JP2002500362A - 固相チップおよびそれに関する使用 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
固相アッセイは、医学的診断および基礎研究における生体分子の分析に対する強力なアプローチを提供する。固相核酸ハイブリダイゼーション法は、例えば、遺伝的多型性の分析、遺伝的疾患の診断、癌の診断、ウイルス性病原体および微生物病原体の検出、クローンのスクリーニング、ならびにゲノムフラグメントの整列に適用されてきた。新しい固相サンプル保持チップは、生体分子の合成または検出に関する改良された手順を提供する。これらのチップは、デバイスサンプル保持アセンブリーを考案するために使用し得、これはまた、自動化プロセスにおいて有用な固相サンプル保持アセンブリーのアレイを形成するために組合せられ得る。このチップは、バネでバイアスされた支持ピンに連結可能であり、そしてまた、生体分子が結合可能な、上記チップをコーティングする化学物質層を含み得る。
Description
【0001】 (技術分野) 本発明は、一般に、核酸分子を合成および分析する固相技術の適用に関する。
特に、本発明は、種々の生体分子手順を実行するために使用し得る改良された固
相支持体に関する。
特に、本発明は、種々の生体分子手順を実行するために使用し得る改良された固
相支持体に関する。
【0002】 (発明の背景) 核酸ハイブリダイゼーションは、生体分子(例えば、DNA配列およびRNA
配列)の認識に関する特異性を提供し、そして医学的診断において強力な技術と
なってきている。例えば、核酸ハイブリダイゼーション法は、遺伝的多型性の分
析、遺伝的疾患の診断、癌の診断、ウイルス性病原体および微生物病原体の検出
、クローンのスクリーニング、ならびにゲノムフラグメントの整列に適用されて
きた(概説として、ChetverinおよびKramer、Bio/Tech
nology 12:1093、1994を参照のこと)。オリゴヌクレオチド
プローブの自動合成の開発もまた、核酸ハイブリダイゼーションに基づく迅速、
簡単かつ安価な診断アッセイの開発を促進してきた。分析技術におけるDNAプ
ローブの使用は、MatthewsおよびKricka、Anal.Bioch
em.169:1 1988により概説されている(KellerおよびMan
k編、DNAプローブ、第2版(Stockton Press 1993)、
Persingら、Diagnostic Molecular Microb
iology(American Society for Microbio
logy 1993)もまた参照のこと)。
配列)の認識に関する特異性を提供し、そして医学的診断において強力な技術と
なってきている。例えば、核酸ハイブリダイゼーション法は、遺伝的多型性の分
析、遺伝的疾患の診断、癌の診断、ウイルス性病原体および微生物病原体の検出
、クローンのスクリーニング、ならびにゲノムフラグメントの整列に適用されて
きた(概説として、ChetverinおよびKramer、Bio/Tech
nology 12:1093、1994を参照のこと)。オリゴヌクレオチド
プローブの自動合成の開発もまた、核酸ハイブリダイゼーションに基づく迅速、
簡単かつ安価な診断アッセイの開発を促進してきた。分析技術におけるDNAプ
ローブの使用は、MatthewsおよびKricka、Anal.Bioch
em.169:1 1988により概説されている(KellerおよびMan
k編、DNAプローブ、第2版(Stockton Press 1993)、
Persingら、Diagnostic Molecular Microb
iology(American Society for Microbio
logy 1993)もまた参照のこと)。
【0003】 核酸ハイブリダイゼーションに対する一般的アプローチには、固体支持体(例
えば、ニトロセルロースフィルターおよびナイロン膜)上での標的核酸の固定化
、その後の検出可能な核酸プローブを用いるハイブリダイゼーションが必要であ
る。このような方法の不利は、固定化された核酸が、代表的に強固に結合してお
らず、支持体からの標的物質の損失を生じることである。さらに、少量の核酸分
子のみが、ハイブリダイゼーションに利用可能である。
えば、ニトロセルロースフィルターおよびナイロン膜)上での標的核酸の固定化
、その後の検出可能な核酸プローブを用いるハイブリダイゼーションが必要であ
る。このような方法の不利は、固定化された核酸が、代表的に強固に結合してお
らず、支持体からの標的物質の損失を生じることである。さらに、少量の核酸分
子のみが、ハイブリダイゼーションに利用可能である。
【0004】 これらの問題は、「サンドイッチ型」ハイブリダイゼーションアッセイにより
克服され得、このアッセイにおいて、標的核酸は、固体支持体に共有結合的に固
定化された「捕獲」オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされる。次いで
、検出可能な標識プローブが、捕獲された標的核酸の異なる領域とハイブリダイ
ズされ、このプローブの存在が測定される。
克服され得、このアッセイにおいて、標的核酸は、固体支持体に共有結合的に固
定化された「捕獲」オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされる。次いで
、検出可能な標識プローブが、捕獲された標的核酸の異なる領域とハイブリダイ
ズされ、このプローブの存在が測定される。
【0005】 新しい治療標的および診断マーカーの発見は、大きな発現配列タグデータベー
ス(Fannon,Trends Biotechnol.、14:294、1
996)由来の遺伝子発現パターンを分析するための技術により増進される。こ
のような配列データ(広範な種類のcDNAライブラリー由来)は、薬学的製品
開発のための遺伝子の同定に関する豊富な情報を提供する。正常な組織および疾
患組織由来の発現パターンの比較もまた、遺伝子機能についての推論を提供し、
そして医学的に関連する遺伝子を、治療的研究および開発計画のための候補とし
て同定する。
ス(Fannon,Trends Biotechnol.、14:294、1
996)由来の遺伝子発現パターンを分析するための技術により増進される。こ
のような配列データ(広範な種類のcDNAライブラリー由来)は、薬学的製品
開発のための遺伝子の同定に関する豊富な情報を提供する。正常な組織および疾
患組織由来の発現パターンの比較もまた、遺伝子機能についての推論を提供し、
そして医学的に関連する遺伝子を、治療的研究および開発計画のための候補とし
て同定する。
【0006】 固相cDNA合成のより広範な使用および簡易アッセイにおけるDNAプロー
ブの使用に対する重要な障壁は、ハイブリダイゼーションプロセスに完全に適合
可能な固体支持体および固定化方法がないことであった。DNAプローブに基づ
くハイブリダイゼーションにおける固体支持体の使用は、Meinkothおよ
びWahl,Anal.Biochem.138:267、1984により概説
されている。
ブの使用に対する重要な障壁は、ハイブリダイゼーションプロセスに完全に適合
可能な固体支持体および固定化方法がないことであった。DNAプローブに基づ
くハイブリダイゼーションにおける固体支持体の使用は、Meinkothおよ
びWahl,Anal.Biochem.138:267、1984により概説
されている。
【0007】 ポリ(エチレンイミン)(「PEI」)コーティングが、生体分子を結合する
ために当該分野において広範に使用されている。PEIは、種々の理由のために
この能力において非常に有効である。例えば、PEIは非常に親水性であり、従
って、生体分子を含む水性溶液で容易に湿る。さらに、PEIは多くのアミノ基
を含み、このことにより生体分子において酸性基と塩を形成し得る。しかし、P
EIが生体分子の水性溶液を容易に受容することは、今日まで、生体分子アレイ
の調製における使用が見られなかったまさにその理由である。水性生体分子溶液
が、PEIの層上に配置される場合、その溶液は、分散した位置にとどまるより
も、PEIコーティング全体に急速に浸透して逃げる。
ために当該分野において広範に使用されている。PEIは、種々の理由のために
この能力において非常に有効である。例えば、PEIは非常に親水性であり、従
って、生体分子を含む水性溶液で容易に湿る。さらに、PEIは多くのアミノ基
を含み、このことにより生体分子において酸性基と塩を形成し得る。しかし、P
EIが生体分子の水性溶液を容易に受容することは、今日まで、生体分子アレイ
の調製における使用が見られなかったまさにその理由である。水性生体分子溶液
が、PEIの層上に配置される場合、その溶液は、分散した位置にとどまるより
も、PEIコーティング全体に急速に浸透して逃げる。
【0008】 バネプローブ(spring probe)が、一般に周知になってきた。な
ぜなら、バネプローブが、プリント回路基板産業の発達の初期に導入されたから
である。バネプローブは、機能回路基板に組み立てられる場合の種々の電子構成
要素、およびそれら電子構成要素の連続の構築ならびに試験において、正確さお
よび信頼性に関する必要性を満たすように設計された機械デバイスである。バネ
プローブは、基本的に電気機械的デバイスであり、代表的には、圧縮バネ、ボー
ルおよびプランジャーを入れる管状ハウジングからなる。いくつかのプローブは
、電流の流れを運ぶように特に設計されているが、一方他のプローブは、電子構
成要素を回路基板に穴を空け、圧着し、そして確保するために使用され、そして
さらに他のプローブは、はんだ付けを実行するように設計される。微生物学、生
化学、または分子生物学の分野における使用のために、溶液を固体支持体に移動
および整列させるための機械的デバイスとしてのバネプローブの潜在的有用性を
示唆する、バネプローブの設計およびマーケティングは存在しない。
ぜなら、バネプローブが、プリント回路基板産業の発達の初期に導入されたから
である。バネプローブは、機能回路基板に組み立てられる場合の種々の電子構成
要素、およびそれら電子構成要素の連続の構築ならびに試験において、正確さお
よび信頼性に関する必要性を満たすように設計された機械デバイスである。バネ
プローブは、基本的に電気機械的デバイスであり、代表的には、圧縮バネ、ボー
ルおよびプランジャーを入れる管状ハウジングからなる。いくつかのプローブは
、電流の流れを運ぶように特に設計されているが、一方他のプローブは、電子構
成要素を回路基板に穴を空け、圧着し、そして確保するために使用され、そして
さらに他のプローブは、はんだ付けを実行するように設計される。微生物学、生
化学、または分子生物学の分野における使用のために、溶液を固体支持体に移動
および整列させるための機械的デバイスとしてのバネプローブの潜在的有用性を
示唆する、バネプローブの設計およびマーケティングは存在しない。
【0009】 従って、生体分子を固体支持体上に整列するための、高度に効率的で、費用対
効果に優れた手段に関する必要性が存在する。本発明は、本明細書中により詳細
に開示されるこれらの利点および関連する利点を提供する。
効果に優れた手段に関する必要性が存在する。本発明は、本明細書中により詳細
に開示されるこれらの利点および関連する利点を提供する。
【0010】 (発明の要旨) 本発明は、先行技術が経験した欠点を克服する、固相サンプル保持アセンブリ
を提供し、かつ関連する利点をさらに提供する。
を提供し、かつ関連する利点をさらに提供する。
【0011】 本発明の1つの実施態様において、固相サンプル保持チップが提供され、これ
は、生体分子を合成するか、または検出することにおける手順で使用され得る。
サンプル保持チップは、支持体ピンに連結可能な固体支持体チップ構造物と、こ
のチップ構造物の少なくとも一部分での化学物質層のコーティングを備える。こ
の化学物質層は、チップ構造物上に生体分子の固相サンプルを形成するようにこ
の生体分子に結合可能である。1つの実施態様において、チップ構造物は、支持
体ピンに取り外し可能に連結されている。チップ構造物は、部分的に円錐形であ
り、複数の溝がそこに形成されている。これらの溝は、複数の熱交換フィンを規
定し、このフィンは、生体分子の合成または検出における選択された熱サイクル
手順の間に、チップ構造物が速やかに加熱および冷却することを可能にする。
は、生体分子を合成するか、または検出することにおける手順で使用され得る。
サンプル保持チップは、支持体ピンに連結可能な固体支持体チップ構造物と、こ
のチップ構造物の少なくとも一部分での化学物質層のコーティングを備える。こ
の化学物質層は、チップ構造物上に生体分子の固相サンプルを形成するようにこ
の生体分子に結合可能である。1つの実施態様において、チップ構造物は、支持
体ピンに取り外し可能に連結されている。チップ構造物は、部分的に円錐形であ
り、複数の溝がそこに形成されている。これらの溝は、複数の熱交換フィンを規
定し、このフィンは、生体分子の合成または検出における選択された熱サイクル
手順の間に、チップ構造物が速やかに加熱および冷却することを可能にする。
【0012】 本発明の別の実施態様において、サンプル保持アセンブリは、生体分子を合成
または検出するための固相手順での使用のために提供される。サンプル保持アセ
ンブリは、支持体ピン、この支持体ピンに連結されたチップ構造物、およびこの
支持体ピンの少なくとも一部分にコーティングされている化学物質層を備える。
この化学物質層は、チップ構造物上の生体分子の固相サンプルを形成するように
生体分子に結合可能である。1つの実施態様において、支持体ピンは、ばねプロ
ーブまたは他のばねピンであり、そしてこのチップ構造物は、このばねプローブ
に取り外し可能に連結されているナイロン6/6部材である。
または検出するための固相手順での使用のために提供される。サンプル保持アセ
ンブリは、支持体ピン、この支持体ピンに連結されたチップ構造物、およびこの
支持体ピンの少なくとも一部分にコーティングされている化学物質層を備える。
この化学物質層は、チップ構造物上の生体分子の固相サンプルを形成するように
生体分子に結合可能である。1つの実施態様において、支持体ピンは、ばねプロ
ーブまたは他のばねピンであり、そしてこのチップ構造物は、このばねプローブ
に取り外し可能に連結されているナイロン6/6部材である。
【0013】 本発明の別の実施態様において、固相サンプル保持アセンブリのアレイが提供
され、ここで、複数の支持体ピンは、選択されたアレイで基部に連結されている
。各支持体ピンは末端部分を有し、この末端部分は、基部から間隔を開けられて
配置されており、そして複数のチップ構造物がこの末端部分に連結されている。
化学物質層は、各チップ構造物の少なくとも一部分をコーティングする。この化
学物質層は、生体分子の固相サンプルを形成するように生体分子に結合可能であ
る。
され、ここで、複数の支持体ピンは、選択されたアレイで基部に連結されている
。各支持体ピンは末端部分を有し、この末端部分は、基部から間隔を開けられて
配置されており、そして複数のチップ構造物がこの末端部分に連結されている。
化学物質層は、各チップ構造物の少なくとも一部分をコーティングする。この化
学物質層は、生体分子の固相サンプルを形成するように生体分子に結合可能であ
る。
【0014】 本発明の別の実施態様において、固相サンプル保持アセンブリは、マイクロタ
イタープレートと組み合わせられる。このマイクロタイタープレートは、生体分
子を有する一定容量のサンプルを含むように成形されているウェルを有する。固
相サンプル保持アセンブリは、ウェルに少なくとも部分的に拡がるように一定の
大きさに作られる。固相保持アセンブリは、支持体ピンと、支持体ピンに連結さ
れたチップ構造物(このチップ構造物は、ウェル中に位置合わせ可能であり、取
り外し可能である)と、このチップ構造物の少なくとも一部分にコーティングさ
れている化学物質層とを備える。この化学物質層は、生体分子および生体分子の
固相サンプルを形成する溶液に結合可能である。
イタープレートと組み合わせられる。このマイクロタイタープレートは、生体分
子を有する一定容量のサンプルを含むように成形されているウェルを有する。固
相サンプル保持アセンブリは、ウェルに少なくとも部分的に拡がるように一定の
大きさに作られる。固相保持アセンブリは、支持体ピンと、支持体ピンに連結さ
れたチップ構造物(このチップ構造物は、ウェル中に位置合わせ可能であり、取
り外し可能である)と、このチップ構造物の少なくとも一部分にコーティングさ
れている化学物質層とを備える。この化学物質層は、生体分子および生体分子の
固相サンプルを形成する溶液に結合可能である。
【0015】 本発明の1つの実施態様において、マイクロタイタープレートは、そこに複数
のウェルを有し、そして固相サンプル保持アセンブリは、選択されたアレイに配
置された複数の支持体ピンを備え、そして複数のチップ構造物は、複数のウェル
に位置合わせ可能である固相サンプル保持チップのアレイを形成するように支持
体ピンに連結されている。
のウェルを有し、そして固相サンプル保持アセンブリは、選択されたアレイに配
置された複数の支持体ピンを備え、そして複数のチップ構造物は、複数のウェル
に位置合わせ可能である固相サンプル保持チップのアレイを形成するように支持
体ピンに連結されている。
【0016】 本発明の別の局面では、固相サンプル保持チップは、複数のウェルを有するマ
イクロタイタープレートと組み合わされる。固相サンプル保持チップは、このマ
イクロタイタープレートのウェル内に、取り外し可能に位置合わせされる。この
マイクロタイタープレートおよびサンプル保持チップは、サンプル保持チップ上
の固相サンプルが合成または分析手順のために必要とされるまで容易に保存され
得るように、ユニットとして保存可能である。
イクロタイタープレートと組み合わされる。固相サンプル保持チップは、このマ
イクロタイタープレートのウェル内に、取り外し可能に位置合わせされる。この
マイクロタイタープレートおよびサンプル保持チップは、サンプル保持チップ上
の固相サンプルが合成または分析手順のために必要とされるまで容易に保存され
得るように、ユニットとして保存可能である。
【0017】 本発明の別の局面は、固相分子生物学プロセスにおける使用のための固相サン
プル保持チップを製造する方法を提供する。この方法は、基板材料を支持体ピン
に取り付け可能なチップ構造物として形成する工程、生体分子の固相サンプルを
形成するように選択された生体分子に結合可能である化学物質層を備える基板材
料の少なくとも一部分をコーティングする工程、およびこの基板に化学物質層を
結合させる工程を包含する。1つの実施態様において、この化学物質層は、ポリ
(エチレンイミン)であり、そしてこの基板材料は、ナイロン6/6材料であり
、そしてこの基板材料に化学物質層を結合させる工程は、ナイロン6/6材料に
ポリ(エチレンイミン)を共有結合させる工程を包含する。
プル保持チップを製造する方法を提供する。この方法は、基板材料を支持体ピン
に取り付け可能なチップ構造物として形成する工程、生体分子の固相サンプルを
形成するように選択された生体分子に結合可能である化学物質層を備える基板材
料の少なくとも一部分をコーティングする工程、およびこの基板に化学物質層を
結合させる工程を包含する。1つの実施態様において、この化学物質層は、ポリ
(エチレンイミン)であり、そしてこの基板材料は、ナイロン6/6材料であり
、そしてこの基板材料に化学物質層を結合させる工程は、ナイロン6/6材料に
ポリ(エチレンイミン)を共有結合させる工程を包含する。
【0018】 本発明の別の実施態様は、生体分子の固相サンプルを形成する方法に関する。
この方法は、生体分子を有する溶液にチップアセンブリの一部分を浸漬する工程
を包含する。このチップアセンブリは基板部分、および基板部分上の化学物質層
を有し、この化学物質層は、生体分子に結合可能である。この生体分子は、チッ
プアセンブリ上に生体分子の固相サンプルを形成するように化学物質層に結合さ
れ、そしてこのチップセンブリは、生体分子が化学物質層に結合した後に、溶液
から取り除かれる。
この方法は、生体分子を有する溶液にチップアセンブリの一部分を浸漬する工程
を包含する。このチップアセンブリは基板部分、および基板部分上の化学物質層
を有し、この化学物質層は、生体分子に結合可能である。この生体分子は、チッ
プアセンブリ上に生体分子の固相サンプルを形成するように化学物質層に結合さ
れ、そしてこのチップセンブリは、生体分子が化学物質層に結合した後に、溶液
から取り除かれる。
【0019】 本発明の別の局面において、この方法は、生体分子が化学物質層に結合した後
に、保持部材に固相チップアセンブリを保存する工程を包含する。本発明の1つ
の実施態様における保持部材は、ウェルを有するマイクロタイタープレートであ
る。保存工程は、生体分子が化学物質層に結合した後にウェルにチップアセンブ
リを配置する工程、およびマイクロタイタープレートおよびチップアセンブリを
保存位置にユニットとして配置する工程を包含する。
に、保持部材に固相チップアセンブリを保存する工程を包含する。本発明の1つ
の実施態様における保持部材は、ウェルを有するマイクロタイタープレートであ
る。保存工程は、生体分子が化学物質層に結合した後にウェルにチップアセンブ
リを配置する工程、およびマイクロタイタープレートおよびチップアセンブリを
保存位置にユニットとして配置する工程を包含する。
【0020】 (発明の詳細な説明) 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
する際に明らかになる。さらに、種々の参考文献が以下に示され、そして本明細
書中にその全体が参考として援用される。
する際に明らかになる。さらに、種々の参考文献が以下に示され、そして本明細
書中にその全体が参考として援用される。
【0021】 (1.定義) 以下に続く説明において、多くの用語が広範に使用される。以下の定義は、本
発明の理解を容易にするために提供される。
発明の理解を容易にするために提供される。
【0022】 「構造遺伝子」は、メッセンジャーRNA(mRNA)に転写されるヌクレオ
チド配列であり、次いで、これは、特定のポリペプチドを示すアミノ酸配列に翻
訳される。
チド配列であり、次いで、これは、特定のポリペプチドを示すアミノ酸配列に翻
訳される。
【0023】 本明細書中で使用される「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸
(DNA)、リボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応
(PCR)によって生成されたフラグメント、ならびにライゲーション、切断、
エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生
成されるフラグメントのうちのいずれかをいう。核酸は、天然に存在するヌクレ
オチド(例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド)または天
然に存在するヌクレオチドのアナログ(例えば、天然に存在するヌクレオチドの
α−エナンチオマー形態)のモノマー、または両方の組み合わせから構成され得
る。修飾されたヌクレオチドは、糖部分および/またはピリミジンもしくはプリ
ン塩基部分において修飾を有し得る。糖修飾としては、例えば、1つ以上のヒド
ロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置換が挙げら
れ得、または糖は、エーテルもしくはエステルとして官能基化し得る。さらに、
糖部分全体は、立体的におよび電子的に類似の構造(例えば、アザ糖および炭素
環式糖アナログ)で置換され得る。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プ
リンおよびピリミジン、アシル化プリンおよびピリミジン、または他の周知のヘ
テロ環式置換体が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合、または
このような結合物のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合物の
アナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロ
セレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホル
アニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。用語「核酸」としては、
いわゆる「ペプチド核酸」もまた挙げられ、これは、ポリアミド骨格に結合した
、天然に存在するか、または修飾された核酸塩基を含む。核酸は、1本鎖または
2本鎖のいずれかであり得る。
(DNA)、リボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応
(PCR)によって生成されたフラグメント、ならびにライゲーション、切断、
エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生
成されるフラグメントのうちのいずれかをいう。核酸は、天然に存在するヌクレ
オチド(例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド)または天
然に存在するヌクレオチドのアナログ(例えば、天然に存在するヌクレオチドの
α−エナンチオマー形態)のモノマー、または両方の組み合わせから構成され得
る。修飾されたヌクレオチドは、糖部分および/またはピリミジンもしくはプリ
ン塩基部分において修飾を有し得る。糖修飾としては、例えば、1つ以上のヒド
ロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置換が挙げら
れ得、または糖は、エーテルもしくはエステルとして官能基化し得る。さらに、
糖部分全体は、立体的におよび電子的に類似の構造(例えば、アザ糖および炭素
環式糖アナログ)で置換され得る。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プ
リンおよびピリミジン、アシル化プリンおよびピリミジン、または他の周知のヘ
テロ環式置換体が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合、または
このような結合物のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合物の
アナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロ
セレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホル
アニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。用語「核酸」としては、
いわゆる「ペプチド核酸」もまた挙げられ、これは、ポリアミド骨格に結合した
、天然に存在するか、または修飾された核酸塩基を含む。核酸は、1本鎖または
2本鎖のいずれかであり得る。
【0024】 「単離された核酸分子」は、生物のゲノムDNAに組み込まれていない核酸分
子である。例えば、哺乳動物細胞のゲノムDNAから分離されたインターロイキ
ン−2をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核
酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない、化学合成された核酸分
子である。
子である。例えば、哺乳動物細胞のゲノムDNAから分離されたインターロイキ
ン−2をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核
酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない、化学合成された核酸分
子である。
【0025】 本文脈で、用語「生体分子」とは、核酸分子またはアミノ酸もしくはアミノ酸
アナログのポリマーのいずれかをいう。
アナログのポリマーのいずれかをいう。
【0026】 本明細書中で使用される「検出可能なタグ」または「検出可能な標識」は、核
酸分子に結合体化して、検出方法のために有用であるプローブを生成する分子ま
たは原子である。このようなタグまたは標識の例としては、光活性(photo
active)薬剤もしくは色素、ラジオアイソトープ、蛍光薬剤、質量分析タ
グ、または他の分子およびマーカー部分が挙げられる。適切な蛍光標識化化合物
としては、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン
、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルデハイドおよびフルオレス
カミンが挙げられる。化学発光標識化化合物の例としては、ルミノール、イソル
ミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩お
よびシュウ酸エステルが挙げられる。このようなタグのために有用な生体発光化
合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが挙げられる
。
酸分子に結合体化して、検出方法のために有用であるプローブを生成する分子ま
たは原子である。このようなタグまたは標識の例としては、光活性(photo
active)薬剤もしくは色素、ラジオアイソトープ、蛍光薬剤、質量分析タ
グ、または他の分子およびマーカー部分が挙げられる。適切な蛍光標識化化合物
としては、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン
、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルデハイドおよびフルオレス
カミンが挙げられる。化学発光標識化化合物の例としては、ルミノール、イソル
ミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩お
よびシュウ酸エステルが挙げられる。このようなタグのために有用な生体発光化
合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが挙げられる
。
【0027】 「相補DNA(cDNA)」は、逆転写酵素という酵素によってmRNAテン
プレートから形成される1本鎖DNA分子である。代表的には、mRNAの部分
に相補的なプライマーが逆転写の開始のために使用される。当業者はまた、この
ような1本鎖DNA分子およびその相補DNA鎖からなる二本鎖DNA分子をい
うために用語「cDNA」を使用する。
プレートから形成される1本鎖DNA分子である。代表的には、mRNAの部分
に相補的なプライマーが逆転写の開始のために使用される。当業者はまた、この
ような1本鎖DNA分子およびその相補DNA鎖からなる二本鎖DNA分子をい
うために用語「cDNA」を使用する。
【0028】 用語「発現」とは、遺伝子産物の生合成をいう。例えば、構造遺伝子の場合で
は、発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写およびmRNAの1つ以上のポリペ
プチドへの翻訳を含む。
は、発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写およびmRNAの1つ以上のポリペ
プチドへの翻訳を含む。
【0029】 「クローニングベクター」とは、例えば、プラスミド、コスミド、またはバク
テリオファージのような核酸分子であり、これは、宿主細胞中で自律的に複製す
る能力を有する。クローニングベクターは、代表的には、1または少数の制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位を含み、ここで、外来ヌクレオチド配列は、ベクター
の本質的な生物学的機能、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞
の同定および選択における使用に適切なマーカー遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列を失うことなく決定できる様式で挿入され得る。マーカー遺伝子としては
、代表的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子
が挙げられる。
テリオファージのような核酸分子であり、これは、宿主細胞中で自律的に複製す
る能力を有する。クローニングベクターは、代表的には、1または少数の制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位を含み、ここで、外来ヌクレオチド配列は、ベクター
の本質的な生物学的機能、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞
の同定および選択における使用に適切なマーカー遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列を失うことなく決定できる様式で挿入され得る。マーカー遺伝子としては
、代表的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子
が挙げられる。
【0030】 「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現される遺伝子をコードする核酸分子で
ある。代表的には、遺伝子発現は、プロモーターの制御下におかれ、そして必要
に応じて、少なくとも1つの調節エレメントの制御下におかれる。このような遺
伝子は、プロモーター「に作動可能に連結され」るといわれる。同様に、調節エ
レメントおよびプロモーターは、調節エレメントがプロモーターの活性を調節す
る場合、作動可能に連結されている。
ある。代表的には、遺伝子発現は、プロモーターの制御下におかれ、そして必要
に応じて、少なくとも1つの調節エレメントの制御下におかれる。このような遺
伝子は、プロモーター「に作動可能に連結され」るといわれる。同様に、調節エ
レメントおよびプロモーターは、調節エレメントがプロモーターの活性を調節す
る場合、作動可能に連結されている。
【0031】 「組換え宿主」は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかであり得、こ
れは、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含む。この用語は
、宿主細胞の染色体またはゲノム中に、クローニングされた遺伝子を含むように
遺伝子操作された原核生物細胞または真核生物細胞もまた含む。
れは、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含む。この用語は
、宿主細胞の染色体またはゲノム中に、クローニングされた遺伝子を含むように
遺伝子操作された原核生物細胞または真核生物細胞もまた含む。
【0032】 本明細書中で使用される「ハイボトロープ(hybotrope)」とは、緩
衝液、キレート剤、塩、および/もしくは界面活性剤を伴う水性または有機性環
境中の任意の化学物質または任意の化学物質の混合物をいい、これは、標準的塩
溶液(0.165M NaCl、0.01M Tris pH7.2、5mM
EDTAおよび0.1% SDS)をいう場合、核酸二重鎖の少なくとも20%
のエンタルピーを変化させる。すなわち、核酸二重鎖のエネルギー含量は減少す
る。参照オリゴヌクレオチドは、固定化オリゴヌクレオチドとして
衝液、キレート剤、塩、および/もしくは界面活性剤を伴う水性または有機性環
境中の任意の化学物質または任意の化学物質の混合物をいい、これは、標準的塩
溶液(0.165M NaCl、0.01M Tris pH7.2、5mM
EDTAおよび0.1% SDS)をいう場合、核酸二重鎖の少なくとも20%
のエンタルピーを変化させる。すなわち、核酸二重鎖のエネルギー含量は減少す
る。参照オリゴヌクレオチドは、固定化オリゴヌクレオチドとして
【0033】
【化1】 および溶液ヌクレオチドとして
【0034】
【化2】 であり、この溶液オリゴヌクレオチドは、代表的には、5’末端においてテキサ
スレッドのような蛍光色素で標識される。オリゴヌクレオチド二重鎖(24ヌク
レオチド長)は、25℃以下でらせんからコイルへの遷移(helical t
o coil transition)(HCT)を有する。HCTは、二重鎖
の80%と20%が一本鎖である温度間の相違である。溶液がハイボトロープと
して規定される平均最小勾配は、HCTの第1の導関数であり、そしてユニット
/温度(摂氏)((80%一本鎖−20%一本鎖)/25℃)で2.4に等しい
。
スレッドのような蛍光色素で標識される。オリゴヌクレオチド二重鎖(24ヌク
レオチド長)は、25℃以下でらせんからコイルへの遷移(helical t
o coil transition)(HCT)を有する。HCTは、二重鎖
の80%と20%が一本鎖である温度間の相違である。溶液がハイボトロープと
して規定される平均最小勾配は、HCTの第1の導関数であり、そしてユニット
/温度(摂氏)((80%一本鎖−20%一本鎖)/25℃)で2.4に等しい
。
【0035】 本明細書中で使用される「Tm」は、核酸二重鎖分子の半分の分子が一本鎖で ある温度である。Tmは、溶液中で測定される一方で、Tdが固体支持体に固定さ
れた二重鎖について測定される。両方の用語は、二重鎖の半分が一本鎖である温
度を示す。
れた二重鎖について測定される。両方の用語は、二重鎖の半分が一本鎖である温
度を示す。
【0036】 本明細書中で使用される「ストリンジェンシー」は、所定の条件下でのハイブ
リダイゼーションについて許容されるミスマッチ塩基対の割合である。
リダイゼーションについて許容されるミスマッチ塩基対の割合である。
【0037】 本明細書中で称される「識別(discrimination)」は、完全に
塩基対形成した二重鎖とミスマッチを含む二重鎖との間のTdにおける差異であ る。
塩基対形成した二重鎖とミスマッチを含む二重鎖との間のTdにおける差異であ る。
【0038】 本明細書中で使用される「識別温度」は、ハイブリダイゼーション反応が行わ
れる温度であり、この温度によって、ミスマッチ二重鎖と完全にマッチした二重
鎖との間の検出可能な識別が可能になる。
れる温度であり、この温度によって、ミスマッチ二重鎖と完全にマッチした二重
鎖との間の検出可能な識別が可能になる。
【0039】 (2.固体支持体) 本発明の例示的実施態様に従う、固相サンプル保持アセンブリ12のアレイ1
0は、例示的目的について図面に示される。図1で最もよく示されるように、ア
レイ10は、基部構造14に取り付けられた(attached)、複数のサン
プル保持アセンブリ12を備える。各サンプル保持アセンブリ12は、基部14
に対して一方の末端18で完全に固定された支持体ピン16を備え、そしてサン
プル保持チップ構造物20は、支持体ピン16の他方の末端22に取り付けられ
る。例示的実施態様における各チップ構造物20は、ナイロン6/6固体支持体
構造であり、そしてナイロン6/6は、ポリ(エチレンイミン(ethylen
einine))(PEI)層24または他の選択された化学物質層でコーティ
ングされる。PEI層24または他の選択された化学物質層は、選択された生体
分子に結合するように適合されて、固相サンプルを形成する。この固相サンプル
は、1つ以上の核酸を合成するか、または検出するための手順で使用される。
0は、例示的目的について図面に示される。図1で最もよく示されるように、ア
レイ10は、基部構造14に取り付けられた(attached)、複数のサン
プル保持アセンブリ12を備える。各サンプル保持アセンブリ12は、基部14
に対して一方の末端18で完全に固定された支持体ピン16を備え、そしてサン
プル保持チップ構造物20は、支持体ピン16の他方の末端22に取り付けられ
る。例示的実施態様における各チップ構造物20は、ナイロン6/6固体支持体
構造であり、そしてナイロン6/6は、ポリ(エチレンイミン(ethylen
einine))(PEI)層24または他の選択された化学物質層でコーティ
ングされる。PEI層24または他の選択された化学物質層は、選択された生体
分子に結合するように適合されて、固相サンプルを形成する。この固相サンプル
は、1つ以上の核酸を合成するか、または検出するための手順で使用される。
【0040】 例示的実施態様のアレイ10は、12個のサンプル保持アセンブリ12の8つ
の実質的に平行な列を備え、基部構造14に沿って等しく配置された96個のサ
ンプル保持アセンブリを備えるアレイを規定する。各サンプル保持アセンブリ1
2は、ほぼ同じ長さを有するので、チップ構造物20は、基部から等しく間隔を
あけられ、それによって固相サンプル保持チップ構造物の実質的に同一平面上の
アレイを規定する。チップ構造物20は離れて間隔を開けられ、従来の96ウェ
ルCetusプレートまたはマイクロタイタープレートと一致される。これは、
選択された液体サンプルの生体分子または核酸を受け取り、かつ保持するために
適合される。例示的実施態様が8×12アレイのサンプル保持アセンブリ12を
有する一方で、別の実施態様は、他の配置(1×8アレイ、1×12アレイ、お
よび4×12アレイ、ならびに16×24アレイのようなより大きなアレイを含
む)を有する。
の実質的に平行な列を備え、基部構造14に沿って等しく配置された96個のサ
ンプル保持アセンブリを備えるアレイを規定する。各サンプル保持アセンブリ1
2は、ほぼ同じ長さを有するので、チップ構造物20は、基部から等しく間隔を
あけられ、それによって固相サンプル保持チップ構造物の実質的に同一平面上の
アレイを規定する。チップ構造物20は離れて間隔を開けられ、従来の96ウェ
ルCetusプレートまたはマイクロタイタープレートと一致される。これは、
選択された液体サンプルの生体分子または核酸を受け取り、かつ保持するために
適合される。例示的実施態様が8×12アレイのサンプル保持アセンブリ12を
有する一方で、別の実施態様は、他の配置(1×8アレイ、1×12アレイ、お
よび4×12アレイ、ならびに16×24アレイのようなより大きなアレイを含
む)を有する。
【0041】 例示的実施態様において、96チップ構造物20は、生体分子がPEI層24
に化学的に結合するように、生体分子を有するCetusプレートのウェル中に
浸漬するように適合される。チップ構造物20が、サンプルから取り出されると
き、生体分子はPEI層に接着し、それによって、生体分子の固相サンプルを形
成する。次いで、その表面に固相サンプルを有するチップ構造物20は、以下で
より詳細に記載されるように、例えば、固相核酸アッセイおよび検出プロセスの
ような合成または分析手順で使用され得る。
に化学的に結合するように、生体分子を有するCetusプレートのウェル中に
浸漬するように適合される。チップ構造物20が、サンプルから取り出されると
き、生体分子はPEI層に接着し、それによって、生体分子の固相サンプルを形
成する。次いで、その表面に固相サンプルを有するチップ構造物20は、以下で
より詳細に記載されるように、例えば、固相核酸アッセイおよび検出プロセスの
ような合成または分析手順で使用され得る。
【0042】 1つの実施態様において、アレイ10は、ロボットまたは自動化アクチュエー
タに導入されるため、基部14は、アクチュエータにクランプで締められ、そし
てサンプル保持アセンブリ12は基部から離れて突き出す。アクチュエータは、
所定の試験、合成、または分析プロセスに従って、選択された、制御された位置
(position)または位置(station)へ、自動化試験の間に、迅
速かつ正確にアレイ10を動かす。アレイ10および96固相サンプルでのこの
ような自動化試験は、実質的により迅速な試験、合成、または分析手順を可能に
する。
タに導入されるため、基部14は、アクチュエータにクランプで締められ、そし
てサンプル保持アセンブリ12は基部から離れて突き出す。アクチュエータは、
所定の試験、合成、または分析プロセスに従って、選択された、制御された位置
(position)または位置(station)へ、自動化試験の間に、迅
速かつ正確にアレイ10を動かす。アレイ10および96固相サンプルでのこの
ような自動化試験は、実質的により迅速な試験、合成、または分析手順を可能に
する。
【0043】 アレイ10は、サンプル保持アセンブリ12の支持体ピン16のために、一部
分、このような自動化プロセシングについて十分に適合される。図2Aで最もよ
く見られるように、各支持体ピン16は、ばねプローブである。このバネプロー
ブは、代表的には、電気的成分を構成および試験するために使用されるが、本発
明における使用について適合されている。このばねプローブは、一般的には、バ
イアス部材30を覆っているハウジング28を備える。プランジャー32は、ハ
ウジング28へ伸長しているので、プランジャーの第1の末端34はバイアス部
材に隣接するハウジング28内にあり、そして第2の末端36は、ハウジングの
外側にある。例示的実施態様におけるこのバイアス部材30は、基部14に向か
って、プランジャー32に対して軸方向に押す圧縮ばねである。プランジャーの
第1の末端34はショルダー38を有し、このショルダー38は、ハウジング2
8から内向きに、迅速に突き出すストップ40を埋め込んで、ハウジングに関し
てプランジャー32の最大伸長を制限する。プランジャーの第2の末端36は、
基部14に固定して取り付けられ、そしてプランジャー32は、基部から実質的
に垂直に突き出す。
分、このような自動化プロセシングについて十分に適合される。図2Aで最もよ
く見られるように、各支持体ピン16は、ばねプローブである。このバネプロー
ブは、代表的には、電気的成分を構成および試験するために使用されるが、本発
明における使用について適合されている。このばねプローブは、一般的には、バ
イアス部材30を覆っているハウジング28を備える。プランジャー32は、ハ
ウジング28へ伸長しているので、プランジャーの第1の末端34はバイアス部
材に隣接するハウジング28内にあり、そして第2の末端36は、ハウジングの
外側にある。例示的実施態様におけるこのバイアス部材30は、基部14に向か
って、プランジャー32に対して軸方向に押す圧縮ばねである。プランジャーの
第1の末端34はショルダー38を有し、このショルダー38は、ハウジング2
8から内向きに、迅速に突き出すストップ40を埋め込んで、ハウジングに関し
てプランジャー32の最大伸長を制限する。プランジャーの第2の末端36は、
基部14に固定して取り付けられ、そしてプランジャー32は、基部から実質的
に垂直に突き出す。
【0044】 例示的実施態様において、ハウジング28は、同軸の内部管状バレル42およ
び外部管状バレルおよび44を備え、ここで、バイアス部材30およびプランジ
ャーの第1の末端34は、内部バレル内に備えられる。外側バレル44は、そこ
に内部バレル42を取り外し可能に受け入れ、そして内部バレルに摩擦的に埋め
込まれる。その結果、この内部バレルおよび外部バレルは、互いに取り外し可能
に取り付けられる。外部バレル44は、遠位末端部分46で終わり、この遠位末
端部分46は、基部14から離れて間隔を開けられ、かつチップ構造物20に連
結する。従って、ハウジングの外側バレル44およびチップ構造物20は、内部
バレル42およびプランジャー32からユニットとして取り外し可能であり、内
部バレル42およびプランジャー32は、基部14に固定されたままである。従
って、外側バレル44およびチップ構造物20は、ばねプローブ全体を交換する
必要なく、ユニットとして容易かつ迅速に交換され得る。適切なばねプローブは
、Everett Charles(Pomona,California)、
Interconnect Devices,Inc.(Kansas Cit
y,Kansas)、Test Connections,Inc.(Upla
nd,California)、および他の製造業者から入手可能である。例示
的な実施態様が支持体ピン16としてばねプローブを利用しているが、他の支持
体ピン(バイアス支持体ピンおよび非バイアス支持体ピンを含む)が、本発明の
別の実施態様で使用される。
び外部管状バレルおよび44を備え、ここで、バイアス部材30およびプランジ
ャーの第1の末端34は、内部バレル内に備えられる。外側バレル44は、そこ
に内部バレル42を取り外し可能に受け入れ、そして内部バレルに摩擦的に埋め
込まれる。その結果、この内部バレルおよび外部バレルは、互いに取り外し可能
に取り付けられる。外部バレル44は、遠位末端部分46で終わり、この遠位末
端部分46は、基部14から離れて間隔を開けられ、かつチップ構造物20に連
結する。従って、ハウジングの外側バレル44およびチップ構造物20は、内部
バレル42およびプランジャー32からユニットとして取り外し可能であり、内
部バレル42およびプランジャー32は、基部14に固定されたままである。従
って、外側バレル44およびチップ構造物20は、ばねプローブ全体を交換する
必要なく、ユニットとして容易かつ迅速に交換され得る。適切なばねプローブは
、Everett Charles(Pomona,California)、
Interconnect Devices,Inc.(Kansas Cit
y,Kansas)、Test Connections,Inc.(Upla
nd,California)、および他の製造業者から入手可能である。例示
的な実施態様が支持体ピン16としてばねプローブを利用しているが、他の支持
体ピン(バイアス支持体ピンおよび非バイアス支持体ピンを含む)が、本発明の
別の実施態様で使用される。
【0045】 図2Bにおいて最も理解されるように、本発明の別の実施態様は、支持ピン1
6のようなばねプローブを含むが、ばねプローブは、上述されかつ図2Aで図示
された実施態様から180°配向されている。例えば、外側容器44の遠位端部
分46は、基部14に固定して取り付けられ、そしてプランジャ32の第2末端
36は、基部から離れて間隔をおかれ、チップ構造物20に連結される。
6のようなばねプローブを含むが、ばねプローブは、上述されかつ図2Aで図示
された実施態様から180°配向されている。例えば、外側容器44の遠位端部
分46は、基部14に固定して取り付けられ、そしてプランジャ32の第2末端
36は、基部から離れて間隔をおかれ、チップ構造物20に連結される。
【0046】 ばねプローブは、操作の間に与えられる損傷からアレイ10を保護する安全機
能を提供する。サンプリング過程または分析過程の間、例えば、ここでアレイ1
0が選択位置に移動され、そしてチップ構造物20が、Cetusプレートウェ
ルなどに浸漬下落されたとき、そして支持ピン16またはチップ構造物が表面ま
たは他の対象物に不注意に衝撃を与えた場合、ばねプローブは、衝撃を吸収ため
に軸方向に圧縮し、次いで、復元された位置に戻る。
能を提供する。サンプリング過程または分析過程の間、例えば、ここでアレイ1
0が選択位置に移動され、そしてチップ構造物20が、Cetusプレートウェ
ルなどに浸漬下落されたとき、そして支持ピン16またはチップ構造物が表面ま
たは他の対象物に不注意に衝撃を与えた場合、ばねプローブは、衝撃を吸収ため
に軸方向に圧縮し、次いで、復元された位置に戻る。
【0047】 図3において最も理解されるように、模範的な実施態様のチップ構造物20は
、それらの中に複数個のチャンネルまたは溝50を有する切形の円錐形状を有す
る。このチップ構造物は、支持ピンに連結可能であるか、または支持ピンと一体
であり得る。溝50は、平らな遠位面48と平らな近位面54との間を軸方向に
伸長するV形状の溝である。溝50は、近位面54から遠位面48の方へ選択さ
れた角度で収束する脈または隆起52をする。チップ構造物20の切形の円錐形
状は、Cetusプレートウェルのより低い断面形状に実質的に等しく整合する
ように選択される。従って、チップ構造物20は、Cetusプレートウェル内
のきわめて正確な位置に一致するように、成形されかつ大きさに作られる。
、それらの中に複数個のチャンネルまたは溝50を有する切形の円錐形状を有す
る。このチップ構造物は、支持ピンに連結可能であるか、または支持ピンと一体
であり得る。溝50は、平らな遠位面48と平らな近位面54との間を軸方向に
伸長するV形状の溝である。溝50は、近位面54から遠位面48の方へ選択さ
れた角度で収束する脈または隆起52をする。チップ構造物20の切形の円錐形
状は、Cetusプレートウェルのより低い断面形状に実質的に等しく整合する
ように選択される。従って、チップ構造物20は、Cetusプレートウェル内
のきわめて正確な位置に一致するように、成形されかつ大きさに作られる。
【0048】 チップ構造物20は、近位面54の開口近位面58、ならびにチップ構造物の
近位面と遠位面(それぞれ54および48)の中間部分に位置する閉鎖遠位端6
0とともにピン受入開口部56を含む。このピン受入開口部56は、支持ピンの
遠位端部分46を離脱可能に受入するように、成形されかつ大きさに作られる。
従って、チップ構造物20は、支持ピン16に離脱可能に連結される。しかし、
チップ構造物は、あるいはピンに永久に連結され得、実際ピンおよびチップ構造
物は1つのユニット構造であり得る。
近位面と遠位面(それぞれ54および48)の中間部分に位置する閉鎖遠位端6
0とともにピン受入開口部56を含む。このピン受入開口部56は、支持ピンの
遠位端部分46を離脱可能に受入するように、成形されかつ大きさに作られる。
従って、チップ構造物20は、支持ピン16に離脱可能に連結される。しかし、
チップ構造物は、あるいはピンに永久に連結され得、実際ピンおよびチップ構造
物は1つのユニット構造であり得る。
【0049】 図解した実施態様において、ピン受入開口部56は、チップ構造物の長軸方向
軸と同軸上に揃えられる。開口部近位部分59は、開口部近位端58が、閉鎖遠
位端60よりもより大きな直径を有するような、ほぼ漏斗形状である。この漏斗
型の近位部分59は、そこに支持ピン遠位端部分46を受入するために適合され
る。導入手順の間に、支持ピンが開口部56に対してわずかに誤って配置された
場合、漏斗型の近位部分59は、ばねプローブがチップ構造物20と同軸上に揃
えられるように、支持ピン16を受入し、正しい位置に配向する。
軸と同軸上に揃えられる。開口部近位部分59は、開口部近位端58が、閉鎖遠
位端60よりもより大きな直径を有するような、ほぼ漏斗形状である。この漏斗
型の近位部分59は、そこに支持ピン遠位端部分46を受入するために適合され
る。導入手順の間に、支持ピンが開口部56に対してわずかに誤って配置された
場合、漏斗型の近位部分59は、ばねプローブがチップ構造物20と同軸上に揃
えられるように、支持ピン16を受入し、正しい位置に配向する。
【0050】 図4において最も理解されるように、模範的な実施態様の開口部56はチップ
構造物20の軸内部壁61によって規定され、実質的に環状の断面形状を有する
。しかし、ばねプローブ遠位端部分46は、4つのコーナー63を有する実質的
に四角の断面形状を有する。チップ構造物20を支持ピン16上に摩擦的に保持
するために、ばねプローブ遠位端部分46は、コーナー63がチップ構造物の内
部壁61と摩擦的に係合するような大きさに作られる。
構造物20の軸内部壁61によって規定され、実質的に環状の断面形状を有する
。しかし、ばねプローブ遠位端部分46は、4つのコーナー63を有する実質的
に四角の断面形状を有する。チップ構造物20を支持ピン16上に摩擦的に保持
するために、ばねプローブ遠位端部分46は、コーナー63がチップ構造物の内
部壁61と摩擦的に係合するような大きさに作られる。
【0051】 本発明の他の実施態様は、端部分は、チップ構造物の内部壁61と係合する複
数の角を有する、多角形状の断面形状を有する。例えば、八つの角を有する八角
形状の断面図領域は、内部壁61と摩擦的に係合する。別の代替えの実施態様に
おいては、支持ピンの遠位端部分は、チップ構造物20がばねプローブの遠位端
部分46に対してプレス固定され、そこに摩擦的に保持されるように、ピン受入
開口部56の環状の断面領域と実質的に対応する環状の断面形状を有する。別の
実施態様においては、このチップ構造物20は、チップ構造物が支持ピン16に
永久に取り付けられるように、従来の接着剤を用いて遠位端部分46に接着され
る。
数の角を有する、多角形状の断面形状を有する。例えば、八つの角を有する八角
形状の断面図領域は、内部壁61と摩擦的に係合する。別の代替えの実施態様に
おいては、支持ピンの遠位端部分は、チップ構造物20がばねプローブの遠位端
部分46に対してプレス固定され、そこに摩擦的に保持されるように、ピン受入
開口部56の環状の断面領域と実質的に対応する環状の断面形状を有する。別の
実施態様においては、このチップ構造物20は、チップ構造物が支持ピン16に
永久に取り付けられるように、従来の接着剤を用いて遠位端部分46に接着され
る。
【0052】 図4において最も理解されるように、溝50および隆起52は、ほぼ星型の断
面領域を有する切形の円錐形型のチップ構造物20を規定する。結果として、チ
ップ構造物20は、拡張された外部表面62を有するため、固相サンプルの形成
の間、より多くの量の生体分子をPEI層24に付着し得る。模範的な実施態様
において、チップ構造物20の溝50、隆起、遠位面48および近位面54が、
PEI層24に共有結合的に結合されるナイロン6/6固体支持体の広範な表面
積を規定する。別の実施態様において、チップ構造物20は、ガラスまたはシリ
コンのような固体基材で作製され、PEI層24は、以下により詳細に記載され
るようにシリル化化学的作用を使用して、固体基材に共有結合的に結合される。
面領域を有する切形の円錐形型のチップ構造物20を規定する。結果として、チ
ップ構造物20は、拡張された外部表面62を有するため、固相サンプルの形成
の間、より多くの量の生体分子をPEI層24に付着し得る。模範的な実施態様
において、チップ構造物20の溝50、隆起、遠位面48および近位面54が、
PEI層24に共有結合的に結合されるナイロン6/6固体支持体の広範な表面
積を規定する。別の実施態様において、チップ構造物20は、ガラスまたはシリ
コンのような固体基材で作製され、PEI層24は、以下により詳細に記載され
るようにシリル化化学的作用を使用して、固体基材に共有結合的に結合される。
【0053】 別の実施態様において、チップ構造物20の溝50および隆起52の外部表面
62は、PEI層24が結合する表面積をさらに拡張させるようくぼみが入れら
れている。1つの実施態様において、くぼみは一般的に微視的であり、そして別
の実施態様においては、くぼみは巨視的である。従って、くぼんだのチップ構造
物20は、合成手順または分析手順において、より優れた効率化のためにより広
範な反応表面を提供する。
62は、PEI層24が結合する表面積をさらに拡張させるようくぼみが入れら
れている。1つの実施態様において、くぼみは一般的に微視的であり、そして別
の実施態様においては、くぼみは巨視的である。従って、くぼんだのチップ構造
物20は、合成手順または分析手順において、より優れた効率化のためにより広
範な反応表面を提供する。
【0054】 選択された合成手順または分析手順の間、チップ構造物20は、熱サイクリン
グ(thermocycle)に供され、ここでチップ構造物20は、高温と低
温との間をサイクリングされる。チップ構造物20の隆起52は、熱サイクリン
グの間、チップ構造物のより迅速な温度変化を許容する複数の熱変換フィン64
を形成する。その結果、熱サイクリングは、より迅速にかつより効率的に行われ
得る。
グ(thermocycle)に供され、ここでチップ構造物20は、高温と低
温との間をサイクリングされる。チップ構造物20の隆起52は、熱サイクリン
グの間、チップ構造物のより迅速な温度変化を許容する複数の熱変換フィン64
を形成する。その結果、熱サイクリングは、より迅速にかつより効率的に行われ
得る。
【0055】 図5において最も理解されるように、アレイ10は、組み合わせられるように
適合され、そしてその中に複数個のウェル72を有するCetusプレートまた
はマイクロタイタープレート70と共に使用される。上記で議論したように、ウ
ェル72部分の形状は、実質的に、チップ構造物20の切形の円錐形状と一致す
る。従って、隆起52は、実質的に、ウェル72のウェル側壁74と係合し、そ
してチップ構造物の平らな遠位面48は、ウェルの底面76に対して配置される
。好ましい実施態様において、マイクロタイタープレート70は、12個のウェ
ル72が、実質的に平行する8つの列によって形成されるウェルのアレイを有し
、アレイ10のチップ構造物と対になる96個のウェルの立体配置を形成する。
他の実施態様において、マイクロタイタープレート70は、1×8個のウェル、
1×12個のウェルおよび4×12個のウェルのアレイ、ならびに16×24個
のウェル形成のようなより大きなアレイを有する。
適合され、そしてその中に複数個のウェル72を有するCetusプレートまた
はマイクロタイタープレート70と共に使用される。上記で議論したように、ウ
ェル72部分の形状は、実質的に、チップ構造物20の切形の円錐形状と一致す
る。従って、隆起52は、実質的に、ウェル72のウェル側壁74と係合し、そ
してチップ構造物の平らな遠位面48は、ウェルの底面76に対して配置される
。好ましい実施態様において、マイクロタイタープレート70は、12個のウェ
ル72が、実質的に平行する8つの列によって形成されるウェルのアレイを有し
、アレイ10のチップ構造物と対になる96個のウェルの立体配置を形成する。
他の実施態様において、マイクロタイタープレート70は、1×8個のウェル、
1×12個のウェルおよび4×12個のウェルのアレイ、ならびに16×24個
のウェル形成のようなより大きなアレイを有する。
【0056】 アレイ10の使用の間、このアレイは、上げ位置(ウェル72の外側にあるチ
ップ構造物20と共に、図5において実線で示される)から下げ位置(ウェル7
2内に位置されているチップ構造物と共に、破線で示される)へ、自動的にまた
は手動的に移動され得る。1つの例において、ウェル72は、その中に選択され
た生体分子を有する液体サンプルを収容する。アレイ10が下げ位置にありかつ
チップ構造物20が液体サンプル中にある場合、生体分子の選択された固相サン
プルを形成し得るように、化学反応はPEI層24と生体分子の間で生じる。模
範的な実施態様において、ウェル72は、チップ構造物20よりも深さが約33
%大きいため、チップ構造物がウェルに浸された場合、液体サンプルはチップ構
造物全体にわたって流動し、可能な限りの生体分子と結合する。
ップ構造物20と共に、図5において実線で示される)から下げ位置(ウェル7
2内に位置されているチップ構造物と共に、破線で示される)へ、自動的にまた
は手動的に移動され得る。1つの例において、ウェル72は、その中に選択され
た生体分子を有する液体サンプルを収容する。アレイ10が下げ位置にありかつ
チップ構造物20が液体サンプル中にある場合、生体分子の選択された固相サン
プルを形成し得るように、化学反応はPEI層24と生体分子の間で生じる。模
範的な実施態様において、ウェル72は、チップ構造物20よりも深さが約33
%大きいため、チップ構造物がウェルに浸された場合、液体サンプルはチップ構
造物全体にわたって流動し、可能な限りの生体分子と結合する。
【0057】 図6において最も理解されるように、サンプル保持アセンブリ12のアレイ1
0はまた、ウェル72内にチップ構造物20を位置合わせする工程、および支持
ピン16(実線で示される)からチップ構造物を分離させる工程に有効であるた
め、チップ構造物はウェルに残存する。次いで、基部14および支持ピン16は
、1ユニットとしてマイクロタイタープレート70から移動される。結果として
、ウェル72内に保持または収納された96個のチップ構造物20を有するマイ
クロタイタープレート70が、1つのユニットとして移動され得、そして例とし
て、固相サンプルが選択された合成手順または分析手順に必要とされるまで、低
温貯蔵場所または他の適切な貯蔵場所に配置される。
0はまた、ウェル72内にチップ構造物20を位置合わせする工程、および支持
ピン16(実線で示される)からチップ構造物を分離させる工程に有効であるた
め、チップ構造物はウェルに残存する。次いで、基部14および支持ピン16は
、1ユニットとしてマイクロタイタープレート70から移動される。結果として
、ウェル72内に保持または収納された96個のチップ構造物20を有するマイ
クロタイタープレート70が、1つのユニットとして移動され得、そして例とし
て、固相サンプルが選択された合成手順または分析手順に必要とされるまで、低
温貯蔵場所または他の適切な貯蔵場所に配置される。
【0058】 模範的な実施態様において、ウェル72は、チップ構造物20をマイクロタイ
タープレート70に対して非常に正確な位置に保持するため、このチップ構造物
は、支持ピン16に対して、容易にかつ実質的に同時に導入され得る。例として
、マイクロタイタープレート70が公知でかつ固定された場所に保持され、そし
て基部14および支持ピン16は、支持ピンがチップ構造物内のピン受入開口部
56と実質的に同軸上に整列されるように、自動的かまたは手動的かのいずれか
で、ウェル72の上方の選択された位置に、1つのユニットとして移動される。
次いで、基部14および支持ピン16は、支持ピン16がチップ構造物の開口部
にプレスされるように、マイクロタイタープレート70側に移動され、その結果
、チップ構造物を支持ピンに解除可能に連結させる。次いで、基部14、支持ピ
ン16およびチップ構造物20は、マイクロタイタープレート70から1つのユ
ニットとして離され、その結果、ウェル72からチップ構造物20を取り出す。
その上に、固相サンプルを有するサンプル保持チップアセンブリ12は、予め決
定された場所に移動され、そして核酸を分析または合成するための、選択された
固相手順に供され得る。
タープレート70に対して非常に正確な位置に保持するため、このチップ構造物
は、支持ピン16に対して、容易にかつ実質的に同時に導入され得る。例として
、マイクロタイタープレート70が公知でかつ固定された場所に保持され、そし
て基部14および支持ピン16は、支持ピンがチップ構造物内のピン受入開口部
56と実質的に同軸上に整列されるように、自動的かまたは手動的かのいずれか
で、ウェル72の上方の選択された位置に、1つのユニットとして移動される。
次いで、基部14および支持ピン16は、支持ピン16がチップ構造物の開口部
にプレスされるように、マイクロタイタープレート70側に移動され、その結果
、チップ構造物を支持ピンに解除可能に連結させる。次いで、基部14、支持ピ
ン16およびチップ構造物20は、マイクロタイタープレート70から1つのユ
ニットとして離され、その結果、ウェル72からチップ構造物20を取り出す。
その上に、固相サンプルを有するサンプル保持チップアセンブリ12は、予め決
定された場所に移動され、そして核酸を分析または合成するための、選択された
固相手順に供され得る。
【0059】 本発明の固相支持体は、並列で使用され、好ましくは、96−ウェル構成また
は384−ウェル構成において設定される。固相支持体は、96−ウェル構成ま
たは384−ウェル構成において、離脱可能か、あるいは特定の構成に一体化し
た固相支持体のいずれかとして、ペグ、ステムまたはロッドに取り付けられる得
る。固相支持体の特定の構成は、アッセイ機能について決定的な重要性を有さな
いが、むしろアッセイを自動化システムに適応させる容易さに影響する。
は384−ウェル構成において設定される。固相支持体は、96−ウェル構成ま
たは384−ウェル構成において、離脱可能か、あるいは特定の構成に一体化し
た固相支持体のいずれかとして、ペグ、ステムまたはロッドに取り付けられる得
る。固相支持体の特定の構成は、アッセイ機能について決定的な重要性を有さな
いが、むしろアッセイを自動化システムに適応させる容易さに影響する。
【0060】 (3.固体支持体に核酸分子を結合するための方法) 本明細書に記載されるチップは、核酸分子、ペプチド、ポリぺプチド、または
タンパク質の固体支持体への付着を必要とする種々の方法に有用である。このよ
うなチップを用いて実施され得る固相アッセイおよび検出方法の例は、以下に記
載される。
タンパク質の固体支持体への付着を必要とする種々の方法に有用である。このよ
うなチップを用いて実施され得る固相アッセイおよび検出方法の例は、以下に記
載される。
【0061】 核酸分子をチップへ付着するために標準的な方法が使用され得る。例えば、ア
ルデヒドまたはカルボン酸で5’末端を改変された核酸分子は、ヒドラジド残基
を有する固体支持体に付着され得る(例えば、Kremskyら、Nuclei
c Acids Res.15:2891,1987を参照のこと)。あるいは
、オリゴヌクレオチドの5’アミノヘキシルホスホラミダイト誘導体は、カルボ
ジイミド媒介結合反応において、カルボキシル基を有する固相支持体と結合され
得る(例えば、Ghoshら、Nucleic Acids Res.15:5
353,1987を参照のこと)。
ルデヒドまたはカルボン酸で5’末端を改変された核酸分子は、ヒドラジド残基
を有する固体支持体に付着され得る(例えば、Kremskyら、Nuclei
c Acids Res.15:2891,1987を参照のこと)。あるいは
、オリゴヌクレオチドの5’アミノヘキシルホスホラミダイト誘導体は、カルボ
ジイミド媒介結合反応において、カルボキシル基を有する固相支持体と結合され
得る(例えば、Ghoshら、Nucleic Acids Res.15:5
353,1987を参照のこと)。
【0062】 固相支持体は、ポリエチレン(イミン)、アクリルアミド、アミノ−デンドリ
マー(amino−dendrimer)などのようなアミンポリマーを用いて
優先的にコーティングされる。核酸分子を共有結合的に固定するために、ポリマ
ー上のアミンが使用される。好ましくは、核酸は、ポリ(エチレンイミン)(P
EI)コーティングを使用して本明細書に記載される固相支持体に結合される。
PEI層を基材に接着するために使用される化学的性質は、本質的部分において
、基材の化学的同一性に依存する。先行技術は、PEIを固相支持体に接着し得
る適切な化学的性質の多数の例を提供する。例えば、基材がナイロン−6/6で
ある場合、PEIコーティングは、Van Nessら、Nucleic Ac
ids Res.19:3345,1991ならびに国際公開第WO 94/0
0600号に開示される方法によって供され得る。PEI層をガラスまたはシリ
コンの固相支持体に適用するのに適切な方法は、例えば、Wasserman,
Biotechnology and Bioengineering XXI
I:271,1980ならびにD’Souza,Biotechnology
Letters 8:643,1986に記載される。
マー(amino−dendrimer)などのようなアミンポリマーを用いて
優先的にコーティングされる。核酸分子を共有結合的に固定するために、ポリマ
ー上のアミンが使用される。好ましくは、核酸は、ポリ(エチレンイミン)(P
EI)コーティングを使用して本明細書に記載される固相支持体に結合される。
PEI層を基材に接着するために使用される化学的性質は、本質的部分において
、基材の化学的同一性に依存する。先行技術は、PEIを固相支持体に接着し得
る適切な化学的性質の多数の例を提供する。例えば、基材がナイロン−6/6で
ある場合、PEIコーティングは、Van Nessら、Nucleic Ac
ids Res.19:3345,1991ならびに国際公開第WO 94/0
0600号に開示される方法によって供され得る。PEI層をガラスまたはシリ
コンの固相支持体に適用するのに適切な方法は、例えば、Wasserman,
Biotechnology and Bioengineering XXI
I:271,1980ならびにD’Souza,Biotechnology
Letters 8:643,1986に記載される。
【0063】 好ましくは、PEIコーティングは固相基材に共有結合的に付着される。固相
基材がガラスまたはシリコンである場合、PEIコーティングは、シリル化化学
を使用して、基材に共有結合的に結合され得る。例えば、反応性のシロキシエン
ド基を有するPEIは、Gelest,Inc.(Tullytown,PA)
から市販されている。このような反応性PEIは、ガラスチップまたはシリコン
チップに接触され得、穏やかな攪拌の後、このPEIは基材に接着する。あるい
は、二重機能的なシリル化試薬が使用され得る。この過程に従って、ガラス基材
またはシリコン基材は、二重機能的なシリル試薬で処理され、反応性表面を有す
る基材を提供する。次いで、このPEIは反応性表面に接触され、そして二重機
能的な試薬を介して表面に共有結合的に結合される。
基材がガラスまたはシリコンである場合、PEIコーティングは、シリル化化学
を使用して、基材に共有結合的に結合され得る。例えば、反応性のシロキシエン
ド基を有するPEIは、Gelest,Inc.(Tullytown,PA)
から市販されている。このような反応性PEIは、ガラスチップまたはシリコン
チップに接触され得、穏やかな攪拌の後、このPEIは基材に接着する。あるい
は、二重機能的なシリル化試薬が使用され得る。この過程に従って、ガラス基材
またはシリコン基材は、二重機能的なシリル試薬で処理され、反応性表面を有す
る基材を提供する。次いで、このPEIは反応性表面に接触され、そして二重機
能的な試薬を介して表面に共有結合的に結合される。
【0064】 PEIコーティングは、好ましくは、核酸を本明細書に記載されるナイロンチ
ップに固定するために使用される。ナイロン6/6をPEIでコーティングする
ための1つの適切な方法は、Van Nessら、Nucleic Acids
Res.19:3345,1991に記載される。簡単には、ナイロン基材は
、トリエチルオキソニウムテトラフルオロホウ酸塩を使用してエチル化され、ナ
イロン表面上にアミン反応性イミデートエステルを形成する。次いで、この活性
化されたナイロンはPEIと反応され、広範なアミン表面を提供するポリマーコ
ーティングを形成する。2,4,6−トリクロロ−1,3,5−トリアジン(塩
化シアヌル酸)を用いた尾状5’−アミノヘキシル−テール化オリゴヌクレオチ
ドの活性化に続いて、この改変されたオリゴヌクレオチドは、トリアジン部分を
介してナイロン表面に共有結合的に付着される。
ップに固定するために使用される。ナイロン6/6をPEIでコーティングする
ための1つの適切な方法は、Van Nessら、Nucleic Acids
Res.19:3345,1991に記載される。簡単には、ナイロン基材は
、トリエチルオキソニウムテトラフルオロホウ酸塩を使用してエチル化され、ナ
イロン表面上にアミン反応性イミデートエステルを形成する。次いで、この活性
化されたナイロンはPEIと反応され、広範なアミン表面を提供するポリマーコ
ーティングを形成する。2,4,6−トリクロロ−1,3,5−トリアジン(塩
化シアヌル酸)を用いた尾状5’−アミノヘキシル−テール化オリゴヌクレオチ
ドの活性化に続いて、この改変されたオリゴヌクレオチドは、トリアジン部分を
介してナイロン表面に共有結合的に付着される。
【0065】 従って、望ましい核酸ポリマーは「アミン改変型」であり、これらは、核酸ポ
リマーの5’末端に第一級アミンを含むように改変され、好ましくは、第一級ア
ミンと核酸ポリマーの核酸部分との間に配置された1つ以上のメチレン基を有す
る。メチレン基の望ましい数は6つである。
リマーの5’末端に第一級アミンを含むように改変され、好ましくは、第一級ア
ミンと核酸ポリマーの核酸部分との間に配置された1つ以上のメチレン基を有す
る。メチレン基の望ましい数は6つである。
【0066】 核酸分子は、標準的な技術を使用するアミン部分の付加によって改変され得る
。ポリメラーゼ連鎖反応産物は、例えば、5’ヘキシルアミン改変プライマーを
使用してアレイ化され得る。核酸二重鎖は、アミンアリル−dUTP(Sigm
a,St.Louis,MO)を使用するニックトランスレーションによって、
アミン導入後にアレイ化され得る。アミンはまた、アミノアリル−dUTPを有
する末端転移酵素のようなポリメラーゼか、あるいはリガーゼによる短いアミン
含有核酸ポリマーの核酸へのライゲーションによって核酸に導入され得る。
。ポリメラーゼ連鎖反応産物は、例えば、5’ヘキシルアミン改変プライマーを
使用してアレイ化され得る。核酸二重鎖は、アミンアリル−dUTP(Sigm
a,St.Louis,MO)を使用するニックトランスレーションによって、
アミン導入後にアレイ化され得る。アミンはまた、アミノアリル−dUTPを有
する末端転移酵素のようなポリメラーゼか、あるいはリガーゼによる短いアミン
含有核酸ポリマーの核酸へのライゲーションによって核酸に導入され得る。
【0067】 好ましくは、核酸ポリマーは、PEIコーティングに接触される以前に活性化
される。これは、塩化シアヌルのような多機能性のアミン反応性化学物質と、ア
ミン官能化核酸ポリマーとを結合することによって、都合よく達成され得る。例
えば、過剰の塩化シアヌル酸は、核酸ポリマー溶液を含む溶液に添加され得る。
好ましくは、この溶液は、アレイ化溶液における核酸ポリマー中のアミン数に対
して、10倍〜1000倍のモル濃度過剰の塩化シアヌルを含む。このようにし
て、アミンで終端された大部分の核酸ポリマーは、塩化シアヌルの1つの分子と
反応するため、核酸ポリマーはジクロロトリアジンで終端される。
される。これは、塩化シアヌルのような多機能性のアミン反応性化学物質と、ア
ミン官能化核酸ポリマーとを結合することによって、都合よく達成され得る。例
えば、過剰の塩化シアヌル酸は、核酸ポリマー溶液を含む溶液に添加され得る。
好ましくは、この溶液は、アレイ化溶液における核酸ポリマー中のアミン数に対
して、10倍〜1000倍のモル濃度過剰の塩化シアヌルを含む。このようにし
て、アミンで終端された大部分の核酸ポリマーは、塩化シアヌルの1つの分子と
反応するため、核酸ポリマーはジクロロトリアジンで終端される。
【0068】 本発明の有利な特徴は、たとえアレイ化溶液が有意な量の多機能性のアミン反
応性化学的物質を含むとしても、生体分子含有アレイ化溶液はPEIコーティン
グ上に沈着し得ることである。これは、結合剤が、アレイ化過程に先行してアレ
イ化溶液から除去される必要がある方法に対して有意な利点を提供する。
応性化学的物質を含むとしても、生体分子含有アレイ化溶液はPEIコーティン
グ上に沈着し得ることである。これは、結合剤が、アレイ化過程に先行してアレ
イ化溶液から除去される必要がある方法に対して有意な利点を提供する。
【0069】 核酸ポリマーが二重鎖である場合、鎖の両方または鎖の1方は末端アミノ基を
含む。この二重鎖核酸ポリマーは、PEIコーティングに1つの末端アミノ基を
介して結合され得、二重鎖ポリマーを固定する。2本の鎖の1方のみがPEIコ
ーティングに共有結合的に結合されるので、他方の鎖は、変性条件および洗浄条
件下で除去され得る。このアプローチは、一本鎖の核酸ポリマーのアレイを達成
する、本発明に基づく1つの簡便的な方法を提供する。二重鎖の核酸ポリマーは
、例えば、PCRからの反応産物として得られ得る。
含む。この二重鎖核酸ポリマーは、PEIコーティングに1つの末端アミノ基を
介して結合され得、二重鎖ポリマーを固定する。2本の鎖の1方のみがPEIコ
ーティングに共有結合的に結合されるので、他方の鎖は、変性条件および洗浄条
件下で除去され得る。このアプローチは、一本鎖の核酸ポリマーのアレイを達成
する、本発明に基づく1つの簡便的な方法を提供する。二重鎖の核酸ポリマーは
、例えば、PCRからの反応産物として得られ得る。
【0070】 好ましくは、アレイ化溶液は、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナ
トリウム、またはTris−HClのような通常の緩衝液を使用して緩衝化され
る。アレイ化溶液の望ましいpH範囲は、7〜9であり、望ましい緩衝液は、新
たに調製されたホウ酸ナトリウム、pH8.3〜pH8.5である。
トリウム、またはTris−HClのような通常の緩衝液を使用して緩衝化され
る。アレイ化溶液の望ましいpH範囲は、7〜9であり、望ましい緩衝液は、新
たに調製されたホウ酸ナトリウム、pH8.3〜pH8.5である。
【0071】 以下に記載する種々の方法は、本発明の固相支持体に結合するオリゴヌクレオ
チドの使用を必要とする。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、5’−アミン(
一般的に、6つの炭素スペーサーアームならびに末端アミンであるヘキシルアミ
ン)で合成される。代表的には、オリゴヌクレオチドの長さは15〜50ヌクレ
オチドであり、塩化シアヌルのようなホモ−二重機能的またはヘテロ−二重機能
的な架橋試薬で活性化される。この活性化されたオリゴヌクレオチドは、必要に
応じて排除クロマトグラフィーによって過剰の架橋試薬(例えば、塩化シアヌル
)から精製され得る。次いで、この活性化されたオリゴヌクレオチドは固相支持
体と混合され、共有結合性の付着をもたらす。オリゴヌクレオチドの共有結合性
の付着の後、固相支持体の未反応アミンをキャップし(例えば、無水コハク酸で
)、固相支持体の正電荷を排除する。
チドの使用を必要とする。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、5’−アミン(
一般的に、6つの炭素スペーサーアームならびに末端アミンであるヘキシルアミ
ン)で合成される。代表的には、オリゴヌクレオチドの長さは15〜50ヌクレ
オチドであり、塩化シアヌルのようなホモ−二重機能的またはヘテロ−二重機能
的な架橋試薬で活性化される。この活性化されたオリゴヌクレオチドは、必要に
応じて排除クロマトグラフィーによって過剰の架橋試薬(例えば、塩化シアヌル
)から精製され得る。次いで、この活性化されたオリゴヌクレオチドは固相支持
体と混合され、共有結合性の付着をもたらす。オリゴヌクレオチドの共有結合性
の付着の後、固相支持体の未反応アミンをキャップし(例えば、無水コハク酸で
)、固相支持体の正電荷を排除する。
【0072】 特定の方法は、ストレプトアビジンに結合するビオチン化されたオリゴヌクレ
オチドの使用を必要とし、これは順々に固相支持体に結合される。ビオチン化さ
れた核酸分子ならびに支持体に結合されたストレプトアビジンを産生するための
方法は、当業者に周知である。例えば、Van Nessら、Nucleic
Acids Res.19:3345(1991)は、オリゴヌクレオチドのビ
オチン化のための方法を記載しており、ここでは、オリゴヌクレオチドは活性化
されたビオチンで処理される。あるいは、ビオチン化オリゴヌクレオチドは、ビ
オチン標識されたdNTPを用いてオリゴヌクレオチドを合成することによって
調製され得る(例えば、Ausubelら(編)、Short Protoco
ls in Molecular Biology、第3版、12−23頁から
12−25頁(John Wiley & Sons,Inc.1995)を参
照のこと)。核酸をビオチン化するための方法は、当該分野で周知であり、例え
ば、Avidin−Biotin Chemistry:A Handbook
(Pierce Chemical Company 1992)に記載される
。ストレプトアビジンを本発明のチップに結合するために使用され得る標準的な
方法は、例えば、DasおよびFox、Ann.Rev.Biophys.Bi
oeng.8:165.1979、ならびにWilchekおよびBayer,
Anal.Biochem.171:1,1983によって提供される。
オチドの使用を必要とし、これは順々に固相支持体に結合される。ビオチン化さ
れた核酸分子ならびに支持体に結合されたストレプトアビジンを産生するための
方法は、当業者に周知である。例えば、Van Nessら、Nucleic
Acids Res.19:3345(1991)は、オリゴヌクレオチドのビ
オチン化のための方法を記載しており、ここでは、オリゴヌクレオチドは活性化
されたビオチンで処理される。あるいは、ビオチン化オリゴヌクレオチドは、ビ
オチン標識されたdNTPを用いてオリゴヌクレオチドを合成することによって
調製され得る(例えば、Ausubelら(編)、Short Protoco
ls in Molecular Biology、第3版、12−23頁から
12−25頁(John Wiley & Sons,Inc.1995)を参
照のこと)。核酸をビオチン化するための方法は、当該分野で周知であり、例え
ば、Avidin−Biotin Chemistry:A Handbook
(Pierce Chemical Company 1992)に記載される
。ストレプトアビジンを本発明のチップに結合するために使用され得る標準的な
方法は、例えば、DasおよびFox、Ann.Rev.Biophys.Bi
oeng.8:165.1979、ならびにWilchekおよびBayer,
Anal.Biochem.171:1,1983によって提供される。
【0073】 本明細書に記載されるチップはまた、ペプチドをアッセイするために使用され
得る。ペプチド、ポリぺプチド、およびタンパク質の固相支持体への結合のため
の一般的な指針は、例えば、Wong,Chemistry of Prote
in Conjugation and Cross−linking(CRC
Press,Inc.1991)、ならびにPartisら、J.Prote
in Chemistry 2:263(1983)によって示される。固相手
順におけるペプチドおよび抗体の使用は、例えば、Vaughnら、Natur
e Biotechnology 14:309,1996、ならびにHuse
ら、Science 246:1275,1989から公知である。
得る。ペプチド、ポリぺプチド、およびタンパク質の固相支持体への結合のため
の一般的な指針は、例えば、Wong,Chemistry of Prote
in Conjugation and Cross−linking(CRC
Press,Inc.1991)、ならびにPartisら、J.Prote
in Chemistry 2:263(1983)によって示される。固相手
順におけるペプチドおよび抗体の使用は、例えば、Vaughnら、Natur
e Biotechnology 14:309,1996、ならびにHuse
ら、Science 246:1275,1989から公知である。
【0074】 (4.cDNA合成における固体支持体の使用) 上記で考察したように、cDNAを固体支持体上で合成する必要が高まってい
る。これらのcDNA分子は、cDNAライブラリーを作成するため、ならびに
遺伝子発現分析および診断的分析のためのプローブとして使用され得る。開示さ
れた固体支持体の設計は、現在のcDNAに依存する技術における以下の問題点
に取り組む。すわなち、多くのRNAの投入が必要であること、試料処理数が少
ないこと、使用者の操作が多いこと、有機的な抽出物および沈殿物、挿入サイズ
によるベクターの偏りおよび低い適合性である。固相アプローチの1つの利点は
、溶液中でのcDNA合成が中間の沈殿工程をともなう多くの工程が必要である
ことである。
る。これらのcDNA分子は、cDNAライブラリーを作成するため、ならびに
遺伝子発現分析および診断的分析のためのプローブとして使用され得る。開示さ
れた固体支持体の設計は、現在のcDNAに依存する技術における以下の問題点
に取り組む。すわなち、多くのRNAの投入が必要であること、試料処理数が少
ないこと、使用者の操作が多いこと、有機的な抽出物および沈殿物、挿入サイズ
によるベクターの偏りおよび低い適合性である。固相アプローチの1つの利点は
、溶液中でのcDNA合成が中間の沈殿工程をともなう多くの工程が必要である
ことである。
【0075】 この開示において記載されるように、特定の固体支持体上でcDNA分子を生
成する種々のアプローチが存在する。以下の一般的なスキームが1つの実例を提
供する。まず、RNAを標準的な技術を用いて調製する。実施例1に記載する研
究において、全RNAを、酸−グアニジニウム−フェノール抽出によって、周知
の方法を用いて調製した(例えばAusubelら(編)、Short Pro
tocols in Molecular Biology、第3版、4−4か
ら4−6頁(John Wiley&Sons,Inc.1995);Wuら、
Methods in Gene Biotechnology、33−34頁
(CRC Press 1997)を参照のこと)。次いで、メッセンジャーR
NAを、例えばオリゴ(dT)テールを有するオリゴヌクレオチドを含む固体支
持体上に捕獲する。
成する種々のアプローチが存在する。以下の一般的なスキームが1つの実例を提
供する。まず、RNAを標準的な技術を用いて調製する。実施例1に記載する研
究において、全RNAを、酸−グアニジニウム−フェノール抽出によって、周知
の方法を用いて調製した(例えばAusubelら(編)、Short Pro
tocols in Molecular Biology、第3版、4−4か
ら4−6頁(John Wiley&Sons,Inc.1995);Wuら、
Methods in Gene Biotechnology、33−34頁
(CRC Press 1997)を参照のこと)。次いで、メッセンジャーR
NAを、例えばオリゴ(dT)テールを有するオリゴヌクレオチドを含む固体支
持体上に捕獲する。
【0076】 あるいは、グアニジニウムチオシアネートまたは塩酸グアニジンのようなカオ
トロープを細胞溶解およびハイブリダイゼーションの両方のために用いた、同時
溶解−mRNA捕獲プロトコールを使用することが可能である。このアプローチ
は少数の細胞の溶解を可能にする。この方法によれば、溶解物をグラスファイバ
ーフィルターに通すことによってDNAを除去し、mRNAを固体支持体上に捕
獲し、そして結合していない混入物および材料を洗い流す。これは標準的なRN
A調製手順に固有の有機相抽出および連続的なエタノール沈殿に伴う損失を阻止
する。
トロープを細胞溶解およびハイブリダイゼーションの両方のために用いた、同時
溶解−mRNA捕獲プロトコールを使用することが可能である。このアプローチ
は少数の細胞の溶解を可能にする。この方法によれば、溶解物をグラスファイバ
ーフィルターに通すことによってDNAを除去し、mRNAを固体支持体上に捕
獲し、そして結合していない混入物および材料を洗い流す。これは標準的なRN
A調製手順に固有の有機相抽出および連続的なエタノール沈殿に伴う損失を阻止
する。
【0077】 支持体に結合したRNAを、cDNAの第1鎖を標準的な方法を用いて作成す
る鋳型として使用する。次いで、cDNAの第2鎖を合成するか、またはアダプ
ターをcDNAの第1鎖の遠位端に置く。例示としては、例えばターミナルトラ
ンスフェラーゼを用いて、3つのdNGを第1鎖の3’末端に置くことが可能で
ある。あるいは、アダプターをcDNA分子の3’末端にライゲーションし得る
。次いで、相補的なプライマーをアダプターとハイブリダイズする。次いで、c
DNAの第2鎖を、cDNAの第1鎖を鋳型として用いて合成する。
る鋳型として使用する。次いで、cDNAの第2鎖を合成するか、またはアダプ
ターをcDNAの第1鎖の遠位端に置く。例示としては、例えばターミナルトラ
ンスフェラーゼを用いて、3つのdNGを第1鎖の3’末端に置くことが可能で
ある。あるいは、アダプターをcDNA分子の3’末端にライゲーションし得る
。次いで、相補的なプライマーをアダプターとハイブリダイズする。次いで、c
DNAの第2鎖を、cDNAの第1鎖を鋳型として用いて合成する。
【0078】 あるいは、結合したRNAのランダムな配列または特定の配列のいずれかをポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅し得る。手短には、PCRは特定化
されたポリメラーゼに基づく方法であり、これはデオキシリボヌクレオチドおよ
びそれぞれ約20塩基の長さで標的配列に隣接する2つのDNAプライマーを含
む混合物中で、所定のDNA鎖に相補的な鎖を合成し得る。標的配列を含む二本
鎖DNAの鎖を分離するために混合物を加熱し、次いで、プライマーが、分離し
た鎖上のそれらの相補的な配列に結合できるように冷却する。次いで、ポリメラ
ーゼがプライマーを伸長して新しい相補的な鎖ができる。新しい二本鎖はそれぞ
れ分離してさらなる合成のための2つの鋳型になるので、加熱と冷却のサイクル
を繰り返すと標的DNAは指数関数的に増加する。約1時間で、20PCRサイ
クルは標的を100万倍増幅し得る。PCRを行うための標準的な方法は当業者
に周知である(例えば、Delidowら、「ポリメラーゼ連鎖反応:基本的プ
ロトコル」PCR Protocols:Current Methods a
nd Applications、White(編)、1−29頁(Human
a Press,Inc.1993);Ausubelら(編)、Short
Protocols in Molecular Biology、第3版、1
5−1から15−40頁(John Wiley&Sons,Inc.1995
)を参照のこと)。
リメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅し得る。手短には、PCRは特定化
されたポリメラーゼに基づく方法であり、これはデオキシリボヌクレオチドおよ
びそれぞれ約20塩基の長さで標的配列に隣接する2つのDNAプライマーを含
む混合物中で、所定のDNA鎖に相補的な鎖を合成し得る。標的配列を含む二本
鎖DNAの鎖を分離するために混合物を加熱し、次いで、プライマーが、分離し
た鎖上のそれらの相補的な配列に結合できるように冷却する。次いで、ポリメラ
ーゼがプライマーを伸長して新しい相補的な鎖ができる。新しい二本鎖はそれぞ
れ分離してさらなる合成のための2つの鋳型になるので、加熱と冷却のサイクル
を繰り返すと標的DNAは指数関数的に増加する。約1時間で、20PCRサイ
クルは標的を100万倍増幅し得る。PCRを行うための標準的な方法は当業者
に周知である(例えば、Delidowら、「ポリメラーゼ連鎖反応:基本的プ
ロトコル」PCR Protocols:Current Methods a
nd Applications、White(編)、1−29頁(Human
a Press,Inc.1993);Ausubelら(編)、Short
Protocols in Molecular Biology、第3版、1
5−1から15−40頁(John Wiley&Sons,Inc.1995
)を参照のこと)。
【0079】 従って、結合したmRNAの既知の部分に相補的なプライマーを加え得る。次
いで、特異的なプライマーおよびアダプターに相補的なプライマーを用いて増幅
することが可能である。代表的には5−15回の熱サイクルの増幅の後、次いで
、生じたDNAフラグメントをクローニングし得、配列の5’末端の配列を決定
し得る。次いで、アダプターおよび遺伝子の5’末端に相補的な配列を含む新し
いハイブリッドプライマーを合成することが可能である。次いで、全長のcDN
Aを固体支持体から増幅する。
いで、特異的なプライマーおよびアダプターに相補的なプライマーを用いて増幅
することが可能である。代表的には5−15回の熱サイクルの増幅の後、次いで
、生じたDNAフラグメントをクローニングし得、配列の5’末端の配列を決定
し得る。次いで、アダプターおよび遺伝子の5’末端に相補的な配列を含む新し
いハイブリッドプライマーを合成することが可能である。次いで、全長のcDN
Aを固体支持体から増幅する。
【0080】 「アンカー(anchor)PCR」と呼ばれるPCRの修飾は、配列情報が
少ししか入手可能でなくても、全長mRNAの増幅を可能にする(Ausube
lら(編)、Short Protocols in Molecular B
iology、第3版、15−27から15−32頁(John Wiley&
Sons,Inc.1995))。この手順は、既知の配列に対して下流へ向か
って増幅する場合は成熟mRNAのポリ(A)テールに相補的であるか、または
既知の配列に対して上流へ向かって増幅する場合は第1鎖の合成後にcDNAに
加える合成ホモポリマーテールに相補的であるかのいずれかの、オリゴ(dT)
プライマーを必要とする。
少ししか入手可能でなくても、全長mRNAの増幅を可能にする(Ausube
lら(編)、Short Protocols in Molecular B
iology、第3版、15−27から15−32頁(John Wiley&
Sons,Inc.1995))。この手順は、既知の配列に対して下流へ向か
って増幅する場合は成熟mRNAのポリ(A)テールに相補的であるか、または
既知の配列に対して上流へ向かって増幅する場合は第1鎖の合成後にcDNAに
加える合成ホモポリマーテールに相補的であるかのいずれかの、オリゴ(dT)
プライマーを必要とする。
【0081】 これらの一般的なcDNA合成方法には、固体支持体方法論を利用するさらな
る技術の開始連絡点を提供する、少なくとも2つの分岐点がある。1つの分岐点
はcDNAの第1鎖の合成後である。この点において、残っているRNA鋳型を
RNアーゼHで消化し、水酸化ナトリウム中で加水分解し、または熱変性により
除去して、オリゴヌクレオチドによる第2鎖の合成、PCR、ランダムプライマ
ープローブの作成、または標識オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現研究のた
めに使用され得る1本鎖DNA鋳型を残し得る。結合したcDNAをサブトラク
ト(subtracted)ライブラリーまたは種々の適用のためのディファレ
ンシャル(differential)プローブを調製するためにもまた、使用
し得る。
る技術の開始連絡点を提供する、少なくとも2つの分岐点がある。1つの分岐点
はcDNAの第1鎖の合成後である。この点において、残っているRNA鋳型を
RNアーゼHで消化し、水酸化ナトリウム中で加水分解し、または熱変性により
除去して、オリゴヌクレオチドによる第2鎖の合成、PCR、ランダムプライマ
ープローブの作成、または標識オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現研究のた
めに使用され得る1本鎖DNA鋳型を残し得る。結合したcDNAをサブトラク
ト(subtracted)ライブラリーまたは種々の適用のためのディファレ
ンシャル(differential)プローブを調製するためにもまた、使用
し得る。
【0082】 cDNAの第2鎖の合成が、固体支持体cDNA技術における2番目の分岐点
を提示する。ここでは、全長1本鎖cDNAプローブ、ライブラリーの産生、イ
ンビトロ転写、および5’RACEのようなプロセスを補助し得るcDNAに、
アダプターを連結するために選択し得る。
を提示する。ここでは、全長1本鎖cDNAプローブ、ライブラリーの産生、イ
ンビトロ転写、および5’RACEのようなプロセスを補助し得るcDNAに、
アダプターを連結するために選択し得る。
【0083】 固体支持体cDNA合成の1つの重要な利点は、プロセスを自動化できる能力
である。高処理量cDNAライブラリー産生または遺伝子発現研究のためには、
本明細書中に記載された固体支持体を96ウェル方式に適応させることが有用で
ある。ロボットアームを使用して、96の支持体を96の金メッキしたピンに運
び、そして標準的な96ウェルCetusプレートでcDNA合成を指示し得る
。
である。高処理量cDNAライブラリー産生または遺伝子発現研究のためには、
本明細書中に記載された固体支持体を96ウェル方式に適応させることが有用で
ある。ロボットアームを使用して、96の支持体を96の金メッキしたピンに運
び、そして標準的な96ウェルCetusプレートでcDNA合成を指示し得る
。
【0084】 (5.遺伝子発現の分析) 本明細書中に記載した固体支持体が、多数の遺伝子(1−2000)の発現を
1回の測定で調べるための高処理量の方法で使用され得る。そのような方法は、
1回の処理あたり100より多い試料で同時に行い得る。その方法は薬物のスク
リーニング、発生生物学、分子医学研究等に適用できる。従って、本発明の1つ
の局面では、選択された生物学的試料から遺伝子発現のパターンを分析するため
の方法が提供される。それは以下の工程を含む。すなわち、(a)生物学的試料
から核酸を取り出す工程、(b)取り出した核酸を、プローブが核酸とハイブリ
ダイズするのに十分な条件下および時間で、1つ以上の選択した検出可能な標識
核酸プローブと組み合わせる工程であって、ここで検出可能な標識は特定の核酸
プローブと相関的であり、分光測定法または電位差測定法で検出可能である、工
程、(c)ハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしていないプローブと
分離する工程、(d)分光測定法または電位差測定法で標識を検出する工程、お
よび(e)それから生物学的試料の遺伝子発現のパターンを決定する工程。
1回の測定で調べるための高処理量の方法で使用され得る。そのような方法は、
1回の処理あたり100より多い試料で同時に行い得る。その方法は薬物のスク
リーニング、発生生物学、分子医学研究等に適用できる。従って、本発明の1つ
の局面では、選択された生物学的試料から遺伝子発現のパターンを分析するため
の方法が提供される。それは以下の工程を含む。すなわち、(a)生物学的試料
から核酸を取り出す工程、(b)取り出した核酸を、プローブが核酸とハイブリ
ダイズするのに十分な条件下および時間で、1つ以上の選択した検出可能な標識
核酸プローブと組み合わせる工程であって、ここで検出可能な標識は特定の核酸
プローブと相関的であり、分光測定法または電位差測定法で検出可能である、工
程、(c)ハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしていないプローブと
分離する工程、(d)分光測定法または電位差測定法で標識を検出する工程、お
よび(e)それから生物学的試料の遺伝子発現のパターンを決定する工程。
【0085】 本発明の特に好ましい実施態様では、次のように行われるアッセイまたは方法
を提供する。標的供給源由来のRNAを、特異的なハイブリダイゼーション工程
を通して固体支持体につなぐ(例えば、結合したオリゴ(dT)捕獲プローブに
よるポリ(A)mRNAの捕獲)。次いで、固体支持体を洗浄し、そしてcDN
Aを固体支持体上で標準的な方法(すなわち、逆転写酵素)を用いて合成する。
次いで、RNA鎖を加水分解を通して除去する。その結果は、固体支持体に共有
結合的に固定化され、そこからcDNAを合成したRNAの多様性、存在量、お
よび複雑さを反映したDNA集団の産生である。次いで、固体支持体を、目的の
遺伝子配列に相補的な1つから数千のプローブとハイブリダイズさせる。それぞ
れのプローブを質量分析のような分光測定法で検出可能なタグで標識する。検索
工程の後で、過剰のまたはハイブリダイズしていないプローブを洗い流し、固体
支持体を、例えばマイクロタイタープレートのウェル中に置き、そして検出可能
なタグを固体支持体から切断する。次いで、固体支持体を試料容器のウェルから
取り除き、ウェルの内容物を分光計で測定する。特定のタグが現れることは、試
料中でのRNAの存在、および所定の生物学的試料中で特定の遺伝子が発現して
いるという証拠を示す。本方法はまた、定量的でもあり得る。
を提供する。標的供給源由来のRNAを、特異的なハイブリダイゼーション工程
を通して固体支持体につなぐ(例えば、結合したオリゴ(dT)捕獲プローブに
よるポリ(A)mRNAの捕獲)。次いで、固体支持体を洗浄し、そしてcDN
Aを固体支持体上で標準的な方法(すなわち、逆転写酵素)を用いて合成する。
次いで、RNA鎖を加水分解を通して除去する。その結果は、固体支持体に共有
結合的に固定化され、そこからcDNAを合成したRNAの多様性、存在量、お
よび複雑さを反映したDNA集団の産生である。次いで、固体支持体を、目的の
遺伝子配列に相補的な1つから数千のプローブとハイブリダイズさせる。それぞ
れのプローブを質量分析のような分光測定法で検出可能なタグで標識する。検索
工程の後で、過剰のまたはハイブリダイズしていないプローブを洗い流し、固体
支持体を、例えばマイクロタイタープレートのウェル中に置き、そして検出可能
なタグを固体支持体から切断する。次いで、固体支持体を試料容器のウェルから
取り除き、ウェルの内容物を分光計で測定する。特定のタグが現れることは、試
料中でのRNAの存在、および所定の生物学的試料中で特定の遺伝子が発現して
いるという証拠を示す。本方法はまた、定量的でもあり得る。
【0086】 切断可能なタグを用いた、遺伝子発現の迅速な測定のための組成物および方法
は、以下のように詳細に記載され得る。簡単には、遺伝子発現を決定することが
有用である組織、初代細胞株または形質転換細胞株、単離または精製した細胞型
あるいは他のあらゆる生物学的材料の供給源をRNAの供給源として使用し得る
。好ましい方法においては、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼを抑制するため、
および標的核酸の固体支持体へのストリンジェントなハイブリダイゼーションを
支持するために、生物学的材料供給源をカオトロープ存在下で溶解する。組織、
細胞および生物学的供給源を、1から6モルのカオトロープ塩(塩酸グアニジン
、グアニジンチオシアネート、過塩素酸ナトリウム等)中で効果的に溶解し得る
。
は、以下のように詳細に記載され得る。簡単には、遺伝子発現を決定することが
有用である組織、初代細胞株または形質転換細胞株、単離または精製した細胞型
あるいは他のあらゆる生物学的材料の供給源をRNAの供給源として使用し得る
。好ましい方法においては、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼを抑制するため、
および標的核酸の固体支持体へのストリンジェントなハイブリダイゼーションを
支持するために、生物学的材料供給源をカオトロープ存在下で溶解する。組織、
細胞および生物学的供給源を、1から6モルのカオトロープ塩(塩酸グアニジン
、グアニジンチオシアネート、過塩素酸ナトリウム等)中で効果的に溶解し得る
。
【0087】 生物学的試料供給源を溶解した後、その溶液を固体支持体と共に15分間から
数時間混合して、標的核酸を固定化する。一般的に、標的核酸の捕獲は、標的R
NAおよび固体支持体に固定化した捕獲プローブの相補的な塩基対形成を通して
達成される。1つの並びかえは、固体支持体につながれたオリゴ(dT)にハイ
ブリダイズするために、ほとんどの真核生物のメッセンジャーRNAに見いださ
れる3’ポリ(A)ストレッチを利用する。別の並びかえは、規定された配列を
含むRNAを捕獲するために、特異的なオリゴヌクレオチドまたは長いプローブ
(50塩基より長い)を利用することである。
数時間混合して、標的核酸を固定化する。一般的に、標的核酸の捕獲は、標的R
NAおよび固体支持体に固定化した捕獲プローブの相補的な塩基対形成を通して
達成される。1つの並びかえは、固体支持体につながれたオリゴ(dT)にハイ
ブリダイズするために、ほとんどの真核生物のメッセンジャーRNAに見いださ
れる3’ポリ(A)ストレッチを利用する。別の並びかえは、規定された配列を
含むRNAを捕獲するために、特異的なオリゴヌクレオチドまたは長いプローブ
(50塩基より長い)を利用することである。
【0088】 別の可能性は、標的RNA集団で多くの関連する配列の捕獲をもたらす縮重プ
ライマー(オリゴヌクレオチド)を利用することである。例えば、RNA試料を
、5’−T12MN−3’の式を有する4セットの縮重結合オリゴ(dT)プライ
マーそれぞれを用いて逆転写し得る。ここでMはG、A、またはCであり得、そ
してNはG、A、T、およびCである(Ausubelら(編)、Short
Protocols in Molecular Biology、第3版、1
5−35〜15−40頁(John Wiley&Sons,Inc.1995
))。それぞれのプライマーのセットは3’塩基によって規定され、Mの位置で
縮重している。
ライマー(オリゴヌクレオチド)を利用することである。例えば、RNA試料を
、5’−T12MN−3’の式を有する4セットの縮重結合オリゴ(dT)プライ
マーそれぞれを用いて逆転写し得る。ここでMはG、A、またはCであり得、そ
してNはG、A、T、およびCである(Ausubelら(編)、Short
Protocols in Molecular Biology、第3版、1
5−35〜15−40頁(John Wiley&Sons,Inc.1995
))。それぞれのプライマーのセットは3’塩基によって規定され、Mの位置で
縮重している。
【0089】 ハイブリダイゼーション時間は、RNA集団の配列の複雑さおよび利用した捕
獲プローブの型によって導かれる。ハイブリダイゼーション温度は、利用したカ
オトロープの型およびカオトロープの最終的な濃度によって規定される。一般的
な指針が例えば、Van NessおよびChen、Nucleic Acid
s Res.19:5143,1991によって提供される。好ましくはその溶
解物を固体支持体と共に連続的に攪拌し、標的RNAを拡散させる。標的核酸の
捕獲後、その溶解物を固体支持体から洗浄し、そして全てのカオトロープまたは
ハイブリダイゼーション溶液を除去する。この固体支持体を、好ましくはイオン
性または非イオン性界面活性剤、緩衝液、および塩を含む溶液で洗浄する。
獲プローブの型によって導かれる。ハイブリダイゼーション温度は、利用したカ
オトロープの型およびカオトロープの最終的な濃度によって規定される。一般的
な指針が例えば、Van NessおよびChen、Nucleic Acid
s Res.19:5143,1991によって提供される。好ましくはその溶
解物を固体支持体と共に連続的に攪拌し、標的RNAを拡散させる。標的核酸の
捕獲後、その溶解物を固体支持体から洗浄し、そして全てのカオトロープまたは
ハイブリダイゼーション溶液を除去する。この固体支持体を、好ましくはイオン
性または非イオン性界面活性剤、緩衝液、および塩を含む溶液で洗浄する。
【0090】 次の工程は捕獲RNAに相補的なDNAの合成である。そこではつながれた捕
獲オリゴヌクレオチドが逆転写酵素のための伸長プライマーとして働く。反応は
一般的に25〜37℃で行い、そして好ましくはポリマー化反応の間攪拌する。
捕獲オリゴヌクレオチドが伸長プライマーとして働くので、cDNAを合成した
後、それは固体支持体に共有結合に付着している。次いで、RNAをcDNA/
RNA二本鎖から加水分解する。この工程は、二本鎖を変性させる熱を用いて、
またはRNAを化学的に加水分解するために塩基(すなわち0.1N NaOH
)を用いて行い得る。この工程の目的は、cDNAを規定されたプローブとの引
き続くハイブリダイゼーションのために利用可能にすることである。次いで、固
体支持体または固体支持体のセットをさらに洗浄して、RNAまたはRNAフラ
グメントを除去する。この時点で、固体支持体は、配列の含有量、複雑さ、およ
び多様性の点でRNA集団を代表する、cDNA分子の近似的に代表する集団を
含む。
獲オリゴヌクレオチドが逆転写酵素のための伸長プライマーとして働く。反応は
一般的に25〜37℃で行い、そして好ましくはポリマー化反応の間攪拌する。
捕獲オリゴヌクレオチドが伸長プライマーとして働くので、cDNAを合成した
後、それは固体支持体に共有結合に付着している。次いで、RNAをcDNA/
RNA二本鎖から加水分解する。この工程は、二本鎖を変性させる熱を用いて、
またはRNAを化学的に加水分解するために塩基(すなわち0.1N NaOH
)を用いて行い得る。この工程の目的は、cDNAを規定されたプローブとの引
き続くハイブリダイゼーションのために利用可能にすることである。次いで、固
体支持体または固体支持体のセットをさらに洗浄して、RNAまたはRNAフラ
グメントを除去する。この時点で、固体支持体は、配列の含有量、複雑さ、およ
び多様性の点でRNA集団を代表する、cDNA分子の近似的に代表する集団を
含む。
【0091】 次の工程は、選択されたプローブを固体支持体にハイブリダイズして、特異的
なcDNA配列の存在または欠如、および相対的な含有量を同定することである
。プローブは好ましくは15から50ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド
である。プローブの配列はアッセイの実施者(end−user)によって規定
される。例えば、実施者(end−user)が組織の炎症性応答における遺伝
子発現を意図する場合、プローブを多くのサイトカインmRNA、脂質を調節す
る酵素をコードするRNA、炎症性応答に関与する細胞を調節する因子をコード
するRNAなどに相補的になるように選択する。一旦所望の配列のセットが研究
のために規定されると、各々の配列を、オリゴヌクレオチドプローブを設計する
ために使用し、そして各々のプローブを、特異的な切断可能なタグに割り当てる
。次いで、そのタグをそれぞれのオリゴヌクレオチドに結合させる。次いで、オ
リゴヌクレオチドを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、固体支持体上の
cDNAとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション工程の完了後、固体
支持体を洗浄してハイブリダイズしていないプローブを除去する。次いで、固体
支持体または支持体のアレイを、検出可能なタグの切断をもたらす溶液中に入れ
る。発現されたmRNAの存在(および存在量)を検出可能なタグの量を測定す
ることによって決定する。例えば、質量分析タグを、質量分析計を用いて調べる
。
なcDNA配列の存在または欠如、および相対的な含有量を同定することである
。プローブは好ましくは15から50ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド
である。プローブの配列はアッセイの実施者(end−user)によって規定
される。例えば、実施者(end−user)が組織の炎症性応答における遺伝
子発現を意図する場合、プローブを多くのサイトカインmRNA、脂質を調節す
る酵素をコードするRNA、炎症性応答に関与する細胞を調節する因子をコード
するRNAなどに相補的になるように選択する。一旦所望の配列のセットが研究
のために規定されると、各々の配列を、オリゴヌクレオチドプローブを設計する
ために使用し、そして各々のプローブを、特異的な切断可能なタグに割り当てる
。次いで、そのタグをそれぞれのオリゴヌクレオチドに結合させる。次いで、オ
リゴヌクレオチドを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、固体支持体上の
cDNAとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション工程の完了後、固体
支持体を洗浄してハイブリダイズしていないプローブを除去する。次いで、固体
支持体または支持体のアレイを、検出可能なタグの切断をもたらす溶液中に入れ
る。発現されたmRNAの存在(および存在量)を検出可能なタグの量を測定す
ることによって決定する。例えば、質量分析タグを、質量分析計を用いて調べる
。
【0092】 上記で述べたディファレンシャル発現を分析するための方法の多くのバリエー
ションがある。例えば、ディファレンシャル発現はサブトラクトライブラリーを
用いて調べ得る。活性化または発達の特定の段階を代表する遺伝子発現のパター
ンを明らかにするために余剰なメッセージをサブトラクトすること(subtr
action)は、あらゆる遺伝子発見プログラムの所望の能力である。サブト
ラクトcDNAライブラリー作成のための多くのプロトコールが存在するが、ほ
とんどが大量のRNAまたは既に存在するcDNAライブラリーのいずれかを必
要とする。mRNAを捕獲するための固体支持体の使用は、バックグラウンドを
示すメッセージの供給源を差し引くことを可能にする。所望のmRNA種を逆転
写し、そしてRNA鋳型をアルカリを用いて破壊する。生じる「サブトラクト鋳
型」は無限に再利用され得る。
ションがある。例えば、ディファレンシャル発現はサブトラクトライブラリーを
用いて調べ得る。活性化または発達の特定の段階を代表する遺伝子発現のパター
ンを明らかにするために余剰なメッセージをサブトラクトすること(subtr
action)は、あらゆる遺伝子発見プログラムの所望の能力である。サブト
ラクトcDNAライブラリー作成のための多くのプロトコールが存在するが、ほ
とんどが大量のRNAまたは既に存在するcDNAライブラリーのいずれかを必
要とする。mRNAを捕獲するための固体支持体の使用は、バックグラウンドを
示すメッセージの供給源を差し引くことを可能にする。所望のmRNA種を逆転
写し、そしてRNA鋳型をアルカリを用いて破壊する。生じる「サブトラクト鋳
型」は無限に再利用され得る。
【0093】 サブトラクトライブラリーを作成するために、調査中の供給源由来のRNAを
熱で変性させ、次いで、サブトラクト鋳型上のcDNAの第1鎖にハイブリダイ
ズさせる。次いで、結合していないRNAを洗浄して除き、そして、全ての結合
した、サブトラクトRNAがサブトラクト鋳型から溶出された後、2回目に直接
捕獲またはハイブリダイズのいずれかを行う。捕獲後、cDNA合成を以前に記
載したように継続する。
熱で変性させ、次いで、サブトラクト鋳型上のcDNAの第1鎖にハイブリダイ
ズさせる。次いで、結合していないRNAを洗浄して除き、そして、全ての結合
した、サブトラクトRNAがサブトラクト鋳型から溶出された後、2回目に直接
捕獲またはハイブリダイズのいずれかを行う。捕獲後、cDNA合成を以前に記
載したように継続する。
【0094】 関連したアプローチにおいては、1種類の細胞型由来の1本鎖cDNAを、密
接に関連した細胞型由来の固定化したmRNAとハイブリダイズし、ハイブリダ
イズしていないcDNAの少量の画分を単離することによって、サブトラクトc
DNAプローブを調製する。この濃縮の結果、サブトラクトcDNAのDNA断
片を、ディファレンシャルに発現している配列を含むcDNAクローンを同定す
るために使用し得る。サブトラクトcDNAはまた、サブトラクトcDNAライ
ブラリーを調製するために使用し得る。プローブとして使用するための、または
クローニングのためのサブトラクトcDNAを増幅するためにPCRを使用し得
る(例えば、KuelおよびBattey、「サブトラクトcDNAのポリメラ
ーゼ連鎖反応の継続する供給源の産生」 PCR Protocols:Cur
rent Methods and Applications、White(
編)、287〜304頁(Humana Press,Inc.1993);W
uら、Methods in Gene Biotechnology、29−
65頁(CRC Press 1997)を参照のこと)。
接に関連した細胞型由来の固定化したmRNAとハイブリダイズし、ハイブリダ
イズしていないcDNAの少量の画分を単離することによって、サブトラクトc
DNAプローブを調製する。この濃縮の結果、サブトラクトcDNAのDNA断
片を、ディファレンシャルに発現している配列を含むcDNAクローンを同定す
るために使用し得る。サブトラクトcDNAはまた、サブトラクトcDNAライ
ブラリーを調製するために使用し得る。プローブとして使用するための、または
クローニングのためのサブトラクトcDNAを増幅するためにPCRを使用し得
る(例えば、KuelおよびBattey、「サブトラクトcDNAのポリメラ
ーゼ連鎖反応の継続する供給源の産生」 PCR Protocols:Cur
rent Methods and Applications、White(
編)、287〜304頁(Humana Press,Inc.1993);W
uら、Methods in Gene Biotechnology、29−
65頁(CRC Press 1997)を参照のこと)。
【0095】 さらに別のバリエーションにおいて、ビオチン化オリゴ(dT)MN分子、上
記で述べた縮重プライマーを、mRNAを固体支持体に結合させ、そして第1鎖
の合成を始めるために使用する(例えば、Rosokら、BioTechniq
ues 21:114、1996を参照のこと)。逆転写の後、ビオチン化オリ
ゴ(dT)MNおよび任意のデカマーをプライマーとして、固相cDNAをポリ
メラーゼ連鎖反応における鋳型として使用する。次いで、2つの細胞集団から得
られたPCR産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分画の後比較する
。目的のPCRのバンドをゲルから溶出し、そして精製したPCR産物を、選択
されたバンドを増幅するさらなるポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用する。
2回目のポリメラーゼ連鎖反応の産物をプローブとして使用し得るか、または配
列分析によってさらに試験し得る。
記で述べた縮重プライマーを、mRNAを固体支持体に結合させ、そして第1鎖
の合成を始めるために使用する(例えば、Rosokら、BioTechniq
ues 21:114、1996を参照のこと)。逆転写の後、ビオチン化オリ
ゴ(dT)MNおよび任意のデカマーをプライマーとして、固相cDNAをポリ
メラーゼ連鎖反応における鋳型として使用する。次いで、2つの細胞集団から得
られたPCR産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分画の後比較する
。目的のPCRのバンドをゲルから溶出し、そして精製したPCR産物を、選択
されたバンドを増幅するさらなるポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用する。
2回目のポリメラーゼ連鎖反応の産物をプローブとして使用し得るか、または配
列分析によってさらに試験し得る。
【0096】 (6.固相診断アッセイ) ((A)多型性の検出) 制限エンドヌクレアーゼは短いDNA配列を認識し、そしてその特定の部位で
DNA分子を切断する。ある制限酵素はDNAをごくまれにしか切断せず、少数
の非常に大きなフラグメント(数千から百万塩基対)を産生する。ほとんどの制
限酵素はDNAをより頻繁に切断し、従って多くの小さな断片(100塩基対未
満から1000塩基対より大きい)を産生する。平均として、4塩基の認識部位
を有する制限酵素は256塩基の長さの断片を産生し、6塩基の認識部位を有す
るものは4000塩基の長さの断片を産生し、そして8塩基の認識部位を有する
ものは64,000塩基の長さの断片を産生する。何百もの異なった制限酵素が
同定されているので、DNAは多くの異なった小さい断片に切断され得る。
DNA分子を切断する。ある制限酵素はDNAをごくまれにしか切断せず、少数
の非常に大きなフラグメント(数千から百万塩基対)を産生する。ほとんどの制
限酵素はDNAをより頻繁に切断し、従って多くの小さな断片(100塩基対未
満から1000塩基対より大きい)を産生する。平均として、4塩基の認識部位
を有する制限酵素は256塩基の長さの断片を産生し、6塩基の認識部位を有す
るものは4000塩基の長さの断片を産生し、そして8塩基の認識部位を有する
ものは64,000塩基の長さの断片を産生する。何百もの異なった制限酵素が
同定されているので、DNAは多くの異なった小さい断片に切断され得る。
【0097】 少数の既知のヒトDNA多型性は、非反復配列の挿入、欠失、または他の配置
転換に基づくが、非常に多くは1塩基の置換またはタンデムリピートの数の変異
のいずれかに基づく。塩基の置換はヒトゲノムで非常に豊富に存在し、平均20
0−500塩基対ごとに1回起こる。タンデムリピートブロックの長さの変異も
また、ゲノムではよくあることで、少なくとも何万もの散在する多型性部位、ま
たは「遺伝子座」が存在する。タンデムリピート多型性の反復の長さは、(dA
)n(dT)n配列中の1塩基対からαサテライトDNA中の少なくとも170塩
基対の範囲にわたる。タンデムリピート多型性は、代表的な反復の長さが数十塩
基対であり、かつ全体の反復単位が数十から数千であるミニサテライト/可変長
タンデムリピート(variable number of tandem r
epeats)(VNTR)、および、反復の長さが6塩基対まで、かつ全長が
最長で約70塩基対であるマイクロサテライトからなる、2つの大きなグループ
に分けられ得る。現在までに同定されたマイクロサテライト多型性のほとんどが
(dC−dA)nまたは(dG−dT)nジヌクレオチド反復配列に基づいていた
。マイクロサテライト多型性の分析は、反復のブロックを含む小さいDNAフラ
グメントのポリメラーゼ連鎖反応による増幅、その次いで、増幅したDNAの変
性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動を含む。PCRプライマーは、反復の
ブロックに隣接する特有の配列に相補的である。対立遺伝子は、しばしば1回の
反復分しかサイズが違わないので、マイクロサテライトのためには従来アガロー
スゲルよりもポリアクリルアミドゲルが使われている。
転換に基づくが、非常に多くは1塩基の置換またはタンデムリピートの数の変異
のいずれかに基づく。塩基の置換はヒトゲノムで非常に豊富に存在し、平均20
0−500塩基対ごとに1回起こる。タンデムリピートブロックの長さの変異も
また、ゲノムではよくあることで、少なくとも何万もの散在する多型性部位、ま
たは「遺伝子座」が存在する。タンデムリピート多型性の反復の長さは、(dA
)n(dT)n配列中の1塩基対からαサテライトDNA中の少なくとも170塩
基対の範囲にわたる。タンデムリピート多型性は、代表的な反復の長さが数十塩
基対であり、かつ全体の反復単位が数十から数千であるミニサテライト/可変長
タンデムリピート(variable number of tandem r
epeats)(VNTR)、および、反復の長さが6塩基対まで、かつ全長が
最長で約70塩基対であるマイクロサテライトからなる、2つの大きなグループ
に分けられ得る。現在までに同定されたマイクロサテライト多型性のほとんどが
(dC−dA)nまたは(dG−dT)nジヌクレオチド反復配列に基づいていた
。マイクロサテライト多型性の分析は、反復のブロックを含む小さいDNAフラ
グメントのポリメラーゼ連鎖反応による増幅、その次いで、増幅したDNAの変
性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動を含む。PCRプライマーは、反復の
ブロックに隣接する特有の配列に相補的である。対立遺伝子は、しばしば1回の
反復分しかサイズが違わないので、マイクロサテライトのためには従来アガロー
スゲルよりもポリアクリルアミドゲルが使われている。
【0098】 DNA多型性の分析のために広範な種々の技術が開発されてきた。最も広範に
使用されている方法、制限フラグメント長多型(RFLP)アプローチは、制限
酵素消化、ゲル電気泳動、膜へのブロッティング、およびクローニングしたDN
Aプローブへのハイブリダイゼーションを組み合せている。多型性はブロット上
の標識フラグメントの長さの変動として検出される。配列の変化が制限酵素部位
に起こった場合、塩基の置換を分析するためにRFLPアプローチを使用し得る
か、または反復単位の外側を切断する制限酵素を選択することによってミニサテ
ライト/VNTRを分析するために使用し得る。アガロースゲルは通常1反復単
位で異なるミニサテライト/VNTR対立遺伝子を区別するのに必要な分離はで
きないが、それでも多くのミニサテライト/VNTRは非常に多様であるので、
高度に情報量の多いマーカーを得ることができる(Vosら、Nuc.Acid
s Res.23:4407、1995)。
使用されている方法、制限フラグメント長多型(RFLP)アプローチは、制限
酵素消化、ゲル電気泳動、膜へのブロッティング、およびクローニングしたDN
Aプローブへのハイブリダイゼーションを組み合せている。多型性はブロット上
の標識フラグメントの長さの変動として検出される。配列の変化が制限酵素部位
に起こった場合、塩基の置換を分析するためにRFLPアプローチを使用し得る
か、または反復単位の外側を切断する制限酵素を選択することによってミニサテ
ライト/VNTRを分析するために使用し得る。アガロースゲルは通常1反復単
位で異なるミニサテライト/VNTR対立遺伝子を区別するのに必要な分離はで
きないが、それでも多くのミニサテライト/VNTRは非常に多様であるので、
高度に情報量の多いマーカーを得ることができる(Vosら、Nuc.Acid
s Res.23:4407、1995)。
【0099】 固相技術は多型性を検出する能力を高めた。例えば、対立遺伝子の1つの型を
増幅するために、ビオチン化プライマーを対立遺伝子特異的PCRプライマーと
共に使用する。増幅後、PCR産物を蛍光標識プローブに対する溶液ハイブリダ
イゼーションによって検出し得、そしてハイブリッドを、ストレプトアビジンを
有する固相支持体上に捕獲する(例えば、SyvanenおよびLandegr
en、Human Mutation 3:172、1994を参照のこと)。
増幅するために、ビオチン化プライマーを対立遺伝子特異的PCRプライマーと
共に使用する。増幅後、PCR産物を蛍光標識プローブに対する溶液ハイブリダ
イゼーションによって検出し得、そしてハイブリッドを、ストレプトアビジンを
有する固相支持体上に捕獲する(例えば、SyvanenおよびLandegr
en、Human Mutation 3:172、1994を参照のこと)。
【0100】 「固相ミニシークエンシング」と呼ばれる別のアプローチでは、ビオチン化し
た増幅産物をストレプトアビジンで覆った支持体に固定化する。次いで、増幅産
物を、区別される配列変異体の1つに相補的な1つのヌクレオシド三リン酸の存
在下で、配列特異的伸長反応の鋳型として使用する(例えば、Syvanenお
よびLandegren、Human Mutation 3:172、199
4;Syvanen、Clin.Chem.Acta 226:225、199
4;Jarvelaら、J.Med.Genet.33:1041、1996を
参照のこと)。
た増幅産物をストレプトアビジンで覆った支持体に固定化する。次いで、増幅産
物を、区別される配列変異体の1つに相補的な1つのヌクレオシド三リン酸の存
在下で、配列特異的伸長反応の鋳型として使用する(例えば、Syvanenお
よびLandegren、Human Mutation 3:172、199
4;Syvanen、Clin.Chem.Acta 226:225、199
4;Jarvelaら、J.Med.Genet.33:1041、1996を
参照のこと)。
【0101】 「オリゴヌクレオチド連結アッセイ」では、2つのディファレンシャルに標識
した対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、ビオチン化した下流のオリゴヌク
レオチドに連結するそれらの能力に関して比較する(例えば、Nickerso
nら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8923、19
90;Nickersonら、Genomics 12:377、1992を参
照のこと)。標識していないオリゴヌクレオチドを、テストウェルに突き出して
いるアビジンコートした固体支持体上に固定化する。標的配列の存在を、結合し
た標識オリゴヌクレオチドが発する特定のシグナルを測定することによって決定
する。例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを異なった蛍光団によって
標識し得、そして標的の存在を蛍光測定によって決定する。
した対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、ビオチン化した下流のオリゴヌク
レオチドに連結するそれらの能力に関して比較する(例えば、Nickerso
nら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8923、19
90;Nickersonら、Genomics 12:377、1992を参
照のこと)。標識していないオリゴヌクレオチドを、テストウェルに突き出して
いるアビジンコートした固体支持体上に固定化する。標的配列の存在を、結合し
た標識オリゴヌクレオチドが発する特定のシグナルを測定することによって決定
する。例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを異なった蛍光団によって
標識し得、そして標的の存在を蛍光測定によって決定する。
【0102】 Nepomら、J.Rhematol.23:5(1996)は、核酸の生物
学的試料およびビオチン化プライマーを用いて、選択された配列をPCRを使用
して増幅する遺伝子型分析の方法を記載する。少量の増幅産物を、対立遺伝子特
異的ハイブリダイゼーションおよび検出を行う自動処理機器に移す。
学的試料およびビオチン化プライマーを用いて、選択された配列をPCRを使用
して増幅する遺伝子型分析の方法を記載する。少量の増幅産物を、対立遺伝子特
異的ハイブリダイゼーションおよび検出を行う自動処理機器に移す。
【0103】 DNAフィンガープリンティングは多型性検出の別の局面を表す。種々のDN
Aフィンガープリンティング技術が現在利用可能であり、それらの大部分はフラ
グメントを生成するのにPCRを使用する(例えば、Jeffriesら、Na
ture 314:67、1985;WelshおよびMcClelland、
Nucleic Acids Res.19:861,1991を参照のこと)
。どのフィンガープリンティング技術を使うかの選択は、適用(例えば、DNA
タイピング、DNAマーカーマッピング)および調査中の生物(例えば、原核生
物、植物、動物、ヒト)に依存する。
Aフィンガープリンティング技術が現在利用可能であり、それらの大部分はフラ
グメントを生成するのにPCRを使用する(例えば、Jeffriesら、Na
ture 314:67、1985;WelshおよびMcClelland、
Nucleic Acids Res.19:861,1991を参照のこと)
。どのフィンガープリンティング技術を使うかの選択は、適用(例えば、DNA
タイピング、DNAマーカーマッピング)および調査中の生物(例えば、原核生
物、植物、動物、ヒト)に依存する。
【0104】 一般的には、DNAフィンガープリンティングは全長cDNAを本発明のチッ
プ上で合成することにより行い得る。次いで、cDNAを制限エンドヌクレアー
ゼで消化し、そして結合していない物質をチップから洗浄して除く。次いで、ア
ダプターを結合したcDNAに連結し、そしてその産物を増幅および分析し得る
。
プ上で合成することにより行い得る。次いで、cDNAを制限エンドヌクレアー
ゼで消化し、そして結合していない物質をチップから洗浄して除く。次いで、ア
ダプターを結合したcDNAに連結し、そしてその産物を増幅および分析し得る
。
【0105】 ランダム増幅多型DNA(random amplified polymo
rphic DNA)(RAPD)、DNA増幅フィンガープリンティング(D
AF)、およびarbitrarily primed PCR(AP−PCR
)を含む多くのフィンガープリンティング法が過去数年間で開発された。これら
の方法は全て、任意に選択したPCRプライマーによるランダムなゲノムDNA
フラグメントの増幅に基づいている。先に配列の知識がなくても、あらゆるDN
AについてDNAフラグメントのパターンを産生し得る。産生されるパターンは
、PCRプライマーの配列および鋳型DNAの性質に依存する。PCRは低いア
ニーリング温度で行い、プライマーがDNA上の複数の遺伝子座にアニーリング
することを可能にさせる。プライマー結合部位が増幅可能な距離内にある場合、
DNAフラグメントが産生される。原則として、バンドのパターンを産生するた
めには1つのプライマーで十分である。
rphic DNA)(RAPD)、DNA増幅フィンガープリンティング(D
AF)、およびarbitrarily primed PCR(AP−PCR
)を含む多くのフィンガープリンティング法が過去数年間で開発された。これら
の方法は全て、任意に選択したPCRプライマーによるランダムなゲノムDNA
フラグメントの増幅に基づいている。先に配列の知識がなくても、あらゆるDN
AについてDNAフラグメントのパターンを産生し得る。産生されるパターンは
、PCRプライマーの配列および鋳型DNAの性質に依存する。PCRは低いア
ニーリング温度で行い、プライマーがDNA上の複数の遺伝子座にアニーリング
することを可能にさせる。プライマー結合部位が増幅可能な距離内にある場合、
DNAフラグメントが産生される。原則として、バンドのパターンを産生するた
めには1つのプライマーで十分である。
【0106】 DNAフィンガープリンティングおよび多型性検出のためのより最近の技術は
、増幅フラグメント長多型(amplified fragment leng
th polymorphism)(AFLP)技術である(例えば、Vosら
、Nucleic Acids Res.23:4407、1995;Schr
einerら、J.Immunol.Methods 196:93、1996
を参照のこと)。手短に言えば、ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、オリゴヌクレオチドアダプターと共に連結し、PCRで制限フラグメントの
セットを選択的な増幅を提供し、そして増幅したフラグメントをポリアクリルア
ミドゲル電気泳動による分画に従って分析する。
、増幅フラグメント長多型(amplified fragment leng
th polymorphism)(AFLP)技術である(例えば、Vosら
、Nucleic Acids Res.23:4407、1995;Schr
einerら、J.Immunol.Methods 196:93、1996
を参照のこと)。手短に言えば、ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、オリゴヌクレオチドアダプターと共に連結し、PCRで制限フラグメントの
セットを選択的な増幅を提供し、そして増幅したフラグメントをポリアクリルア
ミドゲル電気泳動による分画に従って分析する。
【0107】 この方法は本発明のチップを用いた固相に容易に適応される。ここでは、全長
ゲノムDNAをチップ上に共有結合的に固定化する。次いで、結合したゲノムD
NAを制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして結合していない物質をチップか
ら洗浄して除く。次いで、アダプターを結合したゲノムDNAフラグメントに連
結して、そして結合したDNA分子を増幅および分析する。
ゲノムDNAをチップ上に共有結合的に固定化する。次いで、結合したゲノムD
NAを制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして結合していない物質をチップか
ら洗浄して除く。次いで、アダプターを結合したゲノムDNAフラグメントに連
結して、そして結合したDNA分子を増幅および分析する。
【0108】 AFLP技術もまた、mRNAフィンガープリンティングに適用されている(
Habuら、Biochem.Biophys.Res.Commun.234
:516、1997)。このアプローチにおいて、固定したオリゴ(dT)プラ
イマーを用いて二本鎖cDNAを合成し、そして4塩基配列を認識するTaqI
を用いて消化する。次いで、AFLPに基づくゲノムフィンガープリンティング
の一般的な方法に従って、TaqIアダプターをcDNAフラグメントの末端に
連結し、そしてPCR増幅を選択されたプライマーを用いて行う。有利なことに
、AFLP技術によるmRNAフィンガープリンティングは、本明細書中に記載
した、オリゴ(dT)プライマーを固定した固体支持体を用いて行われる。
Habuら、Biochem.Biophys.Res.Commun.234
:516、1997)。このアプローチにおいて、固定したオリゴ(dT)プラ
イマーを用いて二本鎖cDNAを合成し、そして4塩基配列を認識するTaqI
を用いて消化する。次いで、AFLPに基づくゲノムフィンガープリンティング
の一般的な方法に従って、TaqIアダプターをcDNAフラグメントの末端に
連結し、そしてPCR増幅を選択されたプライマーを用いて行う。有利なことに
、AFLP技術によるmRNAフィンガープリンティングは、本明細書中に記載
した、オリゴ(dT)プライマーを固定した固体支持体を用いて行われる。
【0109】 変異もまた、短いオリゴヌクレオチドプローブの標的配列に対するハイブリダ
イゼーションにおけるそれらの不安定化効果によって同定し得る(例えば、We
tmur、Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26:22
7、1991を参照のこと)。一般的に、この対立遺伝子特異的オリゴヌクレオ
チドハイブリダイゼーション技術は、標的配列の増幅、および引き続く短いオリ
ゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを含む。固定化されたオリ
ゴヌクレオチドプローブのアレイに対するそのハイブリダイゼーションパターン
を決定することによって、増幅産物を多くの可能性のある配列変異体に関して調
べ得る。このアプローチの例証を実施例6および7で提供する。
イゼーションにおけるそれらの不安定化効果によって同定し得る(例えば、We
tmur、Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26:22
7、1991を参照のこと)。一般的に、この対立遺伝子特異的オリゴヌクレオ
チドハイブリダイゼーション技術は、標的配列の増幅、および引き続く短いオリ
ゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを含む。固定化されたオリ
ゴヌクレオチドプローブのアレイに対するそのハイブリダイゼーションパターン
を決定することによって、増幅産物を多くの可能性のある配列変異体に関して調
べ得る。このアプローチの例証を実施例6および7で提供する。
【0110】 ((B)一般的な診断方法) 感染性の病原体または腫瘍関連抗原を発現している腫瘍細胞のような病的細胞
の存在を検出するのに、DNAプローブを使用し得る。代表的には、生物学的テ
スト試料を、核酸標的を放出するために、イオン性界面活性剤またはカオトロー
プを用いた溶解工程に供する。代表的な核酸標的はmRNA、ゲノムDNA、プ
ラスミドDNAもしくはRNA、およびrRNA、ウイルスDNAもしくはRN
Aを含む。標的核酸を検出するために、標的はある種の固定化を必要とする。例
えば、核酸を固体支持体または核酸にいくらかの親和性を有する基材に固定化す
る。次いで、目的の標的核酸を同定するために、固体支持体をあらかじめ決定さ
れた配列のタグ化標識オリゴヌクレオチドを用いて探索する。ハイブリダイズし
なかったプローブを洗浄工程によって除去し、そのタグをそれらのそれぞれのプ
ローブから切断し、次いで測定する(概説としては、ReischlおよびKo
chanowski、Molec.Biotech.3:55、1995を参照
のこと)。
の存在を検出するのに、DNAプローブを使用し得る。代表的には、生物学的テ
スト試料を、核酸標的を放出するために、イオン性界面活性剤またはカオトロー
プを用いた溶解工程に供する。代表的な核酸標的はmRNA、ゲノムDNA、プ
ラスミドDNAもしくはRNA、およびrRNA、ウイルスDNAもしくはRN
Aを含む。標的核酸を検出するために、標的はある種の固定化を必要とする。例
えば、核酸を固体支持体または核酸にいくらかの親和性を有する基材に固定化す
る。次いで、目的の標的核酸を同定するために、固体支持体をあらかじめ決定さ
れた配列のタグ化標識オリゴヌクレオチドを用いて探索する。ハイブリダイズし
なかったプローブを洗浄工程によって除去し、そのタグをそれらのそれぞれのプ
ローブから切断し、次いで測定する(概説としては、ReischlおよびKo
chanowski、Molec.Biotech.3:55、1995を参照
のこと)。
【0111】 1つの一般的な型のアッセイ方法では、増幅配列の特徴的な部分を代表するオ
リゴヌクレオチドを固体支持体に結合させる。その結合は共有結合的であるか、
またはビオチン:ストレプトアビジンを介するか、もしくは同様の型の結合であ
り得る。標的核酸を検出可能な標識PCR産物を作製する鋳型として使用する。
これらのPCR産物を捕獲オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、そしてP
CR産物の存在を、標識により媒介される検出反応によって決定する。
リゴヌクレオチドを固体支持体に結合させる。その結合は共有結合的であるか、
またはビオチン:ストレプトアビジンを介するか、もしくは同様の型の結合であ
り得る。標的核酸を検出可能な標識PCR産物を作製する鋳型として使用する。
これらのPCR産物を捕獲オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、そしてP
CR産物の存在を、標識により媒介される検出反応によって決定する。
【0112】 このアプローチのバリエーションでは、ビオチン標識したPCR産物をストレ
プトアビジンコートした固体支持体に結合させる。固定化PCR産物を、増幅産
物の内部の配列に相補的な標識プローブとハイブリダイズさせる。
プトアビジンコートした固体支持体に結合させる。固定化PCR産物を、増幅産
物の内部の配列に相補的な標識プローブとハイブリダイズさせる。
【0113】 診断方法のさらなる実例として、Wilber、Immunol.Inves
t.26:9(1997)は、分岐DNAシグナル増幅方法に基づく固相核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイを記載する。この研究において、標的に対する複
数のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、HIV RNAが
血漿中に検出された。それらのうち10個は表面に標的を捕獲し、そしてそれら
のうち39個は、分岐DNA分子のRNAのpol領域へのハイブリダイゼーシ
ョンを媒介した。検出可能な標識プローブは、分岐DNAのそれぞれの枝(ar
m)に結合した。
t.26:9(1997)は、分岐DNAシグナル増幅方法に基づく固相核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイを記載する。この研究において、標的に対する複
数のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、HIV RNAが
血漿中に検出された。それらのうち10個は表面に標的を捕獲し、そしてそれら
のうち39個は、分岐DNA分子のRNAのpol領域へのハイブリダイゼーシ
ョンを媒介した。検出可能な標識プローブは、分岐DNAのそれぞれの枝(ar
m)に結合した。
【0114】 さらなる検出方法が当業者に周知である。例えば、固相検出は、アルカリホス
ファターゼ系、ストレプトアビジン系、または西洋ワサビペルオキシダーゼ系の
ような増幅比色定量手段を使用して達成され得る。放射分析による検出が別の選
択肢である。放射分析による検出のために適切な放射性標識は、3H、125I、13 1 I、35S、14C、32Pなどを含む。蛍光標識した分子がさらに別の検出手段を 提供する。
ファターゼ系、ストレプトアビジン系、または西洋ワサビペルオキシダーゼ系の
ような増幅比色定量手段を使用して達成され得る。放射分析による検出が別の選
択肢である。放射分析による検出のために適切な放射性標識は、3H、125I、13 1 I、35S、14C、32Pなどを含む。蛍光標識した分子がさらに別の検出手段を 提供する。
【0115】 このように一般的に記載した本発明は、以下の実施例を参照することによって
より容易に理解される。実施例は例示の目的で提供され、本発明の制限を意図す
るものではない。
より容易に理解される。実施例は例示の目的で提供され、本発明の制限を意図す
るものではない。
【0116】 (実施例) (実施例1:) (固体支持体上でのcDNA合成) (A)RNAの捕獲 これらの研究では、標準的な技術を用いて、酸−グアニジニウム−フェノール
抽出によって全RNAを調製した(例えば、Ausubelら(編)、Shor
t Protocols in Molecular Biology、第3版
、4−4から4−6頁(John WileyおよびSons,Inc. 19
95)を参照のこと)。まず単離した全RNAの混合物を70℃まで加熱し、高
い塩濃度の(high salt)ハイブリダイゼーション溶液をRNAに加え
、RNAをオリゴ(dT)を持つ固体支持体のチップに加え、次に支持体を回転
攪拌機(rotary mixer)のような動く台に置くことによって、ポリ
アデニル化したmRNAをチップ上に捕獲した。連続攪拌器(continua
l vortexer)、軌道振とう器(orbital shaker)、回
転振とう器(rotary rocker)、および回転装置(rotator
)を備えたハイブリダイゼーションオーブンを含む様々な器械によって、十分に
攪拌した。
抽出によって全RNAを調製した(例えば、Ausubelら(編)、Shor
t Protocols in Molecular Biology、第3版
、4−4から4−6頁(John WileyおよびSons,Inc. 19
95)を参照のこと)。まず単離した全RNAの混合物を70℃まで加熱し、高
い塩濃度の(high salt)ハイブリダイゼーション溶液をRNAに加え
、RNAをオリゴ(dT)を持つ固体支持体のチップに加え、次に支持体を回転
攪拌機(rotary mixer)のような動く台に置くことによって、ポリ
アデニル化したmRNAをチップ上に捕獲した。連続攪拌器(continua
l vortexer)、軌道振とう器(orbital shaker)、回
転振とう器(rotary rocker)、および回転装置(rotator
)を備えたハイブリダイゼーションオーブンを含む様々な器械によって、十分に
攪拌した。
【0117】 RNA捕獲に必要な時間は、投入したRNAの量によることが判明した。環境
温度で、10μgの全RNAは、約2時間でチップを90%飽和するのに十分で
あった。一般的な休止細胞では、全RNAのこの量はチップあたりに結合した約
100ngのポリ(A)+mRNAに対応する。同じ供給源由来の40μgの全 RNAは、30分で同じ程度の飽和に達した。
温度で、10μgの全RNAは、約2時間でチップを90%飽和するのに十分で
あった。一般的な休止細胞では、全RNAのこの量はチップあたりに結合した約
100ngのポリ(A)+mRNAに対応する。同じ供給源由来の40μgの全 RNAは、30分で同じ程度の飽和に達した。
【0118】 別の一連の実験では、刺激したヒトT細胞株をRNA供給源として使用し、そ
して10μgのRNAを投入して、同じ捕獲条件下で、1時間で飽和に達した。
マウス、ハムスター、およびヒト細胞株を含むさらにいくつかのRNA供給源を
捕獲し、そして全ては、1−2時間で10μgの全RNAあたり90%の範囲の
捕獲に達する傾向があり、これは最長および最短のインキュベーション時間を決
定する。
して10μgのRNAを投入して、同じ捕獲条件下で、1時間で飽和に達した。
マウス、ハムスター、およびヒト細胞株を含むさらにいくつかのRNA供給源を
捕獲し、そして全ては、1−2時間で10μgの全RNAあたり90%の範囲の
捕獲に達する傾向があり、これは最長および最短のインキュベーション時間を決
定する。
【0119】 (B)cDNAの最初の鎖の合成 ポリ(A)+mRNAの捕獲の後、チップをハイブリダイゼーション緩衝液中 で3回洗浄し、結合していないRNAを除去した。MMLV−逆転写酵素(MM
LV−RT)および最適化緩衝液システムを含む30μlの容量で、42℃で1
−2時間、ハイブリダイゼーションオーブン回転台上で逆転写を行った。捕獲工
程を伴うので、最初の鎖を十分に合成するには、反応物の連続的な攪拌を必要と
する。
LV−RT)および最適化緩衝液システムを含む30μlの容量で、42℃で1
−2時間、ハイブリダイゼーションオーブン回転台上で逆転写を行った。捕獲工
程を伴うので、最初の鎖を十分に合成するには、反応物の連続的な攪拌を必要と
する。
【0120】 最初の実験は固体支持体あたり50−100ngのcDNAを産生した。チッ
プから切断しアガロースゲル電気泳動でサイズ分けした標識2本鎖cDNAのオ
ートラジオグラフィーによって、逆転写の産物を間接的に分析した。いくつかの
実験では、複製したmRNA種の大きさの範囲は、従来の方法と同程度であり、
多くの場合、より長かった。cDNAの大きさの分布は、0.5キロベース〜2
0キロベースの範囲にわたり、平均は約2.0キロベースであった。
プから切断しアガロースゲル電気泳動でサイズ分けした標識2本鎖cDNAのオ
ートラジオグラフィーによって、逆転写の産物を間接的に分析した。いくつかの
実験では、複製したmRNA種の大きさの範囲は、従来の方法と同程度であり、
多くの場合、より長かった。cDNAの大きさの分布は、0.5キロベース〜2
0キロベースの範囲にわたり、平均は約2.0キロベースであった。
【0121】 (C)cDNAの2番目の鎖の合成 逆転写の後、チップを3回洗浄し、反応物および酵素を除去した。40μlの
用量で、25ユニットのE.coli DNAポリメラーゼIあたり1ユニット
のRNアーゼHを用いて、2番目の鎖の合成を行った。反応は室温で回転振とう
器上、6時間または一晩インキュベーションした。
用量で、25ユニットのE.coli DNAポリメラーゼIあたり1ユニット
のRNアーゼHを用いて、2番目の鎖の合成を行った。反応は室温で回転振とう
器上、6時間または一晩インキュベーションした。
【0122】 2番目の鎖の反応物を除去し、T4DNAポリメラーゼおよびdNTPを加え
ることによって、平坦でない伸長末端を次のライゲーション工程のために「仕上
げ(polished)」した。このインキュベーションをハイブリダイゼーシ
ョンオーブンの回転装置上で、37℃で30分間続けた。32P標識dNTPの存
在下で反応を行い、2番目の鎖の産物を沸騰させるかまたは制限酵素AscIで
支持体から切断することのいずれかによって、産物を直接視覚化した。放射性標
識した産物をゲルに流し、そして視覚化のためにフィルムに置いた。代表的に1
0μgの全RNAを投入すると、特定のRNAによって、50−120ngの2
本鎖cDNAを回収することが可能である。
ることによって、平坦でない伸長末端を次のライゲーション工程のために「仕上
げ(polished)」した。このインキュベーションをハイブリダイゼーシ
ョンオーブンの回転装置上で、37℃で30分間続けた。32P標識dNTPの存
在下で反応を行い、2番目の鎖の産物を沸騰させるかまたは制限酵素AscIで
支持体から切断することのいずれかによって、産物を直接視覚化した。放射性標
識した産物をゲルに流し、そして視覚化のためにフィルムに置いた。代表的に1
0μgの全RNAを投入すると、特定のRNAによって、50−120ngの2
本鎖cDNAを回収することが可能である。
【0123】 MMLV−RTのようなRNアーゼH活性を有する酵素を用いた逆転写の後に
、耐熱性のDNAポリメラーゼを使用することも可能である。この場合、耐熱性
のポリメラーゼはRNA鋳型を消化し、熱変性工程によってRNAを除去する必
要性を除く。
、耐熱性のDNAポリメラーゼを使用することも可能である。この場合、耐熱性
のポリメラーゼはRNA鋳型を消化し、熱変性工程によってRNAを除去する必
要性を除く。
【0124】 RNアーゼH/DNA polI対TthI DNAポリメラーゼを2番目の
鎖の合成において比較する実験は、GAPDHおよびIL−2のような選択され
た遺伝子のPCR増幅によって試験されるAscI切断産物の量またはその産物
の含有量のいずれかにおける、わずかな違いしか示さなかった。TthIの使用
は室温での6時間から、70℃での1時間までインキュベーション時間を短縮す
る。TthIポリメラーゼはまた、マンガンイオン存在下で逆転写酵素活性を示
すが、2価陽イオン存在下の高温では、RNAが加水分解する可能性があるので
、インキュベーションは非常に短くする必要がある。高温でDNAポリメラーゼ
反応を行う別の利点は、2次構造が減少し、高度に構造化されたメッセージの合
成を助けることである。
鎖の合成において比較する実験は、GAPDHおよびIL−2のような選択され
た遺伝子のPCR増幅によって試験されるAscI切断産物の量またはその産物
の含有量のいずれかにおける、わずかな違いしか示さなかった。TthIの使用
は室温での6時間から、70℃での1時間までインキュベーション時間を短縮す
る。TthIポリメラーゼはまた、マンガンイオン存在下で逆転写酵素活性を示
すが、2価陽イオン存在下の高温では、RNAが加水分解する可能性があるので
、インキュベーションは非常に短くする必要がある。高温でDNAポリメラーゼ
反応を行う別の利点は、2次構造が減少し、高度に構造化されたメッセージの合
成を助けることである。
【0125】 (D)アダプターのライゲーション−ベクターへのライゲーション アダプター:cDNA末端のモル比が5〜10:1の30μlの容量で、半(
hemi)リン酸化されたアダプターを2本鎖cDNAにライゲーションした。
好ましいライゲーション緩衝液は10%のPEGを含む。アダプター−cDNA
混合物をT4DNAリガーゼと共に回転振とう機上、室温で一晩インキュベーシ
ョンした。次いで、固体支持体を3回洗浄して過剰のリンカーを除去した。ライ
ゲーションの後、ハイブリダイゼーションオーブン回転台上で、37℃で1時間
、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびATPでアダプターの5’水酸基をリン
酸化した。この反応を、チップをTE緩衝液で3回洗浄することによって停止し
た。cDNAを別の適用に使用するならば、リン酸化工程は必要でない可能性が
ある。
hemi)リン酸化されたアダプターを2本鎖cDNAにライゲーションした。
好ましいライゲーション緩衝液は10%のPEGを含む。アダプター−cDNA
混合物をT4DNAリガーゼと共に回転振とう機上、室温で一晩インキュベーシ
ョンした。次いで、固体支持体を3回洗浄して過剰のリンカーを除去した。ライ
ゲーションの後、ハイブリダイゼーションオーブン回転台上で、37℃で1時間
、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびATPでアダプターの5’水酸基をリン
酸化した。この反応を、チップをTE緩衝液で3回洗浄することによって停止し
た。cDNAを別の適用に使用するならば、リン酸化工程は必要でない可能性が
ある。
【0126】 いくつかの適用では、2番目の鎖の合成を逆転写の直後に加えたアダプターか
ら特異的に始めた。この手法によれば、mRNAの加水分解の後、部分的に1本
鎖のヘテロ2本鎖のアダプターを、T4RNAリガーゼを用いてライゲーション
する。このアダプターの、部分的に2本鎖である性質は、2番目の鎖の合成を開
始し得る3’水酸基を提供し、T4RNAリガーゼは2本鎖核酸をライゲーショ
ンできないので、ライゲーションの間アダプターの鎖状体化(concatem
erization)を阻害する。
ら特異的に始めた。この手法によれば、mRNAの加水分解の後、部分的に1本
鎖のヘテロ2本鎖のアダプターを、T4RNAリガーゼを用いてライゲーション
する。このアダプターの、部分的に2本鎖である性質は、2番目の鎖の合成を開
始し得る3’水酸基を提供し、T4RNAリガーゼは2本鎖核酸をライゲーショ
ンできないので、ライゲーションの間アダプターの鎖状体化(concatem
erization)を阻害する。
【0127】 (E)支持体からの切断/再環状化(Recircularization) ある研究では、ベクターをチップ上で合成したcDNAにライゲーションした
。cDNAまたはベクター:cDNAを40μlの容量で、ハイブリダイゼーシ
ョンオーブン回転台上でAscIを用いて37℃で4時間、固体支持体から切断
した。次いで、切断したDNAを混合しながらまたは混合せずに70℃で20分
加熱した。ライゲーション緩衝液およびT4DNAリガーゼを加えて容量を50
μlにすることによって、ベクター:cDNAを直接再環状化(recircu
larize)した。ライゲーションしたものを試験するために、前もってベク
ターにライゲーションしなかったcDNAをいくつかのアリコートに分けて、ど
のベクター:挿入物比が次の形質転換において最もよい結果を出すか決定した。
この場合、cDNAの全体量が少ない(40μlの容量中、全体で50〜120
ng)ために、ライゲーションしたもの全部が形質転換されなければならず、あ
る種の脱塩工程が必要となる。
。cDNAまたはベクター:cDNAを40μlの容量で、ハイブリダイゼーシ
ョンオーブン回転台上でAscIを用いて37℃で4時間、固体支持体から切断
した。次いで、切断したDNAを混合しながらまたは混合せずに70℃で20分
加熱した。ライゲーション緩衝液およびT4DNAリガーゼを加えて容量を50
μlにすることによって、ベクター:cDNAを直接再環状化(recircu
larize)した。ライゲーションしたものを試験するために、前もってベク
ターにライゲーションしなかったcDNAをいくつかのアリコートに分けて、ど
のベクター:挿入物比が次の形質転換において最もよい結果を出すか決定した。
この場合、cDNAの全体量が少ない(40μlの容量中、全体で50〜120
ng)ために、ライゲーションしたもの全部が形質転換されなければならず、あ
る種の脱塩工程が必要となる。
【0128】 4時間でチップから90%より多いcDNAを切断することが可能である。こ
れらの条件下でインキュベーション時間を延長する利点はないようである。酵素
の濃度を増加させることは、切断に必要な時間を短縮し得るが、インキュベーシ
ョン時間と切断する容量との間でバランスを取らなけらばならない。
れらの条件下でインキュベーション時間を延長する利点はないようである。酵素
の濃度を増加させることは、切断に必要な時間を短縮し得るが、インキュベーシ
ョン時間と切断する容量との間でバランスを取らなけらばならない。
【0129】 (F)形質転換 ライゲーションからのDNAアリコートを用いた、エレクトロコンピテント(
electrocompetent)なE.coliのエレクトロポレーション
による形質転換によって、cDNAクローンを増殖させた。形質転換の頻度はD
NAの1μgあたり、109〜1010cfuの間にわたり得る。当業者が知るよ うに、この手順の主な制限は、エレクトロポレーションの塩感受性である。塩許
容量の閾値を越えて、そしてかけた電流が電極の間にアークをなして(arc)
、細胞を蒸発させ使用したライゲーションの一部を無駄にする前に、エレクトロ
コンピテントな細胞の1アリコートあたり、標準的なライゲーションの1〜2μ
l(全容量の5〜10%)のみがエレクトロポレーションされ得る。多くの細胞
のアリコートをハプニングから防ぐために別々にエレクトロポレーションし得る
が、これは困難であり、そして無駄である。よりよい計画は、現在のcDNA方
法に加え得る脱塩工程を使用することである。その方法は、収量を犠牲にするこ
となく、一連の(in−line)、またはスケ−ルダウンした版の技術に適応
するのに十分変更可能である。
electrocompetent)なE.coliのエレクトロポレーション
による形質転換によって、cDNAクローンを増殖させた。形質転換の頻度はD
NAの1μgあたり、109〜1010cfuの間にわたり得る。当業者が知るよ うに、この手順の主な制限は、エレクトロポレーションの塩感受性である。塩許
容量の閾値を越えて、そしてかけた電流が電極の間にアークをなして(arc)
、細胞を蒸発させ使用したライゲーションの一部を無駄にする前に、エレクトロ
コンピテントな細胞の1アリコートあたり、標準的なライゲーションの1〜2μ
l(全容量の5〜10%)のみがエレクトロポレーションされ得る。多くの細胞
のアリコートをハプニングから防ぐために別々にエレクトロポレーションし得る
が、これは困難であり、そして無駄である。よりよい計画は、現在のcDNA方
法に加え得る脱塩工程を使用することである。その方法は、収量を犠牲にするこ
となく、一連の(in−line)、またはスケ−ルダウンした版の技術に適応
するのに十分変更可能である。
【0130】 形質転換細胞を、抗生物質を含むLB寒天のような標準的な増殖培地にプレー
トした。抗生物質耐性のための遺伝子を持つ細菌のみが、その抗生物質を含む培
地でコロニーを形成する。本当の組換え体とベクター配列のみを含むコロニーと
を区別することは、多くの場合、多くの普通のプラスミドベクターの複数のクロ
ーニング部位を通じて作用するlacZ遺伝子の発現の結果である青色−白色の
色による選択(ブルーホワイトカラーセレクション)で行われる。lacZ遺伝
子産物の発現は複数のクローニング部位にライゲーションされた挿入によって阻
害され、表現型が白色コロニーとなる。この筋書きでは、組換え体は、視覚的に
非組換え体から同定し得るが、非組換え体から選ぶことまたはある程度のバック
グラウンドの非組換え体が、最終産物中で許容されなければならない。挿入無し
のベクターを含む細菌は、より速く増殖する傾向があること、そして特に大きな
挿入を持つ組換え体の場合、挿入を含むものよりも安定であることから、ライブ
ラリーを増幅した場合、非組換え体のバックグラウンドが比較的低くても、問題
を引き起こし得る。
トした。抗生物質耐性のための遺伝子を持つ細菌のみが、その抗生物質を含む培
地でコロニーを形成する。本当の組換え体とベクター配列のみを含むコロニーと
を区別することは、多くの場合、多くの普通のプラスミドベクターの複数のクロ
ーニング部位を通じて作用するlacZ遺伝子の発現の結果である青色−白色の
色による選択(ブルーホワイトカラーセレクション)で行われる。lacZ遺伝
子産物の発現は複数のクローニング部位にライゲーションされた挿入によって阻
害され、表現型が白色コロニーとなる。この筋書きでは、組換え体は、視覚的に
非組換え体から同定し得るが、非組換え体から選ぶことまたはある程度のバック
グラウンドの非組換え体が、最終産物中で許容されなければならない。挿入無し
のベクターを含む細菌は、より速く増殖する傾向があること、そして特に大きな
挿入を持つ組換え体の場合、挿入を含むものよりも安定であることから、ライブ
ラリーを増幅した場合、非組換え体のバックグラウンドが比較的低くても、問題
を引き起こし得る。
【0131】 (実施例2) (固体支持体上でのcDNA合成のための、投入RNAのスケールダウン) 標準的なcDNAライブラリー作成に関与する多くの操作間の、材料の損失を
最小限にすることによって、投入RNAの量を10−100倍にスケールダウン
することが可能である。例えば、約100ngの2本鎖cDNAを、固体支持体
上で10μgの全RNAから合成し得る。これは市販で入手可能なキットで要求
される最初の材料より50倍少ない。上記で述べたプロトコールを大きく変える
ことなく、これを10倍スケールダウンすることが可能であり得るが、これはお
そらく増幅工程の追加を必要とする。
最小限にすることによって、投入RNAの量を10−100倍にスケールダウン
することが可能である。例えば、約100ngの2本鎖cDNAを、固体支持体
上で10μgの全RNAから合成し得る。これは市販で入手可能なキットで要求
される最初の材料より50倍少ない。上記で述べたプロトコールを大きく変える
ことなく、これを10倍スケールダウンすることが可能であり得るが、これはお
そらく増幅工程の追加を必要とする。
【0132】 別の選択肢はT7プロモーター−アダプターを用いてアダプターをライゲーシ
ョンすることによってcDNAを合成することである。これはPCRによるもの
よりインビトロでの転写による増幅を可能にする。これはPCR増幅に存在する
長さの偏りを排除することによって、より代表的なライブラリーを作成し得る。
次いで、インビトロで合成した転写物を捕獲して、他のあらゆるRNA供給源と
同様に処理し得る。この増幅の成功は、全長の転写を保証するインビトロでの転
写条件の注意深い最適化による。捕獲されなかった転写産物を酵母ポリ(A)ポ
リメラーゼを用いてポリアデニル化し、次にそれらをまた同じ支持体に加えるこ
とによって捕獲する。再アデニル化された転写産物は全長ではないが、それらの
情報の全てがRNAプールから失われるわけではない。
ョンすることによってcDNAを合成することである。これはPCRによるもの
よりインビトロでの転写による増幅を可能にする。これはPCR増幅に存在する
長さの偏りを排除することによって、より代表的なライブラリーを作成し得る。
次いで、インビトロで合成した転写物を捕獲して、他のあらゆるRNA供給源と
同様に処理し得る。この増幅の成功は、全長の転写を保証するインビトロでの転
写条件の注意深い最適化による。捕獲されなかった転写産物を酵母ポリ(A)ポ
リメラーゼを用いてポリアデニル化し、次にそれらをまた同じ支持体に加えるこ
とによって捕獲する。再アデニル化された転写産物は全長ではないが、それらの
情報の全てがRNAプールから失われるわけではない。
【0133】 1つの研究では、T7プロモーター−アダプターを合成して、チップ上で10
μgの全RNA由来の2本鎖cDNAにライゲーションした。インビトロでの転
写のために、製造会社の示す条件を用いると、300塩基対から2,000塩基
対の大きさの範囲の大量の転写産物が産生された。これらの大きさは効果的な増
幅工程のために最適ではないが、この研究はインビトロ転写の産生が固体支持体
上で可能であることを示している。
μgの全RNA由来の2本鎖cDNAにライゲーションした。インビトロでの転
写のために、製造会社の示す条件を用いると、300塩基対から2,000塩基
対の大きさの範囲の大量の転写産物が産生された。これらの大きさは効果的な増
幅工程のために最適ではないが、この研究はインビトロ転写の産生が固体支持体
上で可能であることを示している。
【0134】 スケールダウンのための別の戦略は、産物を増幅および再捕獲するためにイン
ビトロ転写と同じ方法で、非対称(直線)PCRを利用することである。増幅産
物はRNAよりもDNAであるので、2本鎖cDNAを作製するためにDNAポ
リメラーゼを使用し得る。
ビトロ転写と同じ方法で、非対称(直線)PCRを利用することである。増幅産
物はRNAよりもDNAであるので、2本鎖cDNAを作製するためにDNAポ
リメラーゼを使用し得る。
【0135】 (実施例3:) (固体支持体プローブ) 10μgの全RNA由来のポリ(A)+mRNAを捕獲し、逆転写し、cDN Aの2番目の鎖を合成し、そしてT7プロモーター−アダプターをcDNAにラ
イゲーションした。1つの研究では、固体支持体を標準的なCetus PCR
チューブ(ABI、Foster City、CA)に入れ、長いPCRポリメ
ラーゼ(Ex−Taq、TAKARA)を用いて、70℃の伸長工程を5サイク
ルごとに1分増加させる形式で、35サイクル行った。PCRで使用した唯一の
プライマーはアダプターに相補的であり、増幅は結合したcDNAの最も5’末
端から始まって多くの(+)鎖の複製を産生した。サイクル終了後、PCR産物
を熱変性させてアガロースゲルに流し、1本鎖cDNAの長さの範囲を視覚化し た。大きさは約500塩基対から20キロ塩基対以上までにわたり、それは並行
して行ったコントロール実験で標識し、切断し、電気泳動してオートラジオグラ
フィーで視覚化した2本鎖DNAの大きさによく一致していた。
イゲーションした。1つの研究では、固体支持体を標準的なCetus PCR
チューブ(ABI、Foster City、CA)に入れ、長いPCRポリメ
ラーゼ(Ex−Taq、TAKARA)を用いて、70℃の伸長工程を5サイク
ルごとに1分増加させる形式で、35サイクル行った。PCRで使用した唯一の
プライマーはアダプターに相補的であり、増幅は結合したcDNAの最も5’末
端から始まって多くの(+)鎖の複製を産生した。サイクル終了後、PCR産物
を熱変性させてアガロースゲルに流し、1本鎖cDNAの長さの範囲を視覚化し た。大きさは約500塩基対から20キロ塩基対以上までにわたり、それは並行
して行ったコントロール実験で標識し、切断し、電気泳動してオートラジオグラ
フィーで視覚化した2本鎖DNAの大きさによく一致していた。
【0136】 1本鎖PCR産物がもとのmRNA集団を代表しているかどうかを決定するた
めに、高レベルで存在する、低レベルで存在する、または全く存在しないことが
公知であるいくつかの遺伝子に関してPCRプライマーを設計した。全ての産物
がほぼ同じ長さ(400〜600塩基対)になるように、そしてcDNAの5’
末端にまたはその近くに位置するようにプライマーを設計した。このプライマー
の設計は、最初の鎖の合成の質に関してよい近似を提供した。RNA供給源がヒ
トJurkat T細胞株であったので、IL−2、IL−4、GM−CSF、
GAPDH、CTLA4、c−fos、およびウェルナーヘリカーゼの配列をプ
ライマーとして使用した。マウスグアニル酸キナーゼをネガティブコントロール
として使用した。
めに、高レベルで存在する、低レベルで存在する、または全く存在しないことが
公知であるいくつかの遺伝子に関してPCRプライマーを設計した。全ての産物
がほぼ同じ長さ(400〜600塩基対)になるように、そしてcDNAの5’
末端にまたはその近くに位置するようにプライマーを設計した。このプライマー
の設計は、最初の鎖の合成の質に関してよい近似を提供した。RNA供給源がヒ
トJurkat T細胞株であったので、IL−2、IL−4、GM−CSF、
GAPDH、CTLA4、c−fos、およびウェルナーヘリカーゼの配列をプ
ライマーとして使用した。マウスグアニル酸キナーゼをネガティブコントロール
として使用した。
【0137】 全てのポリメラーゼ連鎖反応は、予期した通り、CTLA4およびマウスグア
ニル酸キナーゼを除いて、予期した大きさの産物を産生した。50ngの推定I
L−2を32P標識し、刺激した(PMA+イオノマイシン)Jurkatおよび
刺激していないJurkatの両方由来の固定化したRNAを含むブロットに対
してハイブリダイズさせて、IL−2に対する産物をノーザンブロットで確認し
た。高ストリンジェンシーな洗浄の後、刺激していないRNAは、ほとんどシグ
ナルを示さなかったが、刺激した試料は、IL−2のメッセージの期待される大
きさに一致した強いシグナルを示した。
ニル酸キナーゼを除いて、予期した大きさの産物を産生した。50ngの推定I
L−2を32P標識し、刺激した(PMA+イオノマイシン)Jurkatおよび
刺激していないJurkatの両方由来の固定化したRNAを含むブロットに対
してハイブリダイズさせて、IL−2に対する産物をノーザンブロットで確認し
た。高ストリンジェンシーな洗浄の後、刺激していないRNAは、ほとんどシグ
ナルを示さなかったが、刺激した試料は、IL−2のメッセージの期待される大
きさに一致した強いシグナルを示した。
【0138】 (実施例4:) (cDNA末端の高速増幅のための、固体支持体の使用) cDNA末端の高速増幅、またはRACEはまた、本明細書中で述べた固体支
持体cDNA技術に適応可能な技術である。捕獲オリゴヌクレオチドの後部(3
’−RACE)、または適当な5’アダプターオリゴヌクレオチド(5’−RA
CE)をアンカーとして使用して、2本鎖cDNAのアダプターライゲーション
の後に5’−または3’−RACEを行い得る。cDNAを産生するのに少量の
材料しか使用せず、そして産物は再利用できるので、固体支持体RACEは、現
在利用可能な技術に対して利点がある。この適用はPCRを直接上記で述べた固
体支持体上で行う能力による。最初の実験は、これが多くの複製があるハウスキ
ーピング遺伝子、GAPDHに関して行うことができ、そして最終産物が捕獲し
たRNAおよび次に合成したcDNAの質に直接比例することを示した。3’−
RACEおよび5’−RACEを行う標準的な方法は当業者に周知である(例え
ば、Wuら、Methods in Gene Biotechnology、
15−28頁(CRC Press 1997)を参照のこと)。
持体cDNA技術に適応可能な技術である。捕獲オリゴヌクレオチドの後部(3
’−RACE)、または適当な5’アダプターオリゴヌクレオチド(5’−RA
CE)をアンカーとして使用して、2本鎖cDNAのアダプターライゲーション
の後に5’−または3’−RACEを行い得る。cDNAを産生するのに少量の
材料しか使用せず、そして産物は再利用できるので、固体支持体RACEは、現
在利用可能な技術に対して利点がある。この適用はPCRを直接上記で述べた固
体支持体上で行う能力による。最初の実験は、これが多くの複製があるハウスキ
ーピング遺伝子、GAPDHに関して行うことができ、そして最終産物が捕獲し
たRNAおよび次に合成したcDNAの質に直接比例することを示した。3’−
RACEおよび5’−RACEを行う標準的な方法は当業者に周知である(例え
ば、Wuら、Methods in Gene Biotechnology、
15−28頁(CRC Press 1997)を参照のこと)。
【0139】 (実施例5:) (遺伝子発現分析のための固体支持体cDNA合成) (A)細胞の刺激およびRNAの調製 一連の実験において、Jurkat株JRT3.5を、血清なしのRPMI培
地(Life Technologies、Gaithersburg、MD)
中で、1×106細胞/mlの細胞濃度で、10ng/mlのホルボール−12 −ミリステート−13アセテート(Calbiochem、San Diego
、CA)および100ng/mlのイオノマイシン(Calbiochem)存
在下で6時間刺激した。細胞をペレット化し、1×PBS(Life Tech
nologies)で洗浄し、再びペレット化して、そして4Mのグアニジンイ
ソチオシアネート/1%のN−ラウリルサルコシン/25mMのクエン酸ナトリ
ウムを含む緩衝液(pH7.1)(Fisher Scientific、Pi
ttsburg、PA)を用いて106細胞あたり0.5mlで溶解した。10 分の1の容量の2M酢酸ナトリウム(pH4.2)(Fisher Scien
tific)を加え、次に1容量の、水で飽和したフェノール(Amresco
、Solon、OH)を加えた。混合した後、4分の1の容量のクロロホルム:
イソアミルアルコール(29:1)(Fisher Scientific)を
加え、溶液を激しく混合して、次に氷上で10分間インキュベーションした。次
いで、溶解物を遠心分離し、水層を除去し、そして同量のクロロホルム:イソア
ミルアルコールで抽出した。次いで、水層にプールして、そしてRNAを2容量
のエタノール(Quantum Chemical Corp、Tuscola
、IL)で沈殿させた。遠心分離した後、エタノールを捨ててそしてRNAを短
時間、空気乾燥し、次にRNアーゼを含まない水に再懸濁して1から5mg/m
lの間の濃度にした。
地(Life Technologies、Gaithersburg、MD)
中で、1×106細胞/mlの細胞濃度で、10ng/mlのホルボール−12 −ミリステート−13アセテート(Calbiochem、San Diego
、CA)および100ng/mlのイオノマイシン(Calbiochem)存
在下で6時間刺激した。細胞をペレット化し、1×PBS(Life Tech
nologies)で洗浄し、再びペレット化して、そして4Mのグアニジンイ
ソチオシアネート/1%のN−ラウリルサルコシン/25mMのクエン酸ナトリ
ウムを含む緩衝液(pH7.1)(Fisher Scientific、Pi
ttsburg、PA)を用いて106細胞あたり0.5mlで溶解した。10 分の1の容量の2M酢酸ナトリウム(pH4.2)(Fisher Scien
tific)を加え、次に1容量の、水で飽和したフェノール(Amresco
、Solon、OH)を加えた。混合した後、4分の1の容量のクロロホルム:
イソアミルアルコール(29:1)(Fisher Scientific)を
加え、溶液を激しく混合して、次に氷上で10分間インキュベーションした。次
いで、溶解物を遠心分離し、水層を除去し、そして同量のクロロホルム:イソア
ミルアルコールで抽出した。次いで、水層にプールして、そしてRNAを2容量
のエタノール(Quantum Chemical Corp、Tuscola
、IL)で沈殿させた。遠心分離した後、エタノールを捨ててそしてRNAを短
時間、空気乾燥し、次にRNアーゼを含まない水に再懸濁して1から5mg/m
lの間の濃度にした。
【0140】 (B)捕獲および最初の鎖の合成 共有結合で結合したオリゴヌクレオチド、5’−ACTACTGATCAGG
CGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT−3’[配列番号1番
](Genset、La Jolla、CA)を有する1つの固体支持体を、1
0μgの全細胞RNAに加え、そしてRNアーゼを含まない十分な水に希釈して
、滅菌した1.5mlマイクロチューブ(Fisher Scientific
)中でチップを覆った。このオリゴヌクレオチドは、オリゴ(dT)配列の5’
側にスペーサーおよびAscI切断部位を含む。RNAおよびチップを65℃で
5分間インキュベーションした。50mMのTris(pH7.5)、1MのN
aCl(Fisher Scientific)、および20μg/mlのアセ
チル化BSA(New England Biolabs、Beverly、M
A)からなる等量の2×mRNAハイブリダイゼーション緩衝液をそれぞれのチ
ューブに加え、そしてチューブを室温で2時間、静かに振とうした。上清を除去
し、次いでチップを1×mRNAハイブリダイゼーション緩衝液中で3回洗浄し
た。最後の洗浄が終わった後、1×MMLV−逆転写酵素緩衝液、1mMのdN
TP混合物、2mMのDTT(Life Technologies)、20ユ
ニットのRNasin(Promega、Madison、WI)および10μ
g/mlのアセチル化BSA(New England Biolabs)から
なる逆転写混合物をそれぞれのチューブに加え、次に600ユニットのMMLV
−逆転写酵素(Life Technologies)を加えた。この反応物を
42℃で2時間、静かに振とうした。次いで1ユニットのRNアーゼH(Boe
hringer−Mannheim、Indianapolis、IN)を加え
、反応をさらに半時間続けた。上清を再び除去し、それぞれのチップを1mMの
EDTA(pH8)(Fisher Scientific)を加えた10mM
のTris(pH8)中で3回洗浄した。チップを0.01%のSDS(Fis
her Scientific)を加えたTE緩衝液中で沸騰させることにより
、残っているRNAテンプレートを除去した。
CGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT−3’[配列番号1番
](Genset、La Jolla、CA)を有する1つの固体支持体を、1
0μgの全細胞RNAに加え、そしてRNアーゼを含まない十分な水に希釈して
、滅菌した1.5mlマイクロチューブ(Fisher Scientific
)中でチップを覆った。このオリゴヌクレオチドは、オリゴ(dT)配列の5’
側にスペーサーおよびAscI切断部位を含む。RNAおよびチップを65℃で
5分間インキュベーションした。50mMのTris(pH7.5)、1MのN
aCl(Fisher Scientific)、および20μg/mlのアセ
チル化BSA(New England Biolabs、Beverly、M
A)からなる等量の2×mRNAハイブリダイゼーション緩衝液をそれぞれのチ
ューブに加え、そしてチューブを室温で2時間、静かに振とうした。上清を除去
し、次いでチップを1×mRNAハイブリダイゼーション緩衝液中で3回洗浄し
た。最後の洗浄が終わった後、1×MMLV−逆転写酵素緩衝液、1mMのdN
TP混合物、2mMのDTT(Life Technologies)、20ユ
ニットのRNasin(Promega、Madison、WI)および10μ
g/mlのアセチル化BSA(New England Biolabs)から
なる逆転写混合物をそれぞれのチューブに加え、次に600ユニットのMMLV
−逆転写酵素(Life Technologies)を加えた。この反応物を
42℃で2時間、静かに振とうした。次いで1ユニットのRNアーゼH(Boe
hringer−Mannheim、Indianapolis、IN)を加え
、反応をさらに半時間続けた。上清を再び除去し、それぞれのチップを1mMの
EDTA(pH8)(Fisher Scientific)を加えた10mM
のTris(pH8)中で3回洗浄した。チップを0.01%のSDS(Fis
her Scientific)を加えたTE緩衝液中で沸騰させることにより
、残っているRNAテンプレートを除去した。
【0141】 (実施例6:) (固体支持体を用いた高処理能溶解手順) 捕獲オリゴヌクレオチド(36マー)をC6−アミン尾部を介してポリエチレ
ンイミンで覆われたナイロンピン部品に共有結合させた。C6アミン尾部を介し
てテキサスレッドで標識した、より短いオリゴヌクレオチド(18マー)を、1
.5Mのグアニジニウムチオシアネート溶液中で、環境温度で15分間、捕獲オ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。次いでピン部品をTEN緩衝液(0
.01MのTris(pH7.5)、1mMのEDTA、100mMのNaCl
)で2回、次にTENS緩衝液(0.01MのTris(pH7.5)、1mM
のEDTA、100mMのNaCl、0.1%のSDS)で1回、次にTEN緩
衝液で2回洗浄してハイブリダイズしていないシグナルオリゴヌクレオチドを除
去した。試験溶液をポリカーボネートのサーモウェル(thermowell)
プレート(Corning Costar Corp. Cambridge、
MA)のウェルにアリコートに分けて、そしてこのプレートをMJ サーマルサ
イクラ−(thermal cycler)(MJ Research Com
pany、Watertown、MA)上に置いた。ピンを連続的にプレートの
ウェルの間で移動させた。5分ごとに温度を5℃づつ上げて、10℃から始めて
最終的には85℃に達した。この液体を黒い96穴マイクロタイタープレートに
移して、蛍光を測定した。
ンイミンで覆われたナイロンピン部品に共有結合させた。C6アミン尾部を介し
てテキサスレッドで標識した、より短いオリゴヌクレオチド(18マー)を、1
.5Mのグアニジニウムチオシアネート溶液中で、環境温度で15分間、捕獲オ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。次いでピン部品をTEN緩衝液(0
.01MのTris(pH7.5)、1mMのEDTA、100mMのNaCl
)で2回、次にTENS緩衝液(0.01MのTris(pH7.5)、1mM
のEDTA、100mMのNaCl、0.1%のSDS)で1回、次にTEN緩
衝液で2回洗浄してハイブリダイズしていないシグナルオリゴヌクレオチドを除
去した。試験溶液をポリカーボネートのサーモウェル(thermowell)
プレート(Corning Costar Corp. Cambridge、
MA)のウェルにアリコートに分けて、そしてこのプレートをMJ サーマルサ
イクラ−(thermal cycler)(MJ Research Com
pany、Watertown、MA)上に置いた。ピンを連続的にプレートの
ウェルの間で移動させた。5分ごとに温度を5℃づつ上げて、10℃から始めて
最終的には85℃に達した。この液体を黒い96穴マイクロタイタープレートに
移して、蛍光を測定した。
【0142】 それぞれのウェルの蛍光レベルは、捕獲オリゴヌクレオチドから溶解したシグ
ナルオリゴヌクレオチドの量と相関する。「溶解」または2本鎖の分離は、10
℃から95℃の温度範囲で起こった。蛍光を市販の蛍光プレートリーダーで測定
した。Tdを計算するために、それぞれの温度で溶出した蓄積カウントを温度に 対してプロットした。材料の50%がチップから分離する温度をTdとした。へ リックス(helical)コイル転移は、与えられたオリゴヌクレオチド2本
鎖(または2本鎖のあらゆる場所にミスマッチを含むまたは含まない、核酸2本
鎖)に対するアルファの値が0.2である温度から、与えられた同じオリゴヌク
レオチド2本鎖(または核酸2本鎖)に対するアルファの値が0.8である温度
までとして規定される。データをスプレッドシートに出力してそれぞれの溶液に
ついて溶解曲線を作成する。これらの溶解曲線から、Td、ΔHCT、およびΔ Tdを計算する。
ナルオリゴヌクレオチドの量と相関する。「溶解」または2本鎖の分離は、10
℃から95℃の温度範囲で起こった。蛍光を市販の蛍光プレートリーダーで測定
した。Tdを計算するために、それぞれの温度で溶出した蓄積カウントを温度に 対してプロットした。材料の50%がチップから分離する温度をTdとした。へ リックス(helical)コイル転移は、与えられたオリゴヌクレオチド2本
鎖(または2本鎖のあらゆる場所にミスマッチを含むまたは含まない、核酸2本
鎖)に対するアルファの値が0.2である温度から、与えられた同じオリゴヌク
レオチド2本鎖(または核酸2本鎖)に対するアルファの値が0.8である温度
までとして規定される。データをスプレッドシートに出力してそれぞれの溶液に
ついて溶解曲線を作成する。これらの溶解曲線から、Td、ΔHCT、およびΔ Tdを計算する。
【0143】 1×12ピン部品を用いた1つの研究では、それぞれの試験溶液を2つのサー
モウェルプレート(Corning Costar Cambridge、MA
)の、16の別々のウェルに入れた。このウェルは、100μlのアリコートを
含み、それぞれの温度で1つのチューブであった。それぞれ温度が上がる前にピ
ン部品をプレートの新しい列に移動させた。50℃の点に達する直前に、最初の
プレートをサーマルサイクラーから除去し、2つめのサーモウェルプレートと置
換した。thermal cyclingプログラムが終了したとき、液体を2
つの黒いmicrofluorプレート(Dynatech)のウェルに移した
。励起波長584nm、発光波長612nmを用いて、蛍光を測定した。分析の
ためにデータをスプレッドシートプログラムに出力した。
モウェルプレート(Corning Costar Cambridge、MA
)の、16の別々のウェルに入れた。このウェルは、100μlのアリコートを
含み、それぞれの温度で1つのチューブであった。それぞれ温度が上がる前にピ
ン部品をプレートの新しい列に移動させた。50℃の点に達する直前に、最初の
プレートをサーマルサイクラーから除去し、2つめのサーモウェルプレートと置
換した。thermal cyclingプログラムが終了したとき、液体を2
つの黒いmicrofluorプレート(Dynatech)のウェルに移した
。励起波長584nm、発光波長612nmを用いて、蛍光を測定した。分析の
ためにデータをスプレッドシートプログラムに出力した。
【0144】 4×12ピン部品を用いた研究では、8つのサーモウェルプレートを半分に切
って16個の4×12ウェルプレートを作った。それぞれの試験溶液のアリコー
ト100μlを、全てのウェルが試験溶液を含むまで、半分のプレートそれぞれ
の、1つのウェルに入れた。16全ての半分のプレートの、溶液の配置は同じで
あった。ピン部品を、それぞれの温度が上がる前に、新しい半分のプレートに移
動させた。thermal cyclingプログラムが終了したとき、液体を
8つの黒いマイクロタイタープレート(Dynatech)のウェルに移した。
励起波長584nm、発光波長612nmを用いて、蛍光を測定した。分析のた
めにこのデータをスプレッドシートプログラムに出力した。
って16個の4×12ウェルプレートを作った。それぞれの試験溶液のアリコー
ト100μlを、全てのウェルが試験溶液を含むまで、半分のプレートそれぞれ
の、1つのウェルに入れた。16全ての半分のプレートの、溶液の配置は同じで
あった。ピン部品を、それぞれの温度が上がる前に、新しい半分のプレートに移
動させた。thermal cyclingプログラムが終了したとき、液体を
8つの黒いマイクロタイタープレート(Dynatech)のウェルに移した。
励起波長584nm、発光波長612nmを用いて、蛍光を測定した。分析のた
めにこのデータをスプレッドシートプログラムに出力した。
【0145】 (実施例7:) (様々なhybotropeおよびnon−hybotropeを基にしたハ
イブリダイゼーション溶液中での、オリゴヌクレオチド2本鎖の溶解温度の決定
) この実施例は、標的核酸にハイブリダイズしたときの、野生型および変異体オ
リゴヌクレオチドのTdの決定を述べる。hybotropeを基にしたハイブ リダイゼーション溶液は、30ヌクレオチドの長さまでのプローブを用いて、核
酸標的中の1塩基対の変異の検出を可能にすることを示す。
イブリダイゼーション溶液中での、オリゴヌクレオチド2本鎖の溶解温度の決定
) この実施例は、標的核酸にハイブリダイズしたときの、野生型および変異体オ
リゴヌクレオチドのTdの決定を述べる。hybotropeを基にしたハイブ リダイゼーション溶液は、30ヌクレオチドの長さまでのプローブを用いて、核
酸標的中の1塩基対の変異の検出を可能にすることを示す。
【0146】 (A)溶液および試薬 フィルター洗浄液(FW)は0.09MのNaCl、540mMのTris(
pH7.6)、25mMのEDTAであった。「SDS/FW」は0.1%のド
デシル硫酸ナトリウム(SDS)を加えたFWである。ハイブリダイゼーション
溶液は、本文が指定する(text specified)濃度のhybotr
ope、2%のN−ラウロイルサルコシン(サルコシン)、50mMのTris
(pH7.6)、および25mMのEDTAを含んでいた。ホルムアミドハイブ
リダイゼーション溶液は、30%のホルムアミド、0.09MのNaCl、40
mMのTris−HCl(pH7.6)、5mMのEDTA、および0.1%の
SDSを含んでいた。グアニジニウムチオシアネートはKodak(Roche
ster、NY)から購入した。GuCl、水酸化リチウム、トリクロロ酢酸、
NaSCN、NaClO4、およびKIはSigma(St.Louis、MO )から購入した。水酸化ルビジウムはCFS Chemicals(Colum
bus、OH)から購入した。CsTFAはPharmacia(Piscat
away、NJ)から購入した。
pH7.6)、25mMのEDTAであった。「SDS/FW」は0.1%のド
デシル硫酸ナトリウム(SDS)を加えたFWである。ハイブリダイゼーション
溶液は、本文が指定する(text specified)濃度のhybotr
ope、2%のN−ラウロイルサルコシン(サルコシン)、50mMのTris
(pH7.6)、および25mMのEDTAを含んでいた。ホルムアミドハイブ
リダイゼーション溶液は、30%のホルムアミド、0.09MのNaCl、40
mMのTris−HCl(pH7.6)、5mMのEDTA、および0.1%の
SDSを含んでいた。グアニジニウムチオシアネートはKodak(Roche
ster、NY)から購入した。GuCl、水酸化リチウム、トリクロロ酢酸、
NaSCN、NaClO4、およびKIはSigma(St.Louis、MO )から購入した。水酸化ルビジウムはCFS Chemicals(Colum
bus、OH)から購入した。CsTFAはPharmacia(Piscat
away、NJ)から購入した。
【0147】 LiTCAおよびTMATCA、およびTEATCAを、LiOH、TEAO
HおよびTMAOHの3N溶液をそれぞれ絶えず攪拌しながら氷上でpH7.0
になるまでトリクロロ酢酸(100%w/v、6.1N)を用いて1滴ずつ滴定
して調製した。塩を減圧下で蒸発させて乾燥し、エーテルで1回洗浄して乾燥し
た。
HおよびTMAOHの3N溶液をそれぞれ絶えず攪拌しながら氷上でpH7.0
になるまでトリクロロ酢酸(100%w/v、6.1N)を用いて1滴ずつ滴定
して調製した。塩を減圧下で蒸発させて乾燥し、エーテルで1回洗浄して乾燥し
た。
【0148】 標準的なシアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノ−ホスホロアミダイト
(CED−ホスホロアミダイト)の化学を用いて市販の合成機でオリゴヌクレオ
チドを合成した。市販で入手可能なN−モノメトキシトリチルアミノヘクス−6
−イルオキシ−CED−ホスホロアミダイトを用いて、アミン尾部を5’末端に
組み込んだ。あるいは、市販のオリゴヌクレオチドを購入した(Midland
Certified Reagents、Midland、Tx)。
(CED−ホスホロアミダイト)の化学を用いて市販の合成機でオリゴヌクレオ
チドを合成した。市販で入手可能なN−モノメトキシトリチルアミノヘクス−6
−イルオキシ−CED−ホスホロアミダイトを用いて、アミン尾部を5’末端に
組み込んだ。あるいは、市販のオリゴヌクレオチドを購入した(Midland
Certified Reagents、Midland、Tx)。
【0149】 表1は野生型オリゴヌクレオチドと変異体オリゴヌクレオチドとの間の、Td の違いを測定するために使用したオリゴヌクレオチドを示す。野生型オリゴヌク
レオチドは完全に(fully and perfectly)塩基対になった
2本鎖を表し、そして変異体オリゴヌクレオチドは、1塩基対のミスマッチを表
す(一般的にオリゴヌクレオチドの中間にある)。
レオチドは完全に(fully and perfectly)塩基対になった
2本鎖を表し、そして変異体オリゴヌクレオチドは、1塩基対のミスマッチを表
す(一般的にオリゴヌクレオチドの中間にある)。
【0150】
【表1】 オリゴヌクレオチドを本明細書中で述べたチップに結合させた。これらの研究
では、Van Nessら、Nucl.Acids Res. 19:3345
、1991によって述べられた手法を用いて、オリゴヌクレオチドをチップに結
合させた。オリゴヌクレオチド−チップは0.1から1.2μg/チップの共有
結合で固定化したオリゴヌクレオチドを含んでいた。
では、Van Nessら、Nucl.Acids Res. 19:3345
、1991によって述べられた手法を用いて、オリゴヌクレオチドをチップに結
合させた。オリゴヌクレオチド−チップは0.1から1.2μg/チップの共有
結合で固定化したオリゴヌクレオチドを含んでいた。
【0151】 (B)固相ハイブリダイゼーション プローブオリゴヌクレオチドを標識するために、アミンオリゴヌクレオチドを
アミン反応性蛍光色素と反応させた。誘導オリゴヌクレオチドの調製を3つの部
分に分け、そしてそれぞれの部分を(a)20倍モル過剰のテキサスレッドスル
ホニルクロリド(Molecular Probes、Eugene、OR)、
(b)20倍モル過剰のリサミンスルホニルクロリド(Molecular P
robes、Eugene、OR)、または(c)20倍モル過剰のフルオレセ
インイソチオシアネートと反応させた。最終的な反応条件は室温で1時間の0.
15Mのホウ酸ナトリウム(pH8.3)を含んでいた。反応しなかった蛍光色
素を、G−50セファデックスカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによっ
て除去した。
アミン反応性蛍光色素と反応させた。誘導オリゴヌクレオチドの調製を3つの部
分に分け、そしてそれぞれの部分を(a)20倍モル過剰のテキサスレッドスル
ホニルクロリド(Molecular Probes、Eugene、OR)、
(b)20倍モル過剰のリサミンスルホニルクロリド(Molecular P
robes、Eugene、OR)、または(c)20倍モル過剰のフルオレセ
インイソチオシアネートと反応させた。最終的な反応条件は室温で1時間の0.
15Mのホウ酸ナトリウム(pH8.3)を含んでいた。反応しなかった蛍光色
素を、G−50セファデックスカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによっ
て除去した。
【0152】 オリゴヌクレオチド2本鎖の熱力学的性質を測定する高処理能の方法が開発さ
れた。その方法は何千もの溶液試料を、オリゴヌクレオチド2本鎖のへリックス
〜コイル転移の熱力学的パラメーターを調節する能力に関して調査することを可
能にする。この方法はCetusプレート(または96ウェルPCR形式のため
に設計されたプレートのウェル)に合うように設計された固体支持体を採用し、
液体によって完全に覆うために約40μlの容量を必要とする。チップの設計を
図1に示す。このチップはまた、ナイロンチップを1×8、1×12、4×8、
4×12、または8×12の形式に並べるための取り付け部位として使用し得る
、正方形末端のばねプローブと互換性があるように設計されている。そのような
装置の描写を図2に示す。
れた。その方法は何千もの溶液試料を、オリゴヌクレオチド2本鎖のへリックス
〜コイル転移の熱力学的パラメーターを調節する能力に関して調査することを可
能にする。この方法はCetusプレート(または96ウェルPCR形式のため
に設計されたプレートのウェル)に合うように設計された固体支持体を採用し、
液体によって完全に覆うために約40μlの容量を必要とする。チップの設計を
図1に示す。このチップはまた、ナイロンチップを1×8、1×12、4×8、
4×12、または8×12の形式に並べるための取り付け部位として使用し得る
、正方形末端のばねプローブと互換性があるように設計されている。そのような
装置の描写を図2に示す。
【0153】 1つのオリゴヌクレオチド2本鎖を、Van NessおよびChen、Nu
cleic Acids Res. 19:5143、1991によって述べら
れたように、ナイロンチップに固定化する。次にハイブリダイゼーション処理を
チップ上にオリゴヌクレオチド2本鎖を形成するために使用する。ハイブリダイ
ゼーション工程は、1つの容器で全部一緒に、またはPCRに使用するプレート
のウェルで個々に行い得る。従って、96個のチップの列の、全てのチップが異
なるオリゴヌクレオチド2本鎖を持つことが可能である。
cleic Acids Res. 19:5143、1991によって述べら
れたように、ナイロンチップに固定化する。次にハイブリダイゼーション処理を
チップ上にオリゴヌクレオチド2本鎖を形成するために使用する。ハイブリダイ
ゼーション工程は、1つの容器で全部一緒に、またはPCRに使用するプレート
のウェルで個々に行い得る。従って、96個のチップの列の、全てのチップが異
なるオリゴヌクレオチド2本鎖を持つことが可能である。
【0154】 ハイブリダイゼーション工程の後、チップを洗浄して、次にサーモサイクラー
上に装備したPCRプレートに置く。次に1×8または1×12形式の場合、チ
ップを、温度を5℃づつ上げるごとに一連のウェル上を移動させる。代表的に、
温度の上昇は5℃づつであり、それぞれの温度における溶解時間は1から5分で
ある。例えば、1×12形式のチップを10℃で列Hに置く。次にサーモサイク
ラーを5℃づつ温度を上昇させながら2分間隔で16回上昇するようにプログラ
ムする。1連のチップを列から列へ、温度上昇の15秒前に移動させる。この形
式では、2枚のプレートの溶液を用いて12の溶液を研究し得る。96チップの
形式では、溶液のプレート全体を設定した間隔でサーモサイクラーから外したり
置いたりする。
上に装備したPCRプレートに置く。次に1×8または1×12形式の場合、チ
ップを、温度を5℃づつ上げるごとに一連のウェル上を移動させる。代表的に、
温度の上昇は5℃づつであり、それぞれの温度における溶解時間は1から5分で
ある。例えば、1×12形式のチップを10℃で列Hに置く。次にサーモサイク
ラーを5℃づつ温度を上昇させながら2分間隔で16回上昇するようにプログラ
ムする。1連のチップを列から列へ、温度上昇の15秒前に移動させる。この形
式では、2枚のプレートの溶液を用いて12の溶液を研究し得る。96チップの
形式では、溶液のプレート全体を設定した間隔でサーモサイクラーから外したり
置いたりする。
【0155】 蛍光プローブはこの形式で通常使用され、そして本明細書中で述べた測定され
たTdの値にわずかしか影響を与えない。UV分光測定法で得られる溶解曲線( 深色効果シフト)の場合とは対照的に、光学的な透明さを必要としないので、放
射標識または蛍光標識したプローブは種々の広範な種類の溶液の測定を可能にす
る。マイクロタイタープレート蛍光リーダーで蛍光を測定し、データをエクセル
のようなスプレッドシートプログラムに直接入力する。それは次に安定性、エン
タルピー、へリックス(helical)コイル転移、および温度の範囲を計算
し、次に結果をグラフにする。代表的に、1度に12溶液を測定する1×12形
式は、設定およびデータの換算を含めて1時間以内に終了し得る。
たTdの値にわずかしか影響を与えない。UV分光測定法で得られる溶解曲線( 深色効果シフト)の場合とは対照的に、光学的な透明さを必要としないので、放
射標識または蛍光標識したプローブは種々の広範な種類の溶液の測定を可能にす
る。マイクロタイタープレート蛍光リーダーで蛍光を測定し、データをエクセル
のようなスプレッドシートプログラムに直接入力する。それは次に安定性、エン
タルピー、へリックス(helical)コイル転移、および温度の範囲を計算
し、次に結果をグラフにする。代表的に、1度に12溶液を測定する1×12形
式は、設定およびデータの換算を含めて1時間以内に終了し得る。
【0156】 オリゴヌクレオチド−チップからオリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオチドT d を決定するために、蛍光標識したオリゴヌクレオチドを様々なハイブリダイゼ ーション溶液中で、オリゴヌクレオチド−チップに固定化した相補的なオリゴヌ
クレオチドと共にインキュベーションする。5から5000ngのオリゴヌクレ
オチドを300−400μlの容量で、様々な温度で(19−65℃)、5から
30分ハイブリダイズさせる。チップをそれぞれのハイブリダイゼーション溶液
1mlで3回洗浄し、次に溶解工程の開始温度でそれぞれの溶解溶液で1回洗浄
する。それぞれの溶解溶液100μl中のチップを次にサーモサイクラーの上に
置く。1から5分間隔で、温度を5℃上昇させ、そしてチップをマイクロタイタ
ープレートの新しいウェルに移動させる。溶解、または2本鎖の分離は10℃か
ら95℃の温度範囲で起こる。蛍光を市販の蛍光プレートリーダーで測定する。
クレオチドと共にインキュベーションする。5から5000ngのオリゴヌクレ
オチドを300−400μlの容量で、様々な温度で(19−65℃)、5から
30分ハイブリダイズさせる。チップをそれぞれのハイブリダイゼーション溶液
1mlで3回洗浄し、次に溶解工程の開始温度でそれぞれの溶解溶液で1回洗浄
する。それぞれの溶解溶液100μl中のチップを次にサーモサイクラーの上に
置く。1から5分間隔で、温度を5℃上昇させ、そしてチップをマイクロタイタ
ープレートの新しいウェルに移動させる。溶解、または2本鎖の分離は10℃か
ら95℃の温度範囲で起こる。蛍光を市販の蛍光プレートリーダーで測定する。
【0157】 Tdを計算するために、それぞれの温度で溶出された蓄積相対蛍光ユニット( RFU)を温度に対してプロットする。材料の50%がチップから分離した温度
がTdまたはTmである。へリックス(helical)コイル転移は、与えられ
たオリゴヌクレオチド2本鎖(または2本鎖のあらゆる部位にミスマッチを含む
、または含まない核酸2本鎖)に対するaの値が0.2である温度から、同じ与
えられたオリゴヌクレオチド2本鎖(または核酸2本鎖)に対するaの値が0.
8である温度までとして規定される。
がTdまたはTmである。へリックス(helical)コイル転移は、与えられ
たオリゴヌクレオチド2本鎖(または2本鎖のあらゆる部位にミスマッチを含む
、または含まない核酸2本鎖)に対するaの値が0.2である温度から、同じ与
えられたオリゴヌクレオチド2本鎖(または核酸2本鎖)に対するaの値が0.
8である温度までとして規定される。
【0158】 次のTdを下記で述べるハイブリダイゼーションにおいて得た。
【0159】
【表2】 このデータは、標準ハイブリダイゼーション溶液(Rapid Hybe、P
romega QYまたは5×SSC)中では1塩基対のミスマッチを検出する
ことは不可能であったのに対して、hybotropic溶液(LiTCA、G
uSCNおよびGuHCl)は、24マーおよび30マーのプローブにおける、
1塩基対のミスマッチの検出を可能にすることを示す。
romega QYまたは5×SSC)中では1塩基対のミスマッチを検出する
ことは不可能であったのに対して、hybotropic溶液(LiTCA、G
uSCNおよびGuHCl)は、24マーおよび30マーのプローブにおける、
1塩基対のミスマッチの検出を可能にすることを示す。
【0160】 同様の実験を一連のハイブリダイゼーション溶液中で、上記で述べた24マー
に関して行った。
に関して行った。
【0161】
【表3】 Td(wt)は、完全に塩基対になったオリゴヌクレオチド2本鎖のTdであり
、そしてTm(mt)は1つのミスマッチを含んだオリゴヌクレオチド2本鎖の Tdである。示した値は、上記で述べた配列の24マー2本鎖に関するものであ る。表3に示したデータから、ストリンジェンシーの因子は、完全に塩基対にな
った2本鎖とミスマッチを含む2本鎖との間の違いに直接比例する。すなわち、
ストリンジェンシーの因子は与えられたハイブリダイゼーション溶液がミスマッ
チ2本鎖を識別する能力を予想する。
、そしてTm(mt)は1つのミスマッチを含んだオリゴヌクレオチド2本鎖の Tdである。示した値は、上記で述べた配列の24マー2本鎖に関するものであ る。表3に示したデータから、ストリンジェンシーの因子は、完全に塩基対にな
った2本鎖とミスマッチを含む2本鎖との間の違いに直接比例する。すなわち、
ストリンジェンシーの因子は与えられたハイブリダイゼーション溶液がミスマッ
チ2本鎖を識別する能力を予想する。
【0162】 前述のものは特定の好ましい実施態様に言及するが、本発明はそれに限らない
ことが理解される。当業者が開示された実施態様に様々な変形を行うことができ
、そしてそのような変形が以下の請求の範囲で規定される本発明の範囲内である
と解釈される。
ことが理解される。当業者が開示された実施態様に様々な変形を行うことができ
、そしてそのような変形が以下の請求の範囲で規定される本発明の範囲内である
と解釈される。
【図1】 図1は、本発明の例示的実施態様に従う固相サンプル保持アセンブリのアレイ
の模式図である。
の模式図である。
【図2A】 図2Aは、実質的に図1のライン2−2に沿って得られた固相サンプル保持ア
センブリの拡大断面図である。
センブリの拡大断面図である。
【図2B】 図2Bは、別の実施態様の固相サンプル保持アセンブリの断面図である。
【図3】 図3は、図1のサンプル保持アセンブリのチップ構造物の拡大部分断面図であ
る。
る。
【図4】 図4は、実質的に図3のライン4−4に沿って得られたチップ構造物の拡大断
面図である。
面図である。
【図5】 図5は、実線で示された図1のアレイの側面図であり、液体生体分子サンプル
を有する複数のウェルを備えるマイクロタイタープレート上部に位置合わせされ
ている。そしてウェル内に位置合わせされたチップ構造物を備える下部は破線で
示される。
を有する複数のウェルを備えるマイクロタイタープレート上部に位置合わせされ
ている。そしてウェル内に位置合わせされたチップ構造物を備える下部は破線で
示される。
【図6】 図6は、マイクロタイタープレートのウェル中に位置合わせされた複数のチッ
プ構造物とともに示される図1のアレイの拡大側面図である。
プ構造物とともに示される図1のアレイの拡大側面図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM ,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM) ,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,D K,EE,ES,FI,GB,GE,GH,GM,HR ,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG, KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,L U,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO ,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG, SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,UA,U G,US,UZ,VN,YU,ZW (72)発明者 タボーン, ジョン シー. アメリカ合衆国 ワシントン 98011, ボーセル, ノースイースト 166ティー エイチ プレイス 12117 (72)発明者 バン ネス, ジェフリー アメリカ合衆国 ワシントン 98125, シアトル, 49ティーエイチ アベニュー ノースイースト 10020
Claims (70)
- 【請求項1】 核酸を合成または検出するための手順において使用可能な固
相サンプル保持チップであって、以下: 支持ピンに連結可能なチップ構造物;および 該チップ構造物の少なくとも一部をコーティングする化学物質層であり、該化
学物質層は生体分子に結合し得、該チップ構造物上の該生体分子の固相サンプル
を形成する、化学物質層 を備える、サンプル保持チップ。 - 【請求項2】 前記チップ構造物が前記支持ピンに取り外し可能に連結可能
である、請求項1に記載のサンプル保持チップ。 - 【請求項3】 前記化学物質層が前記チップ構造物に直接付着された、請求
項1に記載のサンプル保持チップ。 - 【請求項4】 前記チップ構造物が部分的に円錐の形状を有し、その内部に
形成された複数の溝を備えた、請求項1に記載のサンプル保持チップ。 - 【請求項5】 前記チップ構造物がその上に複数の熱交換フィンを有する、
請求項1に記載のサンプル保持チップ。 - 【請求項6】 前記チップ構造物が部分的に円錐の形状を有する、請求項5
に記載のサンプル保持チップ。 - 【請求項7】 前記チップ構造物が、前記支持ピンをその中に受けるような
大きさに作製された開口部をその中に有し、該開口部は閉口末端部分および開口
末端部分を有し、該開口末端部分は該閉口末端部分の方向に断面積が減少するほ
ぼ漏斗の形状を有する、請求項1に記載のサンプル保持チップ。 - 【請求項8】 前記チップ構造物がナイロン6/6である、請求項1に記載
のサンプル保持チップ。 - 【請求項9】 前記化学物質層が、その中に前記生体分子と結合可能な複数
のアミン基を有するポリマーである、請求項1に記載のサンプル保持チップ。 - 【請求項10】 前記化学物質層がポリ(エチレンイミン)層である、請求
項1に記載のサンプル保持チップ。 - 【請求項11】 選択された化学物質層が前記チップ構造物に共有結合的に
結合された、請求項1に記載のサンプル保持チップ。 - 【請求項12】 核酸の合成または検出のための固相手順における使用のた
めの固相サンプル保持アセンブリであって、以下: 支持ピン; 該支持ピンに連結されたチップ構造物;および 該チップ構造物の少なくとも一部をコーティングする化学物質層であって、該
化学物質層は生体分子に結合可能であり、該チップ上に該生体分子の固相サンプ
ルを形成する、化学物質層、 を備える、アセンブリ。 - 【請求項13】 前記支持ピンがバネピンである、請求項12に記載のアセ
ンブリ。 - 【請求項14】 前記チップ構造物が前記支持ピンに取り外し可能に連結さ
れた、請求項12に記載のアセンブリ。 - 【請求項15】 前記チップ構造物がナイロン6/6部材である、請求項1
2に記載のアセンブリ。 - 【請求項16】 前記チップ構造物が部分的に円錐の形状を有し、その内部
に複数の溝を備えた、請求項12に記載のアセンブリ。 - 【請求項17】 前記チップ構造物がその上に複数の熱交換フィンを有する
、請求項12に記載のアセンブリ。 - 【請求項18】 前記化学物質層が、その中に前記生体分子と結合可能な複
数のアミン基を有するポリマーである、請求項12に記載のアセンブリ。 - 【請求項19】 前記化学物質層がポリ(エチレンイミン)層である、請求
項12に記載のアセンブリ。 - 【請求項20】 前記チップ構造物がくぼんだ表面を有し、該チップ構造物
の表面積の増加を提供する、請求項12に記載のアセンブリ。 - 【請求項21】 前記支持ピンの第1の末端部分がコーナー部分およびほぼ
多角形の断面形状を有し、前記チップ構造物がその中に、側壁により規定されか
つほぼ円形の断面積を有する開口部を有し、該コーナー部分が該側壁と摩擦によ
り係合して該チップ構造物を該支持ピン上に保持する、請求項12に記載のアセ
ンブリ。 - 【請求項22】 前記チップ構造物が、その中に前記支持ピンの第1の末端
部分を取り外し可能に受ける開口部をその中に有し、該開口部は閉口末端部分お
よび開口末端部分を有し、該開口末端部分は該閉口末端部分の方向に断面積が減
少するほぼ漏斗の形状を有する、請求項12に記載のアセンブリ。 - 【請求項23】 核酸の合成または検出のための手順における使用のための
固相サンプル保持アセンブリのアレイであって、以下: 基部; 選択されたアレイ中で該基部に連結された複数の支持ピンであって、各支持ピ
ンは該基部から間隔を空けて末端部分を有する、支持ピン; 該支持ピンの該末端部分に連結された複数のチップ構造物;および 各チップ構造物の少なくとも一部をコーティングする化学物質層であって、該
化学物質層は生体分子に結合可能であり、該生体分子の固相サンプルを形成する
、化学物質層 を備える、アレイ。 - 【請求項24】 前記支持ピンがバネピンである、請求項23に記載のアレ
イ。 - 【請求項25】 前記チップ構造物が前記支持ピンに取り外し可能に連結可
能された、請求項23に記載のアレイ。 - 【請求項26】 前記チップ構造物がナイロン6/6部材である、請求項2
3に記載のアレイ。 - 【請求項27】 各チップ構造物が部分的に円錐の形状を有し、その内部に
複数の溝を備えた、請求項23に記載のアレイ。 - 【請求項28】 各チップ構造物がその上に複数の熱交換フィンを有する、
請求項23に記載のアレイ。 - 【請求項29】 前記化学物質層が、その中に複数のアミン基を有するポリ
マーである、請求項23に記載のアレイ。 - 【請求項30】 前記化学物質層がポリ(エチレンイミン)層である、請求
項23に記載のアレイ。 - 【請求項31】 前記チップ構造物がその上にくぼんだ表面を有する、請求
項23に記載のアレイ。 - 【請求項32】 各チップ構造物が、それぞれの支持ピンの末端部分を取り
外し可能に受ける開口部をその中に有し、該開口部は閉口末端部分および開口末
端部分を有し、該開口末端部分は該閉口末端部分の方向に断面積が減少するほぼ
漏斗の形状を有する、請求項23に記載のアレイ。 - 【請求項33】 核酸の合成または検出のための手順における使用のための
、固相サンプル保持アセンブリとマイクロタイタープレートの組合せであって、
以下: その中に生体分子を有するサンプルの容積を収容するように形成されたウェル
を有する、マイクロタイタープレート;ならびに 該ウェルに少なくとも部分的に届くように作製された、固相サンプル保持アセ
ンブリであって、固相サンプル保持アセンブリは以下: 支持ピン; 該支持ピンに連結されたチップ構造物であって、該チップ構造物は該ウェル
中に取り外し可能に位置し得る、チップ構造物;および 該チップ構造物の少なくとも一部をコーティングする化学物質層であって、
該化学物質層は溶液中の該生体分子に結合可能であり、該生体分子の固相サンプ
ルを形成する、化学物質層 を備える、固相サンプル保持アセンブリ を備える、組合せ。 - 【請求項34】 前記支持ピンがバネピンである、請求項33に記載の組合
せ。 - 【請求項35】 請求項33に記載の組合せであって、ここで前記チップ構
造物が前記支持ピンに取り外し可能に連結され、そして該チップ構造物が該支持
ピンから取り外される場合には前記ウェル中に位置し得る、組合せ。 - 【請求項36】 前記チップ構造物がナイロン6/6の部材である、請求項
33に記載の組合せ。 - 【請求項37】 前記チップ構造物が前記ウェルの断面の形状に密接に対応
する断面の形状を有する、請求項33に記載の組合せ。 - 【請求項38】 前記チップ構造物が、部分的に円錐の形状を有し、その内
部に複数の溝を備えた、請求項33に記載の組合せ。 - 【請求項39】 前記化学物質層が、その中に複数のアミン基を有するポリ
マーコーティングである、請求項33に記載の組合せ。 - 【請求項40】 前記化学物質層がポリ(エチレンイミン)層である、請求
項33に記載の組合せ。 - 【請求項41】 前記チップ構造物が摩擦により前記支持ピン上に保持され
る、請求項33に記載の組合せ。 - 【請求項42】 前記マイクロタイタープレートはその中に複数のウェルを
有し、かつ選択されたアレイ中に整列された複数の前記支持ピン、および該支持
ピンの各々1つに連結され、前記ウェル中に配置可能な固相サンプル保持チップ
のアレイを形成する複数の前記チップ構造物をさらに備える、請求項33に記載
の組合せ。 - 【請求項43】 前記チップ構造物から間隔を空けた前記支持ピンの末端の
連結された基部をさらに備え、そして該チップ構造物が実質的に同一表面上にあ
る、請求項42に記載の組合せ。 - 【請求項44】 核酸の合成または検出のための手順における使用のための
、固相サンプル保持チップとマイクロタイタープレートの組合せであって、以下
: その中に生体分子を有するサンプルの容積を収容するように形成されたウェル
を有する、マイクロタイタープレート;ならびに 該ウェル中に取り外し可能に配置された固相サンプル保持チップであって、該
チップは該ウェル中に存在する場合に支持ピンに連結可能であるチップ構造物、
および該チップ構造物の少なくとも一部をコーティングする化学物質層を有し、
該化学物質層は溶液中の生体分子に結合可能であり、該生体分子の固相サンプル
を該チップ上に形成する、チップ を備える、組合せ。 - 【請求項45】 前記チップ構造物がナイロン6/6の部材である、請求項
44に記載の組合せ。 - 【請求項46】 前記チップ構造物が、前記ウェルの断面の形状に実質的に
対応する断面の形状を有する、請求項44に記載の組合せ。 - 【請求項47】 前記チップ構造物および前記ウェルが部分的に円錐の形状
の断面を有する、請求項44に記載の組合せ。 - 【請求項48】 前記チップ構造物が部分的に円錐の形状を有し、その中に
複数の溝を備えた、請求項44に記載の組合せ。 - 【請求項49】 前記化学物質層がポリ(エチレンイミン)層である、請求
項44に記載の組合せ。 - 【請求項50】 固相分子生物学プロセスにおける使用のための固相サンプ
ル保持チップを製造する方法であって、以下の工程: 基板材料を、支持ピンに取り付け可能なチップ構造物として形成する工程; 該基板材料の少なくとも一部を、選択された生体分子に結合可能な化学物質層
でコーティングし、該生体分子の固相サンプルを形成する工程;および 該化学材料層を該基板材料に取り付ける工程、 を含む、方法。 - 【請求項51】 前記化学物質層を前記基板材料に取り付ける前記工程が、
該化学物質層を該基板材料に共有結合的に取り付ける工程を含む、請求項50に
記載の方法。 - 【請求項52】 前記化学物質層が、その中に複数のアミン基を有するポリ
マーであり、該アミン基は前記生体分子に結合可能であり、そして前記取り付け
る工程が、該ポリマーを前記基板材料に共有結合的に取り付ける工程を含む、請
求項50に記載の方法。 - 【請求項53】 前記化学物質層がポリ(エチレンイミン)であり、そして
前記基板材料がナイロン6/6材料であり、そして前記取り付ける工程が、該ポ
リ(エチレンイミン)を該ナイロン6/6に共有結合的に取り付ける工程を含む
、請求項50に記載の方法。 - 【請求項54】 前記チップ構造物を支持ピンに取り付ける工程をさらに含
む、請求項50に記載の方法。 - 【請求項55】 前記チップ構造物を取り付ける前記工程が、前記チップ構
造物を前記支持ピンの末端に取り外し可能に取り付ける工程を含む、請求項54
に記載の方法。 - 【請求項56】 基部、複数の支持ピン、およびその上に前記化学物質層を
有する複数のチップ構造物を提供する工程、該支持ピンをアレイ中の該基部に取
り付ける工程、および該チップ構造物を複数の支持ピンの各々1つに取り付けて
、該基部から間隔を空けた固相サンプル保持チップのアレイを形成する工程をさ
らに含む、請求項50に記載の方法。 - 【請求項57】 生体分子の固相サンプルを形成する方法であって、以下の
工程: その中に該生体分子を有する溶液中に、チップアセンブリの一部を浸す工程で
あって、該チップアセンブリは、基板部分および該基板部分上に化学物質層を有
し、該化学物質層は該生体分子に結合可能である、工程; 該生体分子を、該化学物質層に結合可能にし、該チップアセンブリ上に該生体
分子の固相サンプルを形成する工程;および 該生体分子が該化学物質層に結合した後に該溶液から該チップアセンブリを取
り出す工程 を含む、方法。 - 【請求項58】 前記溶液がマイクロタイタープレートのウェルに収容され
、そして前記浸す工程が前記チップアセンブリの一部を該ウェル中に配置する工
程を含む、請求項57に記載の方法。 - 【請求項59】 前記生体分子が前記化学物質層に結合した後、前記チップ
アセンブリ上で分子生物学プロセスを実行する工程をさらに含む、請求項57に
記載の方法。 - 【請求項60】 請求項57に記載の方法であって、前記生体分子が前記化
学物質層に結合した後、保持部材中に前記固相チップアセンブリを保管する工程
をさらに含む、方法。 - 【請求項61】 前記保持部材が、その中にウェルを有するマイクロタイタ
ープレートであり、そして前記保管する工程が、前記生体分子が前記化学物質層
に結合した後、前記ウェル中に前記チップアセンブリを配置する工程、ならびに
該マイクロタイタープレートおよびチップアセンブリを保管位置にユニットとし
て配置する工程を含む、請求項60に記載の方法。 - 【請求項62】 前記生体分子が核酸であるかまたはアミノ酸のポリマーで
あるかのいずれかである、請求項57に記載の方法。 - 【請求項63】 前記核酸が、前記化学物質層に結合された1つの末端およ
び1つの非結合末端を有するオリゴヌクレオチドである、請求項62に記載の方
法。 - 【請求項64】 前記オリゴヌクレオチド非結合末端がオリゴ(dT)配列
を含む、請求項63に記載の方法。 - 【請求項65】 ポリ(A+)RNAを前記チップアセンブリに結合する工 程であって、ここで該ポリ(A+)RNAのポリ(A+)部分が前記オリゴヌクレ
オチドのオリゴ(dT)配列に結合されている、工程、をさらに含む、請求項6
4に記載の方法。 - 【請求項66】 前記結合されたポリ(A+)RNAからcDNAを合成す る工程をさらに含む、請求項65に記載の方法。
- 【請求項67】 前記生体分子がアビジン分子である、請求項57に記載の
方法。 - 【請求項68】 オリゴヌクレオチドを前記チップアセンブリに結合する工
程であって、ここで該オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのビオチン部分を含
み、そして該ビオチン化オリゴヌクレオチドが前記アビジン分子に結合する、工
程をさらに含む、請求項67に記載の方法。 - 【請求項69】 前記分子生物学プロセスが以下: cDNA合成; ポリメラーゼ連鎖反応; サブトラクト(subtracted)cDNAライブラリーの調製; 示差的プローブの合成; 固相小配列決定; オリゴヌクレオチド連結アッセイ;および 増幅フラグメント長多型性分析 からなる群から選択される、請求項59に記載の方法。
- 【請求項70】 前記アミノ酸ポリマーが抗体である、請求項62に記載の
方法。
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