JP7001475B2 - 細胞の構成成分を分析するための方法及び組成物 - Google Patents

細胞の構成成分を分析するための方法及び組成物 Download PDF

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Description

本願の実施形態は、細胞の構成成分を分析するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態において、本願は、単一細胞の構成成分を分析するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態において、本願は、単一細胞の種類を同定するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態において、方法及び組成物は、核酸のシークエンシングに関する。提供する方法及び組成物のいくつかの実施形態は、そのような単一細胞の複合状態を導き出すのに有用である。
生体試料中に存在する特定の核酸配列の検出は、例えば、微生物の同定及び分類、感染性疾患の診断、遺伝的異常の検出及び特徴付け、癌に関連した遺伝的変化の同定、疾患に対する遺伝的感受性の研究、並びに様々な種類の治療に対する反応の測定を行う方法として用いられてきた。生体試料中の特定の核酸配列を検出する一般的な技術は、核酸シークエンシングである。
核酸シークエンシング法は、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔが用いた化学分解法、及びＳａｎｇｅｒが用いた鎖伸長法から著しく発展してきた。今日、核酸の並列処理を全て１回のシークエンシングランで行うことを可能にする、いくつかのシークエンシング法が用いられている。そのため、１回のシークエンシングランから生成される情報は、膨大なものとなる可能性がある。
単一細胞の内容物を、ポリマーマトリックスに埋め込む又はビーズに付着させることによる、ＤＮＡ維持エレメント（ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＣＥ）の４段階の組み合わせインデックス化を示す模式図である。区画特異的なインデックスを、各組み合わせプーリング及び再分配工程（段階）で付着させる。示す例では、４つの段階の結果、（ライゲーション、ポリメラーゼ伸長、タグメント化等の繰り返しラウンドを介して）４つのインデックスが互いに連結され、シークエンスの読み上げを容易にすることができる。別の方法として、ＤＮＡを含む連続性維持エレメントは、マトリックスに封入されるか又はビーズに固定された、区分されたＤＮＡ区画（即ち、元のＤＮＡ試料をサブサンプルするＤＮＡ希釈物）により作製することができる。このタイプの希釈物は、フェージング及びアセンブリのアプリケーションに有用である。 ２段階の組み合わせインデックス化スキームを用いた単一細胞のＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを調製する方法を示し、第１のレベルのインデックスはタグメント化を介して付着し（トランスポゾンにおける区画特異的なインデックス）及び第２の段階のインデックスはＰＣＲにより付着する（ＰＣＲプライマー上の区画特異的なインデックス）。単一細胞容器の内容物（即ち、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）は、任意選択的に全ゲノム増幅（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＷＧＡ）又は全トランスクリプトーム増幅工程を用いてもよい。 液滴等のＣＥ中の単一細胞の内容物からｃＤＮＡライブラリーを作製する方法を示す。示す例では、インデックスを用いて、異なる試料をラベルしている。 提案する組み合わせインデックス化スキームを介して分析することができる、単一細胞の代表的な内容物を示す。 ポリマービーズ等の連続維持エレメント（ＣＥ）内に捕捉された単一細胞の内容物を封入及び溶解することによりＣＥを作製するための、例示的な実施形態の概略を示す。細胞は、例えば、ポリマービーズに埋め込まれる。単一細胞からの全ての構成成分をビーズ内で互いに近接して保持し、続いて、１つ又は複数の構成成分を増幅し、修飾（ｃＤＮＡ合成）し、その後インデックス又はタグでラベルすることができる。 ポリマービーズ等の連続維持エレメント（ＣＥ）内に捕捉された単一細胞の内容物を封入及び溶解することによりＣＥを作製するための、例示的な実施形態の概略を示す。細胞は、例えば、ポリマービーズに埋め込まれる。単一細胞からの全ての構成成分をビーズ内で互いに近接して保持し、続いて、１つ又は複数の構成成分を増幅し、修飾（ｃＤＮＡ合成）し、その後インデックス又はタグでラベルすることができる。 封入、増幅／ｃＤＮＡ、又は重合段階で、コードＤＮＡ配列（プラスミド等）を加えることにより、試料のインデックス化を行うことができる、例示的な実施形態の概略を示す。各試料は、異なるセットのコードプラスミド又はコードプラスミドの組み合わせを用いて調製する。組み合わせインデックス化されたどのＣＥも、対応する組み合わせインデックス化された試料をコードするライブラリーエレメントを生成することになる。この方法において、ライブラリーエレメントは、その起源のＣＥ及び起源の試料に戻ってマッピングすることができる。 ポリマーマトリックスビーズ等のＣＥ中における単一細胞の内容物の封入を示す概略図である。 直接表面捕獲による細胞の構成成分のハイスループット解析を示す例示的な概略図である。「Ａ」は、細胞集団を示す。「Ｂ」は、表面結合トランスポソームを示す。「Ｃ」では、細胞は表面上へ流れる。「Ｄ」では、細胞は溶解し、細胞の構成成分は、管理された方法で、細胞が捕捉された部位周辺に拡散することができる。「Ｅ」では、核酸がトランスポソームにより捕捉（タグメント化）される。細胞膜又は核が溶解したかどうかにより、異なる細胞構成成分が捕捉される。構成成分特異的な捕捉部分（即ち、抗体、受容体、リガンド）を用いることにより、種々の細胞の構成成分を捕捉することができる。捕捉した分子の分析を、捕捉表面上で直接行うことができる。別の方法として、捕捉した分子を採取し、異なる表面上で分析することもできる。この場合、第１の表面は複数の領域（即ち、パッド）で構成され、各パッドは固有のバーコードを共有するオリゴで被覆されているため、同じパッド上に捕捉された分子は、同じ同定バーコードを共有することになる。 図７－１と同様である。 ビーズ上の連続性維持エレメントを用いた核酸の解析を示す例示的な概略図である。 例示的なモデル化法を示す。 例示的なモデル化法を示す。 例示的なモデル化法を示す。 例示的なモデル化法を示す。 連続エレメントの作製に有用な粒子を作製する方法を示す。
本発明のいくつかの態様は、連続性維持エレメント（ＣＥ）内に保存されるか、埋め込まれるか、又は含まれる単一細胞の構成成分の評価に関連した方法及び組成物に関する。
１つの態様において、単一細胞からの複数の被検物質タイプを分析する方法を本明細書に開示する。いくつかの実施形態において、複数の連続性維持エレメント（ＣＥ）を提供し、各ＣＥは単一細胞を含む。細胞を、単一細胞内の複数の被検物質がＣＥ内に放出されるように、ＣＥ内で溶解する。いくつかの実施形態において、複数のタイプのレポーター部分を、各タイプのレポーター部分が各タイプの被検物質に特異的となるように、提供する。いくつかの実施形態において、レポーター部分は単一細胞を同定する。複数の被検物質を、各タイプの被検物質が被検物質のタイプに特異的なレポーター部分を含むように、修飾する。いくつかの実施形態において、前記レポーター部分を含んだ被検物質を含むＣＥを複合化する。いくつかの実施形態において、前記レポーター部分を含んだ被検物質を含む複合化されたＣＥを区分する。いくつかの実施形態において、追加のレポーター部分を提供し、被検物質を含む被検物質と、被検物質が２つ以上の異なるレポーター部分を含むように複合化する。レポーター部分を含んだ被検物質を、被検物質の同一性を検出し、レポーター部分が単一細胞からの被検物質の起源を同定するように、分析する。
いくつかの実施形態において、例示的な複数の被検物質としては、これらに限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、脂質、炭水化物、細胞小器官（例えば、核、ゴルジ体、リボソーム、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、細胞膜等）、細胞代謝物、組織切片、細胞、単一細胞、細胞又は単一細胞からの内容物、細胞又は単一細胞から単離された核酸、細胞又は単一細胞から単離され更に修飾された核酸、或いは無細胞ＤＮＡ（例えば、胎盤液又は血漿由来）が挙げられる。いくつかの実施形態において、複数の被検物質に、ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡはポリＡテールを有する。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを、ＣＥ内の固体支持体上に同時に固定する。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡの固定化を、固体支持体へのｍＲＮＡの固定化に続いて行う。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡを、トランスポソーム複合体と複合化し、トランスポゾン末端を固体支持体上に固定し、固体支持体上に固定されたオリゴ（ｄＴ）プローブのハイブリダイゼーションにより、ｍＲＮＡを固体に固定する。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡをトランスポソーム複合体と複合化し、任意選択的に、固体支持体上に固定されたオリゴ（ｄＴ）プローブのハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡが固体に固定されるように、トランスポゾン末端が固体支持体上に固定された相補配列にハイブリダイズする。他の方法を用いてｍＲＮＡを固定することもできる。いくつかの実施形態において、固体支持体はビーズである。いくつかの実施形態において、固体支持体はフローセルの表面である。いくつかの実施形態において、固体表面は反応容器の壁である。
いくつかの実施形態において、方法は、ＣＥ内に保存されるか、又は埋め込まれるか、又は含まれる核酸をシークエンシングする工程を含む。特に、本明細書で提供する方法及び組成物の実施形態は、核酸鋳型の調製及びそこからの配列データの取得に関する。本明細書で提供する方法及び組成物は、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号明細書、及び国際特許出願公開第２０１２／０６１８３２号で提供される方法及び組成物に関連し、各特許出願は、その全体が参照により組み込まれる。本発明のいくつかの実施形態は、標的核酸からフェージング及び配列アセンブリ情報を取得するためにＣＥ内のＤＮＡを調製すること、かかる鋳型からフェージング及び配列アセンブリ情報を取得することに関する。本明細書で提供する特定の実施形態は、インテグラーゼ、例えば、トランスポザーゼを使用してフラグメント化された核酸の関連末端の物理的近接を保つこと、組み合わせインデックス化（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉｃ ｉｎｄｅｘｉｎｇ）を使用して各ＣＥから個々のライブラリーを作製することに関する。ＣＥからのハプロタイプ情報の取得には、標的核酸において異なる対立遺伝子を区別すること（例えば、ＳＮＰ、遺伝子異常等）を含む。かかる方法は、標的核酸における異なる対立遺伝子を特徴付けること、及び配列情報におけるエラー率を減らすことに有用である。
１つの実施形態において、鋳型核酸を液滴等のＣＥに希釈することができる。任意選択的な全ゲノム増幅を使用してもよく、配列情報を、標的核酸の一倍体相当量にほぼ相当する量の鋳型核酸から取得することができる。
更なる実施形態において、鋳型核酸を、複数コピーの染色体が同じ区画内に存在することができるように区分することができ、本明細書で提供する二重又は多重インデックス化の結果、ハプロタイプもまた決定することができる。言い換えれば、鋳型核酸を、仮想区画を用いて調製することができる。このような実施形態において、核酸をいくつかの第１の区画に分配することができ、各区画の核酸に第１のインデックスを提供し、核酸を混ぜ合わせ、いくつかの第２の区画に分配し、各区画の核酸に第２のインデックスを提供することができる。有利なことに、かかるインデックス化は、１つの区画内の核酸を核酸のハプロタイプと同等量に単に希釈したものと比較して高濃度の核酸でハプロタイプ情報を取得することを可能にする。
本明細書で用いる場合、用語「区画」は、あるものを他のものから分離又は単離する領域又は体積を意図している。例示的な区画としては、これらに限定されるものではないが、バイアル、チューブ、ウェル、液滴、ボーラス、ビーズ、容器、表面特徴、又は、流体、磁力、若しくは電流等の物理的力により分離される領域若しくは体積が挙げられる。
区画を作製する例示的な方法を図１０に示す。ポストを有するシリコンマスタープレートを用いてヒドロゲルのシートにウェルを刻み込む（ヒドロゲルにおけるウェルは、ポストの反転画像である）。得られたヒドロゲルのウェルを、標的被検物質又は他の試薬とともに、粒子を形成する材料（例えば、ゲル又はポリマー）で満たすことができる。その後、ヒドロゲルシートを、粒子を溶解しない技法で溶解させることができる。次いで、本明細書に記載する方法を用いて粒子を採取し、操作することができる。
本明細書で提供するいくつかの実施形態において、鋳型ライブラリーを、トランスポソームを用いて調製する。いくつかのかかるライブラリーにおいて、標的核酸をフラグメント化してもよい。それに応じて、本明細書で提供するいくつかの実施形態は、隣接するフラグメントの物理的連続性のための配列情報を維持する方法に関する。かかる方法は、インテグラーゼを用いて、標的核酸の隣接する鋳型核酸フラグメントの関連性を維持することを含む。有利なことに、このようにインテグラーゼを用いてフラグメント化された核酸の物理的近接性を保つことにより、同じ起源の分子、例えば、染色体からのフラグメント化された核酸が、同じ区画に存在する可能性が増える。
本明細書で提供する他の実施形態は、シークエンシング情報におけるエラー率を減らすのに有用である可能性がある、核酸の各鎖から配列情報を得ることに関する。核酸の各鎖から配列情報を得るための鋳型核酸のライブラリーを調製する方法を、各鎖を区別することができ、各鎖の生成物もまた区別することができるように、調製することができる。
本明細書で提供する方法のいくつかは、核酸を分析する方法を含む。かかる方法は、標的核酸の鋳型核酸のライブラリーを調製し、鋳型核酸のライブラリーからの配列データを取得すること、及びかかる配列データからの標的核酸の配列表現をアセンブルすることを含む。
概して、本明細書で提供する方法及び組成物は、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号明細書、及び国際特許出願公開第２０１２／０６１８３２号で提供される方法及び組成物に関連し、各特許出願は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書で提供する方法は、標的核酸に特徴を挿入するのに有用なトランスポソームの使用に関する。かかる特徴としては、フラグメント化部位、プライマー部位、バーコード、親和性タグ、レポーター部分等が挙げられる。
本明細書で提供する実施形態とともに有用な方法において、鋳型核酸のライブラリーを、標的核酸を含むＣＥから調製する。ライブラリーを、標的核酸全体にわたり複数の固有のバーコードを挿入又は付加することにより調製する。いくつかの実施形態において、各バーコードは、間にフラグメント化部位が配置された、第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列を含む。第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列は、互いにペアとなるように同定又は指定することができる。第１のバーコードと第２のバーコードとが関連するようにペアを作ることは、有益（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）である可能性がある。有利なことに、ペアとなったバーコード配列を用いて、シークエンシングデータを鋳型核酸のライブラリーからアセンブルすることができる。例えば、第１のバーコード配列を含む第１の鋳型核酸、及び第１のバーコード配列とペアとなる第２のバーコード配列含む第２の鋳型核酸を同定することは、第１及び第２の鋳型核酸が、標的核酸の配列表示において互いに隣接した配列を表すことを意味する。かかる方法を用いて、参照ゲノムを必要とすることなく、標的核酸の配列表示をデノボで（新たに）アセンブルすることができる。
いくつかの実施形態において、複数の組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）バーコード化を、各単一細胞からの標的核酸が固有のバーコード（例えば、バーコードの固有の組み合せ）を含み、異なる単一細胞からの異なる標的核酸から容易に同定することができるように用いてもよい。いくつかの実施形態において、ＣＥは、単一細胞からの標的核酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＣＥ内の標的核酸は、異なるＣＥ内の標的核酸とは異なる、同定可能な固有のバーコードを有することになる。
いくつかの実施形態において、複数の組み合わせラベル化スキームは、核酸に加えて単一細胞内の構成成分、例えば、タンパク質、細胞小器官、脂質、又は細胞膜に対して、単一細胞内の構成成分が異なる単一細胞からの構成成分と同定されるように用いられてもよい。いくつかの実施形態において、ＣＥは、単一細胞内の構成成分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＣＥ内の単一細胞の構成成分は、異なるＣＥ内の単一細胞の構成成分とは異なる、同定可能な固有のラベルを有することになる。
いくつかの実施形態において、複数の組み合わせバーコード化スキームは、単一細胞からの標的核酸に対して用いてもよく、複数の組み合わせラベル化スキームは、単一細胞内の構成成分に対してもともに用いてもよい。いくつかの実施形態において、かかる組み合わせバーコード化及び組み合わせラベル化は、単一細胞を含むＣＥ内で行ってもよい。いくつかの実施形態において、かかる組み合わせバーコード化及び組み合わせラベル化は、単一細胞を含む複数のＣＥに対して同時に行ってもよい。
いくつかの実施形態において、ＣＥ内に保存されるか、埋め込まれるか、固定されるか、又は含まれるタンパク質をシークエンシングしてもよい。いくつかの実施形態において、かかるタンパク質を固有にラベルする。いくつかの実施形態において、ＣＥ内に保存されるか、埋め込まれるか、固定されるか、又は含まれるタンパク質を、当該技術分野で知られている方法で同定してもよい。いくつかの実施形態において、タンパク質の同定及び／又はシークエンシングは、核酸の配列情報の収集とともに行うことができる。
本明細書で用いる場合、用語「核酸」及び／又は「オリゴヌクレオチド」及び／又はその文法的等価物は、結合している少なくとも２つのヌクレオチド単量体を指すことができる。核酸は、一般にリン酸ジエステル結合を含むことができるが、いくつかの実施形態において、核酸類似体は、例えば、ホスホラミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４９：１９２５（１９９３）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８０５（１９８４），Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：４４７０（１９８８）；ａｎｄ Ｐａｕｗｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ，２６：１４１（１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：１４３７（１９９１）；ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６４４，０４８）、ジチオリン酸（Ｂｒｉｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ－メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照）、並びにペプチド核酸骨格及び結合（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１８９５（１９９２）；Ｍｅｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３１：１００８（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：２０７（１９９６）を参照）等を含む他のタイプの骨格を有してもよい。上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
他の類似体核酸としては、正に荷電された骨格（Ｄｅｎｐｃｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６０９７（１９９５））、非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号明細書、同第５，６３７，６８４号号明細書、同第５，６０２，２４０号号明細書、同第５，２１６，１４１号号明細書、及び同第４，４６９，８６３号号明細書；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ，３０：４２３ （１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１３：１５９７（１９９４）；Ｃｈａｐｔｅｒｓ ２ ａｎｄ ３，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ ａｎｄ Ｐ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３７：７４３（１９９６））、及び非リボース（米国特許第５，２３５，０３３号明細書、米国特許第５，０３４，５０６号明細書、及びＣｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ ７，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ ａｎｄ Ｐ．Ｄａｎ Ｃｏｏ）のものを挙げられる。核酸はまた、１つ又は複数の炭素環式糖を含んでもよい（Ｊｅｎｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，（１９９５）ｐｐ．１６９ １７６を参照）。上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
リボース-リン酸骨格の修飾を、ラベル等の追加部分の付加を容易にするか、又は特定の条件下でそのような分子の安定性を高めるために、行ってもよい。また、天然に存在する核酸及び類似体の混合物を作製することができる。或いは、異なる核酸類似体の混合物、及び天然に存在する核酸と類似体との混合物を作製してもよい。核酸は、指定に応じて、一本鎖又は二本鎖であってもよく、又は、二本鎖配列又は一本鎖配列の両方の特定の部分を含んでいてもよい。核酸は、環境試料からの、更には混合試料、例えば、混合組織試料、又は同じ種の異なる個体のための混合試料等からのメタゲノム試料、癌関連核酸等の疾患試料等と同様に、ＤＮＡ、例えば、単一細胞、複数の細胞からの、又は複数の種からのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ、ＲＮＡ又はハイブリッドであってもよい。核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの任意の組み合せ、及び、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンタニン、ヒポキサンタニン、イソシトシン、イソグアニンを含む塩基と、ニトロピロール（３－ニトロピロールを含む）及びニトロインドール（５－ニトロインドールを含む）等の塩基類似体との任意の組合せを含むことができる。
いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも１つの非特異的塩基（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｂａｓｅ）を含むことができる。非特異的塩基は、２つ以上の異なるタイプの塩基と塩基対をなすことができる。いくつかの実施形態において、非特異的塩基は、少なくとも２つの異なるタイプの塩基及び３つ以下の異なるタイプの塩基と塩基対をなすことができる。非特異的塩基の例としては、アデニン、チミン、又はシトシンと対を作ることができるイノシンが挙げられる。他の例としては、ヒポキサンチン、５－ニトロインドール、アシル化５－ニトロインドール、４－ニトロピラゾール、４－ニトロイミダゾール、及び３－ニトロピロールが挙げられる（Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４０３９（１９９４）；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４３６３（１９９５）；Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：４９２（１９９４）；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：１９３５（１９９７）；Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２３６１（１９９５）；Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：４２６（１９９７）；ａｎｄ Ｆｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１５１５（１９９８））。少なくとも３つ、４つ、又はそれ以上のタイプの塩基と塩基対をなすことができる非特異的塩基もまた用いることができる。上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で用いる場合、用語「ヌクレオチド類似体」及び／又はその文法的等価物は、一般に他に記載のように（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：６１３－２９，１９９１；Ａｇａｒｗａｌ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９４；ａｎｄ Ｓ．Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９－１３４，１９９８）、修飾ヌクレオチド塩基部分、修飾ペントース部分、及び／又は修飾ホスフェート部分を有し、ポリヌクレオチドの場合は、修飾ヌクレオチド間結合を有する合成類似体を指すことができる。一般に、修飾ホスフェート部分は、リン原子が＋５酸化状態であり、１つ又は複数の酸素原子が非酸素部分（例えば、硫黄）に置換されたホスフェート類似体を含む。例示的なホスフェート類似体としては、これらに限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホアミデート、ホウ素ホスフェート（関連対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、Ｎａ＋を、かかる対イオンが存在する場合に含む）が挙げられる。例示的な修飾されたヌクレオチド塩基部分としては、これらに限定されるものではないが、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、Ｃ－５－プロピニル類似体（これらに限定されるものではないが、Ｃ－５－プロピニル－Ｃ及びＣ－５－プロピニル－Ｕを含む）、２，６-ジアミノプリン（２－アミノアデニン又は２－アミノ－ｄＡとしても知られる）、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、２－チオピリミジン、イソシトシン（イソＣ）、５－メチルイソＣ、及びイソグアニン（イソＧ、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号明細書を参照）が挙げられる。例示的な修飾ペントース部分としては、これらに限定されるものではないが、ロック核酸（ＬＮＡ）類似体（これらに限定されるものではないが、Ｂｚ－Ａ－ＬＮＡ、５－Ｍｅ－Ｂｚ－Ｃ－ＬＮＡ、ｄｍｆ－Ｇ－ＬＮＡ、及びＴ－ＬＮＡを含む）（例えば、Ｔｈｅ Ｇｌｅｎ Ｒｅｐｏｒｔ，１６（２）：５，２００３；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４：３６０７－３０，１９９８を参照）、並びに２’位又は３’位が、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、及びフェノキシ）、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、又はブロモである２’又は３’修飾物が挙げられる。修飾ヌクレオチド間結合としては、リン酸類似体、アキラル及び非荷電サブユニット間結合（例えば、Ｓｔｅｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．，５２：４２０２，１９８７）、及びアキラルサブユニット間結合を有する非荷電モルホリノベースのポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号明細書を参照）が挙げられる。いくつかのヌクレオチド間結合類似体としては、モルホリデート、アセタール、及びポリアミド結合複素環が挙げられる。ペプチド核酸（プソイド相補ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）を含む）として知られるヌクレオチド類似体の１つのクラスにおいて、従来の糖及びヌクレオチド間結合が、２－アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーに置換されている（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７－１５００，１９９１；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１８９５－１８９７ １９９２；Ｄｅｍｉｄｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：５９５３－５８，２００２；ペプチド Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｄ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４を参照）。上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で用いる場合、用語「シークエンシングリード」及び／又はその文法的等価物は、ポリマー中の単量体の順序を示すシグナルを得るために行われる物理的又は化学的ステップの繰り返し工程を指すことができる。シグナルは、単一の単量体解像度又はより低い解像度で単量体の順序を示すことができる。特定の実施形態において、ステップを核酸標的に対して開始し、核酸標的中の塩基の順序を示すシグナルを得るために行うことができる。工程は、典型的な完了まで行うことができ、典型的な完了とは、通常、工程からのシグナルが、合理的なレベルの確実性で、標的の塩基をそれ以上区別することができない時点までと定義される。所望する場合、例えば、所望の配列情報量が得られるまで等、より早く完了することができる。シークエンシングリードは、単一の標的核酸分子に対して、又は同じ配列を有する標的核酸分子群に対して同時に、又は異なる配列を有する標的核酸群に対して同時に行うことができる。いくつかの実施形態において、シークエンシングリードは、シグナルが、シグナル取得が開始された１つ又は複数の標的核酸分子からそれ以上は得られない時点で、終了する。例えば、シークエンシングリードは、固相基質上に存在する１つ又は複数の標的核酸分子に対して開始し、１つ又は複数の標的核酸分子を基質から除去した時点で終了させることができる。シークエンシングは、シークエンシングランを開始した時に基質上に存在していた標的核酸の検出を中止することにより、終了することができる。
本明細書で用いる場合、用語「シークエンシング表示」及び／又はその文法的等価物は、ポリマー中の単量体単位の順序及び種類を示す情報を指すことができる。例えば、情報は、核酸中のヌクレオチドの順序及び種類を示すことができる。情報は、例えば、描写、画像、電子メディア、一連の記号、一連の数字、一連の文字、一連の色等を含む、任意の種々の形式であってよい。情報は、単一の単量体解像度又はより低い解像度であってもよい。例示的なポリマーは、ヌクレオチド単位を有するＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸である。一連の文字「Ａ」、「Ｔ」、「Ｇ」、及び「Ｃ」は、単一のヌクレオチド解像度でＤＮＡ分子の実際の配列と相関性があるＤＮＡに対する周知の配列表示である。その他の例示的なポリマーは、アミノ酸単位を有するタンパク質、及び糖単位を有する多糖類である。
本明細書で用いる場合、用語「少なくとも一部」及び／又はその文法的等価物は、全量のうちの任意の分量を指すことができる。例えば、「少なくとも一部」は、全量の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、又は１００％を指すことができる。
本明細書で用いる場合、用語「検出する」及び／又はその文法的等価物は、被検物質の存在（ｐｒｅｓｅｎｃｅ又はｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）を同定すること、被検物質の個々の構成成分、例えば、配列情報を同定すること、及び／又はかかる被検物質の量を定量することを指すことができる。
フラグメント化部位
ループ状のトランスポソームを含むいくつかの実施形態において、リンカーは、フラグメント化部位を含むことができる。フラグメント化部位を用いて、第１のバーコード配列と第２のバーコード配列との物理的関連は切断するが、情報的関連の切断はしないことができる。切断は、生化学的手段、化学的手段、又は他の手段により行ってもよい。いくつかの実施形態において、フラグメント化部位には、種々の手段でフラグメント化することができるヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、フラグメント化部位は、制限エンドヌクレアーゼ部位、リボヌクレアーゼで切断可能な少なくとも１つのリボヌクレオチド、特定の化学薬品の存在下で切断可能なヌクレオチド類似体、過ヨウ素酸塩による処置で切断可能なジオール結合、化学還元剤で切断可能なジスルフィド基、光化学的切断の対象となる可能性がある切断可能部分、及びペプチダーゼ酵素又は他の適切な手段により切断可能なペプチドを含んでいてもよい。各々その全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号明細書、及び国際特許出願公開第２０１２／０６１８３２号を参照。
プライマー部位
いくつかの実施形態において、レポーター部分は、プライマーにハイブリダイズすることができるプライマー部位を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、レポーター部分は、増幅、シークエンシング等に有用な少なくとも１つの第１のプライマー部位を含むことができる。
いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、「シークエンシングアダプター」又は「シークエンシングアダプター部位」、言い換えれば、プライマーにハイブリダイズすることができる１つ又は複数の部位を含む領域を含むことができる。いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、増幅、シークエンシング等に有用な少なくとも第１のプライマー部位を含むことができる。ループ状トランスポソームを含むいくつかの実施形態において、リンカーはシークエンシングアダプターを含むことができる。ループ状トランスポソームを含むさらなる態様において、リンカーは、少なくとも第１のプライマー部位及び第２のプライマー部位を含む。このような実施形態におけるプライマー部位の方向は、第１のプライマー部位にハイブリダイズするプライマー及び第２のプライマー部位にハイブリダイズするプライマーが同じ方向又は異なる方向であるようにすることができる。
いくつかの実施形態において、リンカーは、間に非増幅可能部位が配置された第１のプライマー部位、第２のプライマー部位を含むことができる。非増幅可能部位は、第１及び第２のプライマー部位間におけるポリヌクレオチド鎖の伸長を阻害するのに有用であり、ポリヌクレオチド鎖はプライマー部位の１つにハイブリダイズする。非増幅可能部位はまた、コンカテマーの防止に有用である可能性がある。非増幅可能部位の例としては、ヌクレオチド類似体、非ヌクレオチド化学物質部分、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態において、非増幅可能部位は、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴと有意に塩基対を形成しないヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態は、間にフラグメント化部位が配置された第１のプライマー部位、第２のプライマー部位を含むリンカーを含む。他の実施形態は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４１，４６３号明細書に記載されるように、方向性シークエンシングに有用なフォーク型又はＹ型のアダプターデザインを用いることができる。
プライマー結合部位の例示的な配列としては、これに限定されないが、ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（Ｐ５配列）及びＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（Ｐ７配列）が挙げられる。
レポーター部分
本明細書で用いる場合、用語「レポーター部分」及びその文法的等価物は、任意の同定可能なタグ、ラベル、インデックス、バーコード、又は組成物を決定することが可能な基、同一性、及び／又は研究されている被検物質の起源を示す情報を指すことができる。
当業者は、多くの異なる種のレポーター部分が、本明細書に記載する方法及び組成物とともに、個々に又は１つ若しくは複数のレポーター部分と組み合わせてのいずれかで、使用することができることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、２つ以上のレポーター部分が、２つ以上の被検物質の同時分析に用いられてもよい。いくつかの実施形態において、複数の異なるレポーター部分が同時に用いられて、単一細胞又は単一細胞の構成成分を固有に同定してもよい。
特定の実施形態において、レポーター部分は、シグナルを発することができる。シグナルの例としては、これらに限定されるものではないが、蛍光シグナル、化学発光シグナル、生物発光シグナル、リン光シグナル、放射性シグナル、熱量シグナル、イオン活性シグナル、電子シグナル、又は電気化学発光シグナルが挙げられる。レポーター部分の例は、例えば、各々その全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号明細書、及び国際特許出願公開第２０１２／０６１８３２号に挙げられている。
いくつかの実施形態において、レポーター部分は、アダプターであってもよい。本明細書に記載する方法及び組成物のいくつかの実施形態において、トランスポゾン配列に、レポーター部分を含むことができる。ループ状のトランスポソームを含むいくつかの実施形態において、リンカー又はアダプターは、レポーター部分を含むことができる。
いくつかの実施形態において、レポーター部分は、シグナルを発しなくてもよい。いくつかの実施形態において、レポーター部分は、バーコード、固有の分子インデックス、プラスミド等の核酸フラグメントであってもよい。いくつかの実施形態において、レポーター部分は、タンパク質に特異的に結合する抗体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、固黄体は、検出可能なラベルを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、レポーターは、核酸タグでラベルされた抗体又は親和性試薬を含むことができる。核酸タグは、例えば、近接ライゲーションアッセイ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ：ＰＬＡ）又は近接伸長アッセイ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｓｓａｙ：ＰＥＡ）をす消して検出することができる。
いくつかの実施形態において、レポーター部分のセットを用いてもよい。いくつかの実施形態において、レポーター部分のセットは、レポーター部分のサブセットの混合物を含んでいてもよく、レポーター部分の各サブセットは、異なる種類の被検物質、例えば、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物である。いくつかの実施形態において、レポーター部分のセットは、レポーター部分のサブセットの混合物を含んでいてもよく、レポーター部分の各サブセットは、互いに異なるが、同じ種類の被検物質に特異的である。
バーコード
一般に、バーコードは、１つ又は複数の特定の被検物質、例えば、核酸、タンパク質、代謝物、又は、本明細書に記載された或いは当該技術分野で知られているその他の被検物質等を同定するために使用することができる１つ又は複数のヌクレオチド配列を含むことができる。バーコードは、人工配列であってもよく、或いは、転位の際に生成する自然発生配列、例えば、以前に並置されたＤＮＡフラグメントの末端にある同一のフランキングゲノムＤＮＡ配列（ｇコード）等であってもよい。バーコードは、少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又はそれ以上の連続したヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、バーコードは、少なくとも約１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、又はそれ以上の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、バーコードを含む核酸群におけるバーコードの少なくとも一部は、異なっている。いくつかの実施形態において、バーコードの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％が、異なっている。更なるそのような実施形態において、バーコードの全てが異なっている。バーコードを含む核酸群において、異なるバーコードの多様性は、ランダムに又は非ランダムに生成することができる。
いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、少なくとも１つのバーコードを含む。いくつかの実施形態において、例えば、２つの非連続トランスポゾン配列を含むトランスポソームのように、第１のトランスポゾン配列は、第１のバーコードを含み、第２のトランスポゾン配列は、第２のバーコードを含む。いくつかの実施形態において、例えば、ループ状のトランスポソームにおけるように、トランスポゾン配列は、第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列を含むバーコードを含む。前述の実施形態のいくつかにおいて、第１のバーコード配列は、第２のバーコード配列とペアになるように同定又は設計することができる。例えば、互いにペアとなることが知られている複数の第１及び第２のバーコード配列を含む参照表を用いて、既知の第１のバーコード配列が既知の第２のバーコード配列とペアになることを知ることができる。
別の例において、第１のバーコード配列は、第２のバーコード配列と同じ配列を含んでいてもよい。別の例において、第１のバーコード配列は、第２のバーコード配列の逆相補配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列は、異なっている。第１及び第２のバーコード配列は、バイコード（ｂｉ－ｃｏｄｅ）を含んでいてもよい。
本明細書に記載する組成物及び方法のいくつかの実施形態において、バーコードは、鋳型核酸の調製に用いる。当然のことながら、膨大な数の利用可能なバーコードにより、各鋳型核酸分子は、固有の同定を含むことができる。鋳型核酸の混合物における各分子の固有の同定は、いくつかの用途に用いることができる。例えば、固有に同定された分子は、例えば、ハプロタイプシークエンシング、親対立遺伝子の同定、メタゲノムシークエンシング、及びゲノムのサンプルシークエンシングにおいて、複数の染色体を有する試料、ゲノム、細胞、細胞型、細胞の病状、及び種における、個々の核酸分子の同定に応用することができる。例示的なバーコード配列としては、これに限定されないが、ＴＡＴＡＧＣＣＴ、ＡＴＡＧＡＧＧＣ、ＣＣＴＡＴＣＣＴ、ＧＧＣＴＣＴＧＡ、ＡＧＧＣＧＡＡＧ、ＴＡＡＴＣＴＴＡ、ＣＡＧＧＡＣＧＴ、及びＧＴＡＣＴＧＡＣが挙げられる。
リンカー
ループ状のトランスポソームを含むいくつかの実施形態は、間にリンカーが配置された、第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列を含むトランスポゾン配列を含む。他の実施形態において、リンカーは、存在しなくてもよく、又はヌクレオチドとヌクレオチドとを連結する糖－リン酸骨格であってもよい。リンカーは、例えば、１つ又は複数のヌクレオチド、核酸、非ヌクレオチド化学物質部分、ヌクレオチド類似体、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含むことができる。好ましい実施形態において、リンカーは、核酸を含む。リンカーは、少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又はそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも約１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、又はそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、ＰＣＲ、ローリングサイクル増幅、鎖置換増幅等により、増幅することができる。他の実施形態において、リンカーは、非増幅可能部分を含むことができる。非増幅可能リンカーの例としては、アルキル、プロピル、ＰＥＧ等の有機化学リンカー；ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧ等の非天然塩基；又はＤＮＡベース増幅スキームにおいて増幅しない任意の基を含む。例えば、ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧ対を含むトランスポゾンは、相補的ｉｓｏＧ及びｉｓｏＣを欠くｄＮＴＰ混合物で増幅させて、挿入されたトランスポゾン全体にわたり増幅が起こらないことを確実にすることができる。
いくつかの実施形態において、リンカーは、１本鎖の核酸を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、５’－３’方向、５’－５’方向、又は３’－３’方向で、トランスポゾン配列と連結する。
親和性タグ
いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、親和性タグを含むことができる。ループ状のトランスポソームを含むいくつかの実施形態において、リンカーは、親和性タグを含むことができる。親和性タグは、種々のアプリケーション、例えば、ハイブリダイゼーションタグにハイブリダイズした標的核酸のバルク分類に有用である可能性がある。更なるアプリケーションとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡ、又は標的タンパク質に挿入されたトランスポザーゼ／トランスポゾン複合体及びトランスポゾンを精製するために親和性タグを用いることが挙げられる。本明細書で用いる場合、用語「親和性タグ」及びその文法的等価物は、特異的に相互作用する又は互いに結合する多成分複合体の構成成分を指すことができる。例えば、親和性タグは、それぞれストレプトアビジン又はニッケルに結合することができるビオチン又はポリＨｉｓを含むことができる。多成分親和性タグ複合体の他の例は、例えば、各々その全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号明細書、及び国際特許出願公開第２０１２／０６１８３２号に挙げられている。
固体支持体
固体支持体は、二次元又は三次元とすることができ、平面表面（例えば、ガラススライド）とする又は形付けることができる。固体支持体としては、ガラス（例えば、ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ））、石英、プラスチック（ポリスチレン（低度架橋ポリスチレン及び高度架橋ポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、及びポリ（メチルメタクリレート）等）、アクリルコポリマー、ポリアミド、シリコン、金属（例えば、アルカンチオレート誘導体化金）、セルロース、ナイロン、ラテックス、デキストラン、ゲルマトリックス（例えば、シリカゲル）、ポリアクロレイン、又は複合材を挙げることができる。
適切な三次元固体支持体としては、例えば、球、微粒子、ビーズ、ナノ粒子、アガロース、ポリアクリルアミド、アルギネート等のポリマーマトリックス、膜、スライド、プレート、マイクロ加工チップ、管（例えば、毛細管）、マイクロウェル、マイクロ流体装置、チャネル、フィルター、フローセル、又は、核酸、タンパク質、又細胞を固定するのに適切な構造体が挙げられる。固体支持体としては、鋳型核酸の集合又はプライマーを含む領域を有することが可能な、平坦なアレイ又はマトリックスを挙げることができる。例としては、ヌクレオシド誘導体化ＣＰＧ及びポリスチレンスライド；誘導体化磁気スライド；ポリスチレングリコールをグラフト化したポリスチレン等を挙げることができる。
いくつかの実施形態において、固体支持体は、ミクロスフェア又はビーズを含む。本明細書において、「ミクロスフェア」又は「ビーズ」又は「粒子」又はその文法的等価物は、小さな分散粒子を意味する。適切なビーズ組成物としては、これに限定されないが、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性物質、トリアゾル（ｔｈｏｒｉａ ｓｏｌ）、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス、又は、セファロース等の架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセル、及びテフロンが挙げられ、同様に、固形支持体として本明細書で概説する任意の他の材料を全て使用することができる。Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（インディアナ州フィッシャーズ）の「ミクロスフェア検出ガイド（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ）」は、役立つガイドである。特定の実施態様において、ミクロスフェアは、磁性ミクロスフェア又はビーズである。いくつかの実施形態において、ビーズは、色分けされていてもよい。例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ社（テキサス州オースティン）のＭｉｃｒｏＰｌｅｘ（登録商標）ミクロスフェアを用いてもよい。
ビーズは球状である必要はなく、不規則粒子を用いてもよい。代わりに又は加えて、ビーズは多孔質であってもよい。ビーズのサイズは、ナノメートル即ち約１００ｎｍから、ミリメートル即ち１ｍｍに及び、約０．２ミクロン～約２００ミクロンのビーズが好ましく、約０．５～約５ミクロンのビーズが特に好ましいが、いくつかの実施態様において、より小さい又はより大きいビーズを用いてもよい。いくつかの実施態様において、ビーズは、直径が約１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、２．５μｍ、２．８μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、５．５μｍ、６μｍ、６．５μｍ、７μｍ、７．５μｍ、８μｍ、８．５μｍ、９μｍ、９．５μｍ、１０μｍ、１０．５μｍ、１５μｍ、又は２０μｍであってもよい。
いくつかの実施態様において、ビーズは、抗体又は他の親和性プローブを含むことができる（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃａｓｓ Ｔ，Ｌｉｇｌｅｒ Ｆ Ｓ，ｅｄｓ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８．ｐｐ １－１４，ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｈｅｒｅｉｎ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｆｏｒ ｔｙｐｉｃａｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照）。いくつかの実施態様において、抗体は、モノクローナルであってもよく、他の実施態様において、抗体は、ポリクローナルであってもよい。いくつかの実施態様において、抗体は、細胞表面エピトープに特異的であってもよい。いくつかの実施態様において、抗体は、細胞内部のタンパク質に特異的であってもよい。
いくつかの実施態様において、本明細書で提供する核酸鋳型は、固体支持体に付着することができる。当該技術分野で良く知られている様々な方法を用いて、核酸を固体支持体の表面に付着、係留、又は固定することができる。
被検物質
被検物質は、機能、組成物、同一性、及び／又は起源が研究されている生体分子である。例示的な被検物質としては、これらに限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、脂質、炭水化物、細胞小器官（例えば、核、ゴルジ体、リボソーム、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、細胞膜等）、細胞代謝物、組織切片、細胞、単一細胞、細胞又は単一細胞からの内容物、細胞又は単一細胞から単離された核酸、細胞又は単一細胞から単離され更に修飾された核酸、或いは無細胞ＤＮＡ（例えば、胎盤液又は血漿由来）が挙げられる。
標的核酸
標的核酸は、任意の目的の核酸を含むことができる。１つの実施形態において、標的核酸は、マトリックス、液滴、エマルジョン、固体支持体、又は核酸の連続性を維持する区画等のＣＥ内に、液体及び酵素試薬へのアクセスは可能な状態で、含有、捕捉、埋め込み、又は固定する任意の目的の核酸を含むことができる。標的核酸としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＷＧＡの産物、ＲＮＡ、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、ロック核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、核酸の混合試料、倍数性ＤＮＡ（即ち植物ＤＮＡ）、それらの混合物、及びそれらのハイブリッドを挙げることができる。好ましい実施形態において、ゲノムＤＮＡフラグメント又はその増幅されたコピーを標的核酸として用いる。別の好ましい実施形態において、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又は葉緑体ＤＮＡを用いる。
標的核酸は、任意のヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ホモポリマー配列を含む。標的核酸はまた、繰り返し配列を含むことができる。繰り返し配列は、例えば、２ヌクレオチド、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、又はそれ以上を含めた任意の種々の長さとすることができる。繰り返し配列は、連続又は非連続して、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、又はそれ以上を含めた、任意の種々の回数の繰り返しとすることができる。
本明細書に記載するいくつかの実施形態は、単一の標的核酸を使用することができる。他の実施形態は、複数の標的核酸を使用することができる。かかる実施形態において、複数の標的核酸としては、複数の同じ標的核酸、いくつかの標的核酸は同じである複数の異なる標的核酸、又は全ての標的核酸が異なる複数の標的核酸を挙げることができる。複数の標的核酸を使用する実施形態は、例えば、１つ又は複数のチャンバー又はアレイ表面で試薬が標的核酸に同時に送られるように、多重型式で行うことができる。いくつかの実施形態において、複数の標的核酸としては、実質的に全ての特定の生命体のゲノムを挙げることができる。複数の標的核酸としては、例えば、ゲノムの少なくとも約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％，又は９９％を含めた、特定の生命体のゲノムの少なくとも一部を挙げることができる。特定の実施形態において、当該一部は、ゲノムの最大で約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％，又は９９％である上限を有することができる。
標的核酸は、あらゆる供給源から得ることができる。例えば、標的核酸は、単一の生命体から得られる核酸分子、又は１つ又は複数の生命体を含む自然源から得られる核酸分子群から調製してもよい。核酸分子の供給源としては、これらに限定されるものではないが、細胞小器官、細胞、組織、臓器、又は生命体が挙げられる。標的核酸分子の供給源として用いられてもよい細胞は、原核細胞（バクテリア細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、サルモネア（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｒａ）；クレン古細菌門（ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）、ナノ古細菌門（ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）、又はユリ古細菌門（ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔｉａ）等の古細菌細胞；又は真菌（例えば、酵母）、植物、原生動物や他の寄生生物、及び動物（昆虫（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．）、線形動物（例えば、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、及び哺乳動物（例えば、ラット、マウス、サル、非ヒト霊長類、及びヒト）を含む）等の真核細胞であってもよい。
標的核酸及び鋳型核酸は、当該技術分野でよく知られている種々の方法を用いて、目的とする特定の配列について濃縮することができる。かかる方法の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１２／１０８８６４号において提供されている。いくつかの実施形態において、核酸は、鋳型ライブラリーの調製方法の間に、更に濃縮させてもよい。例えば、核酸は、トランスポソームの挿入前、トランスポソームの挿入後、及び／又は核酸の増幅後に、特定の配列について濃縮させてもよい。
また、いくつかの実施形態において、標的核酸及び／又は鋳型核酸は、高度に精製することができ、例えば、核酸は、本明細書で提供する方法で用いる前に、混入物を少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％含まないものとすることができる。いくつかの実施形態において、当該技術分野で知られている標的核酸の質及びサイズを維持する方法を用いることは有益であり、例えば、標的ＤＮＡの単離及び／又は直接転位を、アガロースプラグを用いて行ってもよい。
いくつかの実施形態において、標的核酸は、生体試料又は患者試料から得てもよい。本明細書で用いる場合、用語「生体試料」又は「患者試料」は、１つ又は複数の細胞、組織、又は体液等の試料を含む。「体液」としては、これらに限定されるものではないが、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、胸膜液、涙液、乳管液（ｌａｃｔａｌ ｄｕｃｔ ｆｌｕｉｄ）、リンパ液、喀痰、尿、羊水、又は精液が挙げられる。試料は、「無細胞」である体液を含んでいてもよい。「無細胞体液」は、約１％（質量／質量）未満の全細胞物質を含む。血漿又は血清は、無細胞体液の例である。試料は、天然又は合成由来（即ち、無細胞となるように調製された細胞試料）の標本を含んでいてもよい。
本明細書で用いる場合、用語「血漿」は、血液中に見られる無細胞性液体を指す。「血漿」は、当該技術分野で知られている方法（例えば、遠心分離、濾過等）で血液から全細胞物質を除去することにより、血液から得ることができる。
鋳型核酸を調製する特定の方法
いくつかの実施形態は、鋳型核酸を調製する方法を含む。本明細書で用いる場合、用語「鋳型核酸」は、配列情報得るための基質を指すことができる。いくつかの実施形態において、鋳型核酸は、少なくとも１つのトランスポゾン配列、そのフラグメント、又はその任意のコピーを含む標的核酸、そのフラグメント、又はその任意のコピーを含むことができる。いくつかの実施形態において、鋳型核酸は、シークエンシングプライマー部位等のシークエンシングアダプターを含む標的核酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＥは、標的核酸を含んでもよい。
鋳型核酸を調製するいくつかの方法は、トランスポゾン配列を標的核酸に挿入し、それにより鋳型核酸を調製することを含む。いくつかの挿入方法は、トランスポザーゼ又はインテグラーゼ等の酵素の存在下、１つ又は複数のトランスポゾン配列を標的核酸に組み込むのに十分な条件の下で、本明細書で提供するトランスポゾン配列を標的核酸に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ＣＥは、かかる標的核酸を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、標的核酸へのトランスポゾン配列の挿入は、非ランダムであってもよい。いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、特定の部位での組み込みを阻害するタンパク質含む標的核酸と接触することができる。例えば、トランスポゾン配列が、タンパク質を含むゲノムＤＮＡ、クロマチンを含むゲノムＤＮＡ、ヌクレオソームを含むゲノムＤＮＡ、又はヒストンを含むゲノムＤＮＡへ組み込まれるのを阻害することができる。いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、標的核酸の特定の配列にトランスポゾン配列を組み込むために、親和性タグと関連付けることができる。例えば、トランスポゾン配列は、特定の核酸配列、例えば、ヒストン、クロマチン結合タンパク質、転写因子、開始因子等を標的とするタンパク質、及び、特定の配列特異的な核酸結合タンパク質に結合する抗体又は抗体フラグメントと関連していてもよい。例示的な実施形態において、トランスポゾン配列は、ビオチン等の親和性タグと関連し、親和性タグは、核酸結合タンパク質に関連付けることができる。いくつかの実施形態において、ＣＥは、かかる標的核酸を含んでいてもよい。
いくつかのトランスポゾン配列を標的核酸に組み込む間、組み込み部位における標的核酸のいくつかの連続ヌクレオチドが、組み込み生成物において複製されることが理解されるだろう。従って、組み込み生成物は、標的核酸内の組み込まれた配列の各末端における重複配列を含むことができる。本明細書で用いる場合、用語「ホストタグ」又は「ｇ－タグ」は、組み込まれたトランスポゾン配列の各末端において複製される標的核酸配列を指すことができる。トランスポゾン配列の挿入により生成される可能性がある核酸の一本鎖部分は、当該技術分野でよく知られている種々の方法、例えば、リガーゼ、オリゴヌクレオチド、及び／又はポリメラーゼの使用により修復することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供する複数のトランスポゾン配列は、標的核酸に挿入される。いくつかの実施形態は、各組み込まれたトランスポゾン配列間の平均距離が特定の数の連続ヌクレオチドを標的核酸に含むように複数のトランスポゾン配列を標的核酸に組み込むことを達成するのに十分な条件を選ぶことを含む。
いくつかの実施形態は、１つ又は複数のトランスポゾン配列を標的核酸に組み込むが、別の１つ又は複数のトランスポゾン配列は組み込まないことを達成するのに十分な条件を選ぶことを含む。種々の方法を用いて、トランスポゾン配列を別のトランスポゾン配列に挿入する可能性を減らすことができる。本明細書で提供する実施形態とともに有用なかかる方法の例は、例えば、各々その全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号明細書、及び国際特許出願公開第２０１２／０６１８３２号に見出すことができる。
いくつかの実施形態において、標的核酸において組み込まれたトランスポゾン配列間の平均距離が、少なくとも約５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、又はそれ以上の連続ヌクレオチドであるように、条件を選択してもよい。いくつかの実施形態において、標的核酸において組み込まれたトランスポゾン配列間の平均距離は、少なくとも約１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、又はそれ以上の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的核酸において組み込まれたトランスポゾン配列間の平均距離は、少なくとも約１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、又はそれ以上の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的核酸において組み込まれたトランスポゾン配列間の平均距離は、少なくとも約１００ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１０００ｋｂ、又はそれ以上の連続ヌクレオチドである。当然のことながら、選択してもよいいくつかの条件は、標的核酸を特定の数のトランスポゾン配列に接触させることを含む。
本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態は、少なくとも一部のトランスポゾン配列を異なる標的核酸に組み込むことを達成するのに十分な条件を選択することを含む。本明細書に記載する方法及び組成物の好ましい実施形態において、標的核酸に組み込まれる各トランスポゾン配列は異なる。トランスポゾン配列の特定の部分を異なる標的配列に組み込むことを達成するために選択してもよいいくつかの条件は、トランスポゾン配列群の多様性の程度を選択することを含む。当然のことながら、トランスポゾン配列の多様性は、一つには、かかるトランスポゾン配列のバーコードの多様性により生じる。その結果、いくつかの実施形態は、少なくとも一部のバーコードが異なるトランスポゾン配列群を提供することを含む。いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列群におけるバーコードの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％が異なる。いくつかの実施形態において、標的核酸に組み込まれたトランスポゾン配列の少なくとも一部は同じである。
鋳型核酸を調製するいくつかの実施形態は、標的核酸を含む配列をコピーすることを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態は、標的核酸に組み込まれたトランスポゾン配列のプライマー部位にプライマーをハイブリダイズすることを含む。いくつかのかかる実施形態において、プライマーは、プライマー部位にハイブリダイズし、伸長することができる。コピーされた配列は、少なくとも１つのバーコード配列及び少なくとも一部の標的核酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、コピーされた配列は、第１のバーコード配列、第２のバーコード配列、及びそれらの間に配置された少なくとも一部の標的核酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのコピーされた核酸は、第２のコピーされた核酸の第２のバーコード配列とペアとなるように同定又は指定することができる第１のコピーされた核酸の少なくとも第１のバーコード配列を含む。いくつかの実施形態において、プライマーは、シークエンシングプライマーを含むことができる。いくつかの実施形態において、シークエンシングデータを、シークエンシングプライマーを用いて取得する。更なる実施形態において、プライマー部位を含むアダプターを、核酸の各末端及びかかるプライマー部位から増幅された核酸にライゲートすることができる。
鋳型核酸を調製するいくつかの実施形態は、少なくとも一部の１つ又は複数のトランスポゾン配列を含む配列及び少なくとも一部の標的核酸を増幅することを含むことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも一部の標的核酸は、標的核酸に組み込まれたトランスポゾン配列のプライマー部位にハイブリダイズするプライマーを用いて増幅することができる。いくつかのかかる実施形態において、増幅された核酸は、間に少なくとも一部の標的核酸が配置された第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの増幅核酸は、第２の増幅核酸の少なくとも第２のバーコード配列とペアとなることが同定可能な第１の増幅核酸の少なくとも第１のバーコード配列を含むことができる。
鋳型核酸を調製するいくつかの実施形態は、一本鎖のリンカーを含むトランスポゾン配列を挿入することを含む。１つの例において、トランスポゾン配列（ＭＥ－Ｐ１－リンカー－Ｐ２－ＭＥ；モザイク末端－プライマー部位１－リンカー－プライマー部位２－モザイク末端）を、標的核酸に挿入する。トランスポゾン／リンカーが挿入された標的核酸を、伸長及び増幅することができる。
本明細書に記載する組成物及び方法の１つの実施形態において、対照な転位可能な末端配列を有するトランスポソームを用いて、末端がタグ化された標的核酸フラグメント（タグメント化フラグメント又はタグメント）を生成する。そのため、各タグメント化フラグメントは、方向性を欠く同一の末端を含む。その後、トランスポゾン末端配列を用いた単一のプライマーＰＣＲを用いて、２ｎ～２ｎ＊２ｘ（ここで、ｘはＰＣＲサイクルの数に相当する）のコピー数の鋳型を増幅することができる。その後の工程において、プライマーを用いたＰＣＲにより、シークエンシングアダプター配列等の追加の配列を追加することができる。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの普遍的プライマー部位を組み込むことは、各鋳型核酸に有利である可能性がある。例えば、鋳型核酸は、第１の普遍的プライマー部位を含む第１の末端配列、及び第２の普遍的プライマー部位を含む第２の末端配列を含むことができる。普遍的プライマー部位は、増幅、シークエンシング、及び／又は１つ又は複数の鋳型核酸の同定に用いる等の、種々のアプリケーションを有することができる。第１及び第２の普遍的プライマー部位は、同じ、実質的に同様の、同様の、又は異なるものであってもよい。普遍的プライマー部位を、当該技術分野でよく知られている種々の方法、例えば、核酸へのプライマー部位のライゲーション、テイルドプライマーを用いた核酸の増幅、及び普遍的プライマー部位を含むトランスポゾン配列の挿入により核酸に導入することができる。
トランスポソーム
「トランスポソーム」は、インテグラーゼ又はトランスポザーゼ等の組み込み（インテグレーション）酵素、及びトランスポザーゼ認識部位等の組み込み認識部位を含む核酸を含む。本明細書で提供する実施形態において、トランスポザーゼは、転位反応を触媒することが可能なトランスポザーゼ認識部位とともに機能的複合体を形成することができる。トランスポザーゼは、「タグメント化」と称することもある工程において、トランスポザーゼ認識部位に結合し、トランスポザーゼ認識部位をＣＥ内の標的核酸に挿入する可能性がある。いくつかのかかる挿入事象において、トランスポザーゼ認識部位の１つの鎖が、標的核酸に転移してもよい。１つの例において、トランスポソームは、２つのサブユニットを含む二量体トランスポザーゼ、及び２つの非連続トランスポゾン配列を含む。別の例において、トランスポザーゼは、２つのサブユニットを含む二量体トランスポザーゼ、及び連続トランスポゾン配列を含む。
いくつかの実施形態は、機能亢進性Ｔｎ５トランスポザーゼ及びＴｎ５型トランスポザーゼ認識部位（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７（１９９８））、又は、ＭｕＡトランスポザーゼ、及びＲ１及びＲ２末端配列を含むＭｕトランスポザーゼ認識部位（Ｍｉｚｕｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｃｅｌｌ，３５：７８５，１９８３；Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，Ｈ，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１４：４８９３，１９９５）の使用を含めることができる。ＭＥ配列はまた、当業者により最適化されて、使用されてもよい。上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供する組成物及び方法の特定の実施形態とともに使用することができる転位システムの更なる例としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｔｎ５５２（Ｃｏｌｅｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：２３８４－８，２００１；Ｋｉｒｂｙ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１７３－８６，２００２）、Ｔｙ１（Ｄｅｖｉｎｅ＆Ｂｏｅｋｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３７６５－７２，１９９４、及び国際特許出願公開第９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１：１５１２，１９９６；Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ：Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：２７－４８，１９９６）、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：４９－８２，１９９６）、マリナートランスポザーゼ（Ｌａｍｐｅ Ｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：５４７０－９，１９９６）、Ｔｃ１（Ｐｌａｓｔｅｒｋ Ｒ Ｈ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：１２５－４３，１９９６）、Ｐエレメント（Ｇｌｏｏｒ，Ｇ Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６０：９７－１１４，２００４）、Ｔｎ３（Ｉｃｈｉｋａｗａ＆Ｏｈｔｓｕｂｏ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８８２９－３２，１９９０）、細菌挿入配列（Ｏｈｔｓｕｂｏ＆Ｓｅｋｉｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：１－２６，１９９６）、レトロウイルス（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：２５２５－９，１９８９）、及び酵母のレトロトランスポゾン（Ｂｏｅｋｅ＆Ｃｏｒｃｅｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：４０３－３４，１９８９）が挙げられる。更なる例としては、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、及び改変型トランスポザーゼファミリー酵素（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．５：ｅ１０００６８９．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｏｃｔ １６；Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１：３３２－５）が挙げられる。上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供する方法及び組成物とともに使用することができるインテグラーゼの更なる例としては、レトロウイルスインテグラーゼ、及びかかるレトロウイルスインテグラーゼに対するインテグラーゼ認識配列が挙げられ、例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＰＦＶ－１、ＲＳＶ由来のインテグラーゼが挙げられる。
トランスポゾン配列
本明細書で提供する組成物及び方法のいくつかの実施形態は、トランスポゾン配列を含む。いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、少なくとも１つのトランスポザーゼ認識部位を含む。いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、少なくとも１つのトランスポザーゼ認識部位及び少なくとも１つのバーコードを含む。本明細書で提供する組成物及び方法とともに有用なトランスポゾン配列は、各々その全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号明細書、及び国際特許出願公開第２０１２／０６１８３２号において提供されている。いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、第１のトランスポザーゼ認識部位、第２のトランスポザーゼ認識部位、及びそれらの間に配置されたバーコードを含む。
非連続トランスポゾン配列を有するトランスポソーム
本明細書で提供するいくつかのトランスポソームは、２つのトランスポゾン配列を含むトランスポザーゼを含む。いくつかのかかる実施形態において、２つのトランスポゾン配列は互いに結合しない、言い換えれば、トランスポゾン配列は互いに非連続である。かかるトランスポソームの例は、当該技術分野で知られている（例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号明細書を参照。）
ループ状構造
いくつかの実施形態において、トランスポソームは、２つのトランスポザーゼサブユニットに結合して「ループ状複合体」又は「ループ状トランスポソーム」を形成する、トランスポゾン配列核酸を含む。１つの例において、トランスポソームは、二量体トランスポザーゼ及びトランスポゾン配列を含む。ループ状複合体は、元の標的ＤＮＡの順序情報を維持しながら、標的ＤＮＡをフラグメント化することなく、トランスポゾンが標的ＤＮＡに挿入されることを保証することができる。理解されるように、ループ状構造は、標的核酸の物理的連結性を維持しながら、プライマー、バーコード、インデックス等を標的核酸に挿入することができる。いくつかの実施形態において、ＣＥは、標的核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ループ状トランスポソームのトランスポゾン配列は、トランスポゾン配列がフラグメント化されて２つのトランスポゾン配列を含むトランスポソームを作製することができるように、フラグメント化部位を含むことができる。かかるトランスポソームは、トランスポゾンが挿入される隣接する標的ＤＮＡフラグメントが、アッセイの後期段階で明瞭にアセンブルすることができるコードの組み合わせを確実に受け取るようにするのに有用である。
トランスポゾン配列を作製する特定の方法
本明細書で提供するトランスポゾン配列は、様々な方法により調製することができる。例示的な方法としては、直接合成及びヘアピン伸長法が挙げられる。いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、直接合成により調製してもよい。例えば、核酸を含むトランスポゾン配列は、化学合成を含む方法によって調製してもよい。かかる方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、保護された２’－デオキシヌクレオシド、リボヌクレオシド、又はヌクレオシド類似体に由来するもの等のホスホラミダイト前駆体を用いた固相合成である。トランスポゾンシークエンシングを調製する例示的な方法は、例えば、各々その全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号明細書、及び国際特許出願公開第２０１２／０６１８３２号に見出すことができる。
ループ状トランスポソームを含むいくつかの実施形態において、一本鎖リンカーを含むトランスポゾン配列を調製することができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、第１のトランスポザーゼ認識配列を含むトランスポゾン配列が第２のトランスポザーゼ認識配列を含む第２のトランスポゾン配列に５’から３’の方向で結合するように、トランスポソームのトランスポゾン配列を連結する。いくつかの実施形態において、リンカーは、第１のトランスポザーゼ認識配列を含むトランスポゾン配列を、第２のトランスポザーゼ認識配列を含む第２のトランスポゾン配列に、５’から５’方向又は３’から３’方向で連結する。トランスポソームのトランスポゾン配列を５’から５’の方向又は３’から３’の方向のいずれかに連結することは、トランスポザーゼ認識エレメント、特にモザイクエレメント（ＭＥ又はＭ）が互いに相互作用するのを防ぐのに有利である可能性がある。連結したトランスポゾン配列は、アルデヒド基又はオキシアミン基のいずれかを含むトランスポゾン配列を調製することにより調製することができる。アルデヒド及びオキシアミン基は、相互作用して共有結合を形成し、それによりトランスポゾン配列を連結することができる。
いくつかの実施形態において、相補的配列を含むトランスポソームを調製することができる。１つの実施形態において、トランスポザーゼは、相補的なテールを含むトランスポゾン配列で負荷される。テールは、ハイブリダイズして連結されたトランスポゾン配列を形成する。ハイブリダイゼーションを希釈条件下で行い、トランスポソーム間のハイブリダイゼーションの可能性を減少させてもよい。
標的挿入
本明細書で提供する方法及び組成物のいくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、標的核酸の特定の標的配列に挿入してもよい。ｄｓＤＮＡへの転位は、ｓｓＤＮＡ標的に対してよりも効率的である可能性がある。いくつかの実施形態において、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに変性し、オリゴヌクレオチドプローブ（２０～２００塩基）とアニーリングする。これらのプローブは、本明細書で提供するトランスポソームとの組み込み部位として効率的に用いることができるｄｓＤＮＡの部位を作製する。いくつかの実施形態において、ｒｅｃＡ被覆オリゴプローブを用いたＤループ形成及びその後の三重鎖形成を用いて、ｄｓＤＮＡを標的化することができる。いくつかのかかる実施形態において、Ｄループは、Ｔｎ４４３０トランスポザーゼを含むトランスポソームの好ましい基質である。より多くの実施形態において、ｄｓＤＮＡにおける目的の領域は、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、亜鉛フィンガー複合体及び他の親和性リガンドを、特異的ＤＮＡ領域に用いることにより、標的化することができる。
いくつかの実施形態において、標的核酸中のミスマッチ位置の好ましい基質を有するトランスポザーゼを含むトランスポソームを、標的核酸への標的挿入に用いてもよい。例えば、ＨＹＰＥＲＭＵ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）等のいくつかのＭｕＡトランスポザーゼは、ミスマッチ標的を優先する。いくつかのかかる実施形態において、ミスマッチを含むオリゴヌクレオチドプローブを、一本鎖標的核酸にアニールする。ＨＹＰＥＲＭＵ等のＭｕＡトランスポザーゼを含むトランスポソームを用いて、標的核酸のミスマッチ配列を標的化することができる。
連続性維持エレメント（ＣＥ）
連続性維持エレメント（ＣＥ）は、１つ又は複数のアッセイ工程を介して近接して（又は連続して）、少なくとも２つ以上又はすべての被検物質を保存し、アッセイ試薬へのアクセスを提供する物理的実体であり、被検物質の接近を失うことなく、複数回プール又は分割することができる。
いくつかの実施形態において、ＣＥは固体支持体とすることができる。１つの実施形態において、ＣＥはエマルジョン又は液滴であってもよい。いくつかの実施形態において、ＣＥは、ゲル、ヒドロゲル、又はゲルビーズである。いくつかの実施形態において、ＣＥは、ビーズ等の固体支持体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ビーズは、抗体、オリゴヌクレオチド、及び／又はバーコードを更に含んでいてもよい。別の実施形態において、ＣＥは、ＷＧＡ、ＲＣＡ、又は任意の核酸試薬の縮合によって作製されるＤＮＡナノボールを構成していてもよい。
いくつかの実施形態において、ＣＥは、アガロース、ポリアクリルアミド、アルギン酸塩等のポリマーマトリックス中の細胞若しくは単一細胞、又はその増幅産物（ＷＧＡ等から）からの核酸を埋め込むことによって作製することができる。いくつかの実施形態において、ＣＥ内の細胞又は単一細胞の内容物の連続性は、カプセル化（例えば、ポリマーマトリックスにおける）、ビーズ又は捕捉物への固定化を通じて互いに構成成分の物理的近接を保存すること、プーリング及び再分配の繰り返しラウンドを通じてＣＥ内の連続性情報を効果的に維持することにより、保持される。個々のＣＥを構成する被検物質の連続性を維持しながら、ＣＥの収集物を独立してプールし、分割し、アッセイ試薬と反応させ、プールし、再分割する等の特徴は、異なる分割及びプール工程を通じた組み合わせインデックス化を可能にする。
いくつかの実施形態において、連続性維持エレメント中の被検物質は、水溶液、酵素（例えば、フラグメント化酵素、ポリメラーゼ、リガーゼ、トランスポザーゼ、キナーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ）、核酸アダプター、核酸バーコード、ラベルを含むアッセイ試薬にアクセス可能である。
いくつかの実施形態において、ＣＥは、細胞又は単一細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥは、細胞又は単一細胞由来の核酸、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ等の核酸；タンパク質、多糖類、脂質及び核酸を含む細胞又は単一細胞の高分子、ならびに細胞又は単細胞由来の一次代謝産物、二次代謝産物、及び天然生成物等の小分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸を含むＣＥを形成する前に、核酸に、ＰＣＲ又は全ゲノム増幅等の増幅を施す。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ及びｍＲＮＡの分析を並行して行うことができる。
いくつかの実施形態において、ＣＥの１つ又は複数の被検物質を、１つ又は複数のラベルで標識する。例示的なラベルとしては、これらに限定されるものではないが、ＤＮＡバーコード又はインデックス、蛍光ラベル、化学発光ラベル、ＲＮＡバーコード又はインデックス、放射性ラベル、ラベルを含む抗体、ラベルを含むビーズが挙げられる。
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）標的核酸を含むＣＥを複数の第１の容器に区分する工程と、（ｂ）各第１の容器の標的核酸に第１のインデックスを提供し、それにより第１のインデックス化された核酸を得る工程と、（ｃ）第１のインデックス化された核酸を組み合わせる工程と、（ｄ）第１のインデックス化された鋳型核酸を複数の第２の容器に区分する工程と、（ｅ）各第２の容器の第１のインデックス化された鋳型核酸に第２のインデックスを提供し、それにより第２のインデックス化された核酸を得る工程とを含むことができる。工程ａ－ｅは、ａ－ｅシリーズからの１つ又は複数の工程の追加のサイクルを続けて、追加の仮想区画を導き出すことができる。この組み合わせインデックス化の方法を用いて、限られた数の物理的区画から多数の仮想区画を効果的に作製することができる。
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）付着した核酸レポーターを有する非核酸被検物質（例えば、タンパク質）を含むＣＥを提供する工程と、（ｂ）ＣＥを複数の第１の容器に区分する工程と、（ｃ）各第１の容器の標的核酸レポーターに第１のインデックスを提供し、それにより第１のインデックス化された標的核酸レポーターを得る工程と、（ｃ）第１のインデックス化された核酸レポーターを組み合わせる工程と、（ｄ）第１のインデックス化されたＣＥを複数の第２の容器に区分する工程と、（ｅ）各第２の容器の第１のインデックス化された核酸レポーターに第２のインデックスを提供し、それにより第２のインデックス化された核酸レポーターを得る工程とを含むことができる。工程ａ－ｅは、ａ－ｅシリーズからの１つ又は複数の工程の追加のサイクルを続けて、追加の仮想区画を導き出すことができる。区分工程は、ＰＬＡ、ＰＥＡ、又は核酸を捕捉又は増幅する他の技術等の核酸増幅又は捕捉工程を更に含むことができる。
いくつかの実施形態において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織を複数のセクションに分割し、各セクションをＣＥに追加することができる。各ＣＥは、その後、内容物又は配列について分析し、後の段階で、各スライドの内容物の２Ｄ又は３Ｄマップを取得することができる。
いくつかの実施形態において、これらに限定されるものではないが、増幅（ＰＣＲ、全ゲノム増幅、ランダムプライマー伸長等）、ライゲーション、転位、ハイブリダイゼーション、制限消化、及びＤＮＡ突然変異誘発等を含む工程を行うために、核酸を限定された空間に閉じ込めるが、試薬アクセスが可能なマトリックス内に１種又は複数の核酸を埋め込むことができる。突然変異誘発の例としては、これらに限定されるものではないが、エラープローン伸長、アルキル化、重亜硫酸塩変換、及び活性化誘導（シチジン）デアミナーゼ等が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＣＥを使用する方法及び組成物は、ＤＮＡ配列情報のアセンブリを大きく改善するために突然変異誘発アセンブリ方法と組み合わせることができる。ゲノムＤＮＡをフラグメント化し、複数のＣＥに分割することができ、各ＣＥはゲノムの画分を含む。ゲノムの異なる画分は、異なるバーコードを受け取り、ゲノムの画分を独立してアセンブリすることを可能にする。大きな課題の１つは、リピートのアセンブリである。リピートをアセンブリする１つの方法は、Ｌｅｖｙ，Ｄ．ａｎｄ Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．（２０１４）Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｙ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１１（４３）．Ｅ４６３２－Ｅ４６３７．ＩＳＳＮ ００２７－８４２４により概説されている。アセンブリアプローチは、米国特許出願公開第２０１４／００２４５３７号明細書（タイトル：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ Ａｎｄ Ｐｈａｓｉｎｇ ｏｆ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ）においても議論されており、この出願はその全体が参照により組み込まれる。上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＤＮＡフラグメントの分割を突然変異誘発又は関連するアプローチと組み合わせる方法では、ＣＥ、ウェル、インデックス、仮想インデックス、物理的区画、液滴等で区画化を行うことができる。突然変異誘発は、これらに限定されるものではないが、エラープローン伸長、アルキル化、重亜硫酸塩変換、及び活性化誘導（シチジン）デアミナーゼ等を含むいくつかの方法により行うことができる。核酸をＣＥに分割する方法及び突然変異誘発アプローチは、従来の方法が繰り返し又は困難な領域をアセンブルすることを困難にする場合に有用である可能性がある。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、変異フェージング、（デノボ）ゲノムアセンブリ、細胞集団をスクリーニングして集団全体の異種性を判定し、細胞間差異を決定するために用いることができる。
いくつかの実施形態において、細胞又は単一細胞由来のｃＤＮＡは、血管内で単離され、上記のように仮想区分アプローチによってインデックス化されるＣＥに変換される。これにより、何千、何万、何十万、及び更に多くの異なるインデックス化された単一細胞ライブラリーからの遺伝子発現及び転写プロファイリングが可能となる。
いくつかの実施形態において、分析することができる単一細胞の数は、ポアソンサンプリングによる仮想区画の総数の約１０％である。各段階で９６ウェル区画を用いた４段階のインデックス化スキームでは、合計４×９６＝３８４の物理的区画を使用した１回の実験において、合計１０％×９６×９６×９６×９６＝８００万個超の単一細胞を分析することができる。図３の例では、４つの組み合わせ希釈及びプール工程を用いて多数の仮想区画（固有のインデックスの組み合わせを含む分子又はＤＮＡライブラリーエレメントのセット）を作製する。この例では、連続ＤＮＡ容器を、単一の細胞の内容物をポリマーマトリックス（例えば、ＰＡＭ＝ポリアクリルアミド）にカプセル封入することにより作製する。ゲノム分析のための好ましい特定の実施形態において、単一細胞のゲノムＤＮＡ内容物をＭＤＡ（ＷＧＡ多重置換増幅反応）により増幅する。この単一細胞ＭＤＡ生成物は、組み合わせインデックス化スキームを通じて進行するＤＮＡ容器を構成する。遺伝子発現のために、単一細胞のｃＤＮＡ調製を、Ｐｉｃｅｌｌｉ（Ｐｉｃｅｌｌｉ、２０１４）により記載されているように単一細胞容器から作製することができる。好ましい実施形態において、初期インデックスは、フラグメント化（酵素的）及びアダプターライゲーションを用いた標準的なライブラリー調製技術、又はトランスポザーゼ複合体を用いたタグメント化により、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡに結合する。好ましい実施形態において、後続のインデックスは、ライゲーション又はＰＣＲを介してライブラリーに付着する。インデックス化されたアダプターを逐次的方法で加えるのは容易であるため、ライゲーションが好ましい。最後の工程は、単にインデックス化されたＰＣＲ又はライゲーション及びＰＣＲを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、標的核酸はヒストン／タンパク質保護されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１２１３-１２１８（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６８８，ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｈｅｒｅｉｎ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅを参照）。アプリケーションは、エピゲノムプロファイリング、及びオープンクロマチン及びＤＮＡ結合タンパク質及びヌクレオソーム位置の分析を含む。
いくつかの実施形態において、連続性維持エレメントは単一細胞を含んでもよく、細胞からの核酸を増幅してもよい。その後、各連続性維持エレメントは、組み合わせインデックス化スキームにより固有にインデックス化することができる。短いシークエンシングのリードは、固有のインデックスに基づいてグループ化することができる。長い合成リードは、固有のインデックスに基づいて個別にデノボでアセンブルすることができる（参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｌｏｓｏｎｅ ２０１４（ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０６６８９）Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｌｏｎｇ－Ｒｅａｄｓ Ｅｍｐｏｗｅｒ Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｖｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｈｉｇｈｌｙ－Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）。
いくつかの実施形態において、ＣＥは、細胞の内容物、例えば、タンパク質、細胞小器官、ＲＮＡ、ＤＮＡ、リボソーム、抗体、ステロイド、特殊構造、グリカン、脂質、小分子、生物学的経路に影響を及ぼす可能性がある分子、単糖及び多糖、アルカロイド、一次及び二次代謝産物を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、ＣＥ内の細胞小器官を個別に染色してもよい。細胞小器官染色試薬の例は、細胞小器官標的化蛍光タンパク質（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｉｇｈｔｓ（商標））、細胞小器官又は細胞構造を選択的又は非選択的にラベル化することができる古典的細胞小器官染色剤又は色素コンジュゲートである。
いくつかの実施形態において、ＣＥ中の目的の被検物質はタンパク質である。タンパク質は、バーコード又は代替ラベルで標識することができる。バーコード又はラベルは、従来のアレイ又は配列ベースの方法を用いて読み取ることができる。近接ライゲーション法及び抗体インデックス配列を用いて、バーコード配列の検出とともにタンパク質を検出し（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４７３－４７７（２００２））、各個々の細胞内のタンパク質の同一性及び存在量を確立することができる。タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの部位特異的化学的ラベル化戦略を含む、当業者に知られている様々な方法（ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／ｃａｔ／ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌａｂｅｌｉｎｇ）によりラベル化することができる。
近接性ライゲーション（Ｄｕｏ－ｌｉｎｋ ＰＬＡ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｂｉｏｌｏｇｙ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｂｉｏｌｏｇｙ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍｌ-ＴａｂｌｅＰａｇｅ＝１１２２３２１３８，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、欧州特許第２７１４９２５号明細書）は、タンパク質の検出、タンパク質－タンパク質相互作用、及び連続性維持エレメントでの使用に適合させることができる翻訳後修飾の例である。この方法を用いて、連続性維持エレメント中の特定のタンパク質又はタンパク質複合体を検出及び定量化することができる。ワークフローの一例は、以下である：（１）１つ又は複数の連続性維持エレメントを作製、（２）目的のタンパク質に特異的な一次抗体の１つ又は複数のペアを洗浄及び添加、（３）バーコード標識された抗体で洗浄及び染色。容器内の連続性維持エレメントの各群は、異なるバーコード標識された抗体を受け取る。一次抗体の１つ又は複数の対の近接ライゲーションにより、特定のタンパク質に固有のバーコードを含む増幅産物を形成することができる。１つのバーコードが目的のタンパク質に特異的である一方、他のバーコードは、タンパク質を特定の連続性維持エレメント及び／又は細胞に割り当てるために使用される。１つ又は複数の分割及びプール工程を使用して、画分に特異的にラベルを付けることができる。このように、個々の連続性維持エレメントの内容は、各連続性維持エレメントを多数の並列工程で個々に処理する必要なく分析することができる。特に、１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、１００，０００，０００、及びそれ以上の連続性維持エレメントをこのようにして処理することは大きな利点である。ステロイド及び小分子は、タンパク質について記載したのと同様の方法で検出することができる。バーコード標識された抗体は、ステロイドのために開発することができる（Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ．１９８８ Ｊａｎ；３（１）：６３－８．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｔｅｒｏｉｄｓ．Ｂoｓｚｅ Ｐ ｅｔ ａｌ．）あるいは、蛍光色素及び放射性コンジュゲートが記載されている（ｗｗｗ．ｊｅｎａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｅｏｍ／ｃｍｓ／ｅｎ／ｌ／ｃａｔａｌｏｇ／２３０５＿ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ＿ｈｏｒｍｏｎｅｓ．ｈｔｍｌ）。ステロイドのためのこれらの抗体コンジュゲートは、上記のように処理することができる。種々の方法を使用して、連続性維持エレメントの１つ又は複数の構成成分を検出することができる。連続性維持エレメントの１つ又は複数の構成成分は、化学発光、蛍光、放射性プローブ、ＤＮＡタグ、バーコード及びインデックスでラベル化することができる。増幅戦略を利用してシグナルを増強することができる。例えば、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＲＣＡ）を用いて被検物質を検出することができる。続いて、ＲＣＡ産物は、シークエンシング、蛍光デコーダ（プローブ）により検出することができる。更に、マイクロアレイ、タンパク質アレイ、シークエンシング、ナノポアシークエンシング、次世代シークエンシング、キャピラリー電気泳動、ビーズアレイを読み出しに使用することができます。
細胞の内容物の連続性確立
いくつかの実施形態において、細胞又は単一の細胞からの内容物（例えば、これらに限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細胞小器官、代謝物、小分子等）の連続性は、連続性維持エレメント（ＣＥ）内に保存することができる。ＣＥは、これらに限定されるものではないが、液滴中に内容物を封入すること、ポリマーマトリックス中に内容物を埋め込むこと（封入後に）、及び内容物をビーズに付着することを含むいくつかの方法により作製してもよい。好ましい実施形態において、ＣＥは、水性緩衝液、酵素（ポリメラーゼ、リガーゼ、トランスポザーゼ等）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアダプター、トランスポゾン、及びプライマー等のアッセイ試薬に対して透過性である。インデックス化されたライブラリーは、上記のようにこのＣＥから作製される。物理的区画への希釈、区画固有インデックスの付加、追加区画へのプール及び再希釈の繰り返しラウンドは、多くの仮想区画の指数関数的な作製をもたらす。適切に設計されていれば、各ＣＥの内容物は、最終的に固有のバーコードで仮想的にインデックス化されるであろう。図１の例として、４段階インデックス化スキームは、合計４×９６＝３８４個の物理的区画だけで、多数の仮想区画及びインデックス（＞８４００万）をもたらす。好ましい実施形態において、区画特異的インデックスを、タグメント化、ライゲーション、又はＰＣＲを介して各区画化段階で加える。好ましい実施形態において、各工程における各物理的区画は、固有のインデックスを有する。後続の区画化では、同じインデックス又は異なるインデックスを使用することができる。１つの区画化段階から次の区画化段階まで同じインデックスを使用する場合、最終配列ストリング内のインデックスの位置は、区画及び区画化段階を同定するであろう。
液滴を用いた細胞の構成成分の分析
１つの実施形態において、ＣＥは、エマルジョン又は液滴であってもよい。１つの実施形態において、ＣＥは、オイルと接触する液滴である。１つの例において、核酸を含むＣＥは、液滴、区画、又はビーズへの核酸試料の希釈及び分配を含む。１つの実施形態において、液滴は、細胞又は単一細胞を含む。１つの実施形態において、単一細胞を含むＣＥは、液滴、区画、又はビーズへの単一細胞の希釈及び分配を含む。
いくつかの実施形態において、「液滴」は、典型的には、液滴は、充填流体により少なくとも部分的に境界される、液滴アクチュエータ上のある量の液体とすることができる。例えば、液滴は、充填流体により完全に包囲されてもよく、又は充填流体及び液滴アクチュエータの１つ又は複数の表面により境界されてもよい。液滴は、多種多様な形状を成してもよく、非限定的な実施例としては、一般に、円盤形、弾丸形、切頭球体、楕円体、球状、部分的に圧縮された球体、半球状、卵形、円筒形、及び混成又は分割等の液滴操作中に形成されるか、或いは液滴アクチュエータの１つ又は複数の表面とそのような形状との接触の結果として形成される種々の形状を含む。
液滴アクチュエータは、多種多様な液滴操作を行うために使用される。液滴アクチュエータは、典型的には、空間によって分離された２つの基質を含む。基質は液滴操作を行うための電極を含む。この空間は、典型的には、液滴アクチュエータ上で操作される流体と混和しない充填流体で満たされる。空間に曝される表面は、典型的には疎水性である。遺伝物質（ゲノミクス）及びその発現（機能ゲノミクス）の分析、プロテオミクス、組み合わせライブラリー分析、及び他の多重生体分析アプリケーションは、液滴で行うことができ、以下の操作を分析液滴アクチュエータで行うことができる。液滴アクチュエータを使用して液滴を操作する方法は、それぞれ米国特許出願公開第２０１０／０１３０３６９号明細書及び同第２０１３／０２０３６０６号明細書に開示されており、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
「液滴アクチュエータ」は、液滴を操作するためのデバイスを意味する。液滴アクチュエータの実施例については、全開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｍｕｌａらの２００５年６月２８日に発行された「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ-Ｂａｓｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」と題される米国特許第６，９１１，１３２号明細書、Ｐａｍｕｌａらの２００６年８月３１日に公開された「Ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｏｎ ａ Ｐｒｉｎｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｂｏａｒｄ」と題される米国特許出願公開第２００６／０１９４３３１号明細書、Ｐｏｌｌａｃｋらの２００７年１０月２５日に公開された「Ｄｒｏｐｌｅｔ-Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」と題される国際特許出願公開第２００７／１２０２４１号、Ｓｈｅｎｄｅｒｏｖの２００４年８月１０日に発行された「Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」と題される米国特許第６，７７３，５６６号明細書、Ｓｈｅｎｄｅｒｏｖの２００３年５月２０日に発行された「Ａｃｔｕａｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｍｏｖｉｎｇ Ｐａｒｔｓ」と題される米国特許第６，５６５，７２７号明細書、Ｋｉｍらの２００３年１１月６日に公開された「Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ-ｄｒｉｖｅｎ Ｍｉｃｒｏｐｕｍｐｉｎｇ」と題される米国特許出願公開第２００３／０２０５６３２号明細書、Ｋｉｍらの２００６年７月２７日に公開された「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｒｏｐｓ ｆｒｏｍ ａ Ｎｏｚｚｌｅ」と題される米国特許出願公開第２００６／０１６４４９０号明細書、Ｋｉｍらの２００７年２月１日に公開された「Ｓｍａｌｌ Ｏｂｊｅｃｔ Ｍｏｖｉｎｇ ｏｎ Ｐｒｉｎｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｂｏａｒｄ」と題される米国特許出願公開第２００７／００２３２９２号明細書、Ｓｈａｈらの２００９年１１月１９日に公開された「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」と題される米国特許出願公開第２００９／０２８３４０７号明細書、Ｋｉｍらの２０１０年４月２２日に公開された「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ Ｆｅｅｄｂａｃｋ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｏｎ Ｃｈｉｐ」と題される米国特許出願公開第２０１０／００９６２６６号明細書、Ｖｅｌｅｖの２００９年６月１６日に発行された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｈａｖｉｎｇ ａ Ｆｌｕｉｄ Ｓｕｒｆａｃｅ」と題される米国特許第７，５４７，３８０号明細書、Ｓｔｅｒｌｉｎｇらの２００７年１月１６日に発行された「Ｍｅｔｈｏｄ，Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ Ａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｖｉａ Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ，ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｉｋｅ」と題される米国特許第７，１６３，６１２号明細書、Ｂｅｃｋｅｒらの２０１０年１月５日に発行された「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」と題される米国特許第７，６４１，７７９号明細書、Ｂｅｃｋｅｒらの２００５年１２月２０日に発行された「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」と題される米国特許第６，９７７，０３３号明細書、Ｄｅｃｒｅらの２００８年２月１２日に発行された「Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂｏｄｙ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ」と題される米国特許第７，３２８，９７９号明細書、Ｙａｍａｋａｗａらの２００６年２月２３日に公開された「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ａｐｐａｒａｔｕｓ」と題される米国特許出願公開第２００６／００３９８２３号明細書、Ｗｕの２０１１年３月３日に公開された「Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｈｅａｔ-ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」と題される米国特許出願公開第２０１１／００４８９５１号明細書、Ｆｏｕｉｌｌｅｔらの２００９年７月３０日に公開された「Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ」と題される米国特許出願公開第２００９／０１９２０４４号明細書、Ｆｏｕｉｌｌｅｔらの２００６年５月３０日に発行された「Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｖｏｌｕｍｅｓ Ａｌｏｎｇ ａ Ｍｉｃｒｏ-ｃａｔｅｎａｒｙ Ｌｉｎｅ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ｆｏｒｃｅｓ」と題される米国特許第７，０５２，２４４号明細書、Ｍａｒｃｈａｎｄらの２００８年５月２９日に公開された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒ」と題される米国特許出願公開第２００８／０１２４２５２号明細書、Ａｄａｃｈｉらの２００９年１２月３１日に公開された「Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ」と題される米国特許出願公開第２００９／０３２１２６２号明細書、Ｒｏｕｘらの２００５年８月１８日に公開された「Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｄｒｏｐ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔｗｏ ｏｒ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」と題される米国特許出願公開第２００５／０１７９７４６号明細書、及びＤｈｉｎｄｓａらの“Ｖｉｒｔｕａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ Ｃｈａｎｎｅｌｓ：Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｗｉｔｈ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，” Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，１０：８３２-８３６（２０１０）を参照。ある液滴アクチュエータは、その間に液滴操作ギャップを伴って配列される１つ又は複数の基板と、１つ又は複数の基板と関連付けられ（例えば、基板上で層状である、基板に取り付けられる、及び／又は基板に埋め込まれる）、１つ又は複数の液滴操作を行うように配列される電極とを含むであろう。例えば、ある液滴アクチュエータは、基部（又は底部）基板と、基板と関連付けられる液滴操作電極と、基板及び／又は電極の上の１つ又は複数の誘電体層と、任意選択的に、液滴操作表面を形成する、基板、誘電体層、及び／又は電極の上の１つ又は複数の疎水性層とを含むであろう。一般的に液滴操作ギャップと称されるギャップによって液滴操作表面から分離される、頂部基板も提供されてもよい。頂部及び／又は底部基板上の種々の電極の配列が、上述の特許及び出願で議論され、ある新規の電極配列が、本開示の説明で議論される。液滴操作の間、液滴が、接地又は基準電極と連続的又は頻繁に接触したままであることが好ましい。接地又は基準電極は、ギャップ内で、ギャップに面する頂部基板、ギャップに面する底部基板と関連付けられてもよい。両方の基板上に電極が提供される場合、電極を制御又は監視するための液滴アクチュエータ機器に電極を連結するための電気的接触は、一方又は両方の基板と関連付けられてもよい。いくつかの場合では、１つの基板のみが液滴アクチュエータと接触するように、一方の基板上の電極は、他方の基板に電気的に連結される。１つの実施形態において、導電性材料（例えば、Ｍａｓｔｅｒ Ｂｏｎｄ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ハッケンサック）から入手可能なＭＡＳＴＥＲ ＢＯＮＤ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ＥＰ７９等のエポキシ）が、一方の基板上の電極と、他方の基板上の電気路との間の電気的接続を提供し、例えば、頂部基板上の接地電極が、かかる導電性材料により底部基板上の電気路に連結されてもよい。複数の基板が使用される場合、基板間のギャップの高さを決定し、アクチュエータ上分配リザーバを画定するように、スペーサが基板間に提供されてもよい。スペーサ高さは、例えば、少なくとも約５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、２７５μｍ、又はそれ以上であってもよい。或いは、又は加えて、スペーサ高さは、最大でも約６００μｍ、４００μｍ、３５０μｍ、３００μｍ、又はそれ未満であってもよい。スペーサは、例えば、頂部基板又は底部基板を形成する突起層、及び／又は頂部基板と底部基板との間に挿入された材料で形成されてもよい。それを通して液体を液滴操作ギャップの中へ送達することができる流体通路を形成するために、１つ又は複数の開口部が、１つ又は複数の基板内に提供されてもよい。１つ又は複数の開口部は、場合によっては、１つ又は複数の電極との相互作用のために整列され、例えば、開口部を通って流れた液体が、１つ又は複数の液滴操作電極と十分に近接して、液体を使用した液滴操作電極によって液体操作が果たされることを可能にするように整列されてもよい。基部（又は底部）基板及び頂部基板は、場合によっては、１つの一体的構成要素として形成されてもよい。１つ又は複数の基準電極が、基部（若しくは底部）基板及び／又は頂部基板上、及び／又はギャップ内に提供されてもよい。基準電極配列の例は、上述の特許及び特許出願で提供される。種々の実施形態において、液滴アクチュエータによる液滴の操作は、電極媒介、例えばエレクトロウェッティング媒介、又は誘電泳動媒介、又はクーロン力媒介であってもよい。本開示の液滴アクチュエータで使用されてもよい、液滴操作を制御するための他の技法の例は、機械的原理（例えば、外部シリンジポンプ、空気圧膜ポンプ、振動膜ポンプ、真空デバイス、遠心力、圧電ポンプ／超音波ポンプ、及び音響力）と、電気的又は磁気的原理（例えば、電気浸透流、動電学的ポンプ、強磁性流体プラグ、電磁流体力学ポンプ、磁力を使用した引力又は斥力、及び電磁流体力学ポンプ）と、熱力学的原理（例えば、気泡発生／相変化誘発型体積膨張）と、他の種類の表面ウェッティング原理（例えば、エレクトロウェッティング及び光学エレクトロウェッティング、ならびに化学的、熱的、構造的、及び放射性誘発型表面張力勾配）と、重力と、表面張力（例えば、毛細管作用）と、静電力（例えば、電気浸透流）と、遠心流（コンパクトディスク上に配置され、回転させられる基板）と、磁力（例えば、振動するイオンが流動を引き起こす）と、電磁流体力学的力と、真空差又は圧力差とに基づき動作するもの等の、流体力学的な流体圧を誘発するデバイスを使用することを含む。ある実施形態では、前述の技法のうちの２つ以上のものの組み合わせが、本開示の液滴アクチュエータにおける液滴操作を行うために採用されてもよい。同様に、前述のうちの１つ又は複数のものが、例えば、別のデバイスのリザーバから、又は液滴アクチュエータの外部リザーバ（例えば、液滴アクチュエータ基板及びリザーバから液滴操作ギャップ内への流路と関連付けられるリザーバ）から、液体を液滴操作ギャップ内に送達するために使用されてもよい。本開示のある液滴アクチュエータの液滴操作表面は、疎水性材料から作製されてもよく、又はそれらを疎水性にするようにコーティング又は処理されていてもよい。例えば、場合によっては、液滴操作表面の一部分又は全体が、例えば、溶液中のポリ又はパーフッ素化化合物等の化合物若しくは重合性単量体を使用する、堆積によって、又はｉｎ ｓｉｔｕ合成を使用することによって、低表面エネルギー材料又は化学作用で誘導体化されてもよい。
例としては、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ（ＤｕＰｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントン）から入手可能）、ｃｙｔｏｐ系の材料の構成要素、疎水性コーティング及び超疎水性コーティングのＦＬＵＯＲＯＰＥＬ（登録商標）族内のコーティング（Ｃｙｔｏｎｉｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリーランド州ベルツビル）から入手可能）、シランコーティング、フルオロシランコーティング、疎水性ホスホネート誘導体（例えば、Ａｃｕｌｏｎ，Ｉｎｃによって販売されているもの）、及びＮＯＶＥＣ（商標）電子コーティング（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（ミネソタ州セントポール）から入手可能）、プラズマ増強化学蒸着（ｐｌａｓｍａ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：ＰＥＣＶＤ）用の他のフッ素化単量体、及びＰＥＣＶＤ用の有機シロキサン（例えば、ＳｉＯＣ）が挙げられる。場合によっては、液滴操作表面は、約１０ｎｍ～約１，０００ｎｍの範囲の厚さを有する疎水性コーティングを含んでもよい。また、いくつかの実施形態において、液滴アクチュエータの頂部基板は、導電性有機ポリマーを含み、これは次いで、疎水性コーティングでコーティングされるか、又は液滴操作表面を疎水性にするように別様に処理される。例えば、プラスチック基板上に堆積される導電性有機ポリマーは、ポリ（３，４-エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート）（ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ）であってもよい。導電性有機ポリマー及び代替的な導電層の他の例は、全開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｏｌｌａｃｋらの２０１１年１月６日に公開された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」と題される国際特許出願公開第２０１１／００２９５７号に記載されている。一方又は両方の基板が、印刷回路板（ｐｒｉｎｔｅｄ ｃｉｒｃｕｉｔ ｂｏａｒｄ：ＰＣＢ）、ガラス、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）コーティングガラス、及び／又は半導体材料を基板として使用して製作されてもよい。基板がＩＴＯコーティングガラスであるとき、ＩＴＯコーティングは、好ましくは、少なくとも約２０ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、又はそれを上回る厚さである。或いは又は加えて、厚さは、最大でも約２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、又はそれ未満であってもよい。場合によっては、頂部基板及び／又は底部基板は、ポリイミド誘電体等の誘電体でコーティングされるＰＣＢ基板を含み、これはまた、場合によっては、液滴操作表面を疎水性にするようにコーティングされるか、又は別様に処理されてもよい。基板がＰＣＢを含むとき、以下の材料、即ち、ＭＩＴＳＵＩ（商標）ＢＮ-３００（ＭＩＴＳＵＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンノゼ）から入手可能）、ＡＲＬＯＮ（商標）１１Ｎ（Ａｒｌｏｎ，Ｉｎｃ（カリフォルニア州サンタアナ）から入手可能）、ＮＥＬＣＯ（登録商標）Ｎ４０００-６及びＮ５０００-３０／３２（Ｐａｒｋ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（ニューヨーク州メルビル）から入手可能）と、ＩＳＯＬＡ（商標）ＦＲ４０６（Ｉｓｏｌａ Ｇｒｏｕｐ（アリゾナ州チャンドラー）から入手可能）、特にＩＳ６２０、フッ素重合体族（低バックグラウンド蛍光を有するため蛍光検出に好適）、ポリイミド族、ポリエステル、ポリエチレンナフタレート、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、液晶ポリマー、シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、アラミド、ＴＨＥＲＭＯＵＮＴ（登録商標）不織アラミド補強材（ＤｕＰｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントン）から入手可能）、ＮＯＭＥＸ（登録商標）ブランド繊維（ＤｕＰｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントン）から入手可能）、及び紙が、好適な材料の例である。種々の材料もまた、基板の誘電体成分としての使用に好適である。例としては、ＰＡＲＹＬＥＮＥ（商標）Ｃ（特にガラス上）、ＰＡＲＹＬＥＮＥ（商標）Ｎ、及びＰＡＲＹＬＥＮＥ（商標）ＨＴ（高温用、約３００℃）（Ｐａｒｙｌｅｎｅ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．（テキサス州カティ）から入手可能）等の蒸着誘電体、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦコーティング、ｃｙｔｏｐ、ＴＡＩＹＯ（商標）ＰＳＲ４０００シリーズ、ＴＡＩＹＯ（商標）ＰＳＲ及びＡＵＳシリーズ（Ｔａｉｙｏ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（ネバダ州カーソンシティ）から入手可能）のような（例えば、ＰＣＢ上の）液体光画像形成性はんだマスク（熱制御を伴う用途にとって良好な熱特性）、ならびにＰＲＯＢＩＭＥＲ（商標）８１６５（熱制御を伴う用途にとって良好な熱特性）（Ｈｕｎｔｓｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ロサンゼルス）から入手可能）等のはんだマスク、ＶＡＣＲＥＬ（登録商標）乾燥フィルムはんだマスク系（ＤｕＰｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントン）から入手可能）のもの等の乾燥フィルムはんだマスク、ポリイミドフィルム（例えば、ＫＡＰＴＯＮ（登録商標）ポリイミドフィルム、ＤｕＰｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントン）から入手可能）、ポリエチレン、及びフッ素重合体（例えば、ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン等のフィルム誘電体、ポリエステル、ポリエチレンナフタレート、シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、上で列挙した任意の他のＰＣＢ基板材料、ブラックマトリクス樹脂、ポリプロピレン、ＤｕＰｏｎｔ（商標）Ｐｙｒａｌｕｘ（登録商標）ＨＸＣ及びＤｕＰｏｎｔ（商標）Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）ＭＢＣ（ＤｕＰｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントン）から入手可能）等のブラックフレキシブル回路材料が挙げられる。液滴輸送の電圧及び周波数は、特定のアッセイプロトコルで使用される試薬を用いた実施のために選択されてもよい。設計パラメータは多様であってもよく、例えば、アクチュエータ上リザーバの数及び配置、独立した電極接続の数、異なるリザーバのサイズ（容積）、磁石／ビーズ洗浄ゾーンの配置、電極サイズ、電極間ピッチ、及び（頂部基板と底部基板との間の）ギャップ高さは、特定の試薬、プロトコル、液滴体積等とともに使用するために多様であってもよい。場合によっては、本開示の基板は、例えば、溶液中のポリ又はパーフッ素化化合物若しくは重合性単量体を使用した、堆積又はｉｎ ｓｉｔｕ合成を使用して、低表面エネルギー材料又は化学作用で誘導体化されてもよい。例としては、浸漬又は噴霧コーティング用のＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦコーティング及びＦＬＵＯＲＯＰＥＬ（登録商標）コーティング、プラズマ増強化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）用の他のフッ素化単量体、及びＰＥＣＶＤ用の有機シロキサン（例えば、ＳｉＯＣ）が挙げられる。加えて、場合によっては、液滴操作表面のある部分又は全体が、ＰＣＢ基板からのバックグラウンド蛍光等のバックグラウンドのノイズを低減するための物質でコーティングされてもよい。例えば、ノイズ低減コーティングは、Ｔｏｒａｙ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（日本）から入手可能なブラックマトリクス樹脂等のブラックマトリクス樹脂を含んでもよい。液滴アクチュエータの電極は、典型的には、それ自体が、処理機能、ならびにデータ及びソフトウェア記憶能力と、入力及び出力能力とを含むことができる、システムの一部として提供される、コントローラ又はプロセッサによって制御される。試薬は、液滴操作ギャップ内の液滴アクチュエータ上に、又は液滴操作ギャップに流体的に連結されるリザーバ内に提供されてもよい。試薬は、液体形態、例えば、液滴であってもよく、又は、液滴操作ギャップ内、若しくは液滴操作ギャップに流体的に連結されるリザーバ内に再構成可能な形態で提供されてもよい。再構成可能な試薬は、典型的には、再構成のために液体と組み合わせられてもよい。本明細書に記載する方法及び装置とともに使用するために好適な再構成可能な試薬の例としては、全開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅａｔｈｒｅｌらの２０１０年６月１日に発行された「Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔａｂｌｅ Ｆｉｌｍｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ」と題される米国特許第７，７２７，４６６号明細書に記載されるものを含む。
「液滴操作」は、液滴アクチュエータ上の液滴の任意の操作を意味する。液滴操作は、例えば、液滴アクチュエータへの液滴の装填、液滴源からの１つ又は複数の液滴の分配、２つ以上の液滴への１つの液滴の分割、分離、又は分断、ある場所から別の場所への任意の方向での液滴の輸送、単一の液滴への２つ以上の液滴の混成又は組み合わせ、液滴の希釈、液滴の混合、液滴の撹拌、液滴の変形、定位置での液滴の保持、液滴のインキュベーション、液滴の加熱、液滴の気化、液滴の冷却、液滴の処分、液滴の液滴アクチュエータ外への輸送、本明細書に記載される他の液滴操作、及び／又は前述の任意の組み合わせを含む。用語「混成する」、「混成」、「組み合わせる」、「組み合わせ」、及び同等物は、２つ以上の液滴から１つの液滴の作製することを表すために使用される。かかる用語が２つ以上の液滴に関して使用される場合、１つの液滴への２つ以上の液滴の組み合わせをもたらすのに十分な、液滴操作の任意の組み合わせを用いてもよいことを理解されたい。例えば、「液滴Ａと液滴Ｂとの混成」は、液滴Ａを静止した液滴Ｂと接触するように輸送すること、液滴Ｂを静止した液滴Ａと接触するように輸送すること、又は液滴Ａ及びＢを相互に接触するように輸送することによって達成することができる。用語「分割」、「分離」、及び「分断」は、得られる液滴の体積（即ち、得られる液滴の体積は、同一又は異なる可能性がある）又は得られる液滴の数（得られる液滴の数は、２、３、４、５、又はそれ以上であってもよい）に関する任意の特定の結果を示唆することを意図してはいない。用語「混合」は、液滴内の１つ又は複数の構成成分のより均一な分布をもたらす液滴操作を指す。「装填」液滴操作の例は、微小透析装填、圧力補助装填、ロボット装填、受動装填、及びピペット装填を含む。液滴操作は、電極媒介されてもよい。場合によっては、液滴操作は、表面上の親水性及び／又は疎水性領域の使用によって、及び／又は物理的障害によって、更に促進される。液滴操作の例については、「液滴アクチュエータ」の定義の下で、上記に引用された特許及び特許出願を参照されたい。液滴操作の結果を判定又は確認するために、インピーダンス若しくは静電容量感知技術、又は画像化技術が、時として使用されてもよい。かかる技術の例は、全開示が参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｓｔｕｒｍｅｒらの２０１０年８月５日に公開された「Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ」と題される米国特許出願公開第２０１０／０１９４４０８号明細書に記載されている。一般的に言えば、感知技術又は画像化技術は、特定の電極における液滴の存在又は非存在を確認するために使用されてもよい。例えば、液滴分配操作後の目的電極における分配された液滴の存在は、その液滴分配操作が有効であったことを確認する。同様に、アッセイプロトコルの適切なステップでの検出スポットでの液滴の存在は、以前の一連の液滴操作が検出用の液滴の生成に成功したことを裏付けることができる。液滴輸送時間は、かなり速くてもよい。例えば、種々の実施形態において、１つの電極から隣の電極までの液滴の輸送は、約１秒、又は約０．１秒、又は約０．０１秒、又は約０．００１秒を超えてもよい。１つの実施形態において、電極を交流モードで操作するが、画像化のために直流モードに切り替える。液滴の占有領域の面積がエレクトロウェッティング面積に類似するための液滴操作を行うことが有益であり、換言すると、１倍、２倍、３倍の液滴が、それぞれ、１、２、及び３個の電極を使用して操作され、有用に制御される。液滴の占有領域が所与の時間において液滴操作を行うために利用可能な電極の数を上回る場合、液滴のサイズと電極の数との間の差は、典型的には、１を超えるべきではなく、換言すると、２倍の液滴は、１個の電極を使用して有用に制御され、３倍の液滴は、２個の電極を使用して有用に制御される。液滴がビーズを含むとき、液滴の大きさが、液滴を制御する、例えば、液滴を輸送する電極の数に等しいことが有用である。
いくつかの態様において、核酸ライブラリーを、液滴等のＣＥを用いて、細胞又は単一細胞から調製することができる。いくつかの実施形態において、細胞を緩衝液に懸濁させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞懸濁液を液滴アクチュエータに導入してもよい。電極媒介液滴操作を使用して、各液滴が単一細胞を含むように細胞懸濁液を含む液滴のアレイを分配してもよい。電極媒介液滴操作を使用して、細胞溶解緩衝液を含む試薬液滴のアレイを分配してもよい（溶解緩衝液滴）。溶解緩衝液滴及び単一細胞を含む細胞懸濁液液滴のアレイは、細胞溶解液滴が単一細胞の構成成分を含むように細胞溶解液滴を形成する電極媒介操作を用いて組み合わせることができる。固有の核酸バーコード、トランスポゾン及び適切な酵素（例えば、フラグメント化酵素、ポリメラーゼ、リガーゼ、トランスポザーゼ、逆転写酵素等）を含む反応試薬を液滴アクチュエータに導入してもよい。いくつかの実施形態において、トランスポゾン及び／又はバーコードは、プライマー結合部位を含んでいてもよい。電極媒介液滴操作を使用して、各試薬液滴が固有の核酸バーコード及び適切な酵素を含むように、反応試薬を含む試薬液滴のアレイを分配させてもよい。細胞溶解物液滴及び試薬液滴は、電極媒介操作を用いて組み合わせて、単一細胞からの核酸が、試薬液滴からの酵素によって作用されて核酸がバーコードを含むように、第１バーコード化液滴のアレイを形成することができる。いくつかの実施形態において、細胞溶解液滴内のｍＲＮＡは、細胞溶解液滴及び試薬液滴が組み合わされ、ｃＤＮＡがバーコードを含むことができる場合に、逆転写することができる。いくつかの実施形態において、バーコードは、プライマー結合部位及び固有の分子インデックスを含むことができる。電極媒介液滴操作を使用して、第１のバーコード化された液滴は、第２のバーコード液滴、第３のバーコード液滴等のアレイを生成するために、試薬液滴と複数回更に組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、組み合わせの各ラウンドについて、バーコードは異なる。従って、バーコード液滴を試薬液滴と組み合わせる複数のラウンドは、組み合わせバーコードを生成するであろう。最後に、異なる液滴からの核酸をプールし、シークエンシングすることができる。シークエンシング情報は、細胞からの核酸のシークエンシング情報を明らかにすることができ、任意選択的に核酸の供給源（例えば、細胞又は単一細胞）も同定することができる。かかる情報は、核酸が、遺伝性の遺伝的疾患又は癌等の疾患に関連する突然変異を含む場合に有益である。
いくつかの態様において、本出願の方法は、プロテオミクスに適用することができる。液滴のアレイ中の各液滴が単一のビーズを含むように、ビーズ懸濁液を液滴アクチュエータに導入してビーズ懸濁液からの液滴のアレイを分配することにより、液滴を含むビーズのアレイを作製することができる（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／０１３０３６９号明細書を参照）。ビーズは、抗体又は他の親和性プローブを含むことができる（典型的な付着プロトコルについては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃａｓｓ Ｔ，Ｌｉｇｌｅｒ Ｆ Ｓ，ｅｄｓ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８．ｐｐ １－１４を参照）。いくつかの実施形態において、抗体は、細胞表面エピトープに特異的であってもよい。いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナルであってもよく、他の実施形態において、抗体はポリクローナルであってもよい。電極媒介液滴操作を使用して、ビーズ懸濁液液滴のアレイと、単一細胞を含む液滴のアレイとを組み合わせて、ビーズ上の細胞のアレイを産生させ、ビーズ上の抗体が細胞表面タンパク質に結合するようにしてもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、細胞内のタンパク質に特異的であってもよい。電極媒介液滴操作を使用して、ビーズ懸濁液液滴のアレイを、ビーズ上の抗体が細胞内のタンパク質に結合してビーズ液滴上のタンパク質のアレイを産生するように、単一細胞の溶解物を含む液滴のアレイと組み合わせてもよい。任意選択的に、電極媒介液滴操作を使用して、ビーズ液滴上のタンパク質のアレイを、タンパク質を固有にラベルすることができるように、タンパク質ラベル試薬を含む試薬液滴のアレイと組み合わせることができる。結合したタンパク質は、関連するラベルから、又は他の手段（ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ等）により検出することができる。タンパク質の同一性及びタンパク質の起源を決定することができる。いくつかの実施形態において、プロテオミクスデータをシークエンシングデータと相関させることができる。
いくつかの実施形態において、抗体は、他の生体分子に特異的であってもよく、タンパク質に限定されない。かかる生体分子は、これらに限定されるものではないが、多糖又は脂質であってもよい。いくつかの実施形態において、かかる生体分子の同一性及び起源は、上記で作成される配列データに関連する可能性がある。
ｉｎ ｓｉｔｕ細胞分析
いくつかの実施形態において、細胞及びその構成成分は、ｉｎ ｓｉｔｕで分析することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、フローセルを通過させてもよい。
本明細書で用いる場合、用語「フローセル」は、表面を有し、当該表面を１つ又は複数の液体試薬が流れることができるチャンバーを意味する。一般に、フローセルは、液体の流れを容易にするための開口入口及び開口出口を有するものである。本開示の方法で容易に用いることができるフローセル及び関連する流体系並びに検出プラットフォームの例は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）；国際特許出願公開第０４／０１８４９７号；米国特許第７，０５７，０２６号明細書；国際特許出願公開第９１／０６６７８号；国際特許出願公開第０７／１２３７４４号；米国特許第７，３２９，４９２号明細書；米国特許第７，２１１，４１４号明細書；米国特許第７，３１５，０１９号明細書；米国特許第７，４０５，２８１号明細書，及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号明細書に記載されている。
いくつかの実施形態において、フローセルは、アレイを収容していてもよい。核酸シークエンシングに用いられるアレイは、核酸特徴のランダムな空間的パターンを有することが多い。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なＨｉＳｅｑ（商標）又はＭｉＳｅｑ（商標）シークエンシングプラットフォームは、核酸アレイがランダムなシーディングとその後に続くブリッジ増幅により形成されるフローセルを用いることができる。しかしながら、パターン化されたアレイはまた、核酸シークエンシング又は他の分析アプリケーションに用いることができる。例示的なパターン化アレイ、その製造方法、及びその使用方法は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／７８７，３９６号明細書；米国特許出願第１３／７８３，０４３号明細書；米国特許出願第１３／７８４，３６８号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０１１６１５３Ａ１号明細書；及び米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８６Ａ１号明細書に記載されている。かかるパターン化アレイの特徴を用いて、単一の核酸鋳型分子を捕捉し、例えば、ブリッジ増幅を介したその後の均質なコロニーの形成をシードすることができる。かかるパターン化アレイは、特に核酸シークエンシングアプリケーションに有用である。
いくつかの実施形態において、フローセル表面は、フローセル表面上で通過する細胞を固定するための抗体等の捕捉部分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、フローセル表面上の抗体は、細胞表面タンパク質に特異的に結合していてもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、癌細胞の細胞表面タンパク質に特異的に結合し、それによりフローセル表面上で癌細胞を濃縮させてもよい。
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞をフローセルに通す前に、当該技術分野で知られている細胞選別技術により種々のタイプに選別することができる。例示的な細胞選別技術としては、これらに限定されるものではないが、フローサイトメトリーを利用した蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（Ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）、又はラベル化された細胞のチューブを磁場中に置くカラムフリー細胞分離によるものが挙げられる。正に選択した細胞はチューブ内に保持され、負に選択した細胞は液体懸濁液内に存在する（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、カナダ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）。
いくつかの実施形態において、フローセルを通過する細胞をフローセル内で溶解し、それにより細胞の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）をフローセルに放出させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を、溶解前にフローセル上に固定する。細胞の溶解方法は、これらに限定されるものではないが、超音波処理、プロテアーゼ処理、浸透圧衝撃、高塩処理を含み、当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ全体を逆転写することができる。いくつかの実施形態において、固有のバーコードを細胞からの核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡに導入することができる。バーコードを核酸に導入する方法は、上記で議論されたとおりであり、これらに限定されるものではないが、Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）技術、リガーゼ、ポリメラーゼを用いたタグメント化を含む。いくつかの実施形態において、バーコードは、細胞起源の同定に有用である可能性がある。いくつかの実施形態において、バーコードは、プライマー結合部位を有していてもよい。いくつかの実施形態において、複数のバーコードを核酸に導入してもよい。いくつかの実施形態において、複数のバーコードは、互いに異なる。いくつかの実施形態において、バーコードを有する核酸を、拡散させ、再度プールし、追加のバーコードを導入してもよい。いくつかの実施形態において、バーコードの導入後又は導入中に、核酸をフラグメント化することができる。いくつかの実施形態において、フラグメント化された核酸を、フローセルに拡散させる前に増幅させてもよい。いくつかの実施形態において、バーコードを含むフラグメント化された核酸を、捕捉プローブを含むフローセルの異なる部分に拡散させ、フローセル上に固定してもよい。固定されたフラグメント化核酸を、ブリッジ増幅させてもよい。
上記の態様のいくつかの実施形態において、フローセルを通過する細胞は、単一細胞である。いくつかの実施形態において、トランスクリプトーム全体を評価することができる。いくつかの実施形態において、細胞又は単一細胞からのＤＮＡ及びＲＮＡを、配列情報のために同時に評価することができる。いくつかの実施形態において、細胞又は単一細胞からのタンパク質を、同一性及び配列情報のために評価することができる。いくつかの実施形態において、細胞又は単一細胞からの他の被検物質、例えば、脂質、炭水化物、細胞小器官等を評価することができる。
鋳型核酸のフラグメント化
鋳型核酸を調製するいくつかの実施形態は、鋳型核酸のフラグメント化を含むことができる。いくつかの実施形態において、バーコード化又はインデックス化されたアダプターをフラグメント化された標的核酸に付着させる。アダプターを、ライゲーション（酵素的又は化学的）、タグメント化、ポリメラーゼ伸長等の当該技術分野でよく知られている様々な方法を用いて付着させることができる。いくつかの実施形態において、非連続トランスポゾン配列を含むトランスポソームの挿入により、標的核酸のフラグメント化をもたらすことができる。ループ状のトランスポソームを含むいくつかの実施形態において、トランスポゾン配列を含む標的核酸を、トランスポゾン配列のフラグメント化部位でフラグメント化することができる。本明細書で提供する実施形態とともに有用な標的核酸をフラグメント化する有用な方法の更なる例は、例えば、各々その全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号明細書、及び国際特許出願公開第２０１２／０６１８３２号に見出すことができる。
単一分子のタグ化
本発明は、個々の分子を追跡し、同定することができるように分子をタグ化する方法を提供する。その後、バルクデータをデコンボリューションして個々の分子に変換することができる。元の分子から最終生成物までのプロセスが元の群の（化学量論的な）表現を変化させる場合、個々の分子を区別して情報を元の分子に関連付ける能力は、特に重要である。例えば、増幅は、元の表現を歪める可能性がある複製（例えば、ＰＣＲ複製又はバイアス増幅）をもたらす。これは、メチル化状態コール、コピー数、不均一な増幅及び／又は増幅バイアスによる対立遺伝子比を変えることができる。個々の分子を同定することにより、コードタグ化は、処理後の同一分子を区別する。このように、重複及び増幅バイアスを除去して、分子又は分子群の元の表現を正確に決定することができる。
単一分子を固有にタグ化する利点は、元のプール中の同一の分子がそれらのタグ化のために固有に同定されることである。更に下流の分析では、これらの固有にタグ化された分子を今や区別することができる。この技術は、増幅が用いられるアッセイスキームにおいて利用することができる。例えば、増幅は、混合された分子群の元の表現を歪めることが知られている。固有のタグ化を用いない場合、元の表現（コピー数又は対立遺伝子比等）は、表現中の各分子のバイアス（既知又は未知の）を考慮する必要がある。固有のタグ化を用いると、重複を除去し、各々固有のタグを有する分子の元の表示を数えることによって、表現を正確に決定することができる。従って、真の配列又は関心のある配列のみがさらなる分析のために選択されるように、データをフィルタリングすることができるため、バイアスを恐れることなくｃＤＮＡを増幅及びシークエンシングすることができる。同じバーコードを使用して多くのリードでコンセンサスを取ることで、正確なリードを構築することができる。
本明細書に記載する組成物及び方法のいくつかの実施形態において、アッセイの初期段階で元の群をタグ化することが好ましいが、初期段階でバイアスを導入しない場合又は重要ではない場合は、タグ化を後の段階で行うことができる。これらのアプリケーションのいずれにおいても、バーコード配列の複雑さは、タグ化される個々の分子の数よりも大きくなければならない。これは、異なる標的分子が異なる固有のタグを確実に受け取ることを保証する。このように、特定の長さ（例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、又は２００ヌクレオチドの長さ）のランダムオリゴヌクレオチドのプールが望ましい。タグのランダムなプールは、コード空間が４ｎ（ここで、ｎはヌクレオチドの数）の非常に複雑なタグを表します。追加のコード（設計されているかランダムであるかにかかわらず）は、エラー訂正のためのパリティ検査のようなさらなる検査として機能するために、異なる段階に組み込むことができる。
本明細書に記載する組成物及び方法１つの一実施形態において、個々の分子（標的ＤＮＡ等）を、固有のオリゴ配列及び／又はバーコード等の固有のラベルに付着する。ラベルの付着は、ライゲーション、カップリング化学、吸着、トランスポゾン配列の挿入等によって行うことができる。他の手段としては、増幅（ＰＣＲ、ＲＣＡ、又はＬＣＲによる等）、コピー（ポリメラーゼによる付加等）、及び非共有相互作用が挙げられる。
特定の方法は、各鋳型がコードスペース内の個々のコードを受け取り、それにより他のアンプリコンと区別することができる固有のアンプリコンを生成するように、ＰＣＲプライマーにバーコード（例えば、設計された又はランダムな配列）を含めることを含む。この概念は、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ（商標）アッセイ、及び、各々その全体が参照により組み込まれる、米国特許第７，５８２，４２０号明細書、同第７，９５５，７９４号明細書、及び同第８，００３，３５４号明細書に開示されているアッセイ等の、ポリメラーゼ増幅を用いる任意の方法に適用することができる。コードタグ化された標的配列は、ローリングサークル増幅等の方法により環状化及び増幅されて、コードタグ化アンプリコンを生成することができる。同様に、コードをＲＮＡに添加することもできる。
鋳型核酸の分析方法
本明細書に記載する技術のいくつかの実施形態は、鋳型核酸を分析する方法を含む。かかる実施形態では、シークエンシング情報を鋳型核酸から得ることができ、この情報を用いて１つ又は複数の標的核酸の配列表現を生成することができる。
本明細書に記載するシークエンシング方法のいくつかの実施形態において、リンクされたリード戦略を用いてもよい。リンクされたリード戦略は、少なくとも２つのシークエンシングリードをリンクするシークエンシングデータを同定することを含むことができる。例えば、第１のシークエンシングリードは第１のマーカーを含み、第２のシークエンシングリードは第２のマーカーを含んでもよい。第１及び第２のマーカーは、標的核酸の配列表記において隣接すると読み取られた各シークエンシングからのシークエンシングデータを同定することができる。本明細書に記載する組成物及び方法のいくつかの実施形態において、マーカーは、第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列を含むことができ、第１のバーコード配列は第２のバーコード配列と対になることができる。他の実施形態において、マーカーは、第１のホストタグ及び第２のホストタグを含むことができる。更なる実施形態において、マーカーは、第１のホストタグを有する第１のバーコード配列と、第２のホストタグを有する第２のバーコード配列とを含むことができる。
鋳型核酸をシークエンシングするための方法の例示的な実施形態は、以下の工程を含むことができる：（ａ）第１のプライマー部位にハイブリダイズするシークエンシングプライマーを用いて第１のバーコード配列をシークエンシングする工程；及び（ｂ）第２のプライマーにハイブリダイズするシークエンシングプライマーを用いて第２のバーコード配列をシークエンシングする工程。その結果、鋳型核酸をそのゲノム近傍に連結するのを助ける２つの配列のリード（読み取り）が行われる。十分に長いリードと十分に短いライブラリフラグメントがあれば、これらの２つのリードを情報科学的に統合してフラグメント全体をカバーする１つの長いリードを行うことができる。バーコード配列のリードと、挿入により存在する９ヌクレオチドの複製配列とを使用することにより、リードをそれらのゲノム近傍に連結して、はるかに長い「連結リード」をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで形成することができる。
理解されるように、鋳型核酸を含むライブラリーは、複製核酸フラグメントを含むことができる。複製核酸フラグメントのシークエンシングは、複製フラグメントのコンセンサス配列を作製することを含む方法において有利である。かかる方法は、鋳型核酸及び／又は鋳型核酸のライブラリーのコンセンサス配列を提供する精度を高めることができる。
本明細書に記載するシークエンシング技術のいくつかの実施形態において、配列分析はリアルタイムで実施される。例えば、リアルタイムシークエンシングは、シークエンシングデータを同時に取得し分析することにより実行することができる。いくつかの実施形態において、シークエンシングデータを得るためのシークエンシングプロセスは、標的核酸配列データの少なくとも一部が得られた後、又は核酸リード全体がシークエンシングされる前を含む様々な時点で終了することができる。例示的な方法、システム、及びさらなる実施形態は、国際特許出願公開第２０１０／０６２９１３号において提供されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連結リード戦略を用いて短いシークエンシングリードをアセンブルする方法の例示的な実施形態において、バーコードを含むトランスポゾン配列をゲノムＤＮＡに挿入し、ライブラリーを調製し、鋳型核酸のライブラリーについてシークエンシングデータを得る。ペアのバーコードを同定することによって鋳型のブロックをアセンブルすることができ、次いで、より大きな連続断片をアセンブルすることができます。１つの実施形態において、アセンブルされたリードは、重複するリードを使用してコードのペアリングにより、より大きな連続断片に更にアセンブルすることができる。
本明細書に記載するシークエンシング技術のいくつかの実施形態は、エラー検出及び訂正機能を含む。エラーの例としては、シークエンシング処理中のベースコールのエラー、フラグメントをより大きな連続断片にアセンブルする際のエラー等を挙げることができる。理解されるように、エラー検出は、データセット内のエラーの存在又は可能性を検出することを含むことができ、従って、エラーの位置又はエラーの数を検出することは必要とされない可能性がある。エラー訂正のために、データセット内のエラーの位置及び／又はエラーの数に関する情報が有用である。エラー訂正のための方法は、当該技術分野においてよく知られてる。例としては、ハミング距離の使用、及びチェックサムアルゴリズムの使用が挙げられる（例えば、開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／０３２３３４８号明細書、米国特許第７，５７４，３０５号明細書；及び米国特許第６，６５４，６９６号明細書を参照。）。
ネスト化ライブラリー
別の方法としては、上記の連結（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）タグ化法及びネスト化されたシークエンシングライブラリーの調製が挙げられる。ネスト化されたサブライブラリーは、コードタグ付きＤＮＡフラグメントから作製される。これにより、ゲノム全体にわたってより少ない頻度でトランスポゾンのタグ化を行うことが可能になる。また、（ネスト化された）シークエンシングリードの多様性を高めることができる。これらの要素は、カバレッジと正確さの改善につながる可能性がある。
サブサンプリング及び全ゲノム増幅は、出発分子の特定の集団の多くのコピーを作製することができる。次に、ＤＮＡフラグメントがトランスポゾン特異的フラグメント化により生成され、各フラグメントは、一致するコードを有する元の隣接物にフラグメントを連結し直すことを可能にするコードを受ける（同一、相補的、又は非形式的に連結されているか否かにかかわらず）。タグ化フラグメントは、、ランダムな方法、又は酵素消化、ランダム剪断、トランスポゾンに基づく剪断、若しくは他の方法等の配列特異的方法により、少なくとも２回目にフラグメント化され、それによりコードタグ化ＤＮＡフラグメントのサブライブラリーを作製する。前述の方法の有用な変形形態では、下流の富化目的のためにビオチン又は他の親和性官能性を含むトランスポゾンを使用することにより、コードタグ化フラグメントを優先的に単離することができる。その後のライブラリー調製では、ネストされたＤＮＡフラグメントをシークエンシング鋳型に変換する。ペアエンドシークエンシングにより、ＤＮＡフラグメント及び標的ＤＮＡのコード－タグの配列が決定される。同じコードタグのためのネスト化ライブラリーが作製されるため、長いＤＮＡフラグメントを、短いリードでシークエンシングすることができる。
シークエンシング方法
本明細書に記載の方法及び組成物は、様々なシークエンシング技術と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸のヌクレオチド配列を決定するためのプロセスは、自動プロセスとすることができる。
本明細書に記載するシークエンシング方法のいくつかの実施形態には、合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）技術、例えばパイロシークエンシング技術が含まれる。パイロシークエンシングは、特定のヌクレオチドが新生鎖に組み込まれる際の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（各々が、参照によりその全体が組み込まれる、Ｒｏｎａｇｈｉｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１）：８４－９（１９９６）；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１）：３－１１（２００１）；Ｒｏｎａｇｈｉｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５）：３６３（１９９８）；米国特許第６，２１０，８９１号明細書；米国特許第６，２５８，５６８号明細書、及び米国特許第６，２７４，３２０号明細書）。
ＳＢＳの別の例において、サイクルシークエンシングは、例えば、各々その全体が参照により組み込まれる、米国特許第７，４２７，６７号明細書、米国特許第７，４１４，１１６３号明細書、及び米国特許第７，０５７，０２６号明細書に記載されているように、例えば、切断可能な又は光脱色可能な色素ラベルを含む可逆ターミネーターヌクレオチドの段階的な付加により達成される。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社により商業化されているこのアプローチはまた、国際特許出願公開第９１／０６６７８号及び国際特許出願公開第０７／１２３７４４号に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。ターミネーションを逆転させ、蛍光ラベルを切断することができる蛍光ラベルターミネーターの利用可能性は、効率的なサイクリック可逆ターミネーション（ＣＲＴ）シークエンシングを容易にする。ポリメラーゼは、修飾されたこれらのヌクレオチドから効率的にくみ込まれ、伸長するように、併せて設計することもできる。
本明細書に記載する方法及び組成物で利用できる追加の例示的なＳＢＳシステム及び方法は、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１８８９０１号明細書、米国特許第７０５７０２６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２４０４３９号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２８１１０９号明細書、ＰＣＴ公開国際特許出願公開０５／０６５８１４号、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号明細書、ＰＣＴ公開国際特許出願公開０６／０６４１９９号、及びＰＣＴ公開国際特許出願公開０７／０１０２５１号に記載されており、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。
本明細書に記載するシークエンシング技術のいくつかの実施形態は、ライゲーション技術によるシークエンシングを利用することができる。かかる技術は、ＤＮＡリガーゼを利用してヌクレオチドを組み込み、かかるヌクレオチドの取り込みを同定する。本明細書に記載する組成物及び方法で利用できる例示的なＳＢＳシステム及び方法は、米国特許第６，９６９，４８８号明細書、米国特許第６，１７２，２１８号明細書、及び米国特許第６，３０６，５９７号明細書に記載されており、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。
本明細書中に記載するシークエンシング方法は、複数の異なる標的核酸が同時に操作されるように多重様式で有利に実施することができる。特定の実施形態において、異なる標的核酸は、共通の反応容器又は特定の基材の表面上で処理することができる。これにより、シークエンシング試薬の便利な送達、未反応試薬の除去、及び組み込み事象の検出が多重様式で可能になる。表面結合標的核酸を使用する実施形態において、標的核酸はアレイ形式であってもよい。アレイ形式では、標的核酸は、典型的には、空間的に区別可能な様式で表面に結合することができる。例えば、標的核酸は、直接共有結合、ビーズ又は他の粒子への結合、又はポリメラーゼ又は表面に結合した他の分子との関連により結合することができる。アレイは、各部位（１つのフィーチャーとも称す）において標的核酸の単一コピーを含むことができ、又は同じ配列を有する複数のコピーが各部位又はフィーチャーに存在することができる。本明細書において更に詳細に記載されるように、ブリッジ増幅又はエマルジョンＰＣＲ等の増幅方法により、複数のコピーを作製することができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、少なくとも約１０フィーチャー／ｃｍ２、１００フィーチャー／ｃｍ２、５００フィーチャー／ｃｍ２、１，０００フィーチャー／ｃｍ２、５，０００フィーチャー／ｃｍ２、１０，０００フィーチャー／ｃｍ２、５０，０００フィーチャー／ｃｍ２、１００，０００フィーチャー／ｃｍ２、１，０００，０００フィーチャー／ｃｍ２、５，０００，０００フィーチャー／ｃｍ２、１０７フィーチャー／ｃｍ２、５×１０７フィーチャー／ｃｍ２、１０８フィーチャー／ｃｍ２、５×１０８フィーチャー／ｃｍ２、１０９フィーチャー／ｃｍ２、５×１０９フィーチャー／ｃｍ２、又はそれ以上を含めた、任意の種々の密度でフィーチャーを有するアレイを使用することができる。
シークエンシングデータのエラー率を低減する方法
本明細書で提供する方法及び組成物のいくつかの実施形態は、シークエンシングデータにおけるエラー率を低減することを含む。いくつかのかかる実施形態において、二本鎖標的核酸のセンス及びアンチセンス鎖は、それぞれ異なるバーコードと関連する。各鎖は増幅され、配列情報は増幅された鎖の複数のコピーから得られ、標的核酸のコンセンサス配列表現が冗長配列情報から生成される。従って、配列情報は、各鎖から生じ、各鎖から同定することができる。従って、一方の鎖に由来する配列情報が他方の鎖由来の配列情報と矛盾する場合、配列エラーを同定し、低減することができる。
いくつかの実施形態において、標的核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、異なるバーコードと関連する。バーコードは、アダプターのライゲーション及びトランスポゾン配列の挿入を含む様々な方法により、標的核酸と関連付けてもよい。いくつかのかかる実施形態において、Ｙ－アダプターを、標的核酸の少なくとも１つの末端にライゲーションしてもよい。Ｙアダプターには、二本鎖配列及び非相補鎖を含むことができ、各鎖は異なるバーコードを含む。Ｙアダプターがライゲーションされた標的核酸は、各バーコードを元のセンス鎖又はアンチセンス鎖を同定するために使用することができるように、増幅及びシークエンシングすることができる。同様の方法が、Ｋｉｎｄｅ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１）ＰＮＡＳ １０８：９５３０－９５３５に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、標的核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、本明細書で提供するトランスポゾン配列を挿入することにより、異なるバーコードと関連する。いくつかのかかる実施形態において、トランスポゾン配列は、非相補的なバーコードを含むことができる。
かかる方法のいくつかの実施形態は、（ａ）間に二本鎖標的核酸の少なくとも一部が配置された第１のシークエンシングアダプター及び第２のシークエンシングアダプターを含む鋳型核酸から配列データを得る工程を含む、標的二本鎖核酸の鎖から配列情報を得る工程を含むものであって、（ｉ）第１のシークエンシングアダプターは、二本鎖の第１のバーコード、一本鎖の第１のプライマー部位、及び一本鎖の第２のプライマー部位を含み、ここで、第１及び第２のプライマー部位は非相補的であり、（ｉｉ）二本鎖の第２のバーコード、一本鎖の第３のプライマー部位、及び一本鎖の第４のプライマー部位を含み、ここで、第３のプライマー部位及び第４のプライマー部位は非相補的である。いくつかの実施形態において、鋳型核酸のセンス鎖の第１のプライマー部位及び鋳型核酸のアンチセンスセンス鎖の第３のプライマー部位は、同じ配列を含む。いくつかの実施形態において、各バーコードは異なる。いくつかの態様において、第１のシークエンシングアダプターは、第１のプライマー部位及び第２のプライマー部位をカップリングする一本鎖ヘアピンを含む。
別の実施形態では、標的核酸の各末端は、核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖由来の伸長産物が互いに区別できるように、異なるバーコードを含むアダプターと会合する。いくつかの実施形態において、プライマー部位配列及びバーコードは、センス鎖にアニーリングされたプライマーからの伸長が、アンチセンス鎖にアニーリングされたプライマーからの伸長産物と区別可能な産物を産出するように選択される。１つの例において、３’センスプライマー部位は、３’アンチセンスプライマー部位と同じであるが、５’センス及び５’アンチセンスプライマー部位のいずれとも異なる。３’センスプライマー部位及び３’アンチセンスプライマー部位にアニールされたプライマーの伸長は、各鎖から以下の産物を生じるであろう：
センス鎖：（５’）バーコード２－［標的配列］－バーコード１（３’）
アンチセンス鎖：（５’）バーコード１－［標的配列］－バーコード２（３’）
従って、核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖からの伸長産物を互いに区別することができる。例示的な方法が、Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｍ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１２）１０９：１４５０８－１３に例示されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかのかかる方法では、アダプターのライゲーション及びトランスポゾン配列の挿入を含む様々な方法により、バーコード及びプライマー部位を標的核酸と関連付けてもよい。いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、アダプターにヘアピンを提供するように設計することができる。ヘアピンは、標的核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖の物理的連続性を維持する能力を提供する。本明細書に記載のリンカーを含むトランスポゾン配列を用いてヘアピンを含む鋳型核酸を調製することができる。リンカーの例としては、一本鎖核酸を挙げられる。
二本鎖標的核酸の各鎖から配列情報を得るための鋳型核酸のライブラリーを調製するいくつかの実施形態は、（ａ）トランスポザーゼ、及び（ｉ）第１のトランスポザーゼ認識部位、第１のプライマー部位、及び第１のバーコードを含む第１のトランスポゾン配列、及び（ｉｉ）第２のトランスポザーゼ認識部位、第２のプライマー部位、及び第２のバーコードを含む第２のトランスポゾン配列を含むトランスポソーム群であって、第１のトランスポゾン配列が第２のトランスポゾン配列とは非連続であるトランスポソーム群を提供する工程；（ｂ）前記第１及び第２のトランスポゾン配列が前記二本鎖標的核酸に挿入されるような条件下で、前記トランスポソームを二本鎖核酸と接触させ、それにより二本鎖標的核酸の各鎖からの配列情報を得るための鋳型核酸のライブラリーを調製する工程を含む。いくつかの実施形態において、トランスポソーム群は、トランスポザーゼと、間にバーコード配列が配置された第３のトランスポザーゼ認識部位及び第４のトランスポザーゼ認識部位を含むトランスポゾン配列を含むトランスポソームを更に含み、前記バーコード配列は、間にシークエンシングアダプターが配置された第３のバーコード及び第４のバーコードを含み、前記シークエンシングアダプターは、間にリンカーを配置した第３のプライマー部位及び第４のプライマー部位を含む。いくつかの実施形態において、鋳型核酸のセンス鎖の第１のプライマー部位及び鋳型核酸のアンチセンスセンス鎖の第３のプライマー部位は、同じ配列を含む。いくつかの実施形態はまた、（ｃ）第１のトランスポゾン配列が、第２のトランスポゾン配列及びリンカーを含むトランスポゾン配列と非連続である、トランスポゾン配列を含む鋳型核酸のために選択する工程を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、捕捉プローブと結合するように適合された親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、親和性タグは、Ｈｉｓ、ビオチン、及びストレプトアビジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、各バーコードは異なる。いくつかの実施形態において、リンカーは一本鎖核酸を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸はゲノムＤＮＡを含む。
ハプロタイプ情報の取得方法
本明細書で提供する方法及び組成物のいくつかの実施形態は、標的核酸からハプロタイプ情報を取得する方法を含む。ハプロタイプ情報は、ゲノム等の標的核酸の特定の遺伝子座における異なる配列の有無を決定することを含むことができる。例えば、配列情報を、対立遺伝子の母性コピー及び父性コピーのために得ることができる。倍数体生物において、配列情報を、少なくとも１つのハプロタイプのために得ることができる。かかる方法はまた、標的核酸からの配列情報の取得におけるエラー率の低減に有用である。
一般に、ハプロタイプ情報を得る方法は、各区画が、核酸のおよそのハプロタイプ量に相当する量の核酸を含むように、又は、核酸のおよそのハプロタイプ量より少ない量に相当するように、核酸を１つ又は複数の区画に分配する工程を含む。次いで、配列情報を各区画から得ることができ、それにより、ハプロタイプ情報を得ることができる。鋳型核酸を複数の容器に分配することは、単一の容器が対立遺伝子又はＳＮＰの単一のコピーを含む確率、又は単一の容器から得られたコンセンサス配列情報が対立遺伝子又はＳＮＰの配列情報を反映する確率を増加させる。理解されるように、いくつかのかかる実施形態において、鋳型核酸を複数の容器に区画化する前に、鋳型核酸を希釈してもよい。例えば、各容器は、標的核酸の約１ハプロタイプ当量に等しい量の標的核酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、容器は、約１ハプロタイプ当量未満の標的核酸を含むことができる。
ハプロタイプ情報を決定する方法、仮想区画を用いてハプロタイプ化する方法、ハプロタイプ化のために標的核酸を調製する方法は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１４／１４２８５０号に記載されている。
実施例１－テンプレートの連続性の維持
この例は、ＣＥ内の鋳型核酸の連続性情報を維持するための方法を例示する。鋳型核酸は、Ｔｎ５トランスポザーゼが転位後の鋳型ＤＮＡに結合したままである非連続的なトランスポゾン配列を含むトランスポソームを用いて調製する。標的核酸は、Ｔｎ５トランスポザーゼ及び非連続トランスポゾン配列を含むトランスポソームと接触する。ＳＤＳで更に処理された試料は、鋳型核酸の種々のフラグメントのスメアとして現れる可能性があり、ＳＤＳで処理されていない試料は、推定上の高分子量鋳型核酸の保持を示すことができる。従って、核酸がフラグメント化されていても、隣接する配列は、依然としてトランスポザーゼにより互いに関連している可能性がある。
更に別の例示的な方法において、鋳型核酸のライブラリーは、ヒト染色体を含む標的核酸とともに非連続的なトランスポゾン配列を含むトランスポソームを用いて調製する。ＣＥは、標的核酸を含む。ＤＮＡのハプロタイプブロックアップは、トランスポザーゼがＳＤＳ後希釈により除去された試料について観察することができる。従って、本明細書に記載の方法を実施することにより、標的核酸は、転位、希釈、及びシークエンシングライブラリーへの形質転換の際に標的の完全性を維持することができる。
本明細書で用いる場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「により特徴づけられる」と同義語であり、包括的又は制限なしであり、追加の列挙されていない要素又は方法ステップを排除しない。
本明細書中で使用される成分の量、反応条件等を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。従って、反対に示されない限り、本明細書に記載される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化する可能性がある近似値である。少なくとも、本出願に優先権を主張する任意の出願の請求項の範囲に対する均等論の適用を制限しようとするものとしてではなく、各数値パラメータは、有効数字の桁数及び通常の丸めアプローチを考慮して解釈されるべきである。
上記の記載は、本発明のいくつかの方法及び材料を開示する。本発明は、方法及び材料の改変、ならびに製造方法及び装置の変更を受け入れる余地がある。かかる改変は、本明細書に開示された本発明の開示又は実施の考察から当業者に明らかになるであろう。従って、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲及び精神の範囲内に入るすべての改変及び代替を包含することを意図している。
公開及び未公開の出願、特許、及び参考文献を含むがこれらに限定されない、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、ここに本明細書の一部とする。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限り、本明細書は、任意のかかる矛盾する資料に取って代わる及び／又は優先されることを意図する。
実施例２－単一細胞の全トランスクリプトームシークエンシング
この例は、ｃＤＮＡの全長にわたり均一にバーコードし、バーコードを用いてｃＤＮＡの連続性情報を決定し、細胞供給源を同定する、即ち、ｍＲＮＡに関連する単一細胞を同定する方法について記載する。
この例では、単一細胞のトランスクリプトームをシークエンシングするための方法を説明する。この実施例では、液滴マイクロ流体を用いて、個々の捕捉ビーズ上の複数の単一細胞のトランスクリプトームを捕捉し、次いで、連続性維持転位及び組み合わせインデックス化（ＣＰＴシークエンシング：ＣＰＴ－ｓｅｑ）を使用して、各単一細胞のトランスクリプトームに由来するｃＤＮＡをバーコード化する。１つの実施形態において、本発明の方法は、第１のバーコードがタグメント化反応において付加され、第２のバーコードがＰＣＲ増幅反応において付加される、単一細胞ｃＤＮＡをインデックス化する多重バーコード化プロセスを用いる。
１つの例では、ポリＡ＋ＲＮＡが単一細胞から捕捉され、捕捉されたポリＡ＋ＲＮＡは、多重シークエンシングライブラリーの生成のためにバルクで処理される。
この方法は、以下の工程を含むことができる。工程１では、単一細胞からのＲＮＡを捕捉ビーズ上に捕捉する。例えば、複数の単一細胞（例えば、約１０００個の単一細胞）が、溶解緩衝液及び捕獲ビーズを含む個々の液滴（即ち、平均して、１つの細胞及び１つの液滴につき１つのビーズ）に封入される。捕捉ビーズの表面には、ポリｄＴ捕捉配列及びＰＣＲプライマー配列を含む複数の捕捉プローブが固定化されている。液滴の溶解緩衝液組成物は、単一細胞の細胞質膜を解離して細胞質ＲＮＡを放出する。放出されたポリ－Ａ＋ＲＮＡは、ＲＮＡ上のポリＡ＋配列と、同時封入捕捉ビーズの表面上に固定されたオリゴ－ｄＴ捕捉配列とのハイブリダイゼーションにより捕捉される。各捕捉ビーズは、今や単一細胞のトランスクリプトームからのポリＡ＋ＲＮＡを含む。単一細胞からの全てのポリＡ＋ＲＮＡは、捕捉ビーズ上に互いに近接して保持される。
工程２では、その上に単一細胞ポリＡ＋ＲＮＡを有する捕捉ビーズを複数の液滴（例えば、約１０００個の捕捉ビーズ）からプールし、二本鎖ｃＤＮＡを合成する。例えば、捕捉ビーズをプールし、洗浄し、第一鎖ｃＤＮＡを、鎖スイッチングが可能なＲＮＡ Ｈ－逆転写酵素を用いて合成する。第一鎖ｃＤＮＡの合成の間に鎖スイッチプライマーが含まれ、ｃＤＮＡの３’末端にユニバーサルプライマー部位を配置することができる。次いで、ＰＣＲ反応（例えば、１～２サイクルのＰＣＲ）においてユニバーサルプライマー及び高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いて、二本鎖ｃＤＮＡを調製する。各捕捉ビーズは、今や単一細胞からのポリＡ＋ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを含む。
工程３では、その上に二本鎖ｃＤＮＡを有する捕捉ビーズを９６ウェルプレートのウェルに分配し、ウェルあたり約１０個の捕捉ビーズが存在するようにする。
工程４では、９６個の固有にインデックス化されたトランスポソームを用いて各ウェル中の二本鎖ｃＤＮＡをタグメント化する。タグメント化を用いてアダプター及びインデックス配列でｃＤＮＡを修飾する一方、単一細胞の連続性を維持する。タグメント化反応に使用される９６個の固有にインデックス化されたトランスポトーム複合体のアセンブリを、以下により詳細に記載する。タグメント化反応は、２つの部分からなるバーコードの第１の部分をそれぞれの将来のｃＤＮＡフラグメントに加える。各捕捉ビーズは、今や単一細胞からのタグメント化されたｃＤＮＡを含む。
工程５では、ウェル当たり約１０個の捕獲ビーズが存在するように、全てのウェルの捕獲ビーズを収集し、プールし、洗浄し、別の９６ウェルプレートのウェルに再分配する。個々の細胞からのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡは、個々のビーズの表面上にとどまり、トランスポザーゼは、フラグメント化したｃＤＮＡに結合したままであり、フラグメントが解離しないようにする。
工程６では、トランスポザーゼ及びタグメント化ｃＤＮＡが捕捉ビーズから放出される。例えば、ＳＤＳ（１％ＳＤＳ）溶液のアリコートを各ウェルに添加して、捕捉ビーズから結合したトランスポザーゼ及びタグメント化ｃＤＮＡを放出させる。
工程７では、各ウェル中のタグメント化ｃＤＮＡを、Ｐ５又はＰ７配列及び固有のバーコード配列を含むＰＣＲプライマーを用いて増幅する。例えば、バーコード化されたＰ５及びＰ７ＰＣＲプライマーの９６個の固有の組み合わせのうちの１つを各ウェルに添加し、タグメント化ｃＤＮＡフラグメントを増幅する。ＰＣＲ反応により、２つの部分からなるバーコードの残りの部分を各ｃＤＮＡフラグメントに付加する。各ｃＤＮＡフラグメントは、今や４つのバーコード配列、即ち、タグメント化反応で加えられた２つの配列及びＰＣＲ増幅中に加えられた２つの配列を含む。従って、個々の細胞からのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡは、タグメント化インデックスと、増幅工程を介して加えられたＰＣＲインデックスとの組み合わせにより同定される。
工程８では、各ウェルからのバーコード化ｃＤＮＡフラグメントをプールし、シークエンシングする。
この例では、９６×９６の組み合わせインデックス化を使用して、２つの細胞が同じバーコードを有する確率約５％で約１０００個の単一細胞をバーコード化する。スループットは、「区画」の数を増やすことにより容易にスケールアップできる。例えば、３８４×３８４の組み合わせバーコード化（約１４７，４５６個の仮想区画）を使用することによって、約１０，０００個の単一細胞を、２つの細胞が同じバーコードを有する確率約３％で、同時に個別にバーコード化することができる。
この例はまた、組み合わせバーコード化プロトコルにおいて２つの部分からなるバーコードの第１の部分を付加するための、９６個の固有のバーコード化トランスポゾーム複合体をアセンブルするプロセスを記載する。このプロセスには、これらに限定されるものではないが、以下の工程が含まれる。
工程Ａでは、ユニバーサル５’リン酸化ＭＥ相補オリゴヌクレオチド（ｐＭＥＮＴＳ）に、それぞれ３’末端にＴｎ５モザイク末端（Ｍｏｓａｉｃ Ｅｎｄ：ＭＥ）配列を含む個々のインデックス化オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、２０個の固有にインデックス化されたトランスポゾンを形成する。例えば、Ｐ５配列、固有の８塩基「ｉ５」インデックス配列、ユニバーサルコネクタ配列であるユニバーサルコネクタＡ－Ｃ１５：及びＭＥ配列を含むインデックス化されたオリゴヌクレオチド１１１０は、ＭＥ相補的配列１１１５にアニーリングされる。ＭＥ相補配列１１１５は、インデックス化オリゴヌクレオチド１１１０のＭＥ配列に相補的なユニバーサル５’リン酸化オリゴヌクレオチド（ｐＭＥＮＴＳ）である。ユニバーサルコネクタ配列Ａ－Ｃ１５は、後に使用して、カスタムインデックス２シークエンシングプライマーをアニールする。
アニーリング反応の第２のセット（即ち、１２個の個々のアニーリング反応）を実施して、それぞれＰ７配列に隣接する固有の８塩基の「ｉ７」インデックス配列を含む１２のトランスポゾンの第２のセットを形成する。例えば、Ｐ７配列、固有の８塩基ｉ７インデックス配列、ユニバーサルコネクタ配列Ｂ－Ｄ１５、及びＭＥ配列を含む、インデックス化オリゴヌクレオチド１１２０は、ＭＥ相補的配列１１１５にアニーリングされる。ユニバーサルコネクタ配列Ｂ－Ｄ１５は、後に使用して、カスタムインデックス１シークエンシングプライマーをアニールする。
工程Ｂでは、アニーリングされたＰ５＿ｉ５トランスポゾン１１２５（即ち、各々が固有の８塩基ｉ５インデックス配列を有する８つのＰ５＿ｉ５トランスポゾン１１２５）及びアニーリングされたＰ７＿ｉ７トランスポゾン１１３０（即ち、各々が固有の８塩基ｉ７インデックス配列を有する１２個のトランスポゾン１１３０）は、Ｔｎ５トランスポザーゼとの個々の反応においてアセンブルして、トランスポソーム複合体を形成する。例えば、各アニールされたＰ５＿ｉ５トランスポゾン１１２５をＴ５トランスポザーゼ１１３５とともに約３７℃で約１時間インキュベートして、Ｐ５＿ｉ５トランスポソーム複合体１１４０を形成する。同様に、各アニールされたＰ７＿ｉ７トランスポゾン１１３０をＴｎ５トランスポザーゼ１１３５とともに約３７℃で約１時間インキュベートして、Ｐ７＿ｉ７トランスポソーム複合体１１４５を形成する。
工程Ｃでは、Ｐ５＿ｉ５トランスポソーム複合体１１４０のアリコートをＰ７＿ｉ７トランスポソーム複合体１１４５のアリコートと組み合わせることにより、９６個の固有のトランスポソーム複合体を作製する。例えば、Ｐ５＿ｉ５トランスポソーム複合体１１４０を９６ウェルプレートのＡ～Ｈ行に等分し、Ｐ７＿ｉ７トランスポソーム複合体１１４５を同じ９６ウェルプレートの１～１２列に等分する。８個のＰ５＿ｉ５トランスポソーム複合体１１４０と１２個のＰ７＿ｉ７トランスポソーム複合体１１４５との組み合わせは、９６個の異なるインデックスの組み合わせを作り出す。
アセンブルしたトランスポソーム複合体を評価するために、単一のタグメント化反応及び単一のＰＣＲ反応を用いて１０個の単一細胞からのシークエンシングライブラリーを調製した。１０個の単一細胞由来のｃＤＮＡを含む１０個の捕捉ビーズをプールし、Ｐ５＿ｉ５＿ｌ＋Ｐ７＿ｉ７＿ｌトランスポソーム混合物を用いてタグメント化した。次いで、タグメント化されたｃＤＮＡを捕獲ビーズから放出させ、シークエンシングライブラリーを生成するためにバーコード化Ｐ５及びＰ７プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。次いで、シークエンシングライブラリー中のフラグメントサイズ分布を、バイオアナライザーを用いて分析した。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ後にクリーンアップが行われる。いくつかの実施形態において、第２のＳＰＲＩのクリーンアップは、第１のＳＰＲＩのクリーンアップの後に行われる。いくつかの実施形態において、バイオアナライザーで分析する前に試料を１０倍希釈する。
別の例では、２つの異なるトランスポソーム複合体混合物を使用して、１００個の単一細胞からシークエンシングライブラリーを調製した。この例では、トランスポソーム複合体を評価するために分割及びプールプロトコルを使用した。１００個の単一細胞からのｃＤＮＡを含む１００個の捕捉ビーズを、２回のタグメント化反応に分け、１回のタグメント化反応をＰ５＿ｉ５＿２＋Ｐ７～ｉ７＿２トランスポソーム混合物を用いて行い、第２のタグメント化反応をＰ５＿ｉ５＿３＋Ｐ７～ｉ７＿３トランスポソーム混合物を用いて行った。タグメント化反応の後、各反応からの捕捉ビーズを、バーコード化Ｐ５及びＰ７ ＰＣＲプライマーの２つの固有の組み合わせ（即ち、Ｐ５及びＰ７ ＰＣＲプライマーの第１の組み合せ及びＰ５及びＰ７ ＰＣＲプライマーの第２の組み合せ）を用いたＰＣＲ増幅のためにプール及び再分配し、２つのシークエンシングライブラリーを作製した。次いで、各シークエンシングライブラリーにおけるフラグメントサイズ分布を、バイオアナライザーを用いて分析した。バーコード化されたライブラリーは、単一の０．７×ＳＰＲＩクリーンアップ工程後に分析した。

Claims (56)

  1. 複数の単一細胞の少なくとも２つ以上の異なるタイプの被検物質を分析する方法であって、
    （ａ）複数の連続性維持エレメント（ＣＥ）を提供する工程であって、各ＣＥが単一細胞を含む工程と、
    （ｂ）前記ＣＥ内で前記単一細胞を溶解する工程であって、前記単一細胞内の被検物質は前記ＣＥ内に放出される工程と、
    （ｃ）各ＣＥ内の前記単一細胞の第１の被検物質に第１のレポーター部分を提供する工程と、
    （ｄ）各ＣＥ内の前記単一細胞の第２の被検物質に第２のレポーター部分を提供する工程と、
    （ｅ）前記ＣＥの前記第１及び第２の被検物質の少なくともいくつかが、それぞれ前記第１及び第２のレポーター部分を含むように前記被検物質を修飾する工程であって、前記修飾はタグメント化、伸長、増幅、又はライゲーションを含む工程と、
    （ｆ）前記レポーター部分を含む前記被検物質を含む前記ＣＥを組み合わせる工程と、
    （ｇ）前記第１及び第２のレポーター部分を含む前記第１及び第２の被検物質を含む前記ＣＥをそれぞれ複数の区画に区分する工程と、
    （ｈ）各ＣＥの前記第１のレポーター部分を含む前記第１の被検物質に第３のレポーター部分を提供する工程と、
    （ｉ）各ＣＥの前記第２のレポーター部分を含む前記第２の被検物質に第４のレポーター部分を提供する工程と、
    （ｊ）前記第１の被検物質の少なくともいくつかが、前記第１及び第３のレポーター部分を含み、前記第２の被検物質の少なくともいくつかが、前記第２及び第４のレポーター部分を含むように前記被検物質を更に修飾する工程であって、前記更なる修飾はタグメント化、伸長、増幅、又はライゲーションを含む工程と、
    （ｋ）各区画の前記レポーター部分を含む前記被検物質を分析する工程であって、各被検物質の同一性を検出し、前記レポーター部分が単一細胞からの各被検物質の起源を同定する工程と
    を含む、方法。
  2. 前記被検物質の分析が同時に行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の被検物質がゲノムＤＮＡであり、前記第２の被検物質がｃＤＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記第１及び第２のレポーター部分を含むように前記ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの少なくともいくつかを修飾する工程が、前記ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを、各々がトランスポザーゼと前記第１のレポーター部分又は第２のレポーター部分を含むトランスポゾン配列とを含む複数のトランスポソームに、少なくともいくつかのトランスポゾン配列が前記ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡに挿入されるような条件下で接触させることを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 工程（ｇ）が、前記ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡからトランスポザーゼを除去することを更に含む、請求項４に記載の方法。
  6. 工程（ｅ）における前記被検物質の修飾の後で、前記トランスポザーゼが除去される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記トランスポザーゼの除去が、試薬の添加、温度の変更、ｐＨの変更、プロテアーゼの添加、シャペロンの添加、塩濃度の変更、及び鎖置換ポリメラーゼの添加からなる群から選択される方法を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 工程（ｅ）が、前記ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを複数のトランスポソームに接触させることを含み、各トランスポゾンは、第１のレポーター部分を含む第１のトランスポゾン配列と、前記第１のトランスポゾン配列と隣接していない第２のトランスポゾン配列と、前記第１のトランスポゾン配列及び前記第２のトランスポゾン配列に関連するトランスポザーゼとを含む、請求項４に記載の方法。
  9. 前記第１のトランスポゾン配列が第１のプライマー部位を含み、前記第２のトランスポゾン配列が第２のプライマー部位を含む、請求項４～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記第１のプライマー部位が第１のバーコードを更に含み、前記第２のプライマー部位が第２のバーコードを更に含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記第１、第２、第３、又は第４のレポーター部分が、バーコードを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. １つの被検物質がタンパク質であり、任意選択的に、前記タンパク質が核酸レポーター部分でラベルされていてもよく、更に任意選択的に、前記核酸レポーター部分が、組み合わせ的に得られるバーコードのセットを含む、請求項１に記載の方法。
  13. 工程（ｃ）～（ｊ）が、少なくとももう１回繰り返される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 追加の各工程において、追加のレポーター部分が、前記第１、第２、第３、及び第４のレポーター部分とは異なる、請求項１３に記載の方法。
  15. 被検物質を分析する方法であって、
    （ａ）連続性維持エレメント（ＣＥ）を提供する工程であって、各ＣＥが少なくとも１つの被検物質を含み、各ＣＥの前記少なくとも１つの被検物質が単一細胞の構成成分であり、前記ＣＥが、独立してプール及び分割することができる三次元構造を含む工程と、
    （ｂ）前記少なくとも１つの被検物質を含む前記ＣＥを複数の第１の区画に区分する工程と、
    （ｃ）前記複数の第１の区画の各区画に、該各区画中の各ＣＥの被検物質のための第１のレポーター部分を提供する工程であって、前記第１のレポーター部分が前記ＣＥを同定し、各区画の前記被検物質に提供された前記第１のレポーター部分は、その他の各区画の前記被検物質に提供された前記第１のレポーター部分とは異なり、各区画に存在する前記ＣＥに固有であり、前記第１のレポーター部分が各区画の前記ＣＥを同定する工程と、
    （ｄ）前記被検物質を、前記ＣＥの少なくともいくつかの前記被検物質が第１のレポーター部分を含むように修飾し、前記修飾はタグメント化、伸長、増幅、又はライゲーションを含む工程と、
    （ｅ）前記第１のレポーター部分を含む前記被検物質を含む前記ＣＥを組み合わせる工程と、
    （ｆ）前記第１のレポーター部分を含む前記被検物質を含む前記ＣＥを複数の第２の区画に区分する工程と、
    （ｇ）前記複数の第２の区画の各区画に、各ＣＥの前記第１のレポーター部分を含む前記被検物質のための第２のレポーター部分を提供する工程であって、各区画の前記被検物質に提供された前記第２のレポーター部分は、その他の各区画の前記被検物質に提供された前記第２のレポーター部分とは異なり、各区画に存在する前記ＣＥに固有であり、前記第２のレポーター部分が各区画の前記ＣＥを同定する工程と、
    （ｈ）前記被検物質を、前記被検物質の少なくともいくつかが、前記第１のレポーター部分及び前記第２のレポーター部分を含むように更に修飾する工程であって、前記更なる修飾はタグメント化、伸長、増幅、又はライゲーションを含む工程と、
    （ｉ）前記第１及び第２のレポーター部分を含む前記被検物質を分析する工程であって、各被検物質の同一性を検出し、前記レポーター部分が単一細胞からの各被検物質の起源を同定する工程と
    を含む、方法。
  16. 前記被検物質が核酸を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記核酸がＤＮＡを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記核酸がｃＤＮＡを含む、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記被検物質が、組織切片、細胞小器官、脂質、炭水化物、及び細胞代謝物からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  21. 工程（ｄ）が、前記ＤＮＡを、各々がトランスポザーゼと第１のレポーター部分を含むトランスポゾン配列とを含む複数のトランスポソームに、少なくともいくつかのトランスポゾン配列が前記ＤＮＡに挿入されるような条件下で接触させることを含む、請求項１７に記載の方法。
  22. 工程（ｄ）が、前記ＤＮＡを複数のトランスポソームに接触させることを含み、各トランスポゾンは、第１のレポーター部分を含む第１のトランスポゾン配列と、前記第１のトランスポゾン配列と隣接していない第２のトランスポゾン配列と、前記第１のトランスポゾン配列及び前記第２のトランスポゾン配列に関連するトランスポザーゼとを含む、請求項１７に記載の方法。
  23. 工程（ｆ）が、区分された第１のインデックス付き鋳型核酸からトランスポザーゼを除去することを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. 工程（ｄ）の後で、前記トランスポザーゼが除去される、請求項２３に記載の方法。
  25. 工程（ｉ）の前に、前記トランスポザーゼが除去される、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記トランスポザーゼの除去が、試薬の添加、温度の変更、ｐＨの変更、プロテアーゼの添加、シャペロンの添加、塩濃度の変更、及び鎖置換ポリメラーゼの添加からなる群から選択される方法を含む、請求項２３に記載の方法。
  27. 前記第１のトランスポゾン配列が第１のプライマー部位を含み、前記第２のトランスポゾン配列が第２のプライマー部位を含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記第１のプライマー部位が第１のバーコードを更に含み、前記第２のプライマー部位が第２のバーコードを更に含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記第１のレポーター部分がプライマーを含み、工程（ｄ）が、前記核酸を少なくとも１つのプライマーで増幅することを含む、請求項１６に記載の方法。
  30. 前記第１のレポーター部分がプライマーを含み、工程（ｄ）が、前記核酸を少なくとも１つのプライマーでライゲートすることを含む、請求項１６に記載の方法。
  31. 工程（ｃ）において、前記ＣＥにプラスミドを提供することを更に含み、工程（ｄ）～（ｈ）において、前記プラスミドが前記第１及び／又は第２のレポーター部分を含むように修飾される、請求項１５～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記被検物質がタンパク質である、請求項１５に記載の方法。
  33. 工程（ｃ）～（ｈ）が少なくとももう１回繰り返される、請求項１５～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 追加の各工程において、追加のセットのレポーター部分が、前記第１及び第２のレポーター部分とは異なる、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記被検物質がｃＤＮＡである、請求項１５に記載の方法。
  36. 前記ｃＤＮＡが単一細胞に由来する、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ＣＥが、前記ｃＤＮＡを固定することが可能な固体支持体を含む、請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. 前記固体支持体が、前記固体支持体上に固定されたオリゴ（ｄＴ）プローブを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記第１のセットのレポーター部分が第１のバーコード配列を含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記第２のセットのレポーター部分が第２のバーコード配列を含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 工程（ｄ）が、核酸を、各々がトランスポザーゼ、及び第１のレポーター部分を含むトランスポゾン配列を含む複数のトランスポソームに、少なくともいくつかのトランスポゾン配列が標的核酸に挿入されるような条件下で接触させることを含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
  42. 工程（ｄ）が、標的核酸を複数のトランスポソームに接触させることを含み、各トランスポゾンは、第１のレポーター部分を含む第１のトランスポゾン配列と、前記第１のトランスポゾン配列と隣接していない第２のトランスポゾン配列と、前記第１のトランスポゾン配列及び前記第２のトランスポゾン配列に関連するトランスポザーゼとを含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
  43. 工程（ｆ）が、区分された第１のインデックス付き鋳型核酸からトランスポザーゼを除去することを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
  44. 工程（ｄ）の後で、前記トランスポザーゼが除去される、請求項４３に記載の方法。
  45. 工程（ｉ）の前に、前記トランスポザーゼが除去される、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記トランスポザーゼの除去が、試薬の添加、温度の変更、ｐＨの変更、プロテアーゼの添加、シャペロンの添加、塩濃度の変更、及び鎖置換ポリメラーゼの添加からなる群から選択される方法を含む、請求項４３に記載の方法。
  47. 工程（ｄ）～（ｉ）が、少なくとももう１回繰り返される、請求項３５～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 追加の各工程において、追加のセットのレポーター部分が、前記第１及び第２のセットのレポーター部分とは異なる、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記単一細胞が疾患と関連している、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記単一細胞が癌と関連している、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記単一細胞が遺伝性疾患と関連している、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記第１、第２、第３、又は第４のレポーター部分がプライマー結合部位を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記第１、第２、又はその両方の被検物質が核酸である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  54. レポーター部分を含む前記核酸が分析前に増幅される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記核酸の分析が、シークエンシングにより行われる、請求項５３又は５４に記載の方法。
  56. 前記ＣＥが、単一細胞をカプセル化したものである、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
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