JP7511344B2 - 単一細胞を封入する方法、封入された細胞およびその使用 - Google Patents

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Description

本明細書で提供されるシステム、方法、および組成物は、単一細胞を封入する中空ビーズ、中空ビーズを作成する方法、ならびに封入された細胞で、例えば、空間インデックスシーケンシングおよび核酸ライブラリー調製を含む複数の同時アッセイを行うために中空ビーズを使用する方法に関する。
生体試料中に存在する特定の核酸配列の検出は、例えば、微生物を同定および分類し、感染症を診断し、遺伝子異常を検出および特徴付けし、がんと関連する遺伝子変化を同定し、疾患への遺伝的感受性を試験し、様々なタイプの治療への応答を測定するための方法として使用されている。生体試料中の特定の核酸配列を検出するための一般的な手法は、核酸シーケンシングである。
次世代シーケンサーは、１シーケンシングランごとに大量のゲノムデータを生成する強力なツールである。この大量のデータを解釈および解析することは、困難である場合がある。単一細胞ＤＮＡシーケンシングが、ゲノム多様性を試験するための１つのツールとして出現している。詳細には、複数の反復ゲノム領域を有するマイクロバイオームが、たった１個の細胞からＤＮＡ配列を得ることにより配列決定され得る。複数のアッセイにわたって単一細胞内に細胞内生体分子を閉じ込め、アクセスするという難題のために、複数の酵素反応を単一細胞で行うことは信頼性が低い。例えば、多くの細胞ベースのアッセイは細胞内分子を確保できず、アッセイの実行中に生体分子の喪失をもたらす。
本開示は、単一細胞で複数の同時アッセイを行うためのシステム、方法、および組成物に関し、単一細胞は、例えば、溶解、ＤＮＡ解析、ＲＮＡ解析、タンパク質解析、タグメンテーション、核酸増幅、核酸シーケンシング、ＤＮＡライブラリー調製、シーケンシングを用いたトランスポザーゼ接近可能なクロマチンアッセイ（ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｃ）（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、連続性保存転移（ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ－ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＣＰＴ－ｓｅｑ）、単一細胞コンビナトリアルインデックス付けシーケンシング（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｎｄｅｘｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＳＣＩ－ｓｅｑ）、もしくは単一細胞ゲノム増幅、または単一細胞で連続的に行われるそれらの任意の組合せを含む、複数の同時アッセイを行うために単一細胞が閉じ込められるように中空ビーズ内に封入される。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、単一細胞を封入する中空ビーズに関する。いくつかの実施形態において、中空ビーズは、ポリマーシェルと、ポリマーシェル内に置かれた単一細胞とを含む。いくつかの実施形態において、ポリマーシェルは、単一細胞を保持しながらポリマーシェルを通じて試薬の拡散を可能にする細孔を含む。
さらなる実施形態は、中空ビーズ内に封入された単一細胞で複数の連続同時アッセイを行う方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、単一細胞を封入する、本明細書に記載されている中空ビーズを得ること、および単一細胞を試薬と連続的に接触させて複数の連続同時アッセイを行うことを含む。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、単一細胞を中空ビーズ内に封入する方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、単一細胞をポリマーと混合して混合物を形成すること、および混合物を架橋油（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｉｌ）と混合して、単一細胞を封入するポリマーシェルを形成することであって、ポリマーシェルが、単一細胞を保持しながらポリマーシェルを通じて試薬の拡散を可能にする細孔を含む、形成することを含む。
図１は、細胞を封入する中空ビーズを調製するのに使用することができるマイクロ流体液滴生成器システムの実施形態の模式図である。 図２は、顕微鏡画像、および水性緩衝液の存在下で大きさを拡大することができる中空ビーズの実施形態の略図を表す。顕微鏡画像は、（左から右に）：無水ビーズ；水相と最初に接触させたビーズ；膨張し始めるビーズ；および完全に膨張したビーズを含む、様々な状態のビーズを表す。 図３は、温度または化学的手段によってビーズ空隙率を向上させるための実施形態を例示する概略図である。図３に示されているように、ビーズ空隙率の向上は、ビーズへのまたはビーズからの粒子の流れを増加させることができ、空隙率の制御は、ビーズにまたはビーズから流れる粒子（粒径を含む）の制御をもたらす。 図４は、ポリマーのモノマー単位を単一細胞上に沈着させることによる、デバイスフリーの細胞封入の方法の実施形態を例示する概略図である。 図５は、ポリマーシェルが特異的結合分子との特異的相互作用により細胞に結合されている、デバイスフリーの方法によって形成されたポリマー内の封入された細胞の実施形態を例示する概略図である。 図６は、ビーズ内に封入された細胞を表す、蛍光色素で染色されたビーズの顕微鏡画像を表す。顕微鏡画像は、（左から右に）：遊離ＰＥＧ－マレイミドを標的にするチオール特異的フルオロフォアによる染色；遊離ＳＨ基を標的にするテキサスレッドフルオロフォアによる染色；およびヘキスト染色による核染色を表す。 図７は、細胞を封入する中空ビーズで複数の同時アッセイを行う方法の実施形態を例示する概略図である。図７は、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ断片を生成するためのタグメンテーション、ｃＤＮＡ合成を開始するための逆転写、およびインデックス付きライブラリーを生成するためのＰＣＲ反応を行う実施形態を示す。 図８は、細胞を封入する中空ビーズで複数の同時アッセイを行う方法の実施形態を例示する概略図である。図８は、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ断片を生成するためのタグメンテーション、ｃＤＮＡ合成を開始するための逆転写、およびインデックス付きライブラリーを生成する完全長ＲＮＡシーケンシングのためのランダム伸長によるＰＣＲ反応を行う実施形態を示す。 図９は、細胞を封入する中空ビーズで複数の同時アッセイを行う方法の実施形態を例示する概略図である。図９は、２回のインデックス（ｉｎｄｅｘ）付きスプリットライゲーションおよび１回のインデックス付きＰＣＲを用いる３段階コンビナトリアルインデックス付けアプローチを示す。 図１０は、細胞を封入する中空ビーズで複数の同時アッセイを行う方法の実施形態を例示する概略図である。図１０は、インデックス付きトランスポソームによるコンビナトリアルインデックス付けの複数の同時アッセイを示す。 図１１は、細胞を封入する中空ビーズで複数の同時アッセイを行う方法の実施形態を例示する概略図である。図１１は、単一細胞全ゲノム増幅の複数の同時アッセイを示す。 図１２は、細胞を封入する中空ビーズを用いて全ゲノムライブラリーを調製する方法の実施形態を示すフロー図である。
以下の発明を実施するための形態では、その一部を成す添付図面が参照される。図面では、文脈が特に指示しない限り、類似記号は典型的には類似の構成要素を識別する。発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲に記載された例示的な実施形態は、限定を意味するものではない。本明細書に提示された発明の主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用されてもよく、他の変更がなされてもよい。本明細書に全般的に記載され、図に例示されているように、本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置され、置き換えられ、組み合わされ、分離され、および設計されてもよく、それらの全てが本明細書において明示的に企図されることが容易に理解されるであろう。
本明細書で提供される実施形態は、単一細胞を封入する中空ビーズ、中空ビーズを作成する方法、および中空ビーズ内に封入された単一細胞で複数の同時アッセイを行う方法に関する。中空ビーズは、細胞の存在下で混合され、および細胞を封入する中空ビーズを形成するハイドロゲルポリマーおよび架橋剤を含む。中空ビーズは、中空ビーズ内に細胞を保持しながら中空ビーズを通じて試薬の拡散を可能にし、これにより中空ビーズ内で反応が起きるようにする細孔を含んでもよい。いくつかの実施形態において、中空ビーズは、細胞の連続性を維持しながら同じ単一細胞で同時アッセイを行うことができるようにする。特に、本明細書で提供される方法、システム、および組成物は、封入された細胞内に細胞内生体分子を閉じ込め、アクセスすることを可能にする。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載された中空ビーズは、本明細書では連続性粒子（ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ）と呼ばれる。故に、用語「連続性粒子」は本明細書で使用される場合、単一細胞を封入する中空ビーズを指す。
本明細書に記載された連続性粒子は、次世代の細胞区画化アプローチのために使用することができ、個々の細胞で多重分析物アッセイが行われるようにする。本明細書に記載された連続性粒子および使用の方法は、数百万個の細胞を個別に効率よく分析し、これにより試料調製の費用を低減し、試料の連続性を維持できるようにする。本明細書に記載された組成物および方法は、乳濁、固定化、または他のマイクロコンパートメントなどの外的区画化（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）戦略（マイクロ流体力学）を使用することなく細胞の連続性を維持する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている連続性粒子は、単一細胞を解析するアッセイで使用することができる。単一細胞で行うことができるアッセイには、例えば、細胞溶解、ＤＮＡ解析、ＲＮＡ解析、核酸シーケンシング、タンパク質解析、タグメンテーション、核酸増幅、ＤＮＡライブラリー調製、シーケンシングを用いたトランスポザーゼ接近可能なクロマチンアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、連続性保存転移（ＣＰＴ－ｓｅｑ）、単一細胞コンビナトリアルインデックス付けシーケンシング（ＳＣＩ－ｓｅｑ）、もしくは単一細胞ゲノム増幅、または連続的に行われるそれらの任意の組合せが挙げられ得る。
単一細胞で１つまたは複数のアッセイを行うための連続性粒子の使用は、多数の単一細胞、例えば１０，０００個～１００万個の単一細胞、例えば１０，０００個、５０，０００個、１００，０００個、５００，０００個、または１００万個の単一細胞で同時アッセイを同時に行うために複数の連続性粒子で同時に使用されてもよい。
連続性粒子の細孔径は、１つまたは複数のアッセイの実行中に中空ビーズの内部に単一細胞自体は保持しながら、またはより大きな核酸（＞３００ｂｐ）などの他のより大きな粒子は保持しながら、酵素、化学物質、およびより小さな大きさのプライマー（＜５０ｂｐ）などの試薬の拡散を可能にするように改変することができる。
本明細書で使用される場合、用語「試薬」は、試料との反応、相互作用、試料の希釈、または試料への添加に有用な薬剤または２つ以上の薬剤の混合物を記載し、溶解、核酸解析、核酸増幅反応、タンパク質解析、タグメンテーション反応、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、ＣＰＴ－ｓｅｑ、もしくはＳＣＩ－ｓｅｑ反応、または他のアッセイ用の薬剤を含む、本明細書に記載されたアッセイで使用される薬剤を含んでもよい。故に、試薬には、例えば、緩衝液、化学物質、酵素、ポリメラーゼ、５０塩基対未満の大きさを有するプライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド、標識、色素、またはヌクレアーゼが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、試薬には、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５およびＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、または二価カチオンが挙げられる。
連続性粒子
いくつかの実施形態において、中空ビーズは、ハイドロゲル組成物から調製されたポリマーシェルを有する。本明細書で使用される場合、用語「ハイドロゲル」は、有機ポリマー（天然または合成）が共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開格子構造を作るときに形成される物質を指す。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルは、生体適合性ハイドロゲルであってもよい。本明細書で使用される場合、用語「生体適合性ハイドロゲル」は、生細胞に対して毒性を示さず、生存能を維持するための捕捉細胞への酸素および栄養素の十分な拡散を可能にするゲルを形成するポリマーを指す。いくつかの実施形態において、ハイドロゲル材料には、アルギン酸、アクリルアミド、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ－アクリレート、ＰＥＧ－アミン、ＰＥＧ－カルボン酸、ＰＥＧ－ジチオール、ＰＥＧ－エポキシド、ＰＥＧ－イソシアネート、ＰＥＧ－マレイミド、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰＯＮ）、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ポリリジン、寒天、アガロース、ヘパリン、硫酸化アルギン酸、デキストラン硫酸、ヒアルロナン、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、コラーゲン、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチルプロパントリメタクリレート、エトキシ化トリメチロールトリアクリレート、またはエトキシ化ペンタエリスリトールテトラアクリレート、またはその組合せもしくは混合物が挙げられる。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルは、アルギン酸、アクリルアミド、またはＰＥＧベースの材料である。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルは、アクリル酸－ジチオール、エポキシド－アミン反応化学を用いるＰＥＧベースの材料である。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルは、ＰＥＧ－マレイミド／ジチオール油（ｄｉｔｈｉｏｌ ｏｉｌ）、ＰＥＧ－エポキシド／アミン油、ＰＥＧ－エポキシド／ＰＥＧ－アミン、またはＰＥＧ－ジチオール／ＰＥＧ－アクリレートを含むポリマーシェルを形成する。いくつかの実施形態において、ハイドロゲル材料は、細胞内生体分子を損傷する可能性があるフリーラジカルの生成を避けるために選択される。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルポリマーは、６０～９０％の流体、例えば水、および１０～３０％のポリマーを含む。特定の実施形態において、ハイドロゲルの水含量は約７０～８０％である。本明細書で使用される場合、数値を修飾する場合の用語「約」または「およそ」は、数値に生じ得る変動を指す。例えば、変動は、特定の基質または成分の製造の違いにより生じ得る。１つの実施形態において、用語「約」は、挙げられた数値の１％、５％、または最大１０％以内を意味する。
本明細書で使用される場合、ポリマーシェルは、単一細胞を封入する内部を備えたシェルを有する、中空ビーズのポリマー表面である。本明細書に記載された中空ビーズの性質のために、連続性粒子は、複数のアッセイ後も遺伝子材料を保持することができ、物理的力、切断化学物質によって、またはポリマーシェルの厚さに応じた浸透圧の不均衡を生じさせることにより放出することができる。
ハイドロゲルは、親水性バイオポリマーまたは合成ポリマーを架橋することにより調製することができる。故に、いくつかの実施形態において、ハイドロゲルは架橋剤を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「架橋剤」は、適当な塩基性モノマーと反応すると三次元ネットワークを形成することができる分子を指す。１つまたは複数の架橋剤を含み得るハイドロゲルポリマーの例には、ヒアルロナン、キトサン、寒天、ヘパリン、硫酸、セルロース、アルギン酸（硫酸化アルギン酸）、コラーゲン、デキストラン（デキストラン硫酸を含む）、ペクチン、カラギーナン、ポリリジン、ゼラチン（Ａ型ゼラチンを含む）、アガロース、（メタ）アクリレート－オリゴラクチド－ＰＥＯ－オリゴラクチド－（メタ）アクリレート、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯコポリマー（プルロニック）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ＰＬ（Ｇ）Ａ－ＰＥＯ－ＰＬ（Ｇ）Ａコポリマー、ポリ（エチレンイミン）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－チオール、ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ＰＥＧ、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリアクリル酸、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチルプロパントリメタクリレート、エトキシ化トリメチロールトリアクリレート、またはエトキシ化ペンタエリスリトールテトラアクリレート、またはその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。故に、例えば、組合せは、ポリマーおよび架橋剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－チオール／ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン（ＢＡＣｙ）、またはＰＥＧ／ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ポリマーシェルは、４アームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、４アームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＰＥＧ－アクリレート、ＰＥＧ－アミン、ＰＥＧ－カルボン酸、ＰＥＧ－ジチオール、ＰＥＧ－エポキシド、ＰＥＧ－イソシアネート、およびＰＥＧ－マレイミドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、架橋剤は、即効性架橋剤または遅効性架橋剤である。即効性架橋剤は、ハイドロゲルポリマーを即座に架橋する架橋剤であり、本明細書ではクリックケミストリーとも呼ばれる。即効性架橋剤には、ジチオール油＋ＰＥＧ－マレイミドまたはＰＥＧ－エポキシド＋アミン油が挙げられ得る。遅効性架橋剤は、ハイドロゲルポリマーを徐々に架橋する架橋剤であり、ＰＥＧ－エポキシド＋ＰＥＧ－アミンまたはＰＥＧ－ジチオール＋ＰＥＧ－アクリレートが挙げられ得る。遅効性架橋剤は、架橋するのに数時間超、例えば架橋するのに２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間超かかる場合がある。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、連続性粒子は即効性架橋剤によって構築され、これにより遅効性架橋剤と比べて細胞状態を良好に保つ。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞は、より長い架橋時間の間に細胞内シグナル伝達機構による生理学的変化を受ける可能性がある。
いくつかの実施形態において、架橋剤は、ハイドロゲルポリマー中でジスルフィド結合を形成し、これによりハイドロゲルポリマーを連結する。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルポリマーは、細孔を有するハイドロゲルマトリックス（例えば、多孔性ハイドロゲルマトリックス）を形成する。これらの細孔は、単一細胞またはそこから抽出された核酸などの大きな粒子をポリマーシェル内に十分に保持することができるが、試薬などの他の材料が細孔を通過し、これにより中空ビーズを出入りできるようにする。いくつかの実施形態において、ポリマーシェルの細孔径は、架橋剤の濃度に対するポリマーの濃度の比を変えることにより細かく調整される。いくつかの実施形態において、架橋剤に対するポリマーの比は、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、もしくは１：３０、または上述の比のいずれか２つによって定義される範囲内の比である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡプライマーなどのさらなる機能、または荷電化学基が、異なる適用の要件を満たすためにポリマーマトリックスに移植されてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「空隙率」は、空間、例えば、細孔または他の開口部から成るハイドロゲルの分画容量（無次元）を意味する。したがって、空隙率は、材料中の空所を測定するものであり、０～１００％（または０～１）の割合としての、全容量と比べた空隙容量の分画である。ハイドロゲルの空隙率は、０．５～０．９９、約０．７５～約０．９９、または約０．８～約０．９５にわたり得る。
ポリマーシェルは、単一細胞またはそこから抽出された核酸を同時に保持しながら十分な試薬の拡散を可能にする任意の細孔径を有することができる。本明細書で使用される場合、用語「細孔径」は、細孔の断面の直径または有効径を指す。用語「細孔径」はまた、複数の細孔の測定値に基づく細孔の断面の平均直径または平均有効径も指し得る。円形でない断面の有効径は、非円形断面と同じ断面面積を有する円形断面の直径に等しい。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルが水和するとハイドロゲルは膨張し得る。細孔径の大きさは、次いでハイドロゲル中の水含量に応じて変化し得る。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルの細孔は、封入された細胞をハイドロゲル内に保持するが、試薬を通過させるのに十分な大きさの細孔を有し得る。いくつかの実施形態において、ポリマーシェルの内部は水性環境である。いくつかの実施形態において、ポリマーシェル内に置かれた単一細胞は、ポリマーシェルとの相互作用を受けない、および／またはポリマーシェルと接触していない。いくつかの実施形態において、ポリマーシェルは、細胞の周囲に形成され（本明細書により詳細に記載されているように）、受動吸着により、または抗体もしくは他の特異的結合分子への結合などによる標的化方式でポリマーシェルが細胞表面にもたらされるために、細胞はポリマーシェルと接触する。
いくつかの実施形態において、連続性粒子は、単一細胞を封入するのに十分な大きさである。いくつかの実施形態において、連続性粒子は、約２０μｍ～約２００μｍ、例えば２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００μｍの直径、または上述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の直径を有する。連続性粒子の大きさは、環境要因により変化し得る。いくつかの実施形態において、連続性粒子は、図２に示されているように連続油相から分離され、水相に浸漬されると拡大する。いくつかの実施形態において、連続性粒子の拡大は、封入された細胞の内側の遺伝子材料についてアッセイを行う効率を向上させる。いくつかの実施形態において、連続性粒子の拡大は、ＰＣＲ中に増幅されるインデックス付きインサートにとってより大きな環境を作り出す。これは、さもなければ現在の細胞ベースのアッセイに限定され得る。
いくつかの実施形態において、細孔径は、図３に表されているように、封入された細胞を保持するが、抽出された核酸をポリマーシェルを通じて拡散させるのに十分に増大される。いくつかの実施形態において、連続性粒子の細孔径は、架橋化学を変更することにより制御することができる。最終架橋細孔径は、連続性粒子の環境を変えることにより、例えば、塩分濃度、ｐＨ、または温度を変え、これにより固定化分子を連続性粒子から放出させてさらに変更することができる。
いくつかの実施形態において、架橋剤は可逆的架橋剤である。いくつかの実施形態において、可逆的架橋剤は、ハイドロゲルポリマーを可逆的に架橋することができ、切断剤の存在下で非架橋状態にすることができる。いくつかの実施形態において、架橋剤は、還元剤の存在、昇温、または電場によって切断することができる。いくつかの実施形態において、可逆的架橋剤は、適切な還元剤の存在下でジスルフィド結合が破壊され得る、ポリアクリルアミドゲルに対する可逆的架橋剤、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミンであってもよい。図３に示されているように、ビーズ空隙率は、温度または化学的手段によって向上され、これにより架橋剤のジスルフィド結合を切断する還元剤と架橋剤を接触させ、中空ビーズを破壊することができる。中空ビーズは、その中に保持されていた核酸などの内容物を分解し、放出する。いくつかの実施形態において、架橋剤は、温度を５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００℃超に上げることにより切断される。いくつかの実施形態において、架橋剤は、中空ビーズを還元剤と接触させることにより切断される。いくつかの実施形態において、還元剤には、ホスフィン化合物、水溶性ホスフィン、ホスフィンおよび塩を含有する窒素ならびにその誘導体、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）［それぞれ、２，３－ジヒドロキシ－１，４－ジチオールブタン（ｄｉｔｈｉｏｌｂｕｔａｎｅ）のシスおよびトランス異性体］、２－メルカプトエタノールまたはβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２－メルカプトエタノールまたはアミノエタンチオール、グルタチオン、チオグリコレートまたはチオグリコール酸、２，３－ジメルカプトプロパノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ）、またはＰ－［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン］プロピオン酸（ＴＨＰＰ）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、拡散を増加させるための温度上昇または還元剤との接触は、架橋剤を分解し、これにより連続性粒子から封入された遺伝子材料を放出する。
いくつかの実施形態において、架橋剤の架橋により連続性粒子内の細孔が確立する。いくつかの実施形態において、ポリマーシェル中の細孔の大きさは制御可能であり、細胞または約３００塩基対を超える核酸を封入するが、試薬などのより小さな粒子、またはプライマーなどの約５０塩基対未満のより小さな大きさの核酸が細孔を通過できるように構築される。いくつかの実施形態において、試薬は、遺伝子材料を処理するための試薬、例えば細胞から核酸を単離するための、核酸を増幅もしくはシーケンシングするための、または核酸ライブラリーの調製のための試薬を含む。いくつかの実施形態において、試薬には、例えば、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５およびＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、または二価カチオンが挙げられる。
連続性粒子内で使用され得る例示的な細胞のタイプには、例えば、組織生検から（例えば、結腸がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、皮膚がんなどの疾患を有する、または病原体等に感染した組織から）単離された細胞、および同じ組織由来、例えば、同じ患者由来の正常な細胞；組織培養で増殖された不死細胞（例えば、増殖性変異または不死化導入遺伝子を有する細胞）、病原体に感染した細胞、または処理された細胞（例えば、ペプチド、ホルモンなどの環境または化学要因、温度変化、増殖条件、物理的ストレス、細胞の形質転換等により）、および正常な細胞（例えば、不死化、感染、または処理等されていないことを除いて、さもなければ実験細胞と同一である細胞）；がん、疾患を有する哺乳動物、老齢哺乳動物、または状態に曝露された哺乳動物から単離された細胞、および健康なまたは若齢の同じ種の、例えば、同じファミリーからの哺乳動物由来の細胞；ならびに同じ哺乳動物由来の分化細胞および非分化細胞（例えば、哺乳動物における他の細胞の前駆細胞である例えば１つの細胞）が挙げられ得る。１つの実施形態において、異なるタイプの細胞、例えば、神経および非神経細胞、または異なる状態の細胞（例えば、細胞における刺激の前および後の）が比較され得る。別の実施形態において、実験材料は、ウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）等などの病原体による感染を起こしやすい細胞であり、および対照材料は、病原体による感染に耐性を示す細胞である。本発明の別の実施形態において、試料ペアは、未分化細胞、例えば幹細胞、および分化細胞に代表される。酵母、植物、ならびに魚、鳥、爬虫類、両生類および哺乳動物などの動物由来の細胞が、対象の方法において使用され得る。特定の実施形態において、哺乳動物細胞、すなわち、マウス、ウサギ、霊長類、もしくはヒト由来の細胞、またはその培養された誘導体が使用され得る。
連続性粒子を作成する方法
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、単一細胞をポリマーシェル内に封入して連続性粒子を形成する方法に関する。いくつかの実施形態において、連続性粒子内に封入される細胞を含有する試料が得られる。いくつかの実施形態において、細胞は封入前に固定剤で連続性粒子内に固定することができる。本明細書で使用される場合、固定剤は、細胞を固定することができる薬剤を一般に指す。例えば、固定細胞は、細胞中のタンパク質複合体、核酸複合体、またはタンパク質－核酸複合体を安定化することができる。適切な固定剤および架橋剤には、アルコールまたはアルデヒドベースの固定剤、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノールベースの固定剤、メタノールベースの固定剤、アセトン、酢酸、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、クロム酸、過マンガン酸カリウム、水銀剤、ピクリン酸塩、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、アミン反応性ＮＨＳ－エステル架橋剤、例えば、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）、３，３’－ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（スルホ－ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］（ＤＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］（ＥＧＳ）、ＮＨＳ－エステル／ジアジリン架橋剤、例えば、ＮＨＳ－ジアジリン、ＮＨＳ－ＬＣ－ジアジリン、ＮＨＳ－ＳＳ－ジアジリン、スルホ－ＮＨＳ－ジアジリン、スルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ジアジリン、およびスルホ－ＮＨＳ－ＳＳ－ジアジリンが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、細胞の固定は、細胞の内部状態を保護し、これにより細胞を連続性粒子内に封入中の細胞の修飾を防ぐ。
いくつかの実施形態において、連続性粒子は、マイクロ流体装置を必要とすることなく、単一細胞マイクロウェル／マイクロアレイ方法またはマイクロダイセクション方法などによる静的手段によって調製される。故に、いくつかの実施形態において、本明細書に記載された連続性粒子は、デバイスフリーの方法によって調製される。デバイスフリーの方法は、細胞をポリマーと接触させ、細胞の周囲にポリマーシェルを形成することによる細胞表面での重合の開始を含み得る。重合の開始は、モノマー単位での活性基と、膜タンパク質、グリカンまたは他の小分子の特定の部分との化学反応によって生じ得る。モノマー重合の最初のステップに続いて、静電力または疎水力のどちらかによって促進される１回または複数回のモノマー単位の沈着が起こり得る。モノマー層のいくつかは、封入された細胞の特異的捕捉に後々使用され得るビオチンなどの官能基または他のリガンドを含有してもよい。例えば、埋め込まれた細胞はビオチンを含有してもよく、磁性ストレプトアビジンビーズによる埋め込まれた細胞のコーティングは、図４に示されているように細胞を磁性にし、自動および容易な処理を可能にするであろう。あるいは、生細胞または固定細胞封入は、図５に示されているように、受動吸着により、または標的化方式（例えば、抗体もしくは他の特異的結合分子に結合される）のどちらかで開始分子が細胞表面にもたらされるとき、光、または他の物理的もしくは化学的手段によって初期化され（ｉｎｉｔｉａｌｉｚｅｄ）、局在化ポリマー増幅を促進し得る。
標的化表面開始重合（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）方法における細胞の封入は、使用者が目的とする細胞を特異的に選択することを可能にし、同時にその後の下流のアッセイ用の細胞を調製し、これによりフロー選別を単一細胞アッセイと組み合わせる。特定の細胞タイプの濃縮は、磁気的に標識されたビーズ、または濃縮表面にコンジュゲートされた特定の細胞膜タンパク質に特異的なカスタム結合分子を利用する細胞分離キットを用いて行うことができる。
いくつかの実施形態において、連続性粒子は、ボルテックス支援の乳濁、マイクロ流体液滴生成、またはバルブベースのマイクロ流体力学などによって動的手段によって調製される。本明細書で使用される場合、ボルテックス支援の乳濁は、チューブ、バイアル、または反応槽などの容器で、本明細書に記載されている固定細胞を含む細胞とハイドロゲルポリマーをボルテックスすることを指す。成分は、例えば手動または機械的ボルテックスまたは振盪によって混合されてもよい。いくつかの実施形態において、手動混合は、直径２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００μｍの大きさ、または上述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の大きさを有する遺伝子材料を封入する中空ビーズをもたらす。いくつかの実施形態において、ビーズの大きさは不均一であり、故に、ビーズの大きさには様々な直径のビーズが挙げられる。
いくつかの実施形態において、連続性粒子は、マイクロ流体フロー手法によって調製される。マイクロ流体フローは、図１に示されているように、ゲル支援の乳濁生成のためのマイクロ流体装置の使用を含む。いくつかの実施形態において、マイクロ流体装置は、所望の大きさの連続性粒子を作製するように設定され、および連続性粒子ごとに単一細胞を封入するように設定されたマイクロ流路を含む。いくつかの実施形態において、マイクロ流体装置は、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μｍの高さ、または上述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の高さを有する。いくつかの実施形態において、マイクロ流体装置は１つまたは複数の流路を含む。いくつかの実施形態において、マイクロ流体装置は、ポリマーに導入された固定細胞を含む細胞を導入するための流路、架橋剤を導入するための流路、および非混和流体のための流路を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の流路の幅は同一である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の流路の幅は異なる。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の流路の幅は、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、もしくは１５０μｍ、または上述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の幅である。流路の幅および高さは、本明細書に記載された値に必ずしも限定されず、当業者は、連続性粒子の大きさがマイクロ流体装置の流路の大きさに部分的に依存することを理解するであろう。故に、連続性粒子の大きさは、流路の大きさを修正することにより部分的に調整され得る。マイクロ流体装置の大きさおよび流路の幅に加えて、流路の流速もまた連続性粒子の大きさに影響を与える場合があり、および各連続性粒子内に封入された細胞数にも影響を与える（ｅｆｆｅｃｔ）場合がある。
いくつかの実施形態において、ポリマーと混合された固定細胞を含む、マイクロ流体流路を通るポリマー中の細胞の流速は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０μＬ／分、または上述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の速度である。いくつかの実施形態において、マイクロ流体流路中の架橋剤の流速は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０μＬ／分、または上述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の速度である。いくつかの実施形態において、マイクロ流体流路中の非混和流体の流速は、２０、３０、５０、８０、１００、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、もしくは４００μＬ／分、または上述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の速度である。いくつかの実施形態において、ポリマーと混合された固定細胞を含むポリマーと混合された細胞、および架橋剤は、非混和流体の上流のマイクロ流体液滴生成器中で互いに接触する。連続性粒子は、架橋剤と接触すると生じはじめ、細胞をポリマーシェル内に封入する。連続性粒子の形成は、非混和流体の流速未満の流速で、マイクロ流体液滴生成器を通じてスペーサー油（ｓｐａｃｅｒ ｏｉｌ）および／または架橋油などの非混和流体に流入し続け、これにより液滴を形成する。いくつかの実施形態において、非混和流体は、図１に示されているように、スペーサー油としておよび架橋剤油としてを含む２段階で導入される。いくつかの実施形態において、スペーサー油は、鉱油、炭化水素油、シリコーン油、フッ化炭素油、またはポリジメチルシロキサン油、またはその混合物である。スペーサー油は本明細書で使用される場合、水性－油中間相の流路でポリマーでのポリマーの架橋を避けるために使用される。
いくつかの実施形態において、連続性粒子は、即効性架橋剤との架橋によって瞬時に形成される。例えば、マイクロ流体液滴生成器を用いて４アームＰＥＧマレイミドまたはエポキシドのようなポリマーにより封入された細胞は、架橋油を形成する鉱油またはＨＦＥ－７５００のようなフッ化炭素油などの油に溶解可能な架橋剤を用いて瞬時に架橋することができる。いくつかの実施形態において、架橋油には、トルエン３，４ジチオール、２，４ジアミノトルエン、ヘキサンジチオールの場合のようにジチオール、アミン官能基を有するトルエン、アセトン、テトラヒドロフランが挙げられる。これらは、形成液滴中に容易に拡散し、これにより連続性粒子を瞬時に架橋する。
いくつかの実施形態において、連続性粒子は均一な粒度分布で構築される。いくつかの実施形態において、連続性粒子の大きさは、マイクロ流体装置の大きさ、１つもしくは複数の流路の大きさの大きさ、またはマイクロ流体流路を通る流速を調節することにより細かく調整される。いくつかの実施形態において、得られた連続性粒子は、２０～２００μｍ、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００μｍにわたる直径、または上述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の直径を有する。
いくつかの実施形態において、連続性粒子の大きさおよび均一性は、粒子形成の前にハイドロゲルポリマーを、イソプロピルアルコールを含むアルコールなどの流体修飾物質（ｆｌｕｉｄｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）と接触させることによりさらに制御することができる。イソプロピルアルコールの非存在下では、連続性粒子は、イソプロピルアルコールの存在下で形成される連続性粒子より大きな直径で生じる。イソプロピルアルコールはハイドロゲルポリマーの流体特性に影響し、連続性粒子の大きさの調節を可能にする。
当業者によって認識されるように、図１に表されたマイクロ流体装置は、典型的な３流路マイクロ流体装置であるが、マイクロ流体装置は、特定の大きさの連続性粒子を生成するか、または様々なハイドロゲル材料もしくは架橋剤から形成される連続性粒子を生成するように修正、変化、もしくは変更することができる。
いくつかの実施形態において、連続性粒子は、ボルテックス支援の乳濁かまたはマイクロ流体慣性流支援の乳濁によって調製されるかにかかわらず、本明細書に記載されているように単一固定細胞を含む単一細胞を封入する。いくつかの実施形態において、連続性粒子内の細胞数は、投入された試料内に細胞を含有する溶液を希釈または濃縮することにより制御することができる。細胞を含む試料はハイドロゲルポリマーと混合され、細胞を含有するハイドロゲルポリマーは、本明細書に記載されているように、ボルテックス支援の乳濁またはマイクロ流体フロー支援の乳濁に提供される。
いくつかの実施形態において、連続性粒子はヌクレオチドで機能化される。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはポリＴヌクレオチド（ｐｏｌｙＴ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは連続性粒子に結合され、機能化された連続性粒子は、目的とするヌクレオチドの標的化捕捉に使用することができる。
いくつかの実施形態において、単一細胞を封入する連続性粒子は、行われるアッセイに基づく複数の緩衝液洗浄、複数の試薬交換、および複数の解析を含む、複数の同時アッセイの単一の連続性粒子での実施を持続させるように硬化される。表面開始重合法、ボルテックスを含む本明細書に記載された方法のいずれか、またはマイクロ流体法によって調製される、構築された連続性粒子は、パターン化フローセル、マイクロアレイ、ウェルを備えたプレート、エッチング表面、マイクロ流体流路、ビーズ、カラム、または封入された細胞で複数の同時アッセイを行うための他の表面にローディングまたは播種することができる。
連続性粒子内に封入された細胞で複数の同時アッセイを行う方法
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、連続性粒子内に封入された単一細胞で複数の連続同時アッセイを行う方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されているように連続性粒子を得ること、および連続性粒子内に封入された単一細胞を試薬と連続的に接触させて複数の連続同時アッセイを行うことを含む。
いくつかの実施形態において、連続性粒子は本明細書に記載されているように調製され、連続性粒子はフローセル装置、プレートのウェル、スライド、またはパターン化表面などの表面にローディングされる。いくつかの実施形態において、表面はフローセル装置であり、フローセル装置での空間インデックス付けのために連続性粒子の分布用アレイ中にマイクロウェルまたはマイクロピラーを有するインサートを含む。いくつかの実施形態において、連続性粒子は、各ウェルに単一連続性粒子を含むウェルプレート（ｗｅｌｌｅｄ ｐｌａｔｅ）にローディングされる。ウェルプレート（ｗｅｌｌｅｄ ｐｌａｔｅ）には、例えば、単一連続性粒子、および故に単一細胞が各ウェルに沈着した１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート、３４５６ウェルプレート、もしくは９６００ウェルプレート、またはプレート中任意の数のウェルが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、連続性粒子は透過処理剤で透過処理される。いくつかの実施形態において、透過処理薬剤には、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００などのマイルドな界面活性剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、透過処理剤は、連続性粒子内の細胞の細胞膜を透過処理して、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡなどの細胞の核酸へのアクセシビリティを高める。いくつかの実施形態において、単一連続性粒子を各ウェル内に沈着させたウェルプレート（ｗｅｌｌｅｄ ｐｌａｔｅ）は、例えば、緩衝液洗浄、溶解、ＤＮＡ解析、ＲＮＡ解析、タンパク質解析、タグメンテーション、核酸増幅、核酸シーケンシング、ＤＮＡライブラリー調製、シーケンシングを用いたトランスポザーゼ接近可能なクロマチンアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、連続性保存転移（ＣＰＴ－ｓｅｑ）、単一細胞コンビナトリアルインデックス付けシーケンシング（ＳＣＩ－ｓｅｑ）、もしくは単一細胞ゲノム増幅、または連続的に行われるそれらの任意の組合せを含む複数の同時アッセイに順次供される。
いくつかの実施形態において、細胞またはウイルス粒子を封入する連続性粒子は、核酸を細胞から精製および単離するために処理される。故に、例えば連続性粒子は、溶解緩衝液と接触される。本明細書で使用される場合、「溶解」は、細胞のＲＮＡまたはＤＮＡへのアクセスまたは放出を容易にする、細胞壁またはウイルス粒子への撹乱または変更を意味する。細胞壁の完全な破壊も切断も溶解の必須要件ではない。用語「溶解緩衝液」とは、少なくとも１つの溶解剤を含有する緩衝液を意味する。典型的な酵素溶解剤には、リゾチーム、グルコラーゼ（ｇｌｕｃｏｌａｓｅ）、チモラーゼ（ｚｙｍｏｌｏｓｅ）、リチカーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、ならびにウイルスエンドリシンおよびエキソリシン（ｅｘｏｌｙｓｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。故に、例えば、連続性粒子中の細胞の溶解は、リゾチームおよびプロテイナーゼＫなどの溶解剤を連続性粒子に導入することにより行うことができる。細胞由来のｇＤＮＡが今や連続性粒子内に含有される。いくつかの実施形態において、溶解処理後、単離された核酸は連続性粒子内に保持され、さらなる処理に使用され得る。
ＤＮＡ解析は、封入された細胞内に含有されるＤＮＡを増幅、配列決定、またはさもなければ解析するのに使用される任意の手法を指す。ＤＮＡ増幅は、ＰＣＲ法またはパイロシーケンシングを用いて達成することができる。ＤＮＡ解析はまた、非標的化、非ＰＣＲベースのＤＮＡシーケンシング（例えば、メタゲノミクス）法も含み得る。非限定的な例として、ＤＮＡ解析は、１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソームＤＮＡ）の超可変領域のシーケンシング、およびＤＮＡによる種同定のためのシーケンシングの使用を含み得る。
ＲＮＡ解析は、封入された細胞内に含有されるＲＮＡを増幅、配列決定、またはさもなければ解析する任意の手法を指す。ＤＮＡを解析するのに使用される同じ手法が、ＲＮＡを増幅および配列決定するのに使用され得る。ＤＮＡより不安定なＲＮＡは、刺激に応答したＤＮＡの翻訳である。したがって、ＲＮＡ解析は、コミュニティーの代謝的に活性なメンバーのより正確な像を提供することができ、試料中の微生物のコミュニティー機能について情報を提供するのに使用することができる。核酸シーケンシングは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸分子の配列中のヌクレオチドの順序を決定するためのシーケンシングの使用を指す。
用語「シーケンシング」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの同一性（例えば、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個もしくは少なくとも２００個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの同一性）が得られる方法を指す。
用語「次世代シーケンシング」または「ハイスループットシーケンシング」または「ＮＧＳ」は、一般に、超並列シグネチャーシーケンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ハイスループットシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤシーケンシング）、プロトンイオン半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、単一分子シーケンシング、およびナノポアシーケンシングを含むがこれらに限定されないハイスループットシーケンシング技術を指し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、またはＲｏｃｈｅ等によって現在使用されている並列化された合成によるシーケンシングまたはライゲーションによるシーケンシングプラットホームを指す場合がある。次世代シーケンシング方法はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商業化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術またはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって商業化された単一分子蛍光ベースの方法などのナノポアシーケンシング方法または電子検出ベースの方法も含み得る。
タンパク質解析は、封入された細胞中のタンパク質の試験を指し、プロテオミクス解析、目的とするタンパク質の翻訳後修飾の決定、タンパク質発現レベルの決定、または他のタンパク質または核酸を含む他の分子とのタンパク質相互作用の決定を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「タグメンテーション」は、トランスポゾン末端配列を含むアダプターと複合体化されたトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を指す。タグメンテーションは、ＤＮＡの同時断片化および二重断片の両鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションをもたらす。トランスポザーゼ酵素を除去するための精製工程後、さらなる配列が、例えばＰＣＲ、ライゲーション、または当業者に公知の任意の他の適切な方法論によって、アダプター付加された断片の末端に付加され得る。
シーケンシングを用いたトランスポザーゼ接近可能なクロマチンアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）は、統合的エピゲノム解析の迅速および高感度な方法を指す。ＡＴＡＣ－ｓｅｑはオープンクロマチン部位を捕捉し、オープンクロマチンのゲノム位置間の相互作用、ＤＮＡ結合タンパク質、個々のヌクレオソーム、およびヌクレオチド分解による制御領域での高次凝縮を明らかにする。ヌクレオソームと重複することを厳重に回避する、許容することができる、またはヌクレオソームと重複する傾向があるＤＮＡ結合因子のクラスが発見されている。ＡＴＡＣ－ｓｅｑを用いて、静止ヒトＴ細胞の連続する毎日のエピゲノムが、標準採血により発端者から測定および評価され、健康および疾患をモニタリングするために臨床タイムスケールで個人のエピゲノムを解読する実現可能性を示した。より具体的には、ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、連続性粒子内の単一の封入された細胞由来のクロマチンを挿入酵素複合体（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）で処理して、ゲノムＤＮＡのタグ付き断片を作製することにより行うことができる。この工程において、クロマチンは、クロマチンのオープン領域でゲノムＤＮＡを切断し、アダプターを断片の両端に付加するＴｎ５またはＭｕＡなどの挿入酵素を用いて、タグメント化される（例えば、同じ反応で断片化およびタグ付けされる）。
いくつかの場合では、クロマチンへの挿入の望ましいレベルを得るために条件が調整されてもよい（例えば、オープン領域で平均５０～２００塩基対ごとに生じる挿入）。該方法において使用されるクロマチンは、任意の適切な方法によって作成されてもよい。いくつかの実施形態において、核が単離、溶解されてもよく、クロマチンが例えば核膜からさらに精製されてもよい。他の実施形態において、クロマチンは、単離された核を反応緩衝液と接触させることにより単離されてもよい。これらの実施形態において、単離された核は、挿入酵素複合体をクロマチンにアクセスできるようにする反応緩衝液（挿入酵素複合体および他の必要な試薬を含む）と接触すると溶解し得る。これらの実施形態において、該方法は、核を細胞集団から単離すること、ならびに単離された核をトランスポザーゼおよびアダプターと組み合わせることを含んでもよく、組み合わせることは、前記クロマチンを放出するための核の溶解およびゲノムＤＮＡのアダプタータグ付き断片の生成の両方をもたらす。クロマチンは、他の方法（例えば、ＣｈＩＰ－ＳＥＱ方法）のように架橋を必要としない。
クロマチンが断片化およびタグ付けされてゲノムＤＮＡのタグ付き断片を作製した後、複数の配列リードを作製するためにアダプタータグ付き断片の少なくともいくつかが配列決定される。断片は、任意の適切な方法を用いて配列決定することができる。例えば、断片は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネーター方法、Ｒｏｃｈｅのパイロシーケンシング方法（４５４）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤプラットホーム）またはＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットホームを用いて配列決定することができる。そのような方法の例は、以下の参考文献：Margulies et al.（Nature 2005 437: 376-80）；Ronaghi et al.（Analytical Biochemistry 1996 242: 84-9）；Shendure et al.（Science 2005 309: 1728-32）；Imelfort et al.（Brief Bioinform. 2009 10:609-18）；Fox et al.（Methods Mol Biol. 2009;553:79-108）；Appleby et al.（Methods Mol Biol. 2009；513:19-39）およびMorozova et al.（Genomics. 2008 92:255-64）に記載されており、これらは、工程ごとの全ての出発生成物、ライブラリー調製のための方法、試薬、および最終生成物を含む、方法および方法の特定の工程の一般的説明のために、参照により本明細書に組み込まれる。明らかとなるように、選択された次世代シーケンシングプラットホームと適合するフォワードおよびリバースシーケンシングプライマー部位は、増幅工程中に断片の末端に付加することができる。特定の実施形態において、断片は、断片に付加されたタグにハイブリダイズするＰＣＲプライマーを用いて増幅されてもよく、ＰＣＲに使用されるプライマーは、特定のシーケンシングプラットホームと適合する５’尾部を有する。ＡＴＡＣ－ｓｅｑを行う方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３８８２５号に記載されている。
用語「クロマチン」は、本明細書で使用される場合、真核細胞の核で見出されるような、タンパク質およびポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む分子の複合体を指す。クロマチンは、ヌクレオソームを形成するヒストンタンパク質、ゲノムＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡに一般に結合される他のＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）から部分的に成る。
連続性保存転移シーケンシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）は、標的核酸に隣接する鋳型核酸断片の結合を維持するためのトランスポザーゼの使用によって連続性情報を保存しながら、配列決定する方法を指す。例えば、ＣＰＴは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸で実施されてもよい。ＣＰＴ核酸は、固有のインデックスまたはバーコードを有する相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって捕捉され、固体支持体に固定化され得る。いくつかの実施形態において、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドは、バーコードに加えてプライマー結合部位、固有の分子インデックスをさらに含んでもよい。有利には、断片化された核酸の物理的近接性を維持するためのトランスポソームのそのような使用は、同じ元の分子、例えば染色体からの断片化された核酸が、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドから同じ固有のバーコードおよびインデックス情報を受け取る可能性を高める。これは、固有のバーコードを有する連続的に連結されたシーケンシングライブラリーをもたらすであろう。連続的に連結されたシーケンシングライブラリーは、配列決定されて連続する配列情報を得ることができる。本明細書に記載された連続性粒子は、封入された細胞から抽出された核酸でＣＰＴ－ｓｅｑを実行するためのＣＰＴ－ｓｅｑ試薬と接触されてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「連続性情報（ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、共有情報に基づく２つ以上のＤＮＡ断片間の空間関係を指す。情報の共有側面は、隣接する、コンパートメントおよび遠距離空間関係に関するものであり得る。これらの関係に関する情報は次いで、ＤＮＡ断片から得られた配列リードの階層的アセンブリーまたはマッピングを促進する。この連続性情報は、そのようなアセンブリーまたはマッピングの効率および精度を改善する。その理由は、個々の配列リードが得られた２つ以上のＤＮＡ断片間の空間関係に関する場合、従来のショットガンシーケンシングと関連して使用される伝統的アセンブリーまたはマッピング方法は、個々の配列リードの相対的なゲノム起源または座標を考慮していないためである。
したがって、本明細書に記載された実施形態によれば、連続性情報を捕捉する方法は、隣接する空間関係を決定する短距離連続性方法、コンパートメント空間関係を決定する中距離連続性方法、または遠距離空間関係を決定する長距離連続性方法によって達成され得る。これらの方法は、ＤＮＡ配列アセンブリーまたはマッピングの精度および質を促進し、本明細書に記載されたものなどの任意のシーケンシング方法と使用することができる。
連続性情報は、個々の配列リードが得られた２つ以上のＤＮＡ断片間の空間関係に関する場合、個々の配列リードの相対的なゲノム起源または座標を含む。いくつかの実施形態において、連続性情報は非重複配列リードからの配列情報を含む。
いくつかの実施形態において、標的核酸配列の連続性情報は、ハプロタイプ情報を示す。いくつかの実施形態において、標的核酸配列の連続性情報は、ゲノム変異体を示す。
単一細胞コンビナトリアルインデックス付けシーケンシング（ＳＣＩ－ｓｅｑ）は、体細胞コピー数変異体検出用の数千個のローパス単一細胞ライブラリーを同時に生成するためのシーケンシング法である。
したがって、複数の同時アッセイが、本明細書に記載されたアッセイを含め、単独でまたは任意の他のアッセイと組み合わせて、細胞または細胞の核酸を解析する目的のために単一細胞で行われ得る。
インデックス付き連続性粒子はまた、ポスト/マイクロウェルのアレイにより保持されたフローセルに直接ローディングすることもできる。インデックス付きライブラリーが連続性粒子から放出され（化学/温度放出）、フローセルに結合する。これは、第１段階のインデックス付けが空間的位置に由来し、次いで次の段階が単一連続性粒子からのインデックス付きライブラリーに由来するインデックス付けアプローチの強化を可能にする。あるいは、連続性粒子から抽出されたインデックス付きライブラリーが、フローセルにまとめてローディングされてもよい。
いくつかの実施形態において、連続性粒子内に封入された細胞は、核酸処理用の１つまたは複数の試薬と接する。いくつかの実施形態において、細胞は連続性粒子内に保持され、試薬は連続性粒子の細孔を通過することができる。いくつかの実施形態において、試薬は、溶解剤、核酸精製剤、ＤＮＡ増幅剤、タグメンテーション剤、ＰＣＲ剤、または遺伝子材料の処理において使用される他の薬剤を含み得る。故に、連続性粒子は、連続性粒子内の細胞自体は保持しながら、試薬のバリアがポリマーシェルを出入りできるようにすることにより、連続性粒子内の、細胞から抽出された核酸を含む細胞の反応制御のための微小環境を提供する。いくつかの実施形態において、ポリマーシェルの細孔は、試薬の流れならびにまた細胞から抽出されたＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸の流れがポリマーシェルを通れるように調節される。
いくつかの実施形態において、全ＤＮＡライブラリーの調製は、ｇＤＮＡおよびそのライブラリー産物をポリマーシェル内に保持しながら多孔性ハイドロゲルを通過することによる複数の試薬交換により、連続性粒子の内側で途切れなく達成することができる。ハイドロゲルは、異なる生化学反応を支持するのに最大９５℃の高温に数時間耐性を示す。
本明細書で使用される場合、用語「単離された」、「単離する」、「単離」、「精製された」、「精製する」、「精製」および本明細書で使用されるその文法的同等物は、特に明示されない限り、試料、または材料が単離された供給源（例えば、細胞）からの少なくとも１つの混入物（タンパク質および／または核酸配列などの）の量の低減を指す。故に精製は、「濃縮」、例えば、試料中の望ましいタンパク質および／または核酸配列の量の増加をもたらす。
核酸の溶解および単離後、特に単一細胞から少量のＤＮＡを増幅するための広く使用されている手法である、多重置換増幅（ＭＤＡ）などの増幅が行われ得る。いくつかの実施形態において、封入核酸が、増幅され、配列決定され、または核酸ライブラリーの調製に使用される。本明細書で使用される場合、核酸または核酸反応に関して使用される用語「増幅する」または「増幅された」「増幅」は、本発明の実施形態により、標的核酸、または例えば、連続性粒子内に封入核酸などの特定の核酸のコピーを作成するインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法を指す。核酸を増幅する数多くの方法が当技術分野で公知であり、増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、多重アニーリングおよびループ化による増幅サイクル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｏｐｉｎｇ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅｓ）（ＭＡＬＢＡＣ）、ＮＡＳＢＡなどの転写媒介増幅方法、ループ媒介増幅方法（例えば、ループ形成配列を用いた「ＬＡＭＰ」増幅）が挙げられる。増幅される核酸は、修飾ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むＤＮＡもしくはＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、からなる、または由来するＤＮＡであってもよい。核酸分子または分子の増幅から生じた産物（例えば、「増幅産物」）は、出発核酸がＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方であれ、ＤＮＡもしくはＲＮＡのどちらか、またはＤＮＡおよびＲＮＡ両方のヌクレオシドもしくはヌクレオチドの混合物であり得、または該産物は、修飾ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。「コピー」は、標的配列に対する完全な配列相補性または同一性を必ずしも意味しない。例えば、コピーは、デオキシイノシンもしくはデオキシウリジンなどのヌクレオチド類似体、意図的な配列変化（標的配列にハイブリダイズ可能であるが相補的でない配列を含むプライマーにより導入される配列変化などの、および／または増幅中に生じる配列誤差を含んでもよい。
連続性粒子内で単離された封入核酸は、当技術分野で公知の任意の適切な増幅方法論に従って増幅することができる。いくつかの実施形態において、封入核酸は連続性粒子内で増幅される。いくつかの実施形態において、連続性粒子は固体支持体上で捕捉、分解され、そこで封入核酸が固体支持体上に放出され、核酸が固体支持体上で増幅される。
いくつかの実施形態において、封入核酸は連続性粒子内で増幅される。例えば、いくつかの実施形態において、増幅プライマーおよび酵素は、連続性粒子の細孔を通過し、封入核酸にハイブリダイズする。
本明細書に記載された、または当技術分野で一般に公知の増幅方法論のいずれかが、封入核酸を増幅するのにユニバーサルまたは標的特異的プライマーと共に利用され得ることが理解され流であろう。増幅のための適切な方法には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００３，３５４号に記載されているような、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の増幅方法は、目的とする１つまたは複数の核酸を増幅するのに使用することができる。例えば、多重ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等を含むＰＣＲが、封入核酸を増幅するのに利用されてもよい。いくつかの実施形態において、目的とする核酸を特異的に対象とするプライマーが増幅反応に含まれる。
核酸増幅のための他の適切な方法には、オリゴヌクレオチド伸長およびライゲーション、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）［参照により本明細書に組み込まれるLizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)］およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）技術（一般に、米国特許第７，５８２，４２０号、第５，１８５，２４３号、第５，６７９，５２４号および第５，５７３，９０７号；ＥＰ０３２０３０８Ｂ１；ＥＰ０３３６７３１Ｂ１；ＥＰ０４３９１８２Ｂ１；ＷＯ９０／０１０６９；ＷＯ８９／１２６９６；およびＷＯ８９／０９８３５参照。これらの特許文献の全ては、参照により組み込まれる）が挙げられ得る。これらの増幅方法論は、封入核酸を増幅するように設計されてもよいことが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態において、増幅方法は、目的とする核酸を特異的に対象とするプライマーを含有するライゲーションプローブ増幅またはオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を含んでもよい。いくつかの実施形態において、増幅方法は、目的とする核酸を特異的に対象とし、ハイドロゲル細孔を通過することができるプライマーを含有するプライマー伸長－ライゲーション反応を含んでもよい。目的とする核酸を増幅するように特異的に設計され得るプライマー伸長およびライゲーションプライマーの非限定的な例として、増幅は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５８２，４２０号および第７，６１１，８６９号によって例証される、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア）に使用されるプライマーを含んでもよい。記載された方法の各々において、核酸反応に関与する試薬および成分は、核酸自体は連続性粒子内に保持しながら連続性粒子の細孔を通過することができる。
いくつかの実施形態において、封入核酸は、米国特許第７，９８５，５６５号および第７，１１５，４００号の開示によって例証されるクラスター増幅方法論を用いて増幅される（これらの特許文献の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。米国特許第７，９８５，５６５号および第７，１１５，４００号の組み込まれた資料は、固定化された核酸分子のクラスターまたは「コロニー」から成るアレイを形成するために増幅産物を固体支持体に固定化させる核酸増幅の方法を記載する。そのようなアレイ上の各クラスターまたはコロニーは、複数の同一の固定化ポリヌクレオチド鎖および複数の同一の固定化相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そのように形成されたアレイは、本明細書では一般に「クラスター化アレイ」と呼ばれる。米国特許第７，９８５，５６５号および第７，１１５，４００号に記載されたものなどの固相増幅反応の産物は、固定化ポリヌクレオチド鎖および固定化相補鎖の対のアニーリングによって形成されたいわゆる「ブリッジ化」構造であり、両鎖は、好ましくは共有結合を介して５’末端で固体支持体に固定化される。クラスター増幅方法論は、固定化アンプリコンを作製するのに固定化核酸鋳型が使用される方法の例である。他の適切な方法論もまた、本明細書で提供される方法により作製される固定化ＤＮＡ断片から固定化アンプリコンを作製するのに使用することができる。例えば、１つまたは複数のクラスターまたはコロニーは、増幅プライマーの各対の一方かまたは両方のプライマーが固定化されているかにかかわらず、固相ＰＣＲを介して形成することができる。いくつかの実施形態において、封入核酸は連続性粒子内で増幅され、次いでクラスター中のアレイまたは固体支持体に沈着される。
さらなる増幅方法には、等温増幅が挙げられる。使用され得る例示的な等温増幅方法には、以下に限定するものではないが、例えばDean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)によって例証されるような多重置換増幅（ＭＤＡ）、または例えば米国特許第６，２１４，５８７号によって例証される等温鎖置換核酸増幅が挙げられ、これらの特許文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示において使用され得る他の非PCRベースの方法には、例えば、例えばWalker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995；米国特許第５，４５５，１６６号、および第５，１３０，２３８号、ならびにWalker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)に記載された鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または例えばLage et al., Genome Research 13:294-307 (2003)に記載された超分岐鎖置換増幅（ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられ、これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。等温増幅方法は、鎖置換Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼまたはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、ゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅用の５’－＞３’ｅｘｏ－と共に使用することができる。これらのポリメラーゼの使用は、その高い処理能力および鎖置換活性を利用する。高い処理能力は、ポリメラーゼが１０～２０ｋｂ長の断片を生成することを可能にする。上記に記載したように、より小さな断片は、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼなどの低い処理能力および鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて等温条件下で作製することができる。増幅反応、条件および成分のさらなる説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６７０，８１０号の開示に詳細に記載されている。いくつかの実施形態において、これらの増幅反応を行うのに必要とされるポリメラーゼ、試薬、および成分は、連続性粒子の細孔を通過して封入核酸と相互作用し、これにより連続性粒子内で核酸を増幅することができる。いくつかの実施形態において、ランダムヘキサマーは変性ＤＮＡにアニールされ、その後、触媒酵素Ｐｈｉ ２９の存在下、一定温度で鎖置換合成される。これは、ＭＤＡ後、蛍光強度の増加によって確認される（ＤＮＡはＳＹＴＯＸで染色された）連続性粒子内でのＤＮＡ増幅をもたらす。独立に、溶解およびクリーンアップ後のＮｅｘｔｅｒａベースのタグメンテーション、ならびにその後のＰＣＲを介したｇＤＮＡ増幅（ＮｅｘｔｅｒａタグメンテーションおよびＰＣＲ後の連続性粒子内の蛍光強度の実質的な増加によって示される）もまた行われ得る。このＮｅｘｔｅｒａライブラリー調製後、連続性粒子は、３分間、８０℃に加熱されて、連続性粒子の内容物、すなわち、シーケンシング準備済みライブラリー産物を細胞から放出することができる。
本開示において有用な別の核酸増幅方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、例えばGrothues et al. Nucleic Acids Res. 21 (5):1321-2 (1993)に記載される、定常５’領域とこれに続くランダム３’領域を有する２ドメインプライマーの集団を使用するＴａｇｇｅｄ ＰＣＲである。１回目の増幅は、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づき熱変性ＤＮＡでの多くの開始を可能にするように実施される。３’領域の性質のために、開始部位は、ゲノム全体を通じてランダムとなるように企図される。その後、非結合プライマーが除去され得、定常５’領域に相補的なプライマーを用いてさらなる複製が起こり得る。
いくつかの実施形態において、封入核酸は、連続性粒子内で全部または部分的に配列決定される。封入核酸は、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ナノポアシーケンシング等を含む、ダイレクトシーケンシングなどの任意の適切なシーケンシング方法論に従って配列決定されてもよい。
１つのシーケンシング方法論は、合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）である。ＳＢＳでは、核酸鋳型（例えば、その標的核酸またはアンプリコン）に沿った核酸プライマーの伸長が、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定するためにモニタリングされる。根底にある化学プロセスは、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）であってもよい。特定のポリメラーゼベースのＳＢＳ実施形態において、プライマーに付加されるヌクレオチドの順序およびタイプの検出が鋳型の配列を決定するのに使用され得るように、蛍光標識ヌクレオチドが鋳型依存的様式でプライマーに付加される（これによりプライマーを伸長する）。
１つまたは複数の増幅された封入核酸が、サイクル中の試薬の反復デリバリーを伴うＳＢＳまたは他の検出法に供されてもよい。例えば、最初のＳＢＳサイクルを開始するために、１つまたは複数の標識されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ等が、１つまたは複数の増幅された核酸分子を収容する連続性粒子の中に／を通って流されてもよい。プライマー伸長により、標識ヌクレオチドが組み込まれる部位が検出されてもよい。ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに付加されると、さらなるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性をさらに含むことができてもよい。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド類似体が、脱ブロック剤がデリバリーされて該部分を除去するまでその後の伸長が生じ得ないようにプライマーに付加されてもよい。故に、可逆的終結を使用する実施形態のために、脱ブロック試薬がフローセルにデリバリーされてもよい（検出が生じる前後に）。洗浄は、様々なデリバリー工程間で実施されてもよい。サイクルは、次いでｎ回反復されて、ｎヌクレオチドによってプライマーを伸長し、これにより長さｎの配列を検出することができる。本開示の方法によって作製されるアンプリコンを用いた使用に容易に適合され得る例示的なＳＢＳ手順、流体システムおよび検出プラットホームは、例えば、Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、ＷＯ０４／０１８４９７；米国特許第７，０５７，０２６号；ＷＯ９１／０６６７８；ＷＯ０７／１２３７４４；米国特許第７，３２９，４９２号；米国特許第７，２１１，４１４号；米国特許第７，３１５，０１９号；米国特許第７，４０５，２８１号、およびＵＳ２００８／０１０８０８２に記載されており、これらの特許文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
サイクル反応を使用する、パイロシーケンシングなどの他のシーケンシング手順が使用されてもよい。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に組み込まれたときに無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する［Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996)；Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001)；Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998)；米国特許第６，２１０，８９１号；米国特許第６，２５８，５６８号および米国特許第６，２７４，３２０号、これらの文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる］。パイロシーケンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に直ちに変換されることにより検出することができ、生成されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼ産生光子を介して検出することができる。故に、シーケンシング反応が、発光検出システムを介してモニタリングされ得る。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射源は、パイロシーケンシング手順には必要ない。本開示により作製されるアンプリコンへのパイロシーケンシングの適用に適合され得る有用な流体システム、検出器および手順は、例えば、ＷＩＰＯ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１号、ＵＳ２００５／０１９１６９８Ａ１、米国特許第７，５９５，８８３号、および米国特許第７，２４４，５５９号に記載されており、これらの文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを伴う方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチド組み込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を通じて、またはゼロモード導波路（ＺＭＷ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴベースのシーケンシングの手法および試薬は、例えば、Levene et al. Science 299, 682-686 (2003)；Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)；Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)に記載されており、これらの文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかのＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されるプロトンの検出に基づくシーケンシングは、商業的に入手可能な電気的検出器および関連手法を使用することができる。そのようなシーケンシングシステムの例は、パイロシーケンシング（例えば、Ｒｏｃｈｅの子会社、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に入手可能なプラットホーム）、γ－リン酸標識ヌクレオチドを用いるシーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に入手可能なプラットホーム）およびプロトン検出を用いるシーケンシング（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔから商業的に入手可能なプラットホーム）、または各々が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００９／００２６０８２Ａ１；ＵＳ２００９／０１２７５８９Ａ１；ＵＳ２０１０／０１３７１４３Ａ１；もしくはＵＳ２０１０／０２８２６１７Ａ１に記載されたシーケンシング方法およびシステムである。動力学的排除（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を用いて標的核酸を増幅するための本明細書に記載された方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載された方法は、プロトンを検出するのに使用されるアンプリコンのクローン集団を作製するのに使用することができる。
別のシーケンシング法は、ナノポアシーケンシングである［例えば、Deamer et al. Trends Biotechnol. 18、147-151 (2000)；Deamer et al. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002)；Li et al. Nat. Mater. 2:611-615 (2003)参照。これらの文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる］。いくつかのナノポア実施形態において、標的核酸から除去された標的核酸または個々のヌクレオチドは、ナノポアを通過する。核酸またはヌクレオチドがナノポアを通過するとき、細孔の電気伝導度の変動を測定することにより各ヌクレオチドタイプが同定され得る［米国特許第７，００１，７９２号；Soni et al. Clin. Chem. 53、1996-2001 (2007)；Healy、Nanomed. 2, 459-481 (2007)；Cockroft et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)。これらの文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる］。
本開示による検出に適用され得るアレイベースの発現および遺伝子型解析の例示的な方法は、米国特許第７，５８２，４２０号；第６，８９０，７４１号；第６，９１３，８８４号もしくは第６，３５５，４３１号または米国特許公開第２００５／００５３９８０Ａ１号；第２００９／０１８６３４９Ａ１号またはＵＳ２００５／０１８１４４０Ａ１に記載されており、これらの特許文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される核酸の単離、増幅、およびシーケンシングの方法では、様々な試薬が核酸単離および調製に使用される。そのような試薬には、例えば、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５およびＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、または二価カチオンが挙げられ得る。遺伝子材料が連続性粒子内に保持されるのに対し、これらの試薬は連続性粒子の細孔を通過する。本明細書に記載された方法の利点は、それらが連続性粒子内で核酸を処理するための封入された微小環境を提供することである。これは、標的核酸を迅速および効率的に処理するための単一細胞処理を可能にする。
アダプターは、シーケンシングプライマー部位、増幅プライマー部位、およびインデックスを含むことができる。本明細書で使用される場合、「インデックス」は、核酸にタグを付加する、および／または核酸源を同定する分子識別子および／またはバーコードとして使用され得るヌクレオチドの配列を含み得る。いくつかの実施形態において、インデックスは、単一の核酸、または核酸のサブ集団を同定するのに使用することができる。いくつかの実施形態において、核酸ライブラリーは、連続性粒子内で調製することができる。いくつかの実施形態において、連続性粒子内に封入された単一細胞は、例えば連続性保存転移（ＣＰＴ－ｓｅｑ）アプローチを用いて、単一細胞のコンビナトリアルインデックス付けに使用されてもよい。いくつかの実施形態において、単一細胞由来のＤＮＡは、バーコード化トランスポゾンを有する別の連続性粒子とのＷＧＡ増幅、およびバーコーディング用のゲノムＤＮＡを放出するための、例えば還元剤と接触させることによるゲルマトリックスの溶解後の単一細胞の封入によってバーコード化されてもよい。
本明細書に記載された「空間インデックス付け」方法および手法の実施形態は、データ解析を短縮し、単一細胞および長いＤＮＡ分子からのライブラリー調製のプロセスを簡略化する。単一細胞シーケンシングの既存のプロトコルは、細胞の効率的な物理的分離、および各単離細胞を固有にバーコード化すること、およびシーケンシングをするために全てを元通りに一緒にプールすることを必要とする。合成の長いリードに対する現在のプロトコルはまた、面倒なバーコーディング工程、ならびにシーケンシング用に各バーコード化断片を一緒にプールし、各バーコード化細胞に由来する遺伝子情報を区別するためにデータ解析をさせることも必要とする。これらの長いプロセス中には、配列の脱落をもたらす遺伝子材料の喪失もある。本明細書に記載された実施形態は、プロセスを短縮するだけでなく、単一細胞に関するデータ分解能も高める。さらに、本明細書で提供される実施形態は、新たな微生物のゲノムのアセンブリーを簡略化する。本明細書に記載された実施形態は、稀な遺伝的変異および変異の同時発生を明らかにするのに使用され得る。いくつかの実施形態において、放出まで連続性粒子中に閉じ込められるＤＮＡライブラリーは、放出プロセスおよびハイドロゲル構築を制御することにより、表面で放出される断片の大きさを制御する機会を提供する。
いくつかの実施形態において、ライブラリーは、アダプター配列中のプライマー部位を用いて増幅され、アダプター配列中のシーケンシングプライマー部位を用いて配列決定され得る。いくつかの実施形態においてアダプター配列は、核酸源を同定するためのインデックスを含むことができる。その後の増幅工程の効率は、プライマーダイマーの形成によって低減され得る。その後の増幅工程の効率を上げるために、非ライゲート一本鎖アダプターがライゲーション産物から除去され得る。
連続性粒子を用いた核酸ライブラリーの調製
本明細書で提供されるシステム、方法および組成物のいくつかの実施形態は、アダプターが標的核酸にライゲートされる方法を含む。アダプターは、シーケンシングプライマー結合部位、増幅プライマー結合部位、およびインデックスを含んでもよい。例えば、アダプターは、Ｐ５配列、Ｐ７配列、またはその補体を含んでもよい。本明細書で使用される場合Ｐ５配列は、配列番号１（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ）によって定義された配列を含み、Ｐ７配列は、配列番号２（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ）によって定義された配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｐ５またはＰ７配列は、１～２０個、例えば１～１５個、または１～１０個のヌクレオチド長、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド長であり得るスペーサーポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、スペーサーは１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、スペーサーは、１０ＴスペーサーなどのポリＴスペーサーである。スペーサーヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端に含まれてもよく、ポリヌクレオチドの５’末端との結合を介して適切な支持体に結合され得る。結合は、ポリヌクレオチドの５’末端に存在するホスホロチオエートなどの硫黄含有求核剤を通じて達成することができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリＴスペーサーおよび５’ホスホロチオエート基を含むであろう。故に、いくつかの実施形態において、Ｐ５配列は、５’ホスホロチオエート－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号３）であり、いくつかの実施形態において、Ｐ７配列は、５’ホスホロチオエート－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ－３’（配列番号４）である。
インデックスは、核酸分子源を同定するのに有用であり得る。いくつかの実施形態において、アダプターは、例えば一端または両端のアダプターの伸長を防ぐブロッキング基の付加によって、コンカテマーの形成を避けるように修飾されてもよい。３’ブロッキング基の例は、３’スペーサーＣ３、デオキシヌクレオチド、および基質への結合を含む。５’ブロッキング基の例は、脱リン酸化５’ヌクレオチド、および基質への結合を含む。
アダプターは、一本鎖核酸などの核酸を含む。アダプターは、約５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド未満、超の、もしくはこれに等しい長さ、または上述の大きさのいずれか２つの間の範囲を有する短い核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、アダプターは、連続性粒子の細孔を通過するのに十分な大きさである。標的核酸には、ゲノムもしくはｃＤＮＡなどのＤＮＡ；ｍＲＮＡ、ｓＲＮＡもしくはｒＲＮＡなどのＲＮＡ；またはＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッドが挙げられる。核酸は、連続性粒子内に封入された単一細胞から単離することができる。核酸は、ホスホジエステル結合を含有してもよく、例えば、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ－メチルホスホロアミダイト、ならびにペプチド核酸骨格および結合を含む他のタイプの骨格を含んでもよい。核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン（ｘａｎｔｈａｎｉｎｅ）、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニンを含む塩基の任意の組合せ、ならびにニトロピロール（３－ニトロピロールを含む）およびニトロインドール（５－ニトロインドールを含む）などの塩基類似体を含有してもよい。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも１つの無差別塩基（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｂａｓｅ）を含んでもよい。無差別塩基は、１個を超える異なるタイプの塩基との塩基対を含み得、例えば、ゲノムＤＮＡ試料などの複雑な核酸試料におけるランダムハイブリダイゼーションに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーまたはインサートに含まれる場合、有用であり得る。無差別塩基の例には、アデニン、チミン、またはシトシンと対合し得るイノシンが挙げられる。他の例には、ヒポキサンチン、５－ニトロインドール、アシル（ａｃｙｌｉｃ）５－ニトロインドール、４－ニトロピラゾール、４－ニトロイミダゾールおよび３－ニトロピロールが挙げられる。少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれ以上のタイプの塩基と塩基対合することができる無差別塩基が使用され得る。
標的核酸は、試料中の核酸の平均大きさが、約２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ未満、超である、もしくはこれに等しい、または上述の大きさのいずれか２つの間の範囲である試料を含んでもよい。いくつかの実施形態において、試料中の核酸の平均大きさは、約２０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、５０ヌクレオチド未満、超である、もしくはこれに等しい、または上述の大きさのいずれか２つの間の範囲である。いくつかの実施形態において、核酸は、連続性粒子の細孔を通過できないように核酸が連続性粒子内に捕捉される十分な大きさである。
例示的方法は、その後のライゲーション工程におけるコンカテマーの形成を防ぐための標的核酸の５’末端の脱リン酸化；脱リン酸化標的の３’末端へのリガーゼを用いた第１のアダプターのライゲート（第１のアダプターの３’末端はブロックされる）；ライゲートされた標的の５’末端の再リン酸化；脱リン酸化標的の５’末端への一本鎖リガーゼを用いた第２のアダプターをライゲート（第２のアダプターの５’末端は非リン酸化される）を含む。
別の例は、一本鎖３’オーバーハングを有する二本鎖核酸を形成するための５’エキソヌクレアーゼによる部分的消化を含む。３’ブロッキング基を含有するアダプターが、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸の３’末端にライゲートされ得る。ライゲートされたアダプターを有する３’オーバーハングを有する二本鎖核酸は、脱ハイブリダイズされて一本鎖核酸を形成し得る。非リン酸化５’末端を含有するアダプターが、一本鎖核酸の５’末端にライゲートされ得る。
核酸の５’ヌクレオチドなどの核酸を脱リン酸化する方法は、核酸をホスファターゼと接触させることを含む。ホスファターゼの例には、仔ウシ腸ホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、南極ホスファターゼ、およびＡＰＥＸアルカリホスファターゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）が挙げられる。
核酸をライゲートする方法は、核酸をリガーゼと接触させることを含む。リガーゼの例には、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、メタノバクテリウムＲＮＡリガーゼ、およびＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ）が挙げられる。
核酸の５’ヌクレオチドなどの核酸をリン酸化する方法は、核酸をキナーゼと接触させることを含む。キナーゼの例には、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼが挙げられる。
本明細書で提供される実施形態は、核酸ライブラリーが単一反応容量で調製されるように連続性粒子中で核酸ライブラリーを調製することに関する。
本明細書で提供されるシステムおよび方法の実施形態は、ハイドロゲルポリマーのいずれか１つまたは複数、架橋剤、または細胞を封入する連続性粒子を調製するためのマイクロ流体装置を含有し、ならびに遺伝子材料の処理に有用な成分［本明細書に記載される、および遺伝子材料のそれぞれの処理に使用される、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５およびＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、または二価カチオンを含む、細胞溶解、および核酸増幅およびシーケンシング用、または核酸ライブラリー調製用の試薬を含む］をさらに含むキットを含む。
実施例１
連続性粒子の調製
以下の例は、単一細胞を封入する連続性粒子をマイクロ流体液滴生成器を用いて調製する実施形態を示す。
－８０℃で貯蔵した細胞を含有する試料を室温で解凍した。１００μＬの各試料を滅菌１．７ｍＬチューブに移し、１ｍＬ０．８５％ＮａＣｌで試料を１回洗浄した。試料をペレット化し、洗浄溶液を除去した。細胞ペレットをハイドロゲル溶液と混合して細胞をハイドロゲル溶液に再懸濁した。
均一な粒度分布の連続性粒子を生成するために、図１に例証する生成器などのマイクロ流体液滴生成器を使用した。ハイドロゲルポリマーおよび細胞を含有する溶液を、マイクロ流体液滴生成器の最初の流路に導入した。スペーサー油として使用する鉱油を第２の流路に添加し、架橋剤を第３の流路に添加した。第３の流路で架橋剤と接触すると、ハイドロゲルは単一細胞を封入する連続性粒子を瞬時に形成した。図６に表すように、連続性粒子は、連続性粒子のポリマーシェルのＳＨ基を標的にする蛍光色素で染色した。図６の右のパネルは、ポリマーシェル細孔を通じて連続性粒子中に拡散するヘキスト（青色核染色）およびＡＦ－６４７ ＢＳＡで染色した連続性粒子の６０×対物像を表す、連続性粒子内の単一細胞の染色を示す。表１に示すように、遅効性架橋剤または即効性架橋剤を含む架橋油のタイプを、架橋の迅速性を調整するために選択した。
表１：架橋化学

実施例２
連続性粒子で行われる同時アッセイ
以下の例は、実施例１からの連続性粒子で行われる、ＳＣＩ－ｓｅｑ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、コンビナトリアルインデックス付け、および単一細胞全ゲノム増幅を含む例示的なアッセイを示す。
実施例１からの連続性粒子を得、単一連続性粒子が単一のウェルに沈着されるように、ウェルを有するプレートに沈着させた。溶解緩衝液を導入して細胞を溶解し、その後洗浄し、これにより核酸を細胞から抽出した。溶解細胞を含む連続性粒子を、以下に記載する一連のアッセイに次いで曝露した。
図７に概説するように、インデックス付きトランスポソーム（ＴＳＭ）を使用してゲノムＤＮＡをタグメント化し、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ断片を生成した。プロテイナーゼ／ＳＤＳ処理後、ＴＳＭと同じインデックスを有するオリゴＴを各ウェルに添加して、逆転写（ＲＴ）によってｃＤＮＡ合成を開始した。他方の末端のＰＣＲアダプターを、ランダマー伸長によって導入した。これはインデックス１を生成した。各ウェルからの連続性粒子を一緒にプールし、次いでインデックス付きＰＣＲプレートに分割してインデックス２を生成した。この２段階インデックス付けは、最大１５０，０００（３８４×３８４）細胞まで拡大することができる；生成した最終ライブラリーは、同じ細胞由来のｇＤＮＡおよびｃＤＮＡが同じインデックスによってグループ化され、ＲＮＡシグナルをＡＴＡＣシグナルと区別する内部マーカーとしてオリゴＴ－ＵＭＩパターンが機能する、ＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑの混合物であった。
さらに、図８に示すように、ランダム伸長も完全長ＲＮＡ－ｓｅｑに使用した。この場合、ＴＳＭのインデックスはランダマーのインデックスとは異なった。これらの２つのインデックスセット間の１対１マッチングは、単一細胞からのリードならびに分化ＤＮＡおよびＲＮＡシグナルを同定するのに役立った。ＵＭＩもまた、リード解析の精度を改善するためにこの方法において適用した。
３段階コンビナトリアルインデックス付けアッセイも、図９の概略図に概説するように、２回のインデックス付きスプリント（ｓｐｌｉｎｔ）ライゲーションおよび１回のインデックス付きＰＣＲを用いて行った。この方法では、ＴＳＭおよびオリゴＴはユニバーサルであり、両方ともスプリント１断片を含有する。スプリント１断片は、スプリントライゲーションによるインデックス付加を可能にした。３段階インデックス付けは、最大１００万個の細胞スループット（９６×９６×９６）を達成した。図１０に概説するように、細胞スループットを高めるために、インデックス付きＴＳＭを用いてＡＴＡＣ－ｓｅｑの別の３段階コンビナトリアルインデックス付けを行った。ユニバーサルＴＳＭを使用するのではなく、ＴＳＭは固有のインデックスをそのＢ７ＧおよびＡ７Ｇ側に含有した。２つの異なるスプリントを使用して、インデックス付きＰＣＲに必要なインデックス付きアダプターを結合した。図１０では、インデックス付けは以下の成分を含んだ：Ｂ１５＿Ｎ６＿Ｌｉｎｋ１配列（配列番号１１）を一緒に形成するＢ１５アダプター配列（配列番号５）、Ｎ６、およびＬｉｎｋ１；Ｐｈｏｓ＿Ｌｉｎｋ２＿Ａ７Ｇ＿ＭＥ配列（配列番号１２）を一緒に形成するＰｈｏｓ＿Ｌｉｎｋ２、Ａ７Ｇ配列（配列番号９）、およびＭＥ配列（配列番号７）；Ａ１４＿Ｎ６＿Ｌｉｎｋ１配列（配列番号１３）を一緒に形成するＡ１４アダプター配列（配列番号６）、Ｎ６、およびＬｉｎｋ１：ならびにＰｈｏｓ＿Ｌｉｎｋ２＿Ｂ７Ｇ＿ＭＥ配列（配列番号１４）を一緒に形成するＰｈｏｓ＿Ｌｉｎｋ２、Ｂ７Ｇ（配列番号１０）、およびＭＥ配列（配列番号７）。図１０はまた、ＭＥ相補配列（配列番号８）、スプリント１配列（配列番号１５）、およびスプリント２配列（配列番号１６）も提供する。
単一細胞全ゲノム増幅も図１１に概説するように連続性粒子を用いて実施した。これは、個々のウェル中の連続性粒子のインデックス付きＴ７転移と、その後のプーリング、およびＴ７インビトロ転写（ＩＶＴ）線形増幅を介した伸長を用いて行った。インデックス付きランダム伸長用にビーズを再び分離し、プールし、最後のインデックス付きＰＣＲ用に再び分割した。
連続性粒子は、ＦＡＭ標識トランスポソームによって標的化した場合、効率的なタグメンテーションを示した。核をヘキストで染色（青色発光によるＤＮＡ染色）し、一方転移核は、ＦＡＭ（蛍光色素）で蛍光緑色に染色した。細胞をＳＤＳで溶解すると、連続性粒子のバックグラウンド蛍光が増加したが、全く細胞がない連続性粒子からはシグナルが見られなかった。結果は、連続性粒子の内側に封入された細胞のＡＴＡＣ－ｓｅｑライブラリーが生成され得、タグメンテーションから短い断片の漏出はほんの一部であることを示している。
実施例３
連続性粒子における核酸ライブラリー調製
以下の例は、連続性粒子内に封入された細胞から全ゲノムライブラリーを調製するための方法を示す。
図１２は、連続性粒子内に封入された単一細胞で全ゲノムライブラリーを行うための概略図を概説する。図１２の概略図に概説するように、連続性粒子をＮｅｘｔｅｒａ全ゲノムライブラリーを生成するのに使用した。実施例１で調製した連続性粒子を得た。連続性粒子（ＣＰ）を４５μｍ細胞ストレーナにローディングし、ＰＢＳまたはＴｒｉｓ－Ｃｌで複数回の洗浄を行って全ての非封入細胞を除去した。細胞を連続性粒子に封入する１つの利点は、それらを操作および処理する能力の向上である。これを行う１つの簡単な方法は、スピンカラムまたはフィルタープレートの使用による。フィルターの細孔径はビーズ直径より小さくてもよい。フィルタープレートの例には、２０、４０、および６０μｍ細孔径を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－Ｍｅｓｈ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、８．０μｍ細孔を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、または３０～４０μｍ細孔を有するＰａｌｌのＡｃｒｏＰｒｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ ９６－Ｗｅｌｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎが挙げられるが、これらに限定されない。これらのフィルタープレートにより、ビーズ封入細胞は溶液から容易に分離され、複数回の緩衝液交換が可能になった。
洗浄ビーズを緩衝液に懸濁し、フィルターから除去した。ビーズの最終濃度、細胞ローディングの効率を推定するために、および非封入細胞が残留していないことを確実にするために、ビーズのアリコートを顕微鏡下で可視化した。
Ｎｅｘｔｅｒａタグメンテーションを行うために、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの２０μｍ Ｎｙｌｏｎ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－Ｍｅｓｈ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅを使用した。ビーズのフィルターへの接着を制限するために、ビーズをＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７でプレウェッティングした。５００ｇで３０秒間のプレートの遠心分離後、フィルターを通って流れた緩衝液はビーズを維持する。ビーズを２００μＬのＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液で２回洗浄し、次いで溶解緩衝液（０．１％ＳＤＳ）に懸濁した。ビーズを溶解緩衝液で１分間インキュベートした後、遠心分離によって除去した。残留溶解緩衝液を除去するために、２回のさらなる２００μＬ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ洗浄を行った。次に、細胞をピペットで混和して４５μＬの１×タグメンテーション緩衝液に懸濁し、次いでストリップチューブに移した。４５μＬのビーズに、５μＬのＴａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｅｎｚｙｍｅ（ＴＤＥ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）を添加し、サーマルサイクラーでのインキュベーションを、ＲＴで１時間、５５℃で３０分間行った。あるいは、タグメンテーションは、ビーズ封入細胞をタグメンテーションマスターミックスに懸濁し、ヒートブロックでインキュベートしてフィルタープレートで行ってもよい。タグメンテーション後、ビーズのアリコートをヘキスト色素で染色し、顕微鏡下で可視化した。可視化によりＤＮＡがビーズ中に残留していることを確認した。
タグメント化ビーズ（２５μＬ）を、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ ＰＣＲ ＭＭ（ＮＰＭ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）およびＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。マスターＰＣＲミックスに、０．１％ＳＤＳを添加してＤＮＡに結合したＴｎ５を除去した。プレインキュベーションを７５℃で行って、ＳＤＳの存在下のＴｎ５除去を補助した。１１回のＰＣＲサイクルを行って最終ライブラリーを生成した。ＰＣＲ後、ライブラリーを０．９×ＳＰＲＩを用いて精製し、ｄｓＤＮＡキュービットおよび／またはＢｉｏＡｎａｌｙｓｅｒを用いて定量し、ＭｉＳｅｑおよび／またはＮｅｘｔＳｅｑで配列決定した。
この例に記載した方法は、ｓｃｉＳＥＱ（Vitak et al. Nat Meth. 2017;14:302-308）と類似したアプローチを用いて単一細胞シーケンシングを行うためにスケールアップすることができる。例えば、９６インデックス付きタグメンテーション反応を同時に行うための９６ウェルフィルタープレートの使用は、スケールアッププロセスで行うことができる。ビーズをプレートに添加した後、連続緩衝液を添加し、次いで遠心分離または真空によって除去する。タグメンテーション後、ビーズをフィルターから回収し、プールする。プールしたビーズを、多重化ＰＣＲ用に第２の９６ウェルＰＣＲプレートに再分配する。この二重レベルのインデックス付けスキーム（タグメンテーションおよびＰＣＲインデックス付け）では、単一ビーズ封入細胞由来の全てのＤＮＡ断片は、細胞のゲノムを再構築するためにデコンボリューションすることができる同じバーコードを受け取る。
この例に概説する工程は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ Ｖａｃｕｕｍ ＭａｎｉｆｏｌｄまたはＯｒｏｃｈｅｍの９６－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ Ｖａｃｕｕｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄなどの真空マニホールドの追加により、リキッドハンドリングプラットホームでの自動化に適している。これらの真空マニホールドは、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ、Ｍｉｃｒｏｌａｂ Ｓｔａｒ、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓ等を含む多くのリキッドハンドリングプラットホームに追加することができる。タグメンテーションは、フィルタープレートをサーマルブロックに移して自動化してもよい。プレートは、次いで、タグメンテーション後洗浄のために真空マニホールドに戻す。
本明細書に記載された実施形態、例、および図は、溶解からライブラリー生成までのプロセス中、物理的に閉じ込められた空間に遺伝子材料を保持するための組成物、方法、およびシステムを提供する。いくつかの実施形態は、閉じられた空間のフローセルの表面で放出される単一の長いＤＮＡ分子または単一細胞に由来するライブラリーを提供する。個々のコンパートメント中の単一ＤＮＡ分子または単一細胞由来のライブラリーがフローセルの表面に放出されると、各コンパートメントからのライブラリーは、互いに極めて近接して播種されるようになる。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と同義であり、包含的または無制限であり、追加の、列挙されない要素または方法工程を排除しない。
上記の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示する。本発明は方法および材料の修正、ならびに製作方法および装置の変更を受けやすい。そのような修正は、本明細書に開示された本開示の検討または本発明の実践から当業者に明らかになるであろう。その結果、本発明が、本明細書に開示された特定の実施形態に限定されることを意図するものではないが、本発明が、本発明の真の範囲および趣旨内に入る全ての修正および代替を含むことを意図する。
公開および未公開出願、特許、および参考文献を含むがこれらに限定されない、本明細書に引用された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含有される開示と矛盾する程度において、本明細書は、そのような矛盾材料の全てに取って代わり、および／または優先することを意図するものである。

Claims (23)

  1. 単一細胞を封入する中空ビーズであって、中空ビーズは、
    ＰＥＧ－エポキシドおよびアミン、またはＰＥＧ－エポキシドおよびＰＥＧ－アミンを反応させて得られたポリマーシェルと、
    ポリマーシェル内に置かれた単一細胞と
    を含み、ポリマーシェルが、単一細胞を保持しながらポリマーシェルを通じて試薬の拡散を可能にする細孔を含む、中空ビーズ。
  2. ポリマーシェルの内部が、水性環境を含む、請求項１に記載の中空ビーズ。
  3. ポリマーシェル内に置かれた単一細胞が、ポリマーシェルとの相互作用を受けない、および／またはポリマーシェルと接触していない、請求項１に記載の中空ビーズ。
  4. 中空ビーズが２０μｍ～２００μｍの直径を有する、請求項１に記載の中空ビーズ。
  5. ポリマーシェルが、４アームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１に記載の中空ビーズ。
  6. 単一細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の中空ビーズ。
  7. 試薬が、酵素、化学物質、および５０塩基対未満の大きさを有するプライマーを含む、請求項１に記載の中空ビーズ。
  8. 試薬が、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ、トランスポザーゼ、Ｔｎ５トランスポザーゼ、プライマー、Ｐ５アダプター配列プライマー、Ｐ７アダプター配列プライマー、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、または二価カチオンを含む、請求項１に記載の中空ビーズ。
  9. 単一細胞を中空ビーズ内に封入する方法であって、
    単一細胞をスペーサー油中でポリマーと混合して混合物（ａ）を形成すること；
    混合物（ａ）を架橋油と混合して、単一細胞を封入するポリマーシェルを形成することであって、ここでポリマーシェルが、単一細胞を保持しながらポリマーシェルを通じて試薬の拡散を可能にする細孔を含み、ここでポリマーがＰＥＧ－エポキシドであり、かつ架橋油が油に溶解されたアミン、または、ＰＥＧ－アミンである、形成すること
    を含む、方法。
  10. 中空ビーズが２０μｍ～２００μｍの直径を有する、請求項９に記載の方法。
  11. ポリマーが、４アームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項９に記載の方法。
  12. スペーサー油が、鉱油またはフッ化炭素油を含む、請求項９に記載の方法。
  13. 単一細胞が哺乳動物細胞である、請求項９に記載の方法。
  14. 試薬が、酵素、化学物質、および５０塩基対未満の大きさを有するプライマーを含む、請求項９に記載の方法。
  15. 試薬が、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ、トランスポザーゼ、Ｔｎ５トランスポザーゼ、プライマー、Ｐ５アダプター配列プライマー、Ｐ７アダプター配列プライマー、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、界面活性剤、または二価カチオンを含む、請求項９に記載の方法。
  16. 混合が、単一細胞、ポリマー、スペーサー油、および架橋油を液滴生成器に投入することを含む、請求項９に記載の方法。
  17. 液滴生成器がマイクロ流体チップである、請求項１６に記載の方法。
  18. 単一細胞が、固定剤との接触による混合の前に固定される、請求項９に記載の方法。
  19. 固定剤が、メタノールまたはエタノールなどのアルコール、またはパラホルムアルデヒドなどのアルデヒドを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 中空ビーズ内に封入された単一細胞で複数の連続同時アッセイを行う方法であって、
    請求項１から８のいずれか一項に記載の単一細胞を封入する中空ビーズを得ることと、
    単一細胞を試薬と連続的に接触させて複数の連続同時アッセイを行うことと
    を含む、方法。
  21. 複数の連続同時アッセイが、溶解、ＤＮＡ解析、ＲＮＡ解析、タンパク質解析、タグメンテーション、核酸増幅、核酸シーケンシング、ＤＮＡライブラリー調製、シーケンシングを用いたトランスポザーゼ接近可能なクロマチンアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、連続性保存転移（ＣＰＴ－ｓｅｑ）、単一細胞コンビナトリアルインデックス付けシーケンシング（ＳＣＩ－ｓｅｑ）、もしくは単一細胞ゲノム増幅、または連続的に行われるそれらの任意の組合せを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 単一細胞を封入する中空ビーズが固体支持体上に播種される、請求項２０に記載の方法。
  23. 固体支持体が、エッチング表面、ウェル、フローセル装置、マイクロ流体流路、ビーズ、またはカラムである、請求項２２に記載の方法。
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