KR20050099514A - 돌연변이된 뉴블라스틴의 중합체 컨주게이트 - Google Patents

돌연변이된 뉴블라스틴의 중합체 컨주게이트 Download PDF

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안토니 로소만도
라우라 실비안
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Abstract

중합체에 결합된 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 이량체가 공개된다. 이러한 이량체는 야생형의 뉴블라스틴에 비하여 연장된 생체이용률을 나타내며, 바람직한 구체예에서는 연장된 생물학적 활성을 나타낸다.

Description

돌연변이된 뉴블라스틴의 중합체 컨주게이트 {POLYMER CONJUGATES OF MUTATED NEUBLASTIN}
관련 출원의 교차 인용
본 출원은 2001년 2월 1일에 출원된 미합중국 가출원 제60/266,071호에 대한 우선권을 주장하여 2002년 1월 25일에 출원된 국제출원 제PCT/US02/02319호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 단백질 화학, 분자 생물학, 신경생물학, 신경학 및 통증 처치에 관한 것이다.
신경향성 인자(Neurotrophic factor)는 발생(development) 기간 동안 뉴런의 생존을 조절하고 성인 신경계의 적응성과 구조적 완전성을 조절하는 자연적으로 존재하는 단백질이다. 신경향성 인자는 신경조직 및 비-신경조직으로부터 분리될 수 있다. 지난 20년 동안, 많은 신경향성 인자들이 발견되었다. 이들 신경향성 인자들은 그들의 구조 및 기능에 기초하여 슈퍼패밀리, 패밀리, 서브패밀리 및 각각의 종(species)으로 분류될 수 있다.
신경향성 인자의 슈퍼패밀리는 섬유아세포 성장인자(FGF) 슈퍼패밀리, 뉴로트로핀 슈퍼패밀리 및 형질전환 성장인자-β(TGF-β) 슈퍼패밀리를 포함한다. 아교세포주(glial cell line)-유도 신경향성 인자(GDNF)-관련 리간드는 TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는 단백질 패밀리이다. GDNF-관련 리간드는 GDNF, 퍼세핀(persephin, PSP), 뉴르튜린(neurturin, NTN) 및 뉴블라스틴(neublastin, NBN; 아르테민(artemin) 또는 에노빈(enovin)으로 알려짐)을 포함한다. DNF-관련 리간드 패밀리의 멤버는 그들의 7개의 보존된 시스테인 잔기에 의하여 다른 것들과 구별된다. 이들 잔기는 분자내 및 분자간 디설파이드 브리지(disulfide bridge)를 형성하여 이량체화된 폴리펩티드 리간드의 3차 및 4차 구조를 초래한다. 상기 과의 멤버들은 또한 GFRα 패밀리의 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-고정된 공-수용체(co-receptor), GDNF-관련 리간드 서브패밀리의 멤버 및 RET 티로신 키나제 수용체로 이루어진 멀티컴포넌트 수용체 복합체를 통한 시그널링을 유도하는 능력을 공유한다.
활성화된 RET는 적어도 부분적으로는 GDNF-관련 리간드의 하부 효과들을 담당하는 신호 전달 캐스캐이드를 개시한다. 따라서, RET의 활성화는 하부 세포 과정에 영향을 미치기 위해 GFRα 수용체 경로를 통하여 작용하는 치료의 하나의 바람직한 측면을 나타낼 수 있다.
7개의 시스테인 모티프(예컨대, EP02/02691, PCT 공개공보 US02/02319 및 US02/06388)를 포함하여 다른 GDNF 리간드와 상동성을 갖는 영역을 공유하고, GFRα 복합체의 일부로서 RET 수용체에 결합하고 활성화시키는 능력 때문에 뉴블라스틴은 GDNF 패밀리에 속하는 것으로 분류된다. 특히, 뉴블라스틴은 GFRα3-RET 수용체 복합체와의 결합에 매우 선택적이다. 이러한 점에서, 뉴블라스틴은 GDNF-관련 리간드 패밀리의 다른 멤버와 비교하여 아미노산 서열에서 독특한 서브-영역을 포함한다.
현재 자료들은 뉴블라스틴이 말초 및 중추 신경계에서 보호 및 재생 역활을 할 수 있고 그 결과, 신경퇴행성 질병의 치료제로서 유용할 수 있다고 제시한다. 예컨대, 자료들은 뉴블라스틴이 배근 신경절(dorsal root ganglia) 및 3차 신경절(trigeminal ganglia)로부터 배양된 지각 뉴런 및 배양된 흑질 도파민성 뉴런(substantia nigra dopaminergic neurons)에 생존 증진 효과를 가질 수 있다고 제시한다(Baloh 등, Neuron 21: 1291-1302(1998)). 그러므로, 뉴블라스틴은 지각 및 도파민성 뉴런을 포함하는 뉴런 집단의 생존을 증진시킬 수 있는 것으로 보인다. 뉴런의 퇴행 및 기능장애가 질환 상태와 관련되었기 때문에 이러한 사실이 중요하다. 예컨데, 지각 및 도파민성 뉴런 병변이 각각 말초 신경병 및 파킨슨 질환의 기초가 된다.
그러므로, 뉴블라스틴의 투여는 예컨대, 뉴런의 퇴행 및 기능장애와 관련된 질환의 치료에 유용할 수 있다. 그러나, 뉴블라스틴은 체내에서 신속하게 소실되어서 치료적 적용에서 요구되는 뉴블라스틴 도징 파라다임(dosing paradigm)에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 개선된 생체 이용률을 갖는 변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 필요성이 존재한다. 따라서, 본 발명의 목적은 개선된 생체 이용률을 나타내는 뉴블라스틴의 변형된 형태를 동정하는 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은 중합체-컨주게이트된, 돌연변이된 뉴블라스틴 이량체를 제공한다. 각 이량체는 제1 아미노-말단 아미노산을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 아미노-말단 아미노산을 포함하는 제2 폴리펩티드를 함유한다. 각 폴리펩티드는 개별적으로 다음을 포함한다: (a)서열번호: 1의 아미노산 8-113과의 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 특징으로 하는 아미노산 서열; (b) (서열번호: 1에 따라서 번호를 붙일 때) 16, 43, 47, 80, 81, 109 및 111 위치의 각각에서 시스테인 잔기; (c) 다음과 같은 아미노산 잔기들: 위치 16에서 C, 위치 18에서 L, 위치 25에서 V, 위치 28에서 L, 위치 29에서 G, 위치 30에서 L, 위치 31에서 G, 위치 36에서 E, 위치 40에서 F, 위치 41에서 R, 위치 42에서 F, 위치 43에서 C, 위치 45에서 G, 위치 47에서 C, 위치 80에서 C, 위치 81에서 C, 위치 82에서 R, 위치 83에서 P, 위치 91에서 F, 위치 93에서 D, 위치 105에서 S, 위치 106에서 A, 위치 109에서 C 및 위치 111에서 C; 및 (d) LGLG 리피트(repeat), FRFC 모티프, QPCCRP 모티프 및 SATACGC 모티프. 이량체는 적어도 하나의 아미노산 치환(서열번호: 1에 대하여)을 포함하여, 중합체가 컨주게이트된 자리에 내부 중합체 컨주게이션 자리를 제공한다.
본 발명은 또한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 중합체-컨주게이트된, 돌연변이된 뉴블라스틴 이량체를 제공하는데, 여기서 각 폴리펩티드는 1-6 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 6의 90-140, 예컨대, 95-120 또는 100-110 아미노산을 포함하고, 각 치환은 폴리머가 컨주게이트된 자리에 중합체 컨주게이션 자리를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드의 구체적인 예들은 NBN113(서열번호: 2), NBN140(서열번호: 6), NBN116(서열번호: 7), NBN112(서열번호: 8), NBN111(서열번호: 9), NBN110(서열번호: 10), NBN109(SEQID NO : 11), NBN108(서열번호: 12), NBN107(서열번호: 13), NBN106(서열번호: 14), NBN105(서열번호 : 15), NBN104(서열번호: 16), NBN103(서열번호: 17), NBN102(서열번호: 18), NBN101 (서열번호: 19), NBN100 (서열번호: 20) 및 NBN99 (서열번호: 21)을 포함한다.
바람직하게는, 이량체에서 2개의 아미노-말단 아미노산 중 적어도 하나 이상이 중합체에 컨주게이트된다. 바람직한 아미노산 치환은 라이신 잔기로 아르기닌 잔기의 교체(Raa#K ; 여기서 aa#은 서열번호: 1에 기초한 아미노산 번호이다) 및 라이신 잔기(Naa#K) 또는 아스파테이트 잔기(Naa#D)로 아스파라긴 잔기의 교체이다. 이러한 치환의 구체적인 예들은 R14K, R39K, R68K, N95D 및 N95K (서열번호: 1에 기초하여 번호매길 때)이다. 특히 바람직한 치환은 N95K이다.
바람직하게는, 이량체에서 중함체의 전체 결합된 분자량은 20,000-40,000Da이다. 바람직하게는, 각 중합체의 평균 분자량은 2,000-100,000Da이고; 보다 바람직하게는, 5,000-50,000Da이고; 가장 바람직하게는, 10,000 내지 20,000Da이다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다. 바람직하게는, 중합체가 폴리알킬렌 글리콜 부분, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분이다. 일부 구체예에서, 1 이상의 폴리펩티드가 당화된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 중합체-컨주게이트된 이량체는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는데, 여기에서: (a) 각 폴리펩티드는 각각 서열번호:1의l 100 내지 110 아미노산을 포함하고, (b) 각 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 번호 95에서 아스파라긴에서 라이신으로의 치환을 포함하고, (c) 이량체는 각 PEG 부분의 분자량이 약 10,000Da이고, 각 PEG 부분이 아미노-말단 또는 라이신 95에서 컨주게이트된, 3 또는 4 PEG 부분을 포함한다. 바람직한 구체예는 3 (,4) x 10 kDa PEG NBN106-N95K로 나타내어지는 한 쌍의 모노머를 포함하는 동종이량체이다.
본 발명은 본 발명에 따른 이량체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 2 또는 그 이상의 상이한 본 발명에 따른 이량체를 포함한다.
본 발명은 핵산, 예컨대, 본 발명의 이량체로 편입되기 위한 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 발현 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 핵산으로 형질전환된 호스트 세포를 포함한다.
본 발명은 포유류에서 신경병적 통증을 치료하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 이량체를 포유류에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료적으로 유효한 양은 0.1μg/kg 내지 1000μg/kg, 1μg/kg 내지 l00μg/kg, 또는 1μg/kg 내지 30μg/kg이다. 이량체는 예컨대, 근육 내, 피하 또는 정맥 내와 같이 다양한 경로에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 일부 방법에서, 이량체는 1주에 3회 투여된다. 본 발명은 또한 포유류에서 RET 수용체를 활성화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이량체의 유효량을 포유류에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 특성 및 잇점은 하기 상세한 설명 및 청구항에 의하여 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 야생형 NBN113와 비교하여 3, (4)X10K PEG화된 NBN106-N95K의 KIRA ELISA 분석으로부터 얻은 자료를 요약하는 스캐터 플롯(scatter plot)이다.
도 2는 야생형 NBN113와 비교하여 3X10K PEG화된 NBN106-N95K 및 4X10K PEG화된 NBN106-N95K의 KIRA ELISA 분석으로부터 얻은 자료를 요약하는 스캐터 플롯이다. 도 3은 척수 신경 결찰을 갖는 랫트에서 3x10K PEG화된 NBN106-N95K 및 4xlOK PEG화된 NBN106-N95K의 혼합물 (즉 ,"3 (,4)x 10kDa PEG NBN106-N95K") 10μg/kg에 의한 충분하게 확립된 촉각성 이질통(tactile allodynia)의 거의 완전한 역전을 나타내는 파선(broken line) 플롯이다.
도 4는 척수 신경 결찰을 갖는 랫트에서 10μg/kg의 3 (,4)x 10kDa PEG화된 NBN106-N95K에 의한 충분하게 확립된 온도 통각과민(thermal hyperalgesia)의 거의 완전한 역전을 나타내는 파선 플롯이다.
발명의 상세한 설명
달리 기재되지 않으면, 뉴블라스틴 아미노산 위치 번호에 대한 모든 참조는 서열번호: 1에 나타낸 번호 매김을 참조할 것이다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 평가에 사용될 수 있다고 하더라도, 적절한 방법 및 재료는 하기에 기재한 바와 같다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참조 문헌은 전체로서 참조 문헌으로 편입된다. 충돌되는 경우, 정의(definitions)를 포함하는 본 명세서가 이를 조절할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예들은 단지 예시적인 것이고 제한적으로 의도된 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는, "야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드"는 자연적으로 존재하는 뉴블라스틴 폴리펩티드 서열을 의미한다. 야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 예컨대, 인간, 마우스 또는 랫트 뉴블라스틴(예컨대, 서열번호: 2, 3 또는 4 참조)과 같이, 뉴블라스틴의 공급원에 의하여 보다 한정될 수 있다. 컨센서스 뉴블라스틴 폴리펩티드 서열은 서열번호: 1로 제공된다.
본 명세서에서 사용되는, "돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드"는 야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드에 대하여 적어도 특정 최소 수준의 서열 동일성을 포함하고, 야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드에 대하여 1 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 융합을 포함하고, 뉴블라스틴 활성(예컨대, 국제출원 제PCT/US02/02319호(WO 02/060929)에 기재된 바와 같이)을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, "내부 중합체 컨주게이션 자리는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드에서 비-말단 아미노산 잔기를 의미하는데, 이러한 잔기는 중합체의 컨주게이션에 적합한 측쇄를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는, "변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드"는 1 이상의 부착된 중합체를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, "융합"은 동일한 리딩 프레임(reading frame)에서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자의 유전적 발현을 통하여, 각각의 펩티드 골격(backbones)을 통하여 2이상의 폴리펩티드가 함께 선형을 이루고, 공유결합된 연결을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, "동일성"은 두 개의 폴리펩티드, 분자들 또는 두개의 핵산 간의 서열 유사성을 가리킨다. 두 개의 비교된 서열 모두에서 하나의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 모노머 서브유닛에 의하여 점유될 때(예를 들면, 두 개의 DNA 분자의 각각에서 한 위치가 아데닌에 의하여 점유되거나, 또는 두 개의 폴리펩티드 각각에서 한 위치가 라이신에 의하여 점유된다면), 각 분자는 그 위치에서 상동성을 갖는다. 두 개의 서열 간의 "동일성 비율(percentage identity)"은 두 서열에 의하여 공유되는 서로 일치하는 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누어 100을 곱한 함수이다. 예컨대, 두 서열에서 10개의 위치 중 6개가 서로 일치된다면, 두 서열은 60% 동일성을 갖는다. 예를 들어, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTT는 50% 상동성을 공유한다(전체 6위치 중에서 3개가 서로 일치된다). 일반적으로, 두 서열이 최대 상동성을 나타내도록 배열된 상태에서 비교가 이루어진다. 이러한 배열은 편리하게 얼라인 프로그램(Align program(DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램이 갖춰진, 예컨대, 니들만 등(Needleman 등, J. Mol Biol. 48:443-453(1970))의 방법을 사용하여 제공될 수 있다. "유사한" 서열은, 배열되었을 때, 동일 또는 유사한 아미노산 잔기를 공유하는 서열로서, 여기에서 유사한 잔기는, 배열된 참조 서열에서 대응 아미노산 잔기의 "허용된 점 돌연변이(allowed point mutations)" 또는 보존적인 치환(conservative substitution)이다. 이 점에서, 참조 서열에서 잔기의 "보존적 치환"은 예컨대, 공유 결합 또는 수소결합을 형성하는 능력을 포함하여 유사한 크기, 모양, 전기적 전하, 화학적 특성 등을 갖는, 대응 참조 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 잔기에 의한 치환이다. 따라서, "보존적 치환으로 돌연변이된" 서열은 1 이상의 보존적 치환 또는 허용된 점 돌연변이가 존재한다는 점에서 참조 서열 또는 야생형 서열과 상이한 서열이다. 두 서열 간의 "포지티브 비율(percentage positive)"는 두 서열에 의하여 공유된 서로 일치하는 잔기 또는 보존적 치환을 포함하는 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누어 100을 곱한 함수이다. 예컨대, 두 서열의 10개의 위치 중 6개가 서로 일치되고 10개의 위치 중 2개의 위치가 보존적 치환을 포함한다면, 두 서열은 80%의 포지티브 상동성을 갖는다.
돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드
본 발명의 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 신경향성 활성을 보유하고, 야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드와 비교하였을 때 개선된 생체이용률을 갖는다. 예컨대, 본 발명의 돌연변이된 뉴블라스틴은 야생형 뉴블라스틴이 RET를 활성화시키는 에세이에서 RET 유전자 산물을 활성화시킨다. 일반적으로, 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 하기 특성 중 1 이상을 보유할 것이나, 추가적으로 1이상의 변형을 포함하여 내부 중합체 컨주게이션 자리가 생성될 것이다:
(i) 서열번호: 1-4에 따라서 번호매겨질 때, 위치 16, 43, 47, 80, 81,109 및 111에서의 7개의 보존된 시스테인 잔기;
(ii) 다음의 아미노산 잔기:
서열번호: 1-4에 따라서 번호매겨졌을 때 각각, 위치 16에서의 C, 위치 18에서의 L, 위치 25에서의 V, 위치 28에서의 L, 위치 29에서의 G, 위치 30에서의 L, 위치 31에서의 G, 위치 36에서의 E, 위치 40에서의 F, 위치 41에서의 R, 위치 42에서의 F, 위치 43에서의 C, 위치 45에서의 G, 위치 47에서의 C, 위치 80에서의 C, 위치 81에서의 C, 위치 82에서의 R, 위치 83에서의 P, 위치 91에서의 F, 위치 93에서의 D, 위치 105에서의 S, 위치 106에서의 A, 위치 109에서의 C 및 위치 111에서의 C;
(iii) LGLG 리피트, FRFC 모티프, QPCCRP 모티프 및 SATACGC 모티프.
일부 구체예에서, 본 발명은 절두되고 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서 절두된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노 말단에서 성숙한 뉴블라스틴 폴리펩티드의 1 이상의 아미노-말단 아미노산이 결여되지만 돌연변이되어서 내부 중합체 부착을 갖는다. 바람직하게는, 절두되고 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드가 이량체화될 때, RET 폴리펩티드를 활성화시킨다. 일부 구체예에서, 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 RET 폴리펩티드의 이량체화를 유도한다. 당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 이러한 유도는 추가적인 폴리펩티드 또는 공-인자(co-factors)를 요구할 수 있다.
인간 및 마우스 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열은 PCT 공개공보 WO 00/01815에 개시된 바와 같다. 본 발명에 따른 야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 예들이 표 1A에 제시된다. 뉴블라스틴 컨센서스 서열(인간, 마우스 및 랫트에 대한 컨센서스)이 표 1B에 제시된다.
일부 구체예에서, 표 1A에서 볼드체로 나타낸 1 이상의 아르기닌 (Arg or R) 또는 아스파라긴(Asn or N) 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 바람직한 구체예에서, 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 표 1A에서 별표로 표시된 아미노산 위치 95에서 아스파라긴을 치환한 라이신(Lys or K) 잔기를 가지고, NBN-N95K로 지칭된다. 일반적으로, N95K 치환은 수용성을 향상시킨다. 이는 고농도에서의 제제화를 용이하게 한다.
표 1B. NBN113 컨센서스 서열
컨세서스 서열 : (서열번호: 1) Ala Gly Xaal Xaa2 Xaa3 Ser Arg Ala Arg Xaa4 Xaa5 Xaa6 Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Xaa7 Ala Leu Gly Leu Gly His Xaa8 Ser Asp Glu Leu Xaa9 Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser XaalO His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Xaall Pro Pro Gly Ser Arg Pro Xaal2 Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Xaal3 Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly여기에서:
Xaa1은 글리신(Gly) 또는 트레오닌(Thr)이다 Xaa6는 글리신(Gly) 또는 아스파르트산(Asp)이다 Xaa11은 프롤린(Pro) 또는 세린(Ser)이다
Xaa2는 프롤린(Pro) 또는 아르기닌(Arg)이다 Xaa7은 아르기닌(Arg) 또는 세린(Ser)이다 Xaa12는 발린(Val) 또는 이소류신(Ile)이다
Xaa3은 글리신(Gly) 또는 세린(Ser)이다 Xaa8은 아르기닌(Arg) 또는 세린(Ser)이다 Xaa13은 아르기닌(Arg) 또는 히스티딘(His)이다
Xaa4는 알라닌(Ala) 또는 트레오닌(Thr)이다 Xaa9는 발린(Val) 또는 이소류신(Ile)이다
Xaa5는 알라닌(Ala) 또는 트레오닌(Thr)이다. Xaa10은 프롤린(Pro) 또는 글루타민(Gln)이다
본 발명은 예컨대, 서열번호: 1의 아미노산 8-113(표 1에서도 도시된)과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 중합체-컨주게이트되고 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 구체예에서는, 위치 14, 위치 39, 위치68에서 1 이상의 아르기닌 또는 위치 95에서 아스파라긴이 아르기닌 또는 아스파라긴 이외의 아미노산으로 교체된다. 하나의 구체예에서는, 야생형 아미노산이 라이신 또는 시스테인으로 치환된다.
돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드에서 치환되는 잔기는 치환된 아미노산에서 예컨대, 폴리알킬렌 글리콜 중합체와 같이 중합체의 커플링을 용이하게 하도록 선택될 수 있다. 변형의 유리한 자리는 뉴블라스틴 폴리펩티드에서 용매가 접근가능한 영역에서의 자리이다. 이러한 자리는 아이겐브로트 등(Eigenbrot 등, Nat. Struct. Biol. 4:435-38, 1997)에 결정 구조가 기재되어 있는, GDNF와 같은 관련된 신경향성 인자의 결정 구조의 조사에 기초하여 선택될 수 있다. 또한, 결정화와 구조 결정을 이하에서 기재하는, 뉴블라스틴의 결정 구조에 기초하여 이러한 자리들이 선택될 수 있다. 또한, 자리들은 퍼세핀/뉴블라스틴 키메릭 단백질을 위하여 제공된 구조적-기능적인 정보에 기초하여 선택될 수 있다. 이들 키메라(chimera)는 발로 등(Baloh 등, J. Biol. Chem. 275:3412-20, 2000)에 기재되어 있다. 이러한 방법론을 통하여 동정된, 용매 접근가능한 또는 표면 노출된 뉴블라스틴 아미노산의 예시적 목록은 표 2에 제시된다.
표 2는 인간 뉴블라스틴에서 표면에 노출된 것으로 예측되는 잔기의 목록 및 수를 제공한다. 첫번째 컬럼은 사슬 A 및 B(PDB 코드 1AGQ)에 의하여 형성된 랫트 GDNF 이량체의 구조를 조사하고 잔기가 구조의 표면에 있는지 여부를 확인하여 결정된 표면 노출된 잔기를 가리킨다. 그 다음, 이러한 구조는 뉴블라스틴에서 적절한 잔기를 결정하기 위하여 Baloh 등, Neuron 21: 1291-1302, 1998의 뉴블라스틴 및 GDNF의 서열 배열과 비교되었다. 두번째 및 세번째 컬럼은 각각, 사슬 A 및 B에 의하여 형성된 인간 뉴블라스틴 이량체의 구조를 조사함으로써 결정된, 표면 노출된 잔기를 가리킨다. 표 2에서 번호매기는 스킴(scheme)은 표 1에 나타낸 것이다.
n은 GDNF 또는 뉴블라스틴의 구조에 잔기들이 존재하지 않음을 가리킨다. 이는 GDNF와 비교하여 뉴블라스틴에서의 컨스트럭트 디자인(construct design), 유연성 영역(flexible region) 또는 인서트(inserts) 때문이다(잔기 68-71).
-은 잔기가 묻혀 있고 표면에 있지 않거나 디설파이드 결합과 관련된 시스테인 잔기임을 가리킨다. 이러한 단백질은 시스테인 노트(knot)이기 때문에 잔기의 거의 대부분이 표면에 있다.
+는 잔기 66-75를 포함하는 루프가 단지 GDNF 모노머 중 하나(아마도 유연성)에서만 가시적임에도 불구하고, 이러한 잔기가 GDNF 구조 또는 뉴블라스틴 구조에서 표면에 노출되어 있음을 가리킨다. 이러한 루프는 또한 GDNF와 비교하여 뉴블라스틴에서 4 잔기 인서트를 포함한다.
일부 구체예에서, 뉴블라스틴 폴리펩티드는 GDNF 서브패밀리 및 TGF-베타 슈퍼패밀리의 특징인 7개의 보존된 시스테인 잔기를 보유한다.
인간 전장 프리프로(prepro) NBN 폴리펩티드(서열번호: 5)의 서열을 동정하였다. 이들 형태는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호: 6로 지칭된 아미노산 서열을 갖는 본 명세서에서 NBN140으로 지칭된 140AA 폴리펩티드;
(ii) 서열번호: 7로 지칭된 아미노산 서열을 갖는 본 명세서에서 NBN116으로 지칭된 116AA 폴리펩티드;
(iii) 서열번호: 2로 지칭된 아미노산 서열을 갖는 본 명세서에서 NBN113으로 지칭된 113AA 폴리펩티드.
표 3은 본 발명의 개시된 프리프로 뉴블라스틴 폴리펩티드 서열 간의 관계를 나타낸다. 라인 1은 서열번호: 5의 폴리펩티드를 제공하고, 라인: 2는 서열번호: 6의 폴리펩티드를 제공하고, 라인 3은 서열번호: 7의 폴리펩티드를 제공하고, 라인 4는 서열번호: 2의 폴리펩티드를 제공한다. 7개의 보존된 시스테인 잔기는 성숙한 이량체화된 뉴블라스틴 리간드에서 형성된 분자내(*와 함께 *, #와 함께 #, 및 +와 함께 +) 및 분자간("│") 디설파이드 브리지를 나타내기 위하여, 기호들("*", "#", "+" 및 "│")로 나타낸다. 탈자 기호("^")는 NBN106-N95K에서 라이신으로 치환된 아미노산 위치 95에서 아스파라긴 잔기를 나타낸다.
대안의 구체예에서, 상기 동정된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 서열은 그들의 아미노-말단 아미노산 서열에서 절두되었다. 이들의 예는 다음을 포함한다:
(iv) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 29-140(서열번호: 8) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 2-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 112 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN112로 지칭되는 112AA 폴리펩티드 서열.
(v) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 30-140(서열번호: 9) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 3-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 111 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN111로 지칭되는 111AA 폴리펩티드 서열.
(vi) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 31-140(서열번호: 10) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 4-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 110 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN110로 지칭되는 110AA 폴리펩티드 서열.
(vii) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 32-140(서열번호: 11) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 5-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 109 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN109로 지칭되는 109AA 폴리펩티드 서열.
(viii) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 33-140(서열번호: 12) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 6-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 108 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN108로 지칭되는 108AA 폴리펩티드 서열.
(ix) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 34-140(서열번호: 13) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 7-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 107 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN107로 지칭되는 107AA 폴리펩티드 서열.
(x) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 35-140(서열번호: 14) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 8-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 106 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN106 또는 N-7 중 양자택일하여 지칭되는 106AA 폴리펩티드 서열.
(xi) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 36-140(서열번호: 15) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 9-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 105 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN105로 지칭되는 105AA 폴리펩티드 서열.
(xii) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 37-140(서열번호: 16) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 10-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 104 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN104 또는 N-9 중 양자택일하여 지칭되는 104AA 폴리펩티드 서열.
(xiii) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 38-140(서열번호: 17) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 11-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 103 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN103로 지칭되는 103AA 폴리펩티드 서열.
(xiv) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 39-140(서열번호: 18) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 12-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 102 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN102로 지칭되는 102AA 폴리펩티드 서열.
(xv) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 40-140(서열번호: 19) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 13-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 101 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN101로 지칭되는 101AA 폴리펩티드 서열.
(xvi) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 41-140(서열번호: 20) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 14-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 100 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN100로 지칭되는 100AA 폴리펩티드 서열.
(xvii) 예컨대, 서열번호: 6의 아미노산 42-140(서열번호: 21) 또는 서열번호: 1, 3 또는 4의 아미노산 15-113과 같은, 뉴블라스틴 폴리펩티드의 99 카르복시 말단 아미노산을 갖는, 본 명세서에서 NBN99 또는 N-14 중 양자택일하여 지칭되는 99AA 폴리펩티드 서열.
이들 절두된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열을 NBN113에서 NBN99에 걸쳐서 표 4에 나타낸다. 디설파이드 브리지 형성은 표 3에 기재한 바와 같다.
본 발명에 따른 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 예컨대, 서열번호: 1의 아미노산 8-113과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열은 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 1-94 및 96-113에서 자연적으로 존재하는 랫트, 인간 또는 마우스 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는데, 예컨대 폴리펩티드는 이들 위치에서 서열번호: 2,3 또는 4의 아미노산 서열을 갖는다.
서열번호:1-4에 개시된 것들과 서열이 상이한 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드가 하나 이상의 보존적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 대안으로서 또는 부가하여, 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 하나 이상의 비-보존적인 아미노산 치환, 또는 결실 또는 삽입에 의하여 상이할 수 있다. 바람직하게는, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 분리된 단백질의 생물학적 활성을 제거하지 않는다.
보존적인 치환은 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 하나의 아미노산을 치환하는 것이다. 보존적 치환은 다음의 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 발린, 알라닌 및 글리신; 류신, 발린 및 이소류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 시스테인 및 트레오닌; 라이신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 비-극성 소수성 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 전하를 띈(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띈(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 상기 극성, 염기성 또는 산성 그룹 중 하나의 멤버가 동일한 그룹 중의 또 다른 멤버에 의하여 치환된 것을 보존적 치환으로 볼 수 있다.
다른 치환들이 당업자에 의하여 용이하게 확인될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 알라닌을 위하여, D-알라닌, 글리신, 베타-알라닌, 시스테인 및 D-시스테인으로부터의 치환이 취해질 수 있다. 라이신을 위하여 D-라이신, 아르기닌, D-아르기닌, 호모-아르기닌, 메티오닌, D-메티오닌, 오르니틴 또는 D-오르니틴 중 어느 하나로 교체할 수 있다. 일반적으로, 분리된 폴리펩티드의 특성 변화를 유도할 것으로 예측될 수 있는, 기능적으로 중요한 영역에서의 치환은: (i) 극성 잔기, 예컨대, 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예컨대 류신, 이소류신, 페닐알라닌 또는 알라닌으로 치환; (ii) 시스테인 잔기가 다른 잔기로 치환; (iii)전기적 양성인 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘을 전기적 음성인 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대, 글루탐산 또는 아스파르트 산으로 치환; 또는 (iv)거대한 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대, 페닐알라닌을 그러한 측쇄를 갖지 않는 것, 예컨대, 글리신으로 치환하는 것이다. 상기 비-보존적 치환 중 하나가 단백질의 기능적 특성을 변화시킬 수 있는 가능성은 또한 단백질의 기능적으로 중요한 영역에 대한 치환의 위치와 상관관계가 있다. 따라서, 일부 비-보존적 치환은 생물학적 특성에 대한 영향이 거의 없거나 없을 수 있다.
많은 경우, 중합체-컨주게이트되고 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드 또는 중합체가 없이 돌연변이된 폴리펩티드의 반감기에 비하여 보다 긴 혈청 반감기를 갖는다. 일부 구체예에서, 중합체 컨주게이트되고 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 중합체가 없는 폴리펩티드 또는 당화된-폴리펩티드의 효능에 비하여 생체 내에서 유의적으로 증가된 효능을 갖는다.
중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 1 이상의 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 이량체로서 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 이량체는 중합체-컨주게이트된 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 동종이량체이다. 다른 구체예에서, 이량체는 중합체-컨주게이트되고 돌연변이된 절두된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 동종이량체이다. 다른 구체예에서, 이량체는 하나의 중합체- 컨주게이트된 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드와 하나의 야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체(heterodimer)이다. 다른 구체예에서, 이량체 는 하나의 중합체-컨주게이트된 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드 및 하나의 중합체-컨주게이트된 야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체인데, 중합체 컨주게이션이 아미노-말단에 있고 폴리펩티드는 절두되거나 절두되지 않을 수 있다. 다른 이량체는 절두되거나 절두되지 않을 수 있는, 중합체-컨주게이트되고 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드 형태의 동종이량체 또는 이종이량체를 포함한다.
본 발명에서는, 서열번호: 5에서 제공된 것처럼, 프리프로NBN 폴리펩티드의 카르복시-말단의 대부분의 아미노산 잔기를 포함하는 성숙한 절두되고 돌연변이된 폴리펩티드 서열이 제공되는데, 본 명세서에서는 NBN#와 같이 지칭되며, 여기서 #는 참조된 뉴블라스틴 폴리펩티드에 남아 있는 카르복시-말단 잔기의 수를 나타낸다. 생체활성 뉴블라스틴 이량체에 존재하는 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 단백질 분해효소 절단 반응 또는 화학적 절단반응의 산물일 수 있거나 재조합 DNA 컨스트럭트로부터 발현될 수 있거나 합성될 수 있다. 뉴블라스틴 폴리펩티드의 예는 예컨대, NBN140, NBN116 및 NBN113을 포함한다. 본 발명의 추가적인 뉴블라스틴 폴리펩티드는 NBN112, NBNlll, NBN110, NBN109, NBN108, NBN107, NBN106, NBN105, NBN104, NBN103, NBN102, NBN101, NBN100 및 NBN99(서열번호: 8-21)를 포함한다.
바람직한 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 3개의 10kDa PEG 부분 ("3x10 kDa PEGNBN106-N95K") 또는 4개의 10kDa PEG 부분("4x10 kDa PEG NBN106-N95K")중 어느 하나에 컨주게이트된 NBN106-N95K의 동종이량체이다. 또한, "3 (,4)x10 kDa PEG NBN106-N95K"로 지칭되는, 3개의 10kDa PEG 부분 또는 4개의 10kDa PEG 부분 중 어느 하나에 컨주게이트된 NBN106-N95K의 혼합 집단도 바람직하다. 또한, 두개의 아미노-말단 아미노산이 PEG 부분과 공유결합되고 제3 및/또는 제4 PEG 부분이 하나 또는 양쪽의 치환된 N95K 잔기에 공유결합된, 3 (,4)x10 kDa PEG NBN106-N95K 동종이량체도 바람직하다.
일부 구체예에서, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 서열번호: 1의 컨센서스 서열에 기초한다. 특정 구체예에서, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 아미노산 8-113에 더하여, 서열번호 1의 아미노산 1-7을 포함한다.
일부 구체예에서, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 이량체화될 때, GFRα3과 결합한다. 일부 구체예에서, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 이량체화될 때, 스스로 또는 GFRα3에 결합되어서 RET 폴리펩티드의 티로신 인산화를 자극한다.
일부 구체예에서, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는, 이량체화될 때, 예컨대, 지각 뉴런의 생존을 증가시키는 것과 같이, 뉴런의 생존을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는, 이량체화될 때, 지각 뉴런과 같은 뉴런의 병리학적 변화를 감소 또는 역전시킨다.
일부 구체예에서, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는, 이량체화될 때, 예컨대, 자율적 뉴런 또는 도파민성 뉴런과 같은, 뉴런의 생존을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 14에서 아르기닌 이외의 아미노산, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 39에서 아르기닌 이외의 아미노산, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 68에서 아르기닌 이외의 아미노산, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 95에서 아스파라긴 이외의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2, 3, 4 또는 그 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 위치 14, 39, 68 및 95의 1 이상의 아미노산에서 아미노산은 라이신이다. 바람직하게는, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 8-94 및 96-113는 서열번호: 1의 아미노산 8-94 및 96-113과 적어도 90% 이상 동일하다. 보다 바람직하게는, 아미노산 서열이 적어도 95% 이상 동일하다. 가장 바람직하게는, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열은 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 8-94 및 96-113에서 자연적으로 존재하는 인간, 마우스 또는 랫트 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 예컨대, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 8-94 및 96-113는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 아미노산 8-94 및 96-113을 포함할 수 있다. 상기 구체예에서, 아미노산 위치 95에서의 바람직한 잔기는 라이신 또는 시스테인이다.
본 발명은 예컨대, 서열번호: 36에서 제공된 폴리히스티딘(His)-태깅된 뉴블라스틴 또는 융합 부분이 면역글로불린(Ig) 폴리펩티드, 혈청 알부민 폴리펩티드 또는 레플리카제(replicase)-유도된 폴리펩티드인 뉴블라스틴 융합 단백질과 같은 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 융합 단백질을 포함하는 동종이량체 또는 이종이량체인 컨스트럭트를 포함한다. 뉴블라스틴 융합 단백질은 생체 내에서 향상된 약동학적 및 생체이용률 특성을 갖는다.
본 발명은 돌연변이된 폴리펩티드 서열을 갖고, 성숙한 또는 절두된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 제공된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 바람직하게는, 벡터, 예컨대, 발현 벡터에서 제공된다. 돌연변이된 뉴블라스틴 핵산 분자 또는 이를 포함하는 벡터는 세포에서 제공될 수 있다. 세포는 예컨대, 포유류 세포, 진균 세포, 이스트 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포일 수 있다. 바람직한 포유류 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포("CHO cell")이다.
또한, 본 발명은 뉴블라스틴 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 뉴블라스틴 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양함으로써, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 뉴블라스틴은 자연적으로 존재하는 부분에 컨주게이트된다. 특정한 구체예에서, 자연적으로 존재하는 부분은 당화 부분이다. 어떤 구체예에서, 당화된 뉴블라스틴은, 예컨대, CHO 세포에서 발현된다. 본 발명은 또한, 세포에서 발현된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함한다. 유사한 핵산, 벡터, 호스트 세포 및 폴리펩티드 생산 방법이 본 발명의 융합 단백질(뉴블라스틴-혈청 알부민 융합 단백질과 같은)을 위하여 본 명세서에 개시된다.
일부 구체예에서, 세포에서 발현된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 회수되고 중합체에 컨주게이트된다. 일부 구체예에서, 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분이다. 특정 구체예에서, 중합체는 PEG 부분이다.
구체적으로, 본 발명은 비-자연적으로 존재하는 중합체에 커플링된 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드가, 아미노산의 위치를 서열번호:1의 폴리펩티드 서열에 따라서 번호매길 때, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 14에서 아르기닌 이외의 아미노산, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 39에서 아르기닌 이외의 아미노산, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 68에서 아르기닌 이외의 아미노산, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 95에서 아스파라긴 이외의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환 중 1 이상을 포함한다면, 조성물에서 돌연변이된 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호: 1의 아미노산 8-113과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드가 PEG 부분에 불안정한 결합에 의하여 커플링되는, PEG 부분에 커플링된 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는, 안정하고 수용성인 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 일부 구체예에서, 불안정한 결합은 생화학적 가수분해, 단백질분해(proteolysis) 또는 설프히드릴(sulfhydryl) 절단에 의하여 절단될 수 있다. 일부 구체예에서, 불안정한 결합은 생체내 조건 하에서 절단될 수 있다.
또한, 본 발명은, 야생형 뉴블라스틴에 비하여 연장된 혈청 반감기를 갖는, 변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 제공하는 단계, 폴리펩티드 또는 변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 비-자연적으로 존재하는 중합체 부분에 커플링시키는 단계, 이에 의하여 커플링된 중합체 뉴블라스틴 폴리펩티드 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 중합체-컨주게이트된 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 예컨대, 아미노산의 위치를 서열번호:1의 폴리펩티드 서열에 따라서 번호매길 때, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 14에서 아르기닌 이외의 아미노산, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 39에서 아르기닌 이외의 아미노산, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 68에서 아르기닌 이외의 아미노산, 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 95에서 아스파라긴 이외의 아미노산인, 1 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
야생형 및 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 합성 및 분리
뉴블라스틴 폴리펩티드는 공지의 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 자연적으로 존재하는 뉴블라스틴 폴리펩티드는 표준적인 단백질 정제 테크닉을 사용하여 적절한 정제 스킴에 의하여 세포 또는 조직의 공급원으로부터 분리될 수 있다. 대안으로서, 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 표준적인 펩티드 합성 테크닉을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 짧은 아미노산 서열의 합성은 펩티드 분야에서 잘 확립되어 있다(예컨대, Stewart, 등, Solid Phase Peptide Synthesis(2d ed., 1984) 참조).
일부 구체예에서, 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 재조합 DNA 테크닉에 의하여 생산된다. 예컨대, 변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 벡터, 예컨대, 발현벡터로 삽입될 수 있고, 핵산은 세포로 도입될 수 있다. 적절한 세포는 예컨대, 포유류 세포(인간세포 또는 CHO 세포와 같은), 진균 세포, 이스트 세포, 곤충 세포 및 박테리아 세포를 포함한다. 재조합 세포에서 발현되었을 때, 세포는 바람직하게는, 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양된다. 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 원한다면 세포 현탁액으로부터 회수될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "회수된"은 돌연변이된 폴리펩티드가 회수 공정 이전에 존재하고 있는 세포 또는 배양 배지의 구성성분들로부터 제거된다는 것을 의미한다. 회수 공정은 1 이상의 재접힘(refolding) 또는 정제 단계를 포함할 수 있다.
돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 공지된 다수의 방법 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있다. 그러한 하나의 방법은, 암호화된 뉴블라스틴 폴리펩티드에서 단일 아미노산(또는 원한다면 소수의 미리 결정된 아미노산 잔기들)을 변화시키기 위하여 특정 뉴클레오티드(또는 원한다면 소수의 특정 뉴클레오티드들)이 변화되는, 특정 부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)이다. 당업자는 특정 부위 돌연변이유발이 일상적이고 널리 사용되는 테크닉임을 인지한다. 사실, 많은 특정 부위 돌연변이유발 키트가 상업적으로 시판되고 있다. 그러한 하나의 키트는 클론테크 래보라토리즈(팔로 알토, 캘리포니아)에서 판매하는 "트랜스포머 사이트 디렉티드 뮤타제네시스 키트(Transformer Site Directed Mutagenesis Kit)"이다.
달리 지시되지 않으면, 본 발명의 실시는 당업계의 기술에 속하는, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 단백질 화학 및 면역학의 종래의 테크닉을 이용할 것이다. 그러한 테크닉은 문헌에 기재되어 있다. 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition.(Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II(D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; 미국 특허 제4,683, 195호(Mullis 등,) ; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Haines and S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc. , 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning(13. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu 등, eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochernical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, VolumesI-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
뉴블라스틴 폴리펩티드의 중합체 컨주게이션
본 명세서의 개시내용에 기초하여 화학적으로 변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드가 당업자에 의하여 제조될 수 있다. 뉴블라스틴 폴리펩티드와의 컨주게이션에 바람직한 화학적 부분은 수용성 중합체이다. 수용성 중합체는 부착되는 단백질이 생리적 환경과 같은 수성 환경에서 침전되지 않기 때문에 유리하다. 바람직하게는, 중합체는 치료적 제품 또는 조성물의 제조를 위하여 약제학적으로 허용가능할 것이다.
1 이상의 중합체 분자가 또한 부착될 수 있지만, 원한다면, 단일 중합체 분자가 뉴블라스틴 폴리펩티드와의 컨주게이션을 위하여 이용될 수 있다. 본 발명의 컨주게이트된 뉴블라스틴 조성물은 비-생체내 적용 뿐만 아니라 생체 내에서도 유용성을 찾을 수 있을 것이다. 추가로, 컨주게이트하는 중합체는 최종 사용 용도에 적합하게 다른 임의의 그룹, 부분 또는 다른 컨주게이트된 종들을 이용할 수 있음을 알 것이다. 예로서, 일부 용도에서는 중합체에 UV-분해 내성 또는 항산화성 또는 다른 특성 또는 특징을 부여하는 기능적 부분을 공유결합시키는 것이 유용할 수 있다. 또 다른 예로서, 일부 용도에서는 전체 컨주게이트된 물질의 다양한 특성 또는 특징을 증가시키도록 중합체에 반응성 또는 가교가능한 특성을 부여하여 중합체를 기능화하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 중합체는 의도된 목적을 위한 컨주게이트된 뉴블라스틴 조성물의 효능을 배제하지 않는, 임의의 기능성, 반복 그룹, 연결들 또는 다른 구성적 구조를 포함할 수 있다.
당업자는 중합체/단백질 컨주게이트가 치료적으로 사용될 것인지 여부에 대한 고려, 만약 그렇다면, 소정의 용량, 순환 시간, 단백질분해에 대한 내성 및 다른 고려사항들에 기초하여 소정의 중합체를 선택할 수 있을 것이다. 유도체화의 효율성은 유도체를 소정의 형태(예, 삼투압 펌프에 의하여 또는 더욱 바람직하게는 주사 또는 주입에 의하여, 또는 경구, 폐 또는 다른 송달 루트용으로 보다 제제화되어)로 투여하고 그 효율성을 측정함으로써 확인될 수 있다.
적절한 수용성 중합체는 PEG, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체들, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레익 안하이드리드 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체(homopolymer) 또는 랜덤 공중합체) 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)PEG, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸레이티드 폴리올(예, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
중합체는 적절한 분자량을 갖을 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다.
PEG에서, 적절한 평균 분자량은 약 2kD 내지 약 100kDa이다. 이는 취급 및 제조의 용이성을 제공한다. 당업자는 PEG의 제조시, 일부 분자들은 언급된 분자량보다 더 많이, 약간 적은 분자량을 가질 것임을 이해 l 것이다. 그러므로, 분자량은 일반적으로 "평균 분자량"으로 특정된다. 소정의 치료 프로파일(예, 소정의 지연된 방출 기간; 있다면, 생물학적 활성에 대한 효과; 취급 용이성; 치료 단백질에 대한 항원성의 정도 또는 결여 및 다른 공지된 효과).에 따라서, 다른 분자량(크기)가 사용될 수 있다. 다양한 구체예에서, 분자량은 약 2kDa, 약 5kDa, 약 10 kDa, 약 15kDa, 약 20kDa, 약 25kDa, 약 30kDa, 약 40kDa 또는 약 100 kDa이다. 어떤 바람직한 구체예에서, 각 PEG 사슬의 평균 분자량은 약 20kD이다. 어떤 바람직한 구체예에서 평균 분자량은 약 10kDa이다.
그렇게 부착된 중합체 분자의 수는 다양할 수 있고, 당업자라면 기능에 미치는 영향을 확인할 수 있을 것이다. 당업자는 동일 또는 상이한 화학 부분(예, 중합체, 예컨대 상이한 분자량의 PEG들)으로 모노-유도체화를 제공하거나 또는 디-, 트리-, 테트라- 또는 몇몇 조합의 유도체화를 제공할 수 있다. 단백질(또는 폴리펩티드) 분자에 대한 중합체 분자의 비율은 반응 혼합물에서의 농도에 따라서 다양할 것이다. 일반적으로, 최적 비율(과량의 미반응 단백질 또는 중합체가 없다는 반응의 효율성 측면에서)은 유도체화의 소정의 정도(예, 모노, 디-, 트리-, 등), 선택된 중합체의 분자량, 중합체가 분지형 또는 비-분지형인지 여부 및 반응 조건과 같은 요소들에 의하여 결정될 것이다.
PEG 분자(또는 다른 화학 부분들)은 단백질의 기능적 또는 항원성 도메인에 대한 영향을 고려하여 단백질에 부착되어야 한다. 당업자가 사용할 수 있는 다수의 부착방법이 있다. 참조, 예컨대, EP 0 401384 (PEG를 G-CSF에 커플링) ; Malik 등, Exp. Hematol. 20: 1028-1035, 1992 (트레실 클로라이드를 이용한 GM-CSF의 PEG화(PEGylation)를 보고).
예컨대, PEG는 반응성 기, 예컨대 자유 아미노 또는 카르복실 기를 통하여 아미노산 잔기로 공유결합(PEG화)될 수 있다. 자유 아미노 기를 갖는 아미노산 잔기는 라이신 잔기 및 아미노-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 자유 카르복실 기를 갖는 아미노산 잔기들은 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 설프히드릴 기는 또한 PEG 분자의 부착을 위한 반응성 기로 사용될 수 있다. 치료적 목적을 위하여, 부착은 아미노 기, 예컨대 N-말단 또는 라이신 기에서 있을 수 있다. 당업자는 아미노-말단이 화학적으로 변형된 단백질을 요구할 수 있다.
PEG를 본 발명 조성물의 하나의 예시로 사용하여, 다양한 PEG 분자(분자량, 분지화 등에 의한)로부터 반응 혼합물 중 단백질(또는 펩티드) 분자에 대한 PEG 분자의 비율, 수행될 PEG화 반응의 유형 및 선택된 아미노-말단에서 PEG화된 단백질을 얻는 방법을 선택할 것이다. 아미노-말단 PEG화된 제제를 얻는 방법(즉, 필요하다면, 이러한 부분을 다른 모노PEG화된 부분으로부터 분리하여)은 PEG화된 단백질 분자 집단으로부터 아미노-말단 PEG화된 물질의 정제에 의할 수 있다. 선택적인 아미노-말단 화학적 변형은, 특정 단백질에서 유도체화를 위하여 이용가능한, 상이한 유형의 1차 아미노 기(라이신 대 아미노-말단)의 차별적 반응성을 이용하는 환원적 알킬화에 의하여 수행될 수 있다. 적절한 반응 조건 하에서, 중합체를 포함하는 카르보닐기를 갖는 아미노-말단에서 단백질의 실질적으로 선택적인 유도체화가 이루어진다. 예를 들면, 라이신 잔기의 엡실론(ε)-아미노 기와 단백질의 아미노 말단 잔기의 알파(α)-아미노 기 사이의 pKa 차이를 이용할 수 있게 하는 pH에서 반응을 수행함으로써 단백질의 아미노-말단을 선택적으로 PEG화할 수 있다. 이러한 선택적인 유도체화에 의하여 단백질에의 수용성 중합체의 부착이 조절된다: 중합체와의 컨주게이션은 단백질의 아미노-말단에서 우세하게 일어나고 라이신 측쇄 아미노 기와 같은 다른 반응성 기의 유의성있는 변형은 일어나지 않는다.
환원적 알킬화를 이용하여, 수용성 중합체는 상기한 유형일 수 있고, 단백질에 커플링하기 위한 단일 반응성 알데히드를 가져야 한다. 단일 반응성 알데히드를 포함하는 PEG 프로피온알데히드가 사용될 수 있다.
본 발명은 원핵생물 또는 진행생물에서 발현되거나 합성에 의해 제조되는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 뉴블라스틴은 당화된다. 일부 특정 구체예에서 뉴블라스틴 이량체는 각 아미노-말단에서 중합체-컨쥬게이트되고, 각 내부 Asn95 잔기에서 당화된다. 다른 구체예에서, 돌연변이된 뉴블라스틴 이량체는 각 아미노-말단에서 중합체-컨주게이트되고 하나 또는 양쪽의 내부 Lys95 잔기에서 중합체-컨주게이트된다.
PEG화는 적절한 임의의 PEG화 반응에 의하여 수행될 수 있다. 다양한 PEG화 화학이 당업계에 공지되어 있다. 참조, 예컨대, Focus on Growth Factors, 3(2): 4-10, 1992; EP 0 154 316; EP 0 401 384 ; 및 PEG화와 관련하여 이들 문서에서 인용된 다른 간행물들. PEG화는 반응성 PEG 분자(또는 유사 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통하여 수행될 수 있다.
아실화에 의한 PEG화는 일반적으로 PEG의 활성 에스테르 유도체를 반응시키는 것과 관련된다. 임의의 공지 또는 이후에 발견되는 반응성 PEG 분자들이 PEG화를 수행하기 위하여 사용될 수 있다. 바람직한 활성화된 PEG 에스테르 는 N-히드록시석시니미드(NHS)에 에스테르화된 PEG이다. 본 명세서에서 사용되는, "아실화"는 제한 없이 치료 단백질과 PEG와 같은 수용성 중합체 간의 하기 유형의 결합을 포함한다:아미드, 카바메이트, 우레탄 등. 참조, See,Bioconjugate Chem. 5: 133-140,1994. 반응 조건은 PEG화 분야에서 공지되었거나 이후에 개발되는 것 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있으나, 변형될 뉴블라스틴 단백질 또는 폴리펩티드를 불활성화시킬 온도, 용매,및 pH와 같은 조건은 피해야 한다.
아실화에 의한 PEG화는 일반적으로 폴리-PEG화된 뉴블라스틴 단백질 산물을 초래한다. 바람직하게, 연결 결합은 아마이드일 것이다. 또한 바람직하게는, 얻어진 산물이 실질적으로 단지(예, >95%) 모노, 디 또는 트리-PEG화될 것이다. 그러나, 보다 높은 PEG화 정도를 나타내는 일부 종은 요컨대, 사용된 특정 반응 조건에 따라서 형성될 수 있다. 원한다면, 보다 정제된 PEG화 종을 혼합물, 특히 미반응 종들로부터 다른 것들 중에서 투석, 염석(salting-out), 초여과, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동을 포함하는 표준 정제 테크닉에 의하여 분리할 수 있다.
알킬화에 의한 PEG화는 일반적으로 PEG의 말단 알데히드 유도체를 환원제 존재 하에 뉴블라스틴과 반응시키는 것과 관련된다. 알킬화에 의한 PEG화도 폴리-PEG화된 뉴블라스틴 단백질 산물을 초래한다. 또한, 반응조건을 조작하여 실질적으로 뉴블라스틴의 아미노 말단의 α-아미노 기에서만 PEG화가 선호되게 할 수 있다(즉, 모노-PEG화된 단백질). 모노-PEG화 또는 폴리-PEG화 중 어느 경우에, PEG 기는 바람직하게는 -CH2-NH-기를 통하여 단백질에 부착된다. -CH2-기와 특히 관련하여, 이러한 유형의 결합을 본 문서에서 '알킬' 결합이라고 지칭한다.
모노-PEG화된 산물을 생산하기 위한 환원적 알킬화를 통한 유도체화는 유도체화를 위하여 이용가능한 1차 아미노 기(라이신 대 아미노-말단)의 상이한 유형의 차별적인 반응성을 이용한다. 라이신 잔기의 엡실론(ε)-아미노 기와 단백질의 아미노 말단 잔기의 알파(α)-아미노 기 사이의 pKa 차이를 이용할 수 있게 하는 pH에서 반응이 수행된다. 이러한 선택적인 유도체화에 의하여 단백질에 알데히드와 같은 반응성 기를 포함하는 수용성 중합체의 부착이 조절된다: 중합체와의 컨주게이션은 단백질의 아미노-말단에서 우세하게 일어나고 라이신 측쇄 아미노 기와 같은 다른 반응성 기의 유의성 있는 변형은 일어나지 않는다.
아실화 및 알킬화 접근 모두에서 사용된 중합체 분자는 상기한 수용성 중합체 중에서 선택될 수 있다. 선택된 중합체는 단일 반응성기, 예컨대 바람직하게는 아실화를 위한 활성 에스테르 또는 알킬화를 위한 알데히드를 갖도록 변형되어야 하고, 현행 방법에서 제공되는 바에 따라서 중합체화의 정도가 조절될 수 있다. 예시적인 반응성 PEG 알데히드는 수용성인 PEG 프로피온알데히드 또는 이들의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체이다(참조, 미국 특허 5,252,714). 중합체는 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 아실화 반응을 위하여, 선택된 중합체는 단일 반응성 에스테르기를 가져야 한다. 현행 환원적 알킬화를 위해서 선택된 중합체는 단일 반응성 알데히드기를 가져야 한다. 일반적으로, 수용성 고분자는 이들이 대개 포유류 재조합 발현 시스템에 의하여 보다 편리하게 제조되기 때문에 자연적으로 존재하는 당화 잔기로부터 선택되지 않을 것이다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고 분지형 또는 비-분지형일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 예시적인 수용성 고분자는 PEG이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은, 제한되지는 않으나 예컨대,모노-(C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-PEG를 포함하여, 다른 단백질들을 유도체화하기 위하여 사용되어 온 PEG의 임의의 형태를 포함한다.
일반적으로, 화학적 유도체화는 생물학적 활성 물질을 활성화된 중합체 분자와 반응시키기 위하여 사용되는 임의의 적절한 조건 하에서 수행될 수 있다. PEG화된 뉴블라스틴의 제조 방법은 일반적으로, (a) 뉴블라스틴 단백질 또는 폴리펩티드를 분자가 하나 이상의 PEG 기에 부착되는 조건 하에서 PEG(PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은)와 반응시키는 단계 및 (b)반응 산물을 얻는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적의 반응 조건은 공지의 파라미터 및 원하는 결과에 기초하여 경우에 따라서 결정될 것이다. 예컨대, PEG:단백질의 비율이 커지면, 폴리-PEG화된 산물의 비율도 커진다.
모노-중합체/뉴블라스틴의 실질적으로 동질적인 집단을 생산하기 위한 환원적 알킬화는 일반적으로 (a) 환원적 알킬화 조건 하, 뉴블라스틴의 아미노 말단에서 α-아미노 기의 선택적 변형을 펜-니트(pen-nit)하기에 적합한 pH 하에서 뉴블라스틴 단백질 또는 폴리펩티드를 반응성 PEG분자와 반응시키는 단계; 및 (b) 반응 산물을 얻는 단계를 포함한다.
모노-중합체/뉴블라스틴의 실질적으로 동질적인 집단을 위하여, 환원적 알킬화 반응 조건은 수용성 중합체 부분을 뉴블라스틴의 아미노-말단에 선택적으로 부착시키는 것들이다. 그러한 반응 조건은 일반적으로 라이신 아미노 기와 아미노-말단의 α-아미노 기 사이의 pKa 차이를 제공한다(pKa는 아미노 기의 50%가 프로톤화되고 50%는 그렇지 않은 pH이다). 또한 pH는 사용된 단백질에 대한 중합체의 비율에 영향을 미친다. 일반적으로, pH가 낮으면, 단백질에 대하여 보다 과량의 중합체가 요구될 것이다(즉, 아미노-말단의 α-아미노 기가 반응성이 작을수록, 최적의 조건을 얻기 위해 보다 많은 중합체가 필요하다). pH가 더 높으면, 중합체:단백질 비율은 그렇게 클 필요가 없다(즉, 보다 반응성인 기가 이용가능하므로, 적은 중합체 분자가 필요하다). 본 발명의 목적을 위하여, pH는 일반적으로 3~9의 범위, 바람직하게는 3~6의 범위에 속할 것이다.
또 다른 중요한 고려사항은 중합체의 분자량이다. 일반적으로 중합체의 분자량이 클수록, 보다 적은 중합체 분자가 단백질에 부착될 수 있다. 유사하게, 중합체의 분지도 이들 파라미터를 최적화할 때 고려하여야 한다. 일반적으로, 분자량이 높아질수록(또는 분지가 많아질수록), 중합체:단백질의 비율이 높아진다. 일반적으로, 본 명세서에 포함된 PEG화 반응을 위하여, 바람직한 평균 분자량은 약 2kDa 내지 약 100kDa이다. 바람직한 평균 분자량은 약 5kDa 내지 약 50kDa이고, 특히 바람직하게는 약 10kDa 내지 약 20kDa이다. 바람직한 전체 분자량은 약 10kDa 내지 약 40kDa이다.
일부 구체예에서, 뉴블라스틴 폴리펩티드는 폴리펩티드의 말단 반응성 기를 통하여 중합체에 연결된다. 대안으로, 또는 부가하여, 뉴블라스틴 폴리펩티드는 예컨대, 자연적으로 존재하는 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열에 도입된 라이신 잔기와 같은 내부 라이신 잔기의 측쇄 아미노 기를 통하여 연결될 수 있다. 따라서, 컨주게이션은 또한 비-말단 반응성 기로부터 분지될 수 있다. 반응성 기를 갖는 중합체는 본 문서에서 "활성화된 중합체"라고 지칭된다. 반응성 기는 선택적으로 단백질의 반응성 기, 예컨대 프리 아미노와 반응한다.
부착은 활성화된 중합체에서, 임의의 이용가능한 블라스틴 아미노 기, 예컨대 라이신 잔기 또는 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열에 도입된 잔기들의 알파 아미노기 또는 엡실론 아미노기와 같은 임의의 이용가능한 뉴블라스틴 아미노 기에서 일어날 수 있다. 뉴블라스틴의 자유 카르복시 기, 적절하게 활성화된 카르보닐 기, 히드록시, 구아니딜, 이미다졸, 산화된 탄수화물 부분 및 머캅토 기(만약 이용가능하다면) 또한, 부착 자리로 사용될 수 있다.
일반적으로 단백질 몰 당 약 1.0 내지 약 10몰의 활성화된 중합체가 단백질의 농도에 따라서 이용된다. 최종 양은 산물의 비-특이적 변형을 최소화하면서 반응 정도를 최대화하고, 동시에 가능하다면, 단백질의 반감기를 최적화함과 함께 최적 활성을 유지할 화학을 특정하는 사이의 균형 값이다. 바람직하게는, 단백질의 생물학적 활성의 적어도 약 50%가 보유되고 가장 바람직하게는 100% 가까이 보유된다.
중합체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 뉴블라스틴 폴리펩티드에 커플링될 수 있다. 예컨대, 하나의 구체예에서, 폴리알킬렌 글리콜 부분은 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 라이신 기에 커플링될 수 있다. 라이신 기와의 연결은 PEG 석시니미딜 석시네이트(SS-PEG) 및 석시니미딜 프로피오네이트(SPA-PEG)와 같은 N-히드록시석시니미드(NHS) 활성 에스테르로 수행될 수 있다. 적절한 폴리알킬렌 글리콜 부분은 예컨대, 카르복시메틸-NHS, 노르류신-NHS, SC-PEG, 트레실레이트, 알데히드, 에폭시드, 카르보닐이미다졸 및 PNP 카보네이트를 포함한다.
추가적인 아민 반응성 PEG 링커(linkers)는 석시니미딜 부분으로 치환될 수 있다. 이들은 예컨대, 이소치오시아네이트, 니트로페닐카보네이트, 에폭시드 및 벤조트리아졸 카보네이트를 포함한다. 조건들은 반응의 선택성 및 정도를 최대화하도록 선택되는 것이 바람직하다.
원한다면, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 태그(tag), 예컨대, 이후에 단백질분해에 의하여 방출될 수 있는 태그를 포함할 수 있다. 따라서, 라이신 부분은, 라이신과 아미노 말단 모두와 반응할 트라우트 시약(Traut's reagent, Pierce)과 같은 저분자량 링커로 변형된 히스-태그를 우선 반응시키고, 이어서 히스 태그를 방출함으로써 선택적으로 변형될 수 있다. 폴리펩티드는 이후에 말레이미드 기, 비닐설폰 기, 할로아세테이트 기 또는 자유 또는 보호된 SH와 같은 치올 반응성 머리 기(head group)을 포함하는 PEG로 선택적으로 변형될 수 있는 자유 SH기를 포함할 것이다.
트라우트 시약은 PEG 부착용 특정 자리를 설정할 임의의 링커로 대체될 수 있다. 예로서, 트라우트 시약은 SPDP, SMPT, SATA, 또는 SATP(모두 Pierce에서 얻을 수 있음)로 치환될 수 있을 것이다. 유사하게, 단백질은 말레이미드(예컨대, SMCC, AMAS, BMPS,MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS 또는 GMBS), 할로아세테이트 기((SBAP, SIA, SIAB) 또는 비닐설폰 기를 삽입하는 아민 반응성 링커로 반응시키고 얻어진 산물을 자유 SH를 포함하는 PEG와 반응시킬 수 있을 것이다. 이용되는 링커의 크기에 대한 유일한 제한은 이후의 아미노-말단 태그의 제거를 차단할 수 없다는 것이다.
따라서, 다른 구체예에서, 폴리알킬렌 글리콜 부분은 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 시스테인 기에 커플링된다. 커플링은 예컨대, 말레이미드 기, 비닐설폰 기, 할로아세테이트 기 및 치올 기를 이용하여 수행될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 조성물에서 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 중합체 부재의 뉴블라스틴 폴리펩티드의 반감기에 비하여 보다 긴 혈청 반감기를 갖는다. 대안으로, 또는 부가하여, 조성물 중의 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 GFRα에 결합하거나, RET를 활성화하거나, 뉴런의 병리적 변화를 정상화하거나, 뉴런의 생존을 증가시키거나 신경병적 통증을 없애거나 이들 생리적 기능의 조합을 수행한다. 폴리펩티드가 뉴런의 생존을 증가시키거나 뉴런의 병리적 변화를 정상화시키는지 여부를 측정하는 에세이가 예컨대, 국제공개공보 00/01815에 기재되어 있다. 바람직하게는, 뉴런은 지각 뉴런, 자율신경 뉴런 또는 도파민성 뉴런이다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 PEG 부분에 커플링된 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 안정한, 수성 가용성 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 복합체로서 제공된다. 원한다면, 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 PEG 부분에 불안정한 결합에 의하여 커플링될 수 있다. 불안정한 결합은 예컨대, 생화학적 가수분해, 단백질 분해 또는 설프히드릴 절단에 의하여 절단될 수 있다. 예컨대, 결합은 생체 내(생리적) 조건 하에서 절단될 수 있다.
다른 반응 파라미터, 예컨대, 용매, 반응시간, 온도 등 및 산물의 정제 수단은 수용성 중합체로 단백질을 유도체화하는 것과 관련된 공중에 개시된 정보에 기초하여 사안마다 결정할 수 있다.
원한다면, 뉴블라스틴 폴리펩티드 당 컨주게이트용의 단일 중합체 분자가 이용될 수 있다. 대안으로, 1 이상의 중합체 분자가 부착될 수 있다. 본 발명의 컨주게이트된 뉴블라스틴 조성물은 비-생체적 용도 뿐만 아니라 생체적 용도에서도 유용성을 찾을 수 있다. 또한, 컨주게이트하는 중합체는 다른 기, 부분 또는 다른 컨주게이트된 종을 최종 사용 용도에 적절하게 이용할 수 있다. 예로서, 몇몇 용도에서는 중합체에 UV-분해 내성 또는 항산화 또는 다른 특성 또는 특징을 부여하는 기능성 부분을 중합체에 공유결합시키는 것이 유용할 수 있다. 또 다른 예로서, 몇몇 용도에서는 전체 컨주게이트된 물질의 다양한 특성 또는 특징을 향상시키기 위하여 중합체를 기능화하여 반응성 또는 가교가능성 특성을 부여하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 중합체는 의도된 목적을 위한 컨주게이트된 뉴블라스틴 뮤테인 조성물의 효능을 배제하지 않는, 임의의 기능성, 반복되는 기, 결합 또는 다른 구성적 구조를 포함할 수 있다.
이러한 바람직한 특성을 얻기 위하여 유용하게 이용될 수 있는 예시적인 중합체는 본 문서의 이하 예시적인 반응 스킴에 기재된다. 공유 결합된 펩티드 적용예에서, 중합체는 기능화되고 이어서 펩티드의 자유 아미노산과 커플링되어 불안정한 결합을 형성할 수 있다.
만약 반응성 기가 아미노-말단에서 알파 아미노 기에 있다면, 생물학적 활성 물질을 불활성 중합체와 반응시키는 데 사용되는 임의의 적절한 방법에 의하여, 바람직하게는 약 pH 5~8, 예컨대, pH 5, 6, 7 또는 8에서 반응이 일어날 수 있다. 일반적으로, 공정은 활성화된 중합체를 제조하고, 그 후에 단백질을 활성화된 중합체와 반응시켜서 제제화에 적합한 가용성 단백질을 생산하는 단계와 관련된다. 상기 변형 반응은 1 이상의 단계와 관련될 수 있는 다수의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
다른 알킬 형 뿐만 아니라 선형 또는 분지형 PEG가 사용될 수 있다. PEG의 길이는 다양할 수 있다. 대부분의 공통된 형태는 크기가 2K-100kDa로 다양하다. 본원 실시예들은 아미노-말단에서 표적화된 PEG화는 약동학적 특성에 영향을 미치지 않는다고 보고하는데, 물질이 생리적 기능을 보유했다는 사실은 본 문서에 개시된 자리 또는 자리들에서 변형이 유해하지 않음을 나타낸다. 결과적으로, 라이신 잔기의 삽입을 통하여 부가적인 부착 자리를 제공할 수 있는, 뉴블라스틴의 돌연변이 형태를 제조할 때, 이들 형태가 라이신과 아미노 말단 모두에서 PEG화될 것이라는 가능성 있는 결과는 본 발명에 의하여 포함된다.
뉴블라스틴 폴리펩티드에서 1 이상의 자리가 중합체에 커플링될 수 있다. 예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 PEG 부분이 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 몇몇 구체예에서, PEG 부분은 아미노 말단 및/또는 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 14, 39, 68, 및 95(서열번호: 1 및 표 1에 도시된 바에 따라 번호매겼을 때)에 부착된다.
유리한 구체예에서, 조성물에서 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 야생형 또는 중합체 부재의 돌연변이된 폴리펩티드의 뉴블라스틴 반감기에 비하여 보다 긴 혈청 반감기를 갖는다. 대안으로, 또는 부가하여, 조성물에서 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 GFRα3에 결합하거나, RET를 활성화하거나,뉴런의 병리적 변화를 정상화하거나, 뉴런의 생존을 증가시키거나 신경병적 통증을 없애거나 이들 생리적 기능의 조합을 수행한다.
일부 구체예에서, 복합체에서 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 중합체 컨주게이트는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 생리적 활성을 갖는다: GFRα3 결합, RET 활성화, 뉴런의 병리적 변화의 정상화, 뉴런 생존의 증가 또는 신경병적 통증의 소멸.
본 발명에 의하여 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 멀티머릭(multimeric) 폴리펩티드가 또한 제공된다. 멀티머릭 폴리펩티드는 바람직하게는 정제된 멀티머릭 폴리펩티드로서 제공된다. 멀티머릭 복합체의 예로서는, 예컨대, 디머릭(dimeric) 복합체를 포함한다. 멀티머릭 복합체는 헤테로머릭 또는 호모머릭 복합체로서 제공될 수 있다. 따라서, 멀티머릭 복합체는 하나의 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드 및 하나의 비-돌연변이된 뉴블라스틴을 포함하는 헤테로디머릭 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드 복합체이거나 두 개 이상의 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 헤테로디머릭 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드일 수 있다.
일부 구체예에서, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 GFRα3에 결합한다. 바람직하게는, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 결합은 RET 폴리펩티드의 인산화를 자극할 수 있다. 폴리펩티드가 GFRα3에 결합하는지 여부를 측정하기 위하여 국제공보 00/01815에 기재된 바에 따라서 에세이가 수행될 수 있다. 예컨대, CHO 세포주 상청액의 배지에서 뉴블라스틴의 존재는 사니콜라 등(Sanicola 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:6238)에 의하여 기재된 3원 복합체의 변형된 형태를 이용하여 기재될 수 있다. 이러한 에세이에서, GDNF-유사 분자의 능력은 RET 및 다양한 공-수용체의 세포외 도메인과 GFRα1, GFRα2, GFRα3간의 결합을 매개하는 그들의 능력으로 평가될 수 있다. RET와 공-수용체의 가용성 형태는 융합 단백질로서 생산된다. 랫트 RET 및 태반 알칼라인 포스파타제의 융합 단백질(RET-AP) 및 래트 GFRα-1의 세포외 도메인 간의 융합 단백질(국제공개 공보 WO9744356에 개시됨; 1997년 9월 27일) 및 인간 IgG1의 Fc 도메인이 기재되어 있다(Sanicola 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94 : 6238).
본 발명의 중합체는 바람직하게는 폴리알킬렌 글리콜 부분이고 보다 바람직하게는 PEG 부분이다. 일부 구체예에서, 폴리머릭 부분은 약 100Da 내지 약 25,000Da; 약 1000Da 내지 20,000Da; 또는 약 5000 Da내지 약 20,000Da의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 1 이상의 폴리머릭 부분은 약 5000Da의 평균 분자량 ; 약 10,000 Da의 평균 분자량; 또는 약 20,000 Da의 평균 분자량을 갖는다.
폴리알킬렌 글리콜 부분에서 기능기는 예컨대, 카르복시메틸-NHS, 노르류신-NHS, SC-PEG, 트레실레이트, 알데히드, 에폭시드, 카보닐이미다졸 또는 PNP 카르보네이트일 수 있다. 커플링은 N-히드록실석시니미드(NHS) 활성 에스테르를 통하여 일어날 수 있다. 활성 에스테르는 예컨대, PEG 석시니미딜 석시네이트(SS-PEG), 석시니미딜 부티레이트(SPB-PEG) 또는 석시니미딜 프로피오네이트(SPA-PEG)일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 폴리알킬렌 글리콜 부분은 뉴블라스틴 펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 시스테인 기에 커플링된다. 예를 들면, 커플링은 말레이미드 기, 비닐설폰 기, 할로아세테이트 기, 및 치올 기를 통하여 일어날 수 있다. 다양한 구체예에서, 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4개의 PEG 부분을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 중합체는 N-말단인 뉴블라스틴의 자리에서 폴리펩티드와 커플링된다. 몇몇 구체예에서, 중합체는 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 비-말단 아미노산 자리에서 폴리펩티드에 커플링된다. 몇몇 구체예에서, 중합체는 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 용매 노출된 아미노산에 커플링된다.
몇몇 구체예에서, 중합체는 중합체-컨주게이트된 폴리펩티드의 아미노 말단 아미노산, 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 14, 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 39, 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 68 및 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 95로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에서 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드와 커플링된다.
중합체- 컨주게이트된 뉴블라스틴 융합 단백질
원한다면, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 융합 단백질로 제공될 수 있다. 본 발명 단백질의 융합 폴리펩티드 유도체는 또한 생물학적 활성을 보유하는 1차 단백질의 다양한 구조적 형태를 포함한다.
중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴-혈청 알부민 융합체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 대응 아미노 반응 기 및 치올 기를 포함하는 다수의 가교결합제(cross-linker) 중 임의의 것이 뉴블라스틴을 혈청 알부민에 연결하기 위하여 사용될 수 있다. 적절한 링커의 예들로는 치올 반응성-말레이미드를 삽SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, 또는 GMBS를 포함한다. 다른 적절한 링커가 치올 반응성-할로아세테이트 기를 삽입한다. 이들은 예컨대, SBAP, SIA, SIAB를 포함하고, 설프히드릴 기와의 반응을 위한 보호된 또는 비-보호된 치올을 제공하여 환원 가능한 결합을 생산하는 것은 SPDP, SMPT, SATA 또는 SATP(모두 시판가능(예컨대, Pierce Chemicals)). 당업자는 뉴블라스틴의 아미노-말단을 혈청 단백질과 결합할 대체 전략을 유사하게 생각해낼 수 있다.
당업자가 뉴블라스틴의 아미노 말단 또는 혈청 알부민의 치올 부분에서 표적화되지 않은 혈청 알부민에 컨주게이트를 제조할 수 있음 또한 생각된다. 원한다면, 뉴블라스틴-혈청 알부민 융합체는 유전 공학 테크닉을 사용하여 제조될 수 있는데, 여기서 뉴블라스틴은 아미노 말단 또는 카르복시 말단 또는 양쪽 말단에서 혈청 알부민과 융합된다.
예컨대, 생체내 또는 특히, 동물내(인간 포함)에서 연장된 반감기를 갖는 제품을 초래하는 임의의 뉴블라스틴 컨주게이트가 유사한 전략을 사용하여 제조될 수 있다. 생체 내에서 연장된 반감기를 갖는 제품을 초래하는 뉴블라스틴 컨주게이트의 또 다른 예는 융합 파트너가 면역 글로불린인 뉴블라스틴 융합 단백질이다.
중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴의 다른 유도체들은 예컨대, 재조합 배양에서 부가적인 아미노-말단 또는 카르복시 말단에서 합성에 의한, 돌연변이된 뉴블라스틴 또는 이의 단편과 다른 단백질 또는 폴리펩티드와의 공유 또는 응집 컨주게이트를 포함한다. 예컨대, 컨주게이트된 펩티드는 공-번역으로 또는 후-번역으로 세포막 또는 벽의 내부 또는 외부에서 합성 자리로부터 기능 자리로 이송을 지시하는 단백질의 아미노-말단 영역에서의 단일(또는 리더) 폴리펩티드 서열일 수 있다(예컨대, 이스트 알파-팩터 리더). 뉴블라스틴 수용체 단백질은 뉴블라스틴의 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위하여 부가된 펩티드를 포함한다(예컨대, 히스티딘/뉴블라스틴 융합체). 뉴블라스틴의 아미노산 서열은 또한 펩티드 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK) (서열번호: 22) (Hopp 등, Biotechnology 6: 1204(1988))에 연결될 수 있다. 후자의 서열은 항원성이 높고 특정 단일클론 항체에 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하여, 발현된 재조합 단백질의 신속한 에세이와 용이한 정제를 가능케 한다.
이러한 서열은 또한 Asp-Lys 짝을 바로 뒤따르는 잔기에서 소 점막 엔테로키나제에 의하여 특정적으로 절단된다.
생체활성 폴리펩티드
본 발명의 폴리펩티드는 임의의 생체활성 형태로 제공될 수 있는데, 프리-프로 단백질, 프로-단백질, 성숙한 단백질, 당화된 단백질, 비-당화된 단백질, 인산화된 단백질, 비-인산화된 단백질. 절두된 형태 또는 다른 임의의 번역 후 변형된 단백질의 형태를 포함한다. 생체활성 뉴블라스틴 폴리펩티드는 예컨대, 이량체화될 때, 단독 또는 다른 보조인자(예컨대, GFRα3 또는 RET)의 존재 하에 RET와 결합하여 RET의 이량체화 및 자가인산화를 유도하는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 특히 N-당화된 폴리펩티드일 수 있고, 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 서열 목록에서 지시된 N-잔기에서 당화된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 위치 122에서 당화된 아스파라긴 잔기를 유지하는, 서열번호: 6에서 제시된 아미노산 서열; 또는 위치 95에서 당화된 아스파라긴 잔기를 유지하는, 서열번호: 14에서 제시된 아미노산 서열 또는 ClustalW 컴퓨터 소프트웨어에 의하여 배열될 때, 임의의 돌연변이된 뉴블라스틴에서의 유사한 위치를 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 NBN113-N95K로 본 명세서에서 지칭되고 서열번호: 2의 위치 95에서 아스파라긴 잔기를 치환한 라이신 잔기를 포함하는, 서열번호: 23에서 제시된 아미노산 서열 ; 또는 NBN106-N95K로 본 명세서에서 지칭된, 서열번호: 24에서 제시된 아미노산 서열; 또는 ClustalW 컴퓨터 소프트웨어에 의하여 배열될 때, 임의의 돌연변이된 뉴블라스틴에서의 유사한 위치를 갖는다.
본 발명은 또한 돌연변이된 뉴블라스틴 융합 단백질, 예컨대 미국 특허 제5,434,131에 기재된 바와 같은, 예컨대 면역글로불린-융합체 또는 혈청 알부민 융합체를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 1개의 치환의 예외를 갖고 서열번호: 1에 도시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 1에서 제시된 서열과 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 1개의 치환의 예외를 갖고 서열번호: 2에 도시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 2에서 제시된 서열과 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 1개의 치환의 예외를 갖고 서열번호: 3에 도시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 3에서 제시된 서열과 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 1개의 치환의 예외를 갖고 서열번호: 4에 도시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 4에서 제시된 서열과 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 1개의 치환의 예외를 갖고 서열번호: 5에 도시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 5에서 제시된 서열과 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 1개의 치환의 예외를 갖고 서열번호: 6에 도시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 6에서 제시된 서열과 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 1개의 치환의 예외를 갖고 서열번호: 7에 도시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 7에서 제시된 서열과 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 1개의 치환의 예외를 갖고 서열번호: 8-21 중 어느 하나에 도시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8-21 중 어느 하나에서 제시된 서열과 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 1개의 치환의 예외를 갖고 서열번호: 36에 도시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 36에서 제시된 서열과 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
추가 구체예에서, 본 발명은 1개의 치환의 예외를 갖고 서열번호: 1-21 및 36 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 1-21 및 36 에서 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 돌연변이된 폴리펩티드는 GDNF 서브패밀리 핑거프린트, 즉, 표 3 및 4에 지정된 보존된 시스테인 아미노산 잔기를 보유한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 서열번호:1의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 스트랜드 또는 이의 서브-서열을 갖는, 매우 엄중한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 돌연변이된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 돌연변이된 폴리펩티드는 서열번호: 1의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 서열번호:2의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 스트랜드 또는 이의 서브-서열을 갖는, 매우 엄중한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 신규 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 돌연변이된 폴리펩티드는 서열번호: 2의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 8-21의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 스트랜드 또는 이의 서브-서열을 갖는, 매우 엄중한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 돌연변이된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 돌연변이된 폴리펩티드는 서열번호: 8-21의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 36의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 상보적 스트랜드 또는 이의 서브-서열을 갖는, 매우 엄중한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 돌연변이된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 돌연변이된 폴리펩티드는 서열번호: 36의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화된다.
생물학적 기원
비-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 분리한 후 1 이상의 중합체와 컨주게이트시켜서 본 발명의 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 얻을 수 있다. 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포 또는 쥐 기원의 세포 또는 차이니즈 햄스터 난소 기원의 세포로부터 분리될 수 있다.
신경향성 활성
본 발명의 절두된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는, 변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 신경 또는 뉴런 세포의 대사, 성장, 분화 또는 생존을 조절하는데 유용하다. 특히, 변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 살아있는 동물, 예컨대, 인간에서, 신경향성제의 활성에 반응하는 질병 또는 질환을 치료 또는 완화시키는 데 사용된다. 이러한 치료 및 방법은 이하에서 상세하게 기재된다.
뉴블라스틴 -중합체 컨주게이트를 포함하는 약학 조성물
또한, 본 발명의 변형된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 중합체-뉴블라스틴 컨주게이트는 이의 약학적으로 허용가능한 에스테르, 염, 및 기타 생리적으로 기능적인 유도체의 형태는 물론, 그 자체로 투여될 수 있다. 이러한 약학적 제제와 약제 제제에 있어, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 컨주게이트는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(들) 및 임의적으로 임의의 다른 치료 성분들과 함께 사용되는 것이 바람직gk다.
담체(들)은 제제내 다른 성분들과 양립가능하고 이의 수령체에 과도하게 유해하지 않다는 점에서 약학적으로 허용가능해야만 한다. 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴은 본 명세서에 서술한 바와 같이, 소정의 약리학적 효과나 의학적으로 유익한 효과를 얻기에 유효한 양, 및 소정의 생체이용가능한 생체내 투여량이나 농도를 얻기에 적절한 양으로 제공된다.
제제에는 비경구 투여에 적합한 제제와 비경구 투여가 아닌 투여에 적합한 제제가 포함되며, 특이적 투여 양식에는 경구, 직장, 구강, 국부, 비강, 안구, 피하, 근육내, 정맥내, 경피, 포막내, 관절내, 동맥내, 거미망막하, 기관지, 임파선, 질, 및 자궁내 투여가 포함된다. 에어로졸 및 비경구 투여에 적합한 제제(국부적 및 전신적 모두)가 바람직하다.
중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴이 액체 용액을 포함하는 제제에 사용되는 경우, 이 제제는 유리하게 경구적으로, 기관지로, 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴이 액체 현탁액 제제에 사용되거나, 생체양립가능성 담체 제제에서 분말로 사용되는 경우, 이 제제는 유리하게 경구적으로, 직장으로, 또는 기관지로 투여될 수 있다. 대안적으로, 담체 가스내 분말의 네뷸라이제이션을 통해 비강으로 또는 기관지로 투여될 수 있으며, 이때, 적절한 네뷸라이저 장치를 포함하는 호흡 서킷으로부터 환자가 호흡하는 분말의 기체 분산이 형성된다.
본 발명의 단백질을 포함하는 제제는 편리하게 단위 제형으로 존재할 수 있으며, 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 활성 성분(들)을 하나 이상의 부수적인 성분을 구성하는 담체와 함께 제공하는 단계를 포함한다.
전형적으로, 제제는 활성 성분(들)을 액체 담체, 미세하게 분할된 고체 담체, 또는 이 두 가지 모두와 함께 균일하고 통일되게 제공하는 단계, 및 그 이후 필요한 경우 생성물을 소정의 제제의 제형으로 성형하는 단계를 거쳐 제조된다.
경구 투여에 적합한 본원 발명의 제제는 캡슐, 교갑, 타블렛, 또는 로젠지와 같이 분리된 단위(이때 각각의 단위는 미리 결정된 양의 활성 성분을 분말이나 과립으로 포함함); 또는 시럽, 엘리시르(elixir), 유화액 또는 드라우트(draught)와 같이 수성 액체나 비수성 액체내 현탁액으로 존재할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제는 편리하게 활성 컨주게이트의 멸균 수성 제제를 포함하며, 수령체의 혈액에 등장성인 것이 바람직하다(예, 생리학적 염수 용액). 이러한 제제는 현탁제와 농후제, 또는 혈액 성분이나 하나 이상의 기관에 화합물을 표적화하도록 고안된 다른 미세입자 시스템을 포함할 수 있다. 제제는 단위-제형 또는 다중-제형으로 존재할 수 있다.
비강 분무 제제는 활성 컨주게이트를 보존제 및 등장제와 함께 포함하는 정제된 수용액을 포함한다. 이러한 제제는 비강 점막과 양립가능한 pH 및 등장 상태로 조정되는 것이 바람직하다.
직장 투여용 제제는 코코아 버터, 수소화 지방, 또는 수소화 지방 카르복실산과 같은 적합한 담체와 함께 좌제로 존재할 수 있다. 점안액과 같은 안구 제제는 비강 분무와 유사한 방법으로 제조되나, pH 및 등장 인자는 안구와 적합하도록 조정하는 것이 바람직하다.
국부 제제는 미네랄 오일, 석유, 폴리히드록시 알콜 또는 국부 약학 제제용으로 사용되는 다른 베이스에 현탁되거나 용해된 본 발명의 컨주게이트를 포함한다.
전술한 성분에 추가하여, 본 발명의 제제는 희석제, 완충액, 향미제, 붕해제, 표면 활성제, 농후제, 윤활제, 보존제(항산화제 포함) 등에서 선택된 하나 이상의 부가적인 성분(들)을 추가적으로 포함할 수 있다. 앞선 고려 사항들은 본 발명의 뉴블라스틴 융합 단백질(예, 뉴블라스틴-인간 혈청 알부민 융합 단백질)에도 적용된다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 바람직한 예시적 응용으로서, 용액내에 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 컨주게이트를 시험관내 안정화시키는데 적합한 융합 단백질을 제공하는 것을 포함한다. 융합 단백질은 예컨대, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 효소적 붕괴에 대한 내성을 증가시키기 위해, 및 저장 수명, 실온 안정성 등을 개선시키기 위한 수단을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 앞선 고려 사항들은 본 발명의 뉴블라스틴-혈청 알부민 융합 단백질(인간 뉴블라스틴-인간 혈청 알부민 융합 단백질 포함)에도 적용된다.
치료 방법
본 발명의 조성물은 신경향성제의 활성에 반응하는 질병이나 질환을 포유류, 예컨대, 인간을 포함한 영장류에서 치료 또는 완화시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 뉴블라스틴 폴리펩티드에 반응하는 병리학적 과정을 치료하기 위해, 약학 조성물을 집적 사용, 예컨대, 주사, 이식 또는 섭취시킬 수 있다. 조성물은 살아있는 동물체(인간을 포함)의 신경향성제의 활성에 반응하는 질병이나 질환을 완화시키는 데 사용될 수 있다. 질병이나 질환은 특히 외상, 수술, 국소빈혈, 감염, 대사성 질환, 영양 결핍, 악성 또는 독성제, 및 유전 또는 특발적 과정에 의해 초래되는 신경계의 손상일 수 있다.
손상은 특히 배근 신경절의 뉴런; 또는 슬상관절, 추체 및 결절성 신경절; 제8 두개골 신경의 음향 복합체; 3차 신경절의 상하악엽의 복부측면극; 및 중뇌 3차 핵 중 임의의 조직의 뉴런을 포함하는, 지각 뉴런 또는 망막 신경절 세포에서 일어날 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 구체예에서, 질환이나 질병은 상해성 및 외상성 뉴런, 예컨대, 말초 신경, 골수 및/또는 척수의 외상 상해, 대뇌 허혈성 뉴런 손상, 신경병 및 특히 말초 신경병, 말초 신경 외상 또는 상해, 허혈성 발작, 급성 뇌 상해, 급성 척수 상해, 신경계 종양, 다발성 경화증, 신경독에 노출, 대사성 질환, 예컨대, 당뇨 또는 신장 기능장애 및 감염제에 의해 초래된 손상을 포함하는 신경퇴행성 질환; 알츠하이머 질환, 헝틴톤 질환, 파키슨 질환, 파키슨-플러스 증후군, 진행성 핵성 마비(스틸-리차드슨-올스제위스키 증후군), 올리브뇌교소뇌위축(OPCA), 특발성 기립성 증후군(다발성 시스템 위축), 괌 파킨슨성 치매 컴플렉스, 근위축성측색경화증, 또는 임의의 기타 선천성 또는 신경퇴행성 질환을 포함하는 신경퇴행성 질병; 및 치매와 연관된 기억력 감퇴이다.
일부 구체예에서, 지각 및/또는 자율계 뉴런이 치료될 수 있다. 특히, 통각 및 기계수용성 뉴런이 치료될 수 있으며, 더욱 A-델타 섬유, C-섬유 및 A-베타 섬유 뉴런이 치료될 수 있다. 또한, 자율계의 교감 및 부교감 뉴런이 치료될 수 있다.
일부 구체예에서, 근위축성측색경화증("ALS") 및 척수 근육 위축과 같은 운동 뉴런 질환이 치료될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 뉴블라스틴 분자는 외상성 상해 이후의 신경 회복을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 덧붙여, 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드, 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드의 융합 또는 컨주게이트를 함유하는 매트릭스를 가지는 신경 안내 채널이 본 명세서에 서술한 방법에 사용될 수 있다. 이러한 신경 안내 채널은 예컨대, 미국 특허 제5,834,029호에 공개되어 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 공개된 조성물 (및 이를 포함하는 약학 조성물)은 말초 신경병의 치료에 사용된다. 본 발명의 분자로 치료되는 말초 신경병 중에는, 외상-유도된 신경병, 예컨대, 물리적 상해나 질환 상태에서 유래된 것, 뇌에 대한 물리적 손상, 척수에 대한 물리적 손상, 뇌 손상과 연관된 발작, 및 신경퇴행과 관련된 신경학적 질병이 있다. 또한, 이에는 감염, 독소 노출, 및 약물 노출에 부수적인 신경병이 포함된다. 또한 전신성 또는 대사성 질환에 부수적인 신경병도 포함된다. 예컨대, 본 명세서에 공개된 조성물은 화학요법-유도된 신경병(예컨대, 화학치료제, 예컨대, 탁솔 또는 시스플라틴의 송달에 의해 유래된 것); 독소 유도된 신경병, 약물-유도된 신경병, 비타민-결핍-유도된 신경병; 특발성 신경병; 당뇨성 신경병; 및 후대상포진성 신경통을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,496,804호 및 제5,916,555호를 참고하라.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 부가적인 질병에는 축삭 및 탈수초성 신경병을 비롯한 모노-신경병, 모노-멀티플렉스 신경병, 및 폴리-신경병이 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물 (및 이를 포함하는 약학 조성물)은 반점 변성, 망막세포변성, 녹내장, 및 유사한 질환에 걸린 환자의 망막에서의 광수용체의 소실을 비롯한, 안구의 다양한 질병의 치료에 사용된다.
방법 및 약학 조성물
본 발명은 신경병적 통증의 치료 방법, 촉각성 이질통의 치료 방법, 및 신경병과 연관된 통증 감도의 소실 감소 방법을 제공한다. 본 방법은 생체활성 전체-길이 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 생체활성 절두된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 이량체를 비롯한, 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 사용한다. 또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체에 현탁, 용해 또는 분산된 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
1. 신경병적 통증의 치료
한 구체예에서, 본 발명은 피험체에 유효한 양의 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 신경병적 통증을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 피험체에 약학적으로 유효한 양의 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 신경병적 통증을 치료하는 방법을 포함하며, 이때, 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 예컨대, 서열번호: 1, 2, 6-21 및 36 중 임의의 하나, 또는 이의 돌연변이된 형태를 비롯한, 야생형, 절두된 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하며, 약학적으로 유효한 양의 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 단독으로 투여되거나, 유효한 양의 무통증-유도성 화합물과 함께 피험체에 투여될 수 있으며, 무통증-유도성 화합물은 오피오이드, 항부정맥제, 국부 무통제, 국소 마취제, 경련방지제, 항울제, 코르티코스테로이드 및 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAIDS)로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 무통증-유도성 화합물은 경련방지제이다. 다른 바람직한 구체예에서, 무통증-유도성 화합물은 가바펜틴((1-아미노메틸) 시클로헥산 아세트산) 또는 프리가발린(S-(+)-4-아미노-3-(2-메틸프로필) 부타노산)이다.
본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩티드 및 핵산 (및 본 명세서에 서술된 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 포함하는 약학 조성물)은 말초 신경병과 연관된 통증의 치료에 사용된다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 말초 신경병 에는 외상-유도된 신경병, 예컨대, 물리적 상해 또는 질환 상태에 의해 초래되는 것, 뇌에 대한 물리적 손상, 척수에 대한 물리적 손상, 뇌 손상과 연관된 발작, 및 신경퇴행과 관련된 신경학적 질병이 있다.
또한, 본 발명은 화학요법-유도된 신경병(예컨대, 화학요법제, 예컨대, 탁솔 또는 시스플라틴의 송달에 의해 초래되는 것); 독소-유도된 신경병, 약물-유도된 신경병, 병원체-유도된(예컨대, 바이러스-유도된) 신경병, 비타민-결핍-유도된 신경병; 특발성 신경병; 및 당뇨성 신경병의 치료법을 제공한다. 예컨대, 본 발명에 참고문헌으로 포함된 미국 특허 제5,496,804호 및 제5,916,555호를 참고하라. 본 발명은 또한 추가적으로 본 발명의 뉴블라스틴 뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 사용하여, 축삭 및 탈수초성 신경병을 비롯한, 모노-신경병, 모노-멀티플렉스 신경병, 및 폴리-신경병의 치료에 사용될 수 있다.
신경병적 통증은 이하를 포함하는 다수의 말초 신경병과 연관될 수 있다: (a) 외상-유도된 신경병, (b) 화학요법-유도된 신경병, (c) 독소-유도된 신경병(알콜중독, 비타민 B6 중독, 헥사카본 중독, 아미오다론, 클로람페니콜, 디술피람, 이소니아지드, 금, 리튬, 메트로니다졸, 미소니다졸, 니트로푸라토인에 의해 유도된 신경병을 포함하나 이로 제한되지는 않음), (d) 치료 약물-유도된 신경병적 통증을 포함하는 약물-유도된 신경병(예컨대, 항암제, 특히, 탁솔, 탁소티어, 시스플라틴, 노코다졸, 빈크리스틴, 빈데신 및 빈블라스틴으로 구성된 군에서 선택된 항암제에 의해 유래된 것; 및 예컨대, 항바이러스제, 특히, ddI, DDC, d4T, 포스카넷, 대프손, 메트로니다졸, 및 이소니아지드로 구성된 군에서 선택된 항바이러스제에 의해 유래된 것), (e) 비타민-결핍-유도된 신경병(비타민 B12 결핍증, 비타민 B6 결핍증, 및 비타민 E 결핍증을 포함하나 이로 제한되지 않음), (f) 특발성 신경병, (g) 당뇨성 신경병, (h) 병원체-유도된 신경 손상, (i) 감염-유도된 신경 손상, (j) 신경퇴행, (k) 유전성 신경병(프리드라이히 운동실조증, 가족성 아밀로이드 폴리신경병, 탕지어 질환, 화브리 질환을 포함하나 이로 제한되지 않음), (l) 대사성 질병(신장 기능부전 및 갑상선 기능저하증을 포함하나 이로 제한되지 않음), (m) 감염성 및 바이러스성 신경병(나병과 연관된 신경병적 통증, 라임 질환, 바이러스, 특히, 헤르페스 바이러스(예, 후대상포진성 신경통을 초래하는 헤르페스 조스터), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 파필로마 바이러스로 구성된 군에서 선택된 바이러스의 감염과 연관된 신경병적 통증을 포함하나, 이로 제한되지 않음), (n) 자가면역 신경병(길랭-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 폴리신경병, 예측되지 않는 특성을 가지는 모노클로날 감마병증 및 폴리신경병을 포함하나 이로 제한되지 않음), (o) 3차 신경통 및 포착성 증후군(손목터널 증후군을 포함하나 이로 제한되지 않음), 및 (p) 기타 신경병적 통증 증후군, 예컨대, 외상후 신경통, 망상 사지 통증, 다발성 경화증 통증, 복합 지역적 통증 증후군(교감신경성 위축증, 작열통을 포함하나 이로 제한되지 않음), 종양형성-연관된 통증, 맥관염증/맥관병증 신경병, 및 좌골신경통. 신경병적 통증은 이질통, 통각과민증, 자발성 통증 또는 망상통증으로 나타낼 수 있다.
2. 촉각성 이질통의 치료
용어 "촉각성 이질통"은 전형적으로 정상적으로는 해가 없는 피부 자극(예, 접촉)에 의해 통증이 나타나는 피험체의 상태를 나타낸다. 본 발명은 피험체에서 촉각성 이질통을 치료하는 방법을 포함한다.
일부 구체예에서, 촉각성 이질통은 약학적으로 유효한 양의 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 단독으로 피험체에 투여함으로써 치료된다.
관련된 구체예에서, 본 발명은 피험체에 유효한 양의 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 촉각성 이질통을 치료하는 방법을 포함하며, 이때, 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 예컨대, 서열번호: 1, 2, 6-21 및 36 중 임의의 하나, 또는 이의 돌연변이된 형태를 비롯한, 절두된 야생형 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하며, 유효한 양의 중합체 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 단독으로 투여되거나, 유효한 양의 무통증-유도성 화합물과 함께 피험체에 투여될 수 있으며, 무통증-유도성 화합물은 오피오이드, 항부정맥제, 국부 무통제, 국소 마취제, 경련방지제, 항울제, 코르티코스테로이드 및 NSAIDS로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 무통증-유도성 화합물은 경련방지제이다. 다른 바람직한 구체예에서, 무통증-유도성 화합물은 가바펜틴((1-아미노메틸) 시클로헥산 아세트산) 또는 프리가발린(S-(+)-4-아미노-3-(2-메틸프로필) 부타노산)이다.
일부 구체예에서, 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 치료제(항암제 또는 항바이러스제를 포함하나 이로 제한되지 않음)와 함께 투여된다. 항암제에는 탁솔, 탁소티어, 시스플라틴, 노코다졸, 빈크리스틴, 빈데신 및 빈블라스틴이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 항바이러스제에는 ddI, DDC, d4T, 포스카넷, 대프손, 메트로니다졸, 및 이소니아지드가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
3. 통증 감도 소실의 감소의 치료
다른 구체예에서, 본 발명은 신경병에 걸린 피험체에서 통증 감도 소실을 감소시키는 방법을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 신경병은 당뇨성 신경병이다. 바람직한 구체예에서, 통증 감도 소실은 열 통증 감도의 소실이다. 본 발명은 예방적 치료 및 치료적 치료 모두를 포함한다.
예방적 치료에서, 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 통증 감도 소실이 발생할 위험이 있는 피험체에 투여되며, 이러한 피험체는 초기 단계 신경병을 가진 피험체로 예측될 것이다. 이러한 상황에서 뉴블라스틴으로의 치료는 위험 환자를 예방적으로 치료할 것이다.
치료적 치료에서, 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 신경병에 걸려서 통증 감도 소실을 경험한 피험체에 투여되며, 이러한 피험체는 후기 단계 신경병을 가진 피험체로 예측될 것이다. 이러한 상황에서 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체로의 치료는 피험체에서 적절한 통증 감도를 구제할 것이다.
4. 바이러스 감염 및 바이러스-연관된 신경병의 치료
감염성 및 바이러스성 신경병의 예방적 치료도 포함된다. 예방적 치료는 바이러스 감염 확인 이후 및 신경병적 통증의 징후 이전을 나타낸다. 치료 동안, 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 나병과 연관된 신경병적 통증, 라임 질환, 바이러스(특히, 헤르페스 바이러스, 보다 바람직하게는 후대상포진성 신경통을 초래할 수 있는 헤르페스 조스터 바이러스, 인간 면역결핍성 바이러스(HIV), 및 파필로마 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 바이러스) 감염과 연관된 신경병적 통증을 포함하나, 이로 제한되지 않는, 신경병적 통증의 발생을 예방하기 위해 투여된다. 대안적인 구체예에서, 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 발생할 신경병적 통증의 중증도를 감소시키기 위해 투여된다.
급성 바이러스 감염의 증상에는 종종 발진이 포함된다. 다른 증상으로는, 예컨대, 헤르페스 조스터 감염의 통상적인 합병증인, 신체의 감염된 부위에서 지속적인 통증의 발생이 포함된다(대상 포진). 후대상포진성 신경통은 한 달 이상 지속될 수 있으며, 발진과 유사한 증상이 사라진 후에도 여러 달동안 나타날 수 있다.
5. 통증성 당뇨성 신경병의 치료
통증성 당뇨성 신경병의 예방적 치료도 포함된다. 당뇨성 신경병의 예방적 치료는 당뇨나 당뇨와 연관된 증상의 초기 진단 이후 및 신경병적 통증의 발병 이전에 시작될 것이다. 또한, 통증성 당뇨성 신경병의 예방적 치료는 피험체가 당뇨나 당뇨와 연관된 증상의 발병의 위험에 있는지를 결정한 경우 시작될 수 있다. 치료 동안, 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 신경병적 통증의 발생을 예방하기 위해 투여된다. 대안적인 구체예에서, 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 이미 발생한 신경병적 통증의 중증도를 감소시키기 위해 투여된다.
6. 신경계 질병
추가적인 양태에서, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드, 중합체와 결합된 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 또는 폴리알킬렌 부분(예, PEG)에 결합된 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 안정한, 수용성의 컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 또는 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드 복합체를 포함하는 복합체를, 이를 필요로 하는 피험체에 투여함으로써, 피험체(예, 인간)에서 신경계 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
신경계 질병은 말초 신경계 질병, 예컨대, 말초 신경병 또는 신경병적 통증 증후군일 수 있다. 인간은 치료될 바람직한 피험체이다.
본 발명의 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 뉴런(상해된 뉴런과 외상입은 뉴런을 포함하나 이로 제한되지 않음)의 결함을 치료하는 데 유용하다. 외상을 입은 말초 신경에는 골수 또는 척수의 신경을 포함되나 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 신경퇴행성 질환, 예컨대, 대뇌 허혈성 뉴런 손상; 신경병, 예컨대, 말초 신경병, 알츠하이머 질환, 헝틴톤 질환, 파킨슨 질환, 근위축성측색경화증(ALS)의 치료에 유용하다. 이러한 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 기억력 손상, 예컨대, 치매와 연관된 기억력 감퇴의 치료에 사용될 수 있다.
질병이나 질환의 부가적인 예에는 말초 신경계, 골수, 또는 척수의 질병, 및 외상-유도된 신경병, 화학요법-유도된 신경병, 독소-유도된 신경병, 약물-유도된 신경병, 비타민-결핍-유도된 신경병; 특발성 신경병; 및 당뇨성 신경병, 독소-유도된 신경 손상, 병원체-유도된 신경 손상, 염증-유도된 신경 손상, 또는 신경퇴행과 연관된 신경병적 통증이 있다. 본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체는 부가적으로 신경병적 통증의 치료, 촉각성 이질통의 치료 및 신경병과 연관된 통증 감도 소실의 감소에 유용하다.
7. 투여량
상기 방법은 절두되거나 절두되지 않은 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 포함하는 제제를 피험체에, 바람직하게는 전신적으로, 1회 분량당 0.01 ㎍/kg ~ 1000 ㎍/kg 피험체 체중의 투여량으로, 투여하는 방법을 포함한다. 투여량 당 1 ㎍/kg ~ 100 ㎍/kg 피험체 체중이 바람직하다. 투여량이 1회 분량당 1 ㎍/kg ~ 30 ㎍/kg 피험체 체중, 예컨대, 1회 분량당 3 ㎍/kg ~ 10 ㎍/kg 피험체 체중인 것이 보다 바람직하다. 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 제제는 과도한 실험없이 본 기술 분야의 당업자에 의해 확인될 수 있는 투여량 섭생으로 이를 필요로 하는 피험체에 투여될 수 있다.
8. 송달
상기 방법에 사용된 폴리펩티드 이량체는 적절한 송달 시스템을 통해 투여될 수 있으며, 정맥내 송달, 근육내 송달, 폐내 송달, 피하 송달, 및 복막내 송달로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 근육내 송달, 정맥내 송달, 또는 피하 송달이 가장 바람직하다. 상기 방법에 사용된 뉴블라스틴 폴리펩티드는 또한 포막내 송달로 투여될 수 있다.
중합체-컨주게이트된 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체의 투여는 예컨대, 적신적이거나 국부적일 수 있다. 제제는 비경구 및 비경구 투여가 아닌 투여에 적합한 것들을 포함하며, 특이적 투여 양식에는 경구, 직장, 구강, 국부, 비강, 안구, 피하, 근육내, 정맥내, 경피, 포막내, 관절내, 동맥내, 거미망막하, 기관지, 임파선, 질, 및 자궁내 투여가 포함된다. 전신적으로 및 국부적으로 모두, 에어로졸과 비경구 투여에 적합한 제제도 포함된다. 바람직한 제제는 피하, 근육내, 또는 정맥내 투여에 적합하다.
9. 섭생
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 이량체의 투여 빈도는 2주 동안 한주에 3번 피험체에 제제를 투여하도록 제공된다. 치료 효율을 최적화하기 위해, 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체를 먼저 상이한 투여 섭생에서 투여한다. 단위 투여량과 섭생은 예컨대, 면역화된 포유류의 종류, 이의 면역 상태, 포유류의 체중을 포함하는 인자에 의존한다. 전형적으로, 조직내 단백질 수치를 임상적 시험 과정의 일부로 적절한 스크리닝 분석을 사용하여 모니터링하여, 주어진 치료 섭생의 효율을 결정한다.
본 발명의 중합체 컨주게이트된 돌연변이 뉴블라스틴 폴리펩티드 이량체의 투여 빈도는 내과의사의 임상적 판단 및 기술 범위 이내이다. 전형적으로, 투여 섭생은 선택적 투여 변수들을 결정할 수 있는 임상적 시도에 의해 이루어진다. 그러나, 수행하는 자는 피험체의 나이, 건강상태, 체중, 성별 및 의료 상태에 따라, 이러한 투여 섭생을 변형할 수 있다. 투여 빈도는 또한 신경병의 만성 및 급성 치료 간에 다양할 수 있다. 또한, 투여 빈도는 치료가 예방적인지 치료적인지에 따라 다양할 수 있다.
본 발명을 이하 비제한적인 실시예로 설명한다.
실시예 1: 아미노-말단 PEG 화된 뉴블라스틴의 생체이용률
CHO 세포- 및 대장균-유래된 재조합 뉴블라스틴을 랫트에 정맥내 투여한 경우, 순환에서 빠르게 제거됨을 관찰하였다. 피하 투여 이후 혈청내 이 단백질은 검출 역 수치 이하였다. 뉴블라스틴의 생체이용률을 증가시키기 위해, 돌연변이된 뉴블라스틴의 PEG화된 형태를 작제하였다.
뉴블라스틴 서열에는 라이신이 존재하지 않으므로, 아민-특이적 PEG화 화학은 야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노 말단에 PEG화를 초래할 것이다. 따라서, 각각의 뉴블라스틴 이량체의 경우, 2개의 PEG 부분이 부착되어야 한다. 따라서, PEG 형태를 아민 특이적 화학을 통해 아미노-말단에 먼저 직접 표적화하였다. 놀랍게도, 대장균에서 발현된 야생형 뉴블라스틴의 PEG화는 단지 2개의 20 kDa PEG가 부착되었음에도, 반감기에 있어 약간의 이점만을 가졌는데, 이는 제거 경로(clearance pathway)에 기초한 메카니즘이 PEG화에 의해 얻어질 수 있는 반감기의 개선보다 지배적이라는 사실을 나타내준다.
실시예 2: PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴의 작제 ( N95K )
다음으로, 내부 아미노산 잔기에 PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 형태의 생체이용률을 조사하였다. 서열번호: 1에 나타낸 대로 번호 매겨진 경우, 위치 14, 39, 68, 및 95에 천연적으로 존재하는 잔기가 대체되어진 일련의 4가지의 돌연변이체는 서열내 선택된 자리에 라이신을 삽입하여 고안하였다. 이들 라이신은 PEG 부착을 위한 선택적인 자리를 제공할 것이다. 이들 자리는 GDNF의 결정 구조를 표면 잔기를 확인하기 위한 골격으로 사용하여 선택하였다(Nat. Struct. Biol. 4: 435-8,1997). 페르세핀/뉴블라스틴 키메라 돌연변이유발 연구(J. Biol. Chem. 275: 3412-20, 2000)를 피해야 하는 구조의 기능적으로 중요한 영역을 확인하는데 사용하였다.
야생형 뉴블라스틴 유전자를 대장균에서 발현하기 위해, 신유전자(syngene)를 저 GC 함량과 바람직한 대장균 코돈을 가지도록 작제하였다. 신유전자를 pET19b의 유도체인, pET19b 및 pMJB164의 2가지 벡터에 클로닝하였다. pET19b의 경우, 뉴블라스틴(NBN113)의 성숙한 도메인을 암호화하는 서열을 개시 메티오닌에 직접 융합시켰다. pMJB164의 경우, 뉴블라스틴의 성숙한 도메인은 히스티딘 태그(즉, 10 히스티딘)에 융합되며, 엔테로키나아제 절단 자리(서열번호: 35 및 36)에 의해 히스티딘 태그로부터 분리된다. 개시 메티오닌은 히스티딘 태그에 앞선다.
2가지의 돌연변이(R39 및 R68)를 표면의 양전하의 분포에 기초하여, 헤파린 결합 자리를 나타낼 수 있는 영역에 표적화 하였다. 이 자리는 단백질의 빠른 제거에 기여한다. 세번째 자리는 야생형 뉴블라스틴에서 천연 당화 자리인, N95로 표적화 하였다. 이 자리는 복합 탄수화물 구조를 가지도록 천연적으로 변형된다. 그러므로, 이 자리를 PEG로 변형하면 기능과 충돌되리라 예측되지 않는다. 4번째 자리(R14)는 임의의 다른 변형에 의해 커버되지 않는 영역에서 선택하였다. 위치 95의 아스파라긴 잔기가 라이신으로 대체된 돌연변이체("N95K 돌연변이체")는 명세서에 공개된 연구로 선택되었다.
랫트 뉴블라스틴 폴리펩티드의 야생형 서열에 하나 이상의 변화를 포함하는 4가지의 상이한 돌연변이된 랫트 뉴블라스틴을 작제하였다. 이들 돌연변이된 뉴블라스틴은 단일 아미노산 치환을 포함한다: R14K; R68K; R39K; 또는 N95K. 표 1A는 예시적인 점 돌연변이를 진한색으로 나타낸다. "X1N1X2" 명명에서, X1은 야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산을 나타내며, N1은 서열번호: 1에 따라 번호 매긴 경우 서열내 X1 아미노산의 숫자적 위치를 나타내고, X2는 나타내는 숫자적 위치 N1에서 야생형 아미노산을 치환하는 아미노산을 나타낸다.
랫트 N95K 뉴블라스틴 돌연변이를 작제하기 위해, 자리-지시된 돌연변이유발을 야생형 랫트 뉴블라스틴을 암호화하는 플라스미드인, pCMB020에서 수행하였다. 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 야생형 랫트 뉴블라스틴 핵산 및 아미노산 서열을 이하 나타낸다:
올리고뉴클레오티드 KD3-210 및 KD3-211을 사용하여 pCM020을 돌연변이 유발시켜 플라스미드 pCMB027를 형성하였다:
KD3-210 5'-GTATCTTTCATGGACGTTATGTTCTACATGGAGAACC-3' (서열번호: 27)
KD3-211 5'-GGTTCTCCATGTAGAACATACGTCCATGAAAGATAC-3' (서열번호: 28)
pCMB027에서, 위치 95의 아스파라긴을 암호화하는 코돈을 라이신을 암호화하는 코돈으로 대체시켰다.
pCMB020의 뉴블라스틴 암호화 서열에서 위치 14의 아르기닌을 암호화하는 코돈을 라이신을 암호화하는 코돈으로 대체시켜, R14K 돌연변이된 뉴블라스틴을 형성하였다. 자리-지시된 돌연변이유발은 올리고뉴클레오티드 KD3-254 및 KD3-255를 사용하여 pCMB020에서 수행하였다:
KD3-254 5'-GCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCGTCTGCG-3' (서열번호: 29)
KD3-255 5'-CGCAGACGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGC-3' (서열번호: 30)
결과 작제물을 pCMB029로 명명하였다.
R68K 돌연변이된 뉴블라스틴은 pCMB020의 뉴블라스틴 암호화 서열에서, 위치 68의 아르기닌을 암호화하는 코돈을 라이신을 암호화하는 코돈으로 대체하여 형성하였다. 자리-지시된 돌연변이유발은 올리고뉴클레오티드 KD3-258 및 KD3-259를 사용하여 pCMB020에서 수행하였다:
KD3-258 5'-GGAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCCGGGATCTAGACC-3' (서열번호: 31)
KD3-259 5'-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-3' (서열번호: 32)
결과 작제물을 pCMB030으로 명명하였다.
R39K 돌연변이된 뉴블라스틴은 pCMB020의 뉴블라스틴 암호화 서열에서, 아미노산 39의 아르기닌을 라이신으로 대체하여 형성하였다. pCMB020의 자리-지시된 돌연변이유발은 올리고뉴클레오티드 KD3-256 및 KD3-257을 사용하여 수행하였다:
KD3-256 5'-GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3' (서열번호: 33)
KD3-257 5'-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3' (서열번호: 34)
대장균에서 돌연변이된 뉴블라스틴의 발현 및 특징분석
발현과 정제를 위해, 랫트 뉴블라스틴 N95K 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드를 성숙한 113 아미노산 뉴블라스틴 서열의 개시부위에 바로 인접한 엔테로키나아제 절단 자리를 가지는 His-태깅된 융합 단백질로서 대장균에서 발현하였다. 대장균을 500 L 발효기에서 배양하고, 냉동 세포 페이스트로 제공하였다. 대장균 세포를 APV 가울린 프레스(Gaulin Press)에서 용해하고, 랫트 뉴블라스틴 N95K를 세척된 불용성의 펠렛 분획에서 회수하였다.
N95K 돌연변이된 뉴블라스틴을 구아니딘 염산염으로 펠렛에서 추출하고, 리폴딩하고, His-태그를 엔테로키나아제로 제거하였다(실시예 5 참고). 그 후, 생성물을 Ni NTA 아가로즈(Qiagen) 및 Bakerbond WP CBX 양이온 교환 수지 상에서 크로마토그래피 하였다.
His 태깅된 생성물을 엔테로키나아제 처리하면 성숙한 서열의 아르기닌 7의 위치에서 단백질의 비정상적인 절단이 초래된다. 결과 1-7 뉴블라스틴 생성물(NBN106-N95K)은 KIRA ELISA에서 충분히 활성이 있으며, 구아니딘-유도된 변성에 대한 민감성에 있어 성숙한 형태와 구조적으로 구별하는 것이 불가능하여, 이후 작업에 사용하였다.
랫트 돌연변이된 뉴블라스틴 NBN106-N95K는 시약으로 분자 질량 10,000 Da을 가지는 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트(SPA-PEG)를 사용하여, 뉴블라스틴 분자당 평균 3.3 PEG 부분으로 PEG화 되었다. 결과 PEG화된 생성물에 대해 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 역상 HPLC, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 스펙트로메트리(MALD/IMS), 펩티드 맵핑, KIRA ELISA에서 활성 평가, 및 내독소 함량의 결정에 의한 분석을 포함한 광범위한 특징분석을 수행하였다. SDS-PAGE 및 SEC에 의해 측정된 PEG화 이전의 뉴블라스틴 N95K 생성물의 순도는 95% 이상이었다. 뉴블라스틴 N95K 생성물은 예측되는 구조와 일치되게 비환원 조건하에서 이량체로서 운반하였다. PEG화 이후, 결과 생성물은 분자당 2개의 PEG(생성물의 5%임), 분자당 3개의 PEG(생성물의 60%임), 분자당 4개의 PEG(생성물의 30%임)를 포함하는 일련의 변형된 부가물, 및 큰 질량을 가지는 여러 소수 형태들로 구성된다. PEG화된 샘플에는 집합체가 존재하지 않았다. 생성물내 비변형된 뉴블라스틴의 잔여값은 정량 한계 이하이었다. 물질의 내독소 함량은 일반적으로 1 EU/mg 이하이었다. KIRA ELISA에서 PEG화된 뉴블라스틴의 특이적 활성은 10 nM이다. PEG화된 생성물을 PBS pH 6.5내 1.1 mg/mL로 제제화 하였다. 야생형 뉴블라스틴(NBN113)의 효능과 유사한 물질은 -70℃에서 저장되는 냉동 액체로 제공될 수 있다.
R14K, R39K, 및 R68K 돌연변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 대장균에서 발현시키고, 정제를 위해 동일 방법으로 처리할 수 있다. PEG화 및 기능의 분석은 NBN106-N95K 뉴블라스틴에 대해 전술한 대로 수행하였다.
PEG 화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106 - N95K 의 제조
대장균에서 생산되고, 5 mM 인산나트륨 pH 6.5, 100 mM NaCl에서 4℃에서 저장되온 230 mL의 리폴딩된 랫트 N95K 돌연변이된 뉴블라스틴(2.6 mg/mL)을 77 mL의 물, 14.4 mL의 1M HEPES pH7.5, 및 2.8 g(10 mg/mL 최종)의 PEG SPA 10,000 Da(Shearwater Polymers, Inc.)로 희석하였다. 샘플을 실온에서 4시간 동안 암실에서 배양한 후, 5 mM 이미다졸(최종)로 처리하고, 여과 및 4℃에서 밤새 저장하였다. 생성물을 2개의 배치(하나는 130 mL의 N95K 벌크를 함유하고, 다른 하나는 100 mL의 벌크를 함유함)에서 얻었다. PEG화된 뉴블라스틴을 Fractogel EMD S03 - (M)(EM Industries) 상에서 반응 혼합물로부터 정제하였다. 컬럼은 실온에서 작동하였다. 모든 완충액은 발열원이 존재하지 않도록 제조하였다. 염화나트륨을 반응 혼합물에 첨가하여, 최종 농도를 87 mM로 하고, 샘플을 45 mL Fractogel 컬럼(5 cm 내부 직경)에 로딩하였다.
컬럼을 1 컬럼 부피의 5 mM 인산나트륨 pH 6.5, 80 mM NaCl, 그 후, 3번의 1 컬럼 부피 엘리컷의 5 mM 인산나트륨(50 mM NaCl 함유)으로 세척하였다. 수지를 2.5 cm 직경 컬럼으로 옮기고, PEG화된 뉴블라스틴을 6번의 10 mL 단계(5 mM 인산나트륨 pH 6.5, 400 mM NaCl 함유), 3번의 단계(500 mL NaCl 함유), 및 6번의 단계(600 mM NaCl 함유)로 컬럼에서 용출하였다. 용출 분획에 대해 280 mn의 흡광도에서 단백질 함량을 분석하고, SDS-PAGE로 변형 함량을 분석하였다. 선택된 분획을 모으고, 0.2 ㎛ 필터로 여과하고, 물로 희석하여 1.1 mg의 PEG화된 랫트 뉴블라스틴/mL을 얻었다. 각각의 배치에 대해 내독소값을 평가한 후, 이들을 모아 0.2 ㎛ 막으로 재여과하였다. 최종 물질을 엘리컷하고, -70℃에서 저장하였다.
정제된 PEG 화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106 - N95K 의 UV-스펙트럼
PEG화된 NBN N95K의 UV 스펙트럼(240-340 nm)을 깨끗한(neat) 샘플에서 얻었다. 샘플은 3번 반복 분석하였다. PEG화된 샘플은 275-277 nm에서 최대 흡광도를 나타내었으며, 247-249에서 최소 흡광도를 나타내었다. 이 결과는 벌크 중간체에 대해 관찰되는 바와 일치한다. PEG화된 생성물의 단백질 농도는 ∑2800.1%=0.50의 소멸 계수를 사용하여 스펙트럼에서 예측하였다. PEG화된 뉴블라스틴 벌크의 단백질 농도는 1.1 mg/mL이었다. 320 nm에서 흡광도 결여가 증명하는 바와 같이 샘플내 혼탁성은 존재하지 않았다.
SDS-PAGE에 의한 PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106 - N95K 의 특징 분석
3, 1.5, 0.75, 및 0.3 ㎍의 생성물을 함유하는 PEG화된 뉴블라스틴의 엘리컷에 대해 4-20% 구배 겔(Owl) 상에서 SDS-PAGE 하였다. 겔을 코마쉬 브릴리언트 블루 R-250로 염색하였다. 분자량 마커(GIBCO-BRL)를 평행으로 이동시켰다.
비환원 조건하에 PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106-N95K의 SDS-PAGE 분석은 분자당 2, 3, 4, 및 4개 이상의 PEG를 가지는 변형에 대응되는 일련의 밴드를 보여주었다. 겉보기 질량 98 kDa를 가지는 주된 밴드는 분자당 3개의 PEG를 함유한다. 정제된 PEG화된 생성물의 경우, 비-PEG화된 뉴블라스틴은 검출되지 않았다. 부착된 2, 3, 및 4개의 PEG를 가지는 생성물의 혼합물의 존재는 MALDI 질량 스펙트로메트릭 분석에 의해 확인하였다. 2, 3, 및 4개의 PEG를 함유하는 생성물의 비율은 덴시토메트리(densitometry)에 의해 측정하였으며, 각각 전체에 대해 7, 62, 및 30%로 결정되었다.
크기 배제 크로마토그래피에 의한 PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106 -N95K의 특징 분석
PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106-N95K를 이동상으로 5 mM MES pH 6.5, 300 mM NaCl을 사용하여, 분석 Superose 6HR10/30 FPLC 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피 하였다. 컬럼을 20 mL/h로 이동시켰다. 용출 분획을 280 nm 흡광도에서 모니터링 하였다. PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴은 큰 유체역학 부피의 PEG와 일치하는 약 200 kDa의 겉보기 분자량을 가지는 단일 피크로 용출되었다. 집합체의 존재는 관찰되지 않았다. 약 30kDa의 겉보기 분자량을 가지는 유리 뉴블라스틴은 제조시 검출되지 않았다.
역상 HPLC 에 의한 PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106 - N95K 의 특징 분석
PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106-N95K를 Vydac C4(5 ㎛, 1 x 250 mm) 컬럼 상에서 역상 HPLC 하였다. 컬럼을 40 내지 60% B의 60 mm 구배를 사용하여 전개시켰다(완충액 A: 0.1% TFA, 완충액 B: 75% 아세토니트릴/0.085% TFA). 컬럼 용출물을 214 nm의 흡광도에서 모니터링하고, 이후의 분석을 위해 분획을 회수하였다. PEG화된 NBN106-N95K는 C4 컬럼 상에서 역상 HPLC에 의해 다양한 디(60.5 mm), 트리(63.3 mm), 및 테트라(67.8 mm) PEG화된 성분으로 분획화 되었다. 피크의 상대 강도는 성분의 비가 각각 5.4, 60.5, 및 30.1 %임을 제안해준다. 피크 확인은 MALDI-MS에 의해 하였다. 생성물내 비-PEG화된 NBN106-N95K(5-15분에서 용출)는 존재하지 않았다.
질량 스펙트로메트리에 의한 PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106 - N95K 의 분석
PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106-N95K를 C4 Zip Tip 상에서 탈염하고, Voyager-DE™ STR(PerSeptive Biosystems) 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간(time-of-flight)(MALDI-TOF) 질량 스펙트로미터 상에서 매트릭스로 시나핀산을 사용하여 질량 스펙트로메트리로 분석하였다. 0.5 ㎕의 정제된 단백질을 표적 플레이트에서 0.5 ㎕의 매트릭스와 혼합하였다. PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106-N95K의 질량 스펙트로메트리는 3가지의 부산물의 단일 및 이중 하전된 형태를 나타내주었다. 관찰되는 43803 Da, 54046 Da, 및 64438 Da의 질량은 분자당 2, 3, 및 4개의 PEG의 변형과 일치한다.
펩티드 맵핑에 의한 PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106 - N95K 의 분석
PEG화 반응의 특이성을 펩티드 맵핑으로 측정하였다. PEG화된 뉴블라스틴은 C4 컬럼 상의 HPLC에 의해 디, 트리 및 테트라 PEG화된 성분으로 분리되며, 그 후 환원, 알킬화되며, 추가적으로 단일 쇄 성분으로 분리된다. 이들 성분 및 환원 및 알킬화된 비-PEG화된 NBN106-N95K을 대조군으로 Asp-N 프로티나제로 분해시키고, 결과 절단 생성물을 Vydac C18 (5 ㎛,1 x 250 mm) 컬럼 상에서 0 내지 60% B의 60nm 구배(완충액 A: 0.1% TFA, 완충액 B: 75% 아세토니트릴/0.085% TFA)를 사용하여, 역상 HPLC로 분획화 하였다. 컬럼 용출물을 214 mm의 흡광도에서 모니터링 하였다.
랫트 뉴블라스틴 서열은 5개의 내부 아스파르트산을 함유하므로, 엔도프로티나제 Asp-N으로 절단한 경우 단일 절단 프로파일이 얻어지리라 예측되었다. 랫트 N95K의 Asp-N 절단시의 피크 모두를 질량 스펙트로메트리 및/또는 에드만(Edman) 아미노-말단 서열분석에 의해 확인할 수 있으므로, 펩티드 맵은 피크의 존재 또는 부존재에 의해 변형 자리를 탐지하기 위한 간단한 수단으로서 사용될 수 있다. 다양한 피크의 확인 결과를 표 7에 요약한다.
보유 시간에 따른 피크(mm) 관찰된 질량 평균 이론적인 질량 평균 잔기 할당(서열번호: 2) 아미노산 서열
38.8 1261.1(M) 1262.4 102-113 DHLSATACGCLG
40.7 1090.9 1092.2 93-101 DVKSTWRTV
44.6 2508.4 2508.9 35-54 DELIRFRFCSGSCRRARSPH
46.0 2437.0 2437.8 12-34 DARGCRLRSQLVPVSALGLGHSS
51.4 3456.7 3456.0 55-86 DLSLAS...CRPTRY
51.9 4134.4 55-92(oxid) DLSLAS...CRPTRYEAVSFM
53.2 4136.3* 4120.8 55-92 DLSLAS...CRPTRYEAVSFM
(M): 모노로스토픽 질량
* : MALDI시 메티오닌을 함유하는 펩티드의 산화로 인한 것임
뉴블라스틴은 천연적으로 동종이량체로 존재하므로, 랫트 돌연변이된 뉴블라스틴 NBN106-N95K 생성물은 4개의 가능성있는 PEG화 자리, 쇄들 각각의 2개의 아미노-말단 아민, 및 작제물 제조를 위한 2개의 N95K 자리를 함유한다. 디-PEG화된 쇄의 펩티드 맵에서, N95K 돌연변이를 가지는 펩티드를 함유하는 피크만이 PEG 변형에 의해 변화되었다. 다른 피크들 중 어떤 것도 PEG 변형에 의해 영향받지 않았다. 따라서, 맵핑 데이타는 PEG 부분이 특이적으로 이 펩티드에 부착하며, 스크리닝된 다른 펩티드에는 부착하지 않는다는 것을 나타낸다. 2번째 가능성 있는 부착 자리, 아미노-말단은 단지 3개의 아미노산 길이인 펩티드 상에 있으며, 펩티드 맵에서 검출되지 않았다. 부가적인 PEG 부착 자리가 이 자리에 존재함이 추측된다. 이러한 추측과 일치하게, 적은 비율의 랫트 돌연변이된 뉴블라스틴 N95K가 절두되지 않고, 성숙한 Ala-1 서열을 함유한다. 이 펩티드는 30 ㎛에서 용출되며, 펩티드 맵상에서 비-PEG화된 분해물에서는 관찰되나, PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106-N95K 분해물에서는 존재하지 않았다.
실시예 3: 키나아제 수용체 활성화( KIRA ) ELISA에서 내부 PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106 - N95K 의 효능 평가
PEG화된 돌연변이 랫트 뉴블라스틴의 효능은 인산화된 RET의 존재에 대해 특이적인 ELISA에서, 뉴블라스틴 활성에 대한 레포터로서 c-Ret의 뉴블라스틴 의존성 활성화/인산화를 사용하여 측정하였다. NB41A3-mRL3 세포, 즉, Ret 및 GFRα3을 발현하는 부착성 쥐과 뉴블라스토마 세포주를 10% 소 태아 혈청이 보충된, 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)에서 24-웰 플레이트의 웰당 2 x 105 세포로 도말하고, 18시간 동안 37℃ 및 5% C02에서 배양하였다.
세포를 PBS로 세척하고, 10분 동안 37℃ 및 5% C02에서, 0.25 mL의 DMEM으로 뉴블라스틴을 연속 희석하였다. 각각의 샘플을 2회 반복 분석하였다. 세포를 1 mL의 PBS로 세척하고, 1시간 동안 4℃에서 0.30 mL의 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5 % Nonidet P40, 0.2% 나트륨 데옥시콜레이트, 50 mM NaF, 0.1 mM Na3V04, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오리드로 플레이트를 살살 흔들면서 용해하였다. 용해물을 피펫팅을 반복하여 추가적으로 교반시키고, 0.25 mL의 샘플을 50 mM 탄산 완충액, pH 9.6 중의 5 ㎍/mL의 항-Ret mAb(AA. GE7.3)로 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트에 4℃에서 18시간 동안 옮기고, 실온에서 1시간 동안 블록 완충액(20 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20(TBST), 1% 정상 마우스 혈청과 3% 소 혈청 알부민을 함유)으로 블록킹 하였다.
실온에서 2시간 동안 배양한 후, 웰을 TBST로 6번 세척하였다. 블록 완충액내 2 ㎍/mL의 호르세라디쉬 페록시다아제(HRP)-컨주게이트된 항-포스포티로신 4G10 항체로 실온에서 2시간 동안 웰을 배양시키고, TBST로 6번 세척하고, HRP 활성을 450 nm에서 비색 검출 시약으로 측정함으로써, 인산화된 Ret를 검출하였다. 용해물이나 용해 완충액으로 처리된 웰의 흡광도 값을 측정하고, 백그라운드가 보정된 시그날을 활성화 혼합물에 존재하는 뉴블라스틴 농도의 함수로 플랏하였다. KIRA ELISA에서 PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴(3(,4) X 10 kDa PEG NBN106-N95K)의 효능은 야생형 NBN113 물질의 효능과 구별가능하지 않았다(도 1 및 표 8). 2번의 냉동-해동 사이클은 효능에 아무런 영향을 주지 않았으며, 이러한 처리 이후, 샘플의 혼탁도에 뚜렷한 증가가 존재하지 않았는데, 이는 샘플이 이 연구에서 안전하게 해동될 수 있음을 나타낸다. 분자당 3개 및 4개의 10 kDa PEG를 가진 생성물의 활성을 각각 평가하는 독립적인 연구에서, 3개의 PEG를 가지는 부산물은 완전히 활성인 반면, 4개의 PEG 생성물은 감소된 효능을 가졌다(도 2 및 표 8). 이 데이타는 3(,4) X 10 kDa PEG NBN106-N95K(도 1) 및 3 X 10 kDa PEG NBN106-N95K(도 2)가 비돌연변이된(야생형) 뉴블라스틴, NBN113과 유사한 정도 및 동일한 투여량-의존성을 가지고 Ret을 활성화 시킨다는 것을 설명해준다. 그러나, 4 X 10 kDa PEG NBN106-N95K(도 2)가 비돌연변이된(야생형) NBN113과 유사한 정도로 Ret을 활성화시킴에도 불구하고, 4 X 10 kDa PEG NBN106-N95K는 Ret의 활성화 면에서 비돌연변이된(야생형) NBN113에 비해 거의 10배 낮다. 예측되는 EC50은 표 8에 나타낸다.
실시예 4: 랫트 및 마우스에서 내부 PEG화된 돌연변이 랫트 뉴블라스틴 NBN106 - N95K 의 약동력학적 연구
랫트와 마우스 모델에서 다양한 PEG화된 및 비-PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 생성물의 약역학적 성질을 조사하였다(결과 요약은 표 8을 참고).
이 데이타는 3.3, 10,000 Da PEG를 가지는 랫트 돌연변이된 뉴블라스틴 NBN106-N95K의 PEG화가 뉴블라스틴의 반감기와 생체이용률에 현저한 효과를 초래함을 보여준다. 스프라지 다울리(Sprague Dawley) 랫트에 1 mg/kg IV 투여 후, 3000 ng/mL의 PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴의 피크 값은 7분 후에 검출되었으며, 700 ng/mL의 값은 24시간 후에 검출되고, 200 ng/mL은 48시간 후, 100 ng/mL은 72시간 후에 검출되었다. 반대로, 1 mg/kg IV 투여 이후 비-PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴 N95K의 경우는, 1500 ng/mL의 값은 7분 후에 검출되었으나, 값은 빠르게 감소하여 3시간 후에는 70 ng/mL이 되었으며, 7시간 후에는 검출되지 않았다. PEG화의 영향은 피하 투여에 의해 PEG화된 뉴블라스틴으로 처리된 동물에서 보다 더욱 두드러졌다.
1 mg/kg s.c. 투여 이후, PEG화된 뉴블라스틴의 순환 값은 24시간 이후 최대 200 ng/mL에 도달하며, 이 값은 3일의 연구 기간 동안 유지되었다. 대조적으로, 비-PEG화된 돌연변이 뉴블라스틴을 투여한 이후에는 임의의 어떠한 시점에서도 뉴블라스틴이 검출되지 않았다.
PEG화된 N95K 샘플의 분석은 각각 상이한 PK 프로파일을 나타내는, 분자당 2, 3 및 4개의 PEG를 포함하는 부가물의 존재에 의해 복잡해진다. 초기 PK 연구에서는, 마우스를 다양한 투여 후보 및 경로를 통해 스크리닝을 용이하게 하는 데 사용하였다. 마우스 연구는 후보들간의 생체이용률에 있어 극적인 차이를 나타내었다. 그러나, 3.3 10 kDa PEG 부가물을 랫트에서 평가한 경우, 마우스보다는 랫트에서 덜 생체이용가능하다는 것이 밝혀졌다. 이러한 생체이용률에 있어서의 차이는 i.p. 투여 이후 특히 두드러졌다. 마우스에서의 값은 7시간 후 1600 ng/mL에 도달하였으며, 24시간 후에는 400 ng/mL로 유지되었다. 대조적으로, 랫트에서의 값은 4 내지 48시간 동안 100 ng/mL로 일정하였다.
PK 연구에서 초래된 2가지의 놀랍고도 예측하지 못했던 결과를 표 8에 요약하였다: 1) 비-당화된 뉴블라스틴의 아미노-말단 아미노산의 PEG화는 실질적으로 혈청 노출을 증가시키기에 충분하지 않았으며; 2) 아미노산 95번의 변형(예, PEG화 또는 당화)을 가지는 뉴블라스틴의 아미노-말단 아미노산(들)의 PEG화는 혈청 노출을 실질적으로 증가시키기에 충분하였다. 예컨대, 당화된 NBN104(CHO)는 s.c. 투여 이후에 검출가능한 노출을 보이지 않았으나; 당화된 1 X 20 kDa PEG NBN104(CHO)는 s.c. 투여 이후 높은 혈청 노출을 보였다. 유사하게, 2 X 20 kDa PEG NBN113은 s.c. 투여 이후 저-내지-중간 혈청 노출을 보였으나; 당화된 2 X 20 kDa PEG NBN104(CHO)는 s.c. 투여 이후 높은 혈청 노출을 보였다. 이러한 결과는 내부 아미노산(예, 위치 95번)의 중합체 컨주게이션 또는 내부 아미노산(예, 위치 95번)에서의 당화를 가지는, 뉴블라스틴의 아미노-말단 아미노산(들)의 중합체 컨주게이션이 전신 투여 후 실질적으로 증가된 혈청 노출을 초래한다는 것을 나타내준다.
야생형 랫트 뉴블라스틴 및 돌연변이된 뉴블라스틴 N95K 모두 STZ 당뇨성 랫트 신경병 모델에서 효율 테스트에 대해 > 95%로 정제되고 리폴딩 되었다. 야생형 뉴블라스틴은 동물 테스트에 직접 제제화되며, N95K는 10 kDa PEG-SPA로 PEG화를 위해 준비된다. 리폴딩 및 정제 목적을 달성하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하는 리폴딩 방법은 다량 및 고농도의 대장균 봉입체로부터 뉴블라스틴을 재생하기 위해 개발되었다. SEC에 덧붙여, Ni-NTA 및 CM 실리카 컬럼 크로마토그래피 단계를 최종 단백질 순도를 증가시키기 위해 사용하였다. 단백질에 대해 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피, ESMS, KIRA ELISA에 의한 활성 평가, 및 내독소 함량의 측정에 의한 분석을 비롯한, 광범위한 특징분석을 하였다. 최종 단백질 생성물의 SDS-PAGE 및 SEC은 95% 이상의 순도를 나타낸다. 각각의 생성물의 내독소 값은 < 0.2 EU/mg 이었다. KIRA ELISA에서 양 단백질의 특이적 활성은 거의 10 nM이었다. 야생형 뉴블라스틴은 1.0 mg/ml로, N95K는 2.6 mg/ml로 포스페이트-완충된 염수(PBS) pH6.5내에 제제화 하였다. 야생형 뉴블라스틴은 15 ml 튜브로 엘리컷하고, -70℃에서 냉동 저장하며, N95K는 엘리컷하고 냉동하기 전에 PEG화 하였다.
실시예 5: 야생형 뉴블라스틴 및 돌연변이된 N95K 뉴블라스틴의 리폴딩 및 정제
두 뉴블라스틴 형태를 성숙한 113개의 아미노산 서열의 시작 부위에 바로 인접한 엔테로키나아제 절단 자리를 가지는 히스티딘(His)-태깅된 융합 단백질로서, 대장균에서 발현시켰다. 야생형(1.8 kg 펠렛) 또는 N95K(2.5 kg 펠렛) 뉴블라스틴을 발현하는 박테리아를 APV 가울린 프레스(Gaulin Press)를 사용하여, 2 리터의 PBS 중에서 용해하였다. 그 후, 원심분리(10,000 rpm)하여 봉입체를 펠렛화하고, 각각의 상청액을 따라버렸다. 봉입체 펠렛을 세정 완충액(0.02M Tris-HCl pH 8.5, 0.5 mM EDTA)으로 2번 세척하고, 트리톤 X-100(2%, v/v)이 함유된 동일한 완충액으로 2번 세척한 후, 세제가 포함되지 않은 완충액으로 2번 더 세척하였다. 두 펠렛을 6M 구아니딘 염산염, 0.1M Tris pH8.5, 0.1M DTT, 및 1 mM EDTA를 사용하여 용해화 하였다. 용해화 과정을 돕기 위해, 각각의 펠렛을 폴리트론 호모게나이저를 사용하여 호모게나이제이션한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 용해된 단백질을 원심분리하고, Superdex 200(0.05M 글리신/H3P04 pH 3.0(2M 구아니딘-HCl 함유)로 평형화된, 5.5 리터 컬럼)을 통해 분당 20 ml로, 변성 크로마토그래피 하였다.
변성된 뉴블라스틴을 SDS-PAGE로 확인하였다. 야생형-뉴블라스틴 또는 N95K를 함유하는 분획을 모으고, Amicon 2.5-리터 교반 셀 농축기를 사용하여 거의 250 mL로 농축하였다. 임의의 침전물을 제거하기 위해 여과한 후, 농축된 단백질을 0.1M Tris-HCl pH7.8, 0.5 M 구아니딘-HCl, 8.8 mM 환원된 글루타티온 및 0.22 mM 산화된 글루타티온으로 평형화된, Superdex 200을 통해 재생 크기 크로마토그래피 하였다. 컬럼을 분당 20 mL로 0.5 M 구아니딘-HCl을 사용하여 전개하였다. 재생된 야생형 뉴블라스틴 또는 N95K 뉴블라스틴을 함유하는 분획을 SDS-PAGE로 확인하고, 모아서, His 태그 제거에 필요할 때까지 4℃에서 저장하였다.
야생형 뉴블라스틴 및 돌연변이된 N95K 뉴블라스틴을 희석에 의해 리폴딩하는 대안적인 방법
뉴블라스틴을 희석에 의해 리폴딩하기 위해, 용해화된 단백질을 리폴딩 완충액(0.5 M 구아니딘-HCl, 0.35 M L-아르기닌, 50 mM 인산칼륨(pH 7.8), 0.2 mM 환원된 글루타티온, 1 mM 산화된 글루타티온, 및 0.1% Tween-80)에 최종 농도 0.1 mg/ml로 신속하게 희석하고, 교반없이 실온에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 리폴딩된 뉴블라스틴을 25배로 농축하고, 40 mM 이미다졸이 되게 하고, Ni-NTA 아가로즈를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하여, 추가적으로 생성물을 농축하고, 숙주 세포 단백질을 제거하였다. 컬럼을 10배 컬럼 부피의 세정 용액(40 mM 이미다졸, 0.5 M 구아니딘-HCl)으로 세척하였다. 그 후, 뉴블라스틴을 0.2 M 이미다졸과 0.5 M 구아니딘-HCl로 수지로부터 용출하였다.
Ni - NTA 크로마토그래피에 의한 컬럼 - 리폴딩된 뉴블라스틴의 농축
컬럼-재생된 뉴블라스틴을 뉴블라스틴 단량체들간의 디설피드 형성을 촉진하기 위해 정제 과정 이전에 적어도 24시간 동안 4℃에서 저장하였다. 이 동안, 침전물이 형성되며, 이는 0.2 μ 폴리에테르 설폰(PES) 필터 유닛을 통해 여과하여 제거하였다. 비특이적 결합을 감소시키기 위해, 단백질 용액을 20 mM 이미다졸이 되게 한 후, 분당 50 ml로, 컬럼 완충액(0.5 M 구아니딘 및 20 mM 이미다졸)으로 평형화된 100 ml Ni-NTA(Qiagen) 컬럼에 로딩하였다. 단백질 적용 이후, 컬럼을 동일한 완충액을 사용하여 베이스라인으로 세척하였다. 뉴블라스틴을 0.5 M 구아니딘-HCl 및 0.4 M 이미다졸을 함유하는, 약 300 mL의 용출 완충액을 사용하여, 수지로부터 용출시켰다. 용출 이후, 뉴블라스틴을 10배 부피의 5 mM HCl에 대해, 실온에서 밤새 10 kDa 투석 튜빙을 사용하여 투석하였다. 투석은 오염된 물질의 가수분해를 촉진하며, 구아니딘-HCl 및 이미다졸 농도를 0.05 M 및 0.04M로 각각 감소시킨다.
라이실 엔도펩티다제 또는 엔테로키나아제에 의한 His 태그의 제거
다음 날, 투석 동안 형성된 임의의 침전물을 여과로 제거하였다. 이후 정제 단계를 컬럼- 및 희석-리폴딩된 뉴블라스틴 생성물 모두에 적용하였다. 단백질 샘플은 약 150 mM의 잔여 구아니딘-HCl를 포함하는 최종 염 농도를 위해, 5M 스톡에 NaCl을 추가하여 0.1 M NaCl로 만들었다. 이 농도는 전도율 미터를 사용하여 확인하였다. 부가적으로, 1 M HEPES pH 7.8를 25 mM 최종 농도로 첨가하였다. His 태그를 절단하기 위해, 라이실 엔도펩티다제를 야생형 뉴블라스틴에 첨가하고, 엔테로키나아제를 N95K 돌연변이된 뉴블라스틴에 첨가하여, 둘 다 약 1:300의 프로테아제 대 뉴블라스틴 비로 하였다. Lys 95의 돌연변이된 단백질에서의 부가적인 프로테아제 절단 자리로 인해, N95K 돌연변이된 뉴블라스틴에 대해서는 엔테로키나아제를 라이실 인도펩티다제 대신 사용하였다. 샘플을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 분해를 SDS-PAGE로 모니터링 하였다.
Ni - NTA 크로마토그래피에 의한 His 태그 제거
프로테아제-처리된 뉴블라스틴을 분당 50 mL로 0.5M 구아니딘-HCl 및 20 mM 이미다졸로 평형화된 100 mL Ni-NTA 컬럼에 첨가하였다. 컬럼을 동일한 완충액으로 베이스라인으로 세척하였다. 컬럼에서 세척되어 나온 임의의 단백질을 His 태그가 없는 뉴블라스틴을 함유하는 유통(flow-through) 단백질과 모았다.
CM 실리카 크로마토그래피
Ni-NTA 크로마토그래피 직후, 단백질을 CM 실리카 수지를 통해 추가 정제하였다. 로딩 완충액(5 mM 포스페이트 pH 6.5, 150 mM NaCl)로 평형화된, 20 mL CM 실리카 컬럼에 뉴블라스틴을 분당 20 mL로 로딩하였다. 컬럼을 20 컬럼 부피의 세척 완충액(5 mM 포스페이트 pH 6.5, 400 mM NaCl)으로 세척하고, 단백질을 5 mM 포스페이트 pH 6.5는 함유하나, 1 M NaCl은 함유하지 않는 용출 완충액으로 용출하였다. 용출된 단백질을 밤새 포스페이트 단독에 대해 투석하여, 염 농도를 N95K의 경우 100 mM로, 야생형 뉴블라스틴의 경우 150 mM로 감소시켰다. 두 샘플을 0.2 μ PES 필터 유닛으로 여과하고, SDS-PAGE로 분석한 후, 추가적인 특징분석 및/또는 PEG화를 위해 필요할 때까지 4℃에서 저장하였다.
야생형 및 N95K 돌연변이된 뉴블라스틴 단백질 제제에 대해 UV 스펙트럼 분석을 하여, 280에서의 흡광도를 측정하였다. 마이크로 석영 큐벳을 사용하고, 버퍼 단독을 블랭크로 하여, 100 ㎕의 야생형 또는 N95K 돌연변이된 뉴블라스틴을 Beckman 흡광기를 사용하여 230 내지 330 nm에서 연속 스캐닝하였다. 이러한 분석에 기초하여, 야생형 뉴블라스틴은 1.1 mg/ml의 농도이고, N95K 돌연변이된 뉴블라스틴은 2.6 mg/ml의 농도임이 결정되었다(A280 nm - E0 .1% = 0.5 각각의 단백질 당 사용). 1% 이하의 침전 물질이 330 nm의 흡광도에 기초하여 확인되었다.
두 단백질 제제의 순도를 평가하기 위해, 각각의 샘플(0.5 mg)을 16/30 Superdex 75 컬럼을 통해 크기 배제 크로마토그래피 하였다. 이 컬럼은 400 mM NaCl을 함유하는 5 mM 포스페이트 pH 6.5로 평형화되었으며, 분당 1.5 mL의 유속으로 전개하였다. 280 mn에서의 흡광도에 기초하여, 야생형 및 N95K 돌연변이된 뉴블라스틴 제제 모두는 예측되는 분자량(23-24 kDa)을 가지는 단일 피크로 이동되며, 이들은 어떠한 뚜렷한 단백질 오염을 가지지는 않았다.
야생형 및 N95K 돌연변이된 뉴블라스틴 단백질을 모두 2.5 M 구아니딘-HCl, 60 mM Tris pH 8.0 및 16 mM DTT에서 환원하였다. 환원된 샘플을 쇼트 C4 컬럼을 통해 탈염시키고, 트리플 사중극자 장치를 이용하여 ESMS에 의해 온라인으로 분석하였다. ESMS 원 데이타를 MaxEnt 프로그램에 의해 해석하여 질량 스팩트럼을 생성하였다. 이 과정은 다중 하전된 시그날을 킬로달톤(kDa)으로 분자량에 직접 대응되는 하나의 피크로 붕괴되도록 해준다. 야생형에 대해 해석된 질량 스펙트럼은 주된 종이 12046 Da임을 보여주며, 이는 단백질의 113 아미노산 형태에 대해 예측되는 분자량임 12046.7 Da과 일치하는 것이다. 소수 성분도 관찰되며(12063 Da), 이는 산화 생성물의 존재를 제안해준다. 3개의 피크가 N95K 돌연변이된 뉴블라스틴 단백질 샘플에서 확인되었다. 주된 성분은 11345 Da의 겉보기 분자량을 나타내며, 이는 단백질의 106 아미노산 형태에 대해 예측되는 질량과 일치하는 것이다. 다른 2개의 피크는 11362 및 12061 Da의 질량을 가졌으며, 이는 N95K 산화와 113 아미노산 형태의 존재를 각각 제안해준다.
N95K 돌연변이된 뉴블라스틴 단백질 제제에서 106 및 113 아미노산 형태의 존재는 엔테로키나아제로의 분해로 인한 것이다. Biozyme 유래의 이 프로테아제는 소의 장점막에서 정제된 천연 효소 제제이며, 다소 트립신 오염을 함유한다고 보고되어 있다(엔테로키나아제 ㎍ 당 0.25 ng 트립신). 따라서, 트립신은 N95K 돌연변이된 뉴블라스틴 단백질에서 Arg 7의 카르복시 말단면에 작용하여, 우세한 106 아미노산 형태를 생성할 수 있다. 한편, 야생형 뉴블라스틴을 절단하는데 사용된 이실 엔도펩티다제는 His 태그내에 함유된 라이신 잔기의 카르복시 말단면에 작용하여, 성숙한 113 아미노산 뉴블라스틴 형태를 생성하는 단일 프로테아제 활성을 가진다. 뉴블라스틴의 106 및 113 아미노산 형태 모두 테스트된 모든 분석에서 동일한 활성을 가지며, 구아니딘-HCl 안정성 테스트에서 유사하게 행동한다.
실시예 3에 서술된 KIRA ELISA를 사용하여, NB41A3-mRL3 세포에서 c-Ret 인산화를 자극하는 능력에 의해 뉴블라스틴 활성을 측정하였다. 인산화된 Ret는 HRP-컨주게이트된 포스포티로신 항체(4G10 ; 웰당 0.2 ㎍)와 함께 포획된 수용체를 배양하여 (2시간) 검출하였다. 배양 이후, 웰을 TBST로 6번 세척하고, HRP 활성을 비색 분석으로 450 nm에서 측정하였다. 용출물 또는 용출 완충액 단독으로 처리된 웰의 흡광도 값을 측정하고, 백그라운드에 대해 보정하고, 데이타를 활성화 혼합물내에 존재하는 뉴블라스틴의 농도의 함수로 플롯하였다. 이 데이타는 정제된 뉴블라스틴 폴리펩티드가 인산화된 RET의 출현을 초래하며, 이는 정제된 뉴블라스틴이 이 분석에서 활성있음을 나타내주는 것이다.
실시예 6: 혈청 알부민- 뉴블라스틴 컨주게이트의 제조
PBS내 1 mg/ml의 농도의 야생형 랫트 뉴블라스틴을 1 mM 설포-SMCC(Pierce)로 처리하고, 탈염하여 과량의 교차결합제를 제거하였다. 야생형 뉴블라스틴 단백질은 이의 아미노-말단에 단일 아민만을 함유하며, 유리 설피드릴기를 함유하지 않기 때문에, SMCC과의 반응은 이의 아미노-말단에 부착된 SMCC를 가지는 뉴블라스틴의 자리-특이적 변형을 초래하리라 예측된다.
다음으로, 60 ㎍의 뉴블라스틴-SMCC 컨주게이트를 120 ㎍의 소 혈청 알부민과 배양하고, SDS-PAGE에 의해 가교결합의 정도를 분석하였다. BSA는 단일 유리 SH 기를 함유하므로, 뉴블라스틴-SMCC 컨주게이트와의 반응은 SMCC 상의 말레이미드를 통해 이 자리 변형을 초래하리라 예측된다. 이러한 조건하에, 큰 분자량을 가지는 2개의 추가적인 밴드가 관찰되는데, 이는 단일 BSA 부분과 2개의 BSA 분자를 가지는 변형화된 뉴블라스틴의 질량과 일치하는 것이며, 각각의 뉴블라스틴 분자는 반응을 일으킬 수 있는 2개의 아미노-말단을 함유하므로, 이러한 개념과 일치하는 것이다. 이러한 밴드의 형성과 일치하게, 뉴블라스틴-SMCC 및 BSA 밴드의 강도가 감소하였다. 잔여 뉴블라스틴 밴드의 강도에 기초하여, 반응은 70-80% 완료된 것으로 보여진다.
전술한 PEG화 연구에 대해 서술된 대로 필수적으로, Superdex 200 컬럼(Pharmacia) 상에서, 물질을 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피 함으로써, 단일 치환된 생성물을 반응 혼합물로부터 정제하였다. 겔 여과 조작의 컬럼 분획을 SDS-PAGE로 분석하고, 단일 치환된 생성물을 포함하는 분획에 대해서는 280 nm에서의 흡광도로 단백질 함량을 분석하였다. BSA의 질량이 거의 뉴블라스틴의 질량의 2배이므로, 겉보기 농도를 3의 인자로 나누면 뉴블라스틴 당량이 얻어진다. 이 분획에 대해 KIRA ELISA로 기능을 분석하였다. 야생형- 및 BSA-컨주게이트된 뉴블라스틴의 IC50 값은 3-6 nM이며, 이는 BSA에 대한 컨주게이션이 기능을 절충시키지 않음을 나타낸다.
예비적인 연구들이 BSA로 수행되었으나, 랫트와 인간 유래의 대응되는 혈청 알부민 단백질 또한 유리 SH를 함유한다. 따라서, 유사한 접근법이 적용되어, 임상적 시도를 위해, 랫트 및 인간 혈청 알부민-인간 뉴블라스틴에서 PK 및 효율 연구를 수행하기 위해, 랫트 혈청 알부민-랫트 뉴블라스틴 컨주게이트를 생성할 수 있을 것이다. 유사하게, SMCC는 한쪽에 아미노 반응성기를 함유하고 다른 쪽에 티올 반응성기를 함유하는 임의의 수의 가교결합제로 치환될 수 있다. 티올 반응성-말레이미드가 삽입된 아민 반응성 가교결합제의 예에는 AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, 또는 GMBS가 있으며, 티올 반응성-할로아세테이트기가 삽입된 아민 반응성 가교결합제의 예에는 SBAP, SIA, SIAB가 있고, 설프히드릴기와의 반응을 위해 보호 또는 비보호된 티올을 제공하여 환원성 결합을 형성하는 아민 반응성 가교결합제의 예에는 SPDP, SMPT, SATA, 또는 SATP가 있으며, 이 모두는 Pierce에서 구입가능하다. 이러한 가교결합제는 단순히 예시적인 것이며, 많은 대안적인 것들이 뉴블라스틴의 아미노-말단을 혈청 알부민과 결합시키리라 예측된다. 당업자라면 뉴블라스틴의 아미노-말단 또는 혈청 알부민의 티올 부분에 표적화되지 않는 혈청 알부민에 대한 컨주게이트를 생성할 수 있다. 뉴블라스틴-혈청 알부민 융합은 뉴블라스틴을 혈청 알부민 유전자의 아미노-말단, 카르복시-말단, 또는 양쪽 말단에 융합시켜, 유전공학 기법을 사용하여 얻으며, 이는 또한 기능적일 것이 예측되어야 한다.
동물과 그 결과로서 인간에서 연장된 반감기를 가지는 생성물을 초래하는, 임의의 뉴블라스틴-혈청 알부민 컨주게이트에 반복적인 적용을 통해, 이 방법은 확장될 수 있다.
실시예 7: 인간 뉴블라스틴의 결정화 및 구조 결정
셀레노메티오닌 표지된 뉴블라스틴을 표준 방법을 사용하여 발현시켜, 메티오닌 생합성을 억제하였다(Van Duyne 등, 1991, Science 252, 839-842). 야생형 뉴블라스틴 및 셀레노메티오닌-결합된 뉴블라스틴을 0.8 M 아르기닌 내 17 mg/ml로 농축하였다. 단백질 스톡을 0.8 M 아르기닌 내 17 mg/ml으로 농축하였다. 행잉-드롭(hanging-drop) 증기 확산법으로 결정을 1.25 M 황산마그네슘, 0.1 M MES pH 6.5으로부터 20℃에서 증가시켰다(Jancarik, J. & Kim, S. H., 1991, J. Appl . Crystallogr. 24, 409-411). 가장 재생가능한 결정은 마이크로시딩(microseeding)으로 얻었다. 60초마다 5% 에틸렌 글리콜을 최종 농도 1.25 M 황산마그네슘, 0.1 M MES pH 6.5, 및 30%(v/v) 에틸렌 글리콜이 되도록 첨가하여 결정을 냉보호한 후, 액체 질소로 신속하게 옮겼다.
각 면에서 약 100 미크론의 결정이 National Synchrotron Light Source(Upton, NY)의 빔라인 X4A에서 1.6A로 분산된다. HKL 프로그램 패키지(Otwinowski (1993): Proceeding of the CCP4 Study Weekend: Data Collection and Processing (Sawer 등, Eds.) pp. 56-62, Daresbury Laboratory, Warrington)로 프로세싱된 데이타는 결정이 비대칭 단위당 1 공유 이량체를 가지며, 대략적으로 a=1115 Å, b=33 Å, c=55 Å 및 α=γ=90°, β=99°의 셀 디멘젼을 가지는 C2 스페이스군에 속한다는 것을 밝혀주었다.
결정 구조는 다중 동형 대체로 확인되었다. 천연 뉴블라스틴 결정을 1 mM PtCl4에 4시간 동안, 10 mM IrCl3에 72시간 동안, 10 mM IrCl6에 18시간 동안 침지시키고, 데이타를 회수하여, HKL 스위트로 프로세싱 하였다(Otwinowski 등, supra). 2개의 셀레노메티오닌 자리를 동형 및 이상 차이 패터슨(patterson)으로 조사하여 위치 결정하였다. 잔여 자리를 SOLVE(4)를 사용하여 위치 결정하였다. 상은 RESOLVE(Terwilliger 등, 1999,. ActaCrystallogr. D. 55, 849-861)에 의해 개선되어, 0.56 메릿의 피겨를 나타내고, 결과 맵은 뉴블라스틴 모델을 추적하기에 충분한 품질을 가진다. 02D를 가지는 모델 빌딩의 대안적인 사이클(5 G J Kleywegt & T A Jones, "02D-the manual", software manual, Uppsala, 1994) 및 mlhl 표적을 사용한 CNX의 제거 및 셀레노메티오닌 데이타에 대한 제거는 89개의 물 분자와 6개의 설페이트 음이온은 물론, 제1 아미노-말단 13 아미노산을 제외한, 뉴블라스틴 단백질의 완전한 모델을 초래한다. 훌륭한 입체화학으로 최종 R유리는 28.5%이고, R-인자는 24.7% 내지 2.O Å이다.
실시예 8: 설페이트 결합 자리 및 헤파린 설페이트의 모델링
거의 등변 삼각형의 꼭지점에서의 3개의 설페이트의 클러스터는 뉴블라스틴의 프리-헬릭스 영역에 위치하며, 헤파린 설페이트의 결합 자리를 나타낼 수 있다. 이들 설페이트와 중요하게 상호작용하는 것으로 보이는 3개의 아르기닌 잔기가 존재한다. 아르기닌 잔기 R48은 3개의 모든 설페이트와 함께 결합한다(#2, #6 및 #3). 이의 백본 아미드는 설페이트 #2와 상호작용하는 반면, 이의 측쇄 구아니디늄기는 설페이트 #6 및 #3과 두갈래로 나누어진(bifurcated) 수소 결합을 형성한다. 2번째 아르기닌 잔기(R49)는 설페이트 #2와 수소 결합을 형성하고, 세번째의 아르기닌 잔기(R51)는 설페이트 #6과 긴 수소 결합을 형성한다.
이들 설페이트는 헤파린 설페이트를 위한 결합 포켓을 나타낼 수 있으며, 비양전하 잔기로 돌연변이되는 경우 헤파린 설페이트 결합이 감소되고, 생체내 투여시 뉴블라스틴 분자의 제거를 감소 및/또는 지연시켜준다. 뉴블라스틴에 결합하는 헤파린 설페이트의 모델은 글리코사미노글리칸의 설페이트가 뉴블라스틴 결정 구조에 존재하는 설페이트와 포개져서 구성될 수 있다. 헤파린 설페이트에 복합체화된 FGF-1의 결정 구조에서 헤파린 설페이트내의 n 및 n+2 당류-결합된 설페이트는 약 8.5 Å만큼 분리되어 있다(Pellegrini 등, (2000) Nature 407,1029-1034). 이 측정값은 뉴블라스틴 구조내 3-설페이트 클러스터의 설페이트간의 거리와 거의 일치한다; 설페이트 #3과 #6은 8.8 Å만큼 떨어져 있고, 설페이트 #3과 #2는 8.1 Å만큼 떨어져 있다. 이러한 거리 측정값은 이러한 R48/R49/R51 모티프가 헤파린 결합 자리의 일부라는 점에 대응될 수 있다. 이는 R48, R49 또는 R51가 글루타메이트 또는 아스파테이트, 또는 다른 비양성 아미노산으로 단일 자리 돌연변이되는 경우, 뉴블라스틴의 수용체-결합 활성을 감소시키지 않으면서, 헤파린 설페이트 결합 친화성을 감소시킬 수 있으며, 이로써, 동물 및 결과적으로는 인간에서 연장된 반감기를 가지는 생물학적으로 활성있는 생성물을 초래한다는 것을 제안해준다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, 본 발명자는 글루탐산으로 돌연변이된 하나 이상의 아르기닌을 함유하는 일련의 작제물을 제조하였다. 돌연변이된 뉴블라스틴 생성물을 대장균에서 발현, 정제 및 리폴딩하고, 기능을 시험하였다. 마지막으로, 헤파린에 결합하는 능력과 동물에서 약역학 및 약동학에 대해 시험하였다.
하나 이상의 이러한 자리는 또한 R를 K 또는 C로 대체하고 상기 서술된 방법에 적용될 수 있는 다른 PEG화 자리를 제공한다.
실시예 9: 신경병적 통증의 신경 결찰 동물 모델에서, 촉각 및 열 통각과민증의 교정시 PEG 화된 돌연변이 뉴블라스틴 NBN106 - N95K 의 투여량
주당 3번 s.c. 투여된 1 mg/kg 야생형 뉴블라스틴이 랫트에서 척수 신경 결찰에 의해 유도되는 신경병적 통증 행동(촉각성 이질통 및 열 통각과민증)의 거의 완전한 교정과 정상화를 초래하는 반면, 주당 3번 s.c. 투여된 0.03 mg/kg 야생형 뉴블라스틴은 아무런 효과도 없으며, 주당 3번 s.c. 투여된 0.1 mg/kg 및 0.6 mg/kg 야생형 뉴블라스틴은 이 모델에서 중간적인 효과만을 가졌음을 이미 살펴보았다.
여기서, 본 발명자는 Chung L5/L6 척수 신경 결찰("SNL") 모델에서, 촉각성 이질통 및 열 통각과민증에 대한 PEG화된 N95K 뉴블라스틴의 교정 효과를 평가하고자 한다. 스프라지 다울리(Sprague Dawley) 수컷 랫트(230-380 g)를 두 군으로 나누었다. 모든 랫트에 척수 신경 결찰을 시켰다. 한 군의 랫트(n=6)는 피하 주사로 비히클을 투여하였다. 2번째 군의 랫트(군당 n=6)는 피하 주사로 PEG화된 N95K 뉴블라스틴(3,(4) X 10 kDa PEG NBN106-N95K)을 10 ㎍/kg으로 투여하였다. 3(,4) X 10 kDa PEG NBN106-N95K는 대장균에서 유래된 뉴블라스틴 단백질을 포함하며, 위치 95에 Asn-대-Lys 아미노산 치환을 포함하고, 절두되며(7개 아미노산의 아미노-말단 절두; NBN106), 최종적으로 시약으로 10,000 Da의 분자량을 가지는 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트(SPA-PEG)를 사용하여, PEG화된다. 비히클은 5 mM 포스페이트와 150 mM 염화나트륨 pH 6.5로 구성된다. 피하 주사는 조작 후 3, 5, 7, 10, 12 및 14일째 투여하였다(후-SNL). Von Frey(Chaplan 등(1994), J. Neurosci. Meth . 53: 55-63) 및 Hargreave(Hargreaves 등 (1988), Pain. 32: 77-88) 행동 테스트를 각각 촉각 및 열 반응을 모니터링 하는데 사용하였다. 이러한 통증 반응은 척수 신경 결찰 이전에도 모니터링하여 베이스라인 반응을 결정하였으며, 2일째 후-SNL에도 모니터링하여 촉각 및 열 통각과민증을 평가하였으며, 3, 5, 7, 10, 12, 14 및 15일째 후-SNL에서 모니터링 하였다. 비히클 처리에 비해 약물을 처리하였을때 얻어지는 값의 통계적 유의성을 평가하기 위해, 분산의 1-원 분석 (1-원 ANOVA)을 수행하고, 후-호크 스튜던트 뉴만 켈(post-hoc Student Neuman Keuls, SNK) 테스트를 수행하였다.
결과를 평균값의 평균 표준 에러로 도 3-4에 나타내었다. 두 유형의 신경병적 통증 행동(촉각성 이질통은 도 3에 나타내고, 열 통각과민증은 도 4에 나타냄)은 예상한대로 2일째 후-SNL에 충분히 발생하였다. 10 ㎍/kg의 3(,4) X 10 kDa PEG N95K-NBN106의 피하 투여(도 3 및 4의 아래 화살표로 나타냄)는 척수 신경 결찰을 가진 랫트에서, 두 유형의 신경병적 통증의 교정에 실질적이고 통계적인 유의성을 초래한다(촉각은 도 3, 열은 도 4임). 척수 신경 결찰을 가진 랫트의 열 감도 및 촉각성 이질통에서, 10 ㎍/kg의 3(,4) X 10 kDa PEG NBN106-N95K는 PEG화된 N95K 뉴블라스틴의 투여 개시 4일 이후 통계적으로 유의성있게 된다. 열 감도 및 촉각성 이질통에서, 10 ㎍/kg의 3(,4) X 10 kDa PEG NBN106-N95K는 PEG화된 N95K 뉴블라스틴의 투여 개시 약 4일 후, 평행에 도달한다. 3(,4) X 10 kDa PEG NBN106-N95K의 효과는 투여 2 내지 3일 사이에 감소하지 않았다. 실제로, 5일 및 7일째의 PEG화된 N95K 뉴블라스틴의 투여간의 통증 행동이 실질적으로 정상화된다. 다른 실험의 경우(데이타는 나타내지 않음), 3 ㎍/kg 3(,4) X 10 kDa PEG NBN106-N95K를 3, 5, 7, 10, 12 및 14일째 피하 투여한 경우 효과의 개시는 다소 느리나. SNL 모델에서 통증 행동(촉각 및 열 통각과민증)의 현저한 정상화가 초래되었다.
이러한 결과는 SNL 모델에서 3(,4) X 10 kDa PEG NBN106-N95K가 비-돌연변이되고 비-당화된 뉴블라스틴 보다 촉각성 이질통 및 열 통각과민증 통증 행동에 있어 적어도 100 내지 333배 증가된 효능을 가진다는 것을 보여준다. 비-돌연변이되고 비-당화된 뉴블라스틴에 비해 3(,4) X 10 kDa PEG NBN106-N95K의 개선된 약역학 성질은 전신 투여된 뉴블라스틴의 효능이 뉴블라스틴의 혈청 값에 대응됨을 나타낸다. 이러한 결과는 비컨주게이트된 뉴블라스틴에 비해 증진된 생체이용률로 인해서, 돌연변이된 뉴블라스틴의 중합체 컨주게이트가 환자의 신경병적 통증을 굉장히 감소된 투여량으로, 상당히 감소된 투여 빈도로 치료할 수 있게 해줌을 나타낸다.
노트: nd는 검출 불가능함, +는 저-중간 노출, ++는 고 노출을 나타냄
노트: 달리 지시되지 않은 한 모두 NBN113임
노트: CHO라고 지시되지 않은 한 모두 대장균 유래임
서열번호 서열:
1 컨세서스 성숙한 뉴블라스틴 폴리펩티드-113 aa
2 인간 성숙한 NBN113
3 마우스 성숙한 NBN113
4 랫트 성숙한 NBN113
5 프리프로NBN-220 aa
6 성숙한 NBN140
7 성숙한 NBN116
8 절두된 NBN112
9 절두된 NBN111
10 절두된 NBN110
11 절두된 NBN109
12 절두된 NBN108
13 절두된 NBN107
14 절두된 NBN106
15 절두된 NBN105
16 절두된 NBN104
17 절두된 NBN103
18 절두된 NBN102
19 절두된 NBN101
20 절두된 NBN100
21 절두된 NBN99
22 폴리펩티드 DYKDDDDK-8 aa
23 NBN113-N95K
24 NBN106-N95K
25 랫트 야생형 ORF-675 nt
26 랫트 야생형 프리프로NBN 폴리펩티드-224 aa
27 KD2-310 프라이머
28 KD2-311 프라이머
29 KD3-254 프라이머
30 KD2-255 프라이머
31 KD3-258 프라이머
32 KD3-259 프라이머
33 KD3-256 프라이머
34 KD3-257 프라이머
35 His-태깅된 NBN ORF-414 nt
36 His-태깅된 NBN-135 aa
기타 구체예들
특정 구체예들을 본 명세서에 상세히 서술하였음에도, 이는 단지 설명 목적을 위해 예시적으로 수행된 것이며, 이하 부가된 청구항의 권리 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 특히, 청구항에 의해 정의된 발명의 기술적 사상과 권리 범위를 벗어나지 않으면서, 발명자에 의해 발명에 다양한 치환, 변화 및 변형이 가해질 수 있음을 이해해야 한다.

Claims (34)

  1. 제1 아미노-말단 아미노산을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 아미노-말단 아미노산을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 중합체-컨주게이트된 이량체로서, 각각의 폴리펩티드는 개별적으로
    a) 서열번호: 1의 아미노산 8 내지 113번과 70% 이상의 서열 동일성으로 특징지어지는 아미노산 서열;
    b) 폴리펩티드가 서열번호: 1에 따라 번호 매겨진 경우, 위치 16, 43, 47, 80, 81, 109, 및 111 각각의 시스테인 잔기;
    c) 서열번호: 1에 따라 번호 매겨진 경우, 위치 16의 C, 위치 18의 L, 위치 25의 V, 위치 28의 L, 위치 29의 G, 위치 30의 L, 위치 31의 G, 위치 36의 E, 위치 40의 F, 위치 41의 R, 위치 42의 F, 위치 43의 C, 위치 45의 G, 위치 47의 C, 위치 80의 C, 위치 81의 C, 위치 82의 R, 위치 83의 P, 위치 91의 F, 위치 93의 D, 위치 105의 S, 위치 106의 A, 위치 109의 C 및 위치 111의 C의 아미노산 잔기; 및
    d) LGLG 리피트, FRFC 모티프, QPCCRP 모티프, 및 SATACGC 모티프
    를 포함하며, 적어도 제1 폴리펩티드는 서열번호: 1과 비교시 1 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 융합을 포함하고, 치환, 삽입 또는 융합은 중합체가 컨주게이트된 내부 중합체 컨주게이션 자리를 제공하는 것인 이량체.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 서열번호: 1의 아미노산 8 내지 113번과 95% 이상의 서열 동일성으로 특징지어지는 것인 이량체.
  3. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 중합체-컨주게이트된 이량체로서, 각각의 폴리펩티드는 개별적으로 1 내지 6개의 아미노산 치환을 가지는 서열번호: 6의 90 내지 140개의 아미노산을 포함하며, 각각의 치환은 중합체가 컨주게이트된 중합체 컨주게이션 자리를 제공하는 것인 이량체.
  4. 제1항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 NBN113, NBN140, NBN116, NBN112, NBN111, NBN110, NBN109, NBN108, NBN107, NBN106, NBN105, NBN104, NBN103, NBN102, NBN101, NBN100 및 NBN99(각각 서열번호: 2, 6-21임)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 이량체.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 제1 아미노-말단 아미노산 또는 제2 아미노-말단 아미노산이 중합체로 컨주게이트되는 것인 이량체.
  6. 제5항에 있어서, 제1 아미노-말단 아미노산 및 제2 아미노-말단 아미노산이 중합체로 컨주게이트되는 것인 이량체.
  7. 제3항에 있어서, 1 이상의 치환이
    상기 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 양쪽의 아미노산 서열의 위치 14의 아르기닌이 아닌 아미노산;
    상기 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 양쪽의 아미노산 서열의 위치 39의 아르기닌이 아닌 아미노산;
    상기 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 양쪽의 아미노산 서열의 위치 68의 아르기닌이 아닌 아미노산; 및
    상기 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 양쪽의 아미노산 서열의 위치 95의 아스파라긴이 아닌 아미노산
    으로 이루어진 군 중에서 선택되고;
    상기 아미노산의 위치가 서열번호: 1의 폴리펩티드 서열에 따라 번호 매겨지는 것인 이량체.
  8. 제1항에 있어서, 아미노산 치환이 아스파라긴 대신 라이신인 것인 이량체.
  9. 제3항에 있어서, 아미노산 치환이 아스파라긴 대신 라이신인 것인 이량체.
  10. 제1항에 있어서, 아미노산 치환이 아르기닌 대신 라이신인 것인 이량체.
  11. 제3항에 있어서, 아미노산 치환이 아르기닌 대신 라이신인 것인 이량체.
  12. 제1항에 있어서, 아미노산 치환이 위치 48, 49 또는 51의 아르기닌 대신 중성 또는 산성 아미노산인 것인 이량체.
  13. 제12항에 있어서, 중성 또는 산성 아미노산이 글루타메이트 및 아스파테이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 이량체.
  14. 제9항에 있어서, 치환이 위치 95에 존재하는 것인 이량체.
  15. 제1항에 있어서, 치환이 위치 95의 아스파라긴 대신 아스파테이트인 것인 이량체.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중합체의 평균 분자량이 약 2,000 Da 내지 약 100,000 Da인 것인 이량체.
  17. 제11항에 있어서, 중합체의 평균 분자량이 약 5,000 Da 내지 약 50,000 Da인 것인 이량체.
  18. 제12항에 있어서, 중합체의 평균 분자량이 약 10,000 Da 내지 약 20,000 Da인 것인 이량체.
  19. 제1항 또는 제3항에 있어서, 중합체가 선형인 것인 이량체.
  20. 제1항 또는 제3항에 있어서, 중합체가 분지형인 것인 이량체.
  21. 제1항 또는 제3항에 있어서, 중합체가 필수적으로 폴리알킬렌 글리콜 부분으로 구성되는 것인 이량체.
  22. 제16항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜 부분이 PEG 부분인 것인 이량체.
  23. 제1항 또는 제3항에 있어서, 1 이상의 폴리펩티드가 당화되는 것인 이량체 .
  24. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 중합체-컨주게이트된 이량체로서, (a) 각각의 폴리펩티드는 개별적으로 서열번호: 1의 100 내지 110개의 아미노산을 포함하고, (b) 각각의 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 번호 95의 아스파라긴-대-라이신 치환을 포함하며, (c) 이량체는 3 또는 4개의 PEG 부분을 포함하고, 각각의 PEG 부분의 분자량은 약 10,000 Da이며, 각각의 PEG 부분은 아미노-말단 또는 라이신 95에서 컨주게이트된 것인 이량체.
  25. a) 약 10,000 Da의 분자량을 가지는 3개의 PEG 중합체에 컨주게이트된 NBN106-N95K의 동종이량체;
    b) 약 10,000 Da의 분자량을 가지는 4개의 PEG 중합체에 컨주게이트된 NBN106-N95K의 동종이량체; 또는
    c) 제1항 또는 제3항의 2 이상의 상이한 이량체들의 혼합물
    을 포함하는 조성물.
  26. 제1항 또는 제3항의 제1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  27. 제21항의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포.
  28. 치료적으로 유효한 양의 제1항 또는 제3항의 이량체를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 신경병적 통증의 치료 방법.
  29. 제23항에 있어서, 치료적으로 유효한 양이 0.01 ㎍/kg 내지 1,000 ㎍/kg인 것인 방법.
  30. 제24항에 있어서, 치료적으로 유효한 양이 1 ㎍/kg 내지 100 ㎍/kg인 것인 방법.
  31. 제25항에 있어서, 치료적으로 유효한 양이 1 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg인 것인 방법.
  32. 제26항에 있어서, 치료적으로 유효한 양이 3 ㎍/kg 내지 10 ㎍/kg인 것인 방법.
  33. 제23항에 있어서, 이량체가 근육내 송달 또는 피하 송달로 투여되는 것인 방법.
  34. 유효한 양의 제1항 또는 제3항의 이량체를 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 RET 수용체의 활성화 방법.
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