偶联反应之后，进行Superdex尺寸排阻色谱以从反应混合物中除去未反应的物质和副产物，从而纯化IFNα-PEG-Fc缀合物。浓缩反应混合物并使其与10mM PBS(pH 7.3)一起以2.5mL/min的流速经过柱以除去未结合的Fc和未反应物质，从而洗脱IFNα-PEG-Fc缀合物级分。因为少量杂质(包括未反应的Fc和IFNα二聚体)还共存于IFNα-PEG-Fc缀合物级分中，进一步进行阳离子交换色谱以除去它们。将IFNα-PEG-Fc缀合物级分加载到用10mM乙酸钠(pH 4.5)平衡的PolyCAT LP柱(PolyLC)上，然后用包含1M NaCl的10mM乙酸钠缓冲剂(pH 4.5)以线性梯度(NaCl 0M→0.5M)方式洗脱。随后，使用阴离子交换色谱以得到纯的IFNα-PEG-Fc缀合物。
使用PolyWAX LP柱(PolyLC)进一步纯化该缀合物。将级分加载到用10mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡的柱上，并用包含1M NaCl的10mM Tris-HCl(pH 7.5)以线性梯度(NaCl0M→0.3M)方式洗脱，从而产生高纯度的IFNα-PEG-Fc缀合物。
[实施例1]：测定根据不同稳定剂的长效干扰素α缀合物的稳定性
在磷酸盐缓冲剂存在下，测定包括糖、糖醇和氨基酸在内的不同稳定剂稳定长效IFNα缀合物的能力。
对于该测定，使用柠檬酸盐(柠檬酸钠)溶液(pH 5.5)作为缓冲剂，使用甘露醇作为糖醇，使用组氨酸或甲硫氨酸作为氨基酸，使用蔗糖作为糖。
将表1所列组合物在40℃下储存一周后，进行RH-HPLC和SE-HPLC分析。结果归纳在下表2中。在表2中，RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)柱示出长效IFNα缀合物相比于其初始值的保留率，其表示为面积％(/初始面积％)。
表1
[表1]
表2
[表2]
从表2的数据明显看出，使用甘露醇作为稳定剂使长效IFNα缀合物最稳定。
[实施例2]测定根据稳定剂pH的长效IFNα缀合物的稳定性
在不同pH值的缓冲剂中测量长效IFNα缀合物的稳定性。
在将用作缓冲剂的表3组合物在40℃下储存两周后，用反相色谱法进行分析。对于RP-HPLC和SE-HPLC测定，分别使用甘露醇和聚山梨酯80分别作为稳定剂和表面活性剂。结果归纳在下表4中。长效IFNα缀合物相比于其初始值的保留率在RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)柱中表示为面积％(/初始面积％)。
表3
[表3]
表4
[表4]
由表3和表4可以看出，在储存一周后在pH 5.2下形成沉淀，并且与pH 6.0相比，长效干扰素α缀合物的稳定性在pH 5.5的柠檬酸盐缓冲剂中增强。
由数据可推断出，本发明的长效干扰素α缀合物根据所使用缓冲剂的pH值被不同程度地稳定并且在某些pH值下表现出更高的稳定性。
[实施例3]：测定根据非离子型表面活性剂的长效干扰素α缀合物的稳定性
在柠檬酸盐缓冲剂存在下，如下测定了不同非离子型表面活性剂稳定长效IFNα缀合物的能力。
对于该测定，将聚山梨酯80和泊洛沙姆188用作表面活性剂，并且以适当组合使用实施例1中表现出提供长效IFNα缀合物稳定性的其他试剂，包括甘露醇。
在将IFNα设定为在20mM柠檬酸钠缓冲剂(pH 5.5)中360μg/ml的相同稳定剂条件下，将本发明的长效IFNα缀合物在表5所列组合物中于25±2℃下储存四周，然后通过RP-HPLC和SE-HPLC分析。结果归纳在下表5中。长效IFNα缀合物相比于其初始值的保留率在RH-HPLC(％)和SE-HPLC(％)柱中表示为面积％(/初始面积％)。
表5
[表5]
表6
[表6]
在表5和表6中，如通过SE-HPLC所测量的，不考虑表面活性剂的类型和浓度，长效干扰素α缀合物的稳定性仅有有小幅波动，但是发现如通过RP-HPL所C测量的，长效干扰素α缀合物在聚山梨酯80中与在泊洛沙姆188中的稳定性相同或比其更高。另外，长效干扰素α缀合物在补加0.02％聚山梨酯80的液体制剂中比在补加0.005％聚山梨酯80的液体制剂中更稳定。
[实施例4]：比较本发明液体制剂与可商购制剂之间长效IFNα缀合物的储存稳定性
为了确定其稳定性，对均已在实施例1至3的稳定性测定中证明的包含柠檬酸盐缓冲剂(pH 5.5)、NaCl、甘露醇和聚山梨酯80的长效干扰素α缀合物之液体制剂与可商购干扰素α液体制剂(INF α2a，)进行了比较。
如下表7所示，制备了长效干扰素α缀合物的液体制剂(液体制剂#1)，并且将长效干扰素α缀合物应用于市售药物(INF α2a，)以制备液体制剂(液体制剂#2)。将它们在25±2℃下储存两周，然后进行RP-HPLC分析。在表8中，长效干扰素α缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC(％)。
表7
[表7]
表8
[表8]
由表8的数据可以看出，与可商购液体干扰素α制剂(IFN α2a，)相比，根据本发明的液体制剂可确保长效干扰素α缀合物的更高稳定性。
[实施例5]：测定长效干扰素α缀合物的补加甲硫氨酸的液体制剂的稳定性
为了检查其加速稳定性，将均已在之前实施例中证明确保最佳储存稳定性的由除柠檬酸盐缓冲剂(pH 5.5)、氯化钠、甘露醇和聚山梨酯80之外还包含甲硫氨酸的稳定剂制备的液体制剂在25±2℃下储存4周，期间分析长效干扰素α缀合物的稳定性。
如下表9所示制备了长效干扰素α缀合物的的液体制剂并分析稳定性。在表10和11中，RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)代表在每个时间点上长效干扰素α缀合物和杂质的含量。加速稳定性测定(25±2℃)的RP-HPLC和SE-HPLC结果分别归纳在表10和11中，其中杂质#6是氧化的长效干扰素α缀合物。长效干扰素α缀合物的氧化形式与非氧化形式之间的分子量仅有很小的差异。因此，SE-HPLC(利用待分析样品分子量的方法)不能用于分离氧化的长效干扰素α缀合物。
表9
[表9]
表10
[表10]
表11
[表11]
由加速稳定性测定理解，氧化的长效干扰素α缀合物(RP-HPLC中的杂质#6)的含量在不含甲硫氨酸的液体制剂中氧化升高，而在补加有0.01％甲硫氨酸的液体制剂中不升高。
这些结果表明甲硫氨酸赋予长效干扰素α缀合物另外的稳定性。
[实施例6]：测定液体制剂长效干扰素α缀合物的长期储存稳定性
测定包含柠檬酸盐缓冲剂(pH 5.5)、NaCl、甘露醇、聚山梨酯80和甲硫氨酸(均已在之前实施例中证明具有其稳定化活性的)的液体制剂长时间稳定长效干扰素α缀合物的能力。在本上下文中，在5±3℃下储存6个月后评价液体制剂中长效IFNα缀合物的稳定性。结果示于图1中并归纳在表12中。长效IFNα缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC(％)、SE-HPLC(％)和蛋白质含量(％)。
表12
[表12]
由数据可以看出，长效干扰素α缀合物可在本发明液体制剂中储存6个月或更久。
本发明实施方案的以上详细描述并不旨在穷举或者将本发明限制在以上公开的精确形式。尽管出于举例说明的目的在以上描述了本发明的具体实施方案和实施例，但本领域技术人员应认识到，在本发明范围内可进行多种等价修改。根据详细描述可对本发明做出这些和其他改变。
本申请还涉及以下实施方案：
1.液体制剂，其包含药用有效量的长效干扰素α缀合物和不含白蛋白的稳定剂，其中所述缀合物中干扰素α与免疫球蛋白Fc区域共价连接在一起，并且所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂。
2.实施方案1的液体制剂，其中所述干扰素α是天然IFNα、天然IFNα的衍生物或活性与天然IFNα活性相似的多肽。
3.实施方案1的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区域来自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。
4.实施方案3的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区域是选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的两个或更多个结构域的杂合体，所述结构域具有不同来源。
5.实施方案3的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区域是由相同来源之结构域构成的单链免疫球蛋白的二聚体或多聚体。
6.实施方案3的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区域是IgG4 Fc区域。
7.实施方案6的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区域是无糖基化的人IgG4 Fc区域。
8.实施方案1的液体制剂，其中所述干扰素α与所述免疫球蛋白Fc区域通过非肽聚合物共价连接。
9.实施方案8的液体制剂，其中所述非肽聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸及其组合。
10.实施方案1的液体制剂，其中所述糖醇选自甘露醇、山梨糖醇及其组合。
11.实施方案10的液体制剂，其中所述糖醇的浓度为基于所述液体制剂总体积的1至10％(w/v)。
12.实施方案1的液体制剂，其中所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液。
13.实施方案12的液体制剂，其中所述缓冲剂的pH为4至7。
14.实施方案12的液体制剂，其中所述缓冲剂的pH为5.2至7。
15.实施方案1的液体制剂，其中所述等张剂是氯化钠。
16.实施方案15的液体制剂，其中氯化钠以5至200mM的浓度使用。
17.实施方案1的液体制剂，其中所述非离子型表面活性剂是聚山梨酯80。
18.实施方案17的液体制剂，其中所述非离子型表面活性剂的浓度为基于所述液体制剂总体积的0.001至0.05％(w/v)。
19.实施方案1的液体制剂，其中所述稳定剂还包含甲硫氨酸。
20.实施方案19的液体制剂，其中甲硫氨酸的浓度为基于所述液体制剂总体积的0.005至0.1％(w/v)。
21.实施方案1的液体制剂，其中所述稳定剂还包含选自糖、多元醇及其组合的组分。
22.液体制剂，其包含药用有效量的长效干扰素α缀合物和稳定剂，其中所述缀合物中干扰素α与免疫球蛋白Fc区域通过聚乙二醇共价连接，并且所述稳定剂包含柠檬酸盐缓冲溶液、甘露醇、聚山梨酯80、氯化钠和甲硫氨酸。
23.用于制备实施方案1至21中任一项的液体制剂的方法，其包括：
a)构建长效干扰素α缀合物；和
b)将步骤a)中构建的所述长效干扰素α缀合物与不含白蛋白的稳定剂混合，所述稳定剂包含糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂。
24.实施方案23的方法，其中所述等张剂是氯化钠。
25.用于稳定长效干扰素α缀合物的稳定剂，其中所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂并且不含白蛋白，所述长效干扰素α缀合物具有与免疫球蛋白Fc区域共价连接的干扰素α。
26.用于通过稳定剂稳定长效干扰素α缀合物的方法，其中所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和等张剂并且不含白蛋白，并且所述长效干扰素α缀合物具有与免疫球蛋白Fc区域共价连接的干扰素α。

Claims (19)

1.液体制剂，其由药用有效量的长效干扰素α缀合物和不含白蛋白的稳定剂组成，其中所述缀合物中干扰素α与免疫球蛋白Fc区域共价连接在一起，并且所述稳定剂由缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和作为等张剂的氯化钠组成；并且
其中所述糖醇是甘露醇并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至10％(w/v)；
所述非离子型表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨酯并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.001至0.05％(w/v)；
所述缓冲剂是包含柠檬酸盐的柠檬酸盐缓冲溶液，其浓度为5至100mM；以及
氯化钠浓度范围为5至200mM。
2.权利要求1的液体制剂，其中所述干扰素α是天然IFNα、天然IFNα的衍生物或活性与天然IFNα活性类似的多肽。
3.权利要求1的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区域来自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。
4.权利要求3的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区域是选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的两个或更多个结构域的杂合体，所述结构域具有不同来源。
5.权利要求3的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区域是由相同来源之结构域构成的单链免疫球蛋白的二聚体或多聚体。
6.权利要求3的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区域是IgG4 Fc区域。
7.权利要求6的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区域是无糖基化的人IgG4 Fc区域。
8.权利要求1的液体制剂，其中所述干扰素α与所述免疫球蛋白Fc区域通过非肽聚合物共价连接。
9.权利要求8的液体制剂，其中所述非肽聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸及其组合。
10.权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂的pH范围为4至7。
11.权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂的pH范围为5.2至7。
12.权利要求1的液体制剂，其中所述非离子型表面活性剂是聚山梨酯80。
13.液体制剂，其由药用有效量的长效干扰素α缀合物和不含白蛋白的稳定剂组成，其中所述缀合物中干扰素α与免疫球蛋白Fc区域共价连接在一起，并且所述稳定剂由缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂、甲硫氨酸和作为等张剂的氯化钠组成；并且
其中所述糖醇是甘露醇并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至10％(w/v)；
所述非离子型表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨酯并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.001至0.05％(w/v)；
所述缓冲剂是包含柠檬酸盐的柠檬酸盐缓冲溶液，其浓度为5至100mM；以及
氯化钠浓度范围为5至200mM。
14.权利要求13的液体制剂，其中甲硫氨酸的浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.005至0.1％(w/v)。
15.液体制剂，其由药用有效量的长效干扰素α缀合物和不含白蛋白的稳定剂组成，其中所述缀合物中干扰素α与免疫球蛋白Fc区域共价连接在一起，并且所述稳定剂由缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂、作为等张剂的氯化钠和多元醇组成；并且
其中所述糖醇是甘露醇并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至10％(w/v)；
所述非离子型表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨酯并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.001至0.05％(w/v)；
所述缓冲剂是包含柠檬酸盐的柠檬酸盐缓冲溶液，其浓度为5至100mM；以及
氯化钠浓度范围为5至200mM。
16.液体制剂，其由药用有效量的长效干扰素α缀合物和稳定剂组成，其中所述缀合物中干扰素α与免疫球蛋白Fc区域通过聚乙二醇共价连接，并且所述稳定剂由柠檬酸盐缓冲溶液、甘露醇、聚山梨酯80、氯化钠和甲硫氨酸组成；其中甘露醇的浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至10％(W/v)；
聚山梨酯80的浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.001至0.05％(w/v)；
所述柠檬酸盐缓冲溶液包含柠檬酸盐，其浓度为5至100mM；以及
所述氯化钠浓度范围为5至200mM。
17.用于制备权利要求1至12中任一项的液体制剂的方法，其包括：
a)构建长效干扰素α缀合物；和
b)将步骤a)中构建的所述长效干扰素α缀合物与不含白蛋白的稳定剂混合，所述稳定剂由缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和作为等张剂的氯化钠组成；并且
其中所述糖醇是甘露醇并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至10％(w/v)；
所述非离子型表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨酯并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.001至0.05％(w/v)；
所述缓冲剂是包含柠檬酸盐的柠檬酸盐缓冲溶液，其浓度为5至100mM；以及
氯化钠浓度范围为5至200mM。
18.用于稳定长效干扰素α缀合物的稳定剂，其中所述稳定剂由缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和作为等张剂的氯化钠组成并且不含白蛋白，所述长效干扰素α缀合物的干扰素α与免疫球蛋白Fc区域共价连接；并且
其中所述糖醇是甘露醇并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至10％(w/v)；
所述非离子型表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨酯并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.001至0.05％(w/v)；
所述缓冲剂是包含柠檬酸盐的柠檬酸盐缓冲溶液，其浓度为5至100mM；以及
氯化钠浓度范围为5至200mM。
19.用于通过稳定剂稳定长效干扰素α缀合物的方法，其中所述稳定剂由缓冲剂、糖醇、非离子型表面活性剂和作为等张剂的氯化钠组成并且不含白蛋白，并且所述长效干扰素α缀合物具有与免疫球蛋白Fc区域共价连接的干扰素α；并且
其中所述糖醇是甘露醇并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的1至10％(w/v)；
所述非离子型表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨酯并且浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.001至0.05％(w/v)；
所述缓冲剂是包含柠檬酸盐的柠檬酸盐缓冲溶液，其浓度为5至100mM；以及
氯化钠浓度范围为5至200mM。
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