JP6047495B2 - 持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤 - Google Patents

Description

本発明は、薬理学的有効量の持続型インターフェロンアルファ結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含んでなり、前記安定化剤は緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含有する、持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤に関する。

インターフェロンは、１９５７年、ＩｓａａｃｓとＬｉｎｄｅｎｍａｎｎが、ニワトリをインフルエンザＡウイルスで感染させるとウイルスを抑制する因子があることを報告することにより、知られることになった(非特許文献１)。ヒトインターフェロンは、防御的免疫反応を行うウイルスのような病原体の誘発を阻害する細胞間の疎通を可能とするサイトカインとして知られているタンパク質である。これらは生成される細胞の種類によってインターフェロンアルファ、インターフェロンベータおよびインターフェロンガンマに分けられる(非特許文献２、非特許文献３)。すなわち、インターフェロンアルファはＢリンパ球細胞(B lymphocytes)、ヌルリンパ球細胞(Null lymphocytes)、およびマクロファージ(Macrophage)によって生成され、インターフェロンガンマはマクロファージの助けによりＴリンパ球細胞から生成される。

インターフェロンは、抗ウイルス機能、抗癌機能、ＮＫ(Natural Killer)細胞の活性化および骨髄細胞の抑制機能に互いに相乗作用を持っていると知られている(非特許文献４、 非特許文献５、非特許文献６)。その後、数多くの研究結果より、インターフェロンは抗ウイルス機能だけでなく、細胞内遺伝子の発現、構造および機能の調節因子として作用することが知られたうえ、直接的な抗増殖効果(Antiproliferative effect)があることが明らかになった。また、インターフェロンは様々なウイルス性疾病などに効果的に作用し、様々な癌に効果があると知られている。

インターフェロンアルファは、Ｂ細胞分裂促進因子(mitogen)、ウイルスまたは癌細胞などによって白血球が刺激されたときに生成される。現在まで２０余種以上のインターフェロン遺伝子が存在することが明らかになっており、これらは大部分１６５または１６６個のアミノ酸ポリペプチドから構成されたものと知られている。

組み換えヒトインターフェロンアルファを用いた臨床試験の結果、様々な固形癌の治療に効果があると知られている。特に、膀胱癌、腎癌及び後天性免疫不全症に関連したカポジ肉腫(Kaposi's sarcoma)などに効果があると知られている(非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９)。また、最近、Ｃ型肝炎ウイルスの治療にも効果があると知られている(非特許文献１０) 。これらの新しい発見に基づくと、インターフェロンアルファの治療領域はより広くなる。

インターフェロンアルファなどのポリペプチドは、一般に安定性が低くて容易に変性し、血液内のタンパク質加水分解酵素により分解されて腎臓または肝を介して容易に除去される。よって、薬理成分としてポリペプチドを含むタンパク質医薬品の血中濃度および力価を維持するためには、タンパク質薬物を患者にたびたび投与する必要がある。ところが、大部分注射剤として患者に投与されるタンパク質医薬品の場合、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するためにたびたび注射するのは患者に苦痛を引き起こす。

このような問題点を解決するために、タンパク質薬物の血中安定性を増加させ且つ血中薬物濃度を長時間高く持続させて薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。このようなタンパク質薬物の持続性製剤は、タンパク質薬物の安定性を高めると同時に、薬物自体の力価が十分に高く維持されなければならず、患者に対して免疫反応を誘発してはならない。

タンパク質を安定化させ且つプロテアーゼの接触および腎臓の損失を抑制するための方法として、従来ではポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）のように溶解度の高い高分子をタンパク質薬物の表面に化学的に付加させる方法が使用されてきた。ＰＥＧは目的タンパク質の特定部位または多様な部位に非特異的に結合して溶解度を高めることによりタンパク質を安定化させ且つタンパク質の加水分解を防止する効果があり、特別な副作用も起こさないと知られている(非特許文献１１)。ところが、ＰＥＧを結合させる場合、タンパク質の安定性は増加しうるが、生理活性タンパク質の力価が顕著に低くなり、ＰＥＧの分子量が増加するほどタンパク質との反応性が低くなって収率が減少するという問題がある。

生理活性タンパク質の生体内安定性を高める別の方法として、遺伝子組み換えによって血中安定性の高いタンパク質遺伝子と生理活性タンパク質遺伝子とを連結した後、前記組み換え遺伝子で形質転換された動物細胞などを培養して融合タンパク質を生産する方法が開発されている。例えば、タンパク質の安定性の増加により効果が高いものと知られているアルブミンまたはその断片を遺伝子組み換えによって目的の生理活性タンパク質に結合させて生産した融合タンパク質が報告されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。

また、免疫グロブリンを用いる方法として、特許文献４は、交差結合剤を用いてヒト成長ホルモンにウシ血清アルブミン（bovine serum albumin、ＢＳＡ）またはマウスの免疫グロブリンを結合させることにより、変形していない成長ホルモンに比べて成長ホルモンの活性を増加させることができることを開示している。ところが、前記特許では、交差結合剤としてカルボジイミド(carbodiimide)またはグルタルアルデヒド(glutaraldehyde)のような低分子量の化学物質のみを開示している。このような低分子量の交差結合剤を使用する場合、非特異的結合により均質な組成物を得ることが難しく、生体内毒性を有するという問題がある。また、前記特許では成長ホルモンの化学的結合によってその活性を増加させることができることを示すだけであって、多様な種類のポリペプチド薬物に対しては活性増加の効果が示されるのかさえ不明確であるから、持続時間および血中半減期の増加などタンパク質安定性との関連性については全く認識していない。

一般に言及されるように、活性減少の最小化と安定性の増加を同時に実現することが可能な持続性タンパク質薬物製剤の必要性が求められている。持続型薬品製剤の使用において、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体および生理活性ポリペプチドを結合させて製造した結合体が特許文献５（生体内持続性が増加した生理活性ポリペプチド結合体）および特許文献６（免疫グロブリン断片を用いたタンパク質結合体およびその製造方法）に開示された。

前記持続型インターフェロンアルファ結合体の含まれた薬物を製品として供給するためには、貯蔵運送過程で光、熱、または添加剤内の不純物によって誘導された劣化による変性、凝集、吸着または加水分解などの物理化学的変化を抑制しながら生体内効力を維持させることが必須的である。持続型インターフェロンアルファはポリペプチド上のインターフェロンアルファに比べて体積が大きくなり、分子量が増加して安定化に困難さがある。

一般に、タンパク質は、その半減期が非常に短く、適当でない温度、水−空気の界面への露出、高圧、物理的／機械的ストレス、有機溶媒、微生物による汚染などに晒されるとき、単量体の凝集、凝集による沈殿、容器表面への吸着などの変性現象を示す。変性したタンパク質は元来の物理化学的性質および生理活性効果を失ってしまう。このようなタンパク質の変性現象は非可逆的であるため、１回変性したタンパク質は元来の特性を殆ど回復することができない。特に、インターフェロンアルファのように１回に数百マイクログラム以下の微量で投与されるタンパク質の場合、その安定性が消失して容器内表面への吸着の際にその損失が相対的にさらに大きいという問題点がある。また、吸着したタンパク質は変性過程によって容易に凝集し、このように凝集した変性タンパク質は人体への投与の際に、人体内で自然的に生産されるタンパク質自体に対して抗体形成の原因として作用するので、タンパク質が十分に安定した状態となるように投与しなければならない。

よって、溶液中のタンパク質の変性を防ぐための様々な方法が研究されてきた(非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６)。

その一つの方法として、一部のタンパク質薬品は、凍結乾燥方法によって安定性の問題を解決している。ところが、凍結乾燥製品は、使用するたびにさらに注射用水に溶かさなければならない不便さがあり、凍結乾燥過程が生産工程に含まれているため、大容量の凍結乾燥機を使用しなければならないなどの大規模の投資が必要である。噴霧乾燥機を用いてタンパク質を粉末化する方法も使用されている。ところが、この場合、低い収率により経済性が劣るという欠点がある。また、高温に晒されるため、タンパク質自体の安定性に悪影響を及ぼすおそれもある。

このような限界を解決する代案として、溶液状態のタンパク質に安定化剤を添加してタンパク質薬物の物理化学的変化を抑制しながら長期間貯蔵によっても生体内効力を維持させる研究を行ったが、このような安定化剤としては具体的に炭水化物、アミノ酸、タンパク質、界面活性剤、高分子および塩類などが使われている。この中でも、タンパク質の一種であるヒト血清アルブミンは、様々なタンパク質薬物の安定化剤として幅広く用いられており、その性能が立証されてきた(非特許文献１７)。

ヒト血清アルブミンは、精製過程において、マイコプラズマ、プリオン、バクテリアおよびウイルスなどの生物学的汚染物に対する不活性工程、または一つ以上の生物学的汚染物または病原体に対する生物学的物質のスクリーニング工程または検査を含んでいるが、これらが完全に除去または不活性されないまま患者に露出する危険が存在する。例えば、スクリーニング工程は血液提供者からのヒト血液における特定のウイルスに対する検査を含むが、このような工程は常に信頼できるものではなく、特に非常に少ない数で存在する特定のウイルスを検出することはできない。

また、異なるタンパク質は、それらの化学的相違点により貯蔵期間中に異なる比率および異なる条件の下で漸進的に非活性化できる。すなわち、安定化のために使用される物質による貯蔵期間延長効果は異なるタンパク質に対して同等でなく、これにより貯蔵安定性を与えるために使用される安定化剤は目的タンパク質の物理化学的特性によって使用される比率及び種類が多様である。安定化剤を併用する場合、相互間の競争作用および副作用により、目的とは異なる逆効果をもたらす可能性があり、貯蔵中に貯蔵タンパク質の本質または濃度が変化するため、異なる効果を示す可能性がある。タンパク質の安定化に適した範囲の濃度が存在するので、溶液中のタンパク質を安定化させるためには多くの努力と注意が必要である。

特に、生体内持続性および安定性を高めた持続型インターフェロンアルファ結合体の場合、生理活性ペプチドであるインターフェロンアルファ、非ペプチド性重合体および免疫グロブリンＦｃ領域が結合した形態であるので、分子量および体積が一般のインターフェロンアルファとは確然に異なるから、タンパク質を安定化させるための特別な組成が求められる。また、生理活性ペプチドとしてのインターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域はそれぞれ物理化学的特性の異なるペプチドまたはタンパク質であるから、生理活性ペプチドであるインターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化させなければならない。

前述したように、相異なるペプチドまたはタンパク質は、それらの物理化学的相違点により、貯蔵中に相異なる比率および相異なる条件の下で漸進的に非活性化できる。また、それぞれのペプチドまたはタンパク質に適した安定化剤を併用する場合、相互間の競争作用および副作用により、目的とは異なる逆効果をもたらすおそれがある。

よって、持続型インターフェロンアルファ結合体の場合、生理活性ペプチドであるインターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化させる安定化剤の組成を探し出すのに多くの困難があった。

国際公開公報第９３/１５１９９ 国際公開公報第９３/１５２００２ ヨーロッパ特許公開第４１３，６２２ 米国特許第５，０４５，３１２号 韓国登録特許第１０−０５６７９０２号 韓国登録特許第１０−０７２５３１５号 国際特許公開第９７/３４６３１ 国際特許公開第９６/３２４７８

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そこで、本発明者は、持続型インターフェロンアルファをウイルス汚染の恐れがなく、長期間効能を維持させることができるようにする安定した液状製剤を提供するために研究してきた結果、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み、アルブミンは含まない安定化剤が持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性を増大させることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）と免疫グロブリンＦｃ領域とが結合した薬理学的有効量の持続型インターフェロンアルファ結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含んでなり、前記安定化剤は緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含む、液状製剤を提供することにある。

本発明の他の目的は、ａ）持続型インターフェロンアルファ結合体を製造する段階と、ｂ）ａ）段階で製造された持続型インターフェロンアルファ結合体を、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み、アルブミンは含まない安定化剤と混合する段階とを含んでなる、 持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤を製造する方法を提供することにある。

また、本発明の別の目的は、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み、アルブミンは含まない、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とが共有結合した、持続型インターフェロンアルファ結合体安定化のための安定化剤を提供することにある。

また、本発明の別の目的は、安定化剤として持続型インターフェロンアルファ結合体を安定化させる方法を提供することにあり、前記安定化剤は、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み、アルブミンは含まない安定化剤であり、前記持続型インターフェロンアルファ結合体はインターフェロンアルファ結合体、および免疫グロブリンＦｃ領域が共有結合したものである。

本発明に係る持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤は、安定化剤としてヒト血清アルブミンおよび人体に潜在的に有害な因子を含まないため、ウイルス感染のおそれがなく、インターフェロンアルファポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域との結合からなって天然型に比べて分子量が大きくかつ生理活性持続期間が増大した持続型インターフェロンアルファ結合体に対する優れた貯蔵安定性を提供するので、持続型インターフェロン結合体を安定的に保存するのに有用に使用できる。

実施例６によって最終選択されたｐＨ５．５の持続型インターフェロンアルファ結合体液状製剤の４℃長期保存安定性の試験によって６ヶ月間持続型インターフェロンアルファ結合体を保管しながら試料の安定性をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析したグラフである。

本発明の一つの様態として、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とが結合した薬理学的有効量の持続型インターフェロンアルファ結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含んでなり、前記安定化剤は緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含む、持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤を提供する。

本発明は、他の様態として、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み且つアルブミンは含まない、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とが結合した、持続型インターフェロンアルファ結合体安定化のための安定化剤を提供する。

本発明は、別の様態として、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み且つアルブミンは含まない安定化剤を同時または順次添加し、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とが結合した持続型インターフェロンアルファ結合体を安定化させる方法を提供する。

前記「持続型インターフェロンアルファ結合体」とは、生理活性ペプチドとしてのインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）と免疫グロブリンＦｃ領域とが結合した形態のタンパク質であって、インターフェロンアルファ、両末端に反応基を有する一つ以上の非ペプチド性重合体および一つ以上の免疫グロブリンＦｃ領域を含み、これらの構成要素が共有結合によって互いに連結されているものを含む。

したがって、本明細書において、用語「持続型」とは、生理活性持続期間が天然型インターフェロンアルファに比べて増大したものを意味する。「結合体」とは、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を介して共有結合するなどの形で連結されたものを意味する。

前記持続型インターフェロンアルファ結合体は、タンパク質薬物の生理活性減少を最小化し且つ生体内持続性を最大限増進させるためのタンパク質薬物の変形体である。本発明では免疫グロブリンＦｃ領域を結合させることを特徴とする。

本発明のインターフェロンアルファは、好ましくはヒトインターフェロンアルファである。また、天然型ＩＦＮα、天然型ＩＦＮα誘導体、または天然型ＩＦＮαと類似の活性を示すペプチドであってもよい。すなわち、本発明のインターフェロンアルファは、天然型インターフェロンアルファのアミノ酸配列だけでなく、その配列変異体(mutant)を含むことができる。「アミノ酸配列変異体」とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するものを意味する。

インターフェロンアルファは、天然または組み換え起源のいずれの方法で製造されたものでも使用可能である。好ましくは、大腸菌を宿主細胞として用いて製造した組み換えヒトインターフェロンアルファ（ＨｕＩＦＮα）であり、生物学的活性に大きく影響を及ぼさない範囲でアミノ酸の置換、除去、挿入による変異体も含む。

本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（Ｃ_H1）および軽鎖不変領域１（Ｃ_L1）を除いた、重鎖不変領域２（Ｃ_H2）および重鎖不変領域３（Ｃ_H3）部分を意味し、さらに重鎖不変領域にヒンジ(hinge)部分を含むことができる。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等或いはそれより向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除いて、一部または全体重鎖不変領域１（Ｃ_H1）および／または軽鎖不変領域１（Ｃ_L1）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、Ｃ_H2および／またはＣ_H3に該当する相当長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。

すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）Ｃ_H1ドメイン、Ｃ_H2ドメイン、Ｃ_H3ドメインおよびＣ_H4ドメイン、２）Ｃ_H1ドメインおよびＣ_H2ドメイン、３）Ｃ_H1ドメインおよびＣ_H3ドメイン、４）Ｃ_H2ドメインおよびＣ_H3ドメイン、５）１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体でありうる。

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列変異体(mutant)を含む。アミノ酸配列変異体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られた２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として利用できる。

また、ジスルフィド結合を形成することが可能な部位が除去されるか、或いは天然型ＦｃからＮ末端の幾つかのアミノ酸が除去されるか、或いは天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能を無くすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位またはＡＤＣＣ部位が除去されることがある。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列変異体を製造する技術は、特許文献７、特許文献８などに開示されている。

分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸置換は、当該分野に公知になっている(非特許文献１８)。最も通常起こる置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の置換である。場合によっては、リン酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、グリコシル化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)、アセチル化(acetylation)、アミド化(amidation)などで修飾されることもできる。

上述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同一の生物学的活性を示すが、Ｆｃ領域の熱やｐＨなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体である。

また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が除去された形態でありうる。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には化学的方法、酵素学的方法、および微生物を用いた遺伝工学的方法といった通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃｌｑ）の結合力が顕著に低下し、抗体−依存性細胞毒性または補体−依存性細胞毒性が減少または除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このことからみて、薬物のキャリアとしての本来の目的にさらに符合する形態は、脱グリコシル化或いは非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域であるといえる。

本発明において、「脱グリコシル化(Deglycosylation)」とは酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、「非グリコシル化(Aglycosylation)」とは原核動物、好ましくは大腸菌から生産した、グリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。

また、本発明の免疫グロブリンＦｃは、ヒト免疫グロブリンとその密接に関連した類似体の配列を有する。前記Ｆｃ領域はウシ、ヤギ、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源でありうる。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ(combination)またはこれらのハイブリッド(hybrid)によるＦｃ領域であってもよい。好ましくは、ヒト血液に最も富むＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させるものとして公知になったＩｇＧ由来である。免疫グロブリンＦｃは、天然ＩｇＧを特定のタンパク質分解酵素で処理して製造することができ、組み換え技術を用いて形質転換された細胞からも製造することができる。好ましくは大腸菌(E.coli)から製造した組み換えヒト免疫グロブリンＩｇＧ由来のＦｃである。

本発明において、「組み換え」は、二量体または多量体由来の単鎖ポリペプチドに連結されたＦｃ領域を意味する。

一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のサブクラスに分けられる。本発明では、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドも可能である。好ましくは、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４サブクラスであり、より好ましくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ、Complement dependent cytotoxicity）のようなエフェクター機能(effector function)が殆どないＩｇＧ４のＦｃ領域である。また、最も好ましい本発明の薬物のキャリア用免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化Ｆｃ領域である。

ヒト由来のＦｃ領域は、ヒトの生体で抗原として作用してこれに対する新しい抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を引き起こすおそれのある非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。

本発明の持続型インターフェロンアルファ結合体は、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とを結合させて製造される。その結合方法としては、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とを非ペプチド性重合体を用いて交差結合させ、或いは組み換え技術によってインターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とが連結した形での融合タンパク質に組み換えることができる。

また、本発明で使用される持続型インターフェロンアルファ結合体は、特許文献６に開示された方法で製造することができる。

交差結合の際に使用される非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、polylactic acid）およびＰＬＧＡ（ポリ乳酸グリコール酸、polylactic-glycolic acid）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれる。好ましくはポリエチレングリコールである。当該分野に既に知られているこれらの誘導体および当該分野の技術水準で容易に製造することが可能な誘導体も本発明の範囲に含まれる。

本発明の持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤には、持続型インターフェロンアルファ結合体が薬理学的有効量で含まれる。

用語「薬理学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な利益／危険の比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量水準は、個体の種類および重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、およびその他の医薬／薬学分野によく知られている要素によって決定できる。一般に、インターフェロンアルファの薬理学的有効量は使い捨てバイアル(single-use vial)内に約３０〜２００μｇ程度が含有された量である。本発明で使用される持続型インターフェロンアルファ結合体の濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜５．０ｍｇ／ｍＬである。

前記生体内持続性および安定性を高めた持続型インターフェロンアルファ結合体の場合、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とが結合した形態であるので、分子量および体積が一般のインターフェロンアルファとは確然に異なるから、タンパク質を安定化するための特別な組成が求められる。また、生理活性ペプチドであるインターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域はそれぞれ物理化学的特性の異なるペプチドまたはタンパク質であるから、生理活性ペプチドであるインターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化しなければならない。

よって、本発明はこのような目的のために安定化剤を提供するが、本発明において、「安定化剤」は持続型インターフェロンアルファ結合体が安定的に貯蔵できるようにする物質を意味し、「安定化」は一定の時間特定の貯蔵条件の下で活性成分の損失が特定量未満、一般的に１０％未満であることを意味する。通常、５±３℃で２年、２５±２℃で６ヶ月、または４０±２℃で１〜２週間持続型インターフェロンアルファ結合体が９０％以上、好ましくは約９５％程度の残存率を維持する場合、このような製剤は安定したものと理解できる。

持続型インターフェロンアルファ結合体のようなタンパク質において、貯蔵安定性は、正確な投与量を保障するためだけでなく、持続型インターフェロンアルファ結合体に対する抗原性物質の潜在的な生成を抑制するために重要である。貯蔵中に持続型インターフェロンアルファ結合体が１０％程度の損失を示すことは、組成物内で凝集体や断片などを生じさせ、抗原性物質に転換されない限り、実質的な投与の際に許容すべきものと理解できる。

本発明の前記安定化剤は、持続型インターフェロンアルファ結合体に安定性を与えるために、緩衝剤、糖アルコール、等張化剤および非イオン性界面活性剤を含むことができ、好ましくはメチオニンをさらに含むことができる。

前記緩衝剤は、持続型インターフェロンアルファ結合体を安定化させるために液状製剤のｐＨが急激に変化しないように溶液のｐＨを維持させる役割をする。緩衝剤は、アルカリ塩（リン酸カリウムまたはナトリウムまたはこれらの水素または二水素塩）、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸をはじめとして、当業界における公知の任意の、他の薬学的に許容されるｐＨ緩衝剤を含むことができ、これらの緩衝剤の混合物も使用できる。

本発明の実施例を参照すると、持続型インターフェロンアルファ結合体は、緩衝剤のｐＨによって安定化の度合いが異なり、ｐＨ５．５のクエン酸緩衝溶液の下で持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性が増大することが分かる（実施例２）。

緩衝剤は、好ましくはリン酸緩衝溶液(phosphate buffer)またはクエン酸緩衝溶液(Citrate buffer)であり、より好ましくはクエン酸緩衝溶液である。

クエン酸緩衝溶液を構成するクエン酸塩の濃度は、好ましくは５ｍＭ〜１００ｍＭであり、より好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭである。

緩衝剤のｐＨは、好ましくは４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜７．０、さらに好ましくは５．２〜７．０、さらに一層好ましくは５．２〜６．０である。

前記糖アルコール(sugar alcohol)は、単糖類の誘導体であって、糖を接触還元させ、糖が有しているカルボニル基（＝ＣＯ）が水酸基（−ＯＨ）になったことを意味するもので、持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性を増大させる役目をする。

本発明の糖アルコールの濃度は、好ましくは液状製剤総量に対して１〜１０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは５％（ｗ／ｖ）である。

前記糖アルコールは、エリスリトール(Erythritol)、ガラクチトール(Galactitol)、アラビトール(Arabitol)、キシリトール(Xylitol)、リビトール(Ribitol)、マルチトール(Maltitol)、ソルビトール(Sorbitol)、ラクチトール(Lactitol)、およびマンニトール(Mannitol)よりなる群から選ばれ、好ましくはマンニトールおよびソルビトールよりなる群から選ばれた少なくとも１種である。

本発明の実施例を参照すると、通常の緩衝剤の条件下で安定化物質としてマンニトールを添加したとき、持続型インターフェロンアルファ結合体が安定していることが分かる（実施例１）。

前記等張化剤は、持続型インターフェロンアルファ結合体を液状製剤上で体内に投与するとき、浸透圧を適切に保つ役目をし、持続型インターフェロンアルファ結合体を液状製剤でさらに安定化させる付随的な効果も示す。このような等張化剤の代表的な例としては水溶性無機塩を挙げることができ、好ましくは塩化ナトリウムである。

本発明の一実施例によれば、緩衝剤、糖アルコールおよび非イオン性界面活性剤の存在下で、等張化剤としての塩化ナトリウムを含ませる場合、持続型インターフェロンアルファ結合体の貯蔵安定性を増加させる結果が得られた。これは、緩衝剤、糖アルコールおよび非イオン性界面活性剤と等張化剤としての塩化ナトリウムとの同時使用が相乗効果を示して持続型インターフェロンアルファ結合体に特別な安定性を与えることを示す。

前記塩化ナトリウムの濃度は、液状製剤総量に対して、好ましくは５〜２００ｍＭ、より好ましくは１５０ｍＭであり、剤形に含まれた成分の種類および量などに応じて、それぞれの混合物が全て含まれた液状製剤が等張液となるように適切に調節できる。

前記非イオン性界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を低めて疎水性の表面にタンパク質が吸着または凝集することを防止する役目をする。本発明に使用できる非イオン性界面活性剤の好適な例としては、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤およびポロキサマー系非イオン性界面活性剤などを挙げることができ、これらの一つまたは２つ以上の組み合わせの形で使用できる。その中でも、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤がさらに好ましい。ポリソルベート系非イオン性界面活性剤の例としてはポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、およびポリソルベート８０などがあり、その中でもポリソルベート８０が好ましい。

本発明の実施例を参照すると、ポリソルベート８０を含む持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤が、ポロキサマー１８８を含む液状製剤と類似し或いはそれよりやや安定し、０．００５％ポリソルベート８０を含む液状製剤より高い濃度である０．０２％ポリソルベート８０を含む持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤が安定性にさらに優れることが分かる（実施例３）。

前記非イオン性界面活性剤を液状製剤に高濃度で使用することは、高濃度の非イオン性界面活性剤がＵＶ分光法や等焦点法などの分析法によるタンパク質の濃度測定または安定性の評価時に干渉効果を誘発し、タンパク質の安定性を正確に評価することが難しいので適さない。

よって、本発明の液状製剤には、前記非イオン性界面活性剤が好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下の低濃度、より好ましくは０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）で含まれる。

本発明の安定化剤はメチオニンをさらに含んでもよい。前記メチオニンは、溶液状態でタンパク質の酸化反応などによって起りうる不純物の生成を抑制させて対象タンパク質をさらに安定化させる効果がある。メチオニンの濃度は、好ましくは０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは液状製剤総量に対して０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）である。

本発明の実施例を参照すると、メチオニンの含まれていない液状製剤では酸化した持続型インターフェロンアルファ結合体が増加し、０．０１％メチオニンの含まれた液状製剤では酸化した持続型インターフェロンアルファ結合体が増加しなかった。このような結果は、メチオニンの含まれた液状製剤が持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性をさらに効果的に提供することを示す（実施例５）。

本発明の前記安定化剤はアルブミンを含有しないことが好ましい。タンパク質の安定化剤として利用できるヒト血清アルブミンはヒトの血液から製造されるので、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染可能性が存在し、ゼラチンまたはウシ血清アルブミンは疾患を引き起こし、或いは一部患者の場合にはアレルギー反応を誘発する可能性がある。よって、本発明のアルブミン非含有安定化剤は、ヒトまたは動物由来の血清アルブミンまたは精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないため、ウイルス感染のおそれがない。

また、本発明の安定化剤は糖類または多価アルコールをさらに含んでもよい。持続型インターフェロンアルファ結合体の貯蔵安定性を増大させるためにさらに含まれうる糖類および多価アルコールのうち、糖類の好ましい例としてはマンノース、グルコース、フコースおよびキシロースなどの単糖類、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノースおよびデキストランなどの多糖類を挙げることができ、多価アルコールの好ましい例としてはプロピレングリコール、低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量のポリプロピレングリコールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上の組み合わせの形で使用できる。

本発明の液状製剤には、前記緩衝剤、等張化剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤およびメチオニン以外に、本発明の効果を損傷させない範囲内で当業界における公知のその他の成分または物質が選択的にさらに含まれてもよい。

本発明は、別の様態として、ａ）持続型インターフェロンアルファ結合体を製造する段階と、ｂ）ａ）段階で製造された持続型インターフェロンアルファ結合体を、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含む安定化剤と混合する段階とを含んでなる、持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤を製造する方法を提供する。

前記ａ）持続型インターフェロンアルファ結合体を製造する段階は、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とを非ペプチド性重合体を用いて交差結合させ、或いは組み換え技術を用いてインターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とを融合させることにより行われる。

非ペプチド性重合体を用いたインターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域との交差結合は、両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体、インターフェロンアルファおよび免疫グロブリンＦｃ領域を反応させ、これらを相互共有結合によって連結させる段階と、非ペプチド性重合体の両末端にインターフェロンアルファおよび免疫グロブリンＦｃ領域がそれぞれ共有結合によって連結された結合体を分離する段階とを含んでなる。

前記３つの構成要素の共有結合は順次または同時に起りうる。例えば、非ペプチド性重合体の両末端にそれぞれインターフェロンアルファおよび免疫グロブリンＦｃ領域を結合させる場合には、インターフェロンアルファおよび免疫グロブリンＦｃ領域のうちいずれか一つを先ず非ペプチド性重合体の一方の末端に結合させた後、残りの成分を非ペプチド性重合体の他方の末端に結合させる方式で順次反応を行う方が、目的のタンパク質結合体以外の副産物の生成を最小化するのに有利である。

前記ａ）段階で製造された持続型インターフェロンアルファ結合体を、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含む安定化剤と混合し、本発明の持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤を製造することができる。

前記安定化剤は、好ましくは等張化剤として塩化ナトリウムを含むことができ、メチオニン、糖類および多価アルコールよりなる群から選ばれる少なくとも１種の成分をさらに含むことができる。

以下、本発明を実施例および実験例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。

［製造例１］持続型インターフェロンアルファ結合体の製造
<１−１>免疫グロブリンを用いた免疫グロブリンＦｃ領域の製造
免疫グロブリンＦｃ領域を製造するために、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解した分子量１５０ｋＤａの免疫グロブリンＧ（Immunoglobulin G、ＩｇＧ、緑十字）２００ｍｇにタンパク質加水分解酵素パパイン（Papain、Ｓｉｇｍａ社）を２ｍｇ処理して３７℃で２時間ゆっくり攪拌しながら反応させた。酵素反応の後、生成された免疫グロブリンＦｃ領域を精製するためにスーパーデキスカラム、タンパク質Ａカラムおよび陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを順次行った。具体的に、反応液を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）に平衡化させたスーパーデキス２００カラム（Superdex 200、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に点滴し、同様の緩衝液を用いて１ｍＬ／分の流速で溶出させた。免疫グロブリンＦｃ領域より分子量が相対的に大きい未反応免疫グロブリン（ＩｇＧ）とＦ（ａｂ’）２などは前方から溶出するので、これを先ず除去した。免疫グロブリンＦｃ領域と類似した分子量を有するＦａｂは次のようにタンパク質Ａカラムクロマトグラフィーを行って除去した。２０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に平衡化させたタンパク質Ａカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に、スーパーデキス２００カラムから溶出した免疫グロブリンＦｃ領域含有分画を５ｍＬ／分の流速で負荷した後、カラムに結合していないタンパク質を除去するために同一の緩衝液で十分に洗浄した。ここに１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液を流して純度の高い免疫グロブリンＦｃ領域を溶出させた。タンパク質Ａカラムで精製されたＦｃ分画を最後に陽イオン交換樹脂カラム（ｐｏｌｙＣＡＴ、ＰｏｌｙＬＣ社）を用いて最終精製したが、１０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）を直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０．１５Ｍ→０．４Ｍ）方法で流して高純度のＦｃ分画を得た。

<１−２>ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体の製造
両末端にアルデヒド反応基を有する分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールであるＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をヒトインターフェロンアルファ−２ｂ（ｈＩＦＮα−２ｂ、分子量２０ｋＤａ）が５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に、ＩＦＮα：ＰＥＧのモル比が１：１、１：２．５、１：５、１：１０および１：２０となるように添加した。ここに還元剤としての水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ₃、Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度２０ｍＭとなるように添加し、４℃でゆっくり攪拌しながら３時間反応させた。インターフェロンアルファのアミノ末端部位に選択的にＰＥＧが連結され且つＰＥＧとインターフェロンアルファとが１：１で結合した連結体を得るために、前記反応混合物をもってスーパーデキス（ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）サイズ排除(size exclusion)クロマトグラフィーを行った。溶出液として１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を精製し、ＰＥＧと結合していないインターフェロンアルファ、未反応ＰＥＧ、および２つのインターフェロンアルファがＰＥＧと連結された二量体副産物を除去した。精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍＬの濃度で濃縮した。このことから、反応性が最もよく且つ二量体などの副産物が少ないＩＦＮα：ＰＥＧの最適反応モル比は１：２．５〜１：５であることを確認した。

<１−３>ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の形成
前記段階２で精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に結合させるために、前記段階１で準備された免疫グロブリンＦｃ領域（約５３ｋＤａ）を１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解させた後、ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：Ｆｃのモル比がそれぞれ１：１、１：２、１：４および１：８となるようにＩＦＮα−ＰＥＧ連結体と混合して反応させた。反応液を１００ｍＭのリン酸塩緩衝液状態にし、還元剤としてＮａＣＮＢＨ₃を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で２０時間ゆっくり攪拌しながら反応させた。このことから、反応性が最もよく且つ二量体などの副産物が少ないＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：Ｆｃの最適反応モル比は１：２であることを確認した。

<１−４>ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の分離および精製
前記段階３の結合反応の後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃタンパク質結合体を精製するために、スーパーデキスサイズ排除クロマトグラフィーを行った。反応混合物を濃縮した後、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて２．５ｍＬ／分の流速でカラムに通過させ、結合していないＦｃおよび未反応物質を除去し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃタンパク質結合体分画を得た。得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃタンパク質結合体分画には、不純物として少量の未反応Ｆｃおよびインターフェロンアルファ二量体が混在しているから、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行った。ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃタンパク質結合体分画を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡化させたＰｏｌｙＣＡＴ ＬＰカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に入れ、１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）緩衝液を直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０Ｍ→０．５Ｍ）方法で流してさらに精製した。最後に、陰イオン交換カラムを用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃタンパク質結合体を純粋に収得した。

ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化させた後、精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃタンパク質結合体分画を負荷し、１Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０Ｍ→０．３Ｍ）方法で流して純粋なＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃタンパク質結合体を精製した。

多様な安定化剤による持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性の評価
本発明に係る安定化剤として、クエン酸緩衝溶液の存在下に多様な種類の物質、すなわち、糖類、糖アルコールおよびアミノ酸が持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性に及ぼす影響を実験した。

緩衝溶液は、クエン酸（クエン酸ナトリウム）緩衝剤を用い（ｐＨ５．５）、糖アルコールとしてマンニトール、アミノ酸としてアルギニンまたはグリシン、糖類としてスクロースを用いた。

下記表１のような組成をそれぞれ持続型インターフェロンアルファ結合体の安定化剤として用いて４０℃で１週間保管した後、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表１のＲＰ−ＨＰＬＣ（％）およびＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は、Ａｒｅａ％（／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）として、初期結果値に対比した持続型インターフェロンアルファ結合体の残存率を示す。

表２を参照すると、通常の緩衝溶液の条件下で安定化物質としてマンニトールを添加したとき、持続型インターフェロンアルファ結合体が最も安定した。

緩衝液のｐＨによる持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性の評価
多様なｐＨの緩衝溶液で持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性を比較した。

下記表３のような組成をそれぞれ持続型インターフェロンアルファ結合体の緩衝溶液として用いて４０℃で２週間保管した後、逆相クロマトグラフィー法を用いて分析した。安定化剤としてマンニトール、界面活性剤としてポリソルベート８０を用いて、４０℃で２週間保管した後、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表４のＲＰ−ＨＰＬＣ（％）およびＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は初期結果値に対比した持続型インターフェロンアルファ結合体の残存率を示す。

表３および表４より、ｐＨ５．２で１週分析の際に試料の沈殿発生を確認したとともに、ｐＨ６．０に比べてｐＨ５．５のクエン酸緩衝溶液の下で持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性が増大することを確認した。

これにより、持続型インターフェロンアルファ結合体は、緩衝液のｐＨによって安定化の度合いが異なり、特定のｐＨ範囲でさらに高い安定性を示すことが分かる。

非イオン性界面活性剤による持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性の評価
本発明に係る安定化剤としてクエン酸緩衝溶液の存在下で非イオン性界面活性剤の種類および濃度が持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性に及ぼす影響を実験した。

界面活性剤としては、ポリソルベート８０とポロキサマー１８８を用いた。界面活性剤以外の安定化剤の組成は、実施例１で高い安定性を示すマンニトールを使用した。

インターフェロンアルファの濃度は３６０μｇ／ｍＬ、緩衝溶液は２０ｍＭのクエン酸ナトリウム(Na-Citrate)、ｐＨ５．５を用いた同様の条件に下記表５のような組成をそれぞれ付加し、これを持続型インターフェロンアルファ結合体の安定化剤として用いて、２５±２℃で４週間保管した後、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表５のＲＰ−ＨＰＬＣ（％）およびＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は初期結果値に対比した持続型インターフェロンアルファ結合体の残存率を示す。

表５および表６を参照すると、ＳＥ−ＨＰＬＣの結果では界面活性剤の種類および濃度による持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性に差異が殆どなかったが、ＲＰ−ＨＰＬＣ結果ではポリソルベート８０がポロキサマー１８８と類似し或いはそれよりやや安定した。また、０．００５％ポリソルベート８０を含む液状製剤より高い濃度である０．０２％ポリソルベート８０を含む持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤が安定性にさらに優れることが確認された。

持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤と市販中のインターフェロンアルファ薬物の液状製剤に持続型インターフェロンアルファ結合体を適用した液状製剤との安定性の比較評価
実施例１〜３の安定性実験で選択したｐＨ５．５のクエン酸緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトール、およびポリソルベート８０からなる持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性を確認するために、市販中のインターフェロンアルファ薬物（ＩＮＦα２ａ、Ｐｅｇａｓｙｓ^R)液状製剤の安定化剤の組成に持続型インターフェロンアルファ結合体を適用した液状製剤の安定性の比較実験を行った。

下記表７のような組成で持続型インターフェロンアルファ結合体（液状製剤＃１）を調製し、インターフェロンアルファ薬物（ＩＦＮα２ａ、Ｐｅｇａｓｙｓ^R）液状製剤の安定化剤の組成に持続型インターフェロンアルファ結合体を適用した液状製剤（液状製剤＃２）を調製した。その後、２５±２℃で２週間保管した後、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表８のＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期結果値に対比した持続型インターフェロンアルファ結合体の残存率を示す。

安定性試験の結果、市販中のインターフェロンアルファ薬物（ＩＦＮα２ａ、Ｐｅｇａｓｙｓ^R）の液状製剤の安定化剤の組成を適用した持続型インターフェロンアルファ結合体より本発明の持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤がさらに安定した組成であることを確認することができる。

メチオニンがさらに含まれた持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤の安定性の評価
既存の実施例で選択したｐＨ５．５のクエン酸緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトールおよびポリソルベート８０の他に酸化反応防止のためのメチオニンをさらに含んでなる液状製剤の加速安定性を確認するために、２５±２℃で４週間保管した試料の安定性を分析した。

下記表９のような組成で持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤を調製して分析し、表１０および表１１のＲＰ−ＨＰＬＣ（％）およびＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は各時点の持続型インターフェロンアルファ結合体および不純物の含量を示す。表１０は加速安定性試験（２５±２℃）のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を示し、表１１は加速安定性試験（２５±２℃）のＳＥ−ＨＰＬＣ結果を示し、不純物＃６は酸化した持続型インターフェロンアルファ結合体である。但し、ＳＥ−ＨＰＬＣは試料の分子量を用いて分離する方法であり、酸化した形態と酸化していない形態は分子量の差が非常に小さいため、ＳＥ−ＨＰＬＣによっては酸化した形態の持続型インターフェロンアルファ結合体を分離することができなかった。

加速安定性試験の結果、メチオニンが含まれていない液状製剤では酸化した持続型インターフェロンアルファ結合体（ＲＰ−ＨＰＬＣにおける不純物＃６）が増加することを確認し、０．０１％のメチオニンが含まれた液状製剤では酸化した持続型インターフェロンアルファ結合体が増加しないことを確認した。

このような結果は、メチオニンの含まれた液状製剤が持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性をさらに効果的に提供することを示す。

持続型インターフェロンアルファ結合体液状製剤の長期保存安定性の試験
実施例によって最終選択したｐＨ５．５のクエン酸緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトール、ポリソルベート８０およびメチオニンからなる液状製剤の長期保存安定性を確認するために、５±３℃で６ヶ月間保管した試料の安定性を分析した。その結果を図１および表１２に示した。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（％）、タンパク質の含量（％）は初期結果値に対比した残存率を示す。

長期保存安定性試験の結果、持続型インナーフェロンアルファ結合体は本発明の液状製剤で６ヶ月以上安定であることを確認した。

以上の説明より、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想または必須的特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解することができる。これに関連し、上述した実施例は全ての面で例示的なものに過ぎず、制限的なものではないと理解すべきである。本発明の範囲は、前述した詳細な説明よりは後述の請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価範囲から導出される全ての変更または変形形態が本発明の範囲に含まれると解釈されるべきである。

Claims (17)

1. インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）が免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体を介して共有結合で連結された薬理学的有効量の持続型インターフェロンアルファ結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含んでなり、前記安定化剤が、クエン酸緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含む、液状製剤であって、
   非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールであり、
   インターフェロンアルファがインターフェロンアルファ−２であり、
   クエン酸緩衝溶液が５〜１００ｍＭのクエン酸を含み、
   糖アルコールが、液状製剤総量に対して１〜１０％（ｗ／ｖ）のマンニトールであり、
   非イオン性界面活性剤が、液状製剤総量に対して０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）のポロキサマー系非イオン性界面活性剤又はポリソルベート系非イオン性界面活性剤であり、
   等張化剤が、液状製剤総量に対して５〜２００ｍＭの塩化ナトリウムである、液状製剤。
2. 前記インターフェロンアルファが天然型ＩＦＮα、天然型ＩＦＮα誘導体、または天然型ＩＦＮαと類似の活性を示すペプチドである、請求項１に記載の液状製剤。
3. 前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭよりなる群から選ばれた免疫グロブリンに由来する、請求項１又は２に記載の液状製剤。
4. 前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭよりなる群から選ばれた相異なる起源を有する、２つ以上のドメインのハイブリッドである、請求項３に記載の液状製剤。
5. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンの二量体または多量体である、請求項３に記載の液状製剤。
6. 前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項３に記載の液状製剤。
7. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が非グリコシル化ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項６に記載の液状製剤。
8. 前記緩衝剤のｐＨ範囲が４〜７である、請求項１〜７のいずれか１項記載の液状製剤。
9. 前記緩衝剤のｐＨ範囲が５．２〜７である、請求項１〜８のいずれか１項記載の液状製剤。
10. 前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項１〜９のいずれか１項記載の液状製剤。
11. 前記安定化剤はメチオニンをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の液状製剤。
12. 前記メチオニンの濃度範囲が液状製剤総量に対して０．００５〜０．１％（ｗ／ｖ）である、請求項１１に記載の液状製剤。
13. 前記安定化剤が糖類、多価アルコールおよびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた成分をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の液状製剤。
14. インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とがポリエチレングリコールを介して連結された薬理学的有効量の持続型インターフェロンアルファ結合体と、安定化剤とを含んでなり、前記安定化剤はクエン酸緩衝溶液、マンニトール、ポリソルベート８０、塩化ナトリウムおよびメチオニンを含む、液状製剤であって、
    インターフェロンアルファがインターフェロンアルファ−２であり、
    クエン酸緩衝溶液が５〜１００ｍＭのクエン酸を含み、
    マンニトール濃度が液状製剤総量に対して１〜１０％（ｗ／ｖ）であり、
    ポリソルベート８０濃度が液状製剤総量に対して０．００１〜０．０５（ｗ／ｖ）であり、
    塩化ナトリウム濃度が液状製剤総量に対して５〜２００ｍＭである、液状製剤。
15. ａ）持続型インターフェロンアルファ結合体を製造する段階と、
    ｂ）ａ）段階で製造された持続型インターフェロンアルファ結合体を、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、クエン酸緩衝溶液および等張化剤を含み且つアルブミンは含まない安定化剤と混合する段階とを含んでなる、請求項１〜１３のいずれか１項の液状製剤を製造する方法であって、
    非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールであり、
    インターフェロンアルファがインターフェロンアルファ−２であり、
    クエン酸緩衝溶液が５〜１００ｍＭのクエン酸を含み、
    糖アルコールが、液状製剤総量に対して１〜１０％（ｗ／ｖ）のマンニトールであり、
    非イオン性界面活性剤が、液状製剤総量に対して０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）のポロキサマー系非イオン性界面活性剤又はポリソルベート系非イオン性界面活性剤であり、
    等張化剤が、液状製剤総量に対して５〜２００ｍＭの塩化ナトリウムである、製造方法。
16. クエン酸緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み且つアルブミンは含まない、インターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域とが非ペプチド性重合体を介して共有結合した、持続型インターフェロンアルファ結合体安定化用安定化剤であって、
    非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールであり、
    インターフェロンアルファがインターフェロンアルファ−２であり、
    クエン酸緩衝溶液が５〜１００ｍＭのクエン酸を含み、
    糖アルコールが、液状製剤総量に対して１〜１０％（ｗ／ｖ）のマンニトールであり、
    非イオン性界面活性剤が、液状製剤総量に対して０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）のポロキサマー系非イオン性界面活性剤又はポリソルベート系非イオン性界面活性剤であり、
    等張化剤が、液状製剤総量に対して５〜２００ｍＭの塩化ナトリウムである、安定化剤。
17. クエン酸緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み且つアルブミンは含まない安定化剤によって、免疫グロブリンＦｃ領域に非ペプチド性重合体を介して共有結合したインターフェロンアルファを有する持続型インターフェロンアルファ結合体を安定化させる方法。
    非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールであり、
    インターフェロンアルファがインターフェロンアルファ−２であり、
    クエン酸緩衝溶液が５〜１００ｍＭのクエン酸を含み、
    糖アルコールが、液状製剤総量に対して１〜１０％（ｗ／ｖ）のマンニトールであり、
    非イオン性界面活性剤が、液状製剤総量に対して０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）のポロキサマー系非イオン性界面活性剤又はポリソルベート系非イオン性界面活性剤であり、
    等張化剤が、液状製剤総量に対して５〜２００ｍＭの塩化ナトリウムである、安定化方法。

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