JP2004535814A - Exponential nucleic acid amplification using nicking endonuclease - Google Patents

Exponential nucleic acid amplification using nicking endonuclease Download PDF

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Abstract

本発明は、ニック形成剤を使用する、核酸分子の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。本発明は、多くの領域（例えば、疾患診断、遺伝的バリエーション検出、およびｐｒｅ−ｍＲＮＡ選択的スプライシング分析）において有用である。核酸の増幅のための以前に公知である技術とは対照的に、本発明は、複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットの使用を必要とはせず、転写には基づかない、核酸増幅のための方法を提供する。さらに、本発明は、等温条件下で実行され得、従って、異なる温度のサイクルを提供するための装置に関連する出費を回避し得る。The present invention provides methods and compositions for exponential amplification of nucleic acid molecules using nicking agents. The invention is useful in many areas, such as disease diagnosis, genetic variation detection, and pre-mRNA alternative splicing analysis. In contrast to previously known techniques for the amplification of nucleic acids, the present invention does not require the use of multiple oligonucleotide primer sets and does not require a method for amplification of nucleic acids that is not based on transcription. provide. Further, the present invention can be performed under isothermal conditions, thus avoiding the expense associated with equipment for providing different temperature cycles.

Description

【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学的の分野に関し、より特には、核酸に関する方法および組成物に関し、なおより特には、ニック形成剤を使用して核酸を増幅することに関連する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
多数の方法が、核酸の迅速な増幅のために開発されている。これらとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己維持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびＱβレプリカーゼを用いる増幅が挙げられる。核酸増幅のために広範に使用される方法のうちのほとんど（例えば、ＰＣＲ）は、変性および再アニーリングのサイクルを達成するために異なる温度のサイクルを必要とする。他の方法は、等温で実施され得るが、複数のプライマーセット（例えば、好熱性ＳＤＡのバンパープライマー）を必要とするか、または転写および／もしくは逆転写に基づく（これは、ＲＮＡ変性に感受性である（例えば、ＴＡＳ、ＮＡＳＢＡ、および３ＳＲ））。従って、核酸増幅のためのより簡単でかつより効率の良い方法について、当該分野で長い間感じられた必要性が存在する。
【０００３】
本発明は、下記のように、この必要性および関連する必要性を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の簡単な要旨）
核酸の増幅のための以前に公知である技術とは対照的に、本発明は、複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットの使用を必要とはせず、転写には基づかない、核酸増幅のための方法を提供する。さらに、本発明は、等温条件下で実行され得、従って、異なる温度のサイクルを提供するための装置に関連する出費を回避し得る。本発明は、種々の適用（例えば、遺伝子変化検出、疾患診断、および遺伝子変化検出）において有用性を見出し得る。
【０００５】
この目的のために、本発明は、下記に要約するようなシステムおよびアレイを含む、方法、化合物、および組成物を提供する。
【０００６】
核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法。この方法は、（Ａ）少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１）を提供する工程であって、この少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子は、（ｉ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列、および（ｉｉ）その第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列のうちの少なくとも１つを含む、工程；（Ｂ）その第１のＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）と、ＤＮＡポリメラーゼと、１種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第１の一本鎖核酸分子（Ａ１）を増幅する工程であって、この増幅工程は、このＤＮＡポリメラーゼのためのテンプレートとしてＮ１の一部を使用する、工程；（Ｃ）第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、この第２の一本鎖核酸分子は、５’から３’の方向に、（ｉ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列と、（ｉｉ）Ａ１と少なくとも実質的に相補的である配列とを含む、工程；ならびに（Ｄ）Ｔ２と、Ａ１と、第１のＮＡと、第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡと、ＤＮＡポリメラーゼと、デオキシヌクレオシド三リン酸との存在下で、第３の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する工程であって、Ａ２は、Ａ１と少なくとも実質的に相補的であり、Ａ１、Ａ２、または両方が、最大２５ヌクレオチド長である、工程；を包含する。
【０００７】
核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法。この方法は、（Ａ）混合物を形成する工程であって、この混合物は、（ｉ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１）；（ｉｉ）３’から５’の方向に、（ａ）Ｎ１中の第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置するＮ１の一部と少なくとも実質的に同一である配列と、（ｂ）第２のＮＥＲＳのセンス鎖の配列とを含む、一本鎖核酸分子（Ｔ２）；および（ｉｉｉ）第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）、第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む、工程；ならびに（Ｂ）一本鎖核酸分子（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件にて、上記混合物を維持する工程であって、Ａ２が最大２５ヌクレオチド長である、工程；を包含する。
【０００８】
核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法。この方法は、（Ａ）（ｉ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１）と；（ｉｉ）一本鎖核酸分子（Ｔ２）と、（ｉｉｉ）第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）、第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸との混合物を形成する工程であって、この一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、３’から５’の方向に、（ａ）Ｎ１中の第１のＮＡＲＳのセンス鎖の３’側に位置するＮ１の一部と少なくとも実質的に相補的である配列と、（ｂ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列とを含む、工程；ならびに（Ｂ）一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件にて、上記混合物を維持する工程であって、Ａ２が最大２５ヌクレオチド長である、工程；を包含する。
【０００９】
タンデム核酸増幅システム。このシステムは、第１の核酸（Ａ１）を増幅するための第１のプライマー伸長手段と、第２の核酸（Ａ２）を増幅するための第２のプライマー伸長手段とを備え、ここで、（ｉ）Ａ１は、Ａ２を増幅するための第２のプライマー伸長手段のための開始プライマー；（ｉｉ）この第１のプライマー伸長手段および第２のプライマー伸長手段の両方が、単一の反応容器内に含まれており、かつニック形成剤（ＮＡ）の存在を必要とし；（ｉｉｉ）Ａ１、Ａ２、または両方が、最大２５ヌクレオチド長であり；そして（ｉｖ）Ａ２は、Ａ１と少なくとも実質的に相補的である。
【００１０】
核酸分子Ａ２の指数関数的増幅のための方法。この方法は、（ａ）第１のテンプレート核酸（Ｔ１）を、第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）と、第１のＤＮＡポリメラーゼの存在下でのプライマー伸長反応により、テンプレートとして使用して核酸分子（Ａ１）を増幅する工程であって、この第１のテンプレート核酸（Ｔ１）は、第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）の１本の鎖の配列を含む、工程；ならびに（ｂ）第２のテンプレート核酸（Ｔ２）をテンプレートとして使用し、Ａ１を開始プライマーとして使用して、第２のＮＡと第２のＤＮＡポリメラーゼとの存在下でのプライマー伸長反応によってＡ２を増幅する工程であって、この第２のテンプレート核酸（Ｔ２）は、第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む、工程；を包含する。好ましくは、Ａ１、Ａ２、または両方が、最大２５ヌクレオチド長である。
【００１１】
ゲノム核酸またはｃＤＮＡ分子における遺伝子変化を同定するための方法。この遺伝子変化は、そのゲノム核酸またはｃＤＮＡ分子中の第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する。この方法は、（Ａ）混合物を形成する工程であって、この混合物は、（ｉ）ゲノム核酸またはｃＤＮＡ分子、（ｉｉ）一本鎖核酸分子（Ｔ２）、および（ｉｉｉ）第１のＮＥＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）、第２のＮＥＲＳを認識する第２のＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含み、この一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、３’から５’の方向に、（ａ）第１のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置するゲノム核酸部分またはｃＤＮＡ分子部分と少なくとも実質的に同一である配列と、（ｂ）第２のＮＥＲＳのセンス鎖の配列とを含む、工程；（Ｂ）この混合物を、一本鎖核酸分子（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件にて維持する工程；ならびに（Ｃ）そのゲノム核酸またはｃＤＮＡ分子中の遺伝子変化を同定するためにＡ２を特徴付ける工程；を包含する。
【００１２】
標的核酸中の規定された位置における遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、（ａ）第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮＰ）と、第２のＯＤＮＰと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、（ｉ）その標的核酸が、第１の鎖と第２の鎖とを有する二本鎖核酸である場合に、その第１のＯＤＮＰは、第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の３’側に位置する標的核酸の第１の鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含み、第２のＯＤＮＰは、その遺伝子変化の３’側に位置する標的核酸の第２の鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその第２のＯＤＮＰは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１本の鎖の配列を必要に応じて含むか、または（ｉｉ）標的核酸が一本鎖核酸である場合に、その第１のＯＤＮＰは、第１のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列とを含み、その第２のＯＤＮＰは、その遺伝子変化の３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてその第２のＯＤＮＰは、必要に応じてＲＥＲＳを含む、工程；ならびに（ｂ）その第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰとを伸長して、その第１のＯＤＮＰのヌクレオチド配列と第２のＯＤＮＰのヌクレオチド配列とを含む伸張産物を生成させる工程；（ｃ）工程（ｂ）の伸長産物を、ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて必要に応じて消化して、消化産物を生成する工程；（ｄ）工程（ｂ）の伸長産物の１本の鎖または工程（ｃ）の消化産物の一本の鎖を、第１のＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下でテンプレートとして使用して、第１の一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅する工程；（ｅ）Ａ１にアニールするための第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、Ｔ２は、５’から３’の方向に、（ｉ）第２のＮＥＲＳのセンス鎖の配列と、（ｉｉ）Ａ１と少なくとも実質的に相補的な配列とを含む、工程；（ｆ）Ａ１をテンプレートとして使用して、第３の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する工程；ならびに（ｇ）Ａ２を特徴付けて、標的核酸中の遺伝子変化を同定する工程；を包含する。好ましくは、Ａ１、Ａ２、または両方が、最大２５ヌクレオチドを有する。
【００１３】
標的核酸における規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、（ａ）第１のＯＤＮＰと、第２のＯＤＮＰと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、（ｉ）標的核酸が、第１鎖と第２鎖とを有する二本鎖である場合、その第１のＯＤＮＰは、第１の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の３’側に位置する標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列とを含み、第２のＯＤＮＰは、第２のＲＥＲＳの一本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の３’側に位置する標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列とを含むか、または（ｉｉ）標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第１ＯＤＮＰは、第１ＲＥＲＳの１本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列とを含み、その第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１本の鎖の配列と、その遺伝子変化の３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含む、工程；（ｂ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸と、少なくとも１種の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸との存在下で、その第１ＯＤＮＰと第２ＯＤＮＰとを伸長させて、第１ＲＥＲＳおよび第２ＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する工程；（ｃ）第１ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）と第２ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼとの存在下で、工程（ｂ）の伸長産物をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸フラグメントを指数関数的に増幅する工程であって、この一本鎖核酸フラグメントは、２５ヌクレオチド長以下である、工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）の一本鎖フラグメントのうちの少なくとも１つを特徴付けて、その遺伝子変化を同定する工程；を包含する。
【００１４】
標的核酸における規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、（ａ）第１ＯＤＮＰと、第２ＯＤＮＰと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、（ｉ）その標的核酸が、第１鎖と第２鎖とを有する二本鎖核酸である場合、その第１ＯＤＮＰは、第１制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の３’側に位置する標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含み、その第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の３’側に位置する標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含むか；または（ｉｉ）その標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第１ＯＤＮＰは、第１ＲＥＲＳの一本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列とを含み、第２ＯＤＮＰは、第２ＲＥＲＳの１本の鎖の配列と、その遺伝子変化の３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含む、工程；（ｂ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸と、少なくとも１種の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸との存在下で、第１ＯＤＮＰと第２ＯＤＮＰとを伸長させて、第１ＲＥＲＳおよび第２ＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する工程；（ｃ）第１ＲＥＲＳと第２ＲＥＲＳとを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、工程（ｂ）の伸長産物の一本の鎖をテンプレートとして使用して、第１の一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程；（ｄ）Ａ１にアニールする第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、Ｔ２は、５’から３’の方向に、（ｉ）第３のＲＥＲＳのセンス鎖の配列と、（ｉｉ）Ａ１と少なくとも実質的に相補的な配列とを含む、工程；（ｅ）Ａ１をテンプレートとして使用して、第３の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する工程；ならびに（ｆ）工程（ｃ）の一本鎖フラグメントの少なくとも１つを特徴付けして、その遺伝子変化を同定する工程；を包含する。
【００１５】
標的核酸中の規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法であって、この方法は、（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）と、第２ＯＤＮＰと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、（ｉ）その標的核酸が、第１鎖と第２鎖とを有する二本鎖核酸である場合、その第１ＯＤＮＰは、その遺伝子変化の相補体の３'側に位置する標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、第２ＯＤＮＰは、その遺伝子変化の３’側に位置する標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、または（ｉｉ）その標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第１ＯＤＮＰは、その遺伝子変化の５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、第２ＯＤＮＰは、その遺伝子変化の３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、この第１ＯＤＮＰと第２ＯＤＮＰとは、各々さらに、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、工程；（ｂ）この第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰを伸長させて、２つのＮＥＲＳを含む伸長産物を生成させる工程；（ｃ）上記ＮＥＲＳを認識する１種以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（ｂ）の伸長産物をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸フラグメントを指数関数的に増幅する工程であって、この一本鎖核酸フラグメントは、２５個以下のヌクレオチドを有する、工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）の一本鎖フラグメントの少なくとも１つを特徴付け、それによりその遺伝子変化を同定する工程；を包含する。
【００１６】
標的核酸における規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）と、第２ＯＤＮＰと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、（ｉ）その標的核酸が、第１鎖と第２鎖とを有する二本鎖核酸分子である場合、その第１ＯＤＮＰは、その遺伝子変化の相補体の３’側に位置する標的核酸の第１鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、その第２ＯＤＮＰは、その遺伝子変化の３’側に位置する標的核酸の第２鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、または（ｉｉ）その標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第１ＯＤＮＰは、その遺伝子変化の５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、その第２ＯＤＮＰは、その遺伝子変化の３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、その第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰは、各々さらに、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、工程；（ｂ）その第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰを伸長させて、２つのＮＥＲＳを含む伸長産物を生成させる工程；（ｃ）ＮＥＲＳを認識する１種以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（ｂ）の伸長産物の１本の鎖をテンプレートとして使用して、第１の一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程；（ｄ）Ａ１にアニールする第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、Ｔ２は、５’から３’の方向に、（ｉ）ＮＥＲＳのセンス鎖の配列と、（ｉｉ）Ａ１と少なくとも実質的に相補的な配列とを含む、工程；（ｅ）Ａ１をテンプレートとして使用して、第３の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する工程；ならびに（ｆ）工程（ｃ）の一本鎖フラグメントを特徴付けることにより、その遺伝子変化を同定する工程；を包含する。好ましくは、Ａ１、Ａ２、または両方が、最大２５ヌクレオチドを有する。
【００１７】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する：（Ａ）以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む混合物を形成する工程：（ｉ）このサンプルの核酸分子；（ｉｉ）３’から５’の向きで、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、第１の１本鎖核酸分子（Ｔ１）：（ａ）標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である第１配列、（ｂ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列、および（ｃ）多くとも２５ヌクレオチドを有する第２配列；（ｉｉｉ）３’から５’の向きで、以下の（ａ）および（ｂ）を含む、第２の１本鎖核酸分子（Ｔ２）：（ａ）Ｔ１の第２配列に対して少なくとも実質的に同一である配列、および（ｂ）第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列；ならびに（ｉｖ）この第１ＮＡＲＳを認識する第１ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、この第２ＮＡＲＳを認識する第２ＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；（Ｂ）この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば１本鎖核酸分子（Ａ２）が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程；ならびに（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【００１８】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する：（Ａ）以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む混合物を形成する工程：（ｉ）このサンプルの核酸分子；（ｉｉ）３’から５’の向きで、以下の（ａ）および（ｂ）を含む、第１の１本鎖核酸分子（Ｔ１）：（ａ）標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である配列、および（ｂ）第１ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列、（ｉｉｉ）３’から５’の向きで、以下の（ａ）および（ｂ）を含む、第２の１本鎖核酸分子（Ｔ２）：（ａ）第１ＮＡＲＳのセンス鎖の配列の３’側に位置する、Ｔ１の配列に対して少なくとも実質的に相補的である配列、および（ｂ）第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列；ならびに（ｉｖ）この第１ＮＡＲＳを認識する第１ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、この第２ＮＡＲＳを認識する第２ＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；（Ｂ）この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば１本鎖核酸分子（Ａ２）が増幅される条件にて、この混合物を維持する工程であって、ここで、Ａ２は、（ｉ）この標的核酸に対して少なくとも実質的に同一であり、そして（ｉｉ）好ましくは多くとも２５ヌクレオチドを有する、工程；ならびに（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、このサンプル中のこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【００１９】
サンプル中の、第１ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する：（Ａ）以下の（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む混合物を形成する工程：（ｉ）このサンプルの核酸分子、（ｉｉ）３’から５’の向きで、以下の（ａ）および（ｂ）を含む、１本鎖核酸分子（Ｔ２）：（ａ）この第１ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する、標的核酸分子の一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、および（ｂ）第２ＮＥＲＳのセンス鎖の配列、ならびに（ｉｉｉ）この第１ＮＥＲＳを認識する第１ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；この第２ＮＥＲＳを認識する第２ＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；（Ｂ）この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば１本鎖核酸分子（Ａ２）が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程；ならびに（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【００２０】
サンプル中の、第１ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する：（Ａ）以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む混合物を形成する工程：（ｉ）この標的核酸分子、（ｉｉ）この標的核酸の一方の鎖に対して実質的に同一であり、かつこの第１ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、第１の１本鎖核酸分子（Ｔ１）、（ｉｉｉ）３’から５’の向きで、以下の（ａ）および（ｂ）を含む、第２の１本鎖核酸分子（Ｔ２）：（ａ）この第１ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する、Ｔ１の一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、および（ｂ）第２ＮＥＲＳのセンス鎖の配列、ならびに（ｉｖ）この第１ＮＥＲＳを認識する第１ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；この第２ＮＥＲＳを認識する第２ＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；（Ｂ）この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば１本鎖核酸分子（Ａ２）が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程；ならびに（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【００２１】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は以下を包含する：（Ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびこのサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）この標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第１鎖の第１の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この標的核酸の第２鎖の第２の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２ＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、この第２の部分は、この標的核酸の第２鎖において第１の部分の相補体の３’側に位置するか、または（ｉｉ）この標的核酸が１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１ＲＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第１の部分に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この標的核酸の第２の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２ＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、この第２の部分は、この標的核酸において第１の部分の５’側に位置する、工程；（Ｂ）この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば、この第１ＲＥＲＳおよびこの第２ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）、デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ならびにＤＮＡポリメラーゼの存在下で１本鎖核酸分子（Ａ２）が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程であって、ここでＡ２は、２５ヌクレオチド長以下である、工程；ならびに（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【００２２】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する：（Ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびこのサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）この標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第１鎖の第１の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この標的核酸の第２鎖の第２の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、この第２の部分は、この標的核酸の第２鎖において第１の部分の相補体の３’側に位置するか、または（ｉｉ）この標的核酸が１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１ＮＥＲＳのセンス鎖の配列、およびこの標的核酸の第１の部分に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この標的核酸の第２の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、この第２の部分は、この標的核酸において第１の部分の５’側に位置する、工程；（Ｂ）この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば、この第１ＮＥＲＳおよびこの第２ＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）、デオキシリボヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で１本鎖核酸フラグメント（Ａ２）が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程であって、ここでＡ２は、好ましくは、２５ヌクレオチド長以下である、工程；ならびに（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【００２３】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は以下を包含する：（Ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびこのサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）この標的核酸が、第１鎖および第２鎖を有する２本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第１鎖の第１の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この標的核酸の第２鎖の第２の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、この第２の部分は、この標的核酸の第２鎖において第１の部分の相補体の３’側に位置するか、または（ｉｉ）この標的核酸が１本鎖核酸である場合、この第１ＯＤＮＰは、第１ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第１の部分に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２ＯＤＮＰは、この標的核酸の第２の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、この第２の部分は、この標的核酸において第１の部分の５’側に位置する、工程；（Ｂ）この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば、（ｉ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰを伸長して、この第１ＮＥＲＳおよびこの第２ＮＥＲＳの両方を含む伸長産物が生成される条件；（ｉｉ）この第１ＮＥＲＳおよびこの第２ＮＥＲＳを認識するさらにもう１つのニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（ｂ）のこの伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして用いて、第１の１本鎖核酸フラグメント（Ａ１）が増幅される条件；（ｉｉｉ）Ａ１にアニーリングし得る第２の１本鎖核酸分子（Ｔ２）の存在下で、Ａ１をテンプレートとして用いて、第３の１本鎖核酸フラグメント（Ａ２）が増幅される条件にこの混合物を供する工程であって、Ａ１、Ａ２または両方は、多くとも２５ヌクレオチドを有し、そしてここでＴ２は、５’から３’の向きで、以下の（ａ）および（ｂ）を含む、工程：（ａ）第３のＮＥＲＳのセンス鎖の配列、および（ｂ）Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的な配列；ならびに（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【００２４】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する：（Ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む混合物を形成する工程：（ｉ）このサンプルの核酸分子、および（ｉｉ）３’から５’の向きで、この標的核酸の５’部分に対して少なくとも実質的に相補的である配列、および第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列を含む、１本鎖核酸プローブ（Ｔ１）、（Ｂ）存在する場合、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子を、この標的核酸にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程；（Ｃ）存在するならば、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子、およびこの第１ＮＡＲＳを認識する第１ニック形成剤（ＮＡ）の存在下で増幅反応を行う工程；（Ｄ）５’から３’の向きで、以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む、１本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程：（ｉ）第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）この第１ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する、この第１の１本鎖核酸プローブの一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、（Ｅ）この第２ＮＡＲＳを認識する第２ＮＡの存在下で増幅反応を行う工程；（Ｆ）工程（Ｅ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、このサンプル中での標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【００２５】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する：（Ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む混合物を形成する工程：（ｉ）このサンプルの核酸分子、および（ｉｉ）以下の（ａ）および（ｂ）を含む、部分的に２本鎖の核酸プローブ：（ａ）第１ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、この第１ＮＡＲＳのアンチセンスの配列、または両方；および（ｂ）この鎖自体またはその伸長産物が、この第１ＮＡＲＳを認識する第１ニック形成剤（ＮＡ）によってニック形成可能なニック形成部位（ＮＳ）を含む鎖中の５’突出部、またはこの鎖もその伸長産物もこのＮＳを含まない鎖中の３’突出部であって、ここで、突出部は、この標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程；（Ｂ）存在する場合、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子を、この標的核酸にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程；（Ｃ）存在するならば、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子、およびこの第１ＮＡＲＳを認識する第１ニック形成剤（ＮＡ）の存在下で増幅反応を行う工程；（Ｄ）５’から３’の向きで、以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む、１本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程：（ｉ）第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）この第１ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する、この核酸プローブの一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、（Ｅ）この第２ＮＡＲＳを認識する第２ＮＡの存在下で増幅反応を行う工程；（Ｆ）工程（Ｅ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、このサンプル中での標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【００２６】
ｃＤＮＡ分子中の２つの特定のエキソン間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する：（Ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む少なくとも部分的に２本鎖の核酸分子（Ｎ１）を提供する工程：（ｉ）第１ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列、およびこの第１ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列のうちの少なくとも一方、ならびに（ｉｉ）このｃＤＮＡ分子の一部分の少なくとも一方の鎖であって、この部分は、この２つのエキソンの間に連結部を含む疑いがある、工程；（Ｂ）この第１ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で第１の１本鎖核酸分子（Ａ１）を増幅する工程であって、ここで、この増幅する工程は、このｃＤＮＡの一部分を、このポリメラーゼについてのテンプレートとして用いる、工程；（Ｃ）５’から３’の向きで、以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む、第２の１本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程：（ｉ）第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的である配列；（Ｄ）Ｔ２、Ａ１、この第１ＮＡ、この第２ＮＡＲＳを認識する第２ＮＡ、このＤＮＡポリメラーゼ、およびこのデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第３の１本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する工程であって、ここで、Ａ２は、Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的である、工程；ならびに（Ｅ）Ａ２を検出および／または特徴付けして、このｃＤＮＡ分子の連結部の存在または非存在を決定する工程。
【００２７】
ｃＤＮＡ分子中の２つのエキソン間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、ここで、この連結部は、存在する場合、このｃＤＮＡ分子中の第１ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のアンチセンス鎖の配列の５’側に位置し、この方法は、以下を包含する：（Ａ）以下の（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む混合物を形成する工程：（ｉ）このｃＤＮＡ分子、（ｉｉ）３’から５’の向きで、以下の（ａ）および（ｂ）を含む、１本鎖核酸分子（Ｔ２）：（ａ）この第１ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する、このｃＤＮＡ分子の一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、および（ｂ）第２ＮＥＲＳのセンス鎖の配列、ならびに（ｉｉｉ）この第１ＮＥＲＳを認識する第１ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；この第２ＮＥＲＳを認識する第２ＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；（Ｂ）１本鎖核酸分子（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件にて、この混合物を維持する工程；ならびに（Ｃ）Ａ２を特徴付けして、このｃＤＮＡ分子中での連結部の存在または非存在を決定する工程。
【００２８】
ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する：（Ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびこのｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、（ｉ）この第１ＯＤＮＰは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列をこのアンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端付近に含み、（ｉｉ）この第２ＯＤＮＰは、エキソンＢのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列をこのセンス鎖中のエキソンＢの５’末端付近に含み、そして（ｉｉｉ）この第１ＯＤＮＰおよびこの第２ＯＤＮＰのうちの少なくとも一方は、第１ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；ならびに（Ｂ）エキソンＡおよびエキソンＢの両方がこのｃＤＮＡ中に存在するならば第１の１本鎖核酸（Ａ１）が増幅される条件下にて、この第１ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）の存在下で、第１増幅反応を行う工程；（Ｃ）５’から３’の向きで、以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む、第２の１本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程：（ｉ）第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的な配列；（Ｄ）エキソンＡおよびエキソンＢの両方が、このｃＤＮＡ分子中に存在するならば、Ａ１をテンプレートとして用いて、第３の１本鎖核酸フラグメント（Ａ２）が増幅される条件下にて、この第２ＮＡＲＳを認識する第２ＮＡの存在下で、第２増幅反応を行う工程；ならびに（Ｇ）Ａ２を検出および／または特徴付けして、このｃＤＮＡ分子中でのエキソンＡとエキソンＢとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程。
【００２９】
ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する：（Ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびこのｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、（ｉ）この第１ＯＤＮＰは、以下の（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）エキソンＡのアンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端付近に、このアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列、および（ｂ）第１ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列；そして（ｉｉ）この第２ＯＤＮＰは、以下の（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）エキソンＢのセンス鎖中のエキソンＢの５’末端付近に、このセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列、および（ｂ）第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列；（Ｂ）エキソンＡおよびエキソンＢの両方がこのｃＤＮＡ中に存在するならば第１の１本鎖核酸（Ａ１）が増幅される条件下にて、この第１ＮＡＲＳを認識する第１ニック形成剤（ＮＡ）およびこの第２ＮＡＲＳを認識する第２ＮＡの存在下で、第１増幅反応を行う工程；（Ｃ）５’から３’の向きで、以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む、第２の１本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程：（ｉ）第３のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的な配列；（Ｄ）エキソンＡおよびエキソンＢの両方が、このｃＤＮＡ分子中に存在するならば、Ａ１をテンプレートとして用いて、第３の１本鎖核酸フラグメント（Ａ２）が増幅される条件下にて、この第２ＮＡＲＳを認識する第３ＮＡの存在下で、第２増幅反応を行う工程；ならびに（Ｅ）Ａ２を検出および／または特徴付けして、このｃＤＮＡ分子中でのエキソンＡとエキソンＢとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程。
【００３０】
ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の接合部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２ＯＤＮＰ、およびｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、（ｉ）第１ＯＤＮＰは、（ａ）アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端付近のエキソンＡのアンチセンス鎖の一部に少なくとも実質的に相補的な配列、および（ｂ）第１ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列、を含み；そして（ｉｉ）第２ＯＤＮＰは、：（ａ）センス鎖中のエキソンＢの５’末端付近のエキソンＢのセンス鎖の一部に少なくとも実質的に相補的な配列、および（ｂ）第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む、工程；（Ｂ）エキソンＡおよびエキソンＢの両方がｃＤＮＡ分子中に存在する場合に、一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件下にこの混合物を維持する工程；ならびに（Ｃ）Ａ２を検出および／または特徴付けして、ｃＤＮＡ分子中のエキソンＡとエキソンＢとの間の接合部の存在または非存在を決定する工程。
【００３１】
以下の基準を単独または任意の組合せで使用して、上記および本明細書中の他の部分に概略を示すように本発明の方法をさらに記載し、ここでこれらの基準は、例示のみであり、そして本明細書の他の箇所に記述され得る他の基準をまた使用して、本発明の方法をさらに記載し得る：第１ＮＡＲＳは、第２ＮＡＲＳと同一である；第１ニック形成剤は、第２ニック形成剤と同じである；方法における任意の１つ以上のＮＡＲＳがＮＥＲＳである；第１ＮＡおよび第２ＮＡの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である；ＮＥが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである；ＮＥが、Ｎ．Ａｌｗ Ｉである；第１ＮＥおよび第２ＮＥの両方が、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである；第１ニック形成剤または第２ニック形成剤の少なくとも一方がニック形成エンドヌクレアーゼである；第１ＮＡおよび第２ＮＡの両方が、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である；第１ＮＡＲＳ、第２ＮＡＲＳおよび第３ＮＡＲＳ（３つのＮＡＲＳが、本発明の実施形態において特定される場合）が、互いに同一である；第１ＮＡＲＳ、第２ＮＡＲＳおよび第３ＮＡＲＳの各々が、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識される；第１ＮＡＲＳ、第２ＮＡＲＳおよび第３ＮＡＲＳの少なくとも１つが、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識される；この方法の、任意の１つ、または任意の２つ、または任意の３つ、または任意の４つ、または任意の５つ、または任意の６つ、または任意の７つ、または任意の８つ、または任意の９つ、または任意の１０などの工程（例えば、工程（Ａ）、工程（Ｂ）、工程（Ｃ）および工程（Ｄ）、または例えば、工程（ａ）〜工程（ｊ））が、単一の容器で行われる；一本鎖核酸フラグメントの増幅が、等温条件下で行われる；各増幅反応が、５０℃〜７０℃の範囲内の１つ以上の温度で行われる；各増幅反応が、６０℃または約６０℃で行われる；各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度から２０℃以内であり；各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度の１５℃以内であり；各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度の１０℃以内であり；各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度の５℃以内であり；Ｎ１が、第１ＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含み；Ｎ１が、第１ＮＥＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み；第１ＮＡおよび第２ＮＡの両方が、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）であり；Ｎ１が、トリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）および一本鎖核酸（Ｔ１）をアニーリングすることにより与えられ、ここでＴ１は、第１ＮＥＲＳのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド配列を含み；Ｎ１が、５’側から３’側に以下：（Ａ）第１ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列；および（Ｂ）トリガーＯＤＮＰの少なくとも一部に対して少なくとも実質的に相補的である配列、を含む一本鎖標的核酸（Ｔ１）に対してトリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）をアニーリングさせることにより与えられる場合、Ｔ１の配列（Ｂ）が、トリガーＯＤＮＰの少なくとも一部に正確に相補的である；Ｔ１がＴ２に対して実質的に同一である；Ｔ２の３’末端が、リン酸基に結合される；Ｔ１の３’末端が、リン酸基に結合される；Ｔ１が、Ｔ２と正確に同一である；Ｔ１が、Ｔ２に対して実質的にも正確にも同一でない；Ｎ１中のＮＡＲＳのアンチセンス鎖に対して５’側に位置するＮ１の部分に少なくとも実質的に同一であるＴ２のヌクレオチド配列が、実際に、第１ＮＡＲＳのアンチセンス鎖に対して５’側に位置するＮ１の部分に正確に同一である；Ｔ３が、テンプレート配列Ｔ２の少なくとも一部に少なくとも実質的に同一である配列を含む場合、一実施形態においてＴ３が、テンプレート配列Ｔ２の少なくとも一部に正確に同一である配列を含む；Ａ２が、Ａ１中のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む；Ａ２が、Ａ１中のヌクレオチド配列に正確に同一であるヌクレオチド配列を含む；Ａ１が、Ａ２中のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む；Ａ１が、Ａ２中のヌクレオチド配列に正確に同一であるヌクレオチド配列を含む；Ａ２およびＡ１が、同一である；Ａｌが、Ａ２と実質的に同一である；Ａ２が、Ａ１と実質的に同一である；Ａ１が、Ａ２と正確に同一である；Ａ１が、Ａ２と実質的に同一でも正確に同一でもない；Ａ１が、トリガーＯＤＮＰと実質的に同一である；Ａ１が、トリガーＯＤＮＰ正確に同一である；Ａ２が、トリガーＯＤＮＰと実質的に同一である；Ａ２が、トリガーＯＤＮＰと正確に同一である；Ａ１が、少なくとも５、もしくは少なくとも６、もしくは少なくとも７、もしくは少なくとも８、もしくは少なくとも９、もしくは少なくとも１０、もしくは少なくとも１１、もしくは少なくとも１２、もしくは少なくとも１３、もしくは少なくとも１４、もしくは少なくとも１５、もしくは少なくとも１６、もしくは少なくとも１７、もしくは少なくとも１８、もしくは少なくとも１９、もしくは少なくとも２０、もしくは少なくとも２１、もしくは少なくとも２２、もしくは少なくとも２３、もしくは少なくとも２４、もしくは少なくとも２５ヌクレオチド長であり、一方、さらにまたはあるいは、Ａ１は、４０以下、もしくは３９以下、もしくは３８以下、もしくは３７以下、もしくは３６以下、もしくは３５以下、もしくは３４以下、もしくは３３以下、もしくは３２以下、もしくは３１以下、もしくは３０以下、もしくは２９以下、もしくは２８以下、もしくは２７以下、もしくは２６以下、もしくは２５以下、もしくは２４以下、もしくは２３以下、もしくは２２以下、もしくは２１以下、もしくは２０以下、もしくは１９以下、もしくは１８以下、もしくは１７以下、もしくは１６以下、もしくは１５以下、もしくは１４以下、もしくは１３以下、もしくは１２以下、もしくは１１以下、もしくは１０以下のヌクレオチド長であり、ここで、Ａ１のヌクレオチド長に対する示された任意の上限は、Ａ１のヌクレオチド長に対する任意の示された下限と組み合わされ得、その結果、例えば、Ａ１は、８〜２４ヌクレオチド長であり得るか、１２〜１７のヌクレオチド長である；Ａ２は、少なくとも５、もしくは少なくとも６、もしくは少なくとも７、もしくは少なくとも８、もしくは少なくとも９、もしくは少なくとも１０、もしくは少なくとも１１、もしくは少なくとも１２、もしくは少なくとも１３、もしくは少なくとも１４、もしくは少なくとも１５、もしくは少なくとも１６、もしくは少なくとも１７、もしくは少なくとも１８、もしくは少なくとも１９、もしくは少なくとも２０、もしくは少なくとも２１、もしくは少なくとも２２、もしくは少なくとも２３、もしくは少なくとも２４、もしくは少なくとも２５ヌクレオチド長であり、一方、さらにまたはあるいは、Ａ２は、４０以下、もしくは３９以下、もしくは３８以下、もしくは３７以下、もしくは３６以下、もしくは３５以下、もしくは３４以下、もしくは３３以下、もしくは３２以下、もしくは３１以下、もしくは３０以下、もしくは２９以下、もしくは２８以下、もしくは２７以下、もしくは２６以下、もしくは２５以下、もしくは２４以下、もしくは２３以下、もしくは２２以下、もしくは２１以下、もしくは２０以下、もしくは１９以下、もしくは１８以下、もしくは１７以下、もしくは１６以下、もしくは１５以下、もしくは１４以下、もしくは１３以下、もしくは１２以下、もしくは１１以下、もしくは１０ヌクレオチド長であり、ここでＡ２のヌクレオチド長に対して述べた任意の上限は、Ａ２のヌクレオチド長に対して述べた任意の下限と組み合わされ得、その結果、Ａ２は、例えば、８〜２４ヌクレオチド長、または１２〜１７ヌクレオチド長であり得る；Ｔ２分子の最初の数が、Ｔ１分子の最初の数より多い；Ｎ１は、ゲノムＤＮＡ由来である；Ｎ１が、ゲノムＤＮＡの一部である；標的核酸が、変性二本鎖核酸の一方の鎖である；標的核酸が、二本鎖ゲノム核酸またはｃＤＮＡの一方の鎖である；標的核酸が、ＲＮＡ分子である；標的核酸が、細菌から得られた核酸由来である；標的核酸が、ウイルスから得られた核酸由来である；標的核酸が、真菌から得られた核酸由来である；標的核酸が、寄生生物由来の核酸由来である；トリガーＯＤＮＰが、二本鎖ゲノム核酸またはｃＤＮＡの一方の鎖である；トリガーＯＤＮＰが、ＲＮＡ分子である；トリガーＯＤＮＰが、細菌から得られた核酸由来である；トリガーＯＤＮＰが、ウイルスから得られた核酸由来である；トリガーＯＤＮＰが、真菌から得られた核酸由来である；トリガーＯＤＮＰが、寄生生物由来の核酸由来である；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが、標識される；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが、放射性標識に連結される；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが、酵素標識に連結される；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが、標識として機能する蛍光色素に連結される；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが、標識として機能するジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｄｅｎｉｎ）に連結される； デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが、ビオチンに連結される；方法の全ての工程において同じ型のＤＮＡポリメラーゼが使用される；ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損である；ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であり、そしてｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイム（ｈｏｍｏｅｎｚｙｍｅ）から選択され、ここでこれらの列挙されたＤＮＡポリメラーゼの任意の２つ以上が組み合わされて本発明の方法において使用されるＤＮＡポリメラーゼが選択される群を形成し得、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭ ＤＮＡポリメラーゼまたはｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼである；ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有する；各増幅反応が、鎖置換促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）の存在下で行われる；鎖置換促進因子が、増幅の間に使用され、ここでこの鎖置換促進因子は、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼ補助（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）サブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、子ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースの群から選択され、ここで本発明は、列挙した促進因子の任意の２つ以上を組み合わせて、本発明の実施形態を実施するために促進因子が選択される群を形成し得ることを提供する；鎖置換促進因子はトレハロースである。
【００３２】
本発明の方法のいずれも、増幅された核酸を検出する工程（例えば、定量的または定性的のいずれかでＡ２の形成を検出する工程）を包含し得るか、好ましくは包含する。一実施形態において、この検出は、発光分光法または分光測定法、蛍光分光法または分光測定法、質量分析、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、および電気泳動から選択される技術により少なくとも部分的に実行され、ここで列挙された技術の任意の２つ、３つ、４つまたはそれ以上のメンバーを、本発明の実施形態において利用される技術が選択され得る技術の群を形成するように一緒にグループ化し得る（例えば、検出は、質量分析または液体クロマトグラフィーにより実行され得る）。一実施形態において、検出は、二本鎖核酸に特異的に結合する蛍光インターカレート剤の使用を伴う。
【００３３】
さらなる局面において、本発明は、以下を提供する：
組成物であって、以下：（Ａ）一方の鎖が５’側から３’側に以下を含む、第１の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（例えば、本明細書中に記載されるＮ１またはＨ１）：（ｉ）多くとも２５ヌクレオチド長の配列、および（ｉｉ）第１ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列；ならびに（Ｂ）一方の鎖が、５’側から３’側に以下を含む、第２の少なくとも二本鎖の核酸分子（例えは、本明細書中に記載されるＮ２またはＨ２）：（ｉ）第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）第１核酸分子中の第１ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一な配列、を含む組成物。
【００３４】
組成物であって、以下：（ａ）一方の鎖が、第１ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列を含む、第１の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（例えば、本明細書中に記載されるＮ１またはＨ１）；ならびに（ｂ）一方の鎖が、５’側から３’側に以下を含む第２の少なくとも二本鎖の核酸分子（例えば、本明細書中に記載されるＮ２またはＨ２）：（ｉ）第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）第１核酸分子中の第１ＮＡＲＳのセンス鎖の配列に対して３’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である配列、を含み、ここで第１ＮＡＲＳを認識するニック形成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のヌクレオシド三リン酸の存在下において、第１核酸分子をテンプレートとして使用して増幅された一本鎖核酸フラグメントは、多くとも２５個のヌクレオチドを有する。
【００３５】
これらの組成物において、以下のさらなる基準および／または成分を使用して、組成物を記載し得、そして本発明の方法に関しては上記の基準も同様である：この組成物は、第１ＮＡＲＳを認識する第１ＮＡおよび第２ＮＡＲＳを認識する第２ＮＡをさらに含む；この組成物は、第１ＮＡＲＳおよび第２ＮＡＲＳの両方を認識するニック形成剤をさらに含む；この組成物は、第１ＮＥＲＳおよび第２ＮＥＲＳの両方を認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）をさらに含む；この組成物は、第１ＮＡＲＳおよび第２ＮＡＲＳの両方を認識するニック形成剤（ＮＡ）をさらに含む；この組成物は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉをさらに含む；この組成物は、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む；この組成物は、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であるＤＮＡポリメラーゼをさらに含む；この組成物は、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ，９°ＮｍＴＭ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイム（ｈｏｍｏｅｎｚｙｍｅ）からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼをさらに含む；この組成物は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼをさらに含む；この組成物は、鎖置換促進因子をさらに含む；この組成物は、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼ補助サブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、子ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースの群から選択される鎖置換促進因子をさらに含み、ここでこの群の１つ以上のメンバーは、組み合わされて、本発明の実施形態において促進因子が選択される群を形成し得る；この組成物は、トレハロースを含む；この組成物は、標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸を含む。この組成物は、Ｔ２中の第２ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である標識されたオリゴヌクレオチドを含む。この組成物は、蛍光インターカレート剤を含む。
【００３６】
ＮＡＲＳを含む本発明の方法または化合物または組成物のいずれかにおいて、このＮＡＲＳは、１つ以上のミスマッチヌクレオチドを含み得る。換言すると、ＮＡＲＳを形成するヌクレオチド塩基対の１つ以上は、従来のワトソン−クリック塩基対合則に従ってハイブリダイズしないかもしれない。しかし、ミスマッチヌクレオチドがこのＮＡＲＳに存在する場合、少なくともＮＡＲＳのセンス鎖を形成するのに必要な全てのヌクレオチドが存在する。一実施形態において、ＮＡＲＳにミスマッチ塩基対が存在せず、さらにこのＮＡＲＳに存在する全てのヌクレオチドが相補鎖中のヌクレオチドと、従来のワトソン−クリック塩基対合則に従って対になる。一実施形態において、ＮＡＲＳは、ミスマッチ塩基対を含む。一実施形態において、ＮＡＲＳに１つのミスマッチ塩基対が存在するが、別の実施形態では、ＮＡＲＳに２つのミスマッチ塩基対が存在し、別の実施形態では、ＮＡＲＳを形成する全ての塩基対が、ミスマッチであり、別の実施形態では、ＮＡＲＳを形成する塩基対のｎ−１個はミスマッチであり、ここでｎ個の塩基対がＮＡＲＳを形成する。本発明が第１ＮＡＲＳおよび第２ＮＡＲＳの両方を利用する一実施形態において、第１ＮＡＲＳに存在するミスマッチはまた、第２ＮＡＲＳにも存在する。本発明が第１ＮＡＲＳおよび第２ＮＡＲＳの両方を利用する一実施形態において、第１ＮＡＲＳに存在するミスマッチは、第２ＮＡＲＳには存在しない。本発明が第１ＮＡＲＳおよび第２ＮＡＲＳの両方を利用する一実施形態において、第１ＮＡＲＳは、ミスマッチ塩基対を含まないが、第２ＮＡＲＳは、１つ以上のミスマッチ塩基対を含む。一実施形態において、ＮＡＲＳ中にマッチしないヌクレオチドが存在する。別の実施形態において、ＮＡＲＳのセンス鎖を形成するヌクレオチドがマッチしない。別の実施形態において、ＮＡＲＳは、マッチしないヌクレオチドを含む。
【００３７】
また、本発明の方法、化合物および組成物において、１つ以上の核酸分子は、固体支持体に固定化され得る。代表的に、この固定化は、ハイブリダイズした物質とハイブリダイズしていない物質の予備的分離を可能にする。種々の実施形態において：第１ＯＤＮＰが固定化される；第２ＯＤＮＰが固定化される；第１ＯＤＮＰおよび第２ＯＤＮＰの両方が固定化される；標的核酸が固定化される；Ｔ２、または各Ｔ２が固定化される；固定化が、共有結合を介して固体支持体に対するものである。適切な固体支持体は、シリカ、プラスチックおよび金属のような材料から作製される。
【００３８】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかとなる。
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ニック形成剤を使用する、核酸の指数関数的な増幅のための単純かつ効率的な方法およびキットを提供する。この増幅は、等温的に行なわれ得、転写ベースではない。これらの方法およびキットは、遺伝的バリエーションの検出、病原体または疾患の診断、および差次的スプライシング分析のような多くの領域において有用である。
【００４０】
（取り決め／定義）
本発明のより詳細な説明を提供する前に、以下のように、本明細書中で使用される場合の取り決めを規定し、そして定義を提供することは、本発明の理解により有用であり得る。さらなる定義もまた、本発明の記載の全体にわたって提供される。
【００４１】
用語「３’」および「５’」は、核酸の一本鎖内の特定の部位の位置を記載するために、本明細書中で使用される。核酸内の位置が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対して３’（側）」または「の３’（側）」である場合、これは、その位置が参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の３’末端と核酸の鎖の３’ヒドロキシルとの間に位置することを意味する。同様に、核酸内の位置が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対して５’（側）」または「の５’（側）」である場合、これは、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の５’末端と核酸のその鎖の５’リン酸との間に位置することを意味する。さらに、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対してすぐ３’（側）」または「のすぐ３’（側）」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の３’末端にすぐ隣接することを意味する。同様に、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対してすぐ５’（側）」または「のすぐ５’（側）」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の５’末端にすぐ隣接することを意味する。
【００４２】
「天然に存在する核酸」とは、天然に存在する核酸分子（例えば、全長ゲノムＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子）をいう。
【００４３】
「単離された核酸分子」とは、任意の天然に存在する核酸に対して、または３つより多くの別々の遺伝子にわたる天然に存在するゲノム核酸の任意のフラグメントの核酸分子に対して同一でない、核酸分子をいう。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「ニック形成」は、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子の二本鎖の部分の、ニック形成を行う酵素によって認識されるヌクレオチド配列に対する特定の位置での一方の鎖のみの切断をいう。核酸がニック形成される特定の位置は、「ニック形成部位」（ＮＳ）といわれる。
【００４５】
「ニック形成剤」（ＮＡ）は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの認識配列に対して特定の位置で核酸分子の一方の鎖のみを切断する酵素である。ニック形成剤としては、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子が、半改変された認識／切断配列を含む場合、ニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）および制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＨｉｎｃＩＩ）が挙げられるがこれらに限定されず、この半改変された認識／切断配列において、一本の鎖は、制限エンドヌクレアーゼによるその鎖（すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖）の切断を阻止する少なくとも１つの誘導体化されたヌクレオチドを含む。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「ニック形成エンドヌクレアーゼ」（ＮＥ）は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、そして認識配列に対して特定の位置で核酸分子の一方の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼをいう。少なくとも１つの誘導体化されたヌクレオチドを含むことによって改変され、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の誘導体化されたヌクレオチド含有鎖の切断を阻止する、その認識配列を必要とする、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）と違って、ＮＥは、代表的に、ネイティブなヌクレオチドのみを含むヌクレオチド配列を認識し、そしてこのヌクレオチド配列を含む完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の一方の鎖のみを切断する。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「ネイティブなヌクレオチド」は、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸またはウリジル酸をいう。「誘導体化されたヌクレオチド」は、ネイティブなヌクレオチドではないヌクレオチドをいう。
【００４８】
ＮＡが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成剤認識配列」（ＮＡＲＳ）といわれる。同様に、ＮＥが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列」（ＮＥＲＳ）といわれる。ＲＥが認識する特定の配列は、「制限エンドヌクレアーゼ認識配列」（ＲＥＲＳ）といわれる。本明細書中で使用される場合、「半改変されたＲＥＲＳ」は、認識配列の一方の鎖が、少なくとも１つの誘導体化されたヌクレオチド（例えば、α−チオデオキシヌクレオチド）を含み、これは、ＲＥＲＳを認識するＲＥによるその鎖（すなわち、認識配列内に誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖）の切断を阻止する二本鎖ＲＥＲＳをいう。
【００４９】
特定の実施形態において、ＮＡＲＳは、配列の一方の鎖の各ヌクレオチドが、もう一方の鎖の対応する位置のヌクレオチドに対して相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である。このような実施形態において、ＮＡＲＳを認識するＮＡによってニック形成可能なＮＳを含む鎖におけるＮＡＲＳの配列は、「ＮＡＲＳのセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＡＲＳのセンス鎖の配列」といわれ、一方、ＮＳを含まない鎖におけるＮＡＲＳ配列は、「ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列」といわれる。
【００５０】
同様に、ＮＥＲＳが、一方の鎖がもう一方の鎖に厳密に相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である実施形態において、ＮＥＲＳを認識するＮＥによってニック形成可能なＮＳを含む鎖に位置するＮＥＲＳの配列は、「ＮＥＲＳのセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＥＲＳのセンス鎖の配列」といわれ、一方、ＮＳを含まない鎖に位置するＮＥＲＳの配列は、「ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」といわれる。例えば、例示的なニック形成エンドヌクレアーゼ（Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）の認識配列およびニック形成部位は、以下に示され、切断部位を示すために「黒逆三角形」を用い、そして任意のヌクレオチドを示すためにＮを用いる：
【００５１】
【化１】
【００５２】
Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＧＴＣ−３’であるのに対して、アンチセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＣＴＣ−３’である。
【００５３】
同様に、半改変されたＲＥＲＳを認識するＲＥによってニック形成可能なＮＳを含む鎖（すなわち、いずれの誘導体化されたヌクレオチドも含まない鎖）に位置する半改変されたＲＥＲＳの配列は、「半改変されたＲＥＲＳのセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたＲＥＲＳを含む核酸の「半改変されたＲＥＲＳのセンス鎖」に位置し、一方、ＮＳを含まない鎖（すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖）における半改変されたＲＥＲＳの配列は、「半改変されたＲＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたＲＥＲＳを含む核酸の「半改変されたＲＥＲＳのアンチセンス鎖」に位置する。
【００５４】
特定の他の実施形態において、ＮＡＲＳは、１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する最大限に部分的に二本鎖のヌクレオチド配列であるが、上記されるような二本鎖のＮＡＲＳのインタクトなセンス配列を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、ＮＡＲＳを記載する文脈において、２つの核酸分子が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物がＮＡＲＳを含み、そしてハイブリダイズされた産物のＮＡＲＳ内に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在する場合、このＮＡＲＳは、単に部分的に二本鎖であると考えられる。このようなＮＡＲＳは、特定のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性に対して二本鎖認識配列の一方の鎖のみを必要とする。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩのＮＡＲＳは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得：
５’−ＧＡＧＴＣ−３’
３’−ＮＮＮＮＮ−５’
ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドを示し、１つの位置のＮは、他の位置のＮと同一であってもそうでなくてもよいが、この認識配列の中に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在する。この状況において、ＮＡＲＳは、少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを有するとして特徴付けられる。
【００５５】
特定の他の実施形態において、ＮＡＲＳは、１つ以上の一致していないヌクレオチドを有する部分的または完全に一本鎖のヌクレオチド配列であるが、上記されるように、二本鎖ＮＡＲＳのインタクトなセンス鎖を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、ＮＡＲＳを記載する文脈において、２つの核酸分子（すなわち、第１および第２の鎖）が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物が、ＮＡによって認識される第１の鎖内のヌクレオチド配列を含み（すなわち、ハイブリダイズされた産物は、ＮＡＲＳを含む）、そしてＮＡによって認識される配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが、ハイブリダイズされた産物が形成される場合に、第２の鎖中のヌクレオチドに対応しない（すなわち、それと向かい合わない）場合、このハイブリダイズされた産物のＮＡＲＳ内に少なくとも１つの一致しないヌクレオチドが存在し、そしてこのＮＡＲＳが部分的または完全に一本鎖であると考えられる。このようなＮＡＲＳは、特定のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性のために、二本鎖認識配列の一方の鎖のみを必要とする。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩのＮＡＲＳは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得：
５’−ＧＡＧＴＣ−３’
３’−Ｎ０−４−５’
（ここで、「Ｎ」は、任意のヌクレオチドを示し、０−４は、ヌクレオチド「Ｎ」の数を示し、１つの位置での「Ｎ」は、別の位置での「Ｎ」と同じであってもそうでなくてもよい）、この鎖は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの二本鎖認識配列のセンス鎖の配列を含む。この例において、相補鎖中の対応するヌクレオチドが存在しないという点において、Ｇ、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣの少なくとも１つは、一致しない。この状況は、例えば、ハイブリダイズされた産物中に「ループ」が存在し、特に、センス配列がループ内に完全にまたは部分的に存在する場合、生じる。
【００５６】
本明細書中に使用される場合、句「核酸分子を増幅すること」または「核酸分子の増幅」は、特定の核酸分子の２つ以上のコピーを作製することをいう。「核酸分子を指数関数的に増幅すること」または「核酸分子の指数関数的増幅」は、２つ以上の核酸増幅反応を含むタンデムな増幅系による、特定の核酸分子の増幅をいう。このような系において、第１の増幅反応からの増幅産物は、第２の核酸増幅反応のための、開始増幅プライマーとして機能する。本明細書中で使用される場合、用語「核酸増幅反応」は、核酸分子（Ｔ）を使用して、核酸分子（Ａ）の１つより多くのコピーを作製するためのプロセスをいい、この核酸分子（Ｔ）は、テンプレートとして核酸分子Ａの配列に相補的な配列を含む。本発明に従って、第１および第２の核酸増幅反応の両方は、ニック形成反応およびプライマー伸長反応を使用する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「開始プライマー」は、テンプレート核酸にアニールするプライマーであり、核酸増幅反応を開始する。開始プライマーは、開始プライマー伸長のためのプライマーとして機能しなければならないが、任意の続いてのプライマー伸長のためのプライマーである必要はない。例えば、プライマーＡ１がテンプレート核酸Ｔ１の一部にアニールし、このテンプレート核酸Ｔ１が、ＮＡＲＳのセンス鎖に対して３’側の位置で、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含むと仮定のこと。ＤＮＡポリメラーゼの存在下において、Ａ１の３’末端は、二本鎖ＮＡＲＳを含む、二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子（Ｈ１）を産生するためのテンプレートとしてＴ１を使用して伸長される。ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下において、Ｈ１は、開始プライマーＡ１に相補的な鎖においてニック形成される。ニック形成部位に３’末端を含み、開始プライマーＡ１を含まない鎖は、ＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下において、続いてのプライマー伸長のためのプライマーとして機能し得る。Ａ１は、開始プライマーとみなされるが、第１のプライマー伸長に対してのみプライマーとして機能するが、続いてのプライマー伸長に対しては、プライマーとして機能しない。
【００５８】
「トリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）」は、タンデム核酸増幅系の第１の核酸増幅反応におけるプライマーとして機能するＯＤＮＰである。これは、この系の他の必要とされる成分（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＮＡ、デオキシヌクレオシド三リン酸、第１の増幅反応のためのテンプレート（Ｔ１）、および第２の増幅反応のためのテンプレート（Ｔ２））の存在下で、核酸分子の指数関数的増幅を誘発する。特定の実施形態において、第１の増幅反応のためのテンプレート（Ｔ１）がＮＡＲＳの一方の鎖の配列を含む場合、トリガーＯＤＮＰは、ＮＡＲＳの他方の鎖の配列を含み得る。トリガーＯＤＮＰは、標的核酸由来であり得るか、または化学的に合成され得る。
【００５９】
第１の核酸が、第２の核酸の消化産物または第２の核酸分子もしくはテンプレートとしてその相補物の一部を使用した増幅産物のいずれかである場合、第１の核酸分子（「第１の核酸」）が、別の核酸分子（「第２の核酸」）「に由来する」かまたは別の核酸分子（「第２の核酸」）「から生じる」。第１の核酸分子は、第２核酸の少なくとも一部と厳密に同一である配列または厳密に相補的である配列を含まなければならない。
【００６０】
第１の配列の相補物が、所定の反応混合物（例えば、核酸増幅混合物）中の第２の配列にアニールし得る場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に「少なくとも実質的に同一」である。特定の好ましい実施形態において、第１の配列は、第２の配列に「厳密に同一」であり、つまり、各位置での第１の配列のヌクレオチドは、同じ位置での第２の配列のヌクレオチドと同一であり、第１の配列は、第２の配列と同じ長さである。
【００６１】
第１の配列が、所定の反応混合物（例えば、核酸増幅混合物）中の第２の配列にアニールし得る場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と「少なくとも実質的に相補的」である。特定の好ましい実施形態において、第１の配列は、第２の配列に「厳密にまたは完全に相補的」であり、つまり、第１の配列の各ヌクレオチドは、その対応する位置で第２の配列のヌクレオチドと相補的であり、第１の配列は、第２の配列と同じ長さである。
【００６２】
本明細書中で用いられる場合、２本鎖核酸の他方の鎖（「第２鎖」のことをいう）中の別の位置（例えば、規定された位置）「に対応する」位置に位置する２本鎖核酸の一方の鎖（「第１鎖」のことをいう）中のヌクレオチドは、第２鎖中の対応する位置のヌクレオチドに相補的な第１鎖中のヌクレオチドのことをいう。同様に、２本鎖核酸の他方の鎖（「第２鎖」のことをいう）内のニック形成部位に対応する２本鎖核酸の一方の鎖（「第１鎖」のことをいう）中の位置は、第２鎖中の２つのヌクレオチドに相補的な（この間にニック形成が生じる）第１鎖中の２つのヌクレオチド間の位置のことをいう。
【００６３】
核酸配列（または領域）は、この核酸配列が、他の核酸配列に対して５’側に配置される場合、その別の核酸配列（または領域）に対して「上流」にある。核酸配列（または領域）は、この核酸配列が、他の核酸配列に対して３’側に配置される場合、その別の核酸配列（または領域）に対して「下流」にある。
【００６４】
（Ａ．核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物）
本発明は、ニック形成エンドヌクレアーゼを使用する、核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。最初に、以下の節は、この方法の一般的説明を提供し、続いて、２つの型の核酸増幅、および核酸増幅のための組成物またはキットの説明を提供する。
【００６５】
（１．一般的説明）
１つの局面において、本発明は、核酸の指数関数的増幅のための単純かつ迅速な方法を提供する。これは、ニック形成剤（ＮＡ）およびＤＮＡポリメラーゼの組合せによって触媒される、２つ以上の連結された増幅反応（すなわち、タンデム増幅系）を使用する。各増幅反応は、ＮＡが、ＮＡの認識配列を含む二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子にニック形成する能力、およびＤＮＡポリメラーゼが、ＮＡのニック形成部位（ＮＳ）において３’末端から伸長する能力に基づく。
【００６６】
第１の増幅反応（図１）において、トリガーＯＤＮＰは、ＮＡＲＳの一方の鎖の配列（「第１のＮＡＲＳ」と呼ばれる）を含む第１のテンプレート核酸（Ｔ１）にハイブリダイズして、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子（「第１の増幅反応の開始核酸分子（Ｎ１）」）を形成する。トリガーＯＤＮＰは、第１のＮＡＲＳの他方の鎖を含まず、Ｔ１中の第１のＮＡＲＳの鎖の３’側に配置されるＴ１の一部にハイブリダイズするか、または第１のＮＡＲＳの他方の鎖を含み、その結果、Ｔ１へのそのハイブリダイゼーションが、二本鎖の第１のＮＡＲＳを含む核酸分子を形成するかのいずれかである。５’末端においてＴ１の一部が、Ｎ１における５’突出部を形成する場合、ＤＮＡポリメラーゼ（「第１のＤＮＡポリメラーゼ」と呼ばれる）の存在下で、トリガーＯＤＮＰは、テンプレートとしてＴ１を使用して、伸長されて、二本鎖の第１のＮＡＲＳを含むハイブリッド（Ｈ１）を形成する（図１の工程（ａ））。得られるＨ１は、第１のＮＡＲＳを認識するＮＡによってニック形成され得、ニック形成部位において３’末端および５’末端を作製する（工程（ｂ））。ニック形成部位において５’末端を含むフラグメント（「Ａ１」と呼ばれる）が十分に短い（例えば、１８ヌクレオチド長未満）場合、そのフラグメントは、解離的反応条件下（例えば、６０℃）でＨ１の他の部分から解離する。しかし、このフラグメント（すなわち、Ａ１）が容易に解離しない場合、これは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であり、そして鎖置換活性を有する第１のＤＮＡポリメラーゼの存在下で、ＮＳにおいて残りのフラグメントのその３’末端からの伸長により、置換され得る（工程（ｄ））。鎖置換はまた、鎖置換促進剤が存在する場合、第１のＤＮＡポリメラーゼにおける鎖置換活性の非存在下で生じ得る。このような伸長は、第１のＮＡにおけるように、再びニック形成（「再ニック形成」）され得る第１のＮＡについての新たなＮＳを再び作製する。新たなＮＳにおいて５’末端を含むフラグメント（すなわち、新たなＡ１）が、再び、Ｈ１の他の部分から容易に解離し得るか、またはＮＳにおいて３’末端からの伸長によって置換され得る（工程（ｆ））。ニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得（工程（ｇ））、核酸フラグメントＡ１の直線的な蓄積／増幅を生じる。
【００６７】
核酸分子の指数関数的増幅は、この第１増幅反応から増幅されたフラグメントＡ１を介して、上記の第１増幅反応と第２増幅反応とを合わせるかまたは結び付けることによって行われ得る。第２増幅反応（図２）では、Ａ１は、第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む、別の１本鎖核酸分子（Ｔ２）の一部分へとハイブリダイズする。得られる部分的に２本鎖の核酸分子は、「第２増幅反応の開始核酸分子（Ｎ２）」といわれる。Ｔ２のうちの、Ａ１がハイブリダイズする部分は、第２ＮＡＲＳのセンス鎖の配列の３’側に位置し、その結果、Ａ１は、Ｔ２をテンプレートとして用いたプライマー伸長反応についての開始プライマーとして機能する。Ａ１からの伸長は、２本鎖の第２ＮＡＲＳを含むハイブリッド（Ｈ２）を生成する（図２の工程（ａ））。第２ＮＡＲＳを認識する第２ＮＡの存在下では、Ｈ２がニック形成され、このニック形成部位にて３’末端および５’末端を生成する（工程（ｂ））。このニック形成部位にて５’末端を含むフラグメントが充分に短い（例えば、１８ヌクレオチド長未満）である場合、これは、特定の反応条件（例えば、６０℃にて）下で、Ｈ２の他方の部分から解離し得る。しかし、このフラグメントがＨ２の他方の部分から容易に解離されない場合、これは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であって、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（「第２ＤＮＡポリメラーゼ」という）の存在下で、このＮＳにて３’末端を有するフラグメントの伸長によって置換され得る（工程（ｃ））。鎖置換はまた、この第２ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性がなくとも、鎖置換促進因子の存在下で生じ得る。このような伸長は、第２ＮＡによって再度ニック形成され得る（「再ニック形成され得る」）、第２ＮＡについての新たなＮＳを再度作製する（工程（ｄ））。この新たなＮＳにて５’末端を含むフラグメント（「Ａ２という」）は、Ｈ２の他方の部分から再度容易に解離し得るか、またはこのＮＳにおける３’末端から伸長によって置換され得る（工程（ｅ））。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得（工程（ｆ））、この核酸フラグメントＡ２の指数関数的な蓄積／増幅を生じる。この増幅された１本鎖核酸フラグメントＡ２は、Ａ１と少なくとも実質的に相補的である。Ａ２は、Ａ１と同じ長さである場合、Ａ１と完全に相補的であり得る。
【００６８】
１つの局面において、本発明は、核酸分子（Ａ２）を増幅する方法を提供する。この方法は、（ａ）一本鎖核酸分子（Ａ１）を提供する工程；（ｂ）５’から３’にむかって、（ｉ）ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的な配列を含む、第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程；ならびに（ｃ）Ｔ２、Ａ１、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、および１種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、Ａ２を増幅する工程（ここで、Ａ２は、Ａ１に少なくとも実質的に相補的であり、Ａ１、Ａ２またはその両方は、２５ヌクレオチド長以下である）を包含する。Ａ１が提供され得る例示の手段は、本明細書中に記載される。
【００６９】
本発明の指数関数的核酸増幅法は、Ｔ２がＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含むことを必要とするが、Ｔ１は、ＮＡＲＳのセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列を含み得る。これらの２つの型の核酸増幅反応は、第１ＮＡＲＳおよび第２ＮＡＲＳの両方についての例としてＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列を使用して、図３および４に例示される。しかし、当業者は、Ｔ１およびＴ２が、他のニック形成剤の認識配列を含みうることを理解する。
【００７０】
本発明に従う核酸増幅の第１型は、Ｔ１が第１ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む場合である。図３に示されるように、第１増幅反応について、開始核酸分子Ｎ１は、トリガーＯＤＮＰと、３つの領域（領域Ｘ１、Ｙ１、およびＺ１）を有するＴ１とをアニーリングすることによって形成される、部分的に二本鎖の核酸分子である。領域Ｘ１、Ｙ１、およびＺ１は、それぞれ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列のアンチセンス鎖の配列のすぐ３’側の領域、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列のアンチセンス鎖の配列の３’末端からトリガーＯＤＮＰの伸長産物中のＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉのニック形成部位の３’末端ヌクレオチドに対応するヌクレオチドまでの領域（すなわち、３’−ＣＡＣＡＧＮＮＮＮ−５’（ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣであり得る））、および領域Ｙ１のすぐ５’側の領域として規定される。トリガーＯＤＮＰは、領域Ｘ１に少なくとも実質的に相補的であり、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で核酸伸長のためのプライマーとして機能する。その伸長産物（Ｈ１）は、トリガーＯＤＮＰの５’末端配列が、領域Ｘ１の３’末端配列にアニールするか否かに依存して、完全に二本鎖または部分的に二本鎖であり得る。Ｈ１は、二本鎖Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列を含むので、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉによりニック形成され得る。特定の実施形態において、Ｔ１の３’末端は、例えば、リン酸基によりブロックされ、その結果、この末端からの伸長が防止される。トリガーＯＤＮＰの配列を含むニック形成産物は、ＤＮＡポリメラーゼによって、ニック形成部位で、その３’末端から再度伸長され得、ニック形成部位で、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉによって生成される５’末端を含む鎖を置換する。ニック形成−伸長サイクルは、複数回反復され、置換された鎖（Ａ１）が蓄積される。
【００７１】
次いで、第１増幅反応の産物Ａ１は、第２増幅反応のための開始プライマーとして使用される。Ｔ２の領域Ｘ２（これはまた、さらなる２つの領域（領域Ｙ２およびＺ２）を含む）にアニーリングされ、第２増幅反応のための開始核酸分子Ｎ２が形成される。領域Ｙ２は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列のセンス鎖の配列およびその配列のすぐ３’側の４つのヌクレオチド（すなわち、３’−ＮＮＮＮＣＴＧＡＧ−５’（ここで、Ｎの各々は、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであり得る）からなる）のに対し、領域Ｘ２およびＺ２は、それぞれ、領域Ｙ２の３’末端および５’末端にすぐ隣接する領域をいう。Ｔ２をテンプレートとして用いるＡ１の伸長により、Ａ１の５’末端配列が、領域Ｘ２の３’末端配列にアニーリングするか否か依存して、完全な二本鎖または部分的に二本鎖であり得るの伸長産物（Ｈ２）が提供される。Ｈ２は、二本鎖Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列を含むので、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの存在下でニック形成され得る。ニック形成部位の得られる３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって、再度伸長され得、領域Ｘ２を置換する。ニック形成−伸長サイクルは、複数回反復され、ニック形成部位にて５’末端を含む、置換された鎖Ａ２が蓄積／増幅される。Ａ２は、Ａ１の５’末端配列が、領域Ｘ２の３’末端配列にアニールする場合に領域Ｘ２と正確に同一である。さもなければ、Ａ２および領域Ｘ２は、それらが異なる長さを有する場合、互いに実質的に相補的である。Ａ２の増幅は、親数関数的である。なぜならば、それは、２つの関連した線形増幅反応の最終増幅産物であるからである。
【００７２】
本発明に従う第２型の核酸増幅は、Ｔ１が第１ＮＡＲＳのセンス鎖配列を含む場合である。好ましくは、この第１ＮＡＲＳは、第２ＮＡＲＳに同一である。センス鎖配列の配列がＴ１およびＴ２の両方中に存在する例示的ＮＡとして、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉを使用して、この型の核酸増幅を、図４に例示する。
【００７３】
図４に示されるように、第１増幅反応について、開始核酸分子Ｎ１は、トリガーＯＤＮＰを、３つの領域（領域Ｘ１、領域Ｙ１および領域Ｚ１）を有するＴ１とアニーリングすることによって形成される、部分的に２本鎖の核酸分子である。領域Ｘ１、領域Ｙ１および領域Ｚ１は、それぞれ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩによるＮ１の伸長産物（すなわちＨ１）のニック形成部位の直ぐ３’側の領域、ニック形成部位からＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列のセンス鎖配列の５’末端までの領域（すなわち、５’−ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’（ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣであり得る））、および領域Ｙ２の直ぐ５’側の領域として規定される。このトリガーＯＤＮＰは、領域Ｘ１またはその一部に少なくとも実質的に相補的であり、そしてＤＮＡポリメラーゼの存在下で核酸伸長のためのプライマーとして機能する。この伸長産物（Ｈ１）は、トリガーＯＤＮＰの５’末端配列が、領域Ｘ１の３’末端配列にアニーリングするか否かに依存して、完全に二本鎖のまたは部分的に２本鎖であり得る。Ｈ１は、２本鎖のＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列を含むので、これは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉによってニック形成され得る。特定の実施形態において、Ｔ１の３’末端は、この末端からの伸長を妨げるように、例えば、リン酸基でブロックされる。Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列のセンス鎖の配列を含むニック形成産物は、ＤＮＡポリメラーゼによって、ニック形成部位でのその３’末端から再度伸長されて、ニック形成部位で、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉによって生成される５’末端を含む鎖を置換し得る。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返されて、ニック形成部位の５’末端を含む、置換された鎖Ａ１の蓄積を生じる。
【００７４】
次いで、第１増幅反応の産物Ａ１は、第２増幅反応のための開始プライマーとして使用される。これは、Ｔ２の領域Ｘ２（これは、２つのさらなる領域、すなわち領域Ｙ２および領域Ｚ２を含む）にアニーリングされて、第２増幅反応のための開始核酸分子Ｎ２を形成する。領域Ｙ２は、領域Ｙ１に類似しており、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列のセンス鎖配列、およびＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列のセンス鎖配列の直ぐ３’側に位置する４つのヌクレオチド（すなわち、５’−ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’（ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣであり得る））を有する。領域Ｘ２および領域Ｚ２は、それぞれ、領域Ｙ２の３’末端および５’末端の直ぐ隣の領域をいう。テンプレートとしてＴ２を使用するＡ１の伸長は、Ａ１の５’末端配列が領域Ｘ２の３’末端配列にアニーリングするかどうかに依存して、完全に２本鎖または部分的に２本鎖であり得る伸長産物（Ｈ２）を提供する。Ｈ２は、２本鎖Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列を含むので、これはＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉによってニック形成され得る。ニック形成部位での得られた３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって再度伸長されて、領域Ｘ２を置換し得る。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返されて、ニック形成部位の５’末端を含む、置換された鎖Ａ２の蓄積／増幅を生じる。Ａ２のこの増幅は、指数関数的である。なぜなら、これは２つの関連した線形増幅反応の最終増幅産物であるからである。
【００７５】
本発明の方法は、２つの核酸増幅反応を一緒に関連づけることに制限されない。特定の実施形態では、第２増幅反応は、第３増幅反応とさらに結び付けられ得る。言い換えれば、この第２増幅反応の間に増幅された核酸分子Ａ２は、ＮＡＲＳ（「第３ＮＡＲＳ」という）の１つの鎖の配列を含む別の核酸分子「Ｔ３」の一部分へとアニーリングして、第３増幅反応における核酸分子「Ａ３」の増幅を誘発し得る。さらなる増幅反応が、この鎖に付加され得る。例えば、Ａ３は次いで、ＮＡＲＳ（「第４ＮＡＲＳ」という）の１つの鎖をまた含む別の核酸分子「Ｔ４」の一部分へとアニーリングして、第４増幅反応において、核酸分子「Ａ４」の増幅を開始し得る。その後の各増幅反応は、その以前の増幅反応からの増幅フラグメントの線形増幅をもたらすので、この系の他の成分（例えば、テンプレート核酸分子、ＮＡ、およびＤＮＡポリメラーゼ）が増幅速度もレベルも制限しなければ、増幅系における増幅反応の数が多いほど、増幅レベルが高い。
【００７６】
（ａ．ニック形成剤）
上記のとおり、本発明の指数関数的核酸増幅方法は、２以上の核酸増幅反応を一緒に結び付け、そして各増幅反応は、ＮＡの存在下で行われる。１つの増幅反応についてのＮＡは、別の増幅反応についてのＮＡと異なり得る。１つの実施形態では、異なる増幅反応についてのＮＡは、互いに同一であり、その結果、たった１つのＮＡが核酸分子の指数関数的増幅に必要とされる。別の実施形態では、２つの異なるＮＡ（例えば、異なるＮＡＲＳを認識する２つのＮＡ）が用いられる。
【００７７】
特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの配列を含む完全または部分的に２本鎖の核酸の１つの鎖のみを切断する任意の酵素が、本発明においてニック形成剤として使用され得る。このような酵素は、ネイティブなヌクレオチドから構成される特定の配列を認識するＮＥ、または半改変認識配列を認識するＲＥであり得る。
【００７８】
ニック形成エンドヌクレアーゼは、その認識配列と重なるニック形成部位を有しても有さなくてもよい。その認識配列の外側にニックを形成する例示的なＮＥは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉであり、これは、５’−ＧＡＧＴＣ−３’から構成される独特の核酸配列を認識するが、この認識配列の３’末端を４ヌクレオチド超えたところにニック形成する。Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列およびニック形成部位を、以下：
【００７９】
【化２】
【００８０】
によって示し、ここで、「下向き黒三角」は、は、切断部位を示し、文字Ｎは、任意のヌクレオチドを示す。Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉは、米国特許第６，１９１，２６７号に記載されるようにして、調製および単離され得る。このニック形成エンドヌクレアーゼを使用するための緩衝液および条件はまた、この’２６７特許に記載される。その認識配列の外側にニック形成するさらなる例示的なＮＥは、Ｎ．ＡｌｗＩであり、これは、以下の２本鎖認識配列を認識する：
【００８１】
【化３】
【００８２】
Ｎ．ＡｌｗＩのニック形成部位もまた、記号「下向き黒三角」により示される。両方のＮＥは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から入手可能である。Ｎ．ＡｌｗＩはまた、Ｘｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１２９９０−５，２００１）に記載されるように、ＩＩｓ型ＲＥ ＡｌｗＩを変異させることによって、調製され得る。
【００８３】
そのＮＥＲＳ内にニック形成する例示的なＮＥとしては、Ｎ．ＢｂｖＣＩ−ａおよびＮ．ＢｂｖＣＩ−ｂが挙げられる。これら２つのＮＥおよびＮＳの認識配列（記号「下向き黒三角」で示す）を、以下に示す：
【００８４】
【化４】
【００８５】
両方のＮＥは、ＮＥＢから入手可能である。
【００８６】
さらなる例示的なニック形成エンドヌクレアーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ．ＢｓｔＳＥ Ｉ（Ａｂｄｕｒａｓｈｉｔｏｖら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ）３０：１２６１−７，１９９６）、操作されたＥｃｏＲ Ｖ（Ｓｔａｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６１７５−８０，１９９６）、操作されたＦｏｋ Ｉ（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ ２０３：４３−４９，１９９７）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のエンドヌクレアーゼＶ（Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：８７３８−４８，２００１）、Ｃｖｉ Ｎｉｃｋａｓｅ（例えば、ＣｖｉＮＹ２Ａ、ＣｖｉＮＹＳＩ、Ｍｅｇａｂａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）（Ｚｈａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４０：３６６−７５，１９９８；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：４２３−８，１９９８；Ｘｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９４７７−８７，１９８８）、および操作されたＭｌｙ Ｉ（すなわち、Ｎ．Ｍｌｙ Ｉ）（ＢｅｓｎｉｅｒおよびＫｏｎｇ，ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２：７８２−６，２００１）。さらなるＮＥは、他の制限エンドヌクレアーゼ、特に、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを、ＥｃｏＲ Ｖ、ＡｌｗＩ、Ｆｏｋ Ｉおよび／またはＭｌｙ Ｉを操作するための方法と類似の方法を使用して操作することによって、得られ得る。
【００８７】
ニック形成剤として有用なＲＥは、その半改変された認識配列において２本鎖核酸にニック形成する任意のＲＥであり得る。この半改変された２本鎖認識配列にニック形成する例示的なＲＥとしては、Ａｖａ Ｉ、Ｂｓｌ Ｉ、ＢｓｍＡ Ｉ、ＢｓｏＢ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、ＢｓｔＮ Ｉ、ＢｓｔＯ Ｉ、Ｆｎｕ４Ｈ Ｉ、Ｈｉｎｃ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩおよびＮｃｉ Ｉが挙げられるがこれらに限定されない。半改変された認識配列にニック形成するさらなるＲＥは、米国特許第５，６３１，１４７号に記載される鎖保護アッセイによってスクリーニングされ得る。
【００８８】
特定のニック形成剤は、少なくとも部分的に二本鎖の基質核酸中に、２本鎖認識配列のセンス鎖の存在のみを、ニック形成活性のために必要とする。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉは、一方の鎖に、１つ以上のヌクレオチドが、基質核酸の他方の鎖と従来の塩基対（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕ）を形成しない、その認識配列「５’−ＧＡＧＴＣ−３’」のセンス鎖の配列を含む基質核酸のニック形成において活性である。Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉのニック形成活性は、その認識配列のセンス鎖における、この基質核酸の他方の鎖中のいずれのヌクレオチドとも従来の塩基対を形成しないヌクレオチド数の増加に伴って低減する。
【００８９】
特定の実施形態において、ニック形成剤は、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖におけるヌクレオチド配列を認識し得、この二重鎖の一方の鎖にニック形成する。特定の他の実施形態において、ニック形成剤は、２本鎖ＲＮＡにおけるヌクレオチド配列を認識し得、このＲＮＡの一方の鎖にニック形成する。
【００９０】
（ｂ．ＤＮＡポリメラーゼ）
上記のように、本発明の指数関数的核酸増幅方法は、２以上の核酸増幅反応を一緒に結び付け、そして各増幅反応は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われる。１つの増幅反応についてのＤＮＡポリメラーゼは、別の増幅反応についてのＤＮＡポリメラーゼと異なり得る。１つの実施形態では、異なる増幅反応についてのＤＮＡポリメラーゼは、互いに同一であり、その結果、ほんの１つのＤＮＡポリメラーゼが、核酸分子の指数関数的増幅に必要とされる。
【００９１】
本発明において有用なＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であるが鎖置換活性を有する任意のＤＮＡポリメラーゼであり得る。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、およびｅｘｏ−Ｂｃａが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において有用なさらなるＤＮＡポリメラーゼは、スクリーニングされ得るか、または米国特許第５，６３１，１４７号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される方法によって作製され得る。鎖置換活性は、以下に記載されるような鎖置換促進因子の存在によってさらに増強され得る。
【００９２】
あるいは、特定の実施形態において、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼが、使用され得る。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、これらのＤＮＡポリメラーゼの使用は、鎖置換促進因子の存在を必要とする。「鎖置換促進因子」は、ＤＮＡポリメラーゼに触媒される、ニック形成部位での３’末端からの核酸伸長の間の鎖置換を促進する任意の化合物または組成物である。本発明において有用な、例示的な鎖置換促進因子の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：７６４８−５３，１９９３）、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：１１５８−６４，１９９４）、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（ＢｏｅｈｍｅｒおよびＬｅｈｍａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：７１１−５，１９９３；ＳｋａｌｉｔｅｒおよびＬｅｈｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０６６５−９，１９９４）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＲｉｇｌｅｒおよびＲｏｍａｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−９，１９９５）、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質（ＶｉｌｌｅｍａｉｎおよびＧｉｅｄｒｏｃ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４３９５−４４０４，１９９６）、ウシ胸腺ヘリカーゼ（Ｓｉｅｇｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３６２９−３５，１９９２）およびトレハロース。１つの実施形態では、トレハロースが、増幅反応混合物中に存在する。
【００９３】
本発明において有用な、さらなる例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｇｅｎｅ ８４：２４７，１９８９）、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８２８７，１９８７）、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｇｅｎｅ ９７：１３−１９，１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（ＺｈｕおよびＩｔｏ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９：２６７−７６，１９９４）、９°Ｎｍ ＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：５２８１−５，１９９６；Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：４４７−６２，２０００）およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（ＫａｂｏｏｒｄおよびＢｅｎｋｏｖｉｃ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１４９−５７，１９９５）。
【００９４】
あるいは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。例えば、このようなＤＮＡポリメラーゼは、ニック形成の後にテンプレート核酸から自動的に解離する短い核酸フラグメントを増幅するために有用であり得る。
【００９５】
ニック形成剤がＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニック形成する特定の実施形態において、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。ニック形成剤がＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖にニック形成する他の実施形態において、ＤＮＡプライマーから伸長させるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ））が使用され得る。両方の場合において、標的ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写される必要はなく、そして標的ｍＲＮＡに対して少なくとも実質的に相補的であるテンプレート核酸分子と直接に混合され得る。
【００９６】
（ｃ．反応条件）
本発明の指数関数的核酸増幅法は、増幅を達成する際に各々がニック形成反応およびプライマー伸長反応を使用する２つ以上の核酸増幅反応と連結する。本発明の方法に従って、各増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＮＡがテンプレート核酸と混合される前、混合された後、または混合されると同時に、核酸分子（例えば、テンプレート核酸分子）と混合され得る。好ましくは、ニック形成−伸長反応緩衝液は、ＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの両方に適切であるように最適化される。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩがＮＡであり、ｅｘｏ−ＶｅｎｔがＤＮＡポリメラーゼである場合、ニック形成−伸長緩衝液は、０．５×Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ緩衝液および１×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液であり得る。例示的な１×Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ緩衝液は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＫＣｌ、および１ｍＭ ジチオスレイトール（２５℃にてｐＨ７．５）であり得る。例示的な１×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液は、１０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃にてｐＨ８．８）、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００であり得る。当業者は、ＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼのための反応緩衝液を容易に見いだし得る。
【００９７】
さらに、ＤＮＡポリメラーゼが解離性である（すなわち、このＤＮＡポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼのようなテンプレート核酸から比較的解離しやすい）特定の実施形態において、反応混合物中のＮＡ 対 ＤＮＡポリメラーゼの比はまた、全長核酸分子の最大増幅のために最適化され得る。本明細書中で使用される場合、「全長」核酸分子とは、そのテンプレートの５’末端配列に相補的な配列を含む、増幅された核酸分子をいう。言い換えると、全長核酸分子は、完全な遺伝子伸長反応の増幅産物である。ＮＡの量が、ＤＮＡポリメラーゼの量に対して過剰である反応混合物において、部分的な増幅産物が、生成され得る。部分的増幅産物の生成は、ＮＡによる、部分的に増幅した核酸分子の過剰なニック形成およびその後のこれらの分子のテンプレートからの解離に起因し得る。このような解離は、その部分的に増幅した核酸分子がさらに伸長しないようにする。
【００９８】
異なるＮＡまたは異なるＤＮＡポリメラーゼは、異なるニック形成活性またはプライマー伸長活性を有し得るので、全長核酸分子の最大の増幅に最適な、特定のＮＡ 対 特異的な解離性ＤＮＡポリメラーゼの比は、特定のＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの同一性に依存して変化する。しかし、特定のＮＡと特異的なＤＮＡポリメラーゼとの所定の組み合わせについて、その比は、異なるＮＡ 対 ＤＮＡポリメラーゼ比を有する反応混合物中で指数関数的な核酸増幅反応を行い、当該分野で公知の技術を使用して（例えば、液体クロマトグラフィーまたは質量分析法により）その増幅産物を特徴付けることにより最適化され得る。全長核酸分子の最大の産生を可能にする比は、将来的な増幅反応において使用され得る。
【００９９】
核酸分子の部分的な増幅は、第１の増幅反応および第２の増幅反応の両方の間で起こり得るが、第１の増幅反応の間の部分的な増幅は、通常、全核酸増幅レベルまたは速度に有意には影響しないことは、注目すべきである。第１の増幅反応の間に増幅された核酸分子は、第２の増幅反応のための開始増幅プライマーとして使用されるので、これらの核酸分子は、これらのテンプレートに特異的にアニーリングさせるのに十分長い場合、これらの意図される使用のために十分である。全長核酸増幅のための、ＮＡ 対 解離性ＤＮＡポリメラーゼとの最適比を使用することを除いて、代替的に、増幅反応が、ある期間の間進行し、各々の遺伝子伸長反応をその完了まで進行させた後、部分的増幅産物量は、ＮＡを不活性化することによって排除され得るかまたは低減され得るが、ＤＮＡポリメラーゼはそうなり得ない（例えば、熱不活性化）。
【０１００】
特定の好ましい実施形態において、本発明のニック形成反応および伸長反応は、等温条件下で行われる。本明細書中で使用される場合、「等温的に」および「等温条件」とは、増幅過程の間、反応の温度が本質的に一定に保持された（すなわち、同じ温度であるか、または上限温度と下限温度との間の差異が２０℃以下の同じ狭い温度範囲内である）反応条件のセットをいう。本発明の増幅方法の利点は、上限温度と下限温度との間で温度をサイクルさせる必要がないことである。ニック形成反応および伸長反応の両方が、同じ温度にて、または同じ狭い温度範囲内で行われる。温度を維持するために使用される装置が、反応混合物の温度を少ない程度で変動させることが可能である場合、このような変動は、増幅反応に不利益ではない。等温増幅のための例示的な温度としては、５０℃〜７０℃の間の任意の温度、または５０℃〜７０℃、５５℃〜７０℃、６０℃〜７０℃、６５℃〜７０℃、５０℃〜５５℃、５０℃〜６０℃、もしくは５０℃〜６５℃の間の温度範囲が挙げられるが、これらに限定されない。多くのＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼは、上記の例示的温度にてまたは上記の例示的な温度範囲内で活性である。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるニック形成反応およびｅｘｏ− Ｂｓｔポリメラーゼ（ＢｉｏＲａｄ）を用いる伸長反応の両方は、約５５℃にて行われ得る。約５０℃〜７０℃の間で活性な他のポリメラーゼとしては、ｅｘｏ− Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ− Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ−Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、ｅｘｏ−Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）およびＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
制限エンドヌクレアーゼが、ニック形成剤として使用される場合、改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、半改変（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）制限エンドヌクレアーゼ認識配列を生成するために必要である。制限エンドヌクレアーゼ認識配列中に改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む二本鎖核酸の一方の鎖の切断の阻害に寄与する任意の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸が使用され得る。例示的な改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸としては、２’−デオキシシチジン５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）［すなわち、ｄＣＴＰ（．α．Ｓ）］、２’−デオキシグアノシン５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、チミジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、２’−デオキシシチジン５’−Ｏ（１−チオ三リン酸）、２’−デオキシウリジン５’−三リン酸、５−メチルデオキシシチジン５’−三リン酸、および７−デアザ−２’−デオキシグアノシン５’−三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
（ｄ．開始核酸（Ｎ１））
上に議論されるように、第１核酸増幅のための開始核酸（すなわち、Ｎ１）は、トリガーＯＤＮＰをテンプレート核酸分子Ｔ１とアニーリングさせることによって提供され得る。トリガーＯＤＮＰは、Ｔ１をテンプレートとして使用するプライマー伸長のためのプライマーとして機能するので、このトリガーＯＤＮＰは、Ｔ１の一部と実質的に相補性でなければならず、そしてそこからプライマー伸長が生じる３’末端もまた有する。
【０１０３】
特定の実施形態において、トリガーＯＤＮＰは、核酸分子に由来する。トリガーの３’末端は、当該分野で公知の種々の方法によって産生され得る。例えば、トリガーＯＤＮＰの３’末端は、制限ヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）を認識する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ）を使用して、ＲＥＲＳを有する核酸フラグメントを消化することによって提供され得る。核酸フラグメント中のＲＥＲＳは、天然に存在しても、ＲＥＲＳの１つの鎖を含むプライマーを使用することによって、フラグメント中に組込まれてもよい。あるいは、トリガーＯＤＮＰの３’末端は、ＮＡＲＳを認識するＮＡで、ＮＡＲＳを有する核酸フラグメントにニック形成することによって産生され得る。ＮＡＲＳはまた、天然に存在しても、ＮＡＲＳの１つの鎖を含むプライマーを使用することによって、フラグメント中に組込まれてもよい。さらに、トリガーＯＤＮＰの３’末端は、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（米国特許第４，９３５，３５７号）に従うオリゴヌクレオチド指向性切断によってかまたはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０−４，１９７７）に従う塩基特異性化学切断によって、作製され得る。特定の実施形態において、トリガーＯＤＮＰの３’末端は、ＤＮａｓｅ Ｉまたは他の非特異的ヌクレアーゼで、核酸分子を切断することによってか、あるいは核酸分子を剪断することによって、作製され得る。切断生成物が、二本鎖核酸である状況において、トリガーＯＤＮＰは、二本鎖核酸を変性することによって得られ得る。
【０１０４】
トリガーＯＤＮＰが誘導される核酸分子は、天然に存在しても、合成であってもよい。この核酸分子は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このような核酸分子としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはその誘導体（例えば、ランダムにプライムされた増幅産物または特異的にプライムされた増幅産物）が挙げられる。トリガーＯＤＮＰ自体は、一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子であり得る。トリガーＯＤＮＰまたはトリガーＯＤＮＰが誘導される核酸分子は、固体支持体に固定化されていても、固定されていなくてもよい。
【０１０５】
同様に、Ｔ１はまた、酵素的切断、化学的切断、または機械的切断による、別の核酸分子に由来し得る。酵素的切断は、例えば、核酸分子内の特異的配列を認識する制限エンドヌクレアーゼで、核酸分子を消化することによって達成され得る。あるいは、酵素的切断は、核酸分子内の特異的配列を認識するニック形成剤で、核酸分子にニック形成することによって、達成され得る。酵素的切断はまた、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（米国特許第４，９３５，３５７号）に従うオリゴヌクレオチド指向性切断でもあり得る。化学的切断および機械的切断は、核酸分子を切断するために適切な当該分野で公知の任意の方法（例えば、剪断）によって、達成され得る。切断生成物が二本鎖核酸分子である状況において、Ｔ１分子は、二本鎖核酸分子を変性することによって得られ得る。
【０１０６】
上記されるように、Ｔ１は、ＮＡＲＳの１つの鎖の配列を含む。ＮＡＲＳは、Ｔ１が誘導される核酸分子に存在し得る。あるいは、このＮＡＲＳは、例えば、ＮＡＲＳの１つの鎖の配列を含むＯＤＮＰを使用することによって、Ｔ１に組込まれ得る。
【０１０７】
トリガーＯＮＤＰに類似して、Ｔ１分子は、種々の核酸分子から誘導され得る。これらの核酸分子は、天然に存在する核酸および合成核酸を含み、これらのいずれかは、二本鎖核酸分子であっても一本鎖核酸分子であってもよく、そしてＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）であってもＲＮＡであってもよい。
【０１０８】
特定の実施形態において、Ｔ１分子は、３’から５’まで以下を含むかまたは以下から本質的になる：せいぜい１００ヌクレオチド長である第１配列；二本鎖ニック形成剤認識配列の１つの鎖の配列；およびせいぜい１００ヌクレオチド長である第２配列。いくつかの実施形態において、Ｔ１分子は、せいぜい２００、１５０、１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１８，１６、１４、１２、または１０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、第１の配列、第２の配列、またはその両方は、せいぜい１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１８，１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、または４ヌクレオチド長であり得る。
【０１０９】
（１）Ｔ１がニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして（２）トリガーＯＤＮＰがニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に隣接するＴ１分子の一部分に相補的である特定の実施形態において、Ｔ１中のニック形成剤認識配列のセンス鎖内の１つ以上のヌクレオチドとトリガーＯＤＮＰ中の対応するヌクレオチドとの間にミスマッチが存在し得る。言い換えると、Ｔ１中のニック形成剤認識配列のセンス鎖内の１つ以上のヌクレオチドは、トリガーＯＤＮＰ内の任意のヌクレオチドと従来の塩基対を形成し得ない。特定のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ）は、これらの二本鎖認識配列のセンス鎖のみを含む基質にニック形成し得るので、Ｔ１にトリガーＯＤＮＰをアニーリングすることによって形成される開始核酸（Ｎ１）は、Ｔ１分子中の認識配列のセンス鎖を認識するニック形成剤の存在下で、一本鎖核酸（Ａ１）を増幅するためのテンプレートとして使用され得る。二本鎖ニック形成剤認識配列の、センス鎖の配列のみを含み、インタクトなアンチセンス鎖の配列を含まないテンプレート核酸を使用して一本鎖核酸を増幅するためのニック形成剤の使用についての詳細な記載は、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｉｃｋｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ」と表題される、米国特許出願において提供される。
【０１１０】
トリガーＯＤＮＰ、Ｔ１、またはその両方が核酸分子から誘導される実施形態の代わりに、本発明はまた、トリガーＯＤＮＰ、Ｔ１、またはその両方が合成核酸分子である実施形態を含む。オリゴヌクレオチド合成のための当該分野で公知の任意の方法は、トリガーＯＤＮＰおよび／またはＴ１を合成するために使用され得る。例えば、トリガーＯＤＮＰおよび／またはＴ１は、米国特許第６，１６６，１９８号、同第６，０４３，３５３号、同第６，０４０，４３９号、および同第５，９４５，５２４号（参考として本明細書中にその全体が援用される）に開示される固相オリゴヌクレオチド合成方法によって合成され得る。簡単に言えば、固相オリゴヌクレオチド合成は、５’側がブロックされたヌクレオチドを樹脂に結合された発生期のオリゴヌクレオチドに連続的に連結し、続いてリン酸ジエステル結合を形成するために酸化および脱ブロック化することによって実施され得る。さらに、トリガーＯＤＮＰおよび／またはＴ１は、特別に注文されるオリゴヌクレオチドを合成する企業から購入され得る。
【０１１１】
Ｔ１は、特定の実施形態において、固相支持体に固定化され得る。好ましくは、Ｔ１は、その５’末端によって固定化される。他の実施形態において、Ｔ１は、固相支持体に固定されなくてもよい。
【０１１２】
特定の実施形態において、第１増幅反応の開始核酸分子（すなわち、Ｎ１）は、トリガーＯＤＮＰをテンプレート核酸分子Ｔ１とアニーリングさせること以外によって、提供され得る。例えば、Ｎ１は、二本鎖ＮＡＲＳを含む、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子であり得、このＮＡＲＳは、任意の開始プライマー伸長反応（例えば、図１の工程（ａ））なしに、ＮＡＲＳを認識するＮＡによって容易にニック形成され得る（図１の工程（ｃ））。このような場合において、Ｎ１分子の各鎖は、ＮＡＲＳの１つの鎖の配列を含む。従って、いずれかの鎖が、Ｔ１分子とみなされ、その相補鎖がトリガーＯＤＮＰとみなされ得る。二本鎖Ｎ１分子は、例えば、ＮＡＲＳを含む核酸の消化産物であり得る。Ｎ１中のＮＡＲＳ配列は、別のヌクレオチド配列から生じるかまたはそれに由来するか、あるいは、ＮＡＲＳの１つの鎖の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーによってＮ１に組込まれるかまたはＴ１の化学合成の間にＮ１に組込まれ得る。
【０１１３】
Ｎ１は、二本鎖ＮＡＲＳまたはＮＡＲＳの１つの鎖のみのいずれかを含む部分的に二本鎖の核酸分子であり得る。例えば、Ｎ１は、２つのＮＡＲＳを含む核酸分子のニック形成産物であっても、ＮＡＲＳおよびＲＥＲＳの両方を含む核酸分子のニック形成消化産物であってもよい。
【０１１４】
特定の実施形態において、Ｎ１は、固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、Ｎ１は、固体支持体に固定化され得ない。
【０１１５】
（ｅ．Ｔ２分子）
Ｔ１と類似して、Ｔ２はまた、上記されるように他の核酸分子内において、酵素的切断、化学的切断または機械的切断によってか、またはテンプレートとして他の核酸分子を使用した核酸増幅によって、別の核酸分子から由来され得る。Ｔ２が由来する他の核酸分子は、天然に存在する核酸あるいは合成二本鎖核酸または合成一本鎖核酸、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）またはＤＮＡであり得る。１つの実施形態において、Ｔ２は、化学的に合成される。
【０１１６】
上記されるように、Ｔ２は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む。ＮＡＲＳは、Ｔ２が由来する核酸分子中に存在し得る。あるいは、ＮＡＲＳは、例えば、ＮＡＲＳの１つの鎖の配列を含むＯＤＮＰを使用することによって、Ｔ２に組込まれ得る。
【０１１７】
増幅反応混合物中のＴ２分子の数は、代表的に、Ｔ１分子の数より多い。Ｔ１分子より多い数のＴ２分子に対する優先性は、Ｔ２分子がＴ１分子をテンプレートとして使用して増幅された一本鎖核酸分子（すなわち、Ａ１）に対するアニーリングパートナーとして使用されるという事実に起因する。言い換えると、第１増幅反応の間、各Ｔ１分子は、テンプレートとして使用され、複数コピーのＡ１を産生する。従って、各々のＴ１分子について、好ましくは、複数のＴ２分子が、単一のＴ１分子をテンプレートとして使用して増幅された複数のＡ１分子に対するアニーリングパートナーを提供するために存在する。
【０１１８】
特定の実施形態において、Ｔ２分子は、３’から５’まで、以下を含むかまたは以下から本質的になる：せいぜい１００ヌクレオチド長である第１配列；二本鎖ニック形成認識配列のセンス鎖の配列；およびせいぜい１００ヌクレオチド長である第２配列。いくつかの実施形態において、Ｔ２分子は、ぜいぜい２００、１５０、１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１８、１６、１４、１２、または１０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、第１の配列、第２の配列、またはその両方は、せいぜい１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、または４ヌクレオチド長であり得る。
【０１１９】
Ｔ２分子は、固相支持体に、好ましくは、その５’末端で固定化され得る。Ｔ２分子が結合される固相とプライマーの５’末端または３’末端との間にはリンカーが存在し得る。さらに、複数のＴ２分子は、単一の固相に固定化され、Ｔ２分子のアレイを生成し得る。複数のＴ２分子は、アレイの別個の位置で同一な配列を有し得る。あるいは、これらは、アレイの別個の位置で種々のＡ１分子に対して少なくとも実質的に相補的である異なる配列を有し得る。このようなアレイは、異なる配列を有する複数の一本鎖核酸分子を増幅するために使用され得る。特定の実施形態において、アレイの異なる位置で実施される増幅反応は、物理的に分離され（例えば、プレートのマイクロウェル中）、その結果、異なる位置での増幅産物は、互いに混合されず、ここに特徴付けされ得る。
【０１２０】
（２．核酸増幅のための核酸、組成物またはキット）
１つの局面において、本発明は、核酸の指数関数的な増幅のための組成物およびキットを提供する。このような組成物は、一般的に、上記される第１の型または第２の型の核酸増幅において機能するように設計された、第１の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（Ｎ１またはＨ１）と第２の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（Ｎ２またはＨ２）との組み合わせを含む。例えば、第１の型の核酸増幅について、組成物は、（１）一方の鎖が第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む第１の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（Ｎ１またはＨ１）、ならびに（２）５’から３’まで以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む第２の核酸（Ｎ２またはＨ２）を含み得る：（ｉ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）第１の核酸分子における第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一である配列。第２の型の核酸増幅について、組成物は、（１）一方の鎖が第１のＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む第１の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（Ｎ１またはＨ１）、ならびに（２）一方の鎖が、５’から３’まで以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む第２の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（Ｎ２またはＨ２）を含み得る：（ｉ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）第１の核酸分子における第１のＮＡＲＳのセンス鎖の配列に対して３’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である配列。特定の実施形態において、両方の型の核酸増幅について、第１のＮＡＲＳは、第２のＮＡＲＳに対して同一である。
【０１２１】
本発明のキットは、上記の組成物のうちの１つを含み得る。あるいは、このキットは、上記の第１の型の核酸増幅または第２の型の核酸増幅のいずれかにおいて機能するように設計された一本鎖核酸分子Ｔ１およびＴ２の組合せを含み得る。例えば、第１の型の核酸増幅について、この組成物は、第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含むＴ１、ならびに５’から３’へと以下：（ｉ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）Ｔ１中の第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一である配列、を含むＴ２を含み得る。第２の型の核酸増幅について、この組成物は、第１のＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含むＴ１、ならびに５’から３’へと以下：（ｉ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および（ｉｉ）第１の核酸分子中の第１のＮＡＲＳのセンス鎖の配列の３’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である配列、を含むＴ２を含み得る。特定の実施形態では、両方の型の核酸増幅について、第１のＮＡＲＳは、第２のＮＡＲＳと同一である。
【０１２２】
上記の核酸分子に加えて、本発明のキット（または組成物）は、以下の構成要素のうちの少なくとも１つ、２つ、数個、または各々をさらに含み得る：（１）Ｔ１中のＮＡＲＳの一方の鎖の配列の３’側のＴ１の配列に特異的にアニーリングし得るトリガーＯＤＮＰ；（２）ＮＡＲＳ（その一方の鎖の配列が、Ｔ１、Ｔ２または両方に存在する）を認識するニック形成剤（例えば、ＮＥまたはＲＥ）；（３）ニック形成剤（２）用の緩衝液；（４）プライマー伸長に有用なＤＮＡポリメラーゼ；（５）ＤＮＡポリメラーゼ（４）用の緩衝液；（６）デオキシヌクレオシド三リン酸；（７）改変されたデオキシヌクレオシド三リン酸；（８）コントロールＴ１、Ｔ２および／またはトリガーＯＤＮＰ；ならびに（９）鎖置換促進因子（例えば、トレハロース）。多くの上記の構成要素の詳細な説明は、上記に提供される。
【０１２３】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＮＡに特異的な緩衝液もＤＮＡポリメラーゼに特異的な緩衝液も含まない。代りに、本発明の組成物は、ニック形成剤およびＤＮＡポリメラーゼの両方に適切な緩衝液を含む。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉがニック形成剤であり、ｅｘｏ−ＶｅｎｔがＤＮＡポリメラーゼである場合、ニック形成−伸長緩衝液は、０．５×Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ緩衝液および１×ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ緩衝液であり得る。
【０１２４】
本発明の組成物は、それらの構成要素を単純に混合することによってか、またはこの組成物の形成を生じる反応を実施することによって生成され得る。本発明のキットは、それらの構成要素のうちのいくつかを混合することによって調製され得るか、またはそれらの各々を個々の容器に保存する。
【０１２５】
（Ｂ．核酸増幅方法および組成物の診断用途）
本明細書中上記にて詳細に記載されるように、本発明は、核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。これらの方法および組成物は、広範な種々の適用における有用性を見出し得、ここで、核酸分子を迅速に増幅することが好適である。このような迅速な増幅は、診断適用において特に好適であり得る、例えば、生物学的サンプル中の病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫）の存在を迅速に検出する場合に好適である。以下の節は、診断用途に具体的に適用可能な種々の例示的実施形態を記載する。
【０１２６】
（１．概要）
本発明は、生物学的サンプル中の標的核酸分子を検出するために有用である。この標的核酸としては、病原性生物に由来するか、それを起源とする核酸分子が挙げられる。サンプル中の標的核酸の存在または非存在に依存して、増幅産物は、標的核酸またはその部分をテンプレートとして使用するように設計された増幅系において、検出されても検出されなくても良い。標的核酸またはその部分は、第１の増幅反応におけるテンプレートとして使用されるために、まず、開始核酸分子（Ｎ１）中に組み込まれる。この開始核酸分子はまた、第１のＮＡＲＳの少なくとも一方の鎖を含み、従って、ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、第１の増幅反応を誘発する。次いで、第１の増幅反応からの生成物（Ａ１）は、別のテンプレート核酸分子（Ｔ２）にアニーリングする。Ｔ２は、第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含み、従って、ＤＮＡポリメラーゼおよび第２のＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、第２の増幅反応を開始する。第１の増幅反応の生成物（Ａ１）および／または第２の増幅反応の生成物（Ａ２）の存在または非存在の決定は、生物学的サンプル中の標的核酸の存在または非存在を示す。
【０１２７】
（２．開始核酸分子（Ｎ１））
診断適用に有用な開始核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、Ｎ１は、トリガーＯＤＮＰをＴ１分子にアニーリングすることによって獲得され得、ここでトリガーＯＤＮＰは、病原性生物を起源とする核酸分子に由来する（例えば、図５〜７および図１３）。あるいは、Ｎ１は、病原性生物を起源とする二本鎖核酸分子に直接に由来し得る（例えば、図８）。Ｎ１はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対の使用によって調製され得る（例えば、図９〜１１）。特定の実施形態において、Ｎ１は、標的核酸とハイブリダイズし得る突出部を有する部分的に二本鎖の核酸分子であり得る（例えば、図１２）。診断適用に関連する、Ｎ１を提供するためのこれらおよび他の様式は、以下に記載される。
【０１２８】
（ａ．Ｎ１分子を提供するための第１の型の例示的方法）
トリガーＯＤＮＰをＴ１分子にアニーリングすることによってＮ１が提供される本発明の特定の実施形態において、トリガーＯＤＮＰは、病原性生物のＤＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）またはＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）のいずれかに由来し得る。病原性生物由来の核酸分子が、一本鎖である場合、それは、トリガーＯＤＮＰとして直接使用され得る。あるいは、一本鎖核酸分子は、より短いフラグメントを生成するように切断され得、ここで、これらのフラグメントのうちの１つ以上が、トリガーＯＤＮＰとして使用され得る。病原性生物由来の核酸分子が、二本鎖である場合、それは、変性され、そしてトリガーＯＤＮＰとして直接使用され得るか、または変性された生成物は、複数のより短いフラグメントを提供するために切断され得、ここでこれらのフラグメントのうちの１つ以上が、トリガーＯＤＮＰとして機能し得る。あるいは、それは、複数のより短い二本鎖フラグメントを得るためにまず切断され得、次いでこれらのより短いフラグメントは、１つ以上のトリガーＯＤＮＰを提供するために変性される。
【０１２９】
上記のように、Ｔ１分子は、トリガーＯＤＮＰに少なくとも実質的に相補的でなければならない。さらに、増幅反応混合物中のＴ１分子の数は、トリガーＯＤＮＰへのアニーリングに対して、二本鎖核酸分子由来のトリガーＯＤＮＰの相補鎖と効果的に競合するために、好ましくは、トリガーＯＤＮＰの数より多い。
【０１３０】
Ｎ１分子を調製するための第１の型の方法の例は、図５に示される。この図に示されるように、二本鎖ゲノムＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼによって、まず切断され得る。消化産物は、変性され得、そして消化産物のうちの１つの一方の鎖は、核酸増幅反応を開始するためのトリガーＯＤＮＰとして使用され得る。
【０１３１】
（ｂ．Ｎ１分子を提供するための第２の型の例示的方法）
トリガーＯＤＮＰをＴ１分子にアニーリングすることによってＮ１が提供される本発明の特定の実施形態において、このトリガーＯＤＮＰは、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む。トリガーＯＤＮＰは、病原生生物を起源とする標的核酸（例えば、ゲノム核酸）に由来し得る。Ｎ１が、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識可能なＮＥＲＳを含む特定の実施形態が、図６に例示される。この図によって例示されるように、ＮＥＲＳを含むゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントは、変性され、そしてゲノムＤＮＡの一方の鎖またはその鎖のフラグメントは、Ｔ１分子にアニーリングする。このＴ１分子は、ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、ゲノムＤＮＡの他方の鎖の一部である。Ｔ１分子へのトリガーＯＤＮＰのアニーリングは、増幅反応のための開始核酸分子Ｎ１を提供する。増幅反応混合物中のＴ１分子の数は、好ましくは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含むゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントの鎖の数よりも多い。
【０１３２】
上記のゲノムＤＮＡは、特定の実施形態において、固体支持体に固定され得る。他の実施形態において、Ｔ１分子が固体支持体に固定され得る。
【０１３３】
トリガーＯＤＮＰが、標的核酸に由来し、そしてＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む、関連する実施形態において、Ｔ１分子は、その３’部分（すなわち、領域Ｘおよび領域Ｙ）において（その５’部分（すなわち、領域Ｚ）においてではなく）、トリガーＯＤＮＰに少なくとも実質的に相補的であり得る（図７）。Ｔ１の３’部分は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含み、その結果、Ｔ１のトリガーＯＤＮＰへのアニーリングによって形成される開始核酸は、二本鎖ＮＡＲＳを含む。ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下において、Ｎ１分子は、ニック形成される。次いで、ニック形成部位の３’末端は、Ｔ１分子中のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’の領域をテンプレートとして使用して伸長される。得られた増幅産物は、トリガーＯＤＮＰの一部ではなく、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置するＴ１の領域（すなわち、領域Ｚ１）に相補的である一本鎖核酸分子である。
【０１３４】
（ｃ．Ｎ１分子を提供するための第３の型の例示的方法）
本発明の特定の実施形態では、Ｎ１は、ＮＡＲＳおよびＲＥＲＳの両方を含むゲノム核酸に直接由来する二本鎖核酸である。例示的なＮＡＲＳとして、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識可能なＮＥＲＳを用いる実施形態が、図８に例示される。この図に示されるように、ＮＥＲＳおよびＲＥＲＳを含むゲノムＤＮＡは、ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼによって消化され得る。ＮＥＲＳを含む消化産物は、開始核酸分子（Ｎ１）として機能し得る。
【０１３５】
（ｄ．Ｎ１分子を提供するための第４の型の例示的方法）
本発明の特定の実施形態では、開始核酸分子Ｎ１は、種々のＯＤＮＰ対を用いて生成される完全にか、または部分的に二本鎖の核酸分子である。ＯＤＮＰ対を使用してＮ１分子を調製する方法は、図９〜１１と関連して以下に記載される。
【０１３６】
１つの実施形態において、Ｎ１の前駆体は、二本鎖ＮＡＲＳおよび二本鎖ＲＥＲＳを含む。このＮＡＲＳおよびＲＥＲＳは、ＯＤＮＰ対を用いて、この前駆体に組み込まれる。例示的なＮＡＲＳとして、その認識配列の外側にニックを形成するＮＥ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識可能なＮＥＲＳ、および例示的なＲＥＲＳとしてＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を用いる実施形態が、図９に例示される。この図に示されるように、第１のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳの一方の鎖の配列を含み、一方、第２のＯＤＮＰは、ＴＲＥＲＳの一方の鎖の配列を含む。これらの２つのＯＤＮＰが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物（すなわち、Ｎ１の前駆体）は、二本鎖ＮＥＲＳおよび二本鎖ＴＲＥＲＳの両方を含む。ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの存在下で、この増幅産物は、二本鎖ＮＥＲＳを含む核酸分子Ｎ１を生成するために消化される。
【０１３７】
別の実施形態において、Ｎ１の前駆体は、２つの二本鎖ＮＡＲＳを含む。これらの２つのＮＡＲＳは、２つのＯＤＮＰを用いて、Ｎ１の前駆体に組み込まれる。例示的なＮＡＲＳとして、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能なＮＥＲＳを用いる実施形態が、図１０ａに例示される。この図に示されるように、両方のＯＤＮＰが、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む。これらの２つのＯＤＮＰが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物は、２つのＮＥＲＳを含む。これらの２つのＮＥＲＳは、互いに同一であっても同一でなくても良いが、好ましくは、それらは同一である。ＮＥＲＳを認識するＮＥ（単数または複数）の存在下で、この増幅産物は、二本鎖ＮＥＲＳを各々含む２つの核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成するために、２回（各鎖において１回）ニック形成される。
【０１３８】
なお別の実施形態において、Ｎ１の前駆体は、２つの半改変ＲＥＲＳを含む。これらの２つの半改変ＲＥＲＳは、２つのＯＤＮＰを使用することによって、この前駆体に組み込まれる。この実施形態は、図１１に例示される。この図に示されるように、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰの両方が、ＲＥＲＳの一方の鎖の配列を含む。これらの２つのＯＤＮＰが、改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物は、２つの半改変ＲＥＲＳを含む。これらの２つのＲＥＲＳは、互いに同一であっても同一でなくても良い。半改変ＲＥＲＳを認識するＲＥ（単数または複数）の存在下で、上記の増幅産物は、半改変ＲＥＲＳの少なくとも一方の鎖の配列を各々含む２つの部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成するためにニック形成される。
【０１３９】
上記の第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰまたは両方は、特定の実施形態において固体支持体に固定され得る。他の実施形態において、標的核酸を含むサンプルの核酸分子が固定される。
【０１４０】
（ｅ．Ｎ１分子を提供するための第５の型の例示的方法）
本発明の他の実施形態において、開始核酸分子Ｎ１は、ＮＡＲＳおよび標的核酸に少なくとも実質的に相補的な突出部を有する部分的に二本鎖の核酸分子である。Ｎ１が、例示的なＮＡＲＳとして、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能なＮＥＲＳを有する例示的な実施形態が、図１２に例示される。この図に示されるように、Ｎ１分子は、ＮＳを含むか、または伸長の際にＮＳを形成するかのいずれかである鎖中の５’突出部を含み得る。あるいは、Ｎ１分子は、ＮＳを含まず、伸長の際にＮＳを形成もしない鎖中の３’突出部を含み得る。Ｎ１分子の突出部は、標的核酸分子に少なくとも実質的に相補的でなければならず、その結果、Ｎ１分子の突出部は、標的核酸分子にアニーリングし得る。標的核酸へのＮ１のアニーリングは、目的の生物学的サンプル中に標的核酸が存在する場合、標的核酸とＮ１分子との間で形成される複合体（「標的−Ｎ１複合体」）の単離を可能にする。
【０１４１】
例えば、生物学的サンプル中の核酸分子が、図１２に示されるように、固体支持体に固定され得る。このような固定は、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得、この方法としては、固定剤の使用または組織プリンティングが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、特定の標的核酸分子に実質的に相補的である突出部を有するＮ１分子が、サンプルに適用される。このサンプル中に標的核酸が存在する場合、Ｎ１は、その突出部を介して、この標的核酸にハイブリダイズする。続いて、このサンプルは、任意のハイブリダイズしていないＮ１分子を除去するために洗浄される。ＤＮＡポリメラーゼおよびＮ１中のＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、一本鎖核酸分子Ａ１が増幅される。適切なＴ２分子のさらなる存在下で、別の一本鎖核酸分子Ａ２が増幅される。しかし、標的核酸が、サンプル中に存在しない場合、Ｎ１は、サンプル中のいずれの核酸分子ともハイブリダイズできず、従って、サンプルから洗い出される。従って、この洗浄された生物学的サンプルが、核酸増幅反応混合物（すなわち、Ｎ１の一部をテンプレートとして使用する一本鎖核酸増幅に必要な全ての成分（例えば、Ｎ１分子中のＮＥＲＳを認識するＮＥおよびＤＮＡポリメラーゼ）を含む混合物）とともにインキュベートされる場合、Ｎ１の上記部分に相補的であるいずれの一本鎖核酸分子も増幅されない。
【０１４２】
標的核酸分子を固定することに加えて、標的−Ｎ１複合体は、まずＮ１分子を生物学的サンプル中の標的核酸分子とハイブリダイズし、次いで、標的核酸に結合した官能基によって複合体を単離することによって、精製され得る。例えば、標的核酸が、ビオチン分子で標識され得、続いて、標的と結合したビオチン分子を介して（固定化ストレプトアビジンを用いて、この複合体を沈殿させるように）、標的−Ｎ１複合体が精製され得る。
【０１４３】
特定の関連の実施形態において、Ｎ１は、生物学的サンプル由来の固定された標的核酸を、一本鎖Ｔ１分子とハイブリダイズさせることによって形成される。これらの実施形態の一例が、標的核酸を固定しないが、上記のＴ１分子を、その５’末端を介して固体支持体に固定するというものである。標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルの核酸とＴ１とのハイブリダイゼーションは、その固体支持体が洗浄された場合に、その標的がその固体支持体に結合されたまま残ることを可能にする。ニック形成剤認識配列（このアンチセンス配列が、Ｔ１に存在する）を認識するニック形成剤とＤＮＡポリメラーゼとの存在下において、一本鎖核酸分子は、Ｔ１の認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置づけられる配列をテンプレートとして使用して増幅される。標的がサンプル中に存在しない場合、サンプルの核酸は、Ｔ１が結合された固体支持体から洗い流される。従って、一本鎖核酸分子は、Ｔ１の一部分をテンプレートに使用して増幅されない。
【０１４４】
ＮＡＲＳの外側にニックを形成するニック形成剤によって認識可能なＮＡＲＳを使用する上記の実施形態の別の例を、図１３に例示する。この図に示されるように、生物学的サンプルの核酸は、その５’末端を介して固定される。次いで、生じる固定された核酸を、Ｔ１分子（これは、３’→５’に、生物学的サンプル中に存在することが疑われる標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な配列、およびＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む）に対してハイブリダイズさせる。標的核酸がその生物学的サンプル中に存在する場合、Ｔ１分子は、標的核酸にハイブリダイズして、Ｎ１分子を形成する。このＮ１分子は、標的核酸が結合された固相を洗浄することによって、ハイブリダイズしていないＴ１分子から分離される。ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤との存在下において、Ｎ１は、テンプレートとして使用されて、一本鎖核酸分子Ａ１を増幅する。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、Ｔ１は、サンプル中のいかなる標的核酸ともハイブリダイズできず、従って、固体支持体から洗い流される。結果として、固体支持体に結合されるＮ１は形成され得ず、そしてＮ１の一部分に対して相補的な一本鎖核酸分子は増幅され得ない。
【０１４５】
ＮＡＲＳの外側にニックを形成するニック形成剤によって認識可能なＮＡＲＳを使用する上記の実施形態の別の例を、図２５に例示する。この図に示されるように、Ｔ１分子は、その５’末端を介して、固体支持体に固定される。Ｔ１分子は、５’→３’に、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および標的核酸の３’部分に対して実質的に相補的な配列を含む。Ｔ１分子は、生物学的サンプル由来の核酸と混合される。標的核酸がサンプル中に存在する場合、Ｔ１分子は、標的とハイブリダイズされて、テンプレート分子を形成する。Ｔ１分子が結合された固体支持体を洗浄する場合、標的は、Ｔ１分子とのそのハイブリダイゼーションにより、固体支持体に結合されたまま残る。ＤＮＡポリメラーゼの存在下において、標的は、テンプレートとしてＴ１分子を使用して、その３’末端から伸長される。標的の伸長産物と、Ｔ１分子の伸長産物との間で形成される二重鎖は、二本鎖ＮＡＲＳを含む。ＮＡＲＳを認識するニック形成剤とＤＮＡポリメラーゼとの存在下において、一本鎖核酸分子は、テンプレートとして標的核酸の一部分を使用することにより増幅される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、Ｔ１分子は、標的とハイブリダイズできない。従って、一本鎖核酸分子は、テンプレートとして標的を使用することにより増幅されない。
【０１４６】
上記の実施形態の別の例を、図２６に例示する。この例では、固定されたＴ１分子は、標的核酸に対して実質的に相補性であるが、標的の３’部分に対しては必ずしも相補的ではない。Ｔ１はまた、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む。標的が生物学的サンプル中に存在する場合、Ｔ１分子がサンプル中の核酸と混合されると、そのＴ１分子は標的とハイブリダイズし得る。Ｔ１が結合された固体支持体が洗浄される場合、標的は、Ｔ１分子とのそのハイブリダイゼーションにより、固体支持体に結合されたまま残る。ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤との存在下では、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列における１つ以上のヌクレオチドが、標的中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない場合であっても、特定の状況下において、一本鎖核酸が、標的の一部分をテンプレートとして使用することにより増幅され得る。テンプレート核酸が二本鎖ＮＡＲＳを含まない場合に一本鎖核酸が増幅される状況についての詳細な説明は、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｉｃｋｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ」との発明の名称が付けられた米国出願において提供される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、プローブは、標的とハイブリダイズできない。従って、一本鎖核酸分子は、標的をテンプレートとして使用することによって増幅されない。
【０１４７】
（３．特異性）
本発明の方法は、サンプル中における特定の病原性生物の存在または非存在を検出するため、ならびに、いくつかの密接に関連した病原性生物の存在を検出するために使用され得る。例えば、上記の例示的な方法の第１の型および第２の型に関して、Ｔ１分子がアニールするトリガーＯＤＮＰの部分は、検出されるべき特定の病原性生物に対して特異的な標的核酸またはその一部分に由来し得る。あるいは、このようなトリガーＯＤＮＰの一部分は、いくつかの密接に関連した病原性生物の間で実質的にまたは完全に保存されているが、他のより遠縁または無縁の病原性生物には存在しない標的核酸またはその一部分に由来し得る。
【０１４８】
特定の病原性生物に「特異的」な標的核酸またはその部分とは、特定の生物に存在するが、他のすべての生物（その特定の生物に密接に関連した生物を含む）には存在しない配列を有する標的核酸またはその部分をいう。さらに、いくつかの密接に関連した病原性生物の間で「実質的に保存されている」標的核酸中の領域とは、適切な条件下において、いくつかの密接に関連した生物の各々における対応領域にハイブリダイズし得るが、同一条件下において、より遠縁または無縁の生物由来の標的核酸中の類似領域にはハイブリダイズし得ない核酸分子が存在する、標的核酸中の領域をいう。また、いくつかの密接に関連した生物の間で「完全に保存されている」標的核酸中の領域とは、いくつかの密接に関連した病原性生物の各々に由来する標的核酸において同一の配列を有する領域をいう。
【０１４９】
同様に、上記の第４の型の例示的な方法に関して、プライマー対を使用して増幅される標的核酸の部分は、特定の病原性生物に対して特異的である領域、またはいくつかの密接に関連した病原性生物の間では実質的にまたは完全に保存されているが、他の遠縁または無縁の病原性生物には存在しない領域であり得る。さらに、標的核酸の増幅部分は、いくつかの密接に関連した病原性生物の間における、標的核酸の可変領域であり得る。本明細書中で使用される場合、標的核酸の「可変」領域とは、密接に関連した生物由来の標的核酸の間では５０％未満の配列同一性を有するが、同じ密接に関連した生物由来の標的核酸の間で８０％より高い配列同一性を有する領域によって各端を囲まれている領域をいう。本明細書中で使用される場合、２つの核酸の配列同一性のパーセントは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムを、それらのデフォルトパラメータとともに使用して決定される。これらのプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７，１９９３）におけるように改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−８，１９９０）のアルゴリズムを実行する。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えば、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）にて利用可能である。
【０１５０】
同様に、上記の第５の型の例示的な方法に関して、Ｎ１の突出部は、病原性生物に特異的な標的核酸中の領域、またはいくつかの密接に関連した病原性生物の間で実質的にまたは完全に保存された標的核酸中の領域に対して、少なくとも実質的に相補的であり得る。この突出部が、特定の生物由来の標的核酸またはその一部分に対して完全に相補的であるが、１つ以上の密接に関連した生物由来の標的核酸またはその一部分に対しても実質的に相補的である場合、特定の生物の存在を検出するため、または密接に関連した生物のいずれか１つの存在を検出するためのいずれかのために、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは変動され得る。例えば、Ｎ１分子が、高度にストリンジェントな条件下で生物学的サンプル由来の核酸とハイブリダイズされる場合、テンプレートとしてＮ１分子の一部分を使用してハイブリダイズされていないＮ１分子を取り除いた後で、核酸増幅を行うことにより、その生物学的サンプル中における特定の生物の存在が示され得る。他方、Ｎ１分子が、中程度または低度のストリンジェント条件下で生物学的サンプル由来の核酸とハイブリダイズされる場合、核酸増幅（テンプレートとしてＮ１分子の一部分を使用してハイブリダイズされていないＮ１分子を取り除いた後）により、特定の生物および／または特定の生物に密接に関連した１つ以上の生物の存在が示され得る。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの調節は、当該分野で周知であり、そして例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１に見出され得る。
【０１５１】
初回核酸分子（Ｎ１）が、トリガーＯＤＮＰをＴ１分子にアニーリングさせることによって提供される実施形態において、このトリガーＯＤＮＰまたはその一部分、ならびにＴ１においてＮＡＲＳの一方の鎖の配列に対して３’側に位置づけられるＴ１分子の一部分は、互いに対して、完全に相補的ではなく、実質的に相補的であり得る。例えば、トリガーＯＤＮＰが、いくつかの密接に関連した病原性生物の間で実質的に保存されている標的核酸の領域に由来し、そしていくつかの生物のうちのいずれかの存在が検出されることを必要とする場合、トリガーＯＤＮＰに対して実質的に相補的なＴ１分子が使用され得る。このような状況では、プライマーの伸長反応は、トリガーＯＤＮＰがＴ１分子に対してアニーリングするのを妨げる程、または、トリガーＯＤＮＰが、テンプレートとしてＴ１分子の一部分を使用して伸長されるのを妨げる程高いストリンジェントではない条件下で実施される必要がある。しかし、このような条件はまた、Ｔ１分子が、トリガーＯＤＮＰ以外の核酸分子に対して非特異的にアニーリングするのを防止するに十分なストリンジェントである必要もある。トリガーＯＤＮＰまたはその一部分がＴ１分子の一部分に対して実質的に相補的である核酸増幅のために適切な条件は、反応温度および／または反応緩衝液の組成もしくは濃度を調節することによって解明され得る。一般的には、ハイブリダイゼーション反応と同様に、反応温度を上昇させることは、増幅反応のストリンジェンシーを増大させる。
【０１５２】
（４．Ａ１分子）
上記のように、Ａ１分子は、テンプレートとしてＮ１の一部分を使用して増幅される。特定の実施形態において、Ａ１は、比較的短いものであり得、そして最大で２５ヌクレオチド、最大で２０ヌクレオチド、最大で１７ヌクレオチド、最大で１５ヌクレオチド、最大で１０ヌクレオチド、または最大で８ヌクレオチドを有する。このような短い長さは、Ｎ１分子の作製において使用されるＴ１分子またはＯＤＮＰを適切なように設計することによって達成され得る。例えば、Ｎ１分子を提供する第３の型について（図６）、Ｔ１は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側の短い領域を有するように設計され得る。Ｎ１分子を提供する第４の型について（図９〜１１）、ＯＤＮＰ対は、そのプライマーが標的核酸にアニールする場合に互いに対して近接となるように設計され得る。Ａ１分子が短い長さであることは、有益であり得る。なぜなら、そうすることは、増幅の効率および速度を増加させるからである。さらに、このことは、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼの使用を可能にする。これはまた、質量分析法による分析のような特定の技術を介して、Ａ１分子および／または以後の増幅反応（ここでは、Ａ１が、初回増幅プライマーとして使用される）の生成物（Ａ２）の検出を容易にする。
【０１５３】
（５．Ｔ２分子）
本発明のＴ２分子は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、ならびに、そのＮＡＲＳのセンス鎖の配列に対して３’側に位置づけられ、テンプレートとして初回核酸分子Ｎ１の一部分を使用して増幅される一本鎖核酸分子（Ａ１）に対して少なくとも実質的に相補的な配列、を含む。好ましくは、Ｔ２分子は、Ａ１分子に対して完全に相補的な配列を含む。
【０１５４】
また上記で考察されたように、上記の第４の型の例示的な方法において、プライマー対を用いて増幅される標的核酸の部分は、特定の病原性生物に対して特異的である領域、またはいくつかの密接に関連した病原性生物の間では実質的にまたは完全に保存されているが、他の遠縁または無縁の病原性生物には存在しない領域であり得る。さらに、標的核酸の増幅部分は、いくつかの密接に関連した病原性生物の間における、標的核酸の可変領域であり得る。増幅領域が実質的に保存されている場合、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して３’側に位置づけられ、特定の生物由来の増幅領域の一方の鎖に対して同一である配列を含むＴ２分子を使用して、高度にストリンジェントな条件下（例えば、特定の生物以外の生物に由来するＡ１分子が、Ｔ２分子とハイブリダイズするのを防止するために、比較的高い増幅温度）で増幅反応を実施することにより、特定の生物の存在が検出され得る。あるいは、中程度または低度のストリンジェント条件下（例えば、特定の生物に密接に関連する生物に由来するＡ１分子がＴ２分子とハイブリダイズすることを可能にし、そしてテンプレートとしてＴ２分子の一部分を使用して伸長されることを可能にするために、比較的低い増幅温度）で増幅反応を実施することにより、特定の生物の存在を検出するために、ならびに、特定の生物に密接に関連した１つ以上の生物の存在を検出するために、同じＴ２分子が使用され得る。
【０１５５】
さらに、増幅領域が、密接に関連した生物の間における可変領域である実施形態において、Ｔ２分子は、上記の密接に関連した生物の中で特定の生物に由来するＮ１分子を使用して増幅されるＡ１分子に対して少なくとも実質的に相補的である配列を含み得る。テンプレートとしてこのＴ２分子の一部分を使用する一本鎖核酸分子の増幅によって、生物学的サンプル中における特定の生物の存在が示される。
【０１５６】
特定の実施形態では、さらなるＴ２分子は、第２の増幅反応に必要とされない。これらの実施形態では、Ｎ１分子を生成する際に使用された第２のＯＤＮＰは、その第２のＯＤＮＰがＡ１にアニールするのを可能にする３’末端の配列を有する。この第２のＯＤＮＰはまた、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む。従って、テンプレートとして第２のＯＤＮＰを使用したＡ１の伸長により、二本鎖ＮＡＲＳが作製される。ＤＮＡポリメラーゼと、ＮＡＲＳを認識するＮＡとの存在下において、一本鎖核酸（Ａ２）は、テンプレートとしてＡ１を使用して増幅される。上記の実施形態の一例を、図１０ｂに例示する。この図１０ｂにおいて、Ａ１ａおよびＡ１ｂは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を各々含む２つのＯＤＮＰを使用する第１の増幅反応において増幅される（図１０ａ）。
【０１５７】
Ｔ２分子は、特定の実施形態では、固体支持体に、好ましくはその５’末端で、固定され得る。他の実施形態では、Ｔ２分子は、固定されなくてもよい。
【０１５８】
（６．増幅された一本鎖核酸の検出および／または特徴付け）
病原性生物に由来する標的核酸の存在は、増幅産物（例えば、Ａ１、Ａ２など）を検出および／または特徴付けることによって検出され得る。一本鎖核酸分子を検出または特徴付けるために適切な任意の方法が使用され得る。例えば、増幅反応は、標識化されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下において実施され得、その結果、その標識が、増幅された核酸分子に組み込まれる。核酸フラグメントに組み込まれるために適切な標識、およびそのフラグメントの以後の検出のための方法は、当該分野で公知であり、そして例示的な標識としては、放射性標識（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉまたは３５Ｓ）、着色反応産物を生成し得る酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５９】
あるいは、増幅された核酸分子は、その増幅された核酸分子に対して実質的に（好ましくは、完全に）相補的である標識化されたディテクターオリゴヌクレオチドの使用によって検出され得る。標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と同様に、ディテクターオリゴヌクレオチドもまた、放射性タグ、化学発光タグまたは蛍光タグ（蛍光分極または蛍光共鳴エネルギー輸送を使用する検出のために適切なタグを含む）などで標識され得る。Ｓｐａｒｇｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ７：３９５−４０４，１９９３；Ｈｅｌｌｙｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １７３：９３４−４１，１９９６；Ｗａｌｋｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３４８−５３，１９９６；Ｗａｌｋｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：９−１３，１９９６；Ｓｐｅａｒｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：１３０−７，１９９７；Ｍｅｈｒｐｏｕｙａｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ １１：３３７−４７，１９９７；およびＮａｄｅａｕら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６：１７７−８７，１９９９を参照のこと。
【０１６０】
特定の実施形態において、増幅された核酸分子は、さらに特徴付けられ得る。この特徴付けにより、これらの核酸分子の正体が確認され得、それにより、生物学的サンプル中における病原性生物の標的核酸の存在が確認され得る。このような特徴付けは、一本鎖核酸フラグメントを特徴付けるために適切な任意の公知の方法を介して行われ得る。例示的な技術としては、クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー）、質量分析法および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。種々の例示的な方法の詳細な説明、米国仮特許出願６０／３０５，６３７および同６０／３４５，４４５（それらの全体が参考として援用される）に見いだされ得る。
【０１６１】
増幅産物を検出および／または特徴付けして、生物学的サンプル中の標的核酸の存在を検出することに加えて、標的核酸の存在は、増幅反応において生成された完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子（例えば、Ｈ１、Ｈ２またはそれらのニック形成生成物）を検出することによって検出され得る。好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子の検出は、二本鎖核酸分子に特異的に結合し、そして二本鎖核酸分子への結合に際して蛍光性となる色素（例えば、蛍光性インターカレート剤）を、増幅混合物に添加することによって行われ得る。蛍光性インターカレート剤の添加により、核酸増幅のリアルタイムモニタリングが可能になる。あるいは、二本鎖核酸分子（例えば、Ｈ１およびＨ２）の生成を最大にするために、ニック形成伸長反応混合物中において、ＤＮＡポリメラーゼではなくＮＥを、不活性化し得る（例えば、熱処理によって）。ＮＥの不活性化により、反応混合物中のすべてのニック形成された核酸分子が、二本鎖核酸分子を生成するように伸長される。
【０１６２】
種々の蛍光挿入剤が、当該分野において公知であり、そして本発明において使用され得る。例示的な挿入剤としては、米国特許第４，１１９，５２１号；同５，５９９，９３２号、同５，６５８，７３５号；同５，７３４，０５８号；同５，７６３，１６２号；同５，８０８，０７７号；同６，０１５，９０２号；同６，２５５，０４８号および同６，２８０，９３３号に開示される挿入剤、ＧｌａｚｅｒおよびＲｙｅ、Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８５９〜６１、１９９２において論じられる挿入剤、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素ならびに、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＩおよびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＩＩのようなＳＹＢＲ（登録商標）色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ ＷＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光挿入剤によって生成される蛍光は、ＰＭＴ、ＣＣＤカメラ、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー、および蛍光マイクロプレートリーダー、蛍光キャピラリーリーダーを含む種々の検出器によって検出され得る。
【０１６３】
（７．診断において有用な組成物およびキット）
病原体診断において有用な組成物およびキットは、核酸の指数関数的な増幅のための、上記のような組成物およびキットと同じであり得る。特定の実施形態において、これらの組成物およびキットは、増幅生成物の検出を容易にするために、付加的な成分をさらに含み得る。例えば、付加的な成分は、増幅生成物へ組み込まれる標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。あるいは、増幅生成物とハイブリダイズ可能である標識された検出オリゴヌクレオチドであり得る。特定の実施形態において、付加的な成分は、蛍光挿入剤であり得る。
【０１６４】
（８．本発明の診断的使用）
本発明は、目的の任意の標的核酸の存在を迅速に検出することにおいて有用である。特定の実施形態において、標的核酸は、病原性生物（例えば、感染性疾患を引き起こす生物）由来であるか、または病原性生物を起源とする。このような病原性生物は、生体に脅威を突きつける病原性生物（例えば、炭疽および痘瘡）を含む。さらに、上記のように、本発明の方法は、特定の病原性生物の存在の検出のために、そして、幾つかの密接に関連する病原性生物の存在を検出するために使用され得る。本発明はまた、特定の抗生物質に対して耐性のある生物を検出するために使用され得る。例えば、本発明の方法、組成物またはキットは、抗生物質または抗生物質の特定の組み合わせで処置された被験体における特定の病原性生物の検出のために使用され得る。さらに、幾つかの実施形態における核酸増幅を検出するための蛍光挿入剤の使用は、生物学的サンプルにおける標的核酸のリアルタイム検出を提供する。
【０１６５】
（Ｃ．遺伝子バリエーション検出における核酸増幅方法および組成物の使用）
指数関数的な核酸増幅のための方法および組成物はまた、標的核酸における規定された位置で、遺伝子バリエーションを検出するために使用され得る。遺伝子バリエーションを含む標的核酸またはその一部は、第１の増幅反応において、テンプレートとして使用される初回核酸分子（Ｎ１）へ、最初に組み込まれる。初回核酸分子はまた、第１のニック形成剤認識配列の少なくとも一方の鎖を含み、従って、ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下において、第１の増幅反応を可能にする。第１の増幅反応からの生成物（Ａ１）は、標的核酸における規定された位置のヌクレオチドまたは上記のヌクレオチドの相補的ヌクレオチドを含む。次いで、Ａ１は、別のテンプレート核酸（Ｔ２）に対してアニールする。Ｔ２は、第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含み、従って、ＤＮＡポリメラーゼおよび第２のＮＡＲＳを認識するニック形成剤の存在下で、第２の増幅反応を可能にする。Ａ１および／またはＡ２の特徴付けは、標的核酸における遺伝子バリエーションの同定を可能にする。
【０１６６】
（１．標的核酸）
遺伝子バリエーションを同定することに関連する本発明の標的核酸は、参照として野生型核酸配列を使用する遺伝子バリエーションを含み得る任意の核酸分子である。それは、固体支持体に対して固定化されてもよいし、または固定化されなくてもよい。それは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖標的核酸は、変性した二本鎖ＤＮＡの一方の鎖であり得る。あるいは、いかなる二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であり得る。１つの局面において、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、リボソームＤＮＡおよびｃＤＮＡを含むＤＮＡである。別の局面において、標的は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡを含むＲＮＡである。
【０１６７】
１つの局面において、標的核酸は、天然に存在する核酸か、または天然に存在する核酸由来のいずれかである。天然に存在する標的核酸は、生物学的サンプルから得られる。好ましい生物学的サンプルは、１以上の哺乳動物組織、好ましくはヒト組織（例えば、血液、血漿／血清、髪、皮膚、リンパ節、膵臓、肝臓など）および／あるいは細胞または細胞株を含む。生物学的サンプルは、１以上のヒト組織および／またはヒト細胞を含み得る。哺乳動物および／またはヒトの組織および／または細胞は、１以上の腫瘍組織および／または腫瘍細胞をさらに含み得る。
【０１６８】
生物学的サンプルから核酸の集団を単離するための方法論は、本発明の属する分野の当業者に周知であり、そして容易に利用可能である。例示的な技術は、例えば、以下の実験室研究マニュアルにおいて記載される：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第３版、２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）（本明細書でその全体が参考として援用される）。核酸単離キットはまた、多数の企業から商業的に入手可能であり、そして単離プロセスを簡素化および促進するために使用され得る。
【０１６９】
標的核酸は、１以上の正体不明のヌクレオチド（すなわち、遺伝子バリエーション）を含む。本発明は、未知のヌクレオチドの正体が分かり、それによって遺伝子バリエーションが同定される、組成物および方法を提供する。正体不明の塩基は、ヌクレオチド座（または「規定された位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」あるいは「規定された位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）」）に存在し、それは、標的核酸上に正確な位置を有する１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のヌクレオチドを含む特定のヌクレオチドまたは領域をいう。
【０１７０】
用語「多型性」は、集団における小さい領域（すなわち、１〜数個（例えば、２、３、４、５、６、７、または８）のヌクレオチド長）中の、２以上の遺伝子決定された代替配列または対立遺伝子の存在をいう。２以上の遺伝子決定された代替配列または対立遺伝子は各々、「遺伝子バリエーション」として言及され得る。遺伝子バリエーションは、選択された集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子形態であり得、それはまた、「野生型形態」または他の対立遺伝子形態の１つとして言及され得る。二倍体生物は、対立遺伝子形態に対して同型接合または異型接合であり得る。
【０１７１】
遺伝子バリエーションは、発現レベルおよび発現生成物（すなわち、コードされたペプチド）を含む遺伝子発現に対する作用を有してもよいし、または有さなくてもよい。遺伝子発現に作用する遺伝子バリエーションはまた、点変異、フレームシフト変異、調節性変異、ナンセンス変異、およびミスセンス変異を含む「変異」として言及される。「点変異」は、野生型塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）が、核酸サンプル内の規定されたヌクレオチド座で、他の標準的な塩基の１つと置換される変異をいう。点変異は、塩基置換または塩基欠失によって引き起こされ得る。「フレームシフト変異」は、小さい欠失または挿入によって引き起こされ、これは次に、遺伝子の読み取り枠のシフトを引き起こし、従って、新規なペプチドが形成される。「調節性変異」は、非コード領域（例えば、イントロン）（正確な遺伝子発現（例えば、生成量、タンパク質の局在性、発現の時期）に作用するコード領域に対して５’側または３’側に位置する領域）における変異をいう。「ナンセンス変異」は、単一のヌクレオチド変化であって、ペプチド伸長の未成熟な終結（すなわち、短縮されたペプチド）を引き起こす「停止」コドンとして読まれる三重鎖コドン（ここで変異が生じる）が結果として生じる。「ミスセンス」変異は、異なるアミノ酸に交換される１個のアミノ酸が生じる変異である。このような変異は、ペプチドのフォールディング（３次元構造）および／または多量体タンパク質における他のペプチドとのその適切な会合において変化を引き起こし得る。
【０１７２】
本発明の１つの局面において、遺伝子バリエーションは、「単一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）であり、これは、任意の単一のヌクレオチド配列改変、好ましくは、生物の集団において一般的であり、そしてメンデル様式で遺伝される単一ヌクレオチド配列改変をいう。代表的には、ＳＮＰは、２個の可能性のある塩基のいずれかであり、そして、ＳＮＰ部位で第３のヌクレオチド実体または第４のヌクレオチド実体を見出す可能性はない。
【０１７３】
遺伝子バリエーションは、疾患または障害と関連しうるか、またはそれらを引き起こし得る。本明細書で使用される用語「関連する」は、遺伝子バリエーションの発生と宿主における疾患または障害の存在との間の正の相関の存在をいう。このような疾患または障害は、ヒト遺伝性疾患または障害であり得、これらとしては、以下に限定されないが、嚢胞性線維症、膀胱癌、結腸直腸の腫瘍、鎌状血球貧血、サラセミア、ａｌ−抗トリプシン（ａｌ−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）欠損、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症／ムコビシドーシス、デュシェーヌ／ベッカー筋ジストロフィー、アルツハイマー病、Ｘ染色体依存性精神遅滞、およびハンティングトン舞踏病、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、重症複合免疫不全、α−１−抗トリプシン欠損、白皮症、アルカプトン尿症、リソソーム蓄積症、エーレルス−ダンロー症候群、血友病、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ障害、無ガンマグロブリン血症、尿崩症、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、ファブリー病、脆弱Ｘ症候群、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎臓症、遺伝性球状赤血球病、マルファン症候群、ヴォン・ヴィレブランド病、神経線維腫症、結節硬化症、遺伝性出血性毛細管拡張症、家族性結腸ポリポーシス、エーレルス−ダンロー症候群、筋緊張性ジストロフィー、骨形成不全症、急性間欠性ポルフィリン症、およびフォン・ヒッペル−リンダウ病が挙げられる。
【０１７４】
標的核酸は、以下に記載されるように、初回核酸に組み込まれる前に増幅され得る。核酸を増幅させるための任意の公知の方法が、使用され得る。例示的な方法としては、以下に限定されないが、Ｑβレプリカーゼ、鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：１６９１〜６、１９９５）、転写媒介増幅（Ｋｗｏｈら、ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ８８／１０３１５）、ＲＡＣＥ（Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８：３４０〜５６、１９９３）、片側ＰＣＲ（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．８６：５６７３〜７、１９８９）、およびギャップ−ＬＣＲ（Ａｂｒａｖａｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５〜８２、１９９５）の使用が挙げられる。引用された文献およびＰＣＴ国際特許出願は、本明細書でその全体が参考として援用される。
【０１７５】
（２．初回核酸分子（Ｎ１））
遺伝子バリエーションの検出のために有用な初回核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、Ｎ１は、Ｔ１分子に対する、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングによって得られ得、ここでトリガープライマーは、標的核酸分子由来であり、そして標的核酸における遺伝子バリエーションを囲む（例えば、図１４）。あるいは、Ｎ１は、（例えば、図１５に示されるように制限エンドヌクレアーゼによる標的核酸の消化によって）二本鎖標的核酸より直接誘導され得る。Ｎ１はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対の使用によって調製され得る（例えば、図１６〜１８）。初回核酸分子を提供するための幾つかの例示的な手段は、以下に記載される。
【０１７６】
（ａ．Ｎ１分子を提供するための第１の型の例示的な方法）
上記のように、Ｎ１は、Ｔ１分子に対するトリガーオリゴヌクレオチドのアニーリングによって提供され得る。トリガープライマーは、標的核酸の遺伝子バリエーションを囲む必要がある。Ｎ１分子を提供するためのこの型の例示的な方法が、図１４において示される。この図に示されるように、二本鎖標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、認識配列が、遺伝子バリエーションが存在する規定された位置に近い制限エンドヌクレアーゼによって、まず切断される。消化生成物は、変性され得、次いで、潜在的な遺伝子バリエーションを含む消化生成物の鎖は、テンプレート核酸（Ｔ１）に対してアニールするためにトリガーオリゴヌクレオチドプライマーとして使用され得る。Ｔ１は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、その結果、ＤＮＡポリメラーゼおよび認識配列を認識するニック形成剤の存在下において、標的核酸の遺伝子バリエーションの相補的なヌクレオチドを含む一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）が、増幅される。
【０１７７】
（ｂ．Ｎ１分子を提供するための第２の型の例示的な方法）
本発明の特定の実施形態において、Ｎ１は、潜在的な遺伝子バリエーション、ニック形成剤認識配列、および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む標的核酸から直接誘導される。例示的なニック形成剤認識配列として、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識可能な認識配列を用いる実施形態が、図１５に示される。この図において示されるように、標的核酸は、標的核酸における配列を認識する制限エンドヌクレアーゼによって消化され得る。ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む消化生成物は、一本鎖核酸（Ａ１）フラグメントを増幅するための初回核酸分子（Ｎ１）として機能し得る。遺伝子バリエーション（「Ｘ」）は、ニック形成剤によって生成されるニック形成部位に対応する位置と制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位との間に存在する必要がある。このような位置によって、増幅されたフラグメント（Ａ１）が、遺伝子バリエーションの相補体（「Ｘ］）を含むことが可能となる。
【０１７８】
（ｃ．Ｎ１分子を提供するための第３の型の例示的な方法）
本発明の特定の実施形態において、初回核酸分子Ｎ１は、種々のＯＤＮＰ対を使用して生成される完全に二本鎖の核酸分子か、または部分的に二本鎖の核酸分子である。Ｎ１分子を調製するためにＯＤＮＰ対を使用する方法は、図１６〜１８と合わせて、以下に簡単に記載される。より詳細な説明は、米国仮出願番号６０／３０５，６３７および同６０／３４５，４４５に見出され得る。
【０１７９】
特定の実施形態において、Ｎ１に対する前駆体は、二本鎖ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列は、プライマー対を使用して前駆体へ組み込まれる。例示的なニック形成剤認識配列として、ニック形成剤認識配列の外側にニック形成するニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識可能な認識配列、および例示的な制限エンドヌクレアーゼ認識配列として、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を用いる実施形態が、図１６に示される。この図に示されるように、第１のプライマーは、ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列を含み、一方、第２のＯＤＮＰは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。これらの２つのＯＤＮＰが、標的核酸の一部を増幅するためにプライマーとして使用される場合に、生じる増幅生成物（すなわち、Ｎ１に対する前駆体）は、二本鎖ＮＥＲＳおよび二本鎖ＴＲＥＲＳの両方を含む。さらに、第１のプライマーは、遺伝子バリエーションの相補体に対して３’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計されるのに対し、第２のプライマーは、遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計される。このような設計によって、Ｎ１に対する前駆体が、遺伝子バリエーションおよびその相補体を囲むことが可能になる。ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの存在下では、増幅生成物は、二本鎖ＮＥＲＳを含む部分的に二本鎖の核酸分子Ｎ１を生成するように消化される。
【０１８０】
他の実施形態において、Ｎ１に対する前駆体は、２つの二本鎖ニック形成剤認識配列を含む。２つのニック形成剤認識配列は、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Ｎ１に対する前駆体へ組み込まれる。例示的なニック形成剤認識配列として、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能な認識配列を用いた実施形態が、図１７に示される。この図に示されるように、両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。さらに、第１のプライマーが、遺伝子バリエーションの相補体に対して３’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計されるのに対し、第２のプライマーは、遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計される。これらの２つのプライマーが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合に、生じる増幅生成物（すなわち、以下に記載されるＮ１ａおよびＮ１ｂに対する前駆体）は、遺伝子バリエーションおよびその相補体、ならびに２つのニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの２つの認識配列は、互いに同一であっても、または同一でなくてもよいが、好ましくは、それらは同一である。ニック形成エンドヌクレアーゼまたは認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅生成物は、二本鎖ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の１つを各々含む２つの部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成するために、２回（各鎖に対して１回）ニック形成される。
【０１８１】
例示的なニック形成剤認識配列として半改変された（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）制限エンドヌクレアーゼ認識配列を用いる別の実施形態が、図１８に示される。この図に示されるように、第１のプライマーおよび第２のプライマーの両方は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。さらに、第１のプライマーは、遺伝子バリエーションの相補体に対して３’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計されるのに対し、第２のプライマーは、遺伝子バリエーションに対して３’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計される。これらの２つのプライマーが、改変されたデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合に、生じる増幅生成物（すなわち、以下に記載されるＮ１ａおよびＮ１ｂに対する前駆体）は、遺伝子バリエーションおよびその相補体、ならびに２つの半改変された制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの２つの半改変された認識配列は、互いに同一であってよいし、または同一でなくてもよい。制限エンドヌクレアーゼおよび半改変された認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼの存在下で、上記増幅生成物は、１つの半改変された制限エンドヌクレアーゼ認識配列の少なくとも一方の鎖の配列を各々含む、２つの部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成するようにニック形成される。
【０１８２】
上記第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰ、またはその両方は、特定の実施形態において固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、標的核酸を含むサンプルの核酸分子が、固定化される。
【０１８３】
（３．Ａ１分子）
以上に記載されたように、Ａ１分子は、Ｎ１の一部をテンプレートとして使用して増幅される。このＮ１の一部は、標的核酸の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含み、その結果、Ａ１は、遺伝子バリエーションの相補体または遺伝子バリエーション自体を含む。Ａ１は、比較的短いものであり得、そして多くとも２５個、２０個、１７個、１５個、１０個、８個のヌクレオチドを有する。このような短い長さは、Ｎ１分子を作製する際に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを適切に設計することによって達成され得る。例えば、Ｎ１分子を提供する第３の型について（図１６〜１８）、ＯＤＮＰ対は、それらが標的核酸にアニールする場合に、互いに近接となるように設計され得る。上記の本発明の診断適用と類似して、Ａ１分子の長さを短くすることは、増幅効率および増幅速度を増加させ、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼの使用を可能にし、Ａ１分子および／またはＡ１が、例えば、質量分析のような特定の技術を介して初回増幅プライマーとして使用されるその後の増幅反応の生成物（Ａ２）の検出を容易にする。
【０１８４】
（４．Ｔ２分子）
本発明のＴ２分子は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列、およびテンプレートとして開始核酸分子Ｎ１の一部を使用して増幅される一本鎖核酸分子（Ａ１）に少なくとも実質的に相補的である（このＮＡＲＳのセンス鎖の配列に対して３’側に位置する）配列を含む。Ｔ２は、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、その認識配列のセンス鎖の配列を含むので、Ａ１は、開始核酸伸長のためのプライマーとして使用され、続いて、別の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅するためのテンプレートとして使用される。上記のように、Ａ１は、標的核酸の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含む。従って、Ａ２は、遺伝子バリエーションの相補体または遺伝子バリエーションそれ自体を含む。従って、Ａ２の特徴付けは、その標的核酸の遺伝子バリエーションの検出および／または同定を可能にする。
【０１８５】
本発明の診断適用と同様に、本発明に従う遺伝子バリエーション検出の特定の実施形態において、さらなるＴ２分子は、第二の増幅反応のために必要でない。これらの実施形態において、Ｎ１分子を生成する際に使用される第二のＯＤＮＰは、３’末端配列を有し、この３’末端配列は、第二のＯＤＮＰがＡ１にアニーリングするのを可能にする。この第二のＯＤＮＰはまた、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む。従って、この第二のＯＤＮＰをテンプレートとして使用するＡ１の伸長により、二本鎖ＮＡＲＳが作製される。ＤＮＡポリメラーゼおよびＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、一本鎖核酸（Ａ２）は、Ａ１をテンプレートとして使用して増幅される。
【０１８６】
特定の実施形態において、このＴ２分子は、好ましくは、その５’末端を介して、固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、このＴ２分子は、固定化されていなくてもよい。
【０１８７】
（５．増幅された一本鎖核酸の特徴付け）
標的核酸における潜在的な遺伝子バリエーションは、増幅産物（すなわち、Ａ１およびＡ２）を特徴付けることによって、検出または同定され得る。一本鎖核酸分子を特徴付けするのに適切な任意の方法が、使用され得る。例示的な技術としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー）、質量分析法および電気泳動。種々の例示的な方法の詳細な説明は、米国仮特許出願番号６０／３０５，６３７および６０／３４５，４４５において見出され得る。
【０１８８】
増幅された一本鎖核酸フラグメントを特徴付けするための多くの方法論をまた使用して、増幅反応混合物中の特定の増幅された一本鎖核酸フラグメントの量を測定し得る。例えば、増幅された一本鎖核酸分子が、液体クロマトグラフィーによってその増幅反応混合物中の他の分子から最初に分離され、次いで質量分光分析に供される実施形態において、この増幅された一本鎖核酸分子の量は、核酸分子を含む画分の液体クロマトグラフィーによってか、または核酸分子に対応する質量分光ピークのイオン電流測定値のいずれかによって、定量され得る。
【０１８９】
このような方法論を使用して、標的核酸の対立遺伝子改変体もまた存在し得る核酸集団内の標的核酸の対立遺伝子頻度を決定し得る。「対立遺伝子改変体」とは、標的核酸の規定された位置以外でその標的核酸と同一の配列を有する、核酸分子をいう。「核酸集団内の標的核酸の対立遺伝子頻度」とは、標的核酸である核酸集団内での標的核酸およびその対立遺伝子改変体の総量の割合をいう。Ｎ１に対する前駆体を調製する際に使用されるプライマー対は、標的の規定された位置における潜在的な遺伝子バリエーションの各部位においてその標的核酸の一部にアニーリングするように設計されているので、このプライマー対をプライマーとして使用し、この標的核酸を含む核酸集団をテンプレートとして使用する増幅は、この標的核酸の規定された位置において遺伝子バリエーションを含む核酸フラグメントを生じ、そして対立遺伝子改変体がこの核酸集団内に存在する場合、その標的核酸の対立遺伝子改変体の同じ位置において遺伝子バリエーションを含む核酸フラグメントを生じる。標的核酸およびその対立遺伝子改変体の配列は、その規定された位置においてのみ異なるので、標的核酸および対立遺伝子改変体をそれぞれテンプレートとして使用して、Ｎ１に対する前駆体は、同一または類似の効率で増幅される。同様に、標的核酸の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含む一本鎖核酸分子（Ａ１）は、対立遺伝子改変体の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含む一本鎖核酸分子の増幅と同一または類似の効率で増幅される。さらに、標的およびその対立遺伝子改変体をそれぞれテンプレートとして使用して、同じ効率で増幅されたＡ１分子にアニーリングするＴ２分子が使用される場合、開始テンプレートとして標的を用いて増幅されたＡ２分子 対 開始テンプレートとして改変体を使用して増幅されたＡ２分子の比は、その核酸集団内の標的 対 その改変体の比を反映する。従って、反応混合物中のＡ１（またはＡ２）分子の相対量の測定値は、この核酸集団内の標的核酸の相対量を示す。
【０１９０】
（６．遺伝子バリエーションの検出に有用な組成物およびキット）
遺伝子バリエーションの検出に有用な組成物およびキットは、指数関数的核酸増幅について上記される組成物およびキットと同じであり得る。特定の実施形態において、これらのキットは、増幅産物を特徴付けする際に有用な１つ以上のさらなる構成要素をさらに備え得る。例えば、このさらなる構成要素は、以下の（１）〜（５）であり得る：（１）クロマトグラフィーカラム；（２）核酸のクロマトグラフィーによる特徴付けまたは分離を実施するための緩衝液；（３）マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート；（４）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のための、オリゴヌクレオチド標準（例えば、６マー、７マー、８マー、１０マー、１２マー、１４マー、および１６マー）；ならびに、（５）このキットを使用するための指示書冊子。
【０１９１】
（７．本発明の遺伝子バリエーション検出方法の適用）
上で詳細に記載されるように、本発明は、標的核酸における遺伝子バリエーションを検出および／または同定するための方法を提供する。本発明に従う方法は、遺伝子バリエーションを同定または測定することが望ましいかまたは必要である、広範な種々の適用における有用性を見出し得る。このような適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：遺伝性の転移性疾患についての遺伝子分析、腫瘍診断、疾患の素因、法医学、親子鑑定、植物栽培もしくは動物の繁殖の促進、細胞機能および／もしくは疾患マーカー遺伝子の発現プロファイリング、ならびに植物もしくは動物において感染性疾患を引き起こし、そして／もしくは食物安全性に関連する感染性生物の同定および／または特徴付けが挙げられる。
【０１９２】
例えば、本発明は、法医学的目的のための遺伝子分析において有用であり得る。ＤＮＡ配列バリエーションのレベルにおける個体の同定は、従来基準（例えば、指紋、血液型または身体的特徴）よりも有利である。大部分の表現型マーカーとは対照的に、ＤＮＡ分析は、親子鑑定において必要とされるような個体間の関連性の推定を容易に可能にする。遺伝子分析は、密接に関連したドナー細胞とレシピエント細胞との間を識別する必要がある骨髄移植において、高度に有用であることが証明されている。本発明は、サンプルＤＮＡの多型を特徴付けする際に、従って法医学的ＤＮＡ分析において、有用である。例えば、サンプル中の２２の別個の遺伝子配列の分析（各々１つずつが、集団において２つの異なる形態で存在する）が、１０１０の異なる結果を生み出し、このことは、ヒトの個体の唯一の識別を可能にする。
【０１９３】
ウイルス性または細胞性の癌遺伝子の検出は、核酸診断の適用の別の重要な分野である。ウイルス性癌遺伝子（ｖ癌遺伝子）は、レトロウイルスにより伝播され、一方で、これらの細胞性の対応物（ｃ癌遺伝子）は、正常な細胞内にすでに存在する。しかし、細胞性癌遺伝子は、特定の改変（例えば、（膀胱癌および結腸直腸癌におけるｃ−Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子におけるような）点変異）、小さな欠失および小さな挿入により活性化され得る。この活性化プロセスの各々は、さらなる縮重プロセスと組み合わせて、増加した制御されていない細胞増殖を導く。さらに、点変異、小さい欠失または挿入はまた、いわゆる「劣性癌遺伝子」を不活性化し得、そしてそれにより（網膜芽細胞腫（Ｒｂ）遺伝子および骨肉腫におけるような）腫瘍の形成を導く。本発明は、癌遺伝子を活性化するかまたは劣性癌遺伝子を不活性化する（これらは、次いで、癌を引き起こす）点変異、小さい欠失、および小さい変異の検出または識別において有用である。
【０１９４】
本発明はまた、移植分析において有用であり得る。移植された組織の拒絶反応が、特定のクラスの組織適合抗原（ＨＬＡ）によって決定的に制御される。これらは、抗原提示血液細胞（例えば、マクロファージ）の表面上で発現される。ＨＬＡと外来抗原との間の複合体は、細胞表面上の対応するＴ細胞レセプターを介してＴヘルパー細胞により認識される。ＨＬＡ、抗原、およびＴ細胞レセプターの間の相互作用は、複雑な防御反応を引き起こし、これは、身体に対するカスケード様免疫応答を導く。
【０１９５】
異種外来抗原の認識は、抗体反応に類似して、Ｔ細胞レセプターの抗原特異的可変領域により媒介される。従って、移植片の拒絶において、外来抗原に適合する特異的なＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞は、Ｔ細胞プールから排除され得る。そのような分析は、抗原特異的な可変ＤＮＡ配列の同定により可能であり、ここでこの配列は、ＰＣＲにより増幅され、従って選択的に増加される。特異的な増幅反応は、特異的なＴ細胞レセプターの、単一の細胞に特異的な同定を可能にする。
【０１９６】
同様の分析が、若年性糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、または脳脊髄炎のような自己免疫疾患の同定のために本明細書において実施される。
【０１９７】
本発明は、種々の外来抗原の認識に関連する抗原特異的な可変領域をコードするＴ細胞レセプター遺伝子における遺伝子バリエーションを決定するために有用である。従って、本発明は、移植された組織の拒絶反応の可能性を予測する際に有用であり得る。
【０１９８】
本発明はまた、ゲノム診断において有用であり得る。全ての新生児の４％が、遺伝的欠損を有して生まれる；たった１つの遺伝子の改変により引き起こされる、記載された３，５００の遺伝性疾患のうち、原発性の分子の欠損は、それらのうち約４００についてのみ知られている。
【０１９９】
遺伝性疾患は、長い間、表現型分析（病歴（例えば、血液の欠乏：サラセミア））、染色体分析（核型（例えば、モンゴリズム：２１トリソミー））または遺伝産物分析（改変タンパク質（例えば、フェニルケトン尿症：フェニルピルビン酸の増強されたレベルを生じる、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素の欠損））により診断されてきた。核酸検出方法のさらなる使用は、ゲノム診断の範囲を非常に増大させる。
【０２００】
特定の遺伝子疾患の場合、２つの対立遺伝子のうちたった１つの改変が、疾患のために十分である（優性に伝播された単一遺伝子欠損）；多くの場合、両方の対立遺伝子は、改変されなくてはならない（劣性に伝播された単一遺伝子欠損）。第３の型の遺伝子欠損において、この疾患の発症は、遺伝子の改変によってだけでなく、食習慣（糖尿病または動脈硬化の場合）またはライフスタイル（癌の場合）のような要因によっても決定される。非常にしばしば、これらの疾患は、高齢者において生じる。精神分裂病、躁うつ病または癲癇のような疾患は、また、この文脈において、言及されるべきである；これらの場合において、この疾患の発症が、環境要因および異なる染色体位置におけるいくつかの遺伝子の改変に依存するか否かは、調査中である。
【０２０１】
直接的および間接的なＤＮＡ分析を用いて、以下の一連の遺伝子疾患の診断が可能になっている：膀胱癌、結腸直腸癌、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ａ１−抗トリプシン欠損、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症／ムコビシドーシス、デュシェーヌジストロフィー／ベッカー型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、Ｘ染色体依存性精神遅滞、およびハンティングトン舞踏病、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、重症複合型免疫不全、α１−抗トリプシン欠損、白皮症、アルカプトン尿症、リソソーム蓄積症（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、エーレルス−ダンロー症候群、血友病、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ障害、無ガンマグロブリン血症、潜伏性糖尿病、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、ファブリー病、ぜい弱Ｘ症候群、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎疾患、遺伝性球状赤血球症、マルファン症候群、ヴォン・ヴィレブランド病、神経線維腫症、結節硬化症、遺伝性出血性毛細管拡張症、家族性結腸ポリープ症、エーレルス−ダンロー症候群、筋緊張性ジストロフィー、骨形成不全症、急性間欠性ポルフィリン症、およびフォン・ヒッペル−リンダウ症候群。本発明は、規定された位置での点変異、小さい欠損または小さい挿入により引き起こされる任意の遺伝子疾患の診断に有用である。
【０２０２】
関連した局面において、本発明は、疾患感受性についての試験において使用され得る。特定の遺伝子バリエーションは、直接的に疾患を引き起こさないが、これらは、疾患に関連する。言い換えれば、被験体によるこれらの遺伝子のバリエーションの保持は、被験体を、これらの疾患に対して感受性にする。本発明の方法を用いるそのような遺伝子バリエーションの検出は、特定の疾患の疑いのある被験体の識別および引き続く予防方法の実施を可能にする。
【０２０３】
本発明はまた、薬理ゲノム学にも適用可能である。例えば、それは、薬物耐性に関連する遺伝子（例えば、チトクロムＰ４５０遺伝子の種々の対立遺伝子）を検出または同定するために用いられ得る。
【０２０４】
さらに、本発明は、残留する疾患の検出または特徴付けのために有用な方法を提供する。言い換えれば、本発明の方法は、特定の処置（例えば、化学療法手術）の後の癌のような残留する変異体遺伝子型を検出または同定するために用いられ得る。それは、新性の変異体（例えば、病原性生物に薬物耐性を与える特定の遺伝子における遺伝子バリエーション）の同定においても有用であり得る。
【０２０５】
（Ｄ．プレｍＲＮＡの選択的スプライシング分析における核酸増幅方法および組成物の使用）
指数関数的核酸増幅のための方法および組成物はまた、プレｍＲＮＡ選択的スプライシング分析のために使用され得る。特定のエキソン−エキソン連結部を含むと疑われている標的ｃＤＮＡまたはその部分は、第一の増幅反応においてテンプレートとして使用される開始核酸分子（Ｎ１）に、最初に取り込まれる。この開始核酸分子はまた、第一のニック形成剤認識配列の少なくとも一方の鎖を含み、従って、ＤＮＡポリメラーゼおよびこの第一のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、第一の増幅反応を可能にする。この第一の増幅反応からの生成物（Ａ１）は、特定のエキソン−エキソン連結部またはその相補的な部分を含むことが疑われる標的核酸の部分を含む。次いで、Ａ１は、別のテンプレート核酸（Ｔ２）にアニーリングする。Ｔ２は、第二のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、従って、ＤＮＡポリメラーゼおよびこの第二のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、第二の増幅反応を可能にする。Ａ１および／またはＡ２のこの特徴は、標的が特定のエキソン−エキソン連結部を含むか否かを示す。
【０２０６】
（１．定義）
本明細書で用いられる「エキソン」は、成熟ＲＮＡ産物中で提示される、中断された遺伝子の任意のセグメントである。「イントロン」は、転写されるが、そのいずれかの側で配列（エキソン）をともにスプライスすることにより転写物内から除かれるセグメントをいう。
【０２０７】
本明細書で用いられるｃＤＮＡ分子の「センス鎖」は、ｍＲＮＡ中のヌクレオチド「Ｕ」がｃＤＮＡ分子ではヌクレオチド「Ｔ」により置換されることを除けば、このｃＤＮＡ分子が派生するｍＲＮＡ分子と同一の配列を有する鎖をいう。一方、ｃＤＮＡ分子の「アンチセンス鎖」は、ｃＤＮＡ分子が派生するｍＲＮＡ分子に相補的である鎖をいう。
【０２０８】
エキソン（エキソンＡ）は、エキソンＡのセンス鎖の配列がエキソンＢのセンス鎖の配列に対して５’側にあるとき、同一遺伝子内で別のエキソン（エキソンＢ）に対し「上流」にある。エキソンＡおよびエキソンＢは、さらに、それぞれ、上流エキソンおよび下流エキソンと称され得る。
【０２０９】
標的ｃＤＮＡ分子は、目的の遺伝子に由来するｃＤＮＡ分子をいう。言い換えると、それは、目的の遺伝子の転写から得られるｍＲＮＡ分子の逆転写の産物である。標的ｃＤＮＡ分子は、部分配列を有し得る（すなわち、部分的なｍＲＮＡ分子から逆転写される）が、好ましくは、全長配列である。
【０２１０】
第一のＯＤＮＰと第二のＯＤＮＰを取り囲む核酸フラグメントは、１つの鎖が第一のＯＤＮＰの配列、第二のＯＤＮＰの相補配列、および第一のＯＤＮＰと第二のＯＤＮＰの相補配列との間の配列からなり；その一方、他方の鎖が、第一のＯＤＮＰの相補配列、第二のＯＤＮＰの配列、および第一のＯＤＮＰの相補配列と第二のＯＤＮＰの配列との間の配列からなる、二本鎖核酸フラグメントと称される。
【０２１１】
「差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｔｉａｌ）スプライシング」または「選択的スプライシング」は、１つの遺伝子の同じ転写物からの、少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ分子の生成である。例えば、転写物の特定のセグメントは、ｍＲＮＡ分子の１つに存在し得るが、他のｍＲＮＡ分子からスプライシング除去され得る。
【０２１２】
「２つの特定のエキソンの連結部であると疑われる位置」または「２つの特定のエキソンの疑わしい連結部の位置」とは、比較的上流のエキソンのセンス鎖の３’末端および／またはそのエキソンのアンチセンス鎖の５’末端をいう。
【０２１３】
標的ｃＤＮＡにおける「エキソンＡおよびエキソンＢの連結部」とは、標的ｃＤＮＡのセンス鎖中の位置（ここで、エキソンＡの３’末端は、エキソンＢの５’末端と接合している）および／または標的ｃＤＮＡのアンチセンス鎖中の位置（ここで、エキソンＡの５’末端は、エキソンＢの３’末端と接合している）をいう。
【０２１４】
（２．開始核酸分子（Ｎ１））
差次的スプライシング分析のために有用な開始核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、Ｎ１は、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーのＴ１分子へのアニーリングによって得られ得る。ここで、このトリガープライマーは、標的ｃＤＮＡから誘導され、かつ２つのエキソンの連結部であると疑われる位置を包含する（例えば、図１９）。あるいは、Ｎ１は、（例えば、図２０に示されるように、制限エンドヌクレアーゼを用いた標的ｃＤＮＡの消化によって）二本鎖標的ｃＤＮＡから直接誘導され得る。Ｎ１はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対の使用によって調製され得る（例えば、図２１〜２４）。開始核酸分子Ｎ１を提供するためのいくつかの例示的な手段が、以下に記載される。
【０２１５】
（ａ．Ｎ１分子を提供するための例示的な方法の第一型）
上記のように、Ｎ１は、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーをＴ１分子にアニーリングすることによって提供され得る。このトリガープライマーは、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を包含する必要がある。Ｎ１分子を提供するための方法のこの型の例は、図１９に例示される。この図に示されるように、二本鎖標的ｃＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼによって最初に切断され、その認識配列は、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置に近接している。この消化産物は変性され得、次いで、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を含む消化産物の鎖は、テンプレート核酸（Ｔ１）にアニーリングするためのトリガーオリゴヌクレオチドプライマーとして使用され得る。Ｔ１は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、その結果、ＤＮＡポリメラーゼおよびその認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を含む一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）が増幅される。
【０２１６】
特定の実施形態において、標的ｃＤＮＡ分子は、固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、Ｔ１分子は、好ましくは、その５’末端を介して固定化され得る。
【０２１７】
（ｂ．Ｎ１分子を提供するための第２の型の例示的方法）
本発明の特定の実施形態において、Ｎ１は、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を含み、ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列をさらに含む標的ｃＤＮＡから直接誘導され得る。例示的ニック形成剤認識配列としてその認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）により認識されうる認識配列を有する実施形態は、図２０に例示される。この図に示されるように、標的ｃＤＮＡは、標的核酸における配列を認識する制限エンドヌクレアーゼにより消化され得る。ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む消化産物は、開始核酸分子（Ｎ１）として機能して、一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅し得る。特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置は、その位置が、増幅されたＡ１フラグメントへ移入されるかまたは組み込まれるように、ニック形成剤により生成されるニック形成部位と、制限エンドヌクレアーゼの切断部位との間にあることが必要である。
【０２１８】
（ｃ．Ｎ１分子を提供するための第３の型の例示的方法）
特定の実施形態において、開始核酸分子（Ｎ１）は、種々のプライマー対を使用して生成される、完全に二本鎖のまたは部分的に二本鎖の核酸分子である。以下の節は、まず、上記の開始核酸分子を提供するための一般的方法を記載し（図２１）、次いで、一般的方法のある特定の実施形態を提供する（図２２〜２４）。
【０２１９】
上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との連結部の存在または非存在を決定するために、以下の２つのプライマーから構成されるプライマー対が、使用されうる：（１）エキソンＡのアンチセンス鎖においてエキソンＡの５’末端付近にエキソンＡのアンチセンス鎖の一部に相補的な配列を含む第１プライマー、および（２）エキソンＢのセンス鎖においてエキソンＢの５’末端付近にエキソンＢのセンス鎖の一部に相補的な配列を含む第２プライマー（図２１）。第１のＯＤＮＰとエキソンＡのアンチセンス鎖の一部との間の相補性は、正確である必要はないが、このＯＤＮＰが、エキソンＡのその一部に特異的にアニールすることが可能であるに十分でなければならない。同様に、第２のＯＤＮＰと、エキソンＢのセンス鎖の一部との間の相補性は、正確である必要はないが、このＯＤＮＰがエキソンＢのその一部に特異的にアニールすることが可能であるに十分でなければならない。エキソンの鎖の一部は、その一部が、その鎖中のその末端から１００ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド以内にある場合、そのエキソンの一方の末端付近にある。ＯＤＮＰ対の２つのＯＤＮＰの間のこのような間隔を空けた配置は、エキソンＡとエキソンＢとの連結部が標的ｃＤＮＡ中に存在する場合に、標的ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、第１のプライマーおよび第２のプライマーを包含する比較的短いフラグメントの増幅を可能にする。
【０２２０】
各プライマーとその対応するエキソンの一方の鎖との間の配列相補性に加えて、第１のプライマーまたは第２のプライマーのいずれかが、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列をさらに含まなければならない。認識シーケンサーは、ニック形成エンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり得る。特定の好ましい実施形態において、第１のプライマーおよび第２のプライマーの両方が、ニック形成剤認識配列を含む。認識配列の存在は、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む増幅核酸フラグメントが、ＤＮＡポリメラーゼと認識配列を認識するニック形成剤との存在下で一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅するためのテンプレート核酸として機能することを可能にする。
【０２２１】
プライマーおよび標的ｃＤＮＡが増幅反応において組み合わされる場合、増幅産物の存在（または非存在）および組成は、エキソンＡおよびエキソンＢの接合部の存在または非存在を反映する。エキソンＡのみまたはエキソンＢのみが標的ｃＤＮＡに存在する場合、プライマーとしての上記プライマーおよびテンプレートとしての標的ｃＤＮＡを使用して、いかなる増幅産物も作製されない。エキソンＡおよびエキソンＢの両方が標的ｃＤＮＡに存在する場合、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む増幅産物（すなわち、Ｎ１分子またはＮ１に対する前駆体）が作製される。エキソンＡおよびエキソンＢの接合部が標的ｃＤＮＡに存在する場合、増幅産物は、この接合物を含む（図２１Ａ）。エキソンＡとエキソンＢとの接合部が存在しない（すなわち、エキソンＡとエキソンＢとの間に配列が存在する）場合、増幅産物は、接合部を含まないが、２つのエキソンの間の配列を含む（図２１Ｂ）。従って、テンプレートとしてＮ１を使用して増幅される一本鎖核酸分子（Ａ１）および／またはテンプレートとしてＡ１を使用する別の一本鎖核酸分子（Ａ２）を特徴付けることは、標的ｃＤＮＡがエキソンＡとエキソンＢとの接合部を含むか否かを示す。
【０２２２】
上記一般的方法の特定の実施形態が、図２２に示される。この図に示されるように、第１のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてエキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールし、第２のプライマーは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、そしてエキソンＢのセンス鎖の一部にアニールする。これらの２つのプライマーが標的ｃＤＮＡの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物（すなわち、Ｎ１に対する前駆体）は、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖およびＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖を含む。さらに、増幅産物はまた、接合部が標的ｃＤＮＡに存在する場合、エキソンＡとエキソンＢとの接合部を含む。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識するＩＩｓ型エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅産物が消化されて、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖を含み、かつまた接合部が標的ｃＤＮＡに存在する場合には、エキソンＡとエキソンＢとの接合部も含む、部分的に二本鎖の核酸分子Ｎ１を生成する。
【０２２３】
上記一般的な方法の別の特定の実施形態が、図２３に示される。この図に示されるように、両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。さらに、第１のプライマーは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され、第２のプライマーは、エキソンＢのセンス鎖の一部にアニールするように設計される。これらの２つのプライマーが標的ｃＤＮＡの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物（すなわち、Ｎ１に対する前駆体）は、接合部が標的ｃＤＮＡに存在する場合には、エキソンＡとエキソンＢとの接合部、ならびに２つの二本鎖ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの２つの認識配列は、互いに同一であっても良く同一でなくても良いが、好ましくは、これらは、同一である。上記認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下において、増幅産物は、それぞれがニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のうちの１つを含む２つの部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成するために、２回（各鎖で１回）ニック形成される。さらに、これら２つの分子のそれぞれの突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）はまた、接合部が標的ｃＤＮＡに存在する場合には、エキソンＡとエキソンＢとの接合部を含む。
【０２２４】
上記一般的な方法のさらなる特定の実施形態を、図２４に示す。この図に示されるように、両方のプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。さらに、第１のプライマーは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され、第２のプライマーは、エキソンＢのセンス鎖の一部にアニールするように設計される。これら２つのプライマーが、改変デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で標的ｃＤＮＡの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物（すなわち、Ｎ１に対する前駆体）は、接合部が標的ｃＤＮＡに存在する場合には、エキソンＡとエキソンＢとの接合部、ならびに２つの半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの２つの半改変認識配列は、互いに同一であっても良いし、同一でなくても良いが、好ましくは、これらは、同一である。上記認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅産物は、それぞれが半改変認識配列の１つの一方の鎖の配列を含む、２つの部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成するために、２回（各鎖で１回）ニック形成される。さらに、これら２つの分子のそれぞれの突出部はまた、接合部が標的ｃＤＮＡに存在する場合には、エキソンＡとエキソンＢとの接合部を含む。
【０２２５】
上記第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰまたは両方が、特定の実施形態において固体支持体に固定され得る。他の実施形態において、標的ｃＤＮＡ分子が固定化される。
【０２２６】
（３．Ａ１分子）
上記のように、Ａ１分子は、テンプレートとしてＮ１の一部を使用して増幅される。Ｎ１のこの部分は、特定のエキソン−エキソン接合部であると推定される位置を含み、その結果、この位置が、Ａ１に移されるかまたは組み込まれる。特定の実施形態において、Ａ１の長さは、特定のエキソンーエキソン接合部が標的ｃＤＮＡに存在する場合に比較的短いように調整され得る。例えば、Ｎ１分子を提供する第３の型（図２１〜２４）について、ＯＤＮＰ対は、それらが標的ｃＤＮＡにアニールする場合、互いに近接するように設計され得る。より詳細には、第１のプライマーは、エキソンＡの５’末端に近い標的ｃＤＮＡのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され得るが、第２のプライマーは、エキソンＢの５’末端に近い標的ｃＤＮＡのセンス鎖の一部にアニールするように設計され得る。上記の本発明の診断的使用および遺伝的バリエーションの検出と同様に、Ａ１分子の短い長さは、増幅効率および速さを増大し、鎖置換活性を有しないＤＮＡポリメラーゼの使用を可能にし、そして質量分析のような特定の技術を介してＡ１分子および／または引き続く増幅反応（ここで、開始増幅プライマーとしてＡ１が使用される）の生成物（Ａ２）の検出を促進する。
【０２２７】
（４．Ｔ２分子）
本発明のＴ２分子は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、ならびにその認識配列のセンス鎖の配列の３’側に位置する配列（すなわち、テンプレートとして、開始核酸分子Ｎ１の一部を使用して増幅される一本鎖核酸分子（Ａ１）に対して少なくも実質的に相補性である配列）を含む。Ｔ２がニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含むので、その認識配列を認識するニック形成剤とＤＮＡポリメラーゼとの存在下で、Ａ１は、開始増幅プライマーとして使用され、続いて、別の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅するためのテンプレートとして使用される。上記のように、Ａ１は、特定のエキソン−エキソン接合部であると推定される位置を含む。この位置は、続いて、Ａ２に移されるかまたは組み込まれる。従って、Ａ２の特徴付けは、その位置の各側における配列を決定し得、従って、特定のエキソン−エキソン接合部が標的ｃＤＮＡ内に存在するか否かを決定し得る。
【０２２８】
本発明の診断適用と同様に、本発明に従うプレｍＲＮＡ選択的スプライシング分析の特定の実施形態において、第２増幅反応のために、さらなるＴ２分子は必要ではない。これらの実施形態において、Ｎ１モジュールを作製する際に使用される第２のプライマーが、第２プライマーをＡ１にアニールさせる３’末端配列を有する。第２のプライマーはまた、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む。従って、テンプレートとして第２のプライマーを使用するＡ１の伸長は、二本鎖ニック形成剤認識配列を作製する。ＤＮＡポリメラーゼとこの認識配列を認識するニック形成剤との存在下において、一本鎖核酸（Ａ２）は、テンプレートとしてＡ１を使用して増幅される。
【０２２９】
Ｔ２分子は、特定の実施形態において、固体支持体に、好ましくはその５’末端を介して固定され得る。他の実施形態において、Ｔ２は、固定されていなくてもよい。
【０２３０】
（５．増幅された一本鎖核酸の特徴付け）
標的ｃＤＮＡ分子における特定のエキソン−エキソン接合部の存在が、増幅生成物（すなわち、Ａ１またはＡ２）を特徴付けることにより決定され得る。一本鎖核酸分子を特徴付けするために適切な任意の方法が、使用され得る。例示的な技術としては、クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー）、質量分析法、および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。種々の例示的な方法の詳細な記載が、米国特許仮出願第６０／３０５，６３７号および同第６０／３４５，４４５号に見出され得る。
【０２３１】
増幅された一本鎖核酸フラグメントの特徴（例えば、質量分析により得られる質量 対 電荷比）は、続いて、テンプレート核酸フラグメントを調製する際に使用されるプライマーの位置および組成を考慮して推定される一本鎖核酸フラグメントの特徴と、および２つのエキソン（これらに対してプライマーが相補的である）の間の接合部が存在するという仮定と比較される。増幅され推定された核酸フラグメントの特徴が同一である場合、標的ｃＤＮＡ分子中に存在すると仮定された特定のエキソン−エキソン接合部は、実際に標的ｃＤＮＡ分子中に存在する。増幅される一本鎖核酸フラグメントの配列および特徴（例えば、質量 対 電荷比）の推定は、エキソン−イントロン接合部付近のコンセンサス配列についての知見に基づく。この知見は、当業者が、そのエキソン−イントロン接合部を正確に特定し、従って、２つのエキソンの間のイントロンがスプライシングによって除去された場合にエキソン−エキソン接合部の正確な位置を推定することを、可能にする。
【０２３２】
（６．プレｍＲＮＡ差示的スプライシング分析において有用な組成物およびキット）
プレｍＲＮＡ差示的スプライシング分析において有用な組成物およびキットは、指数関数的核酸増幅についての上記の組成物およびキットと同じであり得る。特定の実施形態において、これらのキットは、増幅産物を特徴付ける際に有用な１以上のさらなる成分をさらに含み得る。例えば、そのさらなる成分は、（１）クロマトグラフィーカラム；（２）核酸のクロマトグラフィーによる特徴付けまたは分離を行うための緩衝液；（３）マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート；（４）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のためのオリゴヌクレオチド標準（例えば、６マー、７マー、８マー、１０マー、１２マー、１４マー、および１６マー）；（５）逆転写酵素；（６）逆転写酵素のための緩衝液；および（７）このキットを使用するための説明書冊子。
【０２３３】
（７．本発明のプレｍＲＮＡ差示的スプライシング分析の適用）
本発明は、目的の任意のｍＲＮＡ差示的スプライシングを検出する際に有用である。選択的プレｍＲＮＡスプライシングは、高等真核生物における遺伝子発現を調節するために重要な機構である。最近の評価によると、ヒト遺伝子の約３０％の一次転写産物が、選択的スプライシングに供され、しばしば、通常の発生の間に特定の空間的パターン／時間的パターンにて調節される。複雑な遺伝子においては、選択的スプライシングは、１つの転写産物から、数十個から数百個もの異なるｍＲＮＡアイソフォームを生成し得る（ＢｒｅｉｔｂａｒｔおよびＮａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：４６７−９５，１９８７；ＭｉｓｓｌｅｒおよびＳｕｄｈｏｆ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １４：２０−６，１９８８；Ｇａｓｃａｒｄら、Ｂｌｏｏｄ ９２：４４０４−１４，１９９８）。多くの場合、選択的スプライシングされたエキソンは、触媒活性または結合相互作用にとって機能的に重要なタンパク質ドメインをコードし、生じたタンパク質は、異なる活性または拮抗的活性すら示し得る。
【０２３４】
本明細書中上記で詳細に議論されるように、本発明は、プレｍＲＮＡ選択的スプライシングを検出（ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中の遺伝子の特定のエキソンの末端における選択的スプライシングの検出およびｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中の遺伝子の全てのエキソンの全ての末端における選択的スプライシングの検出を包含する）するための方法、組成物、およびキットを提供する。プレｍＲＮＡスプライシングの重要性に起因して、これらの方法、組成物およびキットは、疾患の診断、素因、および処置、作物栽培、ならびに動物の繁殖、植物および動物の発生調節、薬物開発、ならびに外部刺激（例えば、極端な温度、毒物、および光）に対する生物の応答の操作のような、広範な種々の適用における有用性が見出される。
【０２３５】
例えば、本発明の方法は、病理的条件に特有のプレｍＲＮＡスプライシングパターンを同定および／または特徴付けするために使用され得る。多くの遺伝子における異常なプレｍＲＮＡスプライシングは、種々の疾患または障害（特に癌）に関与している。小細胞性肺癌腫において、タンパク質ｐ１３０の遺伝子（これは、網膜芽細胞腫タンパク質ファミリーに属する）は、コンセンサススプライシング部位にて変異される。この変異の結果として、エキソン２が除去され、未成熟終止コドンの存在に起因してタンパク質の合成がない。同様に、特定の非小細胞性肺癌において、タンパク質ｐ１６１ＮＫ４Ａ（サイクリン依存性キナーゼｃｄｋ４およびｃｄｋ６のインヒビターである）の遺伝子は、ドナースプライシング部位にて変異される。この変異は、短縮化された短い半減期のタンパク質の生成を生じる。さらに、ＷＴ１（ウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子）は、選択的スプライシングによって生成されるいくつかのメッセンジャーＲＮＡへと転写される。乳癌において、異なる改変体の相対的割合は、健常な組織と比較して改変され、従って、診断ツール、または腫瘍進行におけるＷＴ１の種々の機能的ドメインの重要性を理解するに当たっての知見が得られる。細胞形質転換の間の異なるｍＲＮＡ形態およびタンパク質アイソフォームの間の比に影響を及ぼす類似の変化プロセスはまた、ニューロフィブリンＮＦ１において見出される。さらに、頭部および頸部の癌において、ｐ５３が不活性化される機構の１つが、コンセンサススプライシング部位における変異を含んでいた。さらに、ＩＲＦ−１腫瘍サプレッサー遺伝子転写物の改変されたスプライシングパターンは、この腫瘍サプレッサーの不活性化を生じ、そしてＩＲＦ−１ ｍＲＮＡにおけるエキソンスキッピングの加速は、脊髄形成異常症候群からの顕在白血病、急性骨髄性白血病、および脊髄形成異常症候群を含む多くの造血障害の指標である（米国特許第５，６４３，７２９号）。
【０２３６】
本発明の方法は、疾患（または障害）状態と関連することが知られているかまたは疑われる遺伝子の転写物のスプライシングパターンを比較するため、およびその存在または不在が疾患（または障害）状態に特有であるエキソンを同定するため、または疾患（または障害）状態に特有の異なるスプライシング改変体間の比率における変化を同定するために、用いられ得る。疾患（または障害）状態に存在していないエキソンの同定は、これらエキソンによりコードされるドメインが、健常細胞の正常機能に重要であること、そして、このようなドメインを含むシグナル伝達経路が、治療目的のために回復され得ることを、示し得る。その一方、疾患（または障害）状態に特有に存在するエキソンの同定は、診断ツールとして用いられ得、そしてそのコードされるドメインは、これらドメインにより媒介されるシグナル伝達と拮抗することが意図される低分子量化合物についてのスクリーニング標的として考慮され得る。さらに、これらドメインに対する特異的親和性を有する抗体はまた、この疾患（または障害）状態の診断ツールとして用いられ得る。
【０２３７】
本発明はまた、生物発生において重要なプレｍＲＮＡ差次的スプライシングを同定および／または特徴付けるために用いられ得る。選択的スプライシングは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける性決定、ヒトにおける抗体応答、および他の組織特異的プロセスまたは発生段階特異的プロセスにおいて主要な役割を演じている（Ｃｈａｂｏｔ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：４７２〜８；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２３：５２７〜７７、１９８９；Ｂｒｅｉｔｂａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４９：７９３〜８０３、１９８７）。従って、本発明の方法は、異なる発生段階で発生調節に関与することが知られているかまたはそれが疑われる遺伝子のプレｍＲＮＡスプライシングパターンを比較するために用いられ得る。この遺伝子における差次的スプライシングの存在の同定および／または特徴付けは、所望の形質（例えば、より大きな果実、より高いタンパク質含有量の種子またはより高い油含量の種子、より高いミルク生産）を得るために対応する発生プロセスを調節することにおける指針を提供し得る。
【０２３８】
本発明の方法はまた、種々の外部刺激に対する生物の応答において重要なプレｍＲＮＡ差次的スプライシングを同定および／または特徴付けるために用いられ得る。非処置生物の特定の刺激（例えば、病原体の攻撃）に対する応答において役割を演じていることが知られているかまたはそれが疑われる遺伝子のプレｍＲＮＡスプライシングパターンは、この刺激を受けた生物のプレｍＲＮＡスプライシングパターンと比較され得る。その刺激を受けた生物に特有のスプライシングパターンの同定および／または特徴付けは、この応答を増大するため（この応答が所望される場合）、または低減／排除するため（この応答が所望されない場合）に、対応する応答プロセスを操作することにおける指針を提供し得る。
【０２３９】
本明細書中で参照され、そして／または出願データシートに列挙される、上記の全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願、ならびに非特許刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０２４０】
前述より、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されたが、種々の改変が、本発明の本質および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】図１は、本発明のタンデム型増幅系の第１の増幅反応の主要な工程の概略図である。
【図２】図２は、本発明のタンデム型増幅系の第２の増幅反応の主要な工程の概略図である。
【図３】図３は、本発明に従う核酸増幅のための例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列は、例示的ＮＡＲＳとして使用され、第１のテンプレート（Ｔ１）はＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列（すなわち、５’−ＧＡＣＴＣ−３’）を含み、そして第２のテンプレート（Ｔ２）はＮＡＲＳのセンス鎖の配列（すなわち、５’−ＧＡＧＴＣ−３’）を含む。
【図４】図４は、本発明に従う核酸増幅のための例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列は、例示的ＮＡＲＳとして使用され、第１のテンプレート（Ｔ１）および第２のテンプレート（Ｔ２）は、両方、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列（すなわち、５’−ＧＡＧＴＣ−３’）を含む。
【図５】図５は、ゲノムＤＮＡ由来のトリガーＯＤＮＰを第１のテンプレートＴ１にアニーリングすることによって開始核酸分子Ｎ１を調製し、その後一本鎖核酸分子Ａ１を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このトリガーＯＤＮＰは、ゲノムＤＮＡを消化し、次いで消化されたゲノムＤＮＡを変性させることによって調製される。
【図６】図６は、ゲノムＤＮＡから開始核酸分子Ｎ１を調製し、その後一本鎖核酸分子Ａ１を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このゲノムＤＮＡは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。このＮ１分子は、ゲノムＤＮＡフラグメントの一方の鎖をそのゲノムＤＮＡフラグメントの他方の鎖の一部（すなわち、Ｔ１）でアニーリングすることによって生成される。
【図７】図７は、ゲノムＤＮＡから開始核酸分子Ｎ１を調製し、その後一本鎖核酸分子Ａ１を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このゲノムＤＮＡは、ニック形成剤認識配列を含む。Ｎ１分子は、ゲノムＤＮＡフラグメントの一方の鎖を第１のテンプレート（Ｔ１）（これは、ゲノムＤＮＡの３’側部分ではそのゲノムＤＮＡの鎖に相補的であるが、５’側部分では相補的ではない）にアニーリングすることによって生成される。
【図８】図８は、ゲノムＤＮＡから開始核酸分子Ｎ１を調製し、その後核酸分子Ａ１を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このゲノムＤＮＡは、ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能な、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列は、例示的なニック形成剤認識配列として使用される。
【図９】図９は、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子Ｎ１を調製し、その後核酸分子Ａ１を増幅するための主要な工程の概略図を示す。一方のプライマーは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含むが、他方は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）の一方の鎖を含む。
【図１０ａ】図１０ａは、２つのＯＤＮＰを使用して、開始核酸分子Ｎ１ａおよびＮ１ｂを調製し、その後核酸分子Ａ１ａおよびＡ１ｂを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この例示的な実施形態において、両方のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む。
【図１０ｂ】図１０ｂは、図１０ａのＡ１ａおよびＡ１ｂをそれぞれのテンプレートとして使用して、核酸分子Ａ２ａおよびＡ２ｂを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この例示的な実施形態において、図１０ａの第１のプライマーおよび第２のプライマーをＡ１ｂおよびＡ１ａにそれぞれアニールし、Ｎ２ｂ分子およびＮ２ａ分子を形成する。
【図１１】図１１は、２つのＯＤＮＰを使用して、例示的な実施形態において開始核酸分子Ｎ１を調製し、その後核酸分子Ａ１を増幅するための主要な工程の概略図を示す。両方のＯＤＮＰとも、ＲＥＲＳの一方の鎖の配列を含む。この増幅は、例示的な改変デオキシヌクレオシド三リン酸として使用される、α−チオデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で実施される。
【図１２】図１２は、ＮＥＲＳを含む、部分的に２本鎖の開始核酸分子Ｎ１を使用して、固定化された標的核酸を検出するための方法の概略図を示す。
【図１３】図１３は、ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、一本鎖核酸分子Ｔ１を使用して、固定化された標的核酸を検出するための方法の概略図を示す。
【図１４】図１４は、標的核酸から開始核酸分子Ｎ１を調製し、その後一本鎖核酸分子Ａ１を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列および潜在性遺伝的バリエーションを含む。
【図１５】図１５は、標的核酸から開始核酸分子Ｎ１を調製し、その後一本鎖核酸分子Ａ１を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、ニック形成剤認識配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、およびこれら２つの認識配列間の遺伝的バリエーションを含む。
【図１６】図１６は、２つのプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子Ｎ１を調製し、その後核酸分子Ａ１を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション（「Ｘ」）を含む。この第１のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含むが、第２のプライマーは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。
【図１７】図１７は、２つのプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を調製し、その後核酸分子Ａ１ａおよびＡ１ｂを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション（「Ｘ」）を含む。両方のプライマーとも、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。
【図１８】図１８は、２つのプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を調製し、その後核酸分子Ａ１ａおよびＡ１ｂを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション（「Ｘ」）を含む。両方のプライマーとも、制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む
【図１９】図１９は、標的ｃＤＮＡから開始核酸分子（Ｎ１）を調製し、その後核酸分子（Ａ１）を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的ｃＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列および特定のエキソン−エキソン接合部であると疑われる位置を含む。
【図２０】図２０は、標的ｃＤＮＡから開始核酸分子（Ｎ１）を調製し、その後核酸分子（Ａ１）を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的ｃＤＮＡは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、およびこれらの２つの認識配列間の特定のエキソン−エキソン接合部であると疑われる位置を含む。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、標的ｃＤＮＡから開始核酸分子（Ｎ１）を調製し、その後核酸分子（Ａ１）を増幅するためのプロセスの概略図を示す。この標的ｃＤＮＡは、エキソンＡおよびエキソンＡに対して直接的に下流にあるエキソンＢを含むか（図２１Ａ）、またはエキソンＡ、エキソンＢ、およびエキソンＡとエキソンＢとの間の配列を含む（図２１Ｂ）。
【図２２】図２２は、２つのプライマーを使用して、標的ｃＤＮＡから開始核酸分子（Ｎ１）を調製し、その後核酸分子（Ａ１）を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的ｃＤＮＡは、エキソンＡおよびエキソンＢを含む。第１のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含み、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールする。第２のプライマーは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、エキソンＢのセンス鎖の一部にアニールする。
【図２３】図２３は、２つのプライマーを使用して、標的ｃＤＮＡから開始核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を調製し、その後核酸分子（Ａ１ａおよびＡ１ｂ）を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的ｃＤＮＡは、エキソンＡおよびエキソンＢを含む。両方のプライマーとも、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。第一のプライマーは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールするが、第２のプライマーは、エキソンＢのセンス鎖の一部にアニールする。
【図２４】図２４は、２つのプライマーを使用して、標的ｃＤＮＡから開始核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を調製し、その後核酸分子（Ａ１ａおよびＡ１ｂ）を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的ｃＤＮＡは、エキソンＡおよびエキソンＢを含む。両方のプライマーとも、制限エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。第一のプライマーは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールするが、第２のプライマーは、エキソンＢのセンス鎖の一部にアニールする。
【図２５】図２５は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列および標的核酸の３’側部分に少なくとも実質的に相補的である配列を含む固定化されたＴ１分子を使用して、標的核酸の存在を検出するための方法の概略図を示す。
【図２６】図２６は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含み、標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である、固定化されたＴ１分子を使用して、標的核酸の存在を検出するための方法の概略図を示す。【Technical field】
[0001]
(Field of the Invention)
The present invention relates to the field of molecular biology, more particularly to methods and compositions relating to nucleic acids, and even more particularly to methods and compositions relating to amplifying nucleic acids using nicking agents.
[Background Art]
[0002]
(Explanation of related technology)
Numerous methods have been developed for rapid amplification of nucleic acids. These include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR), self-sustaining sequence replication (3SR), nucleic acid sequence based amplification (NASBA), transcription based amplification system (TAS), strand displacement amplification (SDA) , And amplification using Qβ replicase. Most of the widely used methods for nucleic acid amplification (eg, PCR) require different temperature cycles to achieve denaturation and reannealing cycles. Other methods can be performed isothermally, but require multiple primer sets (eg, thermophilic SDA bumper primers) or are based on transcription and / or reverse transcription, which is sensitive to RNA denaturation. (Eg, TAS, NASBA, and 3SR). Thus, there is a long felt need in the art for a simpler and more efficient method for nucleic acid amplification.
[0003]
The present invention fulfills this and related needs, as described below.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Means for Solving the Problems]
[0004]
(Brief summary of the invention)
In contrast to previously known techniques for the amplification of nucleic acids, the present invention does not require the use of multiple oligonucleotide primer sets and does not require a method for amplification of nucleic acids that is not based on transcription. provide. Further, the present invention can be performed under isothermal conditions, thus avoiding the expense associated with equipment for providing different temperature cycles. The present invention may find utility in a variety of applications (eg, gene change detection, disease diagnosis, and gene change detection).
[0005]
To this end, the present invention provides methods, compounds, and compositions, including systems and arrays as summarized below.
[0006]
A method for amplifying a nucleic acid molecule (A2). The method comprises: (A) providing an at least partially double-stranded nucleic acid molecule (N1), wherein the at least partially double-stranded nucleic acid molecule comprises: (i) a first nicking agent; A nicking that recognizes the first NARS, comprising: at least one of the sequence of the sense strand of the recognition sequence (NARS), and (ii) the sequence of the antisense strand of the first NARS; Amplifying the first single-stranded nucleic acid molecule (A1) in the presence of an agent (NA), a DNA polymerase and one or more deoxynucleoside triphosphates. Using a portion of N1 as a template for the polymerase; (C) providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the second single-stranded nucleic acid molecule comprises In the direction from 'to 3', (i) And (D) T2, A1, the first NA, and the second NARS. 2) a sequence of the sense strand of NARS and (ii) a sequence that is at least substantially complementary to A1. Amplifying a third single-stranded nucleic acid molecule (A2) in the presence of a second NA, DNA polymerase, and deoxynucleoside triphosphate, wherein A2 is at least substantially equal to A1. Complementary to each other and wherein A1, A2, or both are up to 25 nucleotides in length.
[0007]
A method for amplifying a nucleic acid molecule (A2). The method comprises the steps of (A) forming a mixture, the mixture comprising (i) an at least partially double-stranded sequence comprising a sequence of an antisense strand of a first nicking agent recognition sequence (NARS). Nucleic acid molecule (N1); (ii) at least substantially at least a portion of N1 located 5 ′ to the sequence of the antisense strand of the first NARS in N1 in the 3 ′ to 5 ′ direction; A single-stranded nucleic acid molecule (T2) comprising a sequence that is identical and (b) the sequence of the sense strand of the second NERS; and (iii) a first nicking agent (NA) that recognizes the first NARS. ), Comprising a second NA that recognizes a second NARS, a DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates; and (B) exponentially amplifying the single-stranded nucleic acid molecule (A2). To maintain the above mixture under the conditions A is, A2 is the maximum 25 nucleotides long, step; encompasses.
[0008]
A method for amplifying a nucleic acid molecule (A2). The method comprises: (A) (i) an at least partially double-stranded nucleic acid molecule (N1) comprising a sequence of a sense strand of a first nicking agent recognition sequence (NARS); (ii) a single-stranded nucleic acid A molecule (T2), (iii) a first nicking agent (NA) recognizing a first NARS, a second NA recognizing a second NARS, a DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates Forming a mixture with an acid, wherein the single-stranded nucleic acid molecule (T2) is in the 3 ′ to 5 ′ direction, (a) on the 3 ′ side of the sense strand of the first NARS in N1. And (b) amplifying the single-stranded nucleic acid molecule (A2) comprising: a sequence that is at least substantially complementary to a portion of the N1 located therein; and (b) the sequence of the sense strand of the second NARS. And maintaining the mixture under the following conditions, wherein A2 is It is greater 25 nucleotides in length, step; encompasses.
[0009]
Tandem nucleic acid amplification system. The system comprises a first primer extension means for amplifying a first nucleic acid (A1) and a second primer extension means for amplifying a second nucleic acid (A2), wherein ( i) A1 is the starting primer for the second primer extension means for amplifying A2; (ii) both the first primer extension means and the second primer extension means are in a single reaction vessel And requires the presence of a nicking agent (NA); (iii) A1, A2, or both are up to 25 nucleotides in length; and (iv) A2 is at least substantially Complementary.
[0010]
A method for exponential amplification of a nucleic acid molecule A2. This method comprises the steps of (a) subjecting a first template nucleic acid (T1) to a first nicking endonuclease (NA) recognizing a first NARS and a primer extension reaction in the presence of a first DNA polymerase. Amplifying a nucleic acid molecule (A1) using the template as a template, wherein the first template nucleic acid (T1) contains a sequence of one strand of a first nicking agent recognition sequence (NARS). And (b) using a second template nucleic acid (T2) as a template and A1 as a starting primer by a primer extension reaction in the presence of a second NA and a second DNA polymerase. Amplifying A2, wherein the second template nucleic acid (T2) comprises the sequence of the sense strand of the second NARS. Preferably, A1, A2, or both are up to 25 nucleotides in length.
[0011]
A method for identifying a genetic alteration in a genomic nucleic acid or cDNA molecule. This genetic alteration is located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first nicking endonuclease recognition sequence (NERS) in the genomic nucleic acid or cDNA molecule. The method comprises the steps of (A) forming a mixture comprising (i) a genomic or cDNA molecule, (ii) a single-stranded nucleic acid molecule (T2), and (iii) a first NERS. The single-stranded nucleic acid molecule (T2) comprising a first nicking endonuclease (NE) that recognizes, a second NE that recognizes a second NERS, a DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates (T2). (A) a sequence that is at least substantially identical to a genomic nucleic acid or cDNA molecule portion located 5 ′ to the sequence of the antisense strand of the first NERS in the 3 ′ to 5 ′ direction; b) maintaining the mixture under conditions that exponentially amplify the single-stranded nucleic acid molecule (A2); and (C) That game Including; step characterizing the A2 to identify genetic changes in beam nucleic acid or a cDNA molecule.
[0012]
A method for identifying a genetic alteration at a defined location in a target nucleic acid. The method comprises the steps of (a) forming a mixture of a first oligonucleotide (ODNP), a second ODNP, and a target nucleic acid, wherein (i) the target nucleic acid comprises a first strand and a first strand. When the nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having two strands, the first ODNP comprises the nucleotide sequence of the sense strand of the first nicking endonuclease recognition sequence (NERS) and the complement of the nucleotide sequence of the gene change. A nucleotide sequence that is at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the first strand of the target nucleic acid located on the 'side, and wherein the second ODNP comprises a second ODNP of the target nucleic acid located 3' to the genetic alteration. And wherein the second ODNP comprises a sequence of one strand of a restriction endonuclease recognition sequence (RERS) optionally comprising a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the Alternatively, or (ii) when the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid, the first ODNP comprises the nucleotide sequence of the sense strand of the first NERS and the target nucleic acid located 5 'to the genetic alteration. The second ODNP comprises a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of a target nucleic acid located 3 'to the genetic alteration. And, the second ODNP optionally includes a RERS; and (b) extending the first ODNP and the second ODNP to obtain the nucleotide sequence of the first ODNP and the second ODNP. (C) generating an extension product comprising the nucleotide sequence of ODNP; and (c) converting the extension product from step (b) to a restriction endonuclease that recognizes RERS. (D) one strand of the extension product of step (b) or one strand of the digestion product of step (c), Amplifying the first single-stranded nucleic acid fragment (A1) using as a template in the presence of a nicking endonuclease (NE) that recognizes the NERS of (a); (e) a second step for annealing to A1 Providing a single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein T2 is at least substantially in the 5 ′ to 3 ′ direction: (i) the sequence of the sense strand of the second NERS, and (ii) A1. (F) amplifying a third single-stranded nucleic acid fragment (A2) using A1 as a template; and (g) characterizing A2 to target nucleic acid Identifying a genetic alteration therein. Preferably, A1, A2, or both have a maximum of 25 nucleotides.
[0013]
A method for identifying a genetic alteration at a defined location in a target nucleic acid. This method comprises the steps of (a) forming a mixture of a first ODNP, a second ODNP, and a target nucleic acid, wherein (i) the target nucleic acid has a first strand and a second strand. If single-stranded, the first ODNP will have the nucleotide sequence of one strand of the first restriction endonuclease recognition sequence (RERS) and the target nucleic acid located 3 'to the complement of the genetic alteration. A second ODNP comprising a nucleotide sequence of a single strand of a second RERS and a 3 ′ position of the genetic alteration thereof, comprising a nucleotide sequence that is at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the first strand. Or (ii) if the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid, the first ODNP is one of the first RERS. book of And a nucleotide sequence that is at least substantially identical to the nucleotide sequence of the target nucleic acid located 5 'to the complement of the genetic alteration, wherein the second ODNP comprises a single strand of the second RERS. (B) deoxyribonucleoside triphosphates and at least one modified deoxyribonucleotide comprising a sequence and a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the target nucleic acid located 3 'to the genetic alteration. Extending the first ODNP and the second ODNP in the presence of a nucleoside triphosphate to generate an extension product containing both the first RERS and the second RERS; (c) a restriction endonuclease that recognizes the first RERS ( RE) and a restriction endonuclease recognizing a second RERS in the presence of step (b). Exponentially amplifying a single-stranded nucleic acid fragment using the long product as a template, wherein the single-stranded nucleic acid fragment is 25 nucleotides or less in length; and (d) step (c). ) Characterizing at least one of the single-stranded fragments to identify their genetic alterations.
[0014]
A method for identifying a genetic alteration at a defined location in a target nucleic acid. This method comprises the steps of: (a) forming a mixture of a first ODNP, a second ODNP, and a target nucleic acid, wherein (i) the target nucleic acid has a first strand and a second strand; Where the first ODNP is the nucleotide sequence of one strand of the first restriction endonuclease recognition sequence (RERS) and the nucleotide of the first strand of the target nucleic acid located 3 ′ to the complement of the genetic alteration. The second ODNP comprises a nucleotide sequence of one strand of a second RERS and nucleotides of a second strand of a target nucleic acid located 3 'to the genetic alteration. Or (ii) if the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid, the first ODNP of the first RERS single-stranded A second ODNP comprising a nucleotide sequence that is at least substantially identical to a nucleotide sequence of a target nucleic acid located 5 ′ to the complement of the genetic alteration, wherein the second ODNP comprises a sequence of one strand of the second RERS. (B) deoxyribonucleoside triphosphates and at least one modified deoxyribonucleoside triphosphate comprising a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the target nucleic acid located 3 'to the genetic alteration; Extending the first ODNP and the second ODNP in the presence of phosphate to produce an extension product containing both the first RERS and the second RERS; (c) a restriction endonuclease that recognizes the first RERS and the second RERS Using one strand of the extension product of step (b) as a template in the presence of (RE) Amplifying the first single-stranded nucleic acid fragment; (d) providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) that anneals to A1, wherein T2 is in the 5 ′ to 3 ′ direction. (E) comprising the sequence of the sense strand of the third RERS and (ii) a sequence at least substantially complementary to A1; (e) using A1 as a template Amplifying the single-stranded nucleic acid fragment (A2); and (f) characterizing at least one single-stranded fragment of step (c) to identify its genetic alteration.
[0015]
A method for identifying a genetic change at a defined location in a target nucleic acid, comprising: (a) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and a target nucleic acid. (I) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand, the first ODNP is located 3 ′ to the complement of the genetic alteration The second ODNP comprises a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the first strand of the target nucleic acid, wherein the second ODNP is at least substantially at least the nucleotide sequence of the second strand of the target nucleic acid located 3 'to the genetic alteration. If the target nucleic acid comprises a complementary nucleotide sequence or (ii) the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid, the first ODNP is the nucleotide of the target nucleic acid located 5 'to the genetic alteration A second ODNP comprising a nucleotide sequence that is at least substantially identical to the sequence, the second ODNP comprising a nucleotide sequence that is at least substantially complementary to the nucleotide sequence of a target nucleic acid located 3 ′ to the genetic alteration; A second ODNP, which further comprises a nucleotide sequence of a sense strand of a nicking endonuclease recognition sequence (NERS); and (b) extending the first ODNP and the second ODNP to obtain an extension product containing the two NERSs. Generating (c) an exponential function of the single-stranded nucleic acid fragment using the extension product of step (b) as a template in the presence of one or more nicking endonucleases (NE) recognizing the NERS. Wherein the single-stranded nucleic acid fragment comprises no more than 25 nucleosides. Having a de step; encompasses, and characterized at least one single-stranded fragment of step (d) (c), the step of identifying thereby the genetic variation.
[0016]
A method for identifying a genetic alteration at a defined location in a target nucleic acid. This method comprises the steps of (a) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and a target nucleic acid, wherein (i) the target nucleic acid comprises a first strand and a second strand; Wherein the first ODNP comprises a nucleotide sequence that is at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the first strand of the target nucleic acid located 3 ′ to the complement of the genetic alteration. The second ODNP comprises a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the second strand of the target nucleic acid located 3 'to the genetic alteration, or (ii) the target nucleic acid is single-stranded If a nucleic acid, the first ODNP comprises a nucleotide sequence that is at least substantially identical to the nucleotide sequence of a target nucleic acid located 5 ′ to the genetic alteration. The second ODNP comprises a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the target nucleic acid located 3 'to the genetic alteration, the first ODNP and the second ODNP each further comprising a nicking endonuclease recognition sequence ( NERS) the nucleotide sequence of the sense strand; (b) extending the first ODNP and the second ODNP to produce an extension product comprising two NERS; (c) one or more NERS recognizing NERS Amplifying the first single-stranded nucleic acid fragment using one strand of the extension product of step (b) as a template in the presence of a nicking endonuclease (NE); (d) annealing to A1 Providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein T2 is in the 5 ′ to 3 ′ direction: (i) Using the sense strand of ERS and (ii) a sequence at least substantially complementary to A1; (e) using A1 as a template to generate a third single-stranded nucleic acid fragment (A2). Amplifying; and (f) characterizing the single-stranded fragment of step (c) to identify genetic alterations thereof. Preferably, A1, A2, or both have a maximum of 25 nucleotides.
[0017]
A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising: (A) the following (i), (ii), (iii) and (iv): Forming a mixture comprising: (i) a nucleic acid molecule of the sample; (ii) a first single strand in the 3 ′ to 5 ′ orientation, comprising (a), (b) and (c): Nucleic acid molecule (T1): (a) a first sequence that is at least substantially complementary to a target nucleic acid, (b) a sequence of an antisense strand of a first nicking agent recognition sequence (NARS), and (c) A) a second sequence having at most 25 nucleotides; (iii) a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) in the 3 ′ to 5 ′ orientation, comprising (a) and (b): (a) A sequence at least substantially identical to the second sequence of T1, and (b) a second N (Iv) a first nicking endonuclease (NA) that recognizes the first NARS, a second NA that recognizes the second NARS, a DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates; B) maintaining the mixture under conditions where the single-stranded nucleic acid molecule (A2) is exponentially amplified if the target nucleic acid is present in the sample; and (C) the presence or absence of A2. Detecting the presence to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample.
[0018]
A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising: (A) the following (i), (ii), (iii) and (iv): Forming a mixture comprising: (i) a nucleic acid molecule of the sample; (ii) a first single-stranded nucleic acid molecule (T1) in the 3 ′ to 5 ′ orientation, comprising (a) and (b): ): (A) a sequence that is at least substantially complementary to the target nucleic acid, and (b) the sequence of the sense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS), (iii) a 3 ′ to 5 ′ orientation. A second single-stranded nucleic acid molecule (T2) comprising the following (a) and (b): (a) with respect to the sequence of T1 located 3 ′ to the sequence of the sense strand of the first NARS. A sequence that is at least substantially complementary, and (b) a sequence of the sense strand of the second NARS. And (iv) a first nicking endonuclease (NA) that recognizes the first NARS, a second NA that recognizes the second NARS, a DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates; Maintaining the mixture under conditions in which the single-stranded nucleic acid molecule (A2) is amplified if present in the sample, wherein A2 comprises (i) at least substantially (Ii) preferably having at most 25 nucleotides; and (C) detecting the presence or absence of A2 to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample Process.
[0019]
A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid comprising a first nicking endonuclease recognition sequence (NERS) in a sample, the method comprising: (A) the following (i) ), Forming a mixture comprising (ii) and (iii): (i) the nucleic acid molecules of this sample, (ii) in 3 'to 5' orientation, comprising (a) and (b): A single-stranded nucleic acid molecule (T2): (a) a sequence located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NERS, which is at least substantially identical to a portion of the target nucleic acid molecule; and (b) The sequence of the sense strand of the second NERS, and (iii) a first nicking endonuclease (NE) that recognizes the first NERS; a second NE that recognizes the second NERS, a DNA polymerase, and one or more (B) maintaining the mixture under conditions in which the single-stranded nucleic acid molecule (A2) is amplified exponentially if the target nucleic acid is present in the sample; and C) detecting the presence or absence of A2 to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample.
[0020]
A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid comprising a first nicking endonuclease recognition sequence (NERS) in a sample, the method comprising: (A) the following (i) A) forming a mixture comprising: (ii), (iii) and (iv): (i) the target nucleic acid molecule, (ii) substantially identical to one strand of the target nucleic acid, and A first single-stranded nucleic acid molecule (T1) comprising the sequence of the antisense strand of the first NERS, (iii) a second single-stranded nucleic acid molecule in the 3 ′ to 5 ′ direction, comprising the following (a) and (b): A single-stranded nucleic acid molecule (T2) of: (a) a sequence located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NERS, which is at least substantially identical to a portion of T1; and (b) 2NERS sense strand sequence, and (i A) a first nicking endonuclease (NE) that recognizes the first NERS; a second NE that recognizes the second NERS, a DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates; Maintaining the mixture under conditions in which the single-stranded nucleic acid molecule (A2), if present, is exponentially amplified; and (C) detecting the presence or absence of A2, Determining the presence or absence of this target nucleic acid.
[0021]
A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising: (A) a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and a nucleic acid molecule of the sample. Forming a mixture, wherein (i) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand, the first ODNP is a first restriction endonuclease recognition sequence (RERS); ) And the nucleotide sequence at least substantially complementary to the first portion of the first strand of the target nucleic acid, and the second ODNP comprises the nucleotide sequence of the second strand of the target nucleic acid. A nucleotide sequence that is at least substantially complementary to the second portion and includes the sequence of the sense strand of a second RERS, wherein the second portion comprises In the second strand of the target nucleic acid, located 3 'to the complement of the first portion, or (ii) if the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid, the first ODNP is the first ROD sense strand. A nucleotide sequence, and a nucleotide sequence that is at least substantially identical to a first portion of the target nucleic acid, and wherein the second ODNP is at least substantially complementary to a second portion of the target nucleic acid. Comprising a nucleotide sequence and comprising the sequence of the sense strand of a second RERS, wherein the second portion is located 5 'to the first portion in the target nucleic acid; A restriction endonuclease (RE) that recognizes the first RERS and the second RERS, the deoxyribonucleoside triphosphate and at least Maintaining the mixture under conditions in which the single-stranded nucleic acid molecule (A2) is amplified exponentially in the presence of one modified deoxyribonucleoside triphosphate and a DNA polymerase, wherein A2 is , No more than 25 nucleotides in length; and (C) detecting the presence or absence of A2 to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample.
[0022]
A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, comprising: (A) a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and a nucleic acid molecule of the sample. (I) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand, the first ODNP is a first nick-forming endonuclease recognition sequence. A nucleotide sequence of the sense strand of (NERS) and a nucleotide sequence that is at least substantially complementary to a first portion of the first strand of the target nucleic acid, and wherein the second ODNP comprises a second nucleotide of the target nucleic acid. A second nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence at least substantially complementary to a second portion of the strand, and comprising a sequence of the sense strand of the second NERS. Is located 3 'to the complement of the first portion in the second strand of the target nucleic acid, or (ii) if the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid, the first ODNP is A sequence of the sense strand and a nucleotide sequence that is at least substantially identical to a first portion of the target nucleic acid, and wherein the second ODNP is at least substantially complementary to a second portion of the target nucleic acid. A second nucleotide located 5 'to the first portion in the target nucleic acid, wherein the second nucleic acid comprises the sequence of the sense strand of the second NERS; If present in the sample, a nicking endonuclease (NE) that recognizes the first NERS and the second NERS, deoxyribonucleoside triphosphate and DNA Maintaining the mixture under conditions in which the single-stranded nucleic acid fragment (A2) is amplified exponentially in the presence of limerase, wherein A2 is preferably no more than 25 nucleotides in length, And (C) detecting the presence or absence of A2 to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample.
[0023]
A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising: (A) a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and a nucleic acid molecule of the sample. Forming a mixture, wherein (i) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand, the first ODNP comprises a first nicking endonuclease recognition sequence ( NERS) and a nucleotide sequence that is at least substantially complementary to a first portion of the first strand of the target nucleic acid, and wherein the second ODNP comprises a second strand of the target nucleic acid. A nucleotide sequence that is at least substantially complementary to a second portion of Is located 3 'to the complement of the first portion in the second strand of the target nucleic acid, or (ii) if the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid, the first ODNP is the sense of the first NERS The nucleotide sequence of the strand, and a nucleotide sequence at least substantially identical to a first portion of the target nucleic acid, and the second ODNP is at least substantially complementary to a second portion of the target nucleic acid. A second nucleotide located 5 'to the first portion in the target nucleic acid, wherein the second nucleic acid comprises the sequence of the sense strand of the second NERS; If present in the sample, (i) extend the first ODNP and the second ODNP to produce an extension product containing both the first NERS and the second NERS (Ii) in the presence of yet another nicking endonuclease (NE) that recognizes the first NERS and the second NERS, using one strand of the extension product of step (b) as a template, A condition under which the first single-stranded nucleic acid fragment (A1) is amplified; (iii) a third condition using A1 as a template in the presence of a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) capable of annealing to A1. Subjecting this mixture to conditions under which the single-stranded nucleic acid fragment (A2) of is amplified, wherein A1, A2 or both have at most 25 nucleotides, and T2 is 5 'to 3'. (A) the sequence of the sense strand of the third NERS, and (b) a sequence at least substantially complementary to A1 And (C) detecting the presence or absence of A2 to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample.
[0024]
A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, comprising: (A) forming a mixture comprising the following (i) and (ii): ( i) a nucleic acid molecule of the sample, and (ii) a sequence that is at least substantially complementary to the 5 ′ portion of the target nucleic acid in a 3 ′ to 5 ′ orientation, and a first nicking agent recognition sequence When a single-stranded nucleic acid probe (T1) or (B) containing the sequence of the antisense strand of (NARS) is present, a probe molecule hybridized to the target nucleic acid is replaced with a probe molecule not hybridized to the target nucleic acid. (C) if present, a probe molecule hybridized to the target nucleic acid and amplification reaction in the presence of a first nicking agent (NA) recognizing the first NARS. (D) providing a single-stranded nucleic acid molecule (T2) in the 5 ′ to 3 ′ orientation and comprising the following (i) and (ii): (i) the sense strand of the second NARS A sequence that is at least substantially identical to a portion of the first single-stranded nucleic acid probe, located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NARS; Performing an amplification reaction in the presence of a second NA that recognizes the second NARS; (F) detecting the presence or absence of the amplification product of step (E) to determine the presence or absence of the target nucleic acid in this sample. The step of determining.
[0025]
A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, comprising: (A) forming a mixture comprising the following (i) and (ii): ( i) a nucleic acid molecule of this sample, and (ii) a partially double-stranded nucleic acid probe comprising (a) and (b): (a) the sequence of the sense strand of the first NARS, And (b) the strand itself or an extension product thereof in the strand comprising a nicking site (NS) nickable by a first nicking agent (NA) that recognizes the first NARS. A 5 'overhang, or a 3' overhang in the strand that does not contain this NS or its extension product, wherein the overhang is a nucleic acid that is at least substantially complementary to the target nucleic acid. Including array (B) separating, if present, probe molecules that have hybridized to the target nucleic acid from probe molecules that have not hybridized to the target nucleic acid; (C) hybridizing to the target nucleic acid, if present Performing an amplification reaction in the presence of a probe molecule and a first nicking agent (NA) that recognizes the first NARS; (D) the following (i) and (ii) in the 5 ′ to 3 ′ orientation: Providing a single-stranded nucleic acid molecule (T2) comprising: (i) the sequence of the sense strand of the second NARS, and (ii) the nucleic acid probe located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NARS. (E) performing an amplification reaction in the presence of a second NA that recognizes this second NARS; (F) performing the amplification reaction in step (E). Detecting a within or without, the step of determining the presence or absence of the target nucleic acid in the sample.
[0026]
A method for determining the presence or absence of a connection between two specific exons in a cDNA molecule, comprising: (A) the following (i) and (ii): Providing an at least partially double-stranded nucleic acid molecule (N1) comprising: (i) the sequence of the sense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS), and the sequence of the antisense strand of the first NARS; And (ii) at least one strand of a portion of the cDNA molecule, wherein the portion is suspected of containing a junction between the two exons; Amplifying the first single-stranded nucleic acid molecule (A1) in the presence of a recognizing nicking agent (NA), a DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates, wherein: The step of amplifying comprises using a portion of the cDNA as a template for the polymerase; (C) in a 5 ′ to 3 ′ orientation, including the following (i) and (ii): Providing a single-stranded nucleic acid molecule (T2): (i) the sequence of the sense strand of the second NARS, and (ii) a sequence that is at least substantially complementary to A1; (D) T2, A1, Amplifying a third single-stranded nucleic acid molecule (A2) in the presence of 1NA, a second NA recognizing the second NARS, the DNA polymerase, and the deoxynucleoside triphosphate, wherein A2 Is at least substantially complementary to A1; and (E) detecting and / or characterizing A2 to determine the presence or absence of a junction of the cDNA molecule. The step of.
[0027]
A method for determining the presence or absence of a junction between two exons in a cDNA molecule, wherein the junction, if present, recognizes the first nicking endonuclease in the cDNA molecule. Located 5 'to the sequence of the antisense strand of the sequence (NERS), the method includes: (A) forming a mixture comprising the following (i), (ii) and (iii): : (I) this cDNA molecule, (ii) a single-stranded nucleic acid molecule (T2) in the 3 ′ to 5 ′ orientation and comprising the following (a) and (b): (a) antisense of this first NERS A sequence that is at least substantially identical to a portion of the cDNA molecule, located 5 'to the sequence of the strand, and (b) the sequence of the sense strand of the second NERS, and (iii) recognizes the first NERS. First Block forming endonuclease (NE); second NE recognizing this second NERS, DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates; (B) conditions for exponentially amplifying single-stranded nucleic acid molecule (A2) Maintaining the mixture at; and (C) characterizing A2 to determine the presence or absence of a junction in the cDNA molecule.
[0028]
A method for determining the presence or absence of a junction between an upstream exon (exon A) and a downstream exon (exon B) of a gene in a cDNA molecule, the method comprising: A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and the cDNA molecule, wherein (i) the first ODNP binds to a portion of the antisense strand of exon A Comprising at least a substantially complementary sequence near the 5 'end of exon A in the antisense strand, and (ii) the second ODNP is at least substantially complementary to a portion of the sense strand of exon B. A sequence near the 5 'end of exon B in the sense strand, and (iii) at least one of the first ODNP and the second ODNP. Further comprising the sequence of the sense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS); and (B) the first single strand if both exon A and exon B are present in this cDNA. Performing a first amplification reaction in the presence of a nicking agent (NA) that recognizes the first NARS under conditions where the nucleic acid (A1) is amplified; (C) in a 5 ′ to 3 ′ direction, Providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) comprising (i) and (ii): (i) the sequence of the sense strand of the second NARS, and (ii) at least substantially relative to A1. (D) If both exon A and exon B are present in the cDNA molecule, a third single-stranded nucleic acid fragment (A2) is amplified using A1 as a template. Under conditions, this second Performing a second amplification reaction in the presence of a second NA that recognizes ARS; and (G) detecting and / or characterizing A2 to link between exon A and exon B in the cDNA molecule. Determining the presence or absence of the part.
[0029]
A method for determining the presence or absence of a junction between an upstream exon (exon A) and a downstream exon (exon B) of a gene in a cDNA molecule, the method comprising: A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and the cDNA molecule, wherein (i) the first ODNP comprises the following (a) and (b): : (A) near the 5 'end of exon A in the antisense strand of exon A, a sequence at least substantially complementary to a portion of this antisense strand, and (b) a first nicking agent recognition sequence The sequence of the sense strand of (NARS); and (ii) the second ODNP comprises the following (a) and (b): (a) the 5 'end of exon B in the sense strand of exon B Closely, a sequence at least substantially complementary to a portion of the sense strand, and (b) the sequence of the sense strand of the second NARS; (B) if both exon A and exon B are present in the cDNA. For example, under the condition that the first single-stranded nucleic acid (A1) is amplified, the first nicking agent (NA) recognizing the first NARS and the first nicking agent (NA) recognizing the second NARS may be used. Performing an amplification reaction; (C) providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) in the 5 ′ to 3 ′ direction, comprising the following (i) and (ii): (i) The sequence of the sense strand of 3 NARS, and (ii) a sequence at least substantially complementary to A1; (D) if both exon A and exon B are present in this cDNA molecule, Using as a template, Performing a second amplification reaction in the presence of a third NA recognizing the second NARS under conditions under which the single-stranded nucleic acid fragment (A2) of No. 3 is amplified; and (E) detecting and / or detecting A2 Characterizing to determine the presence or absence of a junction between exon A and exon B in the cDNA molecule.
[0030]
A method for determining the presence or absence of a junction between an upstream exon (exon A) and a downstream exon (exon B) of a gene in a cDNA molecule, comprising the following steps: : (A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and a cDNA molecule, wherein (i) the first ODNP comprises (a) the exon A of the antisense strand (Ii) a sequence at least substantially complementary to a portion of the antisense strand of exon A near the 5 ′ end, and (b) the sequence of the sense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS); A) a second ODNP comprising: (a) a sequence at least substantially complementary to a portion of the exon B sense strand near the 5 ′ end of exon B in the sense strand; A step comprising the sequence of the sense strand of S; (B) under conditions that exponentially amplify the single-stranded nucleic acid fragment (A2) when both exon A and exon B are present in the cDNA molecule. Maintaining the mixture; and (C) detecting and / or characterizing A2 to determine the presence or absence of a junction between exon A and exon B in the cDNA molecule.
[0031]
The following criteria are used alone or in any combination to further describe the methods of the invention as outlined above and elsewhere herein, where these criteria are exemplary only And using other criteria that may also be described elsewhere herein, may further describe the method of the invention: wherein the first NARS is the same as the second NARS; Same as second nicking agent; any one or more NARS in the method is NERS; both first and second NA are nicking endonucleases (NE); BstNB I; NE is N.N. Alw I; both the first NE and the second NE BstNB I; at least one of the first nicking agent or the second nicking agent is a nicking endonuclease; both the first NA and the second NA are restriction endonucleases (RE); the first NARS, the second NARS And the third NARS (when three NARS are specified in embodiments of the invention) are identical to each other; each of the first NARS, the second NARS and the third NARS is recognized by a nicking endonuclease; the first NARS , The second NARS and at least one of the third NARS are recognized by a nicking endonuclease; any one, or any two, or any three, or any four, or any of the methods of the method. 5, or any 6, or any 7, or any 8, , Or any nine, or any ten steps (eg, step (A), step (B), step (C), and step (D), or, for example, step (a) -step (j)) Is performed in a single vessel; amplification of single-stranded nucleic acid fragments is performed under isothermal conditions; each amplification reaction is performed at one or more temperatures in the range of 50 ° C to 70 ° C; The amplification reactions are performed at or about 60 ° C .; each amplification reaction is performed at a temperature between the maximum and minimum temperatures, where the maximum temperature is within 20 ° C. of the minimum temperature; The reaction is performed at a temperature between the maximum and minimum temperatures, where the maximum temperature is within 15 ° C of the minimum temperature; each amplification reaction is performed at a temperature between the maximum and minimum temperatures. Where the highest temperature is within 10 ° C of the lowest temperature; each amplification reaction is The highest temperature is within 5 ° C. of the lowest temperature; N1 comprises the nucleotide sequence of the sense strand of the first NERS; N1 comprises the nucleotide sequence of the antisense strand of the first NERS The first NA and the second NA are both restriction endonucleases (RE); N1 is provided by annealing a trigger oligonucleotide primer (ODNP) and a single-stranded nucleic acid (T1), wherein T1 comprises the nucleotide sequence of either the sense or antisense strand of the first NERS; N1 from 5 ′ to 3 ′: (A) the sequence of the antisense strand of the first NARS; and (B) A sequence that is at least substantially complementary to at least a portion of a trigger ODNP. The sequence (B) of T1 is exactly complementary to at least a portion of the trigger ODNP when given by annealing a ligating oligonucleotide primer (ODNP); T1 is substantially identical to T2. The 3 'end of T2 is attached to a phosphate group; the 3' end of T1 is attached to a phosphate group; T1 is exactly the same as T2; The nucleotide sequence of T2 that is at least substantially identical to the portion of N1 located 5 'to the antisense strand of NARS in N1 is, in fact, identical to the antisense of the first NARS. Exactly identical to the portion of N1 located 5 'to the sense strand; if T3 comprises a sequence that is at least substantially identical to at least a portion of the template sequence T2. In one embodiment, T3 comprises a sequence that is exactly identical to at least a portion of the template sequence T2; A2 comprises a nucleotide sequence that is at least substantially identical to a nucleotide sequence in A1; A2 comprises A1 A1 comprises a nucleotide sequence that is at least substantially identical to a nucleotide sequence in A2; A1 is exactly identical to a nucleotide sequence in A2 A2 and A1 are identical; Al is substantially identical to A2; A2 is substantially identical to A1; A1 is exactly identical to A2; A1 Is not substantially or exactly the same as A2; A1 is substantially the same as the trigger ODNP; A1 is the same as the trigger ODNP A2 is exactly the same as the trigger ODNP; A2 is exactly the same as the trigger ODNP; A1 is at least 5, or at least 6, or at least 7, or at least 8, or At least 9, or at least 10, or at least 11, or at least 12, or at least 13, or at least 14, or at least 15, or at least 16, or at least 17, or at least 18, or at least 19, or at least 20, or at least 21. Or at least 22, or at least 23, or at least 24, or at least 25 nucleotides in length, while additionally or alternatively, A1 is 40 or less; Or 39 or less, or 38 or less, or 37 or less, or 36 or less, or 34 or less, or 33 or less, or 32 or less, or 31 or less, or 30 or less, or 29 or less, or 28 or less, or 27 or less, or 26 or less, or 25 or less, or 24 or less, or 23 or less, or 22 or less, or 21 or less, or 20 or less, or 19 or less, or 18 or less, or 17 or less, or 16 or less, or 15 or less Or 14 or less, or 13 or less, or 12 or less, or 11 or less, or 10 or less nucleotides, wherein any upper limit indicated for the nucleotide length of A1 is any indication for the nucleotide length of A1. Lower bound Can be combined so that, for example, A1 can be 8 to 24 nucleotides in length, or 12 to 17 nucleotides in length; A2 can be at least 5, or at least 6, or at least 7, or at least 8, or At least 9, or at least 10, or at least 11, or at least 12, or at least 13, or at least 14, or at least 15, or at least 16, or at least 17, or at least 18, or at least 19, or at least 20, or at least 21. Or at least 22, or at least 23, or at least 24, or at least 25 nucleotides in length, while additionally or alternatively, A2 is 40 Or less, or 39 or less, or 38 or less, or 37 or less, or 36 or less, or 34 or less, or 33 or less, or 32 or less, or 31 or less, or 30 or less, or 29 or less, or 28 or less, Or 27 or less, or 26 or less, or 25 or less, or 24 or less, or 23 or less, or 22 or less, or 21 or less, or 20 or less, or 19 or less, or 18 or less, or 17 or less, or 16 or less, or 15 Or less, or 14 or less, or 13 or less, or 12 or less, or 11 or less, or 10 nucleotides in length, where any upper limit stated for the nucleotide length of A2 is stated for the nucleotide length of A2. Any lower limit and pair A2 can be, for example, 8 to 24 nucleotides in length, or 12 to 17 nucleotides in length; the first number of T2 molecules is greater than the first number of T1 molecules; N1 is genomic DNA N1 is part of genomic DNA; the target nucleic acid is one strand of a modified double-stranded nucleic acid; the target nucleic acid is one strand of a double-stranded genomic nucleic acid or cDNA; The nucleic acid is an RNA molecule; the target nucleic acid is derived from a nucleic acid obtained from a bacterium; the target nucleic acid is derived from a nucleic acid obtained from a virus; the target nucleic acid is derived from a nucleic acid obtained from a fungus; The target nucleic acid is derived from a parasite-derived nucleic acid; the trigger ODNP is one strand of a double-stranded genomic nucleic acid or cDNA; the trigger ODNP is an RNA molecule; Trigger ODNP is derived from a nucleic acid obtained from a virus; trigger ODNP is derived from a nucleic acid obtained from a fungus; trigger ODNP is derived from a nucleic acid derived from a parasite; deoxynucleoside At least one of the triphosphates is labeled; at least one of the deoxynucleoside triphosphates is linked to a radiolabel; at least one of the deoxynucleoside triphosphates is linked to an enzyme label; deoxynucleoside triphosphate At least one of the acids is linked to a fluorescent dye that functions as a label; at least one of the deoxynucleoside triphosphates is linked to digoxigenin that functions as a label; At least one of the deoxynucleoside triphosphates is Linked to biotin; a method The same type of DNA polymerase is used in all steps; DNA polymerase, 5 '→ 3' is exonuclease-deficient; DNA polymerase, 5 '→ 3' is exonuclease deficient and exo−Vent, exo−Deep Vent, exo−Bst, exo−Pfu, exo−Bca, Klenow fragment of DNA polymerase I, T5 DNA polymerase, Phi29 DNA polymerase, phage M2 DNA polymerase, phage PhiPRD1 DNA polymerase, Sequenase, PRD1 DNA polymerase, 9 ° NmTMDNA polymerase and T4 DNA polymerase homoenzyme, wherein any two or more of these enumerated DNA polymerases are combined to select a DNA polymerase for use in the methods of the invention. For example, a 5 ′ → 3 ′ exonuclease deficient DNA polymerase can be−Bst polymerase, exo−Bca polymerase, exo−Vent polymerase, 9 ° NmTM  DNA polymerase or exo−Deep Vent polymerase; DNA polymerase has strand displacement activity; each amplification reaction is performed in the presence of a strand displacement promoter; the strand displacement promoter is used during amplification, wherein This strand displacement promoter is from the group of BMRF1 polymerase accession subunit, adenovirus DNA binding protein, herpes simplex virus protein ICP8, single-stranded DNA protein, phage T4 gene 32 protein, calf thymus helicase, and trehalose. Selected, wherein the invention provides that any two or more of the listed promoters can be combined to form a group in which the promoters are selected to practice embodiments of the invention; The replacement promoter is trehalose.
[0032]
Any of the methods of the invention may or preferably includes detecting the amplified nucleic acid (eg, detecting the formation of A2 either quantitatively or qualitatively). In one embodiment, the detecting is performed at least in part by a technique selected from emission or spectroscopy, fluorescence or spectroscopy, mass spectrometry, liquid chromatography, fluorescence polarization, and electrophoresis. Any two, three, four or more members of the technologies listed herein may be grouped together to form a group of technologies from which the technology utilized in embodiments of the present invention may be selected. (Eg, detection can be performed by mass spectrometry or liquid chromatography). In one embodiment, detection involves the use of a fluorescent intercalating agent that specifically binds the double-stranded nucleic acid.
[0033]
In a further aspect, the present invention provides:
A composition comprising: (A) a first at least partially double-stranded nucleic acid molecule (eg, as described herein) wherein one strand comprises, from the 5 ′ side to the 3 ′ side, the following: N1 or H1): (i) a sequence of at most 25 nucleotides in length, and (ii) the sequence of the antisense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS); and (B) one strand is 5 ′ A second at least double-stranded nucleic acid molecule (e.g., N2 or H2 as described herein) including 3 'to: (i) the sequence of the sense strand of the second NARS, and (ii) A) a sequence at least substantially identical to a sequence located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NARS in the first nucleic acid molecule;
[0034]
A composition comprising: (a) a first at least partially double-stranded nucleic acid molecule (eg, wherein one strand comprises a sequence of a sense strand of a first nicking agent recognition sequence (NARS); (N1 or H1 described herein); and (b) a second at least double-stranded nucleic acid molecule (eg, herein) wherein one strand comprises from the 5 ′ to the 3 ′ side: N2 or H2) described in (1): at least substantially the sequence of the sense strand of the second NARS, and (ii) the sequence located 3 ′ to the sequence of the sense strand of the first NARS in the first nucleic acid molecule. Using a first nucleic acid molecule as a template in the presence of a nicking agent that recognizes the first NARS, a DNA polymerase, and one or more nucleoside triphosphates. Single strand Acid fragment has 25 nucleotides at most.
[0035]
In these compositions, the following additional criteria and / or ingredients may be used to describe the compositions, and for the methods of the present invention the same applies to the above criteria: this composition recognizes the first NARS The composition further comprises a nicking agent that recognizes both the first NARS and the second NARS; the composition further comprises a nicking agent that recognizes both the first NARS and the second NARS; the composition comprises both the first NERS and the second NERS. The composition further comprises a nicking endonuclease (NE) that recognizes; the composition further comprises a nicking agent (NA) that recognizes both the first NARS and the second NARS; The composition further comprises BstNB I; the composition further comprises a DNA polymerase; the composition further comprises a DNA polymerase which is 5 'to 3' exonuclease deficient;−Vent, exo−Deep Vent, exo−Bst, exo−Pfu, exo−Bca, Klenow fragment of DNA polymerase I, T5 DNA polymerase, Phi29 DNA polymerase, phage M2 DNA polymerase, phage PhiPRD1 DNA polymerase, Sequenase, PRD1 DNA polymerase, 9 ° NmTM  The composition further comprises a DNA polymerase selected from the group consisting of DNA polymerase and T4 DNA polymerase homoenzyme; the composition further comprises a DNA polymerase having strand displacement activity; The composition further comprises; selected from the group of BMRF1 polymerase auxiliary subunit, adenovirus DNA binding protein, herpes simplex virus protein ICP8, single-stranded DNA binding protein, phage T4 gene 32 protein, calf thymus helicase, and trehalose. Further comprising one or more members of the group, wherein one or more members of this group may be combined to form a group in which the promoter is selected in an embodiment of the present invention; including The composition comprises a labeled deoxynucleoside triphosphate. The composition comprises a labeled oligonucleotide that is at least substantially complementary to a sequence located 5 'to the sequence of the antisense strand of the second NARS in T2. The composition includes a fluorescent intercalating agent.
[0036]
In any of the methods or compounds or compositions of the invention that include a NARS, the NARS may include one or more mismatched nucleotides. In other words, one or more of the nucleotide base pairs forming the NARS may not hybridize according to conventional Watson-Crick base pairing rules. However, if a mismatched nucleotide is present in this NARS, at least all the nucleotides necessary to form the sense strand of NARS are present. In one embodiment, there are no mismatched base pairs in the NARS, and all nucleotides present in the NARS are paired with nucleotides in the complementary strand according to conventional Watson-Crick base pairing rules. In one embodiment, the NARS comprises mismatched base pairs. In one embodiment, there is one mismatched base pair in NARS, but in another embodiment, there are two mismatched base pairs in NARS, and in another embodiment, all base pairs forming NARS are: A mismatch, and in another embodiment, n-1 base pairs forming a NARS are mismatches, where n base pairs form a NARS. In one embodiment where the present invention utilizes both the first NARS and the second NARS, the mismatch present in the first NARS is also present in the second NARS. In one embodiment where the present invention utilizes both the first NARS and the second NARS, the mismatch present in the first NARS is not present in the second NARS. In one embodiment where the present invention utilizes both the first NARS and the second NARS, the first NARS does not include a mismatched base pair, but the second NARS includes one or more mismatched base pairs. In one embodiment, there are unmatched nucleotides in the NARS. In another embodiment, the nucleotides forming the sense strand of NARS are not matched. In another embodiment, the NARS comprises unmatched nucleotides.
[0037]
Also, in the methods, compounds and compositions of the present invention, one or more nucleic acid molecules can be immobilized on a solid support. Typically, this immobilization allows for a preliminary separation of hybridized and non-hybridized material. In various embodiments: the first ODNP is immobilized; the second ODNP is immobilized; both the first ODNP and the second ODNP are immobilized; the target nucleic acid is immobilized; T2, or each T2 is immobilized Immobilization is via a covalent bond to a solid support. Suitable solid supports are made from materials such as silica, plastics and metals.
[0038]
These and other aspects of the invention will become apparent with reference to the following detailed description and accompanying drawings.
[0039]
(Detailed description of the invention)
The present invention provides simple and efficient methods and kits for exponential amplification of nucleic acids using nicking agents. This amplification can be performed isothermally and is not transcription-based. These methods and kits are useful in many areas, such as detecting genetic variations, diagnosing pathogens or diseases, and differential splicing analysis.
[0040]
(Agreement / Definition)
Before providing a more detailed description of the present invention, it may be more useful to understand the present invention, as follows, to define and provide conventions as used herein. . Additional definitions are also provided throughout the description of the invention.
[0041]
The terms "3 '" and "5'" are used herein to describe the position of a particular site within a single strand of a nucleic acid. When a position in a nucleic acid is "3 '(side)" or "3' (side)" of a reference nucleotide or nucleotide sequence, this means that the position is 3 'of the reference nucleotide or nucleotide sequence. It means located between the terminus and the 3 'hydroxyl of the nucleic acid strand. Similarly, if the position in the nucleic acid is 5 ′ (side) or “5 ′ (side)” of the reference nucleotide or nucleotide sequence, this is the 5 ′ of the reference nucleotide or nucleotide sequence. Means located between the terminus and the 5 'phosphate of that strand of the nucleic acid. Further, if the nucleotide sequence is “immediately 3 ′ (side)” or “immediately 3 ′ (side)” to the reference nucleotide or reference nucleotide sequence, then this indicates that the nucleotide sequence is It means immediately adjacent to the 3 'end of the sequence. Similarly, if a nucleotide sequence is “immediately 5 ′ (side)” or “immediately 5 ′ (side)” to a reference nucleotide or reference nucleotide sequence, this indicates that the nucleotide sequence is It means immediately adjacent to the 5 'end of the nucleotide sequence.
[0042]
“Naturally occurring nucleic acid” refers to a naturally occurring nucleic acid molecule (eg, a full-length genomic DNA or mRNA molecule).
[0043]
An "isolated nucleic acid molecule" is not identical to the nucleic acid molecule of any naturally occurring nucleic acid or of any fragment of a naturally occurring genomic nucleic acid spanning more than three separate genes , A nucleic acid molecule.
[0044]
As used herein, `` nicking '' is recognized by an enzyme that nicks a completely double-stranded nucleic acid molecule or a double-stranded portion of a partially double-stranded nucleic acid molecule. Cleavage of only one strand at a particular position relative to a particular nucleotide sequence. The particular location where a nucleic acid is nicked is referred to as the "nicking site" (NS).
[0045]
A “nicking agent” (NA) recognizes a specific nucleotide sequence of a fully or partially double-stranded nucleic acid molecule and recognizes only one strand of the nucleic acid molecule at a specific position relative to the recognition sequence. It is an enzyme that cleaves. Nicking agents include nicking endonucleases (e.g., N.BstNB I) and restriction endonucleases (e.g., where the fully or partially double-stranded nucleic acid molecule contains a semi-modified recognition / cleavage sequence). , HincII), in this semi-modified recognition / cleavage sequence, one strand is cleaved by the restriction endonuclease (ie, the strand containing the derivatized nucleotide). At least one derivatized nucleotide that prevents
[0046]
As used herein, a "nicking endonuclease" (NE) recognizes a nucleotide sequence of a fully or partially double-stranded nucleic acid molecule and at a particular position relative to the recognition sequence. An endonuclease that cleaves only one strand of a nucleic acid molecule. A restriction that is modified by including at least one derivatised nucleotide to require its recognition sequence to prevent cleavage of the derivatised nucleotide-containing strand of a fully or partially double-stranded nucleic acid molecule. Unlike endonucleases (REs), NEs typically recognize a nucleotide sequence containing only native nucleotides and include one strand of a fully or partially double stranded nucleic acid molecule containing this nucleotide sequence. Only disconnect.
[0047]
As used herein, "native nucleotide" refers to adenylic acid, guanylic acid, cytidylic acid, thymidylic acid, or uridylic acid. “Derivatised nucleotides” refers to nucleotides that are not native nucleotides.
[0048]
The nucleotide sequence of a fully or partially double-stranded nucleic acid molecule that NA recognizes is referred to as a "nicking agent recognition sequence" (NARS). Similarly, the nucleotide sequence of a fully or partially double-stranded nucleic acid molecule that is recognized by NE is referred to as a "nick forming endonuclease recognition sequence" (NERS). The particular sequence that the RE recognizes is referred to as a "restriction endonuclease recognition sequence" (RERS). As used herein, “semi-modified RERS” means that one strand of the recognition sequence comprises at least one derivatized nucleotide (eg, an α-thiodeoxynucleotide), A double-stranded RERS that prevents cleavage of that strand (ie, a strand containing derivatized nucleotides within the recognition sequence) by a RE that recognizes the RERS.
[0049]
In certain embodiments, a NARS is a double-stranded nucleotide sequence in which each nucleotide on one strand of the sequence is complementary to a nucleotide at a corresponding position on the other strand. In such an embodiment, the sequence of NARS in the strand containing NS capable of nicking with NA that recognizes NARS is referred to as the “sequence of the sense strand of NARS” or the “sequence of the sense strand of double-stranded NARS” On the other hand, the NARS sequence in the NS-free strand is referred to as “NARS antisense strand sequence” or “double-stranded NARS antisense strand sequence”.
[0050]
Similarly, in embodiments where the NERS is a double-stranded nucleotide sequence where one strand is exactly complementary to the other, the NERS located on the strand comprising the NS nickable by the NE recognizing the NERS Is referred to as the "sequence of the sense strand of NERS" or the "sequence of the sense strand of double-stranded NERS." Or "sequence of the antisense strand of double-stranded NERS". For example, the recognition sequence and nicking site for an exemplary nicking endonuclease (N.BstNB I) are shown below, using "black inverted triangles" to indicate cleavage sites and to indicate any nucleotides. Use N for:
[0051]
Embedded image
[0052]
N. The sequence of the sense strand of the BstNB I recognition sequence is 5'-GAGTC-3 ', while the sequence of the antisense strand is 5'-GACTC-3'.
[0053]
Similarly, the sequence of a semi-modified RERS located on a strand containing NS capable of nicking with a RE that recognizes a semi-modified RERS (ie, a strand that does not contain any derivatized nucleotides) has a "half" The sequence of the modified RERS sense strand is referred to as the "sensed strand of the modified RERS" and is located on the "semi-modified RERS sense strand" of the nucleic acid containing the semi-modified RERS, while the NS-free strand (i.e., the derivatized The sequence of the semi-modified RERS in the nucleic acid containing the semi-modified RERS is referred to as the “sequence of the semi-modified RERS antisense strand”. It is located in.
[0054]
In certain other embodiments, the NARS is a maximally partially double-stranded nucleotide sequence with one or more nucleotide mismatches, but the intact sense sequence of the double-stranded NARS as described above. including. In accordance with the conventions used herein, in the context of describing NARS, two nucleic acid molecules anneal to each other to form a hybridized product, wherein the hybridized product comprises NARS and If there is at least one mismatched base pair within the NARS of the soyed product, the NARS is considered simply partially double-stranded. Such NARS may be recognized by certain nicking agents (eg, N.BstNB I), which require only one strand of the double-stranded recognition sequence for their nicking activity. And For example, N. The BstNB I NARS may, in certain embodiments, comprise an intact sense strand as follows:
5'-GAGTC-3 '
3'-NNNNNN-5 '
Here, N represents any nucleotide and N at one position may or may not be the same as N at another position, but at least one mismatched base pair in the recognition sequence. Exists. In this situation, NARS is characterized as having at least one mismatched nucleotide.
[0055]
In certain other embodiments, the NARS is a partially or completely single-stranded nucleotide sequence having one or more mismatched nucleotides, but as described above, the intact double-stranded NARS Includes sense strand. In accordance with the conventions used herein, in the context of describing NARS, two nucleic acid molecules (ie, first and second strands) anneal to each other to form a hybridized product, and The soy product includes a nucleotide sequence in the first strand that is recognized by NA (ie, the hybridized product includes NARS), and at least one nucleotide in the sequence that is recognized by NA is If, when a hybridized product is formed, does not correspond to (ie, does not face) a nucleotide in the second strand, there is at least one mismatched nucleotide in the NARS of the hybridized product. And the NARS is considered to be partially or completely single-stranded. Such NARS may be recognized by certain nicking agents (eg, N.BstNB I), which, due to their nicking activity, will only recognize one strand of the double-stranded recognition sequence. I need. For example, N. The BstNB I NARS may, in certain embodiments, comprise an intact sense strand as follows:
5'-GAGTC-3 '
3'-N0-4-5 '
(Where "N" indicates an arbitrary nucleotide, 0-4 indicates the number of nucleotides "N", and "N" at one position is the same as "N" at another position. This chain may or may not be present). It includes the sequence of the sense strand of the double-stranded recognition sequence of BstNB I. In this example, at least one of G, A, G, T or C does not match in that there is no corresponding nucleotide in the complementary strand. This situation occurs, for example, when a “loop” is present in the hybridized product, especially when the sense sequence is completely or partially present in the loop.
[0056]
As used herein, the phrase "amplifying a nucleic acid molecule" or "amplifying a nucleic acid molecule" refers to making two or more copies of a particular nucleic acid molecule. "Exponentially amplifying a nucleic acid molecule" or "exponentially amplifying a nucleic acid molecule" refers to the amplification of a particular nucleic acid molecule by a tandem amplification system that includes two or more nucleic acid amplification reactions. In such a system, the amplification product from the first amplification reaction functions as a starting amplification primer for the second nucleic acid amplification reaction. As used herein, the term "nucleic acid amplification reaction" refers to a process for making more than one copy of a nucleic acid molecule (A) using a nucleic acid molecule (T), The nucleic acid molecule (T) contains a sequence complementary to the sequence of the nucleic acid molecule A as a template. According to the present invention, both the first and second nucleic acid amplification reactions use a nicking reaction and a primer extension reaction.
[0057]
As used herein, a “starting primer” is a primer that anneals to a template nucleic acid and initiates a nucleic acid amplification reaction. The starting primer must function as a primer for starting primer extension, but need not be a primer for any subsequent primer extension. For example, assume that primer A1 anneals to a portion of template nucleic acid T1, and that this template nucleic acid T1 contains the sequence of the NARS sense strand at a position 3 'to the sense strand of NARS. In the presence of DNA polymerase, the 3 'end of A1 uses T1 as a template to produce double-stranded or partially double-stranded nucleic acid molecules (H1), including double-stranded NARS To be extended. In the presence of NA that recognizes NARS, H1 is nicked on the strand complementary to starting primer A1. A strand that includes the 3 'end at the nicking site and does not include the starting primer A1 can function as a primer for subsequent primer extension in the presence of NA and DNA polymerase. A1 is considered as the starting primer, but functions as a primer only for the first primer extension, but does not function as a primer for subsequent primer extension.
[0058]
“Trigger oligonucleotide primer (ODNP)” is ODNP that functions as a primer in the first nucleic acid amplification reaction of a tandem nucleic acid amplification system. This is because the other required components of this system (eg, DNA polymerase, NA, deoxynucleoside triphosphate, template for the first amplification reaction (T1), and template for the second amplification reaction) In the presence of (T2)), induce exponential amplification of the nucleic acid molecule. In certain embodiments, if the template for the first amplification reaction (T1) comprises the sequence of one strand of NARS, the trigger ODNP may comprise the sequence of the other strand of NARS. Trigger ODNPs can be derived from a target nucleic acid or can be chemically synthesized.
[0059]
If the first nucleic acid is either a digestion product of the second nucleic acid or an amplification product using a second nucleic acid molecule or a portion of its complement as a template, the first nucleic acid molecule ("first nucleic acid molecule" Nucleic acid ") is" derived from "or" derived from "another nucleic acid molecule (" second nucleic acid "). The first nucleic acid molecule must include a sequence that is exactly identical or exactly complementary to at least a portion of the second nucleic acid.
[0060]
If the complement of the first sequence is able to anneal to the second sequence in a given reaction mixture (eg, a nucleic acid amplification mixture), the first nucleic acid sequence is "at least substantially attached to" the second nucleic acid sequence. The same. " In certain preferred embodiments, the first sequence is “exactly identical” to the second sequence, ie, the nucleotide of the first sequence at each position is the same as the nucleotide of the second sequence at the same position. And the first sequence is the same length as the second sequence.
[0061]
A first nucleic acid sequence is “at least substantially complementary” to a second nucleic acid sequence if the first sequence can anneal to a second sequence in a given reaction mixture (eg, a nucleic acid amplification mixture). It is. In certain preferred embodiments, the first sequence is “exactly or completely complementary” to the second sequence, ie, each nucleotide of the first sequence has a second sequence at its corresponding position. And the first sequence is the same length as the second sequence.
[0062]
As used herein, a double-stranded nucleic acid is located at a position (corresponding to) another position (eg, a defined position) in the other strand (referred to as “second strand”). Nucleotides in one strand (referred to as "first strand") of a double-stranded nucleic acid refer to nucleotides in the first strand that are complementary to the nucleotide at the corresponding position in the second strand. Similarly, in one strand (referred to as “first strand”) of the double-stranded nucleic acid corresponding to the nicking site in the other strand (referred to as “second strand”) of the double-stranded nucleic acid Refers to a position between two nucleotides in the first strand that is complementary to (comprising nicking between) two nucleotides in the second strand.
[0063]
A nucleic acid sequence (or region) is "upstream" with respect to another nucleic acid sequence (or region) if the nucleic acid sequence is located 5 'to another nucleic acid sequence. A nucleic acid sequence (or region) is "downstream" with respect to another nucleic acid sequence (or region) if the nucleic acid sequence is located 3 'to another nucleic acid sequence.
[0064]
A. Methods and compositions for exponential amplification of nucleic acids
The present invention provides methods and compositions for exponential amplification of nucleic acids using nicking endonucleases. First, the following sections provide a general description of the method, followed by a description of the two types of nucleic acid amplification and compositions or kits for nucleic acid amplification.
[0065]
(1. General explanation)
In one aspect, the invention provides a simple and rapid method for exponential amplification of nucleic acids. It uses two or more linked amplification reactions (ie, tandem amplification systems) catalyzed by a combination of a nicking agent (NA) and a DNA polymerase. Each amplification reaction is based on the ability of the NA to nick a double-stranded or partially double-stranded nucleic acid molecule containing the recognition sequence of the NA, and the DNA polymerase at the nicking site (NS) of the NA. Based on ability to extend from 3 'end.
[0066]
In the first amplification reaction (FIG. 1), the trigger ODNP hybridizes to the first template nucleic acid (T1) containing the sequence of one strand of NARS (referred to as “first NARS”) and becomes completely Alternatively, a partially double-stranded nucleic acid molecule ("the starting nucleic acid molecule (N1) of the first amplification reaction)" is formed. The trigger ODNP does not include the other strand of the first NARS and hybridizes to a portion of T1 that is located 3 'to the strand of the first NARS in T1 or the other strand of the first NARS. , So that its hybridization to T1 either forms a nucleic acid molecule comprising the first double NARS. If a portion of T1 at the 5 'end forms a 5' overhang at N1, in the presence of DNA polymerase (termed "first DNA polymerase"), the trigger ODNP uses T1 as a template and To form a hybrid (H1) containing the first double-stranded NARS (step (a) in FIG. 1). The resulting H1 can be nicked by an NA that recognizes the first NARS, creating 3 'and 5' ends at the nicking site (step (b)). If the fragment containing the 5 'terminus at the nicking site (termed "A1") is sufficiently short (eg, less than 18 nucleotides in length), then the fragment will be capable of binding to H1 under dissociative reaction conditions (eg, 60 ° C). Dissociate from the part. However, if this fragment (ie, A1) does not readily dissociate, it is deficient in the 5 ′ → 3 ′ exonuclease, and in the presence of a first DNA polymerase with strand displacement activity, It can be replaced by extension of the fragment from its 3 'end (step (d)). Strand displacement can also occur in the absence of strand displacement activity in the first DNA polymerase when a strand displacement promoter is present. Such elongation again creates a new NS for the first NA that can be nicked ("re-nicked"), as in the first NA. The fragment containing the 5 'end in the new NS (ie, the new A1) can again be easily dissociated from other parts of H1 or replaced by extension from the 3' end in the NS (step ( f)). The nicking-extension cycle can be repeated multiple times (step (g)), resulting in a linear accumulation / amplification of the nucleic acid fragment A1.
[0067]
Exponential amplification of a nucleic acid molecule can be performed by combining or combining the first amplification reaction and the second amplification reaction via the fragment A1 amplified from the first amplification reaction. In the second amplification reaction (FIG. 2), A1 hybridizes to a portion of another single-stranded nucleic acid molecule (T2) containing the sequence of the sense strand of the second NARS. The resulting partially double-stranded nucleic acid molecule is referred to as "the starting nucleic acid molecule (N2) for the second amplification reaction". The portion of T2 to which A1 hybridizes is located on the 3 ′ side of the sequence of the sense strand of the second NARS, so that A1 functions as a starting primer for a primer extension reaction using T2 as a template. . Extension from A1 generates a hybrid (H2) containing a double-stranded second NARS (step (a) in FIG. 2). In the presence of a second NA that recognizes the second NARS, H2 is nicked, generating 3 'and 5' ends at this nicking site (step (b)). If the fragment containing the 5 ′ end at this nicking site is sufficiently short (eg, less than 18 nucleotides in length), this may result, under certain reaction conditions (eg, at 60 ° C.), from the other of H2. May dissociate from parts. However, if this fragment is not easily dissociated from the other part of H2, it may be in the presence of a 5 ′ → 3 ′ exonuclease deficient DNA polymerase with strand displacement activity (referred to as “second DNA polymerase”). Can be replaced by extension of a fragment having a 3 ′ end in this NS (step (c)). Strand displacement can also occur in the presence of a strand displacement promoter without the strand displacement activity of the second DNA polymerase. Such an extension can be nicked again by the second NA ("can be nicked"), creating a new NS for the second NA again (step (d)). The fragment containing the 5 'end at this new NS ("A2") can be easily dissociated again from the other part of H2, or can be displaced by extension from the 3' end in this NS (step ( e)). This nicking-extension cycle can be repeated multiple times (step (f)), resulting in an exponential accumulation / amplification of the nucleic acid fragment A2. This amplified single-stranded nucleic acid fragment A2 is at least substantially complementary to A1. A2 can be completely complementary to A1 if it is the same length as A1.
[0068]
In one aspect, the present invention provides a method for amplifying a nucleic acid molecule (A2). The method comprises: (a) providing a single-stranded nucleic acid molecule (A1); (b) from 5 ′ to 3 ′, (i) the sequence of the sense strand of NARS, and (ii) at least substantially Providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) comprising a sequence complementary to each other; and (c) a nicking agent that recognizes T2, A1, NARS, a DNA polymerase, and one or more deoxy Amplifying A2 in the presence of a nucleoside triphosphate, wherein A2 is at least substantially complementary to A1, and A1, A2, or both are not more than 25 nucleotides in length. . Exemplary means by which A1 can be provided are described herein.
[0069]
The exponential nucleic acid amplification method of the invention requires that T2 comprises the sequence of the sense strand of NARS, while T1 may comprise the sequence of the sense or antisense strand of NARS. These two types of nucleic acid amplification reactions are described in N.C. as examples for both first and second NARS. Using the recognition sequence of BstNB I, it is illustrated in FIGS. However, those skilled in the art will appreciate that T1 and T2 may include recognition sequences for other nicking agents.
[0070]
The first type of nucleic acid amplification according to the invention is where T1 comprises the sequence of the antisense strand of the first NARS. As shown in FIG. 3, for the first amplification reaction, the starting nucleic acid molecule N1 is formed by annealing the trigger ODNP with T1 having three regions (regions X1, Y1, and Z1). A double-stranded nucleic acid molecule. Regions X1, Y1, and Z1 are each N.D. A region immediately 3 'to the sequence of the antisense strand of the BstNB I recognition sequence; From the 3 'end of the sequence of the antisense strand of the recognition sequence of BstNB I, the N.B. A region up to a nucleotide corresponding to the 3 'terminal nucleotide of the nicking site of BstNB I (i.e., 3'-CACAGNNNNN-5', where N can be A, T, G, or C), and It is defined as a region immediately 5 'side of the region Y1. Trigger ODNP is at least substantially complementary to region X1 and functions as a primer for nucleic acid extension in the presence of DNA polymerase. The extension product (H1) can be completely double-stranded or partially double-stranded, depending on whether the 5 ′ terminal sequence of the trigger ODNP anneals to the 3 ′ terminal sequence of region X1. . H1 is a double-stranded N. Since it contains the BstNB I recognition sequence, Can be nicked by BstNB I. In certain embodiments, the 3 'end of T1 is blocked, for example, by a phosphate group, thereby preventing extension from this end. The nicking product containing the sequence of the trigger ODNP can be re-extended from its 3 'end at the nicking site by a DNA polymerase, at which point the N. nucleus is turned off. Displace the strand containing the 5 'end generated by BstNB I. The nicking-extension cycle is repeated multiple times, accumulating the displaced strand (A1).
[0071]
The product A1 of the first amplification reaction is then used as a starting primer for a second amplification reaction. Annealed to region X2 of T2, which also includes two additional regions (regions Y2 and Z2) to form the starting nucleic acid molecule N2 for the second amplification reaction. The region Y2 is the N.V. The sequence of the sense strand of the recognition sequence of BstNB I and the four nucleotides immediately 3 ′ to that sequence (ie, 3′-NNNNCTGAG-5 ′, where each of N is A, T, G or C ), Whereas regions X2 and Z2 refer to the regions immediately adjacent to the 3 'and 5' ends of region Y2, respectively. Extension of A1 using T2 as a template may result in a complete or partially double-stranded strand, depending on whether the 5 ′ terminal sequence of A1 anneals to the 3 ′ terminal sequence of region X2. An extension product (H2) is provided. H2 is a double-stranded N. Since it contains the BstNB I recognition sequence, Nicks can be nicked in the presence of BstNB I. The resulting 3 'end of the nicking site can be re-extended by DNA polymerase, displacing region X2. The nicking-extension cycle is repeated multiple times, accumulating / amplifying the displaced strand A2, including the 5 'end at the nicking site. A2 is exactly identical to region X2 when the 5 'terminal sequence of A1 anneals to the 3' terminal sequence of region X2. Otherwise, A2 and region X2 are substantially complementary to each other if they have different lengths. The amplification of A2 is logarithmic. Because it is the final amplification product of two related linear amplification reactions.
[0072]
A second type of nucleic acid amplification according to the present invention is where T1 comprises the first NARS sense strand sequence. Preferably, this first NARS is identical to the second NARS. Exemplary NAs in which the sequence of the sense strand sequence is present in both T1 and T2 include N.A. This type of nucleic acid amplification using BstNB I is illustrated in FIG.
[0073]
As shown in FIG. 4, for the first amplification reaction, the starting nucleic acid molecule N1 is formed by annealing the trigger ODNP with T1 having three regions (region X1, region Y1 and region Z1). A double-stranded nucleic acid molecule. The region X1, the region Y1, and the region Z1 are respectively N.D. A region immediately 3 'to the nicking site of the extension product of N1 by BstNB I (i.e., H1), N. A region up to the 5 'end of the sense strand sequence of the recognition sequence of BstNB I (i.e., 5'-GAGTCNNNNN-3' (where N can be A, T, G or C)), and immediately following region Y2 It is defined as the region on the 5 'side. This trigger ODNP is at least substantially complementary to region X1 or a portion thereof, and functions as a primer for nucleic acid extension in the presence of a DNA polymerase. This extension product (H1) is completely double-stranded or partially double-stranded, depending on whether the 5 ′ terminal sequence of the trigger ODNP anneals to the 3 ′ terminal sequence of region X1. obtain. H1 is a double-stranded N. Since it contains the BstNB I recognition sequence, Can be nicked by BstNB I. In certain embodiments, the 3 'end of T1 is blocked, e.g., with a phosphate group, to prevent extension from this end. N. The nicking product containing the sequence of the sense strand of the recognition sequence of BstNB I is re-extended from its 3 'end at the nicking site by a DNA polymerase, and N. The strand containing the 5 'end generated by BstNB I may be displaced. This nicking-extension cycle is repeated multiple times resulting in the accumulation of displaced strand A1, including the 5 'end of the nicking site.
[0074]
The product A1 of the first amplification reaction is then used as a starting primer for a second amplification reaction. This is annealed to region X2 of T2, which includes two additional regions, namely region Y2 and region Z2, to form the starting nucleic acid molecule N2 for the second amplification reaction. The region Y2 is similar to the region Y1, and the N.I. The sense strand sequence of the recognition sequence of BstNB I; Has four nucleotides (ie, 5'-GAGTCNNNNN-3 ', where N can be A, T, G or C) located immediately 3' to the sense strand sequence of the recognition sequence of BstNB I . Region X2 and region Z2 refer to the region immediately adjacent to the 3 'end and 5' end of region Y2, respectively. Extension of A1 using T2 as a template can be completely double-stranded or partially double-stranded, depending on whether the 5 ′ terminal sequence of A1 anneals to the 3 ′ terminal sequence of region X2. Provide the extension product (H2). H2 is a double-stranded N. This includes the N.BstNB I recognition sequence and thus Can be nicked by BstNB I. The resulting 3 'end at the nicking site can be re-extended by DNA polymerase to replace region X2. This nicking-extension cycle is repeated multiple times, resulting in accumulation / amplification of the displaced strand A2, including the 5 'end of the nicking site. This amplification of A2 is exponential. Because it is the final amplification product of two related linear amplification reactions.
[0075]
The method of the present invention is not limited to linking two nucleic acid amplification reactions together. In certain embodiments, the second amplification reaction may be further associated with a third amplification reaction. In other words, the nucleic acid molecule A2 amplified during this second amplification reaction anneals to a portion of another nucleic acid molecule "T3" containing the sequence of one strand of NARS ("third NARS"), Amplification of the nucleic acid molecule "A3" in the third amplification reaction may be induced. Additional amplification reactions can be added to this strand. For example, A3 then anneals to a portion of another nucleic acid molecule “T4” that also includes one strand of NARS (referred to as “fourth NARS”) to amplify the nucleic acid molecule “A4” in a fourth amplification reaction. May start. Each subsequent amplification reaction results in a linear amplification of the amplified fragment from the previous amplification reaction, so that other components of the system (eg, template nucleic acid molecules, NA, and DNA polymerase) limit both the rate and level of amplification. Otherwise, the higher the number of amplification reactions in the amplification system, the higher the amplification level.
[0076]
(A. Nick forming agent)
As mentioned above, the exponential nucleic acid amplification method of the invention combines two or more nucleic acid amplification reactions together, and each amplification reaction is performed in the presence of NA. The NA for one amplification reaction can be different from the NA for another amplification reaction. In one embodiment, the NAs for the different amplification reactions are identical to each other, such that only one NA is required for exponential amplification of a nucleic acid molecule. In another embodiment, two different NAs are used (eg, two NAs that recognize different NARS).
[0077]
Any enzyme that recognizes a particular nucleotide sequence and cleaves only one strand of a fully or partially double-stranded nucleic acid containing this sequence can be used as a nicking agent in the present invention. Such an enzyme can be an NE that recognizes a specific sequence composed of native nucleotides, or an RE that recognizes a partially modified recognition sequence.
[0078]
A nicking endonuclease may or may not have a nicking site that overlaps its recognition sequence. An exemplary NE that forms a nick outside of its recognition sequence is the NE. BstNB I, which recognizes a unique nucleic acid sequence composed of 5'-GAGTC-3 ', but nicks 4 nucleotides beyond the 3' end of this recognition sequence. N. The recognition sequence and nicking site of BstNB I are as follows:
[0079]
Embedded image
[0080]
Where the “down triangle” indicates the cleavage site, and the letter N indicates any nucleotide. N. BstNB I can be prepared and isolated as described in US Pat. No. 6,191,267. Buffers and conditions for using the nicking endonuclease are also described in the '267 patent. Additional exemplary NEs that nick outside of their recognition sequence are described in N. et al. AlwI, which recognizes the following double-stranded recognition sequence:
[0081]
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[0082]
N. The nicking site of AlwI is also indicated by the symbol “downward triangle”. Both NEs are available from New England Biolabs (NEB). N. AlwI can also be prepared by mutating type IIs RE AlwI as described in Xu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 12990-5, 2001).
[0083]
Exemplary NEs that nick within the NERS include N.A. BbvCI-a and N.V. BbvCI-b. The recognition sequences of these two NEs and NSs (indicated by the symbol "downward triangle") are shown below:
[0084]
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[0085]
Both NEs are available from NEB.
[0086]
Additional exemplary nicking endonucleases include, but are not limited to, the following: BstSE I (Abdurashitov et al., Mol. Biol. (Mosk) 30: 1261-7, 1996), engineered EcoR V (Stahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6175-80, 1996), manipulation. Fok I (Kim et al., Gene 203: 43-49, 1997), an endonuclease V from Thermotoga maritima (Huang et al., Biochem. 40: 8738-48, 2001), Cvi Nickase (e.g., CviNY2Ab, CviNY2Ab, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CivNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, CviNY2A, and CviNY2A). Research Products, Lincoln, Nebraska) (Zhang et al., Virology 240: 366-75, 1998; Nelson et al., Biol. Chem. 379: 423-8, 1998; Xia et al., Nucleic Acids Res. 16: 9477-87, 1988), and engineered Mly I (i.e., N. Mly I) (Besnier and Kong, EMBO Reports 2: 782). -6, 2001). Additional NEs may be provided by manipulating other restriction endonucleases, particularly type IIs restriction endonucleases, using methods similar to those for manipulating EcoR V, AlwI, FokI and / or MlyI. Can be obtained.
[0087]
A RE useful as a nicking agent can be any RE that nicks a double-stranded nucleic acid at its semi-modified recognition sequence. Exemplary REs that nick this semi-modified double-stranded recognition sequence include Ava I, Bsl I, BsmA I, BsoB I, Bsr I, BstN I, BstO I, Fnu4HI, Hinc II, Hind II. And Nci I, but are not limited thereto. Additional REs that nick the semi-altered recognition sequence can be screened by the strand protection assay described in US Pat. No. 5,631,147.
[0088]
Certain nicking agents require only the presence of the sense strand of the double-stranded recognition sequence in at least partially double-stranded substrate nucleic acid for nicking activity. For example, N. BstNB I is a recognition sequence in which one or more nucleotides on one strand do not form a conventional base pair (eg, G: C, A: T, or A: U) with the other strand of the substrate nucleic acid. It is active in nicking a substrate nucleic acid containing the sequence of the sense strand of "5'-GAGTC-3 '". N. The nicking activity of BstNB I decreases with increasing number of nucleotides in the sense strand of its recognition sequence that do not base pair with any nucleotide in the other strand of the substrate nucleic acid.
[0089]
In certain embodiments, the nicking agent is capable of recognizing a nucleotide sequence in a DNA-RNA duplex and nicking one strand of the duplex. In certain other embodiments, the nicking agent is capable of recognizing a nucleotide sequence in double-stranded RNA and nicking one strand of the RNA.
[0090]
(B. DNA polymerase)
As mentioned above, the exponential nucleic acid amplification method of the present invention combines two or more nucleic acid amplification reactions together, and each amplification reaction is performed in the presence of a DNA polymerase. The DNA polymerase for one amplification reaction can be different from the DNA polymerase for another amplification reaction. In one embodiment, the DNA polymerases for the different amplification reactions are identical to each other, such that only one DNA polymerase is required for exponential amplification of a nucleic acid molecule.
[0091]
The DNA polymerase useful in the present invention can be any DNA polymerase that is 5 'to 3' exonuclease deficient but has strand displacement activity. Such DNA polymerases include exo−Deep Vent, exo−Bst, exo−Pfu and exo−Bca, but is not limited to these. Additional DNA polymerases useful in the present invention can be screened or made by the methods described in US Pat. No. 5,631,147, which is incorporated herein by reference in its entirety. The strand displacement activity can be further enhanced by the presence of a strand displacement promoter as described below.
[0092]
Alternatively, in certain embodiments, a DNA polymerase without strand displacement activity may be used. Such DNA polymerases include exo−Vent, Taq, Klenow fragment of DNA polymerase I, T5 DNA polymerase and Phi29 DNA polymerase. In certain embodiments, the use of these DNA polymerases requires the presence of a strand displacement promoter. A "strand displacement promoter" is any compound or composition that promotes DNA polymerase-catalyzed strand displacement during nucleic acid extension from the 3 'end at a nicking site. Examples of exemplary strand displacement promoters useful in the present invention include, but are not limited to, the BMRF1 polymerase accessory subunit (Tsurumi et al., J. Virology 67: 7648-53, 1993), Adenovirus DNA binding protein (Zijderveld and van der Vliet, J. Virology 68: 1158-64, 1994), herpes simplex virus protein ICP8 (Boehmer and Lehman, J. Virology 67: 711-5, 1993; Skaliter and Lehman). Natl.Acad.Sci.USA 91: 10665-9, 1994), single-stranded DNA binding proteins (Rigler and Romano, J. et al. Biol. Chem. 270: 8910-9, 1995), phage T4 gene 32 protein (Villemain and Giedroc, Biochemistry 35: 14395-4404, 1996), bovine thymic helicase (Siegel et al., J. Biol. Chem. 267: 13629-). 35, 1992) and trehalose. In one embodiment, trehalose is present in the amplification reaction mixture.
[0093]
Additional exemplary DNA polymerases useful in the present invention include, but are not limited to: phage M2 DNA polymerase (Matsumoto et al., Gene 84: 247, 1989), phage PhiPRD1 DNA polymerase (Jung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8287, 1987), T5 DNA polymerase (Chatterjee et al., Gene 97: 13-19, 1991), Sequenase (U.S. Biochemicals), PRD1 DNA polymerase (Zhu and Ito, Biochim. Biophys. Acta. 1219: 267-76, 1994), 9 ° N.m TMDNA polymerase (New England Biolabs) (Southworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 5281-5, 1996; Rodriquez et al., J. Mol. Biol. 302: 447-62, 2000) and T4 DNA polymerase holoenzyme. (Kaboard and Benkovic, Curr. Biol. 5: 149-57, 1995).
[0094]
Alternatively, a DNA polymerase having 5 'to 3' exonuclease activity can be used. For example, such DNA polymerases may be useful for amplifying short nucleic acid fragments that automatically dissociate from template nucleic acids after nicking.
[0095]
In certain embodiments where the nicking agent nicks the DNA strand of an RNA-DNA duplex, an RNA-dependent DNA polymerase may be used. In other embodiments where the nicking agent nicks the RNA strand of an RNA-DNA duplex, a DNA-dependent DNA polymerase (eg, avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (Promega)) that extends from a DNA primer is used. Can be used. In both cases, the target mRNA need not be reverse transcribed into cDNA, and can be mixed directly with a template nucleic acid molecule that is at least substantially complementary to the target mRNA.
[0096]
(C. Reaction conditions)
The exponential nucleic acid amplification method of the present invention links two or more nucleic acid amplification reactions, each using a nicking reaction and a primer extension reaction in achieving amplification. According to the method of the present invention, in each amplification reaction, the DNA polymerase may be mixed with the nucleic acid molecule (eg, template nucleic acid molecule) before, after, or simultaneously with the mixing of the NA with the template nucleic acid. . Preferably, the nicking-extension reaction buffer is optimized to be appropriate for both NA and DNA polymerase. For example, N. BstNB I is NA and exo−If Vent is a DNA polymerase, the nicking-extension buffer is 0.5 × N. It may be BstNB I buffer and 1 × DNA polymerase buffer. Exemplary 1 × N. BstNB I buffer is 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 150 mM KCl, and 1 mM dithiothreitol (pH 7.5 at 25 ° C.). An exemplary 1 × DNA polymerase buffer is 10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM (NH4)2SO4, 2mM MgSO4, And 0.1% Triton X-100. One skilled in the art can readily find reaction buffers for NA and DNA polymerase.
[0097]
Further, in certain embodiments, where the DNA polymerase is dissociable (ie, the DNA polymerase is relatively easy to dissociate from the template nucleic acid, such as Vent DNA polymerase), the ratio of NA to DNA polymerase in the reaction mixture may also be Can be optimized for maximum amplification of full-length nucleic acid molecules. As used herein, "full length" nucleic acid molecule refers to an amplified nucleic acid molecule that contains a sequence that is complementary to the 5 'terminal sequence of the template. In other words, a full-length nucleic acid molecule is the amplification product of a complete gene extension reaction. In a reaction mixture in which the amount of NA is in excess with respect to the amount of DNA polymerase, a partial amplification product may be produced. The production of partially amplified products may be due to excessive nicking of partially amplified nucleic acid molecules by NA and subsequent dissociation of these molecules from the template. Such dissociation prevents the partially amplified nucleic acid molecule from further elongation.
[0098]
Since different NAs or different DNA polymerases may have different nicking or primer extension activities, the ratio of a particular NA to a specific dissociable DNA polymerase that is optimal for maximizing the amplification of a full-length nucleic acid molecule will be It varies depending on the identity of NA and DNA polymerase. However, for a given combination of a particular NA and a specific DNA polymerase, the ratio may be determined by performing an exponential nucleic acid amplification reaction in a reaction mixture having a different NA to DNA polymerase ratio, using techniques known in the art. Can be optimized by characterizing the amplification product (eg, by liquid chromatography or mass spectrometry). The ratio that allows the maximum production of full-length nucleic acid molecules can be used in future amplification reactions.
[0099]
Although partial amplification of a nucleic acid molecule can occur between both the first amplification reaction and the second amplification reaction, partial amplification during the first amplification reaction is usually at the level of total nucleic acid amplification or It should be noted that it does not significantly affect speed. The nucleic acid molecules amplified during the first amplification reaction are used as starting amplification primers for the second amplification reaction, so that these nucleic acid molecules are sufficient to specifically anneal to these templates. If long, it is sufficient for these intended uses. Alternatively, except that the optimal ratio of NA to dissociable DNA polymerase is used for full-length nucleic acid amplification, the amplification reaction proceeds for a period of time, allowing each gene extension reaction to proceed to its completion. After allowing, the amount of partial amplification product can be eliminated or reduced by inactivating the NA, but not the DNA polymerase (eg, heat inactivation).
[0100]
In certain preferred embodiments, the nicking reaction and extension reaction of the present invention are performed under isothermal conditions. As used herein, "isothermal" and "isothermal conditions" refer to conditions in which the temperature of the reaction is kept essentially constant during the amplification process (ie, at the same temperature, or The difference between the upper and lower temperature limits is within the same narrow temperature range of 20 ° C. or less). An advantage of the amplification method of the present invention is that there is no need to cycle the temperature between the upper and lower temperature limits. Both the nicking reaction and the extension reaction are performed at the same temperature or within the same narrow temperature range. If the equipment used to maintain the temperature is capable of varying the temperature of the reaction mixture to a lesser extent, such variations are not detrimental to the amplification reaction. Exemplary temperatures for isothermal amplification include any temperature between 50C and 70C, or 50C to 70C, 55C to 70C, 60C to 70C, 65C to 70C, 50C. C. to 55.degree. C., 50.degree. C. to 60.degree. C., or a temperature range between 50.degree. Many NA and DNA polymerases are active at or within the exemplary temperatures described above. For example, N. Nick formation reaction using BstNB I (New England Biolabs) and exo−  Both extension reactions using Bst polymerase (BioRad) can be performed at about 55 ° C. Other polymerases active between about 50 ° C and 70 ° C include exo−  Vent (New England Biolabs), exo−  Deep Vent (New England Biolabs), exo−Pfu (Strategene), exo−Bca (Panvera) and Sequencing Grade Taq (Promega), but are not limited thereto.
[0101]
If a restriction endonuclease is used as the nicking agent, a modified deoxyribonucleoside triphosphate is required to generate a hemimodified restriction endonuclease recognition sequence. Any modified deoxyribonucleoside triphosphate that contributes to inhibiting cleavage of one strand of a double stranded nucleic acid that includes the modified deoxyribonucleoside triphosphate in the restriction endonuclease recognition sequence can be used. Exemplary modified deoxyribonucleoside triphosphates include 2′-deoxycytidine 5′-O- (1-thiotriphosphate) [ie, dCTP (.α.S)], 2′-deoxyguanosine 5′-. O- (1-thiotriphosphate), thymidine-5′-O- (1-thiotriphosphate), 2′-deoxycytidine 5′-O (1-thiotriphosphate), 2′-deoxyuridine Examples include, but are not limited to, 5′-triphosphate, 5-methyldeoxycytidine 5′-triphosphate, and 7-deaza-2′-deoxyguanosine 5′-triphosphate.
[0102]
(D. Starting nucleic acid (N1))
As discussed above, the starting nucleic acid for the first nucleic acid amplification (ie, N1) can be provided by annealing the trigger ODNP with the template nucleic acid molecule T1. Since the trigger ODNP functions as a primer for primer extension using T1 as a template, the trigger ODNP must be substantially complementary to a portion of T1 from which primer extension occurs. 'It also has a terminus.
[0103]
In certain embodiments, the trigger ODNP is from a nucleic acid molecule. The 3 'end of the trigger can be produced by various methods known in the art. For example, the 3 ′ end of a trigger ODNP can be provided by digesting a nucleic acid fragment with a RERS using a restriction endonuclease that recognizes a restriction nuclease recognition sequence (RERS) (eg, a type IIs restriction endonuclease). . The RERS in the nucleic acid fragment may be naturally occurring or may be incorporated into the fragment by using a primer comprising one strand of the RERS. Alternatively, the 3 'end of the trigger ODNP may be produced by nicking a NARS-bearing nucleic acid fragment with an NA that recognizes NARS. NARS may also be naturally occurring or incorporated into a fragment by using a primer comprising one strand of NARS. In addition, the 3 'end of the trigger ODNP can be modified by oligonucleotide-directed cleavage according to Szybalski (U.S. Patent No. 4,935,357) or by Maxam-Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-4, 1977). In certain embodiments, the 3 'end of the trigger ODNP can be made by cleaving the nucleic acid molecule with DNase I or other non-specific nucleases, or by shearing the nucleic acid molecule. In situations where the cleavage product is a double-stranded nucleic acid, a trigger ODNP may be obtained by denaturing the double-stranded nucleic acid.
[0104]
The nucleic acid molecule from which the trigger ODNP is derived may be naturally occurring or synthetic. This nucleic acid molecule may be RNA or DNA, and may be single-stranded or double-stranded. Such nucleic acid molecules include genomic DNA, cDNA or derivatives thereof (eg, randomly primed or specifically primed amplification products). The trigger ODNP itself can be a single-stranded DNA molecule or a single-stranded RNA molecule. The trigger ODNP or the nucleic acid molecule from which the trigger ODNP is derived may or may not be immobilized on a solid support.
[0105]
Similarly, T1 may also be derived from another nucleic acid molecule by enzymatic, chemical or mechanical cleavage. Enzymatic cleavage can be achieved, for example, by digesting the nucleic acid molecule with a restriction endonuclease that recognizes a specific sequence within the nucleic acid molecule. Alternatively, enzymatic cleavage can be achieved by nicking the nucleic acid molecule with a nicking agent that recognizes a specific sequence within the nucleic acid molecule. The enzymatic cleavage can also be an oligonucleotide-directed cleavage according to Szybalski (US Pat. No. 4,935,357). Chemical and mechanical cleavage can be achieved by any method known in the art suitable for cleaving nucleic acid molecules (eg, shearing). In situations where the cleavage product is a double-stranded nucleic acid molecule, a T1 molecule may be obtained by denaturing the double-stranded nucleic acid molecule.
[0106]
As described above, T1 comprises the sequence of one strand of NARS. NARS can be present in nucleic acid molecules from which T1 is derived. Alternatively, the NARS can be incorporated into T1, for example, by using an ODNP that includes the sequence of one strand of NARS.
[0107]
Similar to triggered ONDP, T1 molecules can be derived from various nucleic acid molecules. These nucleic acid molecules include naturally occurring nucleic acids and synthetic nucleic acids, any of which may be double-stranded or single-stranded nucleic acid molecules, and DNA (eg, genomic DNA And cDNA) or RNA.
[0108]
In certain embodiments, the T1 molecule comprises or consists essentially of 3 ′ to 5 ′: a first sequence that is at most 100 nucleotides in length; one strand of a double-stranded nicking agent recognition sequence And a second sequence which is at most 100 nucleotides in length. In some embodiments, a T1 molecule is at most 200, 150, 100, 80, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 18, 16, 14, 12, or 10 nucleotides in length. In certain embodiments, the first sequence, the second sequence, or both, are at most 100, 80, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, It can be 8, 7, 6, 5, or 4 nucleotides in length.
[0109]
Particular implementations in which (1) T1 comprises the sequence of the sense strand of the nicking agent recognition sequence, and (2) the trigger ODNP is complementary to a portion of the T1 molecule adjacent to the sequence of the sense strand of the nicking agent recognition sequence. In embodiments, there may be a mismatch between one or more nucleotides in the sense strand of the nicking agent recognition sequence in T1 and the corresponding nucleotide in the trigger ODNP. In other words, one or more nucleotides in the sense strand of the nicking agent recognition sequence in T1 cannot form a conventional base pair with any nucleotide in the trigger ODNP. Certain nicking agents (eg, N.BstNBI) are capable of nicking a substrate containing only the sense strand of these double-stranded recognition sequences, such that the starting nucleic acid formed by annealing the trigger ODNP to T1 ( N1) can be used as a template for amplifying single-stranded nucleic acid (A1) in the presence of a nicking agent that recognizes the sense strand of the recognition sequence in the T1 molecule. The use of a nicking agent to amplify a single-stranded nucleic acid using a template nucleic acid that includes only the sense strand sequence and does not include the intact antisense strand sequence of the double-stranded nicking agent recognition sequence. A detailed description is provided in the United States patent application entitled "Amplification of Nucleic Acid Fragments Using Nicking Agents."
[0110]
Instead of an embodiment in which the trigger ODNP, T1, or both are derived from a nucleic acid molecule, the invention also includes embodiments in which the trigger ODNP, T1, or both are synthetic nucleic acid molecules. Any method known in the art for oligonucleotide synthesis can be used to synthesize trigger ODNP and / or T1. For example, Trigger ODNP and / or T1 are disclosed in U.S. Patent Nos. 6,166,198, 6,043,353, 6,040,439, and 5,945,524, which are incorporated by reference. (Incorporated herein in its entirety). Briefly, solid phase oligonucleotide synthesis involves the sequential linking of 5 'blocked nucleotides to a nascent oligonucleotide bound to a resin, followed by oxidation and oxidation to form a phosphodiester bond. It can be performed by deblocking. Further, the trigger ODNP and / or T1 can be purchased from companies that synthesize specially ordered oligonucleotides.
[0111]
T1 may, in certain embodiments, be immobilized on a solid support. Preferably, T1 is immobilized by its 5 'end. In other embodiments, T1 may not be immobilized on a solid support.
[0112]
In certain embodiments, the starting nucleic acid molecule of the first amplification reaction (ie, N1) can be provided by other than annealing the trigger ODNP to the template nucleic acid molecule T1. For example, N1 can be a fully or partially double-stranded nucleic acid molecule, including a double-stranded NARS, which NARS is free of any initiating primer extension reaction (eg, step (a) of FIG. 1). First, a nick can be easily formed by NA that recognizes NARS (step (c) in FIG. 1). In such a case, each strand of the N1 molecule comprises the sequence of one strand of NARS. Thus, either strand can be considered a T1 molecule and its complement can be considered a trigger ODNP. The double-stranded N1 molecule can be, for example, a digestion product of a nucleic acid containing NARS. The NARS sequence in N1 may originate from or be derived from another nucleotide sequence, or may be incorporated into N1 by an oligonucleotide primer comprising the sequence of one strand of NARS, or may be incorporated into N1 during chemical synthesis of T1. Can be incorporated.
[0113]
N1 can be a partially double-stranded nucleic acid molecule comprising either double-stranded NARS or only one strand of NARS. For example, N1 may be a nicking product of a nucleic acid molecule containing two NARSs or a nicking digestion product of a nucleic acid molecule containing both NARS and RERS.
[0114]
In certain embodiments, N1 may be immobilized on a solid support. In other embodiments, N1 cannot be immobilized on a solid support.
[0115]
(E. T2 molecule)
Similar to T1, T2 can also be generated by enzymatic, chemical or mechanical cleavage within other nucleic acid molecules, as described above, or by nucleic acid amplification using other nucleic acid molecules as a template. It can be derived from another nucleic acid molecule. Other nucleic acid molecules from which T2 is derived can be naturally occurring nucleic acids or synthetic double-stranded nucleic acids or synthetic single-stranded nucleic acids, DNA (eg, genomic DNA and cDNA) or DNA. In one embodiment, T2 is chemically synthesized.
[0116]
As described above, T2 comprises the sequence of the sense strand of NARS. NARS may be present in the nucleic acid molecule from which T2 is derived. Alternatively, NARS can be incorporated into T2, for example, by using an ODNP comprising the sequence of one strand of NARS.
[0117]
The number of T2 molecules in the amplification reaction mixture is typically greater than the number of T1 molecules. The preference for a greater number of T2 molecules than T1 molecules is due to the fact that T2 molecules are used as an annealing partner for single-stranded nucleic acid molecules (ie, A1) amplified using the T1 molecule as a template. In other words, during the first amplification reaction, each T1 molecule is used as a template to produce multiple copies of A1. Thus, for each T1 molecule, preferably, multiple T2 molecules are present to provide an annealing partner for the multiple A1 molecules amplified using a single T1 molecule as a template.
[0118]
In certain embodiments, the T2 molecule comprises, or consists essentially of, from 3 ′ to 5 ′: a first sequence that is at most 100 nucleotides in length; a double-stranded nicking recognition sequence of the sense strand. A sequence; and a second sequence which is at most 100 nucleotides in length. In some embodiments, a T2 molecule is at most 200, 150, 100, 80, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 18, 16, 14, 12, or 10 nucleotides in length. In certain embodiments, the first arrangement, the second arrangement, or both, are at most 100, 80, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, It can be 8, 7, 6, 5, or 4 nucleotides in length.
[0119]
The T2 molecule can be immobilized on a solid support, preferably at its 5 'end. A linker may be present between the solid phase to which the T2 molecule is attached and the 5 'or 3' end of the primer. Further, multiple T2 molecules can be immobilized on a single solid phase to generate an array of T2 molecules. The plurality of T2 molecules can have the same sequence at discrete locations in the array. Alternatively, they may have different sequences that are at least substantially complementary to the various A1 molecules at discrete locations in the array. Such an array can be used to amplify multiple single-stranded nucleic acid molecules having different sequences. In certain embodiments, amplification reactions performed at different locations on the array are physically separated (eg, in microwells of a plate) such that amplification products at different locations are not mixed with each other, Can be characterized.
[0120]
(2. Nucleic acid, composition or kit for nucleic acid amplification)
In one aspect, the invention provides compositions and kits for exponential amplification of nucleic acids. Such compositions generally comprise a first at least partially double-stranded nucleic acid molecule designed to function in the first or second type of nucleic acid amplification described above ( N1 or H1) and a second at least partially double-stranded nucleic acid molecule (N2 or H2). For example, for a first type of nucleic acid amplification, the composition comprises (1) a nucleic acid molecule (N1) wherein one strand is a first at least partially double-stranded strand comprising the sequence of the antisense strand of the first NARS. Or H1), and (2) a 5 ′ to 3 ′ second nucleic acid (N2 or H2) comprising the following (i) and (ii): (i) the sequence of the sense strand of the second NARS And (ii) a sequence that is at least substantially identical to a sequence located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NARS in the first nucleic acid molecule. For the second type of nucleic acid amplification, the composition comprises (1) a nucleic acid molecule (N1 or H1) in which one strand is first at least partially double-stranded comprising the sequence of the sense strand of the first NARS. And (2) one strand may comprise a second at least partially double-stranded nucleic acid molecule (N2 or H2) comprising from 5 ′ to 3 ′ the following (i) and (ii): (I) at least substantially complementary to the sequence of the sense strand of the second NARS, and (ii) the sequence located 3 'to the sequence of the sense strand of the first NARS in the first nucleic acid molecule. An array. In certain embodiments, for both types of nucleic acid amplification, the first NARS is the same as the second NARS.
[0121]
A kit of the invention may include one of the compositions described above. Alternatively, the kit may include a combination of single-stranded nucleic acid molecules T1 and T2 designed to function in either the first type of nucleic acid amplification or the second type of nucleic acid amplification described above. For example, for a first type of nucleic acid amplification, the composition comprises a T1 comprising the sequence of the antisense strand of the first NARS, and from 5 ′ to 3 ′: (i) the sense strand of the second NARS And (ii) a sequence at least substantially identical to a sequence located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NARS in T1. For a second type of nucleic acid amplification, the composition comprises a T1 comprising the sequence of the sense strand of the first NARS, and from 5 ′ to 3 ′ the following: (i) the sequence of the sense strand of the second NARS, And (ii) a sequence that is at least substantially complementary to a sequence located 3 'to the sequence of the sense strand of the first NARS in the first nucleic acid molecule. In certain embodiments, for both types of nucleic acid amplification, the first NARS is the same as the second NARS.
[0122]
In addition to the nucleic acid molecules described above, a kit (or composition) of the invention may further comprise at least one, two, several, or each of the following components: (1) NARS in T1 (2) a nick that recognizes NARS (the sequence of one of the strands is present in T1, T2, or both). (3) buffer for nick-forming agent (2); (4) DNA polymerase useful for primer extension; (5) buffer for DNA polymerase (4); (6) ) Deoxynucleoside triphosphates; (7) modified deoxynucleoside triphosphates; (8) control T1, T2 and / or trigger ODNPs; and (9) chain displacement promoters (eg, Reharosu). A detailed description of many of the above components is provided above.
[0123]
In certain embodiments, the compositions of the present invention do not include a buffer specific for NA or a buffer specific for DNA polymerase. Alternatively, the compositions of the present invention include a buffer appropriate for both the nicking agent and the DNA polymerase. For example, N. BstNB I is a nicking agent and exo−If Vent is a DNA polymerase, the nicking-extension buffer is 0.5 × N. BstNB I buffer and 1 × exo−Vent buffer.
[0124]
The compositions of the present invention can be produced by simply mixing the components or by performing a reaction that results in the formation of the composition. Kits of the invention can be prepared by mixing some of their components, or store each of them in individual containers.
[0125]
(B. Diagnostic use of nucleic acid amplification method and composition)
As described in detail herein above, the present invention provides methods and compositions for exponential amplification of nucleic acids. These methods and compositions may find utility in a wide variety of applications, where it is preferred to rapidly amplify nucleic acid molecules. Such rapid amplification may be particularly suitable in diagnostic applications, for example, when rapidly detecting the presence of a pathogen (eg, a bacterium, virus, fungus, parasite) in a biological sample. . The following sections describe various exemplary embodiments that are specifically applicable to diagnostic applications.
[0126]
(1. Overview)
The invention is useful for detecting a target nucleic acid molecule in a biological sample. The target nucleic acid includes a nucleic acid molecule derived from or derived from a pathogenic organism. Depending on the presence or absence of the target nucleic acid in the sample, the amplification product may or may not be detected in an amplification system designed to use the target nucleic acid or a portion thereof as a template. The target nucleic acid or portion thereof is first incorporated into a starting nucleic acid molecule (N1) to be used as a template in a first amplification reaction. The starting nucleic acid molecule also includes at least one strand of the first NARS, and thus elicits a first amplification reaction in the presence of a DNA polymerase and an NA that recognizes the first NARS. The product (A1) from the first amplification reaction then anneals to another template nucleic acid molecule (T2). T2 contains the sequence of the sense strand of the second NARS and thus initiates the second amplification reaction in the presence of DNA polymerase and NA that recognizes the second NARS. A determination of the presence or absence of the product of the first amplification reaction (A1) and / or the product of the second amplification reaction (A2) indicates the presence or absence of the target nucleic acid in the biological sample.
[0127]
(2. Starting nucleic acid molecule (N1))
Starting nucleic acid molecules useful for diagnostic applications can be provided by various approaches. For example, N1 can be obtained by annealing a trigger ODNP to a T1 molecule, where the trigger ODNP is derived from a nucleic acid molecule originating from a pathogenic organism (eg, FIGS. 5-7 and FIG. 13). Alternatively, N1 may be directly derived from a double-stranded nucleic acid molecule from a pathogenic organism (eg, FIG. 8). N1 can also be prepared by using an appropriate pair of oligonucleotide primers (eg, FIGS. 9-11). In certain embodiments, N1 can be a partially double-stranded nucleic acid molecule having an overhang capable of hybridizing to a target nucleic acid (eg, FIG. 12). These and other modalities for providing N1 in connection with diagnostic applications are described below.
[0128]
(A. First Type of Exemplary Method for Providing N1 Molecules)
In certain embodiments of the invention in which N1 is provided by annealing the trigger ODNP to a T1 molecule, the trigger ODNP is a DNA molecule (eg, a genomic DNA molecule) or an RNA molecule (eg, an mRNA molecule) of a pathogenic organism. From any of the following. If the nucleic acid molecule from the pathogenic organism is single-stranded, it can be used directly as a trigger ODNP. Alternatively, single-stranded nucleic acid molecules can be cleaved to produce shorter fragments, where one or more of these fragments can be used as a trigger ODNP. If the nucleic acid molecule from the pathogenic organism is double-stranded, it may be denatured and used directly as a trigger ODNP, or the denatured product may be cleaved to provide multiple shorter fragments Where one or more of these fragments can function as a trigger ODNP. Alternatively, it can be first cleaved to obtain a plurality of shorter double-stranded fragments, and then these shorter fragments are denatured to provide one or more trigger ODNPs.
[0129]
As noted above, the T1 molecule must be at least substantially complementary to the trigger ODNP. Further, the number of T1 molecules in the amplification reaction mixture is preferably determined by the number of trigger ODNPs in order to effectively compete with the complementary strand of the trigger ODNP from the double-stranded nucleic acid molecule for annealing to the trigger ODNP. is more than.
[0130]
An example of a first type of method for preparing the N1 molecule is shown in FIG. As shown in this figure, double-stranded genomic DNA can be first cleaved by restriction endonucleases. The digestion product can be denatured and one strand of one of the digestion products can be used as a trigger ODNP to initiate a nucleic acid amplification reaction.
[0131]
(B. A second type of exemplary method for providing an N1 molecule)
In certain embodiments of the invention in which N1 is provided by annealing the trigger ODNP to a T1 molecule, the trigger ODNP comprises the sequence of the sense strand of NARS. Trigger ODNPs can be derived from target nucleic acids (eg, genomic nucleic acids) that originate from pathogenic organisms. A particular embodiment in which N1 comprises NERS recognizable by a nicking endonuclease that nicks outside its recognition sequence (eg, N.BstNB I) is illustrated in FIG. As illustrated by this figure, genomic DNA containing NERS or a fragment thereof is denatured, and one strand of genomic DNA or a fragment of that strand anneals to the T1 molecule. This T1 molecule is part of the other strand of genomic DNA, including the sequence of the antisense strand of NERS. Annealing of the trigger ODNP to the T1 molecule provides the starting nucleic acid molecule N1 for the amplification reaction. The number of T1 molecules in the amplification reaction mixture is preferably greater than the number of strands of genomic DNA or a fragment thereof comprising the sequence of the sense strand of NERS.
[0132]
The genomic DNA described above may, in certain embodiments, be immobilized on a solid support. In other embodiments, the T1 molecule can be immobilized on a solid support.
[0133]
In a related embodiment, wherein the trigger ODNP is derived from the target nucleic acid and comprises the sequence of the sense strand of NARS, the T1 molecule has its 3 ′ portion (ie, region X and region Y) (ie, its 5 ′ portion ( Ie, not in region Z)), but may be at least substantially complementary to trigger ODNP (FIG. 7). The 3 'portion of T1 contains the sequence of the antisense strand of NARS, such that the starting nucleic acid formed by annealing T1 to the trigger ODNP contains double-stranded NARS. In the presence of NA that recognizes NARS, the N1 molecule is nicked. The 3 'end of the nicking site is then extended using the region 5' of the sequence of the antisense strand of NARS in the T1 molecule as a template. The resulting amplification product is a single-stranded nucleic acid molecule that is not part of the trigger ODNP, but is complementary to the T1 region (ie, region Z1) located 5 ′ to the sequence of the NARS antisense strand. .
[0134]
(C. A third type of exemplary method for providing an N1 molecule)
In certain embodiments of the invention, N1 is a double-stranded nucleic acid directly derived from a genomic nucleic acid that contains both NARS and RERS. An embodiment using NERS recognizable by a nicking endonuclease (eg, N.BstNB I) that nicks outside its recognition sequence as an exemplary NARS is illustrated in FIG. As shown in this figure, genomic DNA containing NERS and RERS can be digested by restriction endonucleases that recognize RERS. A digest containing NERS may function as a starting nucleic acid molecule (N1).
[0135]
D. A fourth type of exemplary method for providing an N1 molecule
In certain embodiments of the invention, starting nucleic acid molecule N1 is a fully or partially double-stranded nucleic acid molecule produced using various ODNP pairs. Methods for preparing N1 molecules using ODNP pairs are described below in connection with FIGS.
[0136]
In one embodiment, the precursor of N1 comprises a double-stranded NARS and a double-stranded RERS. The NARS and RERS are incorporated into the precursor using an ODNP pair. Examples of NERS recognizable by NEs that nick outside of its recognition sequence (eg, N.BstNB I) as exemplary NARS, and implementations using type IIs restriction endonuclease recognition sequence (TRERS) as exemplary RERS The configuration is illustrated in FIG. As shown in this figure, the first ODNP contains the sequence of one strand of NERS, while the second ODNP contains the sequence of one strand of TRERS. When these two ODNPs are used as primers to amplify a portion of the target nucleic acid, the resulting amplification product (ie, the precursor of N1) contains both double stranded NERS and double stranded TRERS . In the presence of a TRERS-recognizing type IIs restriction endonuclease, this amplification product is digested to produce a nucleic acid molecule N1 containing double-stranded NERS.
[0137]
In another embodiment, the precursor of N1 comprises two double-stranded NARS. These two NARSs are incorporated into the precursor of N1 using two ODNPs. An embodiment using NERS recognizable by a nicking endonuclease that nicks outside its recognition sequence as an exemplary NARS is illustrated in FIG. 10a. As shown in this figure, both ODNPs contain the sequence of the sense strand of NERS. If these two ODNPs are used as primers to amplify a portion of the target nucleic acid, the resulting amplification product will contain two NERS. These two NERSs may or may not be identical to each other, but preferably they are identical. In the presence of NE (s) recognizing NERS, this amplification product is transformed twice (once in each strand) to produce two nucleic acid molecules (N1a and N1b) each containing double-stranded NERS. A nick is formed.
[0138]
In yet another embodiment, the precursor of N1 comprises two semi-modified RERS. These two semi-modified RERS are incorporated into this precursor by using two ODNPs. This embodiment is illustrated in FIG. As shown in this figure, both the first ODNP and the second ODNP comprise the sequence of one strand of RERS. When these two ODNPs are used as primers to amplify a portion of a target nucleic acid in the presence of a modified deoxyribonucleoside triphosphate, the resulting amplification product contains two semi-modified RERS. These two RERS may or may not be identical to each other. In the presence of the RE (s) that recognize the hemi-modified RERS, the amplification product described above will contain two partially double-stranded nucleic acid molecules (N1a and Nicked to produce N1b).
[0139]
The first ODNP, the second ODNP, or both, as described above, may be fixed to a solid support in certain embodiments. In another embodiment, the nucleic acid molecules of the sample containing the target nucleic acid are immobilized.
[0140]
(E. A fifth type of exemplary method for providing an N1 molecule)
In another embodiment of the invention, the starting nucleic acid molecule N1 is a partially double-stranded nucleic acid molecule having an overhang at least substantially complementary to the NARS and the target nucleic acid. An exemplary embodiment where N1 has NERS recognizable by a nicking endonuclease that nicks outside its recognition sequence as an exemplary NARS is illustrated in FIG. As shown in this figure, the N1 molecule may include a 5 'overhang in the chain that either contains NS or forms NS upon extension. Alternatively, the N1 molecule may include a 3 'overhang in the strand that does not contain NS and that does not form NS upon extension. The overhang of the N1 molecule must be at least substantially complementary to the target nucleic acid molecule, such that the overhang of the N1 molecule can anneal to the target nucleic acid molecule. Annealing of N1 to the target nucleic acid involves isolating the complex formed between the target nucleic acid and the N1 molecule ("target-N1 complex") when the target nucleic acid is present in the biological sample of interest. Enable.
[0141]
For example, nucleic acid molecules in a biological sample can be immobilized on a solid support, as shown in FIG. Such fixation can be performed by any method known in the art, including, but not limited to, the use of fixatives or tissue printing. An N1 molecule having an overhang that is substantially complementary to the particular target nucleic acid molecule is then applied to the sample. If the target nucleic acid is present in the sample, N1 will hybridize to the target nucleic acid via its overhang. Subsequently, the sample is washed to remove any unhybridized N1 molecules. The single-stranded nucleic acid molecule A1 is amplified in the presence of a DNA polymerase and a nicking endonuclease that recognizes NERS in N1. In the further presence of a suitable T2 molecule, another single-stranded nucleic acid molecule A2 is amplified. However, if the target nucleic acid is not present in the sample, N1 will not be able to hybridize to any nucleic acid molecules in the sample and will therefore be washed out of the sample. Thus, the washed biological sample can be used to detect the nucleic acid amplification reaction mixture (ie, all components necessary for single-stranded nucleic acid amplification using a portion of N1 as a template (eg, NERS in the N1 molecule). When incubated with a mixture comprising NE and DNA polymerase), any single-stranded nucleic acid molecule complementary to said portion of N1 is not amplified.
[0142]
In addition to immobilizing the target nucleic acid molecule, the target-N1 complex first hybridizes the N1 molecule to a target nucleic acid molecule in a biological sample, and then singulates the complex with a functional group attached to the target nucleic acid. Upon release, it can be purified. For example, the target nucleic acid can be labeled with a biotin molecule, followed by the target-N1 complex via the biotin molecule bound to the target (as with the immobilized streptavidin to precipitate the complex). It can be purified.
[0143]
In certain related embodiments, N1 is formed by hybridizing an immobilized target nucleic acid from a biological sample with a single-stranded T1 molecule. One example of these embodiments is that the target nucleic acid is not immobilized, but the T1 molecule is immobilized on a solid support via its 5 'end. If the target nucleic acid is present in the sample, hybridization of the sample nucleic acid with T1 allows the target to remain bound to the solid support when the solid support is washed. . In the presence of a nicking agent recognizing the nicking agent recognition sequence (this antisense sequence is present in T1) and a DNA polymerase, the single-stranded nucleic acid molecule is replaced with the sequence of the antisense strand of the T1 recognition sequence. Amplification is performed using the sequence located on the 5 'side as the template. If the target is not present in the sample, the nucleic acids of the sample are washed away from the T1-bound solid support. Thus, single-stranded nucleic acid molecules are not amplified using a portion of T1 as a template.
[0144]
Another example of the above embodiment using a NARS recognizable by a nicking agent that nicks the NARS outside is illustrated in FIG. As shown in this figure, the nucleic acid of the biological sample is immobilized via its 5 'end. The resulting immobilized nucleic acid is then converted to a T1 molecule (3 ′ → 5 ′, a sequence at least substantially complementary to a target nucleic acid suspected of being present in a biological sample, and NARS (Including the sequence of the antisense strand). If the target nucleic acid is present in the biological sample, the T1 molecule will hybridize to the target nucleic acid to form an N1 molecule. The N1 molecule is separated from the non-hybridized T1 molecule by washing the solid phase to which the target nucleic acid is bound. In the presence of DNA polymerase and a nicking agent that recognizes NARS, N1 is used as a template to amplify the single-stranded nucleic acid molecule A1. However, if the target nucleic acid is not present in the sample, T1 will not be able to hybridize to any target nucleic acid in the sample and will therefore be washed away from the solid support. As a result, N1 bound to the solid support cannot be formed, and single-stranded nucleic acid molecules complementary to a portion of N1 cannot be amplified.
[0145]
Another example of the above embodiment using a NARS recognizable by a nicking agent that nicks the NARS outside is illustrated in FIG. As shown in this figure, the T1 molecule is anchored via its 5 'end to a solid support. The T1 molecule comprises the sequence of the sense strand of NARS, 5'-3 ', and a sequence substantially complementary to the 3' portion of the target nucleic acid. The T1 molecule is mixed with nucleic acids from a biological sample. If the target nucleic acid is present in the sample, the T1 molecule will hybridize to the target to form a template molecule. When washing the solid support to which the T1 molecule is attached, the target remains bound to the solid support due to its hybridization with the T1 molecule. In the presence of a DNA polymerase, the target is extended from its 3 'end using the T1 molecule as a template. The duplex formed between the target extension product and the T1 molecule extension product contains a double-stranded NARS. In the presence of a nicking agent that recognizes NARS and a DNA polymerase, a single-stranded nucleic acid molecule is amplified by using a portion of the target nucleic acid as a template. However, if the target nucleic acid is not present in the sample, the T1 molecule will not be able to hybridize to the target. Thus, single-stranded nucleic acid molecules are not amplified by using the target as a template.
[0146]
Another example of the above embodiment is illustrated in FIG. In this example, the immobilized T1 molecule is substantially complementary to the target nucleic acid, but is not necessarily complementary to the 3 'portion of the target. T1 also contains the sequence of the sense strand of the nicking agent recognition sequence. If the target is present in a biological sample, the T1 molecule can hybridize to the target when the T1 molecule is mixed with the nucleic acids in the sample. If the T1-bound solid support is washed, the target will remain bound to the solid support due to its hybridization with the T1 molecule. In the presence of a DNA polymerase and a nicking agent that recognizes NARS, one or more nucleotides in the sequence of the sense strand of NARS may be identified even if they do not form conventional base pairs with the nucleotides in the target. Under the circumstances, single-stranded nucleic acids can be amplified by using a portion of the target as a template. A detailed description of the situation in which a single-stranded nucleic acid is amplified when the template nucleic acid does not contain a double-stranded NARS is described in the U.S. application entitled "Amplification of Nucleic Acid Fragments Using Nicking Agents". Provided. However, if the target nucleic acid is not present in the sample, the probe will not be able to hybridize to the target. Thus, single-stranded nucleic acid molecules are not amplified by using the target as a template.
[0147]
(3. Specificity)
The methods of the invention can be used to detect the presence or absence of a particular pathogenic organism in a sample, as well as to detect the presence of some closely related pathogenic organisms. For example, with respect to the first and second types of the exemplary methods described above, the portion of the trigger ODNP to which the T1 molecule anneals is a target nucleic acid or a target nucleic acid specific for the particular pathogenic organism to be detected. It can be derived in part. Alternatively, a portion of such a trigger ODNP is substantially or completely conserved among several closely related pathogenic organisms, but is absent from other more distant or unrelated pathogenic organisms It can be derived from a target nucleic acid or a portion thereof.
[0148]
A target nucleic acid or portion thereof that is “specific” for a particular pathogenic organism is present in that particular organism, but is not present in all other organisms, including those closely related to that particular organism Refers to a target nucleic acid having a sequence or a portion thereof. In addition, a region in a target nucleic acid that is "substantially conserved" among several closely related pathogenic organisms is, under appropriate conditions, the correspondence in each of several closely related organisms A region in a target nucleic acid in which there is a nucleic acid molecule that is capable of hybridizing to a region, but cannot hybridize under similar conditions to a similar region in a target nucleic acid from a more distant or unrelated organism. Also, a region in a target nucleic acid that is “fully conserved” between several closely related organisms is a sequence that is identical in target nucleic acid from each of several closely related pathogenic organisms. Area.
[0149]
Similarly, with respect to the fourth type of exemplary method described above, the portion of the target nucleic acid that is amplified using the primer pair may be a region that is specific for a particular pathogenic organism, or some closely related region. May be substantially or completely conserved among pathogenic organisms associated with, but not present in, other remote or unrelated pathogenic organisms. In addition, the amplified portion of the target nucleic acid can be the variable region of the target nucleic acid among several closely related pathogenic organisms. As used herein, a "variable" region of a target nucleic acid refers to a target nucleic acid having less than 50% sequence identity between target nucleic acids from closely related organisms, but from the same closely related organism. Are regions surrounded at each end by regions having a sequence identity higher than 80% among target nucleic acids. As used herein, the percent sequence identity of two nucleic acids is determined using the BLAST program of Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990) with their default parameters. Is determined. These programs were modified as in Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7, 1993), Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-). 8, 1990). The BLAST program is available, for example, on a website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
[0150]
Similarly, with respect to the fifth type of exemplary method described above, the overhang of N1 may be a region in the target nucleic acid that is specific for the pathogenic organism, or a substantial region between several closely related pathogenic organisms. May be at least substantially complementary to a region in the target nucleic acid that is fully or completely conserved. The overhang is completely complementary to a target nucleic acid or a portion thereof from a particular organism, but is also substantially complementary to one or more closely related target nucleic acids or a portion thereof from an organism. If so, the stringency of hybridization can be varied, either to detect the presence of a particular organism, or to detect the presence of any one of the closely related organisms. For example, if the N1 molecule is hybridized under highly stringent conditions to a nucleic acid from a biological sample, after removing the unhybridized N1 molecule using a portion of the N1 molecule as a template, Performing nucleic acid amplification can indicate the presence of a particular organism in the biological sample. On the other hand, if the N1 molecule is hybridized under moderate or low stringency conditions to a nucleic acid from a biological sample, nucleic acid amplification (N1 unhybridized using a portion of the N1 molecule as a template). (After removing the molecule) may indicate the presence of a particular organism and / or one or more organisms closely related to the particular organism. Regulation of stringency of hybridization conditions is well known in the art and can be found, for example, in Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2001.
[0151]
In embodiments where the first nucleic acid molecule (N1) is provided by annealing the trigger ODNP to a T1 molecule, the trigger ODNP or a portion thereof, as well as the sequence of one strand of NARS in T1, is located 3 'to the sequence. The portions of the T1 molecules that are obtained are not completely complementary to each other, but may be substantially complementary. For example, the trigger ODNP is derived from a region of the target nucleic acid that is substantially conserved among several closely related pathogenic organisms, and the presence of any of several organisms is detected If necessary, a T1 molecule that is substantially complementary to the trigger ODNP can be used. In such a situation, the extension reaction of the primer is such that it does not prevent the trigger ODNP from annealing to the T1 molecule, or prevents the trigger ODNP from being extended using a portion of the T1 molecule as a template. It must be performed under conditions that are not high stringency. However, such conditions also need to be sufficiently stringent to prevent the T1 molecule from non-specifically annealing to nucleic acid molecules other than the trigger ODNP. Suitable conditions for nucleic acid amplification in which the trigger ODNP or a portion thereof is substantially complementary to a portion of a T1 molecule can be elucidated by adjusting the reaction temperature and / or the composition or concentration of the reaction buffer. . Generally, as in the hybridization reaction, increasing the reaction temperature increases the stringency of the amplification reaction.
[0152]
(4. A1 molecule)
As described above, the A1 molecule is amplified using a portion of N1 as a template. In certain embodiments, A1 can be relatively short and have a maximum of 25 nucleotides, a maximum of 20 nucleotides, a maximum of 17 nucleotides, a maximum of 15 nucleotides, a maximum of 10 nucleotides, or a maximum of 8 nucleotides. . Such short lengths can be achieved by appropriately designing the T1 molecule or ODNP used in the generation of the N1 molecule. For example, for the third type providing the N1 molecule (FIG. 6), T1 can be designed to have a short region 5 'to the sequence of the antisense strand of NARS. For the fourth type that provides the N1 molecule (FIGS. 9-11), the ODNP pairs can be designed to be in close proximity to each other when the primer anneals to the target nucleic acid. It may be beneficial for the Al molecule to be short in length. This is because doing so increases the efficiency and speed of amplification. In addition, this allows the use of DNA polymerases without strand displacement activity. This may also include, via specific techniques such as mass spectrometry analysis, the A1 molecule and / or the product (A2) of the subsequent amplification reaction (where A1 is used as the first amplification primer). Makes detection easier.
[0153]
(5. T2 molecule)
The T2 molecule of the present invention is located on the 3 ′ side of the sequence of the sense strand of NARS and the sense strand of NARS, and is amplified using a part of the initial nucleic acid molecule N1 as a template. A sequence that is at least substantially complementary to the strand nucleic acid molecule (A1). Preferably, the T2 molecule comprises a sequence that is completely complementary to the A1 molecule.
[0154]
Also as discussed above, in the fourth type of exemplary method above, the portion of the target nucleic acid that is amplified using the primer pair is a region that is specific for a particular pathogenic organism, Or it may be a region that is substantially or completely conserved between some closely related pathogenic organisms, but is not present in other distant or unrelated pathogenic organisms. In addition, the amplified portion of the target nucleic acid can be the variable region of the target nucleic acid among several closely related pathogenic organisms. If the amplification region is substantially conserved, the T2 contains a sequence located 3 'to the sequence of the antisense strand of NARS and which is identical to one strand of the amplification region from a particular organism. The molecules are used to amplify under highly stringent conditions (eg, at relatively high amplification temperatures to prevent A1 molecules from organisms other than a particular organism from hybridizing to T2 molecules). By performing the reaction, the presence of a particular organism can be detected. Alternatively, under moderate or low stringency conditions (eg, allowing an A1 molecule from an organism closely related to a particular organism to hybridize to a T2 molecule, and using a portion of the T2 molecule as a template By carrying out the amplification reaction at a relatively low amplification temperature (e.g., a relatively low amplification temperature) to allow the presence of a particular organism, as well as one that is closely related to the particular organism. The same T2 molecule can be used to detect the presence of one or more organisms.
[0155]
Further, in embodiments where the amplification region is a variable region between closely related organisms, the T2 molecule is amplified using an N1 molecule from a particular organism among the above closely related organisms. May comprise a sequence that is at least substantially complementary to an A1 molecule. Amplification of a single-stranded nucleic acid molecule using a portion of this T2 molecule as a template indicates the presence of a particular organism in a biological sample.
[0156]
In certain embodiments, no additional T2 molecules are required for the second amplification reaction. In these embodiments, the second ODNP used in generating the N1 molecule has a sequence at the 3 'end that allows the second ODNP to anneal to A1. This second ODNP also contains the sequence of the sense strand of NARS. Therefore, double-stranded NARS is created by extension of A1 using the second ODNP as a template. In the presence of DNA polymerase and NA that recognizes NARS, the single-stranded nucleic acid (A2) is amplified using A1 as a template. An example of the above embodiment is illustrated in FIG. In this FIG. 10b, A1a and A1b are amplified in a first amplification reaction using two ODNPs each containing the sequence of the sense strand of NERS (FIG. 10a).
[0157]
The T2 molecule, in certain embodiments, may be immobilized on a solid support, preferably at its 5 'end. In other embodiments, the T2 molecule may not be immobilized.
[0158]
(6. Detection and / or characterization of amplified single-stranded nucleic acid)
The presence of a target nucleic acid from a pathogenic organism can be detected by detecting and / or characterizing the amplification product (eg, A1, A2, etc.). Any suitable method for detecting or characterizing a single-stranded nucleic acid molecule can be used. For example, the amplification reaction can be performed in the presence of a labeled deoxyribonucleoside triphosphate, such that the label is incorporated into the amplified nucleic acid molecule. Labels suitable for incorporation into nucleic acid fragments, and methods for subsequent detection of the fragment are known in the art, and exemplary labels include radioactive labels (eg,32P,33P,125I or35S), an enzyme capable of producing a colored reaction product (eg, alkaline phosphatase), a fluorescent label (eg, fluorescein isothiocyanate (FITC)), biotin, avidin, digoxigenin, an antigen, a hapten, or a fluorescent dye. It is not limited to.
[0159]
Alternatively, the amplified nucleic acid molecule can be detected by the use of a labeled detector oligonucleotide that is substantially (preferably completely) complementary to the amplified nucleic acid molecule. Like labeled deoxynucleoside triphosphates, detector oligonucleotides can also be labeled, such as with radioactive, chemiluminescent, or fluorescent tags, including tags suitable for detection using fluorescence polarization or fluorescence resonance energy transport. Can be done. Spargo et al., Mol. Cell. Probes 7: 395-404, 1993; Hellyer et al. Infectious Diseases 173: 934-41, 1996; Walker et al., Nucl. Acids Res. 24: 348-53, 1996; Walker et al., Clin. Chem. 42: 9-13, 1996; Spears et al., Anal. Biochem. 247: 130-7, 1997; Mehrpoyan et al., Mol. Cell. Probes 11: 337-47, 1997; and Nadeau et al., Anal. Biochem. 276: 177-87, 1999.
[0160]
In certain embodiments, the amplified nucleic acid molecule can be further characterized. This characterization may confirm the identity of these nucleic acid molecules, thereby confirming the presence of the pathogenic organism's target nucleic acid in the biological sample. Such characterization can be performed via any known method suitable for characterizing single-stranded nucleic acid fragments. Exemplary techniques include, but are not limited to, chromatography (eg, liquid chromatography), mass spectrometry, and electrophoresis. Detailed descriptions of various exemplary methods can be found in US Provisional Patent Applications 60 / 305,637 and 60 / 345,445, which are incorporated by reference in their entirety.
[0161]
In addition to detecting and / or characterizing the amplification product to detect the presence of the target nucleic acid in the biological sample, the presence of the target nucleic acid may include the complete or partially duplicated product generated in the amplification reaction. Strands can be detected by detecting nucleic acid molecules (eg, H1, H2 or their nicking products). In a preferred embodiment, the detection of the double-stranded nucleic acid molecule comprises a dye that specifically binds to the double-stranded nucleic acid molecule and becomes fluorescent upon binding to the double-stranded nucleic acid molecule (eg, a fluorescent intercalating agent). ) Is added to the amplification mixture. The addition of a fluorescent intercalating agent allows real-time monitoring of nucleic acid amplification. Alternatively, NE, but not DNA polymerase, can be inactivated (eg, by heat treatment) in the nicking extension reaction mixture to maximize the production of double-stranded nucleic acid molecules (eg, H1 and H2). Inactivation of NE causes all nicked nucleic acid molecules in the reaction mixture to be extended to produce double-stranded nucleic acid molecules.
[0162]
A variety of fluorescent intercalators are known in the art and can be used in the present invention. Illustrative intercalating agents include U.S. Patent Nos. 4,119,521; 5,599,932, 5,658,735; 5,734,058; 5,763,162; Nos. 5,808,077; 6,015,902; 6,255,048 and 6,280,933, Glazer and Rye, Nature 359: 859-61, 1992. Intercalators, PicoGreen dyes and SYBR® dyes such as, for example, SYBR® Gold, SYBR® Green I and SYBR® Green II (Molecular Probes, Eugene WA) But not limited thereto. The fluorescence generated by the fluorescent intercalant can be detected by a variety of detectors, including PMTs, CCD cameras, fluorescent microscopes, fluorescent scanners, and fluorescent microplate readers, fluorescent capillary readers.
[0163]
(7. Compositions and kits useful in diagnosis)
Compositions and kits useful in pathogen diagnosis can be the same as those described above for exponential amplification of nucleic acids. In certain embodiments, these compositions and kits may further include additional components to facilitate detection of the amplification product. For example, the additional component can be a labeled deoxynucleoside triphosphate incorporated into the amplification product. Alternatively, it may be a labeled detection oligonucleotide capable of hybridizing with the amplification product. In certain embodiments, the additional component can be a fluorescent intercalant.
[0164]
(8. Diagnostic use of the present invention)
The present invention is useful in rapidly detecting the presence of any target nucleic acid of interest. In certain embodiments, the target nucleic acid is derived from or derived from a pathogenic organism (eg, an organism that causes an infectious disease). Such pathogenic organisms include those that pose a threat to living organisms (eg, anthrax and smallpox). Further, as described above, the methods of the present invention can be used for detecting the presence of a particular pathogenic organism, and for detecting the presence of some closely related pathogenic organisms. The invention can also be used to detect organisms that are resistant to certain antibiotics. For example, the methods, compositions or kits of the invention can be used for the detection of a particular pathogenic organism in a subject treated with an antibiotic or a particular combination of antibiotics. Further, the use of a fluorescent intercalator to detect nucleic acid amplification in some embodiments provides for real-time detection of a target nucleic acid in a biological sample.
[0165]
(C. Use of nucleic acid amplification method and composition in detecting gene variation)
The methods and compositions for exponential nucleic acid amplification can also be used to detect genetic variations at defined locations in a target nucleic acid. The target nucleic acid containing the gene variation, or a portion thereof, is first incorporated into the first nucleic acid molecule (N1) used as a template in a first amplification reaction. The first nucleic acid molecule also includes at least one strand of the first nicking agent recognition sequence, and thus, in the presence of a DNA polymerase and a nicking agent that recognizes the first nicking agent recognition sequence, the first amplification. Allow the reaction. The product (A1) from the first amplification reaction contains the nucleotide at a defined position in the target nucleic acid or a nucleotide complementary to the above nucleotide. A1 then anneals to another template nucleic acid (T2). T2 contains the sequence of the sense strand of the second NARS, thus enabling a second amplification reaction in the presence of a DNA polymerase and a nicking agent that recognizes the second NARS. Characterization of A1 and / or A2 allows identification of genetic variations in the target nucleic acid.
[0166]
(1. Target nucleic acid)
A target nucleic acid of the invention associated with identifying a genetic variation is any nucleic acid molecule that can contain a genetic variation using a wild-type nucleic acid sequence as a reference. It may or may not be immobilized on a solid support. It can be either single-stranded or double-stranded. The single-stranded target nucleic acid can be one strand of a denatured double-stranded DNA. Alternatively, it may be a single-stranded nucleic acid that is not derived from any double-stranded DNA. In one aspect, the target nucleic acid is DNA, including genomic DNA, ribosomal DNA and cDNA. In another aspect, the target is RNA, including mRNA, rRNA and tRNA.
[0167]
In one aspect, the target nucleic acid is either a naturally occurring nucleic acid or is derived from a naturally occurring nucleic acid. A naturally occurring target nucleic acid is obtained from a biological sample. Preferred biological samples include one or more mammalian tissues, preferably human tissues (eg, blood, plasma / serum, hair, skin, lymph nodes, pancreas, liver, etc.) and / or cells or cell lines. Biological samples can include one or more human tissues and / or human cells. Mammalian and / or human tissues and / or cells may further include one or more tumor tissues and / or tumor cells.
[0168]
Methodologies for isolating a population of nucleic acids from a biological sample are well known to those of skill in the art to which this invention belongs and are readily available. Exemplary techniques are described, for example, in the following laboratory research manuals: Sambrook et al., "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor Press, Third Edition, 2001) and Ausubel et al., "Short Protocols in Molecular Biology (Molecular Biology)". 1999), which is hereby incorporated by reference in its entirety. Nucleic acid isolation kits are also commercially available from a number of companies and can be used to simplify and facilitate the isolation process.
[0169]
The target nucleic acid contains one or more unidentified nucleotides (ie, genetic variations). The present invention provides compositions and methods wherein the identity of the unknown nucleotide is known, thereby identifying the genetic variation. The unidentified base is present at a nucleotide locus (or "defined position" or "defined location") that has the correct position on the target nucleic acid. A specific nucleotide or region comprising 4, 5, 6, 7, or more nucleotides.
[0170]
The term “polymorphism” refers to the determination of two or more genes in a small region (ie, one to several (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8) nucleotides in length) in a population. Refers to the presence of alternative sequences or alleles. Each of the two or more genetically determined alternative sequences or alleles may be referred to as a “gene variation”. Genetic variation may be the most frequently occurring allelic form in the selected population, which may also be referred to as the "wild-type form" or one of the other allelic forms. Diploid organisms can be homozygous or heterozygous for the allelic form.
[0171]
A gene variation may or may not have an effect on gene expression, including expression levels and expression products (ie, encoded peptides). Genetic variations that affect gene expression are also referred to as "mutations," including point mutations, frameshift mutations, regulatory mutations, nonsense mutations, and missense mutations. “Point mutation” refers to a mutation in which a wild-type base (ie, A, C, G, or T) is replaced at a defined nucleotide locus in a nucleic acid sample with one of the other standard bases. Point mutations can be caused by base substitutions or deletions. "Frameshift mutations" are caused by small deletions or insertions, which in turn cause a shift in the open reading frame of the gene, thus forming a new peptide. “Regulatory mutations” are those non-coding regions (eg, introns) (5 ′ or 3 ′ to a coding region that act on precise gene expression (eg, yield, protein localization, timing of expression). (A region located on the side). A "nonsense mutation" is a single nucleotide change in which the triplex codon (where the mutation occurs), which is read as a "stop" codon that causes immature termination of peptide elongation (ie, a shortened peptide) Resulting. A “missense” mutation is a mutation in which one amino acid is exchanged for a different amino acid. Such mutations can cause changes in the folding (three-dimensional structure) of the peptide and / or its proper association with other peptides in the multimeric protein.
[0172]
In one aspect of the invention, the genetic variation is a "single nucleotide polymorphism" (SNP), which is common in any single nucleotide sequence alteration, preferably in a population of organisms, and A single nucleotide sequence alteration that is inherited in a Mendelian fashion. Typically, a SNP is any of the two possible bases, and there is no possibility to find a third nucleotide entity or a fourth nucleotide entity at the SNP site.
[0173]
Genetic variations can be associated with or cause a disease or disorder. As used herein, the term "associated" refers to the presence of a positive correlation between the occurrence of a genetic variation and the presence of a disease or disorder in a host. Such a disease or disorder can be a human genetic disease or disorder, including, but not limited to, cystic fibrosis, bladder cancer, colorectal tumor, sickle cell anemia, thalassemia, al- Anti-trypsin (al-antitrypsin) deficiency, Resh-Nyhan syndrome, cystic fibrosis / mucobicosis, Duchenne / Becker muscular dystrophy, Alzheimer's disease, X chromosome-dependent mental retardation, and Huntington's chorea, phenylketonuria, galactosemia , Wilson disease, hemochromatosis, severe combined immunodeficiency, α-1-antitrypsin deficiency, albinism, alkaptonuria, lysosomal storage disease, Ehrles-Danlo syndrome, hemophilia, glucose-6-phosphate dehydrogenase disorder, Agammaglobulinemia, diabetes insipidus Viscott-Aldrich syndrome, Fabry disease, Fragile X syndrome, familial hypercholesterolemia, polycystic kidney disease, hereditary spherocytosis, Marfan syndrome, von Willebrand disease, neurofibromatosis, tuberous sclerosis Disease, hereditary hemorrhagic telangiectasia, familial colonic polyposis, Ehrles-Danlo syndrome, myotonic dystrophy, osteodystrophy, acute intermittent porphyria, and von Hippel-Lindau disease.
[0174]
The target nucleic acid can be amplified before being incorporated into the first nucleic acid, as described below. Any known method for amplifying nucleic acids can be used. Exemplary methods include, but are not limited to, Qβ replicase, strand displacement amplification (Walker et al., Nucleic Acid Research 20: 1691-6, 1995), transcription-mediated amplification (Kwoh et al., PCT International Patent Application Publication No. WO88 /). 10315), RACE (Frohman, Methods Enzymol. 218: 340-56, 1993), one-sided PCR (Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sc. 86: 5673-7, 1989), and gap-LCR (Abrabaya et al. Nucleic Acids Res. 23: 675-82, 1995). The cited documents and PCT international patent applications are hereby incorporated by reference in their entirety.
[0175]
(2. First nucleic acid molecule (N1))
Initial nucleic acid molecules useful for the detection of genetic variation can be provided by various approaches. For example, N1 can be obtained by annealing a trigger oligonucleotide primer to a T1 molecule, where the trigger primer is derived from the target nucleic acid molecule and surrounds a genetic variation in the target nucleic acid (eg, FIG. 14). Alternatively, N1 can be derived directly from a double-stranded target nucleic acid (eg, by digestion of the target nucleic acid with a restriction endonuclease as shown in FIG. 15). N1 can also be prepared by using an appropriate pair of oligonucleotide primers (eg, FIGS. 16-18). Some exemplary means for providing an initial nucleic acid molecule are described below.
[0176]
(A. A first type of exemplary method for providing an N1 molecule)
As described above, N1 may be provided by annealing a trigger oligonucleotide to a T1 molecule. The trigger primer needs to surround the genetic variation of the target nucleic acid. An exemplary method of this type for providing an N1 molecule is shown in FIG. As shown in this figure, a double-stranded target nucleic acid (eg, genomic DNA) is first cleaved by a restriction endonuclease whose recognition sequence is near a defined location where gene variation is present. The digestion product can be denatured, and then the strand of the digestion product containing potential genetic variations can be used as a trigger oligonucleotide primer to anneal to the template nucleic acid (T1). T1 comprises the sequence of the sense strand of the nicking agent recognition sequence, so that in the presence of the DNA polymerase and the nicking agent recognizing the recognition sequence, a single strand comprising the nucleotide complementary to the genetic variation of the target nucleic acid The nucleic acid fragment (A1) is amplified.
[0177]
(B. A second type of exemplary method for providing an N1 molecule)
In certain embodiments of the invention, N1 is derived directly from a target nucleic acid that includes potential gene variations, nicking agent recognition sequences, and restriction endonuclease recognition sequences. An embodiment using a recognition sequence recognizable by a nicking endonuclease that nicks outside of the nicking endonuclease recognition sequence (eg, N.BstNB I) as an exemplary nicking agent recognition sequence is shown in FIG. It is. As shown in this figure, the target nucleic acid can be digested by a restriction endonuclease that recognizes a sequence in the target nucleic acid. The digestion product containing the nicking endonuclease recognition sequence can serve as a first nucleic acid molecule (N1) for amplifying a single-stranded nucleic acid (A1) fragment. The gene variation ("X") must be between the position corresponding to the nicking site generated by the nicking agent and the restriction endonuclease restriction cleavage site. Such a position allows the amplified fragment (A1) to contain the complement of gene variation ("X").
[0178]
(C. A third type of exemplary method for providing an N1 molecule)
In certain embodiments of the invention, the primary nucleic acid molecule N1 is a completely double-stranded or partially double-stranded nucleic acid molecule produced using various ODNP pairs. The method of using an ODNP pair to prepare the N1 molecule is briefly described below, in conjunction with FIGS. A more detailed description can be found in US Provisional Application Nos. 60 / 305,637 and 60 / 345,445.
[0179]
In certain embodiments, the precursor to N1 comprises a double-stranded nicking agent recognition sequence and a restriction endonuclease recognition sequence. The nicking agent recognition sequence and the restriction endonuclease recognition sequence are incorporated into the precursor using a primer pair. Exemplary nicking agent recognition sequences include a recognition sequence recognizable by a nicking agent (eg, N.BstNB I) that nicks outside of the nicking agent recognition sequence, and an exemplary restriction endonuclease recognition sequence. An embodiment using a type IIs restriction endonuclease recognition sequence (TRERS) is shown in FIG. As shown in this figure, the first primer comprises the sequence of one strand of the nicking agent recognition sequence, while the second ODNP comprises the sequence of one strand of the type IIs restriction endonuclease recognition sequence. Including. When these two ODNPs are used as primers to amplify a portion of a target nucleic acid, the resulting amplification products (ie, precursors to N1) are both double stranded NERS and double stranded TRERS. including. In addition, the first primer is designed to anneal to a portion of one strand of the target nucleic acid located 3 'to the complement of the gene variation, while the second primer is designed to It is designed to anneal to a portion of one strand of the target nucleic acid located 3 'to the variation. Such a design allows a precursor to N1 to surround the gene variation and its complement. In the presence of a TRERS-recognizing type IIs restriction endonuclease, the amplification product is digested to produce a partially double-stranded nucleic acid molecule N1, including double-stranded NERS.
[0180]
In another embodiment, the precursor to N1 comprises two double-stranded nicking agent recognition sequences. Two nicking agent recognition sequences are incorporated into the precursor to N1 using two oligonucleotide primers. An embodiment using a recognition sequence recognizable by a nicking endonuclease that nicks outside the nicking endonuclease recognition sequence as an exemplary nicking agent recognition sequence is shown in FIG. As shown in this figure, both primers contain the sequence of the sense strand of the nicking endonuclease recognition sequence. In addition, the first primer is designed to anneal to a portion of one strand of the target nucleic acid located 3 'to the complement of the gene variation, while the second primer is designed to It is designed to anneal to a portion of one strand of the target nucleic acid located 3 'to the variation. When these two primers are used as primers to amplify a portion of the target nucleic acid, the resulting amplification product (ie, the precursors to N1a and N1b described below) will have the gene variation and its Complement, as well as two nicking endonuclease recognition sequences. These two recognition sequences may or may not be identical to each other, but preferably they are identical. In the presence of a nicking endonuclease or a nicking endonuclease that recognizes a recognition sequence, the amplification product will produce two partially double-stranded nucleic acid molecules each containing one of the double-stranded nicking endonuclease recognition sequences. Nicks twice (once for each strand) to produce (N1a and N1b).
[0181]
Another embodiment that uses a hemimodified restriction endonuclease recognition sequence as an exemplary nicking agent recognition sequence is shown in FIG. As shown in this figure, both the first primer and the second primer contain the sequence of one strand of the restriction endonuclease recognition sequence. In addition, the first primer is designed to anneal to a portion of one strand of the target nucleic acid located 3 'to the complement of the gene variation, while the second primer is designed to It is designed to anneal to a portion of one strand of the target nucleic acid located 3 'to the variation. When these two primers are used as primers to amplify a portion of a target nucleic acid in the presence of a modified deoxynucleoside triphosphate, the resulting amplification product (ie, as described below) Precursors to N1a and N1b) comprise a gene variation and its complement, as well as two semi-modified restriction endonuclease recognition sequences. These two semi-altered recognition sequences may or may not be identical to each other. In the presence of a restriction endonuclease and a restriction endonuclease that recognizes a semi-modified recognition sequence, the amplification product comprises a sequence of at least one strand of one semi-modified restriction endonuclease recognition sequence. Nicked to produce two partially double-stranded nucleic acid molecules (N1a and N1b).
[0182]
The first ODNP, the second ODNP, or both may be immobilized on a solid support in certain embodiments. In another embodiment, the nucleic acid molecules of the sample containing the target nucleic acid are immobilized.
[0183]
(3. A1 molecule)
As described above, the A1 molecule is amplified using a portion of N1 as a template. A portion of this N1 contains the gene variation of the target nucleic acid or its complement, so that A1 contains the complement of the gene variation or the gene variation itself. A1 can be relatively short and has at most 25, 20, 17, 15, 10, 8 nucleotides. Such short lengths can be achieved by appropriately designing the oligonucleotide primers used in making the N1 molecule. For example, for the third type that provides the N1 molecule (FIGS. 16-18), ODNP pairs can be designed to be close together when they anneal to the target nucleic acid. Similar to the diagnostic applications of the present invention described above, shortening the length of the A1 molecule increases amplification efficiency and rate, allows the use of a DNA polymerase without strand displacement activity, // A1 facilitates the detection of the product (A2) of a subsequent amplification reaction used as a first amplification primer, for example, via a specific technique such as mass spectrometry.
[0184]
(4. T2 molecule)
The T2 molecule of the present invention is at least substantially complementary to the sequence of the sense strand of NARS, and to the single-stranded nucleic acid molecule (A1) that is amplified using a portion of the starting nucleic acid molecule N1 as a template. (Located 3 'to the sequence of the sense strand of NARS). Since T2 contains the sequence of the sense strand of its recognition sequence in the presence of a nicking agent and a DNA polymerase that recognizes the nicking agent recognition sequence, A1 is used as a primer for starting nucleic acid extension, Used as a template to amplify another single-stranded nucleic acid fragment (A2). As described above, A1 contains the genetic variation of the target nucleic acid or its complement. Thus, A2 includes the complement of the gene variation or the gene variation itself. Thus, the characterization of A2 allows for the detection and / or identification of genetic variations of the target nucleic acid.
[0185]
As with the diagnostic applications of the present invention, in certain embodiments of the gene variation detection according to the present invention, no additional T2 molecule is required for the second amplification reaction. In these embodiments, the second ODNP used in generating the N1 molecule has a 3 ′ terminal sequence that enables the second ODNP to anneal to A1. I do. This second ODNP also contains the sequence of the sense strand of NARS. Therefore, double-stranded NARS is created by extension of A1 using this second ODNP as a template. In the presence of DNA polymerase and NA that recognizes NARS, single-stranded nucleic acid (A2) is amplified using A1 as a template.
[0186]
In certain embodiments, the T2 molecule may be immobilized on a solid support, preferably via its 5 'end. In other embodiments, the T2 molecule may not be immobilized.
[0187]
(5. Characterization of amplified single-stranded nucleic acid)
Potential genetic variations in the target nucleic acid can be detected or identified by characterizing the amplification products (ie, A1 and A2). Any method suitable for characterizing a single-stranded nucleic acid molecule can be used. Exemplary techniques include, but are not limited to, chromatography (eg, liquid chromatography), mass spectrometry, and electrophoresis. A detailed description of various exemplary methods can be found in US Provisional Patent Application Nos. 60 / 305,637 and 60 / 345,445.
[0188]
Many methodologies for characterizing amplified single-stranded nucleic acid fragments can also be used to determine the amount of a particular amplified single-stranded nucleic acid fragment in an amplification reaction mixture. For example, in embodiments where the amplified single-stranded nucleic acid molecule is first separated from other molecules in the amplification reaction mixture by liquid chromatography and then subjected to mass spectrometry, the amplified single-stranded nucleic acid molecule The amount of the nucleic acid molecule can be quantified either by liquid chromatography of the fraction containing the nucleic acid molecule or by measuring the ionic current of the mass spectral peak corresponding to the nucleic acid molecule.
[0189]
Using such methodology, allelic variants of the target nucleic acid can also be present to determine the allele frequency of the target nucleic acid within the population of nucleic acids. "Allelic variant" refers to a nucleic acid molecule that has the same sequence as a target nucleic acid except at defined positions in the target nucleic acid. The “allele frequency of the target nucleic acid in the nucleic acid population” refers to the ratio of the total amount of the target nucleic acid and its allele variants in the nucleic acid population that is the target nucleic acid. Since the primer pairs used in preparing the precursor to N1 are designed to anneal to a portion of the target nucleic acid at each site of potential genetic variation at defined locations on the target, Amplification using the primer pair as a primer and the nucleic acid population containing the target nucleic acid as a template results in a nucleic acid fragment containing the genetic variation at a defined location of the target nucleic acid, and the allelic variant is transformed into the nucleic acid population. When present within a nucleic acid fragment that contains a genetic variation at the same position in the allelic variant of the target nucleic acid. Since the sequences of the target nucleic acid and its allelic variants differ only in their defined positions, the precursor to N1 is amplified with the same or similar efficiency using the target nucleic acid and the allelic variant as templates, respectively. Is done. Similarly, a single-stranded nucleic acid molecule (A1) containing a genetic variation of a target nucleic acid or its complement has the same or similar efficiency as the amplification of a single-stranded nucleic acid molecule containing a genetic variation of an allelic variant or its complement. Is amplified. Furthermore, if a T2 molecule is used that anneals to the amplified A1 molecule with the same efficiency, using the target and its allelic variants, respectively, as a template, the A2 molecule amplified with the target as the starting template versus the starting A2 molecule. The ratio of A2 molecules amplified using the variant as a template reflects the ratio of target to the variant within the population of nucleic acids. Thus, a measure of the relative amount of A1 (or A2) molecule in the reaction mixture indicates the relative amount of target nucleic acid within this population of nucleic acids.
[0190]
(6. Composition and kit useful for detecting gene variation)
Compositions and kits useful for detecting genetic variation can be the same as the compositions and kits described above for exponential nucleic acid amplification. In certain embodiments, these kits may further comprise one or more additional components useful in characterizing the amplification product. For example, this additional component may be (1) to (5): (1) a chromatography column; (2) a buffer for performing chromatographic characterization or separation of nucleic acids; (3) ) Microtiter or microwell plates; (4) oligonucleotide standards (eg, 6-mers, 7-mers, 8-mers, 10-mers, 12-mers, 14-mers, and for liquid chromatography and / or mass spectrometry) 16mer); and (5) Instruction booklet for using this kit.
[0191]
(7. Application of Gene Variation Detection Method of the Present Invention)
As described in detail above, the present invention provides methods for detecting and / or identifying genetic variations in a target nucleic acid. The method according to the present invention may find utility in a wide variety of applications where it is desirable or necessary to identify or measure genetic variations. Such applications include, but are not limited to: genetic analysis for hereditary metastatic disease, tumor diagnosis, predisposition to the disease, forensic science, paternity testing, promoting plant cultivation or animal reproduction, cells Function and / or expression profiling of disease marker genes, and identification and / or characterization of infectious organisms that cause infectious disease in plants or animals and / or are associated with food safety.
[0192]
For example, the present invention may be useful in genetic analysis for forensic purposes. Identification of individuals at the level of DNA sequence variation is advantageous over conventional criteria (eg, fingerprints, blood types or physical characteristics). In contrast to most phenotypic markers, DNA analysis facilitates the estimation of associations between individuals as required in paternity testing. Genetic analysis has proven to be highly useful in bone marrow transplants where there is a need to distinguish between closely related donor and recipient cells. The present invention is useful in characterizing polymorphisms in sample DNA, and thus in forensic DNA analysis. For example, the analysis of 22 distinct gene sequences in a sample (one each, present in two different forms in the population) yielded 1010 different results, which indicates a unique identification of a human individual Enable.
[0193]
Detection of viral or cellular oncogenes is another important area of application for nucleic acid diagnostics. Viral oncogenes (v oncogenes) are transmitted by retroviruses, while their cellular counterparts (c oncogenes) are already present in normal cells. However, cellular oncogenes can be activated by certain modifications, such as point mutations (such as in the cK-ras oncogene in bladder and colorectal cancers), small deletions and small insertions. Each of this activation processes, combined with further degeneracy processes, leads to increased uncontrolled cell growth. In addition, point mutations, small deletions or insertions can also inactivate so-called "recessive oncogenes" and thereby lead to tumor formation (as in the retinoblastoma (Rb) gene and osteosarcoma). The invention is useful in detecting or identifying point mutations, small deletions, and small mutations that activate oncogenes or inactivate recessive oncogenes, which then cause cancer.
[0194]
The present invention may also be useful in transplant assays. Rejection of the transplanted tissue is critically controlled by a specific class of histocompatibility antigens (HLA). These are expressed on the surface of antigen presenting blood cells (eg, macrophages). The complex between HLA and the foreign antigen is recognized by T helper cells via the corresponding T cell receptor on the cell surface. Interactions between HLA, antigens, and T cell receptors trigger a complex protective response, which leads to a cascade-like immune response to the body.
[0195]
Recognition of heterologous foreign antigens is mediated by the antigen-specific variable region of the T cell receptor, similar to an antibody response. Thus, upon transplant rejection, T cells expressing a specific T cell receptor compatible with the foreign antigen can be eliminated from the T cell pool. Such an analysis is possible by the identification of an antigen-specific variable DNA sequence, where this sequence is amplified by PCR and is thus selectively augmented. A specific amplification reaction allows for the specific identification of a specific T cell receptor to a single cell.
[0196]
A similar analysis is performed herein for the identification of autoimmune diseases such as juvenile diabetes, arteriosclerosis, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, or encephalomyelitis.
[0197]
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful for determining gene variations in a T cell receptor gene encoding an antigen-specific variable region related to recognition of various foreign antigens. Thus, the present invention may be useful in predicting the potential for rejection of transplanted tissue.
[0198]
The present invention may also be useful in genomic diagnostics. 4% of all newborns are born with a genetic defect; of the 3,500 genetic disorders described, caused by a single genetic alteration, the primary molecular deficiency is due to their deficiency. Only about 400 are known.
[0199]
Genetic disorders have long been associated with phenotypic analysis (history (eg, blood deficiency: thalassemia)), chromosome analysis (eg, mongorhythm: trisomy 21) or genetic product analysis (eg, altered proteins (eg, phenylketone)). Uremia: Deficiency of the phenylalanine hydroxylase enzyme, which results in enhanced levels of phenylpyruvic acid)). Further use of nucleic acid detection methods greatly increases the scope of genomic diagnostics.
[0200]
For certain genetic disorders, only one of the two allele alterations is sufficient for the disorder (dominantly transmitted single gene deletion); often, both alleles are altered Must be (recessively transmitted single gene deletion). In the third type of genetic deficiency, the onset of the disease is determined not only by genetic alterations, but also by factors such as dietary habits (for diabetes or atherosclerosis) or lifestyle (for cancer). . Very often, these diseases occur in the elderly. Diseases such as schizophrenia, manic depression or epilepsy should also be mentioned in this context; in these cases, the onset of this disease depends on environmental factors and several genes at different chromosomal locations. Whether it depends on the modification of is under investigation.
[0201]
Direct and indirect DNA analysis has been used to diagnose the following set of genetic disorders: bladder cancer, colorectal cancer, sickle cell anemia, thalassemia, a1-antitrypsin deficiency, Resh-Nyhan. Syndrome, cystic fibrosis / mucovisidosis, Duchenne dystrophy / Becker muscular dystrophy, Alzheimer's disease, X chromosome-dependent mental retardation, and Huntington's chorea, phenylketonuria, galactosemia, Wilson's disease, hemochromatosis, severe complex Type immunodeficiency, α1-antitrypsin deficiency, albinism, alkaptonuria, lysosomal storage disease, Ehrles-Danlo syndrome, hemophilia, glucose-6-phosphate dehydrogenase disorder, agammaglobulinemia , Latency Diabetes, Viscott-Aldrich syndrome, Fabry disease, weak X syndrome, familial hypercholesterolemia, polycystic kidney disease, hereditary spherocytosis, Marfan syndrome, von Willebrand disease, neurofibromatosis, Tuberous sclerosis, hereditary hemorrhagic telangiectasia, familial colonic polyposis, Ehrles-Danlo syndrome, myotonic dystrophy, osteogenesis imperfecta, acute intermittent porphyria, and von Hippel-Lindau syndrome. The invention is useful for diagnosing any genetic disease caused by point mutations, small deletions or small insertions at defined positions.
[0202]
In a related aspect, the invention can be used in tests for disease susceptibility. Certain genetic variations do not directly cause disease, but they are associated with disease. In other words, retention of these gene variations by the subject renders the subject susceptible to these diseases. Detection of such genetic variations using the methods of the present invention allows for the identification of subjects suspected of a particular disease and the subsequent implementation of prophylactic methods.
[0203]
The invention is also applicable to pharmacogenomics. For example, it can be used to detect or identify genes associated with drug resistance, such as various alleles of the cytochrome P450 gene.
[0204]
Further, the present invention provides methods useful for detecting or characterizing residual disease. In other words, the methods of the invention can be used to detect or identify residual mutant genotypes, such as cancer after a particular treatment (eg, chemotherapy surgery). It may also be useful in identifying novel mutants, such as genetic variations in certain genes that confer drug resistance on pathogenic organisms.
[0205]
D. Use of Nucleic Acid Amplification Methods and Compositions in Alternative Splicing Analysis of Pre-mRNA
The methods and compositions for exponential nucleic acid amplification can also be used for pre-mRNA alternative splicing analysis. The target cDNA or portion thereof suspected of containing a particular exon-exon junction is first incorporated into the starting nucleic acid molecule (N1) used as a template in the first amplification reaction. The starting nucleic acid molecule also includes at least one strand of the first nicking agent recognition sequence, and thus, in the presence of a DNA polymerase and a nicking agent that recognizes the first nicking agent recognition sequence. Enables the amplification reaction. The product (A1) from this first amplification reaction comprises a portion of the target nucleic acid suspected of containing a particular exon-exon junction or its complement. A1 then anneals to another template nucleic acid (T2). T2 contains the sequence of the sense strand of the second nicking agent recognition sequence, and thus, in the presence of DNA polymerase and a nicking agent that recognizes this second nicking agent recognition sequence, enable. This feature of A1 and / or A2 indicates whether the target contains a particular exon-exon junction.
[0206]
(1. Definition)
An "exon" as used herein is any segment of a disrupted gene that is displayed in a mature RNA product. "Intron" refers to a segment that is transcribed, but is removed from within the transcript by splicing sequences (exons) together on either side.
[0207]
As used herein, the "sense strand" of a cDNA molecule is the same as the mRNA molecule from which the cDNA molecule is derived, except that nucleotide "U" in the mRNA is replaced by nucleotide "T" in the cDNA molecule. A chain having a sequence. On the other hand, the “antisense strand” of a cDNA molecule refers to a strand that is complementary to the mRNA molecule from which the cDNA molecule is derived.
[0208]
An exon (exon A) is "upstream" with respect to another exon (exon B) in the same gene when the sequence of the sense strand of exon A is 5 'to the sequence of the sense strand of exon B . Exon A and exon B may be further referred to as upstream and downstream exons, respectively.
[0209]
The target cDNA molecule refers to a cDNA molecule derived from the gene of interest. In other words, it is the product of reverse transcription of an mRNA molecule resulting from transcription of the gene of interest. The target cDNA molecule can have a partial sequence (ie, reverse transcribed from a partial mRNA molecule), but is preferably a full-length sequence.
[0210]
The nucleic acid fragment surrounding the first ODNP and the second ODNP has one strand between the sequence of the first ODNP, the complementary sequence of the second ODNP, and the complementary sequence of the first ODNP and the second ODNP. The other strand consists of the complementary sequence of the first ODNP, the sequence of the second ODNP, and the sequence between the complementary sequence of the first ODNP and the sequence of the second ODNP. , Double-stranded nucleic acid fragments.
[0211]
"Differential splicing" or "alternative splicing" is the production of at least two different mRNA molecules from the same transcript of one gene. For example, certain segments of the transcript may be present in one of the mRNA molecules, but may be spliced out of other mRNA molecules.
[0212]
A "position suspected of being a junction of two specific exons" or a "position of a suspected junction of two specific exons" is defined as the 3 'end of the sense strand of a relatively upstream exon and / or the exon thereof. The 5 'end of the antisense strand.
[0213]
The “joining point of exon A and exon B” in the target cDNA means the position in the sense strand of the target cDNA (where the 3 ′ end of exon A is joined to the 5 ′ end of exon B) and / or Or, a position in the antisense strand of the target cDNA (where the 5 'end of exon A is joined to the 3' end of exon B).
[0214]
(2. Starting nucleic acid molecule (N1))
Useful starting nucleic acid molecules for differential splicing analysis can be provided by various approaches. For example, N1 can be obtained by annealing a trigger oligonucleotide primer to a T1 molecule. Here, the trigger primer includes a position derived from the target cDNA and suspected to be a junction of two exons (eg, FIG. 19). Alternatively, N1 can be derived directly from a double-stranded target cDNA (eg, by digestion of the target cDNA with a restriction endonuclease, as shown in FIG. 20). N1 can also be prepared by using an appropriate pair of oligonucleotide primers (eg, FIGS. 21-24). Some exemplary means for providing the starting nucleic acid molecule N1 are described below.
[0215]
(A. First Type of Exemplary Method for Providing N1 Molecules)
As described above, N1 can be provided by annealing a trigger oligonucleotide primer to a T1 molecule. The trigger primer must include a position suspected of being a specific exon-exon junction. An example of this type of method for providing an N1 molecule is illustrated in FIG. As shown in this figure, the double-stranded target cDNA is first cleaved by a restriction endonuclease, and its recognition sequence is in close proximity to a position suspected of being a specific exon-exon junction. This digestion product can be denatured, and then the strand of the digestion product containing the position suspected of being a particular exon-exon junction can be used as a trigger oligonucleotide primer to anneal to the template nucleic acid (T1). T1 contains the sequence of the sense strand of the nicking agent recognition sequence so that, in the presence of DNA polymerase and the nicking agent that recognizes the recognition sequence, the position suspected of being a particular exon-exon junction is determined. The containing single-stranded nucleic acid fragment (A1) is amplified.
[0216]
In certain embodiments, the target cDNA molecule can be immobilized on a solid support. In another embodiment, the T1 molecule may be immobilized, preferably via its 5 'end.
[0217]
(B. A second type of exemplary method for providing an N1 molecule)
In certain embodiments of the invention, N1 may be derived directly from a target cDNA that includes a position suspected of being a specific exon-exon junction and further includes a nicking agent recognition sequence and a restriction endonuclease recognition sequence. An embodiment having a recognition sequence that can be recognized by an exemplary nicking agent recognition sequence by a nicking endonuclease that nicks outside of the recognition sequence (eg, N.BstNB I) is illustrated in FIG. As shown in this figure, the target cDNA can be digested with a restriction endonuclease that recognizes a sequence in the target nucleic acid. The digestion product containing the nicking endonuclease recognition sequence can function as a starting nucleic acid molecule (N1) to amplify a single-stranded nucleic acid fragment (A1). A position suspected of being a particular exon-exon junction is identified as a nicking site generated by a nicking agent such that the position is transferred or incorporated into the amplified A1 fragment, a restriction endonuclease. It is necessary to be between the cleavage sites.
[0218]
(C. A third type of exemplary method for providing an N1 molecule)
In certain embodiments, the starting nucleic acid molecule (N1) is a completely double-stranded or partially double-stranded nucleic acid molecule generated using various primer pairs. The following sections first describe a general method for providing the starting nucleic acid molecules described above (FIG. 21), and then provide certain embodiments of the general method (FIGS. 22-24).
[0219]
To determine the presence or absence of a junction between an upstream exon (exon A) and a downstream exon (exon B), a primer pair consisting of the following two primers can be used: (1) Exon A A first primer containing a sequence complementary to a part of the antisense strand of exon A near the 5 'end of exon A in the antisense strand, and (2) near the 5' end of exon B in the sense strand of exon B A second primer containing a sequence complementary to a part of the exon B sense strand (FIG. 21). The complementarity between the first ODNP and a portion of the antisense strand of exon A need not be exact, but it is possible for this ODNP to anneal specifically to that portion of exon A. Must be enough. Similarly, the complementarity between the second ODNP and a portion of the exon B sense strand need not be exact, but it is possible that this ODNP will specifically anneal to that portion of exon B. Must be enough to be possible. A portion of the exon strand is partially, 100 nucleotides, 90 nucleotides, 80 nucleotides, 70 nucleotides, 60 nucleotides, 50 nucleotides, 40 nucleotides, 35 nucleotides, 30 nucleotides, 25 nucleotides, from its end in the chain. If it is within 20, 15, or 10 nucleotides, it is near one end of the exon. Such a spaced arrangement between the two ODNPs of an ODNP pair is based on the first use of the target cDNA as a template when the junction between exon A and exon B is present in the target cDNA. It allows amplification of relatively short fragments, including the primer and the second primer.
[0220]
In addition to sequence complementarity between each primer and one strand of its corresponding exon, either the first primer or the second primer must further include the sequence of the sense strand of the nicking agent recognition sequence. Must. The recognition sequencer may be recognizable by a nicking endonuclease or a restriction endonuclease. In certain preferred embodiments, both the first primer and the second primer include a nicking agent recognition sequence. The presence of the recognition sequence indicates that the amplified nucleic acid fragment containing the first primer and the second primer amplifies the single-stranded nucleic acid fragment (A1) in the presence of a DNA polymerase and a nicking agent that recognizes the recognition sequence. Function as template nucleic acids.
[0221]
When the primers and target cDNA are combined in an amplification reaction, the presence (or absence) and composition of the amplification product reflects the presence or absence of the exon A and exon B junction. If only exon A or only exon B is present in the target cDNA, no amplification product is made using the primer as a primer and the target cDNA as a template. If both exon A and exon B are present in the target cDNA, an amplification product (i.e., a N1 molecule or precursor to N1) containing the first and second primers is created. If a junction between exon A and exon B is present in the target cDNA, the amplification product will include this conjugate (FIG. 21A). If there is no junction between exon A and exon B (ie, there is a sequence between exon A and exon B), the amplification product will not contain the junction but will have the sequence between the two exons (FIG. 21B). Thus, characterizing a single-stranded nucleic acid molecule (A1) that is amplified using N1 as a template and / or another single-stranded nucleic acid molecule (A2) that uses A1 as a template is such that the target cDNA is identified as exon A Indicates whether or not a junction with exon B is included.
[0222]
A specific embodiment of the general method is shown in FIG. As shown in this figure, the first primer comprises the sequence of the sense strand of the nicking endonuclease recognition sequence and anneals to a portion of the antisense strand of exon A, and the second primer comprises type IIs It contains the sequence of one strand of the restriction endonuclease recognition sequence and anneals to a portion of the exon B sense strand. When these two primers are used as primers to amplify a portion of the target cDNA, the amplification product (ie, the precursor to N1) contains both strands of the nicking endonuclease recognition sequence and the type IIs restriction endonuclease. Includes both strands of the nuclease recognition sequence. Furthermore, the amplification product also contains the junction between exon A and exon B, if the junction is present in the target cDNA. The amplification product is digested in the presence of a type IIs endonuclease recognizing the type IIs restriction endonuclease recognition sequence to include both strands of the nick-forming endonuclease recognition sequence, and also where the junction is present in the target cDNA. Produces a partially double-stranded nucleic acid molecule N1, which also includes the junction between exon A and exon B.
[0223]
Another specific embodiment of the above general method is shown in FIG. As shown in this figure, both primers contain a nicking endonuclease recognition sequence. In addition, the first primer is designed to anneal to a portion of the exon A antisense strand, and the second primer is designed to anneal to a portion of the exon B sense strand. If these two primers are used as primers to amplify a portion of the target cDNA, the amplification product (ie, the precursor to N1) will have an exon A and a junction if the junction is present in the target cDNA. It contains the junction with exon B, as well as two double-stranded nicking endonuclease recognition sequences. These two recognition sequences may or may not be identical to each other, but preferably they are identical. In the presence of the nicking endonuclease recognizing the recognition sequence, the amplification product will have two partially double-stranded nucleic acid molecules (N1a and N1b) each containing one of the nicking endonuclease recognition sequences. Are nicked twice (once for each strand) to produce In addition, the overhang of each of these two molecules also includes the junction between exon A and exon B, if the junction is present in the target cDNA.
[0224]
A further particular embodiment of the general method is shown in FIG. As shown in this figure, both primers contain a restriction endonuclease recognition sequence. In addition, the first primer is designed to anneal to a portion of the exon A antisense strand, and the second primer is designed to anneal to a portion of the exon B sense strand. If these two primers are used as primers to amplify a portion of the target cDNA in the presence of the modified deoxynucleoside triphosphate, the amplification product (ie, the precursor to N1) will have a junction at the target cDNA Contains the junction of exon A and exon B, as well as two semi-modified restriction endonuclease recognition sequences. These two semi-modified recognition sequences may or may not be identical to each other, but preferably they are identical. In the presence of a restriction endonuclease that recognizes the recognition sequence, the amplification product will contain two partially double-stranded nucleic acid molecules (N1a and N1b), each containing the sequence of one strand of the semi-modified recognition sequence. ) Are nicked twice (once for each strand) to produce In addition, the overhang of each of these two molecules also includes the junction between exon A and exon B, if the junction is present in the target cDNA.
[0225]
The first ODNP, the second ODNP, or both may be fixed to a solid support in certain embodiments. In another embodiment, the target cDNA molecule is immobilized.
[0226]
(3. A1 molecule)
As described above, the A1 molecule is amplified using a portion of N1 as a template. This portion of N1 contains a putative putative exon-exon junction so that this position is transferred or incorporated into A1. In certain embodiments, the length of A1 can be adjusted to be relatively short when a particular exon-exon junction is present in the target cDNA. For example, for the third type that provides the N1 molecule (FIGS. 21-24), ODNP pairs can be designed to be close to each other when they anneal to the target cDNA. More specifically, the first primer can be designed to anneal to a portion of the antisense strand of the target cDNA near the 5 'end of exon A, while the second primer is designed to anneal to the 5' end of exon B. Can be designed to anneal to a portion of the sense strand of the target cDNA close to the target strand. Similar to the diagnostic uses and detection of genetic variations of the invention described above, the short length of the A1 molecule increases amplification efficiency and speed, allows the use of DNA polymerases without strand displacement activity, and It facilitates detection of the A1 molecule and / or the product (A2) of the subsequent amplification reaction (where A1 is used as the starting amplification primer) via certain techniques such as mass spectrometry.
[0227]
(4. T2 molecule)
The T2 molecule of the present invention comprises a sequence of the sense strand of the nick-forming agent recognition sequence, and a sequence located on the 3 ′ side of the sequence of the sense strand of the recognition sequence (ie, a part of the starting nucleic acid molecule N1 is used as a template) A sequence that is at least substantially complementary to the single-stranded nucleic acid molecule (A1) that is to be amplified. Since T2 contains the sequence of the sense strand of the nicking agent recognition sequence, in the presence of a nicking agent and a DNA polymerase that recognizes the recognition sequence, A1 is used as a starting amplification primer, followed by another one. Used as a template for amplifying the single-stranded nucleic acid fragment (A2). As described above, A1 includes the location that is presumed to be a particular exon-exon junction. This position is subsequently transferred or incorporated into A2. Thus, the characterization of A2 can determine the sequence on each side of that position, and thus can determine whether a particular exon-exon junction is present in the target cDNA.
[0228]
As with the diagnostic applications of the present invention, in certain embodiments of the pre-mRNA alternative splicing assay according to the present invention, no additional T2 molecule is required for the second amplification reaction. In these embodiments, the second primer used in making the N1 module has a 3 'terminal sequence that anneals the second primer to A1. The second primer also contains the sequence of the sense strand of the nicking agent recognition sequence. Thus, extension of A1 using the second primer as a template creates a double stranded nicking agent recognition sequence. In the presence of a DNA polymerase and a nicking agent that recognizes this recognition sequence, the single-stranded nucleic acid (A2) is amplified using A1 as a template.
[0229]
The T2 molecule, in certain embodiments, can be immobilized on a solid support, preferably via its 5 'end. In other embodiments, T2 may not be fixed.
[0230]
(5. Characterization of amplified single-stranded nucleic acid)
The presence of a particular exon-exon junction in the target cDNA molecule can be determined by characterizing the amplification product (ie, A1 or A2). Any method suitable for characterizing a single-stranded nucleic acid molecule can be used. Exemplary techniques include, but are not limited to, chromatography (eg, liquid chromatography), mass spectrometry, and electrophoresis. A detailed description of various exemplary methods can be found in US Provisional Patent Applications Nos. 60 / 305,637 and 60 / 345,445.
[0231]
The characteristics of the amplified single-stranded nucleic acid fragment (eg, mass-to-charge ratio obtained by mass spectrometry) are then estimated taking into account the location and composition of the primers used in preparing the template nucleic acid fragment. And the assumption that there is a junction between the two exons (to which the primers are complementary). If the characteristics of the amplified and putative nucleic acid fragments are identical, the particular exon-exon junction that is assumed to be present in the target cDNA molecule is actually present in the target cDNA molecule. Estimation of the sequence and characteristics (eg, mass to charge ratio) of the single stranded nucleic acid fragment to be amplified is based on knowledge of the consensus sequence near the exon-intron junction. This finding suggests that one skilled in the art would accurately identify the exon-intron junction and thus estimate the exact location of the exon-exon junction if the intron between the two exons was removed by splicing. Is possible.
[0232]
6. Compositions and Kits Useful in Pre-mRNA Differential Splicing Analysis
Compositions and kits useful in pre-mRNA differential splicing analysis can be the same as those described above for exponential nucleic acid amplification. In certain embodiments, these kits may further include one or more additional components useful in characterizing the amplification product. For example, the additional components include (1) chromatography columns; (2) buffers for performing chromatographic characterization or separation of nucleic acids; (3) microtiter or microwell plates; (4) liquid chromatography. And / or oligonucleotide standards for mass spectrometry (eg, 6-mer, 7-mer, 8-mer, 10-mer, 12-mer, 14-mer, and 16-mer); (5) reverse transcriptase; (6) reverse transcription. Buffer for the enzyme; and (7) instruction booklet for using this kit.
[0233]
(7. Application of pre-mRNA differential splicing analysis of the present invention)
The present invention is useful in detecting any mRNA differential splicing of interest. Alternative pre-mRNA splicing is an important mechanism for regulating gene expression in higher eukaryotes. According to recent assessments, about 30% of the primary transcript of the human gene is subjected to alternative splicing and is often regulated in a specific spatial / temporal pattern during normal development. In complex genes, alternative splicing can generate tens to hundreds of different mRNA isoforms from a single transcript (Breitbart and Nadal-Ginard, Annu. Rev. Biochem. 56: 467-). 95, 1987; Missler and Sudhof, Trends Genet 14: 20-6, 1988; Gascard et al., Blood 92: 4404-14, 1998). In many cases, alternatively spliced exons encode protein domains that are functionally important for catalytic activity or binding interactions, and the resulting proteins may exhibit different or even antagonistic activities.
[0234]
As discussed in detail herein above, the present invention provides for the detection of pre-mRNA alternative splicing (detection of alternative splicing at the end of a particular exon of a gene in a cDNA molecule or population of cDNAs and including detection of alternative splicing at all ends of all exons of a gene in a cDNA population). Due to the importance of pre-mRNA splicing, these methods, compositions and kits are useful for diagnosis, predisposition and treatment of disease, crop cultivation, and animal reproduction, plant and animal developmental regulation, drug development, and external It finds utility in a wide variety of applications, such as manipulating the response of an organism to stimuli (eg, extreme temperatures, toxicants, and light).
[0235]
For example, the methods of the present invention can be used to identify and / or characterize pre-mRNA splicing patterns that are unique to pathological conditions. Abnormal pre-mRNA splicing in many genes has been implicated in various diseases or disorders, particularly cancer. In small cell lung carcinoma, the gene for protein p130, which belongs to the retinoblastoma protein family, is mutated at a consensus splicing site. As a result of this mutation, exon 2 is removed and there is no protein synthesis due to the presence of the immature stop codon. Similarly, in certain non-small cell lung cancers, the gene for the protein p161NK4A, which is an inhibitor of the cyclin-dependent kinases cdk4 and cdk6, is mutated at the donor splicing site. This mutation results in the production of a shortened, short half-life protein. In addition, WT1 (Wilms tumor suppressor gene) is transcribed into several messenger RNAs generated by alternative splicing. In breast cancer, the relative proportions of the different variants are altered compared to healthy tissue, thus providing insight in understanding the importance of various functional domains of WT1 in diagnostic tools or tumor progression . A similar alteration process that affects the ratio between different mRNA forms and protein isoforms during cell transformation is also found in neurofibrin NF1. In addition, one of the mechanisms by which p53 is inactivated in head and neck cancers involved mutations in consensus splicing sites. In addition, the altered splicing pattern of the IRF-1 tumor suppressor gene transcript results in inactivation of this tumor suppressor, and accelerated exon skipping in IRF-1 mRNA is associated with overt leukemia from myelodysplastic syndrome, acute leukemia, It is an indicator of many hematopoietic disorders, including myeloid leukemia, and myelodysplastic syndrome (US Pat. No. 5,643,729).
[0236]
The methods of the present invention are for comparing the splicing patterns of transcripts of genes known or suspected to be associated with a disease (or disorder) condition, and whose presence or absence is specific to the disease (or disorder) condition. Can be used to identify exons that are, or to identify changes in the ratio between different splicing variants specific to a disease (or disorder) condition. The identification of exons that are not present in a disease (or disorder) state requires that the domains encoded by these exons are important for the normal functioning of healthy cells, and that signal transduction pathways containing such domains are therapeutically important. It can be shown that it can be recovered for the purpose. On the other hand, the identification of exons that are unique to a disease (or disorder) condition can be used as a diagnostic tool, and the encoded domains are intended to antagonize signaling mediated by these domains It can be considered as a screening target for low molecular weight compounds. In addition, antibodies with specific affinity for these domains can also be used as diagnostic tools for this disease (or disorder) condition.
[0237]
The present invention can also be used to identify and / or characterize pre-mRNA differential splicing important in biogenesis. Alternative splicing plays a major role in sex determination in Drosophila, antibody response in humans, and other tissue-specific or developmental stage-specific processes (Chabot, Trends Genet. 12: 472-8; Smith et al.). Rev. Genet. 23: 527-77, 1989; Breitbart et al., Cell 49: 793-803, 1987). Accordingly, the methods of the present invention can be used to compare the pre-mRNA splicing patterns of genes known or suspected to be involved in developmental regulation at different stages of development. Identification and / or characterization of the presence of differential splicing in this gene will result in the desired trait (eg, larger fruit, higher protein content seed or higher oil content seed, higher milk production) May provide guidance in adjusting the corresponding developmental process to achieve this.
[0238]
The methods of the present invention can also be used to identify and / or characterize pre-mRNA differential splicing that is important in the response of an organism to various external stimuli. The pre-mRNA splicing pattern of a gene that is known or suspected to play a role in the response of a non-treated organism to a particular stimulus (eg, pathogen attack) is determined by the pre-mRNA of the stimulus organism. It can be compared to a splicing pattern. Identification and / or characterization of splicing patterns specific to the stimulus organism may be to increase (if this response is desired) or to reduce / eliminate (if this response is not desired) May provide guidance in manipulating the corresponding response process.
[0239]
All U.S. patents, U.S. patent application publications, U.S. patent applications, foreign patents, foreign patent applications, and non-patent publications referred to herein and / or listed in the application data sheets, , Which is hereby incorporated by reference in its entirety.
[0240]
From the foregoing, while particular embodiments of the present invention have been described herein for purposes of illustration, it will be understood that various modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.
[Brief description of the drawings]
[0241]
FIG. 1 is a schematic view of main steps of a first amplification reaction of a tandem amplification system of the present invention.
FIG. 2 is a schematic diagram of main steps of a second amplification reaction of the tandem amplification system of the present invention.
FIG. 3 is a schematic diagram of the main steps of an exemplary method for nucleic acid amplification according to the present invention, wherein N. The recognition sequence of BstNB I is used as an exemplary NARS, the first template (T1) contains the sequence of the antisense strand of NARS (ie, 5′-GACTC-3 ′), and the second template (T2 ) Contains the sequence of the sense strand of NARS (ie, 5'-GAGTC-3 ').
FIG. 4 is a schematic diagram of the main steps of an exemplary method for nucleic acid amplification according to the present invention, wherein N. The recognition sequence of BstNB I is used as an exemplary NARS, the first template (T1) and the second template (T2) are both the sequence of the sense strand of NARS (ie 5′-GAGTC-3 ′) including.
FIG. 5 outlines the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule N1 by annealing a trigger ODNP from genomic DNA to a first template T1, and then amplifying a single-stranded nucleic acid molecule A1. The figure is shown. This trigger ODNP is prepared by digesting genomic DNA and then denaturing the digested genomic DNA.
FIG. 6 shows a schematic diagram of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule N1 from genomic DNA and subsequently amplifying the single-stranded nucleic acid molecule A1. This genomic DNA contains a nicking endonuclease recognition sequence. The N1 molecule is generated by annealing one strand of a genomic DNA fragment with a portion of the other strand of the genomic DNA fragment (ie, T1).
FIG. 7 shows a schematic diagram of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule N1 from genomic DNA and subsequently amplifying the single-stranded nucleic acid molecule A1. This genomic DNA contains a nicking agent recognition sequence. The N1 molecule binds one strand of the genomic DNA fragment to the first template (T1), which is complementary to the strand of the genomic DNA in the 3 ′ portion but complementary in the 5 ′ portion. Not).
FIG. 8 shows a schematic diagram of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule N1 from genomic DNA and subsequently amplifying the nucleic acid molecule A1. This genomic DNA contains a nicking agent recognition sequence and a restriction endonuclease recognition sequence. A nicking endonuclease recognition sequence that is recognizable by a nicking endonuclease that nicks outside of the recognition sequence is used as an exemplary nicking agent recognition sequence.
FIG. 9 shows a schematic diagram of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule N1 from a target nucleic acid using two oligonucleotide primers and subsequently amplifying the nucleic acid molecule A1. One primer contains the sequence of the sense strand of NERS, while the other contains one strand of the type IIs restriction endonuclease recognition sequence (TRERS).
FIG. 10a shows a schematic diagram of the main steps for preparing starting nucleic acid molecules N1a and N1b using two ODNPs and subsequently amplifying the nucleic acid molecules A1a and A1b. In this exemplary embodiment, both ODNPs comprise the sequence of the sense strand of NERS.
FIG. 10b shows a schematic diagram of the main steps for amplifying nucleic acid molecules A2a and A2b using A1a and A1b of FIG. 10a as respective templates. In this exemplary embodiment, the first and second primers of FIG. 10a are annealed to A1b and A1a, respectively, to form N2b and N2a molecules.
FIG. 11 shows a schematic diagram of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule N1 in an exemplary embodiment using two ODNPs and subsequently amplifying the nucleic acid molecule A1. Both ODNPs contain the sequence of one strand of RERS. This amplification is performed in the presence of α-thiodeoxynucleoside triphosphate, which is used as an exemplary modified deoxynucleoside triphosphate.
FIG. 12 shows a schematic diagram of a method for detecting an immobilized target nucleic acid using a partially double-stranded starting nucleic acid molecule N1, including NERS.
FIG. 13 shows a schematic diagram of a method for detecting an immobilized target nucleic acid using a single-stranded nucleic acid molecule T1 comprising the sequence of the antisense strand of NERS.
FIG. 14 shows a schematic diagram of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule N1 from a target nucleic acid and subsequently amplifying the single-stranded nucleic acid molecule A1. The target nucleic acid contains a restriction endonuclease recognition sequence and a potential genetic variation.
FIG. 15 shows a schematic diagram of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule N1 from a target nucleic acid and subsequently amplifying the single-stranded nucleic acid molecule A1. The target nucleic acid includes a nicking agent recognition sequence, a restriction endonuclease recognition sequence, and a genetic variation between the two recognition sequences.
FIG. 16 shows a schematic diagram of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule N1 from a target nucleic acid using two primers and subsequently amplifying the nucleic acid molecule A1. The target nucleic acid contains a genetic variation ("X"). The first primer comprises the sequence of the sense strand of the nicking endonuclease recognition sequence, while the second primer comprises the sequence of one strand of the type IIs restriction endonuclease recognition sequence.
FIG. 17 shows a schematic diagram of the main steps for preparing starting nucleic acid molecules (N1a and N1b) from a target nucleic acid using two primers and subsequently amplifying the nucleic acid molecules A1a and A1b. . The target nucleic acid contains a genetic variation ("X"). Both primers contain the sequence of the sense strand of the nicking endonuclease recognition sequence.
FIG. 18 shows a schematic diagram of the main steps for preparing starting nucleic acid molecules (N1a and N1b) from a target nucleic acid using two primers and subsequently amplifying the nucleic acid molecules A1a and A1b. . The target nucleic acid contains a genetic variation ("X"). Both primers contain the sequence of one strand of the restriction endonuclease recognition sequence
FIG. 19 shows a schematic of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule (N1) from a target cDNA and subsequently amplifying the nucleic acid molecule (A1). The target cDNA contains a restriction endonuclease recognition sequence and a location suspected of being a specific exon-exon junction.
FIG. 20 shows a schematic of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule (N1) from a target cDNA and subsequently amplifying the nucleic acid molecule (A1). The target cDNA contains a nicking endonuclease recognition sequence, a restriction endonuclease recognition sequence, and a location suspected of being a specific exon-exon junction between these two recognition sequences.
FIGS. 21A and 21B show schematics of a process for preparing a starting nucleic acid molecule (N1) from a target cDNA and subsequently amplifying the nucleic acid molecule (A1). The target cDNA may include exon A and exon B directly downstream of exon A (FIG. 21A), or may include exon A, exon B, and the sequence between exon A and exon B (FIG. 21A). (FIG. 21B).
FIG. 22 shows a schematic diagram of the main steps for preparing a starting nucleic acid molecule (N1) from a target cDNA using two primers and then amplifying the nucleic acid molecule (A1). This target cDNA contains exon A and exon B. The first primer comprises the sequence of the sense strand of the nicking endonuclease recognition sequence and anneals to a portion of the exon A antisense strand. The second primer contains the sequence of the antisense strand of the type IIs restriction endonuclease recognition sequence and anneals to a portion of the exon B sense strand.
FIG. 23. Schematic representation of the main steps for preparing starting nucleic acid molecules (N1a and N1b) from a target cDNA using two primers and subsequently amplifying the nucleic acid molecules (A1a and A1b). Is shown. This target cDNA contains exon A and exon B. Both primers contain the sequence of the sense strand of the nicking endonuclease recognition sequence. The first primer anneals to a portion of the exon A antisense strand, while the second primer anneals to a portion of the exon B sense strand.
FIG. 24 is a schematic diagram of the main steps for preparing starting nucleic acid molecules (N1a and N1b) from a target cDNA using two primers and subsequently amplifying the nucleic acid molecules (A1a and A1b). Is shown. This target cDNA contains exon A and exon B. Both primers contain the sequence of the sense strand of the restriction endonuclease recognition sequence. The first primer anneals to a portion of the exon A antisense strand, while the second primer anneals to a portion of the exon B sense strand.
FIG. 25 shows the presence of a target nucleic acid using an immobilized T1 molecule comprising the sequence of the sense strand of NARS and a sequence that is at least substantially complementary to the 3 ′ portion of the target nucleic acid. FIG. 2 shows a schematic diagram of a method for detecting.
FIG. 26. Using an immobilized T1 molecule comprising the sequence of the sense strand of NARS and at least substantially complementary to the target nucleic acid, to detect the presence of the target nucleic acid FIG.

Claims (216)

核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法であって、該方法は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）：
（ｉ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列および
（ｉｉ）該第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列；
のうち少なくとも１つを含む少なくとも部分的に二本鎖となっている核酸分子（Ｎ１）を提供する工程；
（Ｂ）該第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で第１の一本鎖核酸分子（Ａ１）を増幅する工程であって、ここで、該増幅する工程は、該ポリメラーゼのためのテンプレートとして該Ｎ１の一部分を使用する、工程；
（Ｃ）以下の（ｉ）〜（ｉｉ）：
（ｉ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列および
（ｉｉ）Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的な配列
を５’から３’の方向で含む第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程；ならびに
（Ｄ）Ｔ２、Ａｌ、第１のＮＡ、第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で第３の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する工程であって、ここで、Ａ２は、Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的な配列であって、かつＡ１、Ａ２または両方が、長くとも２５ヌクレオチド長である、工程
を包含する、方法。A method for amplifying a nucleic acid molecule (A2), which comprises the following steps (A) to (D):
(A) The following (i) and (ii):
(I) the sequence of the sense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS) and (ii) the nucleotide sequence of the antisense strand of the first NARS;
Providing an at least partially double-stranded nucleic acid molecule (N1) comprising at least one of the following:
(B) amplifying the first single-stranded nucleic acid molecule (A1) in the presence of a first nicking agent (NA) that recognizes the first NARS, a DNA polymerase and one or more deoxynucleoside triphosphates; Wherein the step of amplifying uses a portion of the N1 as a template for the polymerase;
(C) The following (i) to (ii):
(I) a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) comprising, in the 5 ′ to 3 ′ direction, a sequence of the sense strand of the second NARS and (ii) a sequence at least substantially complementary to A1. Providing; and (D) a third single-stranded nucleic acid molecule in the presence of T2, Al, a first NA, a second NA recognizing a second NARS, a DNA polymerase and a deoxynucleoside triphosphate ( Amplifying A2), wherein A2 is a sequence that is at least substantially complementary to A1 and wherein A1, A2 or both are at most 25 nucleotides in length. Including, methods. 前記第１のＮＡＲＳが第２のＮＡＲＳに同一である、請求項１に記載の方法。The method of claim 1, wherein the first NARS is identical to a second NARS. 前記第１および第２のＮＡＲＳがニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項２に記載の方法。3. The method of claim 2, wherein said first and second NARS are nicking endonucleases. 前記第１および第２のＮＡの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein both the first and second NAs are nicking endonucleases (NE). 工程（Ａ）〜（Ｄ）が単一の容器の中で実施される、請求項１に記載の方法。The method according to claim 1, wherein steps (A) to (D) are performed in a single vessel. 前記Ｎ１が固定されている、請求項１に記載の方法。The method according to claim 1, wherein the N1 is fixed. 前記Ｔ２が固定されている、請求項１に記載の方法。The method of claim 1, wherein the T2 is fixed. Ｎ１が前記第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein N1 comprises the sequence of the antisense strand of the first NARS. Ｎ１が前記第１のＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein N1 comprises the sequence of the first NARS sense strand. 前記第１および第２の両方のＮＡが制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）であり、かつ前記ヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも１つが改変されている、請求項９に記載の方法。10. The method of claim 9, wherein both the first and second NAs are restriction endonucleases (REs) and at least one of the nucleoside triphosphates has been modified. Ｎ１が、トリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）と前記第１のＮＡＲＳのセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列を含む一本鎖核酸分子（Ｔ１）とをアニーリングすることによって提供される、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein N1 is provided by annealing a trigger oligonucleotide primer (ODNP) with a single-stranded nucleic acid molecule (T1) comprising a sequence of the first NARS sense or antisense strand. the method of. Ａ１が８〜２４のヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein A1 is between 8 and 24 nucleotides in length. Ａ１が１２〜１７のヌクレオチド長である、請求項１２に記載の方法。13. The method of claim 12, wherein A1 is 12-17 nucleotides in length. Ａ２が８〜２４のヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein A2 is 8 to 24 nucleotides in length. Ａ２が１２〜１７のヌクレオチド長である、請求項１４に記載の方法。15. The method of claim 14, wherein A2 is 12-17 nucleotides in length. Ｔ２の開始番号がＴ１の開始番号よりも大きい、請求項１に記載の方法。The method of claim 1, wherein the starting number of T2 is greater than the starting number of T1. Ｎ１はゲノムＤＮＡ由来である、請求項１に記載の方法。The method according to claim 1, wherein N1 is derived from genomic DNA. Ｎ１はゲノムＤＮＡの一部分である、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein N1 is a portion of genomic DNA. 核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法であって、該方法は、以下の（Ａ）〜（Ｂ）：
（Ａ）以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖となっている核酸分子（Ｎ１）；
（ｉｉ）以下の（ａ）〜（ｂ）：
（ａ）Ｎ１中の第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置するＮ１の一部分に少なくとも実質的に同一である配列；および
（ｂ）第２のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列；
を、３’から５’の方向で含む、一本鎖核酸分子（Ｔ２）；
（ｉｉｉ） 該第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）；該第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ；ＤＮＡポリメラーゼ；および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸
を含む混合物を提供する工程；ならびに
（Ｂ）一本鎖核酸分子（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件下で該混合物を維持する工程であって、ここで、Ａ２が長くて２５ヌクレオチド長である、工程
を包含する、方法。A method for amplifying a nucleic acid molecule (A2), the method comprising the following steps (A) and (B):
(A) The following (i) to (iii):
(I) an at least partially double-stranded nucleic acid molecule (N1) containing the sequence of the antisense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS);
(Ii) The following (a) and (b):
(A) a sequence at least substantially identical to the portion of N1 located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NARS in N1; and (b) the antisense strand of the second NERS An array of
A single-stranded nucleic acid molecule (T2) comprising in the 3 'to 5'direction;
(Iii) a mixture comprising a first nicking agent (NA) that recognizes the first NARS; a second NA that recognizes the second NARS; DNA polymerase; and one or more deoxynucleoside triphosphates. Providing; and (B) maintaining the mixture under conditions that exponentially amplify the single-stranded nucleic acid molecule (A2), wherein A2 is long and 25 nucleotides long. A method comprising: 前記第１および第２のＮＡがニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項１９に記載の方法。20. The method of claim 19, wherein said first and second NAs are nicking endonucleases (NE). 前記第１および第２のＮＡが同一である、請求項２０に記載の方法。21. The method of claim 20, wherein said first and second NAs are the same. 前記Ｎ１が固定されている、請求項１９に記載の方法。20. The method according to claim 19, wherein said N1 is fixed. 前記Ｔ２が固定されている、請求項１９に記載の方法。20. The method of claim 19, wherein said T2 is fixed. 配列（Ａ）（ｉｉ）（ａ）がＮ１中の前記第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖に対して５’側に位置するＮ１の一部分に正確に同一である、請求項１９に記載の方法。20. The method of claim 19, wherein sequence (A) (ii) (a) is exactly identical to a portion of N1 located 5 'to the antisense strand of the first NARS in N1. 請求項１９に記載の方法であって、Ｎ１が、一本鎖標的核酸（Ｔ１）に対するトリガーヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）のアニーリングによって提供され、ここで、Ｔ１は、５’から３’の方向で、
（Ａ）該第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列；および
（Ｂ）少なくとも一部分のトリガーＯＤＮＰに少なくとも実質的に相補的であって、該第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖に対して３’側に位置付けられる、配列を含む、方法。20. The method of claim 19, wherein N1 is provided by annealing a trigger nucleotide primer (ODNP) to a single-stranded target nucleic acid (T1), wherein T1 is in the 5 'to 3' direction:
(A) the sequence of the antisense strand of the first NARS; and (B) at least substantially complementary to at least a portion of the trigger ODNP, and 3 ′ to the antisense strand of the first NARS. A method comprising an array, wherein the method comprises: 前記Ｔ１が固定される、請求項２５に記載の方法。26. The method of claim 25, wherein said T1 is fixed. Ｔ１の配列（Ｂ）が少なくとも一部分の前記トリガーＯＤＮＰに正確に相補的である、請求項２５に記載の方法。26. The method of claim 25, wherein the sequence (B) of T1 is exactly complementary to at least a portion of the trigger ODNP. Ｔ１の３’末端がリン酸基に連結している、請求項２５に記載の方法。26. The method of claim 25, wherein the 3 'end of T1 is linked to a phosphate group. 請求項１９に記載に方法であって、Ｎ１中の前記第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側にある配列が、標的核酸分子から誘導され、かつ遺伝的バリエーションを含む、方法。20. The method of claim 19, wherein the sequence 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NARS in N1 is derived from a target nucleic acid molecule and comprises a genetic variation. Method. 前記標的核酸分子の中の遺伝的バリエーションを同定するためにＡ２を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, further comprising characterizing A2 to identify a genetic variation in said target nucleic acid molecule. 請求項１９に記載の方法であって、Ｎ１中の第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側にある配列が、ｃＤＮＡ分子から誘導され、かつ２つの特定のエキソンの間の連結部を含むことが疑われる、方法。20. The method of claim 19, wherein the sequence that is 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NARS in N1 is derived from a cDNA molecule and is located between two specific exons. A method suspected of including a connection. 前記ｃＤＮＡが前記２つの特定のエキソンの連結部を含む否かを決定するために、Ａ２を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。32. The method of claim 31, further comprising characterizing A2 to determine whether the cDNA comprises a junction of the two specific exons. 請求項３０または３２に記載の方法であって、前記特徴付ける工程が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光法および電気泳動からなる群より選択される技術の使用によって少なくとも部分的に実施される、方法。33. The method of claim 30 or 32, wherein the characterizing step is performed at least in part by use of a technique selected from the group consisting of mass spectrometry, liquid chromatography, fluorescence polarization, and electrophoresis. ,Method. 前記特徴付ける工程が、液体クロマトグラフィーの使用によって少なくとも部分的に実施される、請求項３３に記載の方法。34. The method of claim 33, wherein the characterizing step is performed at least in part by use of liquid chromatography. 前記特徴付ける工程が、質量分析法の使用によって少なくとも部分的に実施される、請求項３３に記載の方法。34. The method of claim 33, wherein the characterizing step is performed at least in part by using mass spectrometry. 核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法であって、該方法は、以下の（Ａ）〜（Ｂ）：
（Ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖となっている核酸分子（Ｎ1）；
（ｉｉ）以下の（ａ）〜（ｂ）：
（ａ）Ｎ１における第１のＮＡＲＳのセンス鎖の３’側に位置するＮ１の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列および
（ｂ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列
を、３’から５’の方向で含む、一本鎖核酸分子（Ｔ２）ならびに
（ｉｉｉ）該第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）；第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ；ＤＮＡポリメラーゼ；および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む混合物を形成する工程；ならびに
（Ｂ）一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件下で、該混合物を維持する工程であって、ここでＡ２が長くても２５ヌクレオチド長である、工程
を包含する、方法。A method for amplifying a nucleic acid molecule (A2), the method comprising the following steps (A) and (B):
(A) The following (i) to (iii):
(I) an at least partially double-stranded nucleic acid molecule (N1) containing the sequence of the sense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS);
(Ii) The following (a) and (b):
(A) a sequence at least substantially complementary to a portion of N1 located on the 3 ′ side of the first NARS sense strand in N1 and (b) a sequence of the second NARS sense strand in 3 ′. A single stranded nucleic acid molecule (T2) and (iii) a first nicking agent (NA) that recognizes the first NARS; a second NA that recognizes a second NARS; DNA polymerase; and one or more deoxynucleoside triphosphates;
And (B) maintaining the mixture under conditions that amplify the single-stranded nucleic acid molecule (A2), wherein A2 is at most 25 nucleotides in length, A method comprising the steps of: 前記第１および第２の両方のＮＡがニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項３６に記載の方法。37. The method of claim 36, wherein both the first and second NAs are nicking endonucleases (NE). 前記第１および第２のＮＡが同一である、請求項３７に記載の方法。38. The method of claim 37, wherein said first and second NAs are the same. 前記第１および第２の両方のＮＡが制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）であり、かつ前記デオキシヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも１つが改変されている、請求項３６に記載の方法。37. The method of claim 36, wherein both the first and second NAs are restriction endonucleases (REs) and at least one of the deoxynucleoside triphosphates has been modified. 前記Ｎ１が固定される、請求項３６に記載の方法。37. The method of claim 36, wherein said Nl is fixed. 前記Ｔ２が固定される、請求項３６に記載の方法。37. The method of claim 36, wherein said T2 is fixed. 配列（ｉｉ）（ａ）が、前記第１のＮＡＲＳのセンス鎖に対して３’側に位置するＮ１の一部分に正確に相補的である、請求項３６に記載の方法。37. The method of claim 36, wherein sequence (ii) (a) is exactly complementary to a portion of N1 located 3 'to the sense strand of the first NARS. 請求項３６に記載の方法であって、ここで、Ｎ１が、一本鎖標的核酸（Ｔ１）に対してトリガーオリゴヌクレオチド（ＯＤＮＰ）をアニーリングすることによって提供され、該一本鎖標的核酸（Ｔ１）が、
（Ａ）前記第１のＮＡＲＳのセンス鎖の配列；および
（Ｂ）該トリガーＯＤＮＰの少なくとも一部分に少なくとも実質的に相補的である配列
を５’から３’の方向で含む、方法。37. The method of claim 36, wherein N1 is provided by annealing a trigger oligonucleotide (ODNP) to the single-stranded target nucleic acid (T1), wherein the single-stranded target nucleic acid (T1) is provided. )But,
A method comprising: (A) the sequence of the sense strand of the first NARS; and (B) a sequence that is at least substantially complementary to at least a portion of the trigger ODNP, in the 5 ′ to 3 ′ direction. 前記トリガーＯＤＮＰが標的核酸から誘導され、そして該標的核酸の遺伝的バリエーションを含む、請求項４３に記載の方法。44. The method of claim 43, wherein said trigger ODNP is derived from a target nucleic acid and comprises a genetic variation of said target nucleic acid. 前記標的核酸における遺伝的バリエーションを同定するためにＡ２を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項４４に記載の方法。46. The method of claim 44, further comprising characterizing A2 to identify a genetic variation in said target nucleic acid. 請求項４３に記載の方法であって、前記トリガーＯＤＮＰがｃＤＮＡ分子からから誘導され、かつ２つの特定のエキソンの間の連結部を含むことが疑われる、方法。44. The method of claim 43, wherein said trigger ODNP is derived from a cDNA molecule and is suspected of comprising a junction between two specific exons. 前記ｃＤＮＡが前記２つの特定のエキソンの間の連結部を含む否かを決定するために、Ａ２を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。47. The method of claim 46, further comprising the step of characterizing A2 to determine whether said cDNA comprises a junction between said two specific exons. 前記Ｔ１が固定される、請求項４３に記載の方法。44. The method of claim 43, wherein said T1 is fixed. Ｔ１の配列（Ｂ）が、前記トリガーＯＤＮＰの少なくとも一部分に正確に相補的である、請求項４３に記載の方法。44. The method of claim 43, wherein the sequence (B) of T1 is exactly complementary to at least a portion of the trigger ODNP. タンデム核酸増幅システムであって、以下：
第１の一本鎖核酸（Ａｌ）を増幅するための第１のプライマー伸長手段；および第２の一本鎖核酸（Ａ２）を増幅するための第２のプライマー伸長手段を備え；ここで、
（ｉ）Ａ１が、Ａ２を増幅するための第２のプライマー伸長手段のための開始プライマーであり；
（ｉｉ）該第１および第２のプライマー伸長手段が単一の反応容器に含まれ、かつニック形成剤（ＮＡ）の存在が必要とされ；
（ｉｉｉ）Ａ１、Ａ２、またはそれらの両方が長くて２５ヌクレオチド長であり；そして
（ｉｖ）Ａ２がＡ１に対して少なくとも実質的に相補的である、
タンデム核酸増幅システム。A tandem nucleic acid amplification system, comprising:
A first primer extension means for amplifying a first single-stranded nucleic acid (Al); and a second primer extension means for amplifying a second single-stranded nucleic acid (A2);
(I) A1 is the starting primer for the second primer extension means for amplifying A2;
(Ii) the first and second primer extension means are contained in a single reaction vessel, and the presence of a nicking agent (NA) is required;
(Iii) A1, A2, or both, are at most 25 nucleotides in length; and (iv) A2 is at least substantially complementary to A1.
Tandem nucleic acid amplification system. 請求項５０に記載のタンデム核酸増幅システムであって、ここで、前記第１のプライマー伸長手段のためのＮＡが前記第２のプライマー伸長手段のためのＮＡと同一である、タンデム核酸増幅システム。51. The tandem nucleic acid amplification system according to claim 50, wherein the NA for said first primer extension means is the same as the NA for said second primer extension means. 請求項５０に記載のタンデム核酸増幅システムであって、ここで、
（ａ）Ａ１を増幅するための第１の手段が、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（トリガーＯＤＮＰ）、該トリガーＯＤＮＰに少なくとも実質的に相補的である第１のテンプレート核酸（Ｔ１）、第１のニック形成剤（ＮＡ）、第１のＤＮＡポリメラーゼを含み、ここで、Ｔ１をテンプレートとして使用して該トリガーＯＤＮＰの伸長することによって、第１のＮＡによって認識可能である第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を生成し；そして、
（ｂ）Ａ２を増幅するための第２の手段が、該核酸（Ａ１）、Ａ１に少なくとも実質的に相補的な第２のテンプレート核酸（Ｔ２）を含み、そして、第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、該第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡおよび第２のＤＮＡポリメラーゼを含む、
システム。A tandem nucleic acid amplification system according to claim 50, wherein:
(A) a first means for amplifying A1 comprises a first oligonucleotide primer (Trigger ODNP), a first template nucleic acid (T1) that is at least substantially complementary to said Trigger ODNP, a first A nicking agent (NA), comprising a first DNA polymerase, wherein the first nicking agent recognition is recognizable by the first NA by extending the trigger ODNP using T1 as a template. Generating a sequence (NARS); and
(B) a second means for amplifying A2 comprises said nucleic acid (A1), a second template nucleic acid (T2) at least substantially complementary to A1, and a sense strand of a second NARS A second NARS that recognizes the second NARS and a second DNA polymerase.
system. 前記第１のＮＡが前記第２のＮＡと同一である、請求項５２に記載の方法。53. The method of claim 52, wherein the first NA is the same as the second NA. 前記第１のポリメラーゼが前記第２のポリメラーゼと同一である、請求項５２または５３に記載の方法。54. The method of claim 52 or 53, wherein the first polymerase is the same as the second polymerase. 前記第１および第２の両方のＮＡがニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項５２に記載の核酸増幅システム。53. The nucleic acid amplification system according to claim 52, wherein said first and second NAs are nicking endonucleases. 前記第１および第２の両方のＮＡが制限エンドヌクレアーゼである、請求項５２に記載の核酸増幅システム。53. The nucleic acid amplification system according to claim 52, wherein said first and second NAs are restriction endonucleases. 前記トリガーＯＤＮＰが固定されている、請求項５２に記載の核酸増幅システム。53. The nucleic acid amplification system according to claim 52, wherein said trigger ODNP is fixed. 前記Ｔ１が固定されている、請求項５２に記載の核酸増幅システム。53. The nucleic acid amplification system according to claim 52, wherein said T1 is fixed. 前記Ｔ２が固定されている、請求項５２に記載の核酸増幅システム。53. The nucleic acid amplification system according to claim 52, wherein said T2 is fixed. 核酸分子Ａ２を指数関数的に増幅するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）および第１のＤＮＡポリメラーゼの存在下でのプライマー伸長反応によって、第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のうちの１つの鎖の配列を含む第１のテンプレート核酸（Ｔ１）をテンプレートとして使用して核酸分子（Ａｌ）を増幅する工程；ならびに
（ｂ）第２のＮＡおよび第２のＤＮＡポリメラーゼの存在下でのプライマー伸長反応によって、第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む第２のテンプレート核酸（Ｔ２）をテンプレートとして、そしてＡ１を開始プライマーとして使用してＡ２を増幅する工程であって、ここで、Ａ１、Ａ２、またはその両方は長くても２５ヌクレオチド長である、工程；
を包含する、方法。A method for exponentially amplifying a nucleic acid molecule A2, comprising:
(A) A primer extension reaction in the presence of a first nicking endonuclease (NA) that recognizes a first NARS and a first DNA polymerase causes the first nicking agent recognition sequence (NARS) Amplifying a nucleic acid molecule (Al) using a first template nucleic acid (T1) comprising a sequence of one strand as a template; and (b) in the presence of a second NA and a second DNA polymerase Amplifying A2 by a primer extension reaction using a second template nucleic acid (T2) containing the sequence of the sense strand of the second NARS as a template and A1 as a starting primer, wherein A1 is used. , A2, or both are at most 25 nucleotides in length;
A method comprising: 第１のＮＡＲＳが前記第２のＮＡＲＳと同一である、請求項６０に記載の方法。61. The method of claim 60, wherein a first NARS is the same as the second NARS. 前記第１のＤＮＡポリメラーゼが前記第２のＤＮＡポリメラーゼと同一である、請求項６０または請求項６１に記載の方法。62. The method of claim 60 or claim 61, wherein the first DNA polymerase is the same as the second DNA polymerase. 工程（ａ）および（ｂ）が単一の容器で実施される、請求項６０に記載の方法。61. The method of claim 60, wherein steps (a) and (b) are performed in a single vessel. 前記ＮＡがニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項６１に記載の方法。62. The method of claim 61, wherein said NA is a nicking endonuclease (NE). 前記ＮＡが、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である、請求項６１に記載の方法。62. The method of claim 61, wherein said NA is a restriction endonuclease (RE). 前記Ｔ１が固定される、請求項６０に記載の方法。61. The method of claim 60, wherein said Tl is fixed. 前記Ｔ２が固定される、請求項６０に記載の方法。61. The method of claim 60, wherein said T2 is fixed. 前記ＮＥが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩまたはＮ.Ａｌｗ Ｉである、請求項３、２０および３７のいずれか１項に記載の方法。If the NE is N.P. 38. The method according to any one of claims 3, 20 and 37, wherein the method is BstNB I or N. Alw I. 第１および第２の両方のＮＥが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである、請求項６８に記載の方法。If both the first and second NEs are 69. The method of claim 68, wherein the method is BstNB I. 前記増幅が、等温度条件下で実施される、請求項１、１９および３６のいずれか１項に記載の方法。37. The method according to any one of claims 1, 19 and 36, wherein the amplification is performed under isothermal conditions. 増幅反応の各々が、５０℃〜７０℃で実施される、請求項７０に記載の方法。71. The method of claim 70, wherein each of the amplification reactions is performed at 50C to 70C. 請求項１、１９、および３６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、方法。37. The method according to any one of claims 1, 19 and 36, wherein the DNA polymerase is exo - Vent, exo - Deep Vent, exo - Bst, exo - Pfu, exo - Bca, Selected from the group consisting of Klenow fragment of DNA polymerase I, T5 DNA polymerase, Phi29 DNA polymerase, phage M2 DNA polymerase, phage PhiPRD1 DNA polymerase, Sequenase, PRD1 DNA polymerase, 9 ° Nm ™ DNA polymerase and T4 DNA polymerase homoenzyme. How. 請求項７４に記載の方法であって、ここで、前記５’→３’エンドヌクレアーゼ欠損のＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼまたはｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼである、方法。75. The method of claim 74, wherein the 5 'to 3' endonuclease deficient DNA polymerase is exo - Bst polymerase, exo - Bca polymerase, exo - Vent polymerase, 9 ° Nm ™ DNA polymerase or An exo - Deep Vent polymerase. 組成物であって、以下（Ａ）〜（Ｂ）：
（Ａ）第１の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子であって、該二本鎖である核酸分子のうちの１つの鎖は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）：
（ｉ）長くて２５ヌクレオチド長の配列、および
（ｉｉ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列
を５’から３’の方向で含む、核酸分子
；ならびに
（Ｂ）第２の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子であって、該二本鎖である核酸分子のうちの１つの鎖は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）：
（ｉ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列および
（ｉｉ）該第１の核酸分子における第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置付けられる配列と少なくとも実質的に同一である配列、
を５’から３’の方向で含む、核酸分子
を含む、組成物。A composition comprising the following (A) to (B):
(A) a first at least partially double-stranded nucleic acid molecule, wherein one of the double-stranded nucleic acid molecules has the following (i) to (ii):
(B) a nucleic acid molecule comprising (i) a sequence of at most 25 nucleotides in length, and (ii) the sequence of the antisense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS) in a 5 ′ to 3 ′ direction; A second at least partially double-stranded nucleic acid molecule, wherein one strand of the double-stranded nucleic acid molecule has the following (i) to (ii):
(I) a sequence of the sense strand of the second NARS and (ii) at least substantially identical to a sequence located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NARS in the first nucleic acid molecule. An array,
A nucleic acid molecule comprising in the 5 'to 3' direction. 前記第１のＮＡＲＳが、第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）によって認識可能であり、かつ、前記第２のＮＡＲＳが第２のＮＥによって認識可能である、請求項７４に記載の組成物。75. The composition of claim 74, wherein the first NARS is recognizable by a first nicking endonuclease (NE), and wherein the second NARS is recognizable by a second NE. 前記第１のＮＡＲＳが、制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、かつ、第２のＮＡＲＳがニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能である、請求項７４に記載の組成物。75. The composition of claim 74, wherein the first NARS is recognizable by a restriction endonuclease and the second NARS is recognizable by a nicking endonuclease. 前記第１の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子が固定される、請求項７４に記載の組成物。75. The composition of claim 74, wherein the first at least partially double-stranded nucleic acid molecule is immobilized. 前記第２の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子が固定される、請求項７４に記載の組成物。75. The composition of claim 74, wherein the second at least partially double-stranded nucleic acid molecule is immobilized. 配列（Ｂ）（ｉｉ）が、第１の核酸分子の第１のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置付けられる配列と正確に同一である、請求項７４に記載の組成物。75. The composition of claim 74, wherein sequence (B) (ii) is exactly the same as the sequence located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NERS of the first nucleic acid molecule. . 前記第１のＮＡＲＳが、前記第２のＮＡＲＳと同一である、請求項７４に記載の組成物。75. The composition of claim 74, wherein the first NARS is the same as the second NARS. 前記第１および第２のＮＡＲＳが、１つのＮＥにより認識可能である、請求項８０に記載の組成物。81. The composition of claim 80, wherein the first and second NARS are recognizable by one NE. 以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）第１の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、該核酸分子の１つの鎖が、第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列を含む、第１の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子；ならびに
（ｂ）第２の少なくとも二本鎖の核酸分子であって、該核酸分子の１つの鎖が、５’から３’にむかって、以下の（ｉ）および（ｉｉ）：
（ｉ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および
（ｉｉ）該第１の核酸分子中の該第１のＮＡＲＳの該センス鎖の配列の３’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的な配列、
を含む、第２の少なくとも二本鎖の核酸分子
を含み、ここで、該第１のＮＡＲＳを認識するニック形成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のヌクレオシド三リン酸の存在下で、テンプレートとして該第１の核酸分子を用いて増幅された一本鎖核酸フラグメントは、多くて２５ヌクレオチドを有する、組成物。The following (a) and (b):
(A) a first at least partially double-stranded nucleic acid molecule, wherein one strand of the nucleic acid molecule comprises a sequence of a sense strand of a first nicking agent recognition sequence (NARS); At least partially double-stranded nucleic acid molecule; and (b) a second at least double-stranded nucleic acid molecule, wherein one strand of the nucleic acid molecule from 5 ′ to 3 ′ (I) and (ii):
(I) a sequence of the sense strand of a second NARS, and (ii) at least substantially complementary to a sequence located 3 'to the sequence of the sense strand of the first NARS in the first nucleic acid molecule. Array,
Comprising a second at least double-stranded nucleic acid molecule comprising a nicking agent recognizing the first NARS, a DNA polymerase, and one or more nucleoside triphosphates as a template. A composition wherein the single-stranded nucleic acid fragment amplified with the first nucleic acid molecule has at most 25 nucleotides. 前記第１のＮＡＲＳが第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）によって認識可能であり、そして前記第２のＮＡＲＳが第２のＮＥによって認識可能である、請求項８２に記載の組成物。83. The composition of claim 82, wherein said first NARS is recognizable by a first nicking endonuclease (NE) and said second NARS is recognizable by a second NE. 前記第１のＮＡＲＳが第１の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって認識可能であり、そして前記第２のＮＡＲＳが第２のＲＥによって認識可能である、請求項８２に記載の組成物。83. The composition of claim 82, wherein said first NARS is recognizable by a first restriction endonuclease (RE) and said second NARS is recognizable by a second RE. 前記第１の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が固定化されている、請求項８２に記載の組成物。83. The composition of claim 82, wherein said first at least partially double-stranded nucleic acid molecule is immobilized. 前記第２の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が固定化されている、請求項８５に記載の組成物。86. The composition of claim 85, wherein said second at least partially double-stranded nucleic acid molecule is immobilized. 配列（ｂ）（ｉｉ）が、前記第１の核酸分子中の前記第１のＮＡＲＳの前記センス鎖の配列の３’側に位置する配列に正確に相補的である、請求項８２に記載の組成物。83. The sequence of claim 82, wherein sequence (b) (ii) is exactly complementary to a sequence located 3 'of the sequence of the sense strand of the first NARS in the first nucleic acid molecule. Composition. 前記第１のＮＡＲＳが、前記第２のＮＡＲＳと同一である、請求項８２に記載の組成物。83. The composition of claim 82, wherein said first NARS is the same as said second NARS. 前記第１および第２のＮＡＲＳが、１つのＮＥにより認識可能である、請求項８８に記載の組成物。89. The composition of claim 88, wherein said first and second NARS are recognizable by one NE. 前記第１のＮＡＲＳを認識する第１のＮＡおよび前記第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡをさらに含む、請求項７２または８２に記載の組成物。83. The composition of claim 72 or claim 82, further comprising a first NA that recognizes the first NARS and a second NA that recognizes the second NARS. 前記第１および第２のＮＡＲＳの両方を認識するＮＡをさらに含む、請求項８０または８８に記載の組成物。89. The composition of claim 80 or 88, further comprising an NA that recognizes both the first and second NARS. 前記第１および第２のＮＡＲＳの両方を認識するＮＥをさらに含む、請求項８１または８９に記載の組成物。90. The composition of claim 81 or 89, further comprising an NE that recognizes both the first and second NARS. 前記ＮＥが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである、請求項９３に記載の組成物。If the NE is N.P. 94. The composition of claim 93 which is BstNB I. ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項７４、８２、および９０のいずれか１項に記載の組成物。91. The composition of any one of claims 74, 82, and 90, further comprising a DNA polymerase. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、請求項９４に記載の組成物。The DNA polymerase is exo - Vent, exo - Deep Vent, exo - Bst, exo - Pfu, exo - Bca, Klenow fragment of DNA polymerase I, T5 DNA polymerase, Phi29 DNA polymerase, phage M2 DNA polymerase, phage PhiPRD1 DNA polymerase 95. The composition of claim 94, wherein the composition is selected from the group consisting of:, Sequenase, PRD1 DNA polymerase, 9 ° Nm ™ DNA polymerase, and T4 DNA polymerase homoenzyme. 前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼ、または９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼである、請求項９４に記載の組成物。95. The 5 'to 3' exonuclease deficient DNA polymerase is exo - Bst polymerase, exo - Bca polymerase, exo - Vent polymerase, exo - Deep Vent polymerase, or 9 ° Nm ™ DNA polymerase. Composition. ゲノム核酸またはｃＤＮＡ分子における遺伝子バリエーションを同定する方法であって、ここで、遺伝子バリエーションが、ゲノム核酸またはｃＤＮＡ分子中の第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のアンチセンス鎖の配列の５’側に位置し、該方法は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程：
（Ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）ゲノム核酸またはｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）３’から５’にむかって、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）該第１のＮＥＲＳの該アンチセンス鎖の配列の５’側に位置するゲノム核酸またはｃＤＮＡ分子の一部に少なくとも実質的に同一の配列、および
（ｂ）第２のＮＥＲＳのセンス鎖の配列
を含む、一本鎖核酸分子（Ｔ２）、ならびに
（ｉｉｉ）該第１のＮＥＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；該第２のＮＥＲＳを認識する第２のＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）該混合物を、一本鎖核酸分子（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件で維持する工程；ならびに
（Ｃ）該ゲノム核酸またはｃＤＮＡ分子中の該遺伝子バリエーションを同定するためにＡ２を特徴付ける工程、
を包含する、方法。A method for identifying a genetic variation in a genomic nucleic acid or cDNA molecule, wherein the genetic variation comprises 5% of the sequence of the antisense strand of a first nicking endonuclease recognition sequence (NERS) in the genomic nucleic acid or cDNA molecule. And the method comprises the following steps (A) to (C):
(A) The following (i) to (iii):
(I) genomic nucleic acid or cDNA molecules,
(Ii) From 3 ′ to 5 ′, the following (a) and (b):
(A) a sequence at least substantially identical to a portion of a genomic nucleic acid or cDNA molecule located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NERS, and (b) the sense strand of a second NERS A single-stranded nucleic acid molecule (T2) comprising the sequence of: (iii) a first nicking endonuclease (NE) that recognizes the first NERS; a second NE that recognizes the second NERS; DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates;
Forming a mixture comprising:
(B) maintaining the mixture under conditions that exponentially amplify the single-stranded nucleic acid molecule (A2); and (C) converting A2 to identify the gene variation in the genomic nucleic acid or cDNA molecule. Characterizing process,
A method comprising: 前記第１のＮＥＲＳが、前記第２のＮＥＲＳと同一である、請求項９７に記載の方法。100. The method of claim 97, wherein the first NERS is the same as the second NERS. 標的核酸中の規定された位置の遺伝子バリエーションを同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、および該標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの相補鎖の３’側に位置する該標的核酸の該第１の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして、
該第２のＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸の該第２の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列を含むか、
または、
（ｉｉ）該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、第１のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの５’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そして
該第２のＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、ＲＥＲＳを含む、工程；
（ｂ）該第１および該第２のＯＤＮＰを伸長して、該第１のＯＤＮＰおよび該第２のＯＤＮＰを含む伸長産物を生成する工程；
（ｃ）必要に応じて、工程（ｂ）の伸長産物を、該ＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化産物を生成する工程；
（ｄ）該第１のＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（ｂ）の伸長産物または工程（ｃ）の消化産物の１つの鎖をテンプレートとして用いて第１の一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅する工程；
（ｅ）Ａ１にアニーリングする第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該Ｔ２は、５’から３’にむかって、以下の（ｉ）および（ｉｉ）：
（ｉ）第２のＮＥＲＳのセンス鎖の配列、および
（ｉｉ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的な配列、
を含む、工程；
（ｆ）テンプレートとしてＡ１を用いて第３の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する工程；ならびに
（ｅ）該標的核酸中の該遺伝子バリエーションを同定するためにＡ２を特徴付ける工程、
を包含し、ここで、Ａ１、Ａ２、またはこれら両方が多くて２５ヌクレオチドを有する、方法。A method for identifying a gene variation at a defined position in a target nucleic acid, the method comprising:
(A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and the target nucleic acid, wherein:
(I) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence of a sense strand of a first nicking endonuclease recognition sequence (NERS) and nucleotides of the first strand of the target nucleic acid located 3 ′ to a complementary strand of the gene variation. Comprising a nucleotide sequence at least substantially complementary to the sequence; and
The second ODNP comprises a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the second strand of the target nucleic acid located 3 'to the genetic variation, and optionally, a restriction endonuclease. Contains the sequence of one strand of the nuclease recognition sequence (RERS),
Or
(Ii) when the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence at least substantially identical to a nucleotide sequence of a sense strand of a first NERS and a nucleotide sequence of the target nucleic acid located 5 ′ to the genetic variation, and ODNP comprises a nucleotide sequence that is at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the target nucleic acid located 3 ′ to the genetic variation, and optionally comprises RERS;
(B) extending the first and second ODNPs to produce an extension product comprising the first ODNP and the second ODNP;
(C) optionally, digesting the extension product of step (b) with a restriction endonuclease that recognizes the RERS to produce a digestion product;
(D) in the presence of a nicking endonuclease (NE) that recognizes the first NERS, using the one strand of the extension product of step (b) or the digestion product of step (c) as a template, Amplifying the single-stranded nucleic acid fragment (A1);
(E) providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) that anneals to A1, wherein T2 is, from 5 ′ to 3 ′, the following (i) and (ii):
(I) the sequence of the sense strand of the second NERS, and (ii) a sequence at least substantially complementary to A1;
A process comprising:
(F) amplifying a third single-stranded nucleic acid fragment (A2) using A1 as a template; and (e) characterizing A2 to identify the gene variation in the target nucleic acid;
Wherein A1, A2, or both, have at most 25 nucleotides. 前記第１のＮＥＲＳが、前記第２のＮＥＲＳと同一である、請求項９９に記載の方法。100. The method of claim 99, wherein the first NERS is the same as the second NERS. 標的核酸中の規定された位置の遺伝子バリエーションを同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰ、および該標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、第１の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの相補鎖の３’側に位置する該標的核酸の該第１の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして、
該第２のＯＤＮＰは、第２のＲＥＲＳの１つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸の該第２の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または、
（ｉｉ）該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、第１のＲＥＲＳの１つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの相補鎖の５’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そして
該第２のＯＤＮＰは、第２のＲＥＲＳの１つの鎖の配列および該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程；
（ｂ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で該第１および該第２のＯＤＮＰを伸長して、該第１および該第２のＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する工程；
（ｃ）該第１のＲＥＲＳおよび該第２のＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、工程（ｂ）の伸長産物をテンプレートとして使用して一本鎖核酸フラグメントを指数関数的に増幅する工程であって、該一本鎖核酸フラグメントは、２５ヌクレオチド長以下である、工程；ならびに
（ｄ）該遺伝子バリエーションを同定するために、工程（ｃ）の一本鎖フラグメントの少なくとも１つを特徴付ける工程、
を包含する、方法。A method for identifying a gene variation at a defined position in a target nucleic acid, the method comprising:
(A) forming a mixture of a first ODNP, a second ODNP, and the target nucleic acid, wherein:
(I) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence of one strand of a first restriction endonuclease recognition sequence (RERS) and nucleotides of the first strand of the target nucleic acid located 3 'to the complement of the gene variation. Comprising a nucleotide sequence at least substantially complementary to the sequence; and
The second ODNP is a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of one strand of a second RERS and the nucleotide sequence of the second strand of the target nucleic acid located 3 ′ to the genetic variation. Contains an array or
Or
(Ii) when the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence of one strand of a first RERS and a nucleotide sequence at least substantially identical to the nucleotide sequence of the target nucleic acid located 5 'to the complement of the genetic variation; And wherein said second ODNP comprises a sequence of one strand of a second RERS and a nucleotide sequence at least substantially complementary to a nucleotide sequence of said target nucleic acid located 3 'to said genetic variation;
(B) extending the first and second ODNPs in the presence of deoxyribonucleoside triphosphate and at least one modified deoxyribonucleoside triphosphate to cause both the first and second RERS to Producing an extension product comprising:
(C) using the extension product of step (b) as a template to convert the single-stranded nucleic acid fragment exponentially in the presence of a restriction endonuclease (RE) that recognizes the first RERS and the second RERS. Wherein the single-stranded nucleic acid fragment is no more than 25 nucleotides in length; and (d) at least one of the single-stranded fragments of step (c) for identifying the genetic variation. The process of characterizing one
A method comprising: 前記第１のＲＥＲＳが、前記第２のＲＥＲＳと同一である、請求項１０１に記載の方法。The method of claim 101, wherein the first RERS is the same as the second RERS. 前記第１のＯＤＮＰ、前記第２のＯＤＮＰ、または両方のＯＤＮＰが固定化されている、請求項１０１に記載の方法。102. The method of claim 101, wherein the first ODNP, the second ODNP, or both ODNPs are immobilized. 前記標的核酸が固定化されている、請求項１０１に記載の方法。The method according to claim 101, wherein the target nucleic acid is immobilized. 標的核酸中の規定された位置の遺伝子バリエーションを同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰ、および該標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、第１の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）の１つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの相補鎖の３’側に位置する該標的核酸の該第１の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして、
該第２のＯＤＮＰは、第２のＲＥＲＳの１つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸の該第２の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または、
（ｉｉ）該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、第１のＲＥＲＳの１つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの相補鎖の５’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そして
該第２のＯＤＮＰは、第２のＲＥＲＳの１つの鎖の配列および該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程；
（ｂ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で該第１および該第２のＯＤＮＰを伸長して、該第１および該第２のＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する工程；
（ｃ）該第１のＲＥＲＳおよび該第２のＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、テンプレートとして工程（ｂ）の伸長産物の１つの鎖を用いて、第１の一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程；ならびに
（ｄ）Ａ１にアニーリングする第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該Ｔ２は、５’から３’にむかって、以下の（ｉ）および（ｉｉ）：
（ｉ）第３のＲＥＲＳのセンス鎖の配列、および
（ｉｉ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的な配列、
を含む、工程；
（ｅ）テンプレートとしてＡ１を用いて第３の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する工程；ならびに
（ｆ）該遺伝子バリエーションを同定するために、工程（ｃ）の一本鎖フラグメントの少なくとも１つを特徴付ける工程、
を包含する、方法。A method for identifying a gene variation at a defined position in a target nucleic acid, the method comprising:
(A) forming a mixture of a first ODNP, a second ODNP, and the target nucleic acid, wherein:
(I) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence of one strand of a first restriction endonuclease recognition sequence (RERS) and nucleotides of the first strand of the target nucleic acid located 3 'to the complement of the gene variation. Comprising a nucleotide sequence at least substantially complementary to the sequence; and
The second ODNP is a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of one strand of a second RERS and the nucleotide sequence of the second strand of the target nucleic acid located 3 ′ to the genetic variation. Contains an array or
Or
(Ii) when the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence of one strand of a first RERS and a nucleotide sequence at least substantially identical to the nucleotide sequence of the target nucleic acid located 5 'to the complement of the genetic variation; And wherein said second ODNP comprises a sequence of one strand of a second RERS and a nucleotide sequence at least substantially complementary to a nucleotide sequence of said target nucleic acid located 3 'to said genetic variation;
(B) extending the first and second ODNPs in the presence of deoxyribonucleoside triphosphate and at least one modified deoxyribonucleoside triphosphate to cause both the first and second RERS to Producing an extension product comprising:
(C) using a single strand of the extension product of step (b) as a template in the presence of a restriction endonuclease (RE) that recognizes the first RERS and the second RERS; Amplifying a single-stranded nucleic acid fragment; and (d) providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) that anneals to A1, wherein T2, from 5 ′ to 3 ′, comprises: (I) and (ii):
(I) the sequence of the sense strand of the third RERS, and (ii) a sequence at least substantially complementary to A1;
A process comprising:
(E) amplifying a third single-stranded nucleic acid fragment (A2) using A1 as a template; and (f) at least one of the single-stranded fragments of step (c) to identify the gene variation. The process of characterizing one
A method comprising: 前記第１、第２、および第３のＲＥＲＳが、互いに同一である、請求項１０５に記載の方法。106. The method of claim 105, wherein the first, second, and third RERS are identical to one another. 標的核酸中の規定された位置の遺伝子バリエーションを同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、および該標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの相補鎖の３’側に位置する該標的核酸の該第１の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして、
該第２のＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸の該第２の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または、
（ｉｉ）該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの５’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そして
該第２のＯＤＮＰは、該遺伝子バリエーションの３’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、
該第１および該第２のＯＤＮＰは各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む、工程；
（ｂ）該第１および該第２のＯＤＮＰを伸長して、２つのＮＥＲＳを含む伸長産物を生成する工程；
（ｃ）該ＮＥＲＳを認識する１つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、テンプレートとして工程（ｂ）の伸長産物を用いて一本鎖核酸フラグメントを指数関数的に増幅する工程であって、該一本鎖核酸フラグメントは、多くて２５ヌクレオチドを有する、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の一本鎖フラグメントの少なくとも１つを特徴付けることによって、該遺伝子バリエーションを同定する工程、
を包含する、方法。A method for identifying a gene variation at a defined position in a target nucleic acid, the method comprising:
(A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and the target nucleic acid, wherein:
(I) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence that is at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the first strand of the target nucleic acid located 3 ′ to the complementary strand of the genetic variation; and
The second ODNP comprises a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the second strand of the target nucleic acid located 3 'to the genetic variation;
Or
(Ii) when the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence at least substantially identical to the nucleotide sequence of the target nucleic acid located 5 'to the gene variation, and the second ODNP comprises a nucleotide sequence 3' to the gene variation. A nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the target nucleic acid located at
The first and the second ODNP each further comprising a nucleotide sequence of a sense strand of a nicking endonuclease recognition sequence (NERS);
(B) extending the first and second ODNPs to produce an extension product comprising two NERSs;
(C) exponentially amplifying a single-stranded nucleic acid fragment using the extension product of step (b) as a template in the presence of one or more nicking endonucleases (NE) that recognize said NERS Wherein the single-stranded nucleic acid fragment has at most 25 nucleotides; and (d) identifying the gene variation by characterizing at least one of the single-stranded fragments in step (c);
A method comprising: 前記第１のＯＤＮＰ中の前記ＮＥＲＳが、前記第２のＯＤＮＰ中の前記ＮＥＲＳと同一である、請求項１０７に記載の方法。108. The method of claim 107, wherein the NERS in the first ODNP is the same as the NERS in the second ODNP. 前記遺伝子バリエーションが、単一ヌクレオチド多型である、請求項１０７に記載の方法。108. The method of claim 107, wherein said genetic variation is a single nucleotide polymorphism. 前記遺伝子バリエーションが、疾患に関連する、請求項１０７に記載の方法。108. The method of claim 107, wherein said genetic variation is associated with a disease. 前記疾患が、ヒトの遺伝的疾患である、請求項１０７に記載の方法。108. The method of claim 107, wherein said disease is a human genetic disease. 前記遺伝子バリエーションが、病原性微生物の薬物耐性と関連する、請求項１０７に記載の方法。108. The method of claim 107, wherein said genetic variation is associated with drug resistance of a pathogenic microorganism. 前記ニック形成剤が、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである、請求項１０８に記載の方法。The nicking agent is N.I. 109. The method of claim 108, wherein the method is BstNB I. 前記工程（ｃ）が、等温条件下で実施される、請求項１０７に記載の方法。108. The method of claim 107, wherein step (c) is performed under isothermal conditions. 前記工程（ｃ）が、５０℃〜７０℃で実施される、請求項１１４に記載の方法。115. The method of claim 114, wherein step (c) is performed at 50C to 70C. 前記工程（ｃ）が、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択されるＤＮＡポリメラーゼの存在下で実施される、請求項１０７に記載の方法。The step (c) comprises exo - Vent, exo - Deep Vent, exo - Bst, exo - Pfu, exo - Bca, Klenow fragment of DNA polymerase I, T5 DNA polymerase, Phi29 DNA polymerase, phage M2 DNA polymerase, phage PhiPRD1 108. The method of claim 107, wherein the method is performed in the presence of a DNA polymerase selected from the group consisting of DNA polymerase, sequencenase, PRD1 DNA polymerase, 9 ° Nm ™ DNA polymerase, and T4 DNA polymerase homoenzyme. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、または９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼである、請求項１１６に記載の方法。117. The method of claim 116, wherein the DNA polymerase is exo - Vent polymerase, exo - Deep Vent polymerase, exo - Bst polymerase, exo - Bca polymerase, or 9 ° Nm ™ DNA polymerase. 前記工程（ｃ）の前記増幅された一本鎖フラグメントが、１７ヌクレオチド以下を含む、請求項１０７に記載の方法。108. The method of claim 107, wherein said amplified single-stranded fragment of step (c) comprises 17 nucleotides or less. 前記工程（ｃ）の前記増幅された一本鎖フラグメントが、１２ヌクレオチド以下を含む、請求項１１８に記載の方法。119. The method of claim 118, wherein said amplified single-stranded fragment of step (c) comprises no more than 12 nucleotides. 前記工程（ｃ）の前記増幅された一本鎖フラグメントが、８ヌクレオチド以下を含む、請求項１１９に記載の方法。120. The method of claim 119, wherein said amplified single-stranded fragment of step (c) comprises no more than 8 nucleotides. 前記工程（ｄ）の特徴付けが、少なくとも部分的に、質量分析、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、および電気泳動からなる群より選択される技術の使用により実施される、請求項１０７に記載の方法。108. The method of claim 107, wherein the characterization of step (d) is performed, at least in part, by use of a technique selected from the group consisting of mass spectrometry, liquid chromatography, fluorescence polarization, and electrophoresis. . 前記工程（ｄ）の特徴付けが、少なくとも部分的に、液体クロマトグラフィーの使用により実施される、請求項１２１に記載の方法。122. The method of claim 121, wherein the characterization of step (d) is performed, at least in part, by the use of liquid chromatography. 前記工程（ｄ）の特徴付けが、少なくとも部分的に、質量分析の使用により実施される、請求項１２１に記載の方法。122. The method of claim 121, wherein the characterization of step (d) is performed, at least in part, by use of mass spectrometry. 前記工程（ｄ）の特徴付けが、少なくとも部分的に、液体クロマトグラフィーおよび質量分析の両方により実施される、請求項１２１に記載の方法。122. The method of claim 121, wherein the characterization of step (d) is performed, at least in part, by both liquid chromatography and mass spectrometry. 前記第１のＯＤＮＰ、前記第２のＯＤＮＰ、またはその両方が固定化されている、請求項１０７に記載の方法。108. The method of claim 107, wherein the first ODNP, the second ODNP, or both are immobilized. 前記標的核酸が固定化されている、請求項１０７に記載の方法。108. The method of claim 107, wherein said target nucleic acid is immobilized. 標的核酸中の規定された位置の遺伝的バリエーションを同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰ、および該サンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該標的核酸が第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第一のＯＤＮＰは、該遺伝的バリエーションの相補鎖の３’側に位置する標的核酸の第一の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のＯＤＮＰは、該遺伝的バリエーションの３’側に位置する標的核酸の第二の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または、
（ｉｉ）該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第一のＯＤＮＰは、該遺伝的バリエーションの５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のＯＤＮＰは、該遺伝的バリエーションの３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程であって、
該第一のＯＤＮＰおよび該第二のＯＤＮＰは、各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む、工程；
（ｂ）該第一のＯＤＮＰおよび該第二のＯＤＮＰを伸長して、２つのＮＥＲＳを含む伸長産物を産生する工程；
（ｃ）該ＮＥＲＳを認識する１つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、テンプレートとして工程（ｂ）の伸長産物の一方の鎖を用いて第一の一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程；
（ｄ）Ａ１にアニーリングするような第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、Ｔ２は、５’から３’の方向で、以下：
（ｉ）ＮＥＲＳのセンス鎖の配列、および
（ｉｉ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的な配列
を含む工程；
（ｅ）テンプレートとしてＡ１を用いて、第三の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する工程；
（ｆ）工程（ｃ）の一本鎖核酸フラグメントを特徴付け、それにより該遺伝的バリエーションを同定する工程、
を包含し、ここで、Ａ１、Ａ２またはこれらの両方が長くても２５のヌクレオチドを有する、方法。A method for identifying a genetic variation at a defined position in a target nucleic acid, comprising:
(A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and a nucleic acid molecule of the sample, wherein:
(I) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence that is at least substantially complementary to a nucleotide sequence of a first strand of a target nucleic acid located 3 ′ to a complementary strand of the genetic variation, and the second ODNP Comprises a nucleotide sequence at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the second strand of the target nucleic acid located 3 'to the genetic variation;
Or
(Ii) when the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence at least substantially identical to the nucleotide sequence of a target nucleic acid located 5 'to the genetic variation, and the second ODNP comprises a 3' A nucleotide sequence that is at least substantially complementary to the nucleotide sequence of the flanking target nucleic acid,
The first ODNP and the second ODNP each further comprising a nucleotide sequence of a sense strand of a nicking endonuclease recognition sequence (NERS);
(B) extending the first ODNP and the second ODNP to produce an extension product comprising two NERSs;
(C) amplifying the first single-stranded nucleic acid fragment using one strand of the extension product of step (b) as a template in the presence of one or more nicking endonucleases (NE) recognizing said NERS Performing the step;
(D) providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) that anneals to A1, wherein T2 is in the 5 ′ to 3 ′ direction,
(I) comprising the sequence of the sense strand of NERS, and (ii) a sequence at least substantially complementary to A1;
(E) amplifying a third single-stranded nucleic acid fragment (A2) using A1 as a template;
(F) characterizing the single-stranded nucleic acid fragment of step (c), thereby identifying the genetic variation;
Wherein A1, A2 or both have at most 25 nucleotides. 前記第一のＯＤＮＰ中のＮＥＲＳ、前記第二のＯＤＮＰ中のＮＥＲＳ、およびＴ２中のＮＥＲＳが互いに同一である、請求項１２７に記載の方法。128. The method of claim 127, wherein NERS in the first ODNP, NERS in the second ODNP, and NERS in T2 are the same. 前記遺伝的バリエーションが、一塩基多型である、請求項１２７に記載の方法。130. The method of claim 127, wherein said genetic variation is a single nucleotide polymorphism. 前記遺伝的バリエーションが、疾患に関連する、請求項１２７に記載の方法。130. The method of claim 127, wherein said genetic variation is associated with a disease. 前記疾患が、ヒト遺伝病である、請求項１２７に記載の方法。130. The method of claim 127, wherein said disease is a human genetic disease. 前記遺伝的バリエーションが病原性微生物の薬物耐性に関連する、請求項１２７に記載の方法。130. The method of claim 127, wherein said genetic variation is associated with drug resistance of a pathogenic microorganism. 前記ニック形成剤が、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである、請求項１２８に記載の方法。The nicking agent is N.I. 129. The method of claim 128, wherein the method is BstNB I. 工程（ｃ）が、等温条件下で実施される、請求項１２７に記載の方法。130. The method of claim 127, wherein step (c) is performed under isothermal conditions. 工程（ｃ）が、５０℃〜７０℃で実施される、請求項１３４に記載の方法。135. The method of claim 134, wherein step (c) is performed at 50C to 70C. 工程（ｃ）が、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＲＰＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で実施される、請求項１２７に記載の方法。Step (c) comprises exo - Vent, exo - Deep Vent, exo - Bst, exo - Pfu, exo - Bca, Klenow fragment of DNA polymerase I, T5 DNA polymerase, Phi29 DNA polymerase, phage M2 DNA polymerase, phage PhiPRD1 130. The method of claim 127, wherein the method is performed in the presence of a DNA polymerase selected from the group consisting of DNA polymerase, Sequenase, RPDl DNA polymerase, 9 ° Nm ™ DNA polymerase and T4 DNA polymerase homoenzyme. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、または９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３６に記載の方法。137. The method of claim 136, wherein the DNA polymerase is exo - Vent, exo - Deep Vent, exo - Bst, exo - Bca, or 9 ° Nm ™ DNA polymerase. 前記工程（ｃ）の増幅された一本鎖フラグメントが、１７以下のヌクレオチドを含む、請求項１２７に記載の方法。130. The method of claim 127, wherein the amplified single-stranded fragment of step (c) comprises 17 or fewer nucleotides. 前記工程（ｃ）の増幅された一本鎖フラグメントが、１２以下のヌクレオチドを含む、請求項１３８に記載の方法。139. The method of claim 138, wherein the amplified single-stranded fragment of step (c) comprises 12 or fewer nucleotides. 前記工程（ｃ）の増幅された一本鎖フラグメントが、８以下のヌクレオチドを含む、請求項１３９に記載の方法。140. The method of claim 139, wherein the amplified single-stranded fragment of step (c) comprises 8 or fewer nucleotides. 工程（ｄ）の特徴付ける工程が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光法、および電気泳動より選択される技術を少なくとも部分的に用いることにより実施される、請求項１２７に記載の方法。130. The method of claim 127, wherein the characterizing step (d) is performed by using, at least in part, a technique selected from mass spectrometry, liquid chromatography, fluorescence polarization, and electrophoresis. 工程（ｄ）の特徴付ける工程が、液体クロマトグラフィーを少なくとも部分的に用いることによって実施される、請求項１４１に記載の方法。142. The method of claim 141, wherein the characterizing step (d) is performed by at least in part using liquid chromatography. 工程（ｄ）の特徴付ける工程が、質量分析法を少なくとも部分的に用いることによって実施される、請求項１４１に記載の方法。142. The method of claim 141, wherein the characterizing step (d) is performed at least in part by using mass spectrometry. 工程（ｄ）の特徴付ける工程が、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の両方を少なくとも部分的に用いることによって実施される、請求項１４１に記載の方法。142. The method of claim 141, wherein the characterizing step (d) is performed by at least partially using both liquid chromatography and mass spectrometry. 前記第一のＯＤＮＰ、前記第二のＯＤＮＰ、またはそれらの両方が、固定されている、請求項１２７に記載の方法。130. The method of claim 127, wherein the first ODNP, the second ODNP, or both are fixed. 前記標的核酸が、固定されている、請求項１２７に記載の方法。130. The method of claim 127, wherein said target nucleic acid is immobilized. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：
（ｉ）該サンプルの核酸分子
（ｉｉ）第一の一本鎖核酸分子（Ｔ１）であって、該第一の一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
（ａ）該標的核酸に少なくとも実質的に相補的である第一の配列、
（ｂ）第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列、および
（ｃ）長くても２５ヌクレオチドを有する第二の配列
を含む、第一の一本鎖核酸分子、
（ｉｉｉ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）であって、該第二の一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
（ａ）該Ｔ１の第二の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
（ｂ）第二のＮＡＲＳのセンス鎖の配列
を含む、第二の一本鎖核酸分子；ならびに
（ｉｖ）該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
（Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、一本鎖核酸分子（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件で該混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising:
(A) forming a mixture comprising:
(I) a nucleic acid molecule of the sample (ii) a first single-stranded nucleic acid molecule (T1), wherein the first single-stranded nucleic acid molecule is in the 3 ′ to 5 ′ direction,
(A) a first sequence that is at least substantially complementary to the target nucleic acid;
A first single-stranded nucleic acid molecule comprising: (b) the sequence of the antisense strand of a first nicking agent recognition sequence (NARS); and (c) a second sequence having at most 25 nucleotides.
(Iii) a second single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the second single-stranded nucleic acid molecule is in the 3 ′ to 5 ′ direction,
A second single-stranded nucleic acid molecule comprising: (a) a sequence that is at least substantially identical to the second sequence of T1, and (b) a sequence of the sense strand of the second NARS; A first nicking endonuclease (NA) that recognizes a first NARS, a second NA that recognizes the second NARS, a DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates;
(B) maintaining the mixture under conditions that exponentially amplify the single-stranded nucleic acid molecule (A2) when the target nucleic acid is present in the sample; and (C) determining the presence or absence of A2. Detecting to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample;
A method comprising: 前記第一のＮＡＲＳおよび前記第二のＮＡＲＳが同一であり、かつ１つのニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能である、請求項１４７に記載の方法。148. The method of claim 147, wherein said first NARS and said second NARS are identical and are recognizable by one nicking endonuclease. 前記Ｔ１が固定されている、請求項１４７に記載の方法。148. The method of claim 147, wherein said Tl is fixed. 前記Ｔ２が固定されている、請求項１４７に記載の方法。150. The method of claim 147, wherein said T2 is fixed. 前記標的核酸が、固定されている、請求項１４７に記載の方法。147. The method of claim 147, wherein said target nucleic acid is immobilized. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：
（ｉ）該サンプルの核酸分子
（ｉｉ）第一の一本鎖核酸分子（Ｔ１）であって、該第一の一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
（ａ）該標的核酸に少なくとも実質的に相補的である第一の配列、および
（ｂ）第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列、
を含む、第一の一本鎖核酸分子、
（ｉｉｉ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）であって、該第二の一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
（ａ）該第一のＮＡＲＳのセンス鎖の配列の３’側に位置するＴ１の配列に少なくとも実質的に相補的な配列、および
（ｂ）第二のＮＡＲＳのセンス鎖の配列
を含む、第二の一本鎖核酸分子；ならびに
（ｉｖ）該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
（Ｂ）一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件で該混合物を維持する工程であって、該一本鎖核酸分子は、
（ｉ）該標的核酸に少なくとも実質的に相補的であり、かつ
（ｉｉ）長くても２５ヌクレオチドを有する、
工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising:
(A) forming a mixture comprising:
(I) a nucleic acid molecule of the sample (ii) a first single-stranded nucleic acid molecule (T1), wherein the first single-stranded nucleic acid molecule is in the 3 ′ to 5 ′ direction,
(A) a first sequence that is at least substantially complementary to the target nucleic acid, and (b) a sequence of a sense strand of a first nicking agent recognition sequence (NARS);
Comprising a first single-stranded nucleic acid molecule,
(Iii) a second single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the second single-stranded nucleic acid molecule is in the 3 ′ to 5 ′ direction,
(A) a sequence that is at least substantially complementary to the sequence of T1 located 3 ′ to the sequence of the sense strand of the first NARS, and (b) a sequence of the sense strand of the second NARS. And (iv) a first nicking endonuclease (NA) that recognizes the first NARS, a second NA that recognizes the second NARS, a DNA polymerase, and one The above deoxynucleoside triphosphate;
(B) maintaining the mixture under conditions for amplifying the single-stranded nucleic acid molecule (A2), wherein the single-stranded nucleic acid molecule comprises:
(I) at least substantially complementary to the target nucleic acid, and (ii) having at most 25 nucleotides,
And (C) detecting the presence or absence of A2 to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample.
A method comprising: 前記第一のＮＡＲＳと前記第二のＮＡＲＳとが、同一である、請求項１５２に記載の方法。153. The method of claim 152, wherein said first NARS and said second NARS are the same. 前記Ｔ１が固定されている、請求項１５２に記載の方法。153. The method of claim 152, wherein said Tl is fixed. 前記Ｔ２が固定されている、請求項１５２に記載の方法。153. The method of claim 152, wherein said T2 is fixed. 前記標的配列が固定されている、請求項１５２に記載の方法。153. The method of claim 152, wherein said target sequence is immobilized. サンプル中の、第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：
（ｉ）該サンプルの核酸分子
（ｉｉ）一本鎖核酸分子（Ｔ２）であって、該一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
（ａ）該第一のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する標的核酸の位一部分に少なくとも実質的に相補的である配列、および
（ｂ）第二のＮＥＲＳのセンス鎖の配列、
を含む、一本鎖核酸分子、
（ｉｉｉ）該第一のＮＥＲＳを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）、該第二のＮＥＲＳを認識する第二のＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
（Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在する場合に、一本鎖核酸分子（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件で該混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid comprising a first nicking endonuclease recognition sequence (NERS) in a sample, the method comprising:
(A) forming a mixture comprising:
(I) a nucleic acid molecule of the sample (ii) a single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the single-stranded nucleic acid molecule is in the 3 ′ to 5 ′ direction,
(A) a sequence that is at least substantially complementary to a portion of the target nucleic acid located 5 'to the sequence of the first NERS antisense strand; and (b) the sequence of the second NERS sense strand. ,
A single-stranded nucleic acid molecule,
(Iii) a first nicking endonuclease (NE) that recognizes the first NERS, a second NE that recognizes the second NERS, a DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates;
(B) maintaining the mixture under conditions that exponentially amplify the single-stranded nucleic acid molecule (A2) when the target nucleic acid is present in the sample; and (C) the presence or absence of A2 Detecting the presence or absence of the target nucleic acid in the sample,
A method comprising: 前記第一のＮＥＲＳが、前記第二のＮＥＲＳと同一である、請求項１５７に記載の方法。157. The method of claim 157, wherein the first NERS is the same as the second NERS. サンプル中の、第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）該標的核酸分子
（ｉｉ）第一の一本鎖核酸分子（Ｔ１）であって、該第一の一本鎖核酸分子は、該標的核酸の１つの鎖に実質的に同一であり、かつ該第一のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、第一の一本鎖核酸分子、
（ｉｉｉ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）であって、該第二の一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
（ａ）該第一のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置するＴ１の一部分に少なくとも実質的に同一な配列、および
（ｂ）第二のＮＥＲＳのセンス鎖の配列
を含む、第二の一本鎖核酸分子；
（ｉｖ）該第一のＮＥＲＳを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；該第二のＮＥＲＳを認識する第二のＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在する場合に、一本鎖核酸分子（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件で該混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid comprising a first nicking endonuclease recognition sequence (NERS) in a sample, the method comprising:
(A) The following:
(I) the target nucleic acid molecule (ii) a first single-stranded nucleic acid molecule (T1), wherein the first single-stranded nucleic acid molecule is substantially identical to one strand of the target nucleic acid A first single-stranded nucleic acid molecule, comprising the sequence of the antisense strand of the first NERS;
(Iii) a second single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the second single-stranded nucleic acid molecule is in the 3 ′ to 5 ′ direction,
(A) a sequence at least substantially identical to a portion of T1 located 5 ′ to the sequence of the antisense strand of the first NERS, and (b) a sequence of the sense strand of the second NERS. Two single-stranded nucleic acid molecules;
(Iv) a first nicking endonuclease (NE) that recognizes the first NERS; a second NE that recognizes the second NERS, a DNA polymerase, and one or more deoxynucleoside triphosphates;
Forming a mixture comprising:
(B) maintaining the mixture under conditions that exponentially amplify the single-stranded nucleic acid molecule (A2) when the target nucleic acid is present in the sample; and (C) the presence or absence of A2 Detecting the presence or absence of the target nucleic acid in the sample,
A method comprising: 前記第一のＮＥＲＳが、前記第二のＮＥＲＳと同一である、請求項１５９に記載の方法。160. The method of claim 159, wherein the first NERS is the same as the second NERS. Ａ２が、長くても２５ヌクレオチドを有する、請求項１５９に記載の方法。160. The method of claim 159, wherein A2 has at most 25 nucleotides. 前記Ｔ１が固定されている、請求項１５９に記載の方法。160. The method of claim 159, wherein said Tl is fixed. 前記標的核酸が固定されている、請求項１５９に記載の方法。160. The method of claim 159, wherein said target nucleic acid is immobilized. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰ、および該サンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該標的核酸が第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第一のＯＤＮＰは、第一の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の鎖の第一の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のＯＤＮＰは、該標的核酸の第二の鎖の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の第二の鎖の中の第一の部分の相補鎖の３’側に位置するか、
または、
（ｉｉ）該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第一のＯＤＮＰは、第一のＲＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の部分と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のＯＤＮＰは、該標的核酸の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の中の第一の部分の相補鎖の５’側に位置する、工程；
（Ｂ）該混合物を、以下の条件：該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、該第一のＲＥＲＳおよび該第二のＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）、デオキシリボヌクレオシド三リン酸ならびに少なくとも１つの改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ならびにＤＮＡポリメラーゼの存在下で、一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件で維持する工程であって、ここで、Ａ２は、２５ヌクレオチド長以下である、工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising:
(A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and a nucleic acid molecule of the sample, wherein:
(I) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence of a sense strand of a first restriction endonuclease recognition sequence (RERS) and a nucleotide sequence at least substantially complementary to a first portion of a first strand of the target nucleic acid. And wherein the second ODNP comprises a nucleotide sequence that is at least substantially complementary to a second portion of a second strand of the target nucleic acid, and comprises a sequence of a sense strand of a second RERS; The second portion is located 3 'to the complementary strand of the first portion in the second strand of the target nucleic acid;
Or
(Ii) when the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence of a sense strand of a first RERS, and a nucleotide sequence that is at least substantially identical to a first portion of the target nucleic acid, and the second ODNP comprises A nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence at least substantially complementary to a second portion of the nucleic acid, and comprising a sequence of a sense strand of a second RERS, wherein the second portion comprises a sequence of a first portion in the target nucleic acid. A step located 5 ′ to the complementary strand;
(B) combining the mixture with the following conditions: a restriction endonuclease (RE) that recognizes the first RERS and the second RERS when the target nucleic acid is present in the sample, a deoxyribonucleoside triphosphate; Maintaining the single-stranded nucleic acid fragment (A2) in conditions of exponentially amplifying the single-stranded nucleic acid fragment (A2) in the presence of at least one modified deoxyribonucleoside triphosphate and a DNA polymerase, wherein A2 comprises: (C) detecting the presence or absence of A2 to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample;
A method comprising: 前記第一のＲＥＲＳが、前記第二のＲＥＲＳと同一である、請求項１６４に記載の方法。169. The method of claim 164, wherein the first RERS is the same as the second RERS. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰ、および該サンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該標的核酸が第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第一のＯＤＮＰは、第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の鎖の第一の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のＯＤＮＰは、該標的核酸の第二の鎖の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の第二の鎖の中の第一の部分の相補鎖の３’側に位置するか、
または、
（ｉｉ）該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第一のＯＤＮＰは、第一のＮＥＲＳのセンス鎖の配列、および該標的核酸の第一の部分と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のＯＤＮＰは、該標的核酸の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の中の第一の部分の相補鎖の５’側に位置する、工程；
（Ｂ）該混合物を、以下の条件：該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、該第一のＮＥＲＳおよび該第二のＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ならびにＤＮＡポリメラーゼの存在下で、一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件で維持する工程であって、ここで、Ａ２は、２５ヌクレオチド長以下である、工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising:
(A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and a nucleic acid molecule of the sample, wherein:
(I) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand,
The first ODNP is a nucleotide sequence of a sense strand of a first nicking endonuclease recognition sequence (NERS) and a nucleotide sequence at least substantially complementary to a first portion of a first strand of the target nucleic acid. And the second ODNP comprises a nucleotide sequence at least substantially complementary to a second portion of a second strand of the target nucleic acid, and comprises a sequence of a sense strand of a second RERS; The second portion is located 3 'to the complement of the first portion in the second strand of the target nucleic acid;
Or
(Ii) when the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid,
The first ODNP comprises a sequence of a sense strand of a first NERS, and a nucleotide sequence that is at least substantially identical to a first portion of the target nucleic acid, and wherein the second ODNP comprises a target nucleic acid. A nucleotide sequence that is at least substantially complementary to a second portion of the target nucleic acid and comprises a sequence of the sense strand of a second NERS, wherein the second portion is complementary to a first portion of the target nucleic acid. A step located 5 ′ to the strand;
(B) the mixture is subjected to the following conditions: a nicking endonuclease (NE), a deoxyribonucleoside triphosphate that recognizes the first NERS and the second NERS when the target nucleic acid is present in the sample; And maintaining the single-stranded nucleic acid fragment (A2) under conditions that exponentially amplify the single-stranded nucleic acid fragment (A2) in the presence of a DNA polymerase, wherein A2 is 25 nucleotides or less in length; C) detecting the presence or absence of A2 to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample;
A method comprising: 前記第一のＲＥＲＳが、前記第二のＲＥＲＳと同一である、請求項１６６に記載の方法。169. The method of claim 166, wherein the first RERS is the same as the second RERS. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰ、および該サンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該標的核酸が第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖核酸である場合に、
該第一のＯＤＮＰは、第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の鎖の第一の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のＯＤＮＰは、該標的核酸の第二の鎖の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の第二の鎖の中の第一の部分の相補鎖の３’側に位置するか、
または、
（ｉｉ）該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第一のＯＤＮＰは、第一のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の部分と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のＯＤＮＰは、該標的核酸の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の中の第一の部分の相補鎖の５’側に位置する、工程；
（Ｂ）該混合物を、以下の条件：該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、
（ｉ）該第一のＯＤＮＰおよび該第二のＯＤＮＰを伸長して、該第一のＮＥＲＳおよび該第二のＮＥＲＳの両方を含む伸長産物を産生し；
（ｉｉ）該第一のＮＥＲＳおよび該第二のＮＥＲＳを認識する１つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、テンプレートとして工程（ｂ）の伸長産物の一方の鎖を用いて第一の一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅し；
（ｉｉｉ）Ａ１にアニーリングし得る第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）の存在下で、テンプレートとしてＡ１を用いて、第三の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する条件であって、ここで、Ａ１、Ａ２またはこれらの両方が、長くても２５ヌクレオチドを有し、そして、ここで、Ｔ２が、５’から３’の方向で、以下：
（ａ）第三のＮＥＲＳのセンス鎖の配列、および
（ｂ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的である配列
を含む、条件、
に供する工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising:
(A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP, and a nucleic acid molecule of the sample, wherein:
(I) when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid having a first strand and a second strand,
The first ODNP is a nucleotide sequence of a sense strand of a first nicking endonuclease recognition sequence (NERS) and a nucleotide sequence at least substantially complementary to a first portion of a first strand of the target nucleic acid. And wherein the second ODNP comprises a nucleotide sequence that is at least substantially complementary to a second portion of a second strand of the target nucleic acid, and comprises a sequence of a sense strand of a second NERS; The second portion is located 3 'to the complement of the first portion in the second strand of the target nucleic acid;
Or
(Ii) when the target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid,
The first ODNP comprises a nucleotide sequence of a sense strand of a first NERS, and a nucleotide sequence at least substantially identical to a first portion of the target nucleic acid, and the second ODNP comprises A nucleotide sequence that is at least substantially complementary to a second portion of the nucleic acid, and comprises a sequence of a sense strand of a second NERS, wherein the second portion comprises a sequence of the first portion in the target nucleic acid. A step located 5 ′ to the complementary strand;
(B) the mixture is subjected to the following conditions: when the target nucleic acid is present in the sample,
(I) extending the first ODNP and the second ODNP to produce an extension product comprising both the first NERS and the second NERS;
(Ii) using one strand of the extension product of step (b) as a template in the presence of one or more nicking endonucleases (NE) that recognize the first NERS and the second NERS; Amplifying one single-stranded nucleic acid fragment (A1);
(Iii) conditions for amplifying a third single-stranded nucleic acid fragment (A2) using A1 as a template in the presence of a second single-stranded nucleic acid molecule (T2) capable of annealing to A1, Wherein A1, A2 or both have at most 25 nucleotides, and where T2 is in the 5 'to 3' direction, the following:
A condition comprising (a) the sequence of the sense strand of the third NERS, and (b) a sequence that is at least substantially complementary to A1.
And (C) detecting the presence or absence of A2 to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample.
A method comprising: 前記第一、第二および第三のＮＥＲＳが同一である、請求項１６８に記載の方法。168. The method of claim 168, wherein said first, second and third NERS are the same. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（Ａ）以下：
（ｉ）該サンプルの核酸分子、
（ｉｉ）一本鎖核酸プローブ（Ｔ１）であって、該一本鎖核酸プローブ（Ｔ１）は、３’から５’の方向で、該標的核酸の５’部分と少なくとも実質的に相補的な配列、および第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列を含む、一本鎖核酸プローブ（Ｔ１）、
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）存在する場合、該標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子を、該標的核酸にハイブリダイズしなかったプローブ分子から分離する工程；
（Ｃ）存在する場合、該標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子、および該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成剤（ＮＡ）の存在下で、増幅反応を実施する工程；
（Ｄ）一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、５’から３’の方向で、以下：
（ｉ）第二のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および
（ｉｉ）該第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置する該第一の一本鎖核酸プローブの一部と少なくとも実質的に同一である配列、
を含む、工程；
（Ｅ）該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡの存在下で増幅反応を実施する工程；
（Ｆ）工程（Ｅ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising the following steps:
(A) The following:
(I) a nucleic acid molecule of the sample,
(Ii) a single-stranded nucleic acid probe (T1), wherein the single-stranded nucleic acid probe (T1) is at least substantially complementary to the 5 ′ portion of the target nucleic acid in the 3 ′ to 5 ′ direction. A single-stranded nucleic acid probe (T1) comprising the sequence and the sequence of the antisense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS);
Forming a mixture comprising:
(B) separating, if present, probe molecules that have hybridized to the target nucleic acid from probe molecules that have not hybridized to the target nucleic acid;
(C) performing an amplification reaction in the presence of a probe molecule hybridized to the target nucleic acid, if present, and a first nicking agent (NA) that recognizes the first NARS;
(D) providing a single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the single-stranded nucleic acid molecule (T2) is in the 5 ′ to 3 ′ direction,
(I) a sequence of the sense strand of the second NARS, and (ii) a part of the first single-stranded nucleic acid probe located 5 ′ to the sequence of the antisense strand of the first NARS. A sequence that is at least substantially identical,
A process comprising:
(E) performing an amplification reaction in the presence of a second NA that recognizes the second NARS;
(F) detecting the presence or absence of the amplification product of step (E) to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample;
A method comprising: 前記第一のＮＡＲＳおよび第二のＮＡＲＳが同一である、請求項１７０に記載の方法。170. The method of claim 170, wherein the first NARS and the second NARS are the same. 前記サンプルの核酸分子が、一本鎖であるかまたは一本鎖に変性されており、そしてその５’末端を介して固定化されている、請求項１７０に記載の方法。170. The method of claim 170, wherein the nucleic acid molecules of the sample are single-stranded or modified to single-stranded, and immobilized via its 5 'end. 前記サンプルの核酸分子が固定化されている、請求項１７０に記載の方法。170. The method of claim 170, wherein the nucleic acid molecules of the sample are immobilized. 前記一本鎖核酸プローブＴ１が固定化されている、請求項１７０に記載の方法。The method according to claim 170, wherein said single-stranded nucleic acid probe T1 is immobilized. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（Ａ）以下：
（ｉ）該サンプルの核酸分子、
（ｉｉ）部分的に二本鎖の核酸プローブであって、該部分的に二本鎖の核酸プローブは、以下：
（ａ）第一のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、該第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列またはこれら両方；および
（ｂ）該鎖自体またはその伸長産物が、該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成剤（ＮＡ）によってニック形成可能なニック形成部位（ＮＳ）を含む、該鎖中の５’オーバーハング、または
該鎖もその伸長産物も該ＮＳを含まない、該鎖中の３’オーバーハングを含む、部分的に二本鎖の核酸プローブ、
を含む混合物を形成する工程であって、ここで、各オーバーハングは、該標的核酸と少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程；
（Ｂ）存在する場合、該標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子を、該標的核酸にハイブリダイズしなかったプローブ分子から分離する工程；
（Ｃ）存在する場合、該標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子、および該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成剤（ＮＡ）の存在下で、増幅反応を実施する工程；
（Ｄ）一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、５’から３’の方向で、以下：
（ｉ）第二のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および
（ｉｉ）該第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する該核酸プローブの一部と少なくとも実質的に相同な配列、
を含む、工程；
（Ｅ）該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡの存在下で増幅反応を実施する工程；
（Ｆ）工程（Ｅ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, the method comprising the following steps:
(A) The following:
(I) a nucleic acid molecule of the sample,
(Ii) a partially double-stranded nucleic acid probe, wherein the partially double-stranded nucleic acid probe comprises:
(A) the sequence of the sense strand of the first NARS, the sequence of the antisense strand of the first NARS, or both; and (b) the sequence itself or an extension product thereof recognizes the first NARS. A 5 'overhang in the strand that contains a nicking site (NS) that can be nicked by a nicking agent (NA), or a 3' overhang in the strand that contains neither the strand nor its extension product the NS. 'Partially double-stranded nucleic acid probe, including overhangs
Forming a mixture comprising: wherein each overhang comprises a nucleic acid sequence that is at least substantially complementary to the target nucleic acid;
(B) separating, if present, probe molecules that have hybridized to the target nucleic acid from probe molecules that have not hybridized to the target nucleic acid;
(C) performing an amplification reaction in the presence of a probe molecule hybridized to the target nucleic acid, if present, and a first nicking agent (NA) that recognizes the first NARS;
(D) providing a single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the single-stranded nucleic acid molecule (T2) is in the 5 ′ to 3 ′ direction,
(I) a sequence of the sense strand of the second NARS, and (ii) a sequence at least substantially homologous to a portion of the nucleic acid probe located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NARS.
A process comprising:
(E) performing an amplification reaction in the presence of a second NA that recognizes the second NARS;
(F) detecting the presence or absence of the amplification product of step (E) to determine the presence or absence of the target nucleic acid in the sample;
A method comprising: 前記第一のＮＡＲＳおよび第二のＮＡＲＳが同一である、請求項１７５に記載の方法。177. The method of claim 175, wherein the first NARS and the second NARS are the same. 前記サンプルの核酸分子が固定化されている、請求項１７５に記載の方法。178. The method of claim 175, wherein the nucleic acid molecules of the sample are immobilized. ｃＤＮＡ分子中の２つの特定のエキソン間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（Ａ）少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１）を提供する工程であって、該少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１）は、以下：
（ｉ）第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列および該第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列のうち、少なくとも１つ、ならびに
（ｉｉ）該ｃＤＮＡ分子の一部の少なくとも１つの鎖であって、該一部は、該２つのエキソン間の連結部を含むと疑われる、一部、
を含む、工程；
（Ｂ）第一のＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第一の一本鎖核酸分子（Ａ１）を増幅する工程であって、ここで、該増幅する工程は、該ｃＤＮＡの一部を該ポリメラーゼについてのテンプレートとして使用する、工程；
（Ｃ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、５’から３’の方向で、以下：
（ｉ）第二のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および
（ｉｉ）Ａ１と少なくとも実質的に相補的な配列、
を含む、工程；
（Ｄ）Ｔ２、Ａ１、該第一のＮＡ、該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡ、該ＤＮＡポリメラーゼ、および該デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第三の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する工程であって、ここで、Ａ２は、Ａ１と少なくとも実質的に相補的である、工程；ならびに
（Ｅ）Ａ２を検出および／または特徴づけして、該ｃＤＮＡ分子中の連結部の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a junction between two specific exons in a cDNA molecule, comprising the following steps:
(A) providing an at least partially double-stranded nucleic acid molecule (N1), wherein the at least partially double-stranded nucleic acid molecule (N1) comprises:
(I) at least one of the sequence of the sense strand of the first nicking agent recognition sequence (NARS) and the sequence of the antisense strand of the first NARS, and (ii) at least a portion of the cDNA molecule. A chain, wherein the portion is suspected of containing a connection between the two exons;
A process comprising:
(B) in the step of amplifying the first single-stranded nucleic acid molecule (A1) in the presence of a nicking agent (NA) recognizing the first NARS, a DNA polymerase and one or more deoxynucleoside triphosphates Wherein the step of amplifying uses a portion of the cDNA as a template for the polymerase;
(C) providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the second single-stranded nucleic acid molecule (T2) is in the 5 ′ to 3 ′ direction,
(I) the sequence of the sense strand of the second NARS, and (ii) a sequence at least substantially complementary to A1.
A process comprising:
(D) a third single-stranded nucleic acid molecule in the presence of T2, A1, the first NA, the second NA recognizing the second NARS, the DNA polymerase, and the deoxynucleoside triphosphate; Amplifying (A2), wherein A2 is at least substantially complementary to A1; and (E) detecting and / or characterizing A2 in the cDNA molecule. Determining the presence or absence of a connection,
A method comprising: 前記第一のＮＡＲＳが、前記第二のＮＡＲＳと同一である、請求項１７８に記載の方法。177. The method of claim 178, wherein the first NARS is the same as the second NARS. 前記第一のＮＡおよび前記第二のＮＡの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項１７８に記載の方法。179. The method of claim 178, wherein both the first NA and the second NA are nicking endonucleases (NE). 前記第一のＮＡおよび前記第二のＮＡの両方が、Ｎ．ＢａｔＮＢ Ｉである、請求項１８０に記載の方法。Both the first NA and the second NA are N.V. 181. The method of claim 180, wherein the method is BatNB I. 前記第一のＮＡおよび前記第二のＮＡの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項１７９に記載の方法。179. The method of claim 179, wherein both the first NA and the second NA are nicking endonucleases (NE). 前記工程（Ａ）〜（Ｄ）が単一の容器中で実施される、請求項１７８に記載の方法。177. The method of claim 178, wherein steps (A)-(D) are performed in a single vessel. 前記Ｎ１が、前記第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、請求項１７８に記載の方法。178. The method of claim 178, wherein said Nl comprises the sequence of the antisense strand of said first NARS. 前記Ｎ１が、前記第一のＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む、請求項１７８に記載の方法。178. The method of claim 178, wherein said Nl comprises the sequence of said first NARS sense strand. 前記第一のＮＡおよび前記第二のＮＡの両方が、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）であり、そして前記ヌクレオシド三リン酸のうち少なくとも１つが改変されている、請求項１８５に記載の方法。187. The method of claim 185, wherein both the first NA and the second NA are restriction endonucleases (REs), and wherein at least one of the nucleoside triphosphates has been modified. 前記Ａ１が、８〜２４ヌクレオチド長である、請求項１７８に記載の方法。178. The method of claim 178, wherein A1 is between 8 and 24 nucleotides in length. 前記Ａ１が、１２〜１７ヌクレオチド長である、請求項１８７に記載の方法。187. The method of claim 187, wherein A1 is 12-17 nucleotides in length. 前記Ａ２が、８〜２４ヌクレオチド長である、請求項１７８に記載の方法。178. The method of claim 178, wherein A2 is between 8 and 24 nucleotides in length. 前記Ａ２が、１２〜１７ヌクレオチド長である、請求項１８９に記載の方法。190. The method of claim 189, wherein A2 is 12-17 nucleotides in length. 前記工程（Ｂ）および（Ｄ）の各々が、等温条件下で実施される、請求項１７８に記載の方法。177. The method of claim 178, wherein each of steps (B) and (D) is performed under isothermal conditions. 前記工程（Ｂ）および（Ｄ）の各々が、５０℃〜７０℃で実施される、請求項１９１に記載の方法。192. The method of claim 191, wherein each of steps (B) and (D) is performed at 50C to 70C. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項１７８に記載の方法。178. The method of claim 178, wherein said DNA polymerase is 5 'to 3' exonuclease deficient. 請求項１９３に記載の方法であって、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＲＰＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、方法。194. The method of claim 193, wherein the 5 'to 3' exonuclease deficient DNA polymerase is exo - Vent, exo - DeepVent, exo - Bst, exo - Pfu, exo - Bca, Klenow of DNA polymerase I. A method selected from the group consisting of fragments, T5 DNA polymerase, Phi29 DNA polymerase, phage M2 DNA polymerase, phage PhiPRD1 DNA polymerase, Sequenase, RPD1 DNA polymerase, 9 ° Nm TM polymerase and T4 DNA polymerase homoenzyme. 請求項１９４に記載の方法であって、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−ＤｅｅｐＶｅｎｔポリメラーゼまたは９°ＮｍＴＭポリメラーゼである、方法。195. The method of claim 194, wherein the 5 'to 3' exonuclease deficient DNA polymerase is exo - Bst polymerase, exo - Bca polymerase, exo - Vent polymerase, exo - DeepVent polymerase, or 9 ° Nm ™ polymerase. There is a method. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有する、請求項１７８に記載の方法。178. The method of claim 178, wherein said DNA polymerase has strand displacement activity. 前記工程（Ｂ）および（Ｄ）の各々が、鎖置換活性促進因子の存在下で実施される、請求項１７８に記載の方法。179. The method of claim 178, wherein each of steps (B) and (D) is performed in the presence of a strand displacement activity promoting factor. 請求項１９７に記載の方法であって、前記鎖置換促進因子が、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ウシ胸腺ヘリカーゼおよびトレハロースからなる群より選択される、方法。197. The method of claim 197, wherein the strand displacement promoting factor is BMRF1 polymerase accessory subunit, adenovirus DNA binding protein, herpes simplex virus protein ICP8, single-stranded DNA binding protein, phage T4 gene 32 protein, bovine A method selected from the group consisting of thymic helicase and trehalose. 前記鎖置換促進因子が、トレハロースである、請求項１９８に記載の方法。199. The method of claim 198, wherein said strand displacement promoter is trehalose. 請求項１７８に記載の方法であって、前記工程（Ｅ）が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光および電気泳動からなる群より選択される技術の使用によって、少なくとも部分的に実施される、方法。178. The method of claim 178, wherein step (E) is at least partially performed by using a technique selected from the group consisting of mass spectrometry, liquid chromatography, fluorescence polarization, and electrophoresis. ,Method. 前記工程（Ｅ）が、液体クロマトグラフィーの使用によって、少なくとも部分的に実施される、請求項２００に記載の方法。200. The method of claim 200, wherein said step (E) is at least partially performed by using liquid chromatography. 前記工程（Ｅ）が、質量分析法の使用によって、少なくとも部分的に実施される、請求項２００に記載の方法。200. The method of claim 200, wherein step (E) is performed at least partially by using mass spectrometry. 前記Ｎ１が固定化されている、請求項１７８に記載の方法。177. The method of claim 178, wherein said Nl is immobilized. 前記Ｔ２が固定化されている、請求項２０３に記載の方法。203. The method of claim 203, wherein said T2 is immobilized. ｃＤＮＡ分子中の２つのエキソン間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、ここで、該連結部は、存在する場合、該ｃＤＮＡ分子中の第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置し、該方法は、以下の工程：
（Ａ）以下：
（ｉ）ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）一本鎖核酸分子（Ｔ２）であって、該一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、３’から５’の方向で、以下：
（ａ）該第一のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置する該ｃＤＮＡ分子の一部と少なくとも実質的に同一な配列、および
（ｂ）第二のＮＥＲＳのセンス鎖の配列、
を含む、一本鎖核酸分子（Ｔ２）、ならびに
（ｉｉｉ）該第一のＮＥＲＳを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；該第二のＮＥＲＳを認識する第二のＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）一本鎖核酸分子（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件下で該混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）該Ａ２を特徴付けて、該ｃＤＮＡ分子中の連結部の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a junction between two exons in a cDNA molecule, wherein the junction, if present, is a first nicking endonuclease in the cDNA molecule. Located 5 'to the sequence of the antisense strand of the recognition sequence (NERS), the method comprises the following steps:
(A) The following:
(I) a cDNA molecule,
(Ii) a single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the single-stranded nucleic acid molecule (T2) is in the 3 ′ to 5 ′ direction,
(A) a sequence at least substantially identical to a portion of the cDNA molecule located 5 'to the sequence of the antisense strand of the first NERS; and (b) the sequence of the sense strand of the second NERS. Array,
A single stranded nucleic acid molecule (T2), and (iii) a first nicking endonuclease (NE) that recognizes the first NERS; a second NE that recognizes the second NERS, DNA polymerase And one or more deoxynucleoside triphosphates;
Forming a mixture comprising:
(B) maintaining the mixture under conditions that exponentially amplify the single-stranded nucleic acid molecule (A2); and (C) characterizing the A2 to determine the presence or absence of a junction in the cDNA molecule. The process of determining existence,
A method comprising: 前記第一のＮＥＲＳが、前記第二のＮＥＲＳと同一である、請求項２０５に記載の方法。205. The method of claim 205, wherein the first NERS is the same as the second NERS. ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（Ｅｘｏｎ Ａ）と下流エキソン（Ｅｘｏｎ Ｂ）との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（Ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰおよび該ｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該第一のＯＤＮＰは、アンチセンス鎖中のＥｘｏｎ Ａの５’末端の近傍に、Ｅｘｏｎ Ａのアンチセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列を含み、
（ｉｉ）該第二のＯＤＮＰは、センス鎖中のＥｘｏｎ Ｂの５’末端の近傍に、Ｅｘｏｎ Ｂのセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列を含み、そして
（ｉｉｉ）該第一のＯＤＮＰおよび該第二のＯＤＮＰのうち少なくとも１つは、第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；ならびに
（Ｂ）Ｅｘｏｎ ＡおよびＥｘｏｎ Ｂの両方が該ｃＤＮＡ中に存在する場合、第一の一本鎖核酸（Ａ１）を増幅する条件下で、該第一のＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）の存在下で、第一の増幅反応を実施する工程；
（Ｃ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、５’から３’の方向で、以下：
（ｉ）第二のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および
（ｉｉ）Ａ１と少なくとも実質的に相補的な配列、
を含む、工程；
（Ｄ）Ｅｘｏｎ ＡおよびＥｘｏｎ Ｂの両方が該ｃＤＮＡ中に存在する場合、Ａ１をテンプレートとして使用して、第三の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する条件下で、該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡの存在下で第二の増幅反応を実施する工程；ならびに
（Ｇ）該Ａ２を検出および／または特徴付けて、該ｃＤＮＡ分子中のＥｘｏｎ ＡとＥｘｏｎ Ｂとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a junction between an upstream exon (Exon A) and a downstream exon (Exon B) of a gene in a cDNA molecule, the method comprising the following steps:
(A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP and the cDNA molecule, wherein:
(I) the first ODNP comprises, near the 5 'end of Exon A in the antisense strand, a sequence at least substantially complementary to a part of the Exon A antisense strand;
(Ii) the second ODNP comprises, near the 5 'end of Exon B in the sense strand, a sequence at least substantially complementary to a portion of the Exon B sense strand; and (iii) the second ODNP comprises: Wherein at least one of the one ODNP and the second ODNP further comprises a sequence of a sense strand of a first nicking agent recognition sequence (NARS); and (B) both Exon A and Exon B When present in the cDNA, the first amplification reaction is performed in the presence of a nicking agent (NA) recognizing the first NARS under conditions for amplifying the first single-stranded nucleic acid (A1). Performing the steps;
(C) providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the second single-stranded nucleic acid molecule (T2) is in the 5 ′ to 3 ′ direction,
(I) the sequence of the sense strand of the second NARS, and (ii) a sequence at least substantially complementary to A1.
A process comprising:
(D) When both Exon A and Exon B are present in the cDNA, the second NARS is used under conditions that amplify the third single-stranded nucleic acid fragment (A2) using A1 as a template. Performing a second amplification reaction in the presence of a second NA recognizing A2; and (G) detecting and / or characterizing the A2 to determine the extent between Exon A and Exon B in the cDNA molecule. Determining the presence or absence of a connection,
A method comprising: 前記第一のＮＡＲＳが前記第二のＮＡＲＳと同一である、請求項２０７に記載の方法。210. The method of claim 207, wherein the first NARS is the same as the second NARS. 前記ｃＤＮＡ分子が固定化されている、請求項２０７に記載の方法。210. The method of claim 207, wherein said cDNA molecule is immobilized. 前記第一のＯＤＮＰ、前記第二のＯＤＮＰまたはこれら両方が固定化されている、請求項２０７に記載の方法。210. The method of claim 207, wherein the first ODNP, the second ODNP, or both are immobilized. ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（Ｅｘｏｎ Ａ）と下流エキソン（Ｅｘｏｎ Ｂ）との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（Ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰおよび該ｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該第一のＯＤＮＰが、以下：
（ａ）アンチセンス鎖中のＥｘｏｎ Ａの５’末端の近傍に、Ｅｘｏｎ Ａのアンチセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列、および
（ｂ）第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列、を含み；そして
（ｉｉ）該第二のＯＤＮＰが、以下：
（ａ）センス鎖中のＥｘｏｎ Ｂの５’末端の近傍に、Ｅｘｏｎ Ｂのセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列、および
（ｂ）第二のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、を含む、工程；
（Ｂ）該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成剤（ＮＡ）および第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡの存在下で、Ｅｘｏｎ ＡおよびＥｘｏｎ Ｂの両方が該ｃＤＮＡ分子中に存在する場合に、第一の一本鎖核酸（Ａ１）を増幅する条件下で、第一の増幅反応を実施する工程；
（Ｃ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）が、５’から３’の方向で、以下：
（ｉ）第三のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、および
（ｉｉ）Ａ１と少なくとも実質的に相補的な配列、を含む、工程；
（Ｄ）Ｅｘｏｎ ＡおよびＥｘｏｎ Ｂの両方が該ｃＤＮＡ分子中に存在する場合に、Ａ１をテンプレートとして使用して、第三の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する条件下で、該第二のＮＡＲＳを認識する第三のＮＡの存在下で、第二の増幅反応を実施する工程；
（Ｅ）該Ａ２を検出および／または特徴付けて、該ｃＤＮＡ分子中のＥｘｏｎ ＡとＥｘｏｎ Ｂとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a junction between an upstream exon (Exon A) and a downstream exon (Exon B) of a gene in a cDNA molecule, the method comprising the following steps:
(A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP and the cDNA molecule, wherein:
(I) the first ODNP is as follows:
(A) near the 5 'end of Exon A in the antisense strand, a sequence at least substantially complementary to a portion of the Exon A antisense strand, and (b) a first nicking agent recognition sequence ( And (ii) the second ODNP comprises the following:
(A) near the 5 'end of Exon B in the sense strand, a sequence at least substantially complementary to a portion of the Exon B sense strand, and (b) a sequence of the second NARS sense strand. Including, steps;
(B) In the presence of a first nicking agent (NA) that recognizes the first NARS and a second NA that recognizes a second NARS, both Exon A and Exon B are present in the cDNA molecule. Performing a first amplification reaction under conditions that, if present, amplify the first single-stranded nucleic acid (A1);
(C) providing a second single-stranded nucleic acid molecule (T2), wherein the second single-stranded nucleic acid molecule (T2) is in the 5 'to 3' direction,
(I) a sequence of the sense strand of the third NARS, and (ii) a sequence at least substantially complementary to A1.
(D) when both Exon A and Exon B are present in the cDNA molecule, under conditions that amplify the third single-stranded nucleic acid fragment (A2) using A1 as a template, Performing a second amplification reaction in the presence of a third NA that recognizes the NARS of
(E) detecting and / or characterizing the A2 to determine the presence or absence of a link between Exon A and Exon B in the cDNA molecule;
A method comprising: 前記第一、第二および第三のＮＡＲＳが同一である、請求項２１１に記載の方法。220. The method of claim 211, wherein the first, second, and third NARS are the same. ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（Ｅｘｏｎ Ａ）と下流エキソン（Ｅｘｏｎ Ｂ）との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（Ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰおよび該ｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）該第一のＯＤＮＰが、以下：
（ａ）アンチセンス鎖中のＥｘｏｎ Ａの５’末端の近傍に、Ｅｘｏｎ Ａのアンチセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列、および
（ｂ）第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列、を含み；そして
（ｉｉ）該第二のＯＤＮＰが、以下：
（ａ）センス鎖中のＥｘｏｎ Ｂの５’末端の近傍に、Ｅｘｏｎ Ｂのセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列、および
（ｂ）第二のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、を含む、工程；
（Ｂ）Ｅｘｏｎ ＡおよびＥｘｏｎ Ｂの両方が該ｃＤＮＡ分子中に存在する場合に、一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を指数関数的に増幅する条件で、該混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）該Ａ２を検出および／または特徴付けて、該ｃＤＮＡ分子中のＥｘｏｎ ＡとＥｘｏｎ Ｂとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。A method for determining the presence or absence of a junction between an upstream exon (Exon A) and a downstream exon (Exon B) of a gene in a cDNA molecule, the method comprising the following steps:
(A) forming a mixture of a first oligonucleotide primer (ODNP), a second ODNP and the cDNA molecule, wherein:
(I) the first ODNP is as follows:
(A) near the 5 'end of Exon A in the antisense strand, a sequence at least substantially complementary to a portion of the Exon A antisense strand, and (b) a first nicking agent recognition sequence ( And (ii) the second ODNP comprises the following:
(A) near the 5 'end of Exon B in the sense strand, a sequence at least substantially complementary to a portion of the Exon B sense strand, and (b) a sequence of the second NARS sense strand. Including, steps;
(B) maintaining the mixture under conditions that exponentially amplify the single-stranded nucleic acid fragment (A2) when both Exon A and Exon B are present in the cDNA molecule; and (C) Detecting and / or characterizing the A2 to determine the presence or absence of a link between Exon A and Exon B in the cDNA molecule;
A method comprising: 前記第一のＮＥＲＳおよび第二のＮＥＲＳが同一である、請求項２１３に記載の方法。213. The method of claim 213, wherein the first NERS and the second NERS are the same. 前記ｃＤＮＡ分子が固定化されている、請求項２１３に記載の方法。220. The method of claim 213, wherein said cDNA molecule is immobilized. 前記第一のＯＤＮＰ、前記第二のＯＤＮＰまたはこれら両方が固定化されている、請求項２１３に記載の方法。213. The method of claim 213, wherein the first ODNP, the second ODNP, or both are immobilized.
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