NL1012394C2 - Werkwijze en inrichting voor het gelijktijdig en onafhankelijk van elkaar bemonsteren van ingevroren cultures van micro-organismen en/of eukaryote cellen. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze en inrichting voor het gelijktijdig en onafhankelijk van elkaar bemonsteren van ingevroren 5 cultures van micro-organismen en/of eukaryote cellen.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bemonsteren van ingevroren cultures van micro-10 organismen, eukaryote cellen, en dergelijke, welke cultures zijn ondergebracht in van elkaar gescheiden compartimenten in een gezamenlijke houder, waarbij een monster wordt genomen door een culture in contact te brengen met een overbrengorgaan, alsmede op een inrichting voor het 15 uitvoeren van een dergelijke werkwijze.

Er zijn tegenwoordig zeer vele verschillende soorten micro-organismen en eukaryote cellen bekend en er worden er nog steeds meer ontdekt. Veel van genoemde micro-organismen en eukaryote cellen kunnen worden gekweekt en/of 20 vermeerderd in microbiologische labaratoria. Daarnaast worden veel van de genoemde micro-organismen en eukaryote cellen genetisch gemanipuleerd waardoor zij in een of meerdere eigenschappen verschillen van het uitgangsmateriaal. Om te kunnen beschikken over al deze 25 verschillende organismen en cellen zijn opslagwerkwijzen ontwikkeld voor het langdurig bewaren in levensvatbare vorm. Vaak worden cultures van micro-organismen en/of eukaryote cellen bevroren in de aanwezigheid van 15-20% % glycerol. De micro-organismen en/of eukaryote cellen kunnen 30 dan vervolgens worden opgeslagen bij temperaturen beneden de -20 °C.

Het bevriezen van dergelijke cultures, meestal in aanwezigheid van 15 of 20% glycerol, bij een temperatuur lager dan -70°C is een veel gebruikte en tevens eenvoudige 35 methode voor lange termijn (meerdere jaren) opslag. De methode wordt met name vaak gebruikt voor het opslaan van reincultures van cellulaire en virale micro-organismen. Ten ! « ' < * •uf J «*· 2 einde vanuit deze opgeslagen reincultures tot groeiende cultures te komen wordt een kleine hoeveelheid van de bevroren reincultuur van het bevroren oppervlak afgeschrapt, bijvoorbeeld met behulp van een steriele 5 spatel of naald, en vervolgens overgebracht naar een groeimedium (bijvoorbeeld een agar voedingsbodem). Hierna kan het groeimedium bij een geschikte temperatuur worden geincubeerd ten einde vermenigvuldiging van het betreffende micro-organisme te bewerkstelligen. Hoewel deze techniek 10 goed voldoet voor standaard laboratorium werk, blijkt de werkwijze dermate arbeidsintensief te zijn dat zij een belemmering vormt voor het opschalen naar grotere aantallen cultures. In verscheidene onderzoeksgebieden is het wenselijk om snel en tegelijkertijd de beschikking te 15 hebben over meerdere duizenden groeiende cultures van micro-organismen en/of eukaryote cellen. In die gevallen wordt de voortgang gelimiteerd door de tijd, mankracht en apparatuur benodigd om de beschikbare ingevroren cultures weer tot vermenigvuldigen te brengen cq. op te kweken.

20 Daarom is het vaak niet of niet goed mogelijk om grote aantallen cultures tegelijk te hanteren.

Met de uitvinding wordt beoogd de tijd en/of mankracht benodigd voor het opkweken van grote aantallen verschillende micro-organismen en/of eukaryote cellen 25 aanzienlijk te reduceren.

Het doel wordt volgens de onderhavige uitvinding bij een werkwijze van de in de aanhef omschreven soort bereikt, door het gelijktijdig nemen van meerdere monsters doordat elke bemonsterde culture in contact wordt gebracht met 30 telkens een overbrengorgaan, waarbij de overbrengorganen onafhankelijk ten opzichte van elkaar verend beweegbaar worden gedragen door een gemeenschappelijke drager, die zodanig en zolang wordt bediend, dat door onderlinge verplaatsing van de diverse overbrengorganen elke te 35 bemonstèren culture met een overbrengorgaan in contact is gebracht. Door het gebruiken van een drager met meerdere -.-314« 3 overbrengorganen is het mogelijk om meerdere ingevroren cultures tegelijk te bemonsteren en kan een aanzienlijk reductie in tijd en/of mankracht worden verkregen bij het in culture nemen van ingevroren cultures. Evenwel‘doet zich 5 in de praktijk veelvuldig de situatie voor dat de hoogten van de oppervlakken van de ingevroren cultures zich niet op één, voor iedere culture, gelijke hoogte bevinden. Zo is het heel normaal dat niet alle bakjes van een houder met. dezelfde hoeveelheid vloeistof worden gevuld. Ook kan de 10 vorm van het bevroren oppervlak op een niet voorspelbare manier variëren, waardoor de hoogte van het oppervlak van één ingevroren culture variabel is. Dit probleem nu wordt bij de werkwijze volgens de uitvinding ondervangen door de diverse overbrengorganen onafhankelijk ten opzichte van 15 elkaar verend te laten bewegen. Hierdoor is met één enkele handeling te bewerkstelligen dat van al de cultures gelijktijdig een monster wordt genomen, waarna al de monsters gelijktijdig zijn over te brengen naar en te deponeren op bijvoorbeeld een groeimedium.

20 Als overbrengorgaan kunnen diverse welbekende elementen worden gebruikt, zoals spatels e.d.

Overeenkomstig verdere uitvoeringsvormen van de uitvinding verdient het echter de voorkeur dat, als overbrengorganen langgerekte pinnen worden gebruikt, die zodanig onderling 25 in hoofdzaak evenwijdig in de gemeenschappelijke drager worden aangebracht dat elke pin althans in zijn t langsrichting ten opzichte van de drager verend verplaatsbaar is. De voordelen van een dergelijke verplaatsing is dat relatief gróte verschillen in afstand 30 overbrugd kunnen worden. Alternatief zouden de pinnen ook in een verende drager kunnen zijn ingebed; verend ten opzichte van de drager verplaatsbare pinnen verdienen echter vanwege hun betere hanteerbaarheid de voorkeur.

Om alle pinnen met eenzelfde aandrukkracht in 35 contact te brengen met de diverse cultures, verdient het verder de voorkeur dat elke pin zodanig verend in de 4 gemeenschappelijke drager wordt aangebracht, dat bij het verend verplaatsen van bedoelde pin een in hoofdzaak gelijkblijvende veerkracht wordt opgewekt. Een in hoofdzaak gelijkblijvende veerkracht heeft tot voordeel dat‘om en 5 nabij gelijke monsters kunnen worden getrokken van de ingevroren cultures.

Bij voorkeur wordt elk overbrengorgaan voor het in contact brengen met een ingevroren culture op een zodanige temperatuur gebracht, dat een klein gedeelte van bedoelde 10 ingevroren culture door contact met bedoeld overbrengorgaan wordt ontdooid. Bij deze voorkeurswerkwijze wordt het oppervlak van de ingevroren culture dat in aanraking komt met de pin vloeibaar gemaakt door warmteoverdracht van de pin naar het oppervlak van de ingevroren culture. Na 15 terugtrekking van pin blijft dan een gedeelte van de vloeistof, met daarin een gedeelte van de ingevroren culture van micro-organismen en/of eukaryote cellen, hechten aan het uiteinde van de pin. Om warmteoverdracht te bevorderen kan tenminste het uiteinde van de pin worden 20 uitgevoerd in een materiaal met een relatief grote warmte geleidingscapaciteit. Voor een verdere verbetering van de warmteoverdracht wordt het uiteinde van de pin dat in contact wordt gebracht met de culture bij voorkeur uitgevoerd in een stompe en bij voorkeur enigszins 25 afgeronde vorm.

Bij het overenten van micro-organismen en/of eukaryote cellen is het van belang te kunnen constateren v dat ook inderdaad van alle ingevroren cultures een monster van het bevroren oppervlak is genomen; dit terwijl het 30 zicht door de in de bakjes reikende pinnen met drager wordt belemmerd. In verband hiermee verdient het overeenkomstig een verdere uitvoeringsvorm van de uitvinding de voorkeur dat elk overbrengorgaan wordt voorzien van een indicatiemechanisme, dat actief wordt wanneer bedoeld 35 overbrengorgaan verend is verplaatst.

1012394» 5

De onderhavige uitvinding heeft tevens betrekking op een inrichting voor het toepassen bij een werkwijze van de uitvinding, welke inrichting voorzien is van tenminste een overbrengorgaan met een hanteringsdeel. Overeenkomstig de 5 uitvinding is er daarbij in voorzien, dat het hanteringsdeel een drager omvat, die tenminste twee verend ten opzichte van elkaar beweegbare overbrengorganen draagt, zodat een onafhankelijk van elkaar, met een ingevroren culture in contact brengen van de diverse overbrengorganen 10 mogelijk is. Met een dergelijke inrichting wordt de tijd en/of de mankracht benodigd voor het bemonsteren van grote hoeveelheden ingevroren cultures aanzienlijk verminderd.

Als de overbrengorganen bestaan uit pinnen, die onderling in de hoofdzaak evenwijdig verend zijn 15 aangebracht ten opzichte van de uit een relatief stijf materiaal vervaardigde drager, is de inrichting relatief eenvoudig en goedkoop te realiseren.

Bij voorkeur zijn de pinnen over een door stuitorganen bepaald traject in langsrichting verschuifbaar 20 opgesteld in de drager, waarbij de pinnen elk door veerkracht naar een door een stuitorgaan bepaalde eindstand worden gedrukt. Aldus is een eenduidige uitgangsstand met alle pinuiteinden in eenzelfde vlak te verkrijgen. Een min of meer zelfde pinuiteindenvlak is met name voordelig bij 25 het plaatsen van de inrichting op de houder met de ingevroren cultures.

Als de drager is voorzien van een binnenruimte waarin zich voor elk overbrengorgaan ten minste een veer bevindt, zijn de diverse veren onderhoudsvriendelijk 30 ondergebracht in een omsloten ruimte. Daarnaast is de onderbrenging van de veren in een omsloten ruimte voordelig bij het steriliseren van de inrichting.

Een andere omsloten uitvoering is te verkrijgen als een pin telescopisch verend verschuifbaar is opgenomen in 35 een hulsdeel dat is vastgezet in de drager.

i- U ? / 7' ··' 6

Verder kan er de voorkeur aan worden gegeven dat de pinnen wat betreft de aandrukkingskracht gefaseerd in contact komen met een ingevroren culture. In dat geval kan er in zijn voorzien dat voor elk overbrengorgaan ten minste 5 . twee in serie geschakelde veren met onderling verschillende veerconstanten aanwezig. Het voordeel hiervan is dat dezelfde inrichting onder twee of meer verschillende werkdrukken kan worden gebruikt waardoor verschillende bemonsteringwijzen mogelijk worden gemaakt. Daarnaast kan 10 op deze wijze (door het toenemen van de voor het indrukken benodigde druk) een controle mechanisme voor doordrukken van de overbrengorganen worden ingebouwd, bijvoorbeeld voor het voorkomen van doordrukken van agarbodems.

Zou het uitsluitend drukken niet voldoende zijn om 15 bepaalde cultures te bemonsteren of over te brengen, dan verdient het overeenkomstig een verdere uitvoeringsvorm van de uitvinding de voorkeur dat elke pin zodanig is bevestigd, dat althans het begin van een langsverplaatsing uit bedoelde eindstand gepaard gaat met een 20 rotatiebeweging. Met een rotatiebeweging wordt een meer schrapend contact van de overbrengorganen met het aan te raken oppervlak bewerkstelligd.

Voor het bevorderen van een gelijkmatig contact tussen de pinnen en de cultures wordt er een voorkeur voor 25 uitgesproken dat het hanteringsdeel is voorzien van een geleidingsinrichting waarin de drager in slechts een richting verschuifbaar is, welke richting veelal de v langsrichting van de pinnen zal zijn. Verder kan het daarbij de voorkeur verdienen, dat het hanteringsdeel is 30 voorzien van positioneringsmiddelen voor het richten van de inrichting ten opzichte van een houder met een aantal bakvormige compartimenten voor het onderling gescheiden opnemen van een aantal ingevroren cultures.

Om aan de van de pinnen afgekeerde zijde van de 35 drager te kunnen waarnemen dat elke pin in contact is gebracht met een culture, kan er overeenkomstig een verdere «n . : ., ’' i ί! ^ Ν· 7 uitvoeringsvorm van de uitvinding in zijn voorzien dat elke pin is voorzien van een uiteinde met een eindvlak dat in genoemde eindstand deel uitmaakt van een groter vlak en bij *· een langsverplaatsing van bedoelde pin uit dat groter vlak 5 treedt. Bij voorkeur is bedoeld groter vlak een bij gebruik van de inrichting in het zicht liggend vlak van de drager.

Bij het overenten van micro-organismen en/of eukaryote cellen is het in het algemeen van belang geen _ andere dan de bedoelde micro-organismen en/of eukaryote 10 cellen over te enten. Om dit te bewerkstelligen moet steriel worden gewerkt. Dit betekent dat tenminste het uiteinde van de pinnen dat in contact wordt gebracht met genoemde cultures gesteriliseerd moet kunnen worden. Daarom wordt tenminste het uiteinde van de pinnen dat in contact 15 kan worden gebracht met de genoemde cultures vervaardigd van een steriliseerbaar materiaal. Sterilisatie kan op verschillende manieren gebeuren zoals bijvoorbeeld door hitte, onderdompeling in een desinfecterend middel en/of door dodende straling zoals ultraviolet licht of 20 radioactieve straling. Bij voorkeur wordt tenminste het uiteinde van de pinnen dat in contact kan worden gebracht met de genoemde cultures gemaakt van een materiaal dat meerdere malen kan worden gesteriliseerd. Een voorbeeld van een meerdere malen steriliseerbaar materiaal is roestvrij v 25 staal.

In een andere uitvoering van een inrichting van de uitvinding is tenminste het uiteinde van de pinnen dat in % contact kan worden gebracht met de genoemde cultures gemaakt van een plastic materiaal. Ook kan de gehele 30 inrichting zijn gemaakt van plastic. Een van de voordelen van een uitvoering in plastic is dat de inrichting zodanig goedkoop kan worden gefabriceerd dat eenmalig gebruik voor de meeste toepassingen niet op financiële bezwaren stuit bij de eindgebruiker.

35 Het is duidelijk dat een inrichting van de uitvinding niet alleen geschikt is voor monstername van 'i 01 239 49 8 ingevroren cultures. Zij is ook uitermate geschikt voor monstername van gevriesdroogde cultures. Ook kan de inrichting van de uitvinding worden gebruikt voor het overenten van vloeibare cultures en cultures die groeien op 5 een zachte voedingsbodem zoals agar.

Onder verwijzing naar in de figuren weergegeven uitvoeringsvoorbeelden zullen thans, uitsluitend bij wijze van voorbeeld, de werkwijze en inrichting volgens de onderhavige uitvinding nader worden verduidelijkt. Daarbij 10 toont:

Fig. 1 een eerste uitvoeringsvorm van de inrichting volgens de uitvinding in vooraanzicht;

Fig. 2 een bovenaanzicht van Fig. 1;

Fig. 3 de toepassing van een inrichting volgens de 15 uitvinding;

Fig. 4 een tweede uitvoeringsvorm van de inrichting volgens de uitvinding in vooraanzicht; .

Fig. 5 op vergrote schaal een alternatieve uitvoering van een pin-dragerverbinding; en 20 Fig. 6 op vergrote schaal een verdere variant van een pin-dragerverbinding.

In Fig. 1 en 2 is een monstername-inrichting weergegeven die voorzien is van een drager 1 met een handvat 2. De drager 1 is voorzien van een aantal boringen 25 waar overbrengorganen in de vorm van pinnen 3 in langsrichting verschuifbaar doorheen reiken. Elke pin 3 is aan zijn ene uiteinde voorzien van een kop 4 en aan zijn

V

andere uiteinde van een afgeronde punt 5. In de in Fig. 1 weergegeven ruststand van de inrichting rusten alle koppen 30 4 op de bovenzijde van de drager 1 en worden in die stand gehouden door veren 6, die enerzijds steun nemen tegen de onderzijde van de drager 1 en anderzijds tegen een op elke pin 3 vastgezette ring 7. De drager 1 is verder nabij zijn vier hoekpunten telkens voorzien van een daarin star 35 bevestigde geleidepin 8 met een zoekpunt 9, die tot voorbij de afgeronde punten 5 van de pinnen 3 reikt. Zoals uit Fig.

9 2 blijkt, is de drager voorzien van 96 pinnen 3 en 4 geleidepinnen 8.

In Fig. 3 is het bemonsteren van cultures 10 met behulp van een inrichting volgens Fig. 1 en 2 weergegeven.

5 De te bemonsteren cultures 10 zijn ondergebracht in een in doorsnee weergegeven houder 11, die op de inrichting is afgestemd, dat wil zeggen een houder met 96 onderling gescheiden compartimenten 12 in een met de opstelling van de pinnen 3 corresponderend patroon en van 4 10 geleideboringen 13 in een patroon dat correspondeert met de opstelling van de geleidepinnen 8.

Voor het op de houder 11 plaatsen van de inrichting wordt de inrichting met behulp van het handvat 2 zodanig boven de inrichting gebracht, dat de geleidepinnen 8 15 stroken met de geleideboringen 13. Bij het vervolgens omlaag brengen van de inrichting zorgen de zoekpunten 9 ervoor dat de geleidepinnen 8 soepel in de geleideboringen 13 kunnen schuiven, waardoor de pinnen 3 zodanig ten opzichte van de compartimenten 12 worden gepositioneerd, 20 dat zich boven elk compartiment 12 één pin 3 bevindt. Bij het door middel van het handvat 2 verder omlaag bewegen van de inrichting reiken de pinnen 3 elk in een compartiment 12. Zoals uit Fig. 3 blijkt, is het niveau van de diverse cultures 10 in de diverse compartimenten 12 verschillend.

25 Bij de in Fig. 3 weergegeven situatie is het niveau in het derde compartiment van links het hoogst en in het meest rechtse compartiment het laagst. Omdat de geleidepinnen 8 er zorg voor dragen, dat de drager 1 een horizontale stand heeft en blijft houden tijdens het omlaag bewegen, zal de 30 pin 3 in het derde compartiment van links met zijn afgeronde punt 5 het eerst tegen het oppervlak van een bevroren culture stuiten. Op dat moment bevinden zich derhalve de overige punten 5 van de overige pinnen 3 nog op afstand van de oppervlakken van de diverse cultures.

35 Voortgezette neerwaartse beweging van de drager 1 is mogelijk doordat de pin 3 in het derde compartiment van 1012394¾ 10 links verend kan verplaatsen ten opzichte van de drager 1, dat wil zeggen stil blijven staan terwijl de drager 1 verder neerwaarts wordt verplaatst. Aldus kunnen successievelijk alle afgeronde punten 5 van alle pinnen 3 5 met het oppervlak van de bijbehorende culture 10 in contact worden gebracht. Dit nu is de situatie weergegeven in Fig.

3, waarbij de afgeronde punt 5 van de pin 3 in het meest rechtse compartiment net contact maakt met het oppervlak van de culture 10 in dat compartiment.

10 Opgemerkt wordt dat in de situatie van Fig. 3 alle koppin 4 op één na zijn losgekomen van de bovenzijde van de drager 1. Dit is een teken dat de betreffende punten 5, die niet meer van bovenaf zichtbaar zijn, in contact zijn gekomen met een culture 10. Door de neerwaartse beweging 15 van de drager 1 voort te zetten tot ook de laatste kop 4 is losgekomen van de bovenzijde van de drager 1, is men ervan verzekerd, dat de punten 5 van alle pinnen 3 in contact verkeren met de oppervlakken van de diverse cultures 10. Bovendien is door de veerwerking verzekerd, dat het contact 20 tussen de diverse pinnen 3 en cultures 10 met een door de veren 6 vooraf in te stellen kracht plaatsvindt, zodat aan elk compartiment 12 bij het weer omhoog bewegen van de drager 1 waardoor de pinnen 3 weer loskomen van de cultures 10, de gewenste hoeveelheid culture 10 is te onttrekken en 25 over te brengen naar een voedingsbodem of dergelijke.

In Fig. 4 is een inrichting volgens de uitvinding weergegeven die voorzien is van een drager 21, die is samengesteld uit een bovenplaat 22, een· zijrand 23 en een onderplaat 24. Aldus wordt een omsloten ruimte 25 gevormd 30 waar een aantal pinnen 26 doorheen reikt. Elke pin 26 draagt aan zijn ene uiteinde een kop 27 en is aan het andere uiteinde voorzien van een van scherpe uitsteeksels voorzien uiteinde 28. De bovenplaat 22 en de onderplaat 24 zijn voorzien van in lijn gelegen boringen voor het met een 35 schuifpassing geleidend opnemen van een pin 26. De bovenplaat 22 is verder voorzien van verdiepingen 29, die 11 een hoogte hebben gelijk aan die van een kop 27 en al de koppen zodanig kunnen opnemen, dat deze met hun bovenvlakken in het bovenvlak van de bovenplaat 22 zijn gelegen. In de omsloten ruimte is rond elke pin 26 een veer 5 30 aangebracht die enerzijds steunneemt tegen de onderzijde van de bovenplaat 22 en anderzijds via een vast met de pin verbonden ring 31 tegen de bovenzijde van de onderplaat 24 aanligt. De veren 30 en de plaatsing van de ringen 31 op.de pinnen 26 is zodanig gekozen, dat in de ruststand van de 10 inrichting, zoals weergegeven in Fig. 4, de koppen 27 in de verdiepingen 29 zijn gelegen en de bovenvlakken van die koppen 27 in één vlak liggen met het bovenvlak van de bovenplaat 22. Deze laatste is voorzien van uitstekende randgedeelten 22a, die dienst doen als handvatten. De 15 werking van deze inrichting wat betreft het in contact brengen van alle uiteinden 28 van de pinnen 26 met de oppervlakken van verder niet weergegeven cultures is gelijk aan die volgens Fig. 3, zodat deze werking niet verder zal worden beschreven.

20 Opgemerkt wordt, dat het kiezen van pinuiteinden met scherpe uitsteeksels, zoals weergegeven in Fig. 4, in sommige gevallen de voorkeur kan hebben boven afgeronde uiteinden, zoals weergegeven in Fig. 1. Verder kunnen de koppen 27 een gekleurde zijomtreksrand hebben, zodat beter 25 en gemakkelijker waarneembaar is wanneer een pin 26 is verschoven, en zijn punt 28 dus contact heeft gemaakt met het oppervlak van een culture. Immers dan zal de gekleurde zijomtreksrand van de kop 27 uit de verdieping 29 treden en aldus een duidelijke indicatie van de verplaatsing van de 30 pin 26 geven.

Een verdere mogelijke uitvoering van een pin-dragerverbinding is weergegeven in Fig. 5. Daarbij is voorzien in een (deels weergegeven) plaatvormige drager waaraan een aantal geleidingshulzen 42 is bevestigd. Het 35 van de dr.ager 41 af gekeerde uiteinde van de geleidingshuls 42 is vernauwd tot een doorgang voor het schuivend 12 doorlaten van een pin 43. Bij zijn bovenuiteinde eindigt de pin 43 in een verdikking 44 die met een schuifpassing in de geleidingshuls 42 verplaatsbaar is. Uitgaande van de bovenzijde van de verdikking 44 strekt zich een 5 indicatiestift 45 uit die door een in de drager 41 aangebrachte boring 46 reikt. Tussen de verdikking 44 en de onderzijde van de drager 41 is in de geleidingshuls 42 rond de indicatiestift 45 een veer 47 aangebracht, die de verdikking 44 tegen het vernauwde ondereinde van de 10 geleidingshuls 42 tracht te drukken.

In Fig. 5 is de situatie weergegeven, waarbij het niet getoonde ondereinde van de pin 43 in contact is gebracht met het oppervlak van een culture, waarna neerwaartse verplaatsing van de drager 41, om redenen als 15 bovenstaand besproken, is voortgezet. Voordat bedoeld contact tot stand kwam, lag door de werking van de veer 47 de verdikking 44 aan tegen het vernauwde uiteinde van de geleidingshuls 42 en bevond het bovenuiteinde van de indicatiestift 45 zich in het bovenvlak van de drager 41.

20 De verplaatsing van de pin 43 is aldus snel en betrouwbaar waar te nemen door de uitstekende indicatiestift 45, zoals getoond in Fig. 5.

Fig. 6 toont weer een andere uitvoeringsmogelijkheid voor de pin-dragerverbinding. De 25 pin 51 is vastgezet in een blok 52 van veerkrachtig of elastisch materiaal, welk blok op zijn beurt weer is vastgezet in een drager 53. De pin 51 kan nu verplaatsen

V

ten opzichte van de drager 53 door een verende uitwijking van het blok 52. Om de verende uitwijking te 30 vergemakkelijken kan het blok 52 zijn voorzien van twee groeven zoals in Fig. 6 met een dunne lijn 54 is aangeduid.

Het spreekt voor zich, dat er binnen het kader van de uitvinding, zoals neergelegd in de bijgaande conclusies, nog vele wijzigingen en varianten mogelijk zijn. Zo kan bij 35 de uitvoeringsvorm van Fig. 4 voorzien zijn in een geleiding van de drager ten opzichte van een 101 239 4* 13 cultureshouder, al dan niet op de wijze zoals getoond in Fig. 3. Ook kunnen de punten op elke geschikte of gewenste wijze worden uitgevoerd en is het aantal pinnen per drager naar wens te kiezen. Verder kunnen er voorzieningen 5 aanwezig zijn, die een pin bij een langsverschuiving tevens een draaiing laten maken, bijvoorbeeld door de verdikking 44 in Fig. 5 de vorm van een wormwiel te geven en de geleidingshuls 42 te voorzien van een corresponderende schroefdraad.

10

Ui twerkingsvoorbeeld:

Een inrichting van de uitvinding en een procedure voor opslag en groei van aërobe bacteriën is getest voor een collectie van 48 verschillende bodemisolaten. De 15 verschillende bacteriestammen zijn geïsoleerd uit zestien verschillende bodemmonsters uit verschillende delen van Nederland en vervolgens gekarakteriseerd met behulp van 16SRNA analyse. De moeder-microtiter plaat werd als volgt bereid: aan alle 96 wells van een steriele deepwell 20 microtiterplaat werd 500 ul steriele nutriënt-broth agar (8 g/1 nutriënt broth, 2 g/1 bacto-agar) toegevoegd. Na stolling van de nutriënt-broth agar werden 48 wells aangeënt, elk met één van de 48 stammen (die 3 dagen tevoren op nutriënt broth agarplaten uitgestreken waren).

25 Hierbij werd alternerend één well aangeënt en één well niet aangeënt. Hierdoor ontstond een patroon waarbij iedere aangeënte well omringd is door 2-4 niet-aangeënte wells. Na twee dagen van groei werd aan alle 96 wells 500 μΐ vloeibaar nutriënt broth medium (8 g/1) toegevoegd. De 30 microtiterplaat werd vervolgens afgedekt met een steriele deksel bestaande uit een met 96 gaten geperforeerde rubber laag en daarboven op een laag watten. Het geheel werd samengeklemd en gedurende twee dagen bij 25 °C geschud op een orbitale schudder (300 toeren per minuut). Na deze twee 35 dagen groei werd aan alle wells 150 μΐ van een steriel glycerol:water (60:40 v/v) mengsel toegevoegd en gemengd. Vervolgens werd de microtiterplaat ingevroren bij -70 °C.

14

Na een aantal dagen werd deze moeder microtiterplaat gedurende zo kort mogelijke tijd uit de vriezer genomen en met behulp van een inrichting van de uitvinding werd een kleine hoeveelheid (ongeveer 0.3 μΐ) uit iedere wèll 5 opgenomen en overgebracht naar een steriele microtiterplaat gevuld met 150 μΐ steriele kaliumfosfaat buffer (50 mM, pH 7.0). De inhoud van alle 96 wells van deze plaat werd in verschillende verdunningen uitgeplaat op nutriënt-broth platen en na drie dagen incubatie werden de kolonies geteld 10 en gecontroleerd op reinheid. Uit deze gegevens werd berekend hoeveel kolonie-vormende eenheden uit elk van de wells van de moeder-microtiterplaat waren opgenomen (zie tabel 1). Het aantal door de inrichting overgeënte kolonie-vormende eenheden varieerde voor de verschillende stammen 15 tussen de 180 en 50 000 (zie tabel 1). In geen van de 48 wells van de moeder-microtiterplaat die niet aangeënt waren werden kolonievormende eenheden aangetroffen. Dit geeft aan dat gedurende de beschreven procedure de steriele wells niet werden geïnfecteerd door de aangeënte wells. In een.

20 tweede experiment werd de inrichting op eenzelfde wijze gebruikt om een klein volume uit de moeder-microtiterplaat op te nemen. De inrichting werd vervolgens direct op een nutriënt broth agarplaat overgebracht. Na twee dagen was op deze agarplaat een regelmatig patroon van gevormde kolonies 25 te zien, geheel in overeenstemming met het patroon van de aangeënte wells in de moeder-microtiterplaat. Vervolgens kon een deel van het celmateriaal van de individuele kolonies op deze agarplaat met behulp van een inrichting van de uitvinding overgebracht worden naar een 30 deepwellplate gevuld met een vloeibaar groeimedium (750 ul/well). Na incubatie op een orbitale schudder gedurende 2 dagen (zoals hierboven beschreven) werden celdichtheden in de orde van 2-8 g/1 bereikt, hetgeen voldoende is voor de meeste toepassingen (bijvoorbeeld tests op de aanwezigheid 35 van een specifiek enzym).

15

Tabel 1.

Aantal kolonievormende eenheden opgenomen uit de moeder-microtiterplaat, opgesplitst per bacteriesoort.

aantal kolonievormende eenheden opgenomen '* door de inrichting aantal laagste gemiddeld standaard stammen deviatie

Pseudomonas viridiflava 1 5000 5000

Pseudomonas syringae 6 6400 39400 35290

Pseudomonas stutzeri 3 10000 26667 20817

Pseudomonas putida 5 180 4132 4028.

Pseudomonas mendocina 1 20000 20000

Pseudomonas marginalis 6 10000 50000 40988

Pseudomonas fulva 2 20000 20000 0

Pseudomonas fluorescence 2 20000 35000 21213

Pseudomonas cepacia ·1 50000 50000

Pseudomonas azotoformans 2 20000 35000 21213

Rhodococcus opacus 6 513 2679 2124

Rhodococcus globerulus 5 500 7560 7807

Rhodococcus erythropolis 2 15000 57500 60104

Alcaligenes sp. 3 8000 9333 1414

Achromobacter xylosoxydans 1 10000 10000 -

Variovorax sp. 1 50000 50000

V

101 2394a

Claims (16)

1. Werkwijze voor het bemonsteren van ingevroren. cultures van micro-organismen, eukaryote cellen en dergelijke, 5 welke cultures zijn ondergebracht in van elkaar gescheiden compartimenten in een gezamenlijke houder, waarbij een monster wordt genomen door een culture in contact te brengen met een overbrengorgaan, met het kenmerk, dat meerdere monsters gelijktijdig worden genomen doordat elke 10 te bemonsteren culture in contact wordt gebracht met telkens een overbrengorgaan, waarbij de overbrengorganen onafhankelijk ten opzichte van elkaar verend beweegbaar worden gedragen door een gemeenschappelijke drager, die zodanig en zo lang wordt bediend, dat door onderlinge 15 verplaatsing van de diverse overbrengorganen elke te bemonsteren culture met een overbrengorgaan in contact is gebracht.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als overbrengorganen langgerekte pinnen worden gebruikt, 20 die zodanig in de gemeenschappelijke drager worden aangebracht dat elke pin althans in zijn langsrichting ten opzichte van de drager verend verplaatsbaar is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat elke pin zodanig verend in de gemeenschappelijke drager 25 wordt aangebracht, dat bij het verend verplaatsen van bedoelde pin een in hoofdzaak gelijkblijvende veerkracht ‘ wordt opgewekt.

4. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat elk overbrengorgaan voor het in contact 30 brengen met een ingevroren culture op een zodanige temperatuur wordt gebracht, dat een klein gedeelte van bedoelde ingevroren culture door contact met bedoeld overbrengorgaan wordt ontdooid.

5. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met 35 het kenmerk, dat elk overbrengorgaan wordt voorzien van een ' : . indicatiemechanisme, dat actief wordt wanneer bedoeld overbrengorgaan verend is verplaatst.

6. Inrichting voor het toepassen bij een werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, en voorzien van ten 5 minste een overbrengorgaan met een hanteringsdeel, met het kenmerk, dat het hanteringsdeel een drager omvat, die ten minste twee verend ten opzichte van elkaar beweegbare overbrengorganen draagt.

7. Inrichting volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat 10 de overbrengorganen bestaan uit pinnen, die verend zijn aangebracht ten opzichte van de uit een relatief stijf materiaal vervaardigde drager.

8. Inrichting volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de pinnen over een door stuitorganen bepaald traject in 15 langsrichting verschuifbaar zijn opgesteld in de drager, waarbij de pinnen elk door veerkracht naar een door een stuitorgaan bepaalde eindstand worden gedrukt.

9. Inrichting volgens een der conclusies 6-8, met het kenmerk, dat de drager voorzien is van een binnenruimte 20 waarin zich voor elk overbrengorgaan ten minste een veer bevindt.

10. Inrichting volgens een der conclusies 6-8, met het kenmerk, dat een pin telescopisch verend verschuifbaar is opgenomen in een hulsdeel dat is vastgezet in de drager.

11. Inrichting volgens een der conclusies 6-10, met het kenmerk, dat voor elk overbrengorgaan ten minste twee in v serie geschakelde veren met onderling verschillende veerconstanten aanwezig zijn.

12. Inrichting volgens een der conclusies 6-11, met het kenmerk, dat het hanteringsdeel is voorzien van een 35 geleidingsinrichting waarin de drager in slechts een richting verschuifbaar is. * o s - - - .

12. Inrichting volgens een der conclusies 8-10, met het 30 kenmerk, dat elke pin zodanig is bevestigd, dat althans het begin van een langsverplaatsing uit bedoelde eindstand gepaard gaat met een rotatiebeweging.

13. Inrichting volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het hanteringsdeel voorzien is van positioneringsmiddelen voor het richten van de inrichting ten opzichte v^n een houder met een aantal bakvormige compartimenten voor het 5 onderling gescheiden opnemen van een aantal ingevroren cultures.

14. Inrichting volgens een der conclusies 6-13, met het kenmerk, dat elke pin voorzien is van een uiteinde met een eindvlak dat in genoemde eindstand deel uitmaakt van een 10 groter vlak en bij een langsverplaatsing van bedoelde pin uit dat groter vlak treedt.

15. Inrichting volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat bedoeld groter vlak een bij gebruik van de inrichting in het zicht liggend vlak van de drager is.

16. Inrichting volgens een der conclusies 6-15, met het kenmerk, dat tenminste het uiteinde van de pinnen dat in contact kan worden gebracht met genoemd cultures, is vervaardigd van een steriliseerbaar materiaal. v 101 239 4¾ .