BR112017017025B1

BR112017017025B1 - Métodos e composições para analizar componentes celulares

Info

Publication number: BR112017017025B1
Application number: BR112017017025-6A
Authority: BR
Inventors: Kevin L. Gunderson; Frank J. Steemers; Jeffrey S. Fisher; Roberto Rigatti
Original assignee: Illumina, Inc
Priority date: 2015-02-10
Filing date: 2016-02-10
Publication date: 2024-01-02
Also published as: EP3256604B1; RU2020110764A; CN107406890A; KR20200020997A; RU2761432C2; RU2017127628A3; CN117106871A; US11634707B2; EP3725893A1; DK3256604T3; US20230374493A1; CA2975739A1; KR20210135626A; ES2786652T3; EP3256604A2; AU2016219328A1; SG11201706504RA; AU2016219328B2; JP7001475B2; CA3174951A1

Abstract

métodos e composições para analizar componentes celulares. as concretizações da presente invenção se referem à análise de componentes de uma célula. em algumas concretizações, a presente invenção se refere à análise de componentes de uma única célula. em algumas concretizações, os métodos e composições relacionam-se com o sequenciamento de ácidos nucleicos. em algumas concretizações, os métodos e composições relacionam-se com a identificação e / ou quantificação de ácido nucleico, proteínas, organelas e / ou metabólitos celulares.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Concretizações do presente pedido referem-se a métodos e composições para análise de componentes celulares. Em algumas concretizações, o presente pedido de patente refere-se a métodos e composições para a análise de componentes de uma única célula. Em algumas concretizações, o presente pedido de patente refere-se a métodos e composições para a identificação de um único tipo de célula. Em algumas concretizações, os métodos e composições referem-se a sequenciamento de ácidos nucleicos. Algumas concretizações dos métodos e composições proporcionados são úteis na determinação de um estado composto, de tal única célula.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A detecção de sequências específicas de ácido nucleico presentes em uma amostra biológica tem sido utilizada, por exemplo, como um método para identificação e classificação de microrganismos, diagnóstico de doenças infecciosas, detecção e caracterização de anormalidades genéticas, identificação de alterações genéticas associadas com câncer, estudo da susceptibilidade genética à doença e medio da resposta a vários tipos de tratamento. Uma técnica comum para a detecção de sequências de ácidos nucleicos específicas em uma amostra biológica é sequenciamento de ácido nucleico.

[003] A metodologia de sequenciamento de ácido nucleico evoluiu significativamente dos métodos de degradação química utilizados por Gilbert de Maxam e os métodos de alongamento de cadeia usados por Sanger. Hoje várias metodologias de sequenciamento estão em uso que permitem o processamento paralelo de ácidos nucleicos tudo num único sequenciamento de execução. Como tal, a informação gerada a partir de uma única corrida de sequenciamento pode ser enorme.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[004] A Fig. 1 representa uma vista esquemática de um de quatro níveis de indexação combinatória elemento de preservação de de contiguidade de DNA (EC) criado por incorporação de conteúdo de célula única em uma matriz de polímero ou anexado a um grânulo. Os índices específicos de compartimento estão ligados em cada agrupamento de redistribuição e etapa combinatória (camadas). No exemplo mostrado, os quatro níveis resultarão em quatro índices ser contatados em conjunto (por meio de ciclos repetidos de ligação, extensão com polimerase, marcação, etc.) permitindo uma fácil leitura de sequenciamento. Alternativamente, o DNA que compreende elemento de preservação de contiguidade pode ser criado por uma partição DNA compartimentado (ou seja, uma diluição de subamostragem de DNA da amostra original de DNA) que foi encapsulada em uma matriz ou imobilizada sobre um grânulo. Este tipo de diluição é útil em aplicações de faseamento e de montagem.

[005] A Fig. 2 ilustra um método de preparação de DNA de uma única célula ou bibliotecas de DNAc, utilizando um esquema de dois níveis de indexação combinatória, em que o primeiro nível de índices está ligado através de marcação (índices específicos do compartimento em transposons) e a segunda camada de índices estão ligados por PCR (índices de compartimentos-específicos de iniciadores PCR). Os conteúdos do recipiente de uma única célula (isto é, DNA genômico ou de DNAc) podem empregar uma amplificação opcional de todo o genoma (WGA) ou etapa de amplificação do todo o transcriptoma.

[006] A Fig. 3 descreve um método de produção de biblioteca de DNAc a partir do conteúdo de uma única célula em CE, tal como gotas. No exemplo mostrado, os índices estão a ser usados para marcar diferentes amostras.

[007] A Fig. 4 descreve conteúdo representativo de uma única célula que pode ser analisada por meio do esquema de indexação combinatória proposto.

[008] As Fig. 5A e 5B representam concretizações esquemáticos exemplificativas para a criação de um elemento de preservação de contiguidade (CE) a partir de encapsular e lisar o conteúdo de uma única célula presa dentro de um CE, tal como na pérola de polímero. Célula é incorporada em, por exemplo, uma pérola de polímero. Todos os componentes de uma única célula são mantidos em proximidade um do outro no talão. Subsequentemente, um ou mais componentes pode ser amplificado, (síntese de DNAc) modificado, e, subsequentemente, rotulados com índices ou marcação. A Fig. 5C representa uma concretização esquemática exemplificativa em que a indexação amostra pode ser conseguida pela adição de sequências de DNA que codificam para (tal como, um plasmídeo) no encapsulamento, amplificação / DNAc, ou fase de polimerização. Cada amostra é preparada com um conjunto diferente de plasmídeos codificando ou combinação de plasmídeo. Cada CE combinatória indexado irá produzir correspondente amostras elementos da biblioteca de codificação combinatória indexados. Desta forma, cada elemento da biblioteca pode ser mapeado de volta ao seu CE de origem e amostra de origem.

[009] A Fig. 6 apresenta diagramas esquemáticos para encapsular o conteúdo das células individuais em CE, tais como grânulos de matriz de polímero.

[0010] A Fig. 7 mostra um esquema exemplar de análise de alto rendimento de componentes celulares por captura superfície directa. "A" mostra um conjunto de células. "B" mostra transposomes ligados à superfície. Em "C", as células são vertidas sobre a superfície. Em células de "D" são lisadas e os componentes da célula são permitidos para difundir de um modo controlado em torno do local em que a célula foi capturado. Em "E", os ácidos nucleicos são capturados (marcado) pelos transposomes. Diferentes componentes celulares são capturados dependendo se a membrana celular ou núcleos são lisadas. Ao utilizar porções específicas do componente de captura (ou seja, anticorpos, receptores, ligandos), vários componentes celulares podem ser capturados. A análise das moléculas capturados podem ser efectuadas directamente sobre a superfície da captura. Alternativamente, as moléculas capturadas podem ser colhidas e analisados sobre uma superfície diferente. Neste caso, a primeira superfície é composta de várias áreas (por exemplo, almofadas) e cada almofada é revestido com os oligos que partilham um barcode idêntico de modo a que as moléculas que são capturadas no mesmo bloco vai compartilhar o mesmo barcode de identificação.

[0011] A Fig. 8 ilustra um esquema exemplificativo da análise do ácido nucleico utilizando elementos de preservação de contiguidade em grânulos.

[0012] A Fig. 9A-D descreve uma estratégia de modelação exemplificativa.

[0013] A Fig. 10 mostra um método para a criação de partículas que são úteis para a criação de elementos de contiguidade.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0014] Alguns aspectos da presente invenção se refere a métodos e composições relacionadas com a avaliação dos componentes de uma única célula preservada ou incorporado contida dentro de um elemento de preservação de contiguidade (CE).

[0015] Num aspecto, são aqui descritos métodos para analisar pluralidade de tipos de analito a partir de uma única célula. Em algumas concretizações, uma pluralidade de elementos de preservação de contiguidade (CE) é fornecida, cada CE compreende uma única célula. As células são submetidas a lise dentro do CE, de tal modo que a pluralidade de analitos no interior da única célula são liberados dentro do CE. Em algumas concretizações, a pluralidade de tipos de porções repórter são fornecidos, de modo a que cada tipo de porções repórter é específico para cada tipo de analito. Em algumas concretizações, as porções repórter identificam uma única célula. A pluralidade de analitos são modificadas, de tal modo que cada tipo de analito compreende uma porção repórter específica para o tipo de analito. Em algumas concretizações, a CE compreende os analitos que compreendem as referidas porções repórter são combinados. Em algumas concretizações, a CE combinada compreendendo os analitos que compreendem as referidas porções repórter são compartimentadas. Em algumas concretizações porções repórter adicionais são fornecidos e combinadas com os analitos compreendendo analitos, de tal modo que os analitos compreendem duas ou mais porções repórter diferentes. Os analitos que compreendem as porções repórter são analisadas, de tal modo que a identidade da substância a analisar é detectada e a porções repórter identificam a fonte da substância a analisam a partir de uma única célula.

[0016] Em algumas concretizações, a pluralidade exemplificativa de analitos incluem, mas não estão limitados a DNA, RNA, cDNA, proteínas, lipídeos, carboidratos, organelos celulares, (por exemplo, núcleo, aparelho de Golgi, ribossomas, mitocôndrias, retículo endoplasmático, cloroplasto, membrana celular, etc.), metabólitos celulares, seções teciduais, células, uma única célula, o conteúdo de células ou de uma única célula, o ácido nucleico isolado a partir de células ou de uma única célula, ou ácido nucleico isolado a partir de células ou de uma única célula e ainda modificado, ou DNA isento de células (por exemplo, a partir do fluido ou do plasma da placenta). Em algumas concretizações, a pluralidade de analitos incluem DNA genômico e o RNAm. Em algumas concretizações, o RNAm tem uma cauda poli. Em algumas concretizações, o DNA genômico e o RNAm são imobilizados sobre um suporte sólido no interior do CE simultaneamente. Em algumas concretizações, a imobilização do DNA genômico é sequencial para a imobilização do RNAm para o suporte sólido. Em algumas concretizações, o DNA genômico é combinado com complexos de transpossoma e as extremidades de transposons são imobilizadas sobre um suporte sólido e os RNAm são imobilizadas para o sólido por hibridização de sondas oligo (dT) imobilizadas sobre um suporte sólido. Em algumas concretizações, o DNA genômico é combinado com complexos de transpossoma e, opcionalmente, a extremidade do transposon hibridiza com sequências complementares imobilizadas sobre um suporte sólido, de tal modo que os RNAm são imobilizadas para o sólido por hibridização de sondas oligo (dT) imobilizadas sobre um suporte sólido. Outros métodos podem assim ser usados para imobilizar o RNAm. Em algumas concretizações, o suporte sólido é um grânulo. Em algumas concretizações, o suporte sólido é uma superfície de célula de fluxo. Em algumas concretizações, a superfície sólida é a parede de um vaso de reação.

[0017] Em algumas concretizações, os moldes incluem ácidos nucleicos de sequenciamento conservados ou embutido ou contidos CE. Em particular, concretizações dos métodos e composições aqui proporcionados referem-se à preparação de moldes de ácido nucleico e a obtenção de sequence data do mesmo. Os métodos e composições aqui proporcionados são relacionados com métodos e composições fornecidas no pedido de patente US Pub. No. 2012/0208705, pedido de patente US Pub. No. 2012/0208724 e publicação do Pedido de Patente internacional N ° WO 2012/061832, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Algumas concretizações da presente invenção referem-se à preparação de DNA dentro de CE para obter faseamento e montagem de informações de sequências a partir de um ácido nucleico alvo, e a obtenção de faseamento e montagem sequência de informação de sequência a partir de tais modelos. Concretizações particulares aqui apresentadas referem-se ao uso de integrases, por exemplo, transposases, para manter a proximidade física das extremidades associadas de ácidos nucleicos fragmentados; e ao uso de indexação combinatória para criar bibliotecas individuais de cada CE. Obtenção de informação de haplótipos a partir de CE inclui distinguir entre alelos diferentes (por exemplo, os SNPs, anomalias genéticas, etc.), um ácido nucleico alvo. Tais métodos são úteis para a caracterização de alelos diferentes num ácido nucleico alvo e para reduzir a taxa de erro na informação da sequência.

[0018] Em uma concretização, um ácido nucleico matriz pode ser diluída em CE, tais como gotas. A amplificação do genoma inteiro opcional pode ser empregada, e informação de sequência pode ser obtida a partir de uma quantidade de equivalente ácido nucleico molde a cerca de um equivalente haplóide do ácido nucleico alvo.

[0019] De acordo com outras concretizações, um ácido nucleico matriz pode ser compartimentado, de modo que múltipla cópia de um cromossoma possa estar presente no mesmo compartimento, como um resultado da indexação dupla ou múltipla aqui proporcionada, um haplótipo pode ainda também ser determinada. Em outras palavras, um ácido nucleico molde podem ser preparados utilizando compartimentos virtuais. Em tais concretizações, um ácido nucleico pode ser distribuído entre vários primeiros compartimentos, proporcionando um primeiro índice do ácido nucleico de cada compartimento, combinando os ácidos nucleicos, a distribuição do ácido nucleico entre os vários compartimentos segundo, e fornecer um segundo índice para o ácido nucleico de cada compartimento. De um modo vantajoso, tais indexação permite que a informação haplótipo de ser obtida em concentrações mais elevadas de ácido nucleico em comparação com a mera diluição de um ácido nucleico em um único compartimento para uma quantidade equivalente a um haplótipo do ácido nucleico.

[0020] Tal como aqui utilizado, o termo "compartimento" destina-se a significar uma área ou volume que separa ou algo isolado a partir de outras coisas. Os compartimentos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, frascos, tubos, poços, gotas, grânulos, bolos, vasos, características de superfície ou áreas ou volumes separados por forças físicas, tais como o fluxo de fluido, magnetismo, corrente eléctrica ou semelhantes.

[0021] Um método exemplificativo para fazer compartimentos é mostrado na Fig. 10. Um mestre de placas de silício com postos podem ser usados para imprimir poços em uma folha de hidrogel (poços no hidrogel são as imagens inversas das mensagens). As cavidades resultantes no hidrogel pode ser preenchido com um material que forma as partículas (por exemplo, um gel ou polímero), juntamente com um analito alvo ou outro reagente. A folha de hidrogel pode ser então dissolvido através de uma técnica que não dissolve as partículas. Em seguida, as partículas podem ser recolhidas e manipuladas usando métodos aqui estabelecidos.

[0022] Em algumas concretizações aqui proporcionadas, bibliotecas de modelo são preparados usando transposomes. Em algumas de tais bibliotecas, o ácido nucleico alvo pode ser fragmentado. Consequentemente, algumas concretizações aqui proporcionado referem-se a métodos para a manutenção da informação da sequência para a contiguidade física de fragmentos adjacentes. Tais métodos incluem o uso de integrases de manter a associação de fragmentos de ácidos nucleicos moldes adjacentes no ácido nucleico alvo. De um modo vantajoso, tal uso de integrases para manter a proximidade física de ácidos nucleicos fragmentados aumenta a probabilidade de que os fragmentos de ácidos nucleicos a partir da mesma molécula original, por exemplo, cromossoma, irá ocorrer no mesmo compartimento.

[0023] Outras concretizações aqui proporcionadas referem-se à obtenção de informação de sequência de cada cadeia de um ácido nucleico que pode ser útil para reduzir a taxa de erro na informação do sequenciamento. Métodos para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos moldes para a obtenção de informação de sequência de cada cadeia de um ácido nucleico pode ser preparado de tal modo que cada cadeia pode ser distinguida, e os produtos de cada cadeia podem também ser distinguidos.

[0024] Alguns dos métodos aqui proporcionados incluem métodos de análise de ácidos nucleicos. Tais métodos incluem a preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos moldes de um ácido nucleico alvo, a obtenção de dados da sequência a partir da biblioteca de ácidos nucleicos moldes, e a montagem de uma representação da sequência do ácido nucleico alvo a partir de tais dados de sequência.

[0025] Geralmente, os métodos e composições aqui proporcionados são relacionados com os métodos e composições fornecidas no pedido de patente US Pub. No. 2012/0208705, pedido de patente US No. 2012/0208724 e Pedido de Patente internacional N° WO 2012/061832, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Os métodos aqui proporcionados referem-se à utilização de transposomas útil para inserir as funcionalidades em um ácido nucleico alvo. Tais características incluem sítios de fragmentação, locais iniciadores, barcodes, marcadores de afinidade, porções repórter, etc.

[0026] Em um método útil com as concretizações aqui proporcionadas, uma biblioteca de ácidos nucleicos moldes é preparado a partir de um CE que compreende o ácido nucleico alvo. A biblioteca é preparada através da inserção de fixação ou uma pluralidade de barcodes único em todo o ácido nucleico alvo. Em algumas concretizações, cada barcode inclui uma primeira sequência barcode e uma segunda sequência de barcode, tendo um local de fragmentação disposto entre os mesmos. A primeira sequência barcode e segunda sequência barcode podem ser identificadas ou designadas a ser emparelhada uma com a outra. O emparelhamento pode ser informativo para que um primeiro barcode esteja associado com um segundo barcode. Vantajosamente, as sequências barcode emparelhadas pode ser usada para montar os dados de sequenciamento a partir da biblioteca de ácidos nucleicos moldes. Por exemplo, a identificação de um ácido nucleico primeiro molde que compreende uma primeira sequência barcode e um ácido nucleico segundo molde compreendendo uma segunda sequência barcode que é emparelhado com o primeiro indica que os primeiro e segundo ácidos nucleicos moldes representam sequências adjacentes um ao outro em uma representação sequência do ácido nucleico alvo. Tais métodos podem ser usados para montar uma representação da sequência de um ácido nucleico alvo de novo, sem o requisito de um genoma de referência.

[0027] Em algumas concretizações, vários barcodes combinatória pode ser empregue que o ácido nucleico alvo a partir de tais cada única célula compreende um barcode único (por exemplo, a combinação única de barcodes) e pode ser facilmente identificado a partir de um ácido nucleico alvo diferente a partir de uma única célula diferente. Em algumas concretizações um CE pode compreender o ácido nucleico alvo a partir de uma única célula. Em algumas concretizações, o ácido nucleico alvo dentro de um CE terá barcodes único identificáveis que são diferentes do ácido nucleico alvo dentro de um CE diferente.

[0028] Em algumas concretizações, múltiplos sistema de marcação combinatória pode ser empregados para os componentes dentro de uma única célula, além do ácido nucleico, por exemplo, proteínas, organelas, lipídeos, ou membranas de células, de tal modo que os componentes dentro de uma única célula podem ser identificados a partir da componentes de uma única célula diferente. Em algumas concretizações, um CE pode compreender os componentes dentro de uma única célula. Em algumas concretizações, os componentes de uma única célula dentro de um CE terão marcadores únicos identificável (s) que são diferentes dos componentes de uma única célula dentro de um CE diferente.

[0029] Em algumas concretizações, vários esquemas de barcodes combinatórios podem ser empregados para o ácido nucleico alvo a partir de uma única célula e múltiplos sistemas de marcação combinatórias podem ser empregados para os componentes dentro de uma única célula em conjunto. Em algumas concretizações, o barcode, combinatória e marcação combinatória pode ser realizada dentro de um CE que compreende uma única célula. Em algumas concretizações, o barcode, tais combinatória e marcação combinatória pode ser realizada por CE múltipla que compreende células isoladas em paralelo.

[0030] Em algumas concretizações, as proteínas preservadas, incorporadas, imobilizadas, ou contidas dentro de CE podem ser sequenciadas. Em algumas concretizações, tais proteínas são marcadas de forma única. Em algumas concretizações, as proteínas preservadas, incorporadas, imobilizadas, ou contidas dentro de CE podem ser identificados por métodos conhecidos no estado da técnica. Em algumas concretizações, a identificação e ou sequenciamento da proteína pode ser realizada em conjunto com a informação da sequência de coleta dos ácidos nucleicos.

[0031] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" e / ou "oligonucleotídeo" e / ou seus equivalentes gramaticais pode referir-se, pelo menos, dois monômeros de nucleotídeos ligados uns aos outros. Um ácido nucleico pode geralmente conter ligações fosfodiéster; no entanto, em algumas concretizações, análogos de ácido nucleico pode ter outros tipos de estruturas base, que compreendem, por exemplo, fosforamida (Beaucage, et al, Tetrahedron, 49: 1925 (1993); Letsinger, J. Org Chem., 35:3800 ( 1970); Sprinzl, et al, Eur J. Biochem, 81: 579 (1977); Letsinger, et al, Nucl Acids Res, 14: 3487 (1986); Sawai, et al, Chem Lett., 805 (1984), Letsinger, et al, J. Am Chem Soe, 110: 4470 (1988); e Pauwels, et al, Chemica Scripta, 26:141 (1986)), fosforotioato (Mag, et al, Nucleic Acids Res., 19: 1437 (1991); e Patente US N ° 5644048), fosforoditioato (Briu, et al, J. Am Chem Soe, 111:2321 (1989)., ligações O- metilfosforoamidita (ver Eckstein , Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), e cadeias principais de ácidos nucleicos de peptídeos e ligações (ver Egholm, J. Am Chem Soe, 114:.. 1895 (1992); Meier, et al, Chem Int Ed. Engl, 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson, et al, Nature, 380: 207 (1996)). As referências acima são aqui incorporadas por referência.

[0032] Outros ácidos nucleicos análogos incluem aqueles com cadeias principais positivas (Denpcy, et al, Proc Natl Acad Sci EUA, 92:6097 (1995)); Espinhas dorsais não- iônicos (U.S. Pat. Nos. 5,386,023; 5,637,684; 5,602,240; 5,216,141; and 4,469,863; Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991); Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); Letsinger, et al., Nucleosides & Nucleotides, 13:1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996)) e sem-ribose (U.S. Patent No. 5,235,033 and No. 5,034,506, and Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Coo). Os ácidos nucleicos também podem conter um ou mais açúcares carbocíclicos (ver Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995), pp. 169 176). As referências anteriores são aqui incorporadas por referência.

[0033] As modificações do esqueleto de ribose-fosfato podem ser feitas para facilitar a adição de porções adicionais tais como marcadores, ou para aumentar a estabilidade de tais moléculas, sob certas condições. Além disso, as misturas de ácidos nucleicos e análogos que ocorrem naturalmente podem ser feitas. Alternativamente, misturas de diferentes análogos de ácidos nucleicos e misturas de ácidos nucleicos e análogos que ocorrem naturalmente podem ser feitas. Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, como especificado, ou conter porções de sequência tanto em cadeia dupla ou de cadeia única. O ácido nucleico pode ser DNA, por exemplo, DNA genômico ou DNAc, RNA ou um híbrido, a partir de células individuais, várias células, ou a partir de várias espécies, como com amostras metagenomic, tais como a partir de amostras ambientais, mais a partir de amostras misturadas, por exemplo, amostras de tecido misto ou amostras misturadas para diferentes indivíduos da mesma espécie, as amostras de doença tais como os ácidos nucleicos relacionados com o cancro, e outros semelhantes. Um ácido nucleico pode conter qualquer combinação de deoxyribo- e ribo-nucleotídeos, e qualquer combinação de bases, incluindo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xanthanine, hypoxanthanine, isocitosina, isoguanina, e análogos de bases tais como nitropirrole (incluindo 3-nitropirrol) e nitroindol (incluindo 5-nitroindol), etc.

[0034] Em algumas concretizações, um ácido nucleico pode incluir pelo menos uma base promíscuos. As bases promíscuos podem basear-par com mais do que um tipo diferente de base. Em algumas concretizações, uma base promíscuo pode basear-par com, pelo menos, dois tipos diferentes de bases e não mais de três tipos diferentes de bases. Um exemplo de uma base promíscuo inclui inosina que pode emparelhar com adenina, timina ou citosina. Outros exemplos incluem hipoxantina, 5-nitroindol, acílico 5-nitroindolo, 4- nitropirazol, 4- nitroimidazol e 3- nitropirrole (Loakes et al, Nucleic Acid Res 22: 4039 (1994); Van Aerschot et al, Nucleic Acid Res. 23: 4363 (1995); Nichols et al, Nature 369:. 492 (1994); Bergstrom et al, Nucleic Acid Res 25: 1935 (1997); Loakes et al, Nucleic Acid Res. 23: 2361 (1995); Loakes et al, J. Mol Biol 270: 426 (1997); e Fotin et al, Nucleic Acid Res 26: 1515 (1998)). As bases promiscuas que podem de pares de base com, pelo menos, três, quatro ou mais tipos de bases também pode ser usado. As referências anteriores são aqui incorporadas por referência.

[0035] Tal como aqui utilizado, o termo "análogo de nucleotídeo" e / ou seus equivalentes gramaticais pode se referir a análogos sintéticos possuindo porções de base nucleotídeo modificado, porções de pentose modificada, e / ou porções de fosfato modificadas, e, no caso de polinucleotídeos, ligações internucleotídeos modificadas, como geralmente descrito em outra parte (por exemplo, Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nova Iorque, 1980; Englisch, Angew Chem Int Ed Engl 30: 613-29, 1991; Agarwal, protocolos para polinucleotídeos e análogos, Humana Press, 1994; e S. Verma e F. Eckstein, Ann Rev. Biochem 67: 99-134, 1998). Geralmente, as porções de fosfato modificadas compreendem anogos de fosfato em que o átomo de fósforo está no estado de oxidação +5 e um ou mais dos átomos de oxigénio é substituído por um radical n-oxigénio, por exemplo, enxofre. Análogos de fosfato exemplificativos incluem mas não estão limitados a fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, boronophosphates, incluindo contra-íons associados, por exemplo, H+, NH4+, Na+, se tais contra-íons estão presentes. Exemplo porções de bases nucleoticas modificadas incluem, mas não estão limitados a 5- metilcitosina (5mC); Análogos C-5-propinilo, incluindo mas não se limitando a, C-5 propinil-C e C-5 propinil-L; 2, 6- diaminopurina, também conhecido como 2-amino-adenina ou 2- amino-dA); hipoxantina, pseudouridina, 2-tiopirimidina, isocitosina (ISOC), ISOC 5-metilo, e isoguanina (isoG;. ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 5.432.272). Exemplos de porções de pentose modificados incluem, mas não estão limitados a, ido nucleico bloqueado (LNA) análogos, incluindo, sem limitação, Bz-A-LNA, 5-Me-Bz-C-LNA, DMF-L-LNA, e T-LNA {ver, por exemplo, o Relatório Glen, 16 (2): 5, de 2003; Koshkin et al, Tetrahedron 54: 3607-30, 1998), e 2'- ou 3 '-modifications onde o 2'ou posição 3' é hidrogénio, hidroxi, alcoxi {por exemplo, metoxi, etoxi, aliloxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi e fenoxi), azido, amino, alquilamino, flúor, cloro, ou bromo. As Ligações internucleotídeos modificadas incluem análogos de fosfato, análogos possuindo ligações inter-subunidades aquirais e n carregados (por exemplo, Sterchak, EP et al, Organic Chem., 52: 4202, 1987), e polímeros à base de morfolino n carregados possuindo ligações inter-subunidades aquirais (ver, por exemplo, US Pat. No. 5034506). Alguns análogos de ligação internucleotídeos incluem morfolidato, acetal, e heterociclos ligados a poliamida. Em uma classe de análogos de nucleotídeos, conhecidos como ácidos nucleicos de peptídeos, incluindo ácidos nucleicos de peptídeos de pseudo complementar ("PNA"), uma ligação açúcar convencional e internucleotídeos foi substituído por um polímero de 2- aminoetilglicina amida esqueleto (ver, por exemplo, Nielsen et al, Science, 254: 1497-1500, 1991; Egholm et al, J. Am Chem Soe, 114: 1895- 1897, 1992; Demidov et al, Proc Natl Acad Sci USA 99: 5953-58, 2002; Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, Nielsen, ed, Horizon Bioscience, 2004). As referências anteriores são aqui incorporadas por referência.

[0036] Tal como aqui utilizado, o termo "leitura de sequenciamento" e / ou seus equivalentes gramaticais pode referir-se a um processo repetitivo de etapas físicas ou químicas que é realizado para obter sinais indicativos da ordem de monômeros num polímero. Os sinais podem ser indicativos de uma ordem de monômeros na resolução de um monômero único ou resolução mais baixa. Em concretizações particulares, os passos podem ser iniciados em um alvo de ácido nucleico e realizado para obter sinais indicativos da ordem de bases do ácido nucleico alvo. O processo pode ser realizado a sua conclusão típica, que é geralmente definido pelo ponto no qual os sinais provenientes do processo já não podem distinguir bases do alvo com um nível de certeza razoável. Se desejado, a conclusão pode ocorrer mais cedo, por exemplo, uma vez que tiver sido obtida uma quantidade desejada de informação de sequência. Uma leitura de sequenciamento pode ser realizada em uma única molécula de ácido nucleico alvo simultaneamente ou em uma população de moléculas de ácido nucleico alvo que possuem a mesma sequência, ou simultaneamente, a uma população de ácidos nucleicos alvo que possuem sequências diferentes. Em algumas concretizações, uma leitura de sequenciamento é terminada quando os sinais não são obtidos a partir de uma ou mais moléculas alvo de ácido nucleico a partir do qual se iniciou a aquisição de sinal. Por exemplo, uma leitura de sequenciamento pode ser iniciada por uma ou mais moléculas alvo de ácidos nucleicos que estão presentes em um substrato de fase sólida e terminada após a remoção das moléculas de ácido nucleico alvo uma ou mais a partir do substrato. A sequenciamento pode ser terminada por outra forma cessar a detecção dos ácidos nucleicos alvo que estavam presentes no substrato quando o sequenciamento de execução foi iniciado.

[0037] Tal como aqui utilizado, o termo "representação sequenciamento" e / ou seus equivalentes gramaticais referem-se a pode informação que indica a ordem e tipo de unidades monoméricas no polímero. Por exemplo, a informação pode indicar a ordem e tipo de nucleotídeos de um ácido nucleico. A informação pode ser em qualquer de uma variedade de formatos, incluindo, por exemplo, uma representação, imagem, forma eletrônica, série de símbolos, números de série, série de letras, série de cores, etc. A informação pode ser a resolução monomérico ou na resolução mais baixa. Um polímero exemplar é um ácido nucleico, tal como DNA ou RNA, tendo unidades de nucleotídeos. Uma série de letras "A", "t", "L", e "C" é uma representação da sequência bem conhecida por DNA que pode ser correlacionada, com a resolução de um único nucleotídeo, com a sequência real de uma molécula de DNA. Outros polímeros exemplares são proteínas que possuem unidades de aminoácidos e os polissacáridos que têm unidades de sacarídeos.

[0038] Tal como aqui usado o termo "pelo menos uma porção de" e / ou seus equivalentes gramaticais pode referir- se a qualquer fracção de um valor inteiro. Por exemplo, "pelo menos uma porção de" pode referir-se a pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99,9 % ou 100% de um valor inteiro.

[0039] Tal como aqui utilizado, o termo "detectar" e / ou seus equivalentes gramaticais pode referir-se a identificar a presença ou a existência de uma substância a analisar, identificar os componentes individuais de uma substância a analisar, por exemplo, informao de sequência, e / ou quantificar a quantidade de tal analito.

Locais de fragmentação

[0040] Em algumas concretizações que compreendem um ciclo de transposomas, o ligante pode compreender um local de fragmentação. Um local de fragmentação pode ser usado para clivar o físico, mas não informativo a associação entre uma primeira sequência barcode e uma segunda sequência de barcode. A clivagem pode ser efectuada por bioquímica, química ou outros meios. Em algumas concretizações, um local de fragmentação pode incluir uma sequência de nucleotídeos ou de nucleotídeos que pode ser fragmentado por vários meios. Por exemplo, um local de fragmentação pode compreender um sítio de endonuclease de restrição; pelo menos um ribonucleotídeo clivável com uma RNAse; análogos de nucleotídeos susceptíveis de corte na presença de certos agentes químicos; uma ligação diol clivável por tratamento com periodato; um grupo dissulfito clivável, com um agente redutor químico; uma porção clivável que pode estar sujeito a clivagem fotoquímica; e um peptídeo clivável por uma enzima peptidase ou outros meios adequados. Ver, por exemplo, Pedido de Patente US Pub. No. 2012/0208705, pedido de patente US Pub. No. 2012/0208724 e Int. Pedido de Patente internacional N ° WO 2012/061832, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Locais de iniciadores

[0041] Em algumas concretizações, as porções repórter pode compreender locais iniciadores que podem hibridizar com um iniciador. Em algumas concretizações, porções repórter podem incluir pelo menos um primeiro local de iniciadores úteis para a amplificação, sequenciamento e semelhantes.

[0042] Em algumas concretizações, uma sequência de transposon podem incluir um "adaptador de sequenciamento" ou "local adaptador de sequenciamento", isto é, uma região que compreende um ou mais locais que podem hibridar com um iniciador. Em algumas concretizações, uma sequência de transposon pode incluir pelo menos um primeiro local de iniciadores úteis para a amplificação, sequenciamento e semelhantes. Em algumas concretizações que compreendem transposomes loop, um ligante pode incluir um adaptador de sequenciamento. Em mais concretizações compreendendo transposomes loop, um agente de ligação compreende pelo menos um primeiro local de iniciador e um segundo local de iniciador. A orientação dos locais dos iniciadores em tais concretizações pode ser, de tal modo que um iniciador que hibridiza com o primeiro local de iniciador e um iniciador que hibridiza com o segundo local de iniciador estão na mesma orientação, ou em diferentes orientações.

[0043] Em algumas concretizações, um ligante pode incluir um primeiro local de iniciador, um segundo local de iniciador que possua um local não amplificável disposto entre os mesmos. O local não amplificável é útil para bloquear a extensão de uma cadeia de polinucleotídeo entre o primeiro e segundo locais de iniciadores, em que a cadeia de polinucleotídeo hibrida a um dos locais dos iniciadores. O site não amplificável também pode ser útil para evitar concatiê^eros. Exemplos de sítios não amplificáveis incluem um análogo de nucleotídeo, porção química não-nucleotídeos, amino-ácido, peptídeo e polipeptídeo. Em algumas concretizações, um local não amplificável compreende um análogo de nucleotídeo que não faz significativamente pares de bases com A, C, G ou T. Algumas concretizações incluem um ligante que compreende um primeiro local de iniciador, um segundo local de iniciador possuindo um local de fragmentação disposto entre os mesmos. Outras concretizações podem usar um adpatador bifurcado ou concepção do adaptador em forma de Y útil para a sequenciamento direcional, tal como descrito na Patente US N° 7,741,463, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0044] Exemplos de sequências de locais de ligação de iniciadores incluem, mas não estão limitados a AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC (sequência P5) e CAAGCAGAAGACGGCATACATGAG (sequência P7). Porções repórter

[0045] Tal como aqui utilizado, o termo "porção repórter" e seus equivalentes gramaticais pode referir-se a qualquer marcador identificável, marcador, os índices, os barcodes, ou grupo que permite determinar a composição, a identidade, e / ou a fonte de um analito que é investigado.

[0046] O técnico versado no assunto irá apreciar que muitas espécies diferentes de porções repórter pode ser utilizado com os métodos e composições aqui descritos, quer individualmente ou em combinação com um ou mais diferentes porções repórter. Em algumas concretizações, mais do que podem ser utilizadas as porções repórter diferentes para analisar simultaneamente mais do que um analito. Em algumas concretizações, uma pluralidade de diferentes porções repórter pode ser utilizado simultaneamente para identificar exclusivamente uma única célula ou componentes de uma única célula.

[0047] Em certas concretizações, uma porção repórter pode emitir um sinal. Exemplos de um sinal inclui, mas não está limitado a, um fluorescente, um quimioluminescente, um bioluminescente, um sinal fosforescente, um marcador radioativo, calorimétrico, uma atividade de íons, sinais eletrónicos ou um sinais eletroquimioluminescentes. Exemplo de porções repórter são listados, por exemplo, Pedido de Patente US Pub. No. 2012/0208705, pedido de patente US Pub. No. 2012/0208724 e Int. Pedido de Patente Pub. N ° WO 2012/061832, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0048] Em algumas concretizações, fracção relatora pode ser um adaptador. Em algumas concretizações das composições e métodos aqui descritos, uma sequência de transposon pode incluir porções repórter. Em algumas concretizações que compreendem transposomes loop, um ligante ou adaptador pode compreender uma porções repórter.

[0049] Em algumas concretizações, uma porção repórter pode não emitir um sinal. Em algumas concretizações, uma porção repórter pode ser um fragmento de ácido nucleico, tais como um barcode, o índice de molecular única, um plasmídeo. Em algumas concretizações, uma porção repórter pode compreender um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína. Em algumas concretizações, o anticorpo pode compreender um marcador detectável. Em algumas concretizações, o repórter pode incluir um reagente de anticorpo ou de afinidade marcado com um marcador de ido nucleico. O marcador de ido nucleico pode ser detectada, por exemplo, por meio de um ensaio de proximidade de ligação (PLA) ou um ensaio de extensão de proximidade (PEA).

[0050] Em algumas concretizações, pode ser utilizado um conjunto de porções repórter. Em algumas concretizações, o conjunto de unidades de repórter pode compreender uma mistura de subconjunto de unidades de repórter, no qual cada subconjunto das porções repórter são específicas para um tipo diferente de analito, por exemplo, proteínas, ácidos nucleicos, lipídeos, carboidratos. Em algumas concretizações, o conjunto de unidades de repórter pode compreender uma mistura de subconjunto de unidades de repórter, no qual cada subconjunto das porções repórter são diferentes uns dos outros, mas são específicos para um mesmo tipo de analito. Barcodes

[0051] De um modo geral, um barcode pode incluir uma ou mais sequências de nucleotídeos que podem ser utilizados para identificar um ou mais analitos específicos, tais como ácidos nucleicos, proteínas, metabólitos ou outros analitos aqui estabelecidas ou conhecidas no estado da técnica. O barcode pode ser uma sequência artificial, ou pode ser uma sequência que ocorre naturalmente gerado durante a transposição, tais como sequências idênticas flanqueadoras de DNA genômico(G-códigos) na extremidade dos fragmentos de DNA anteriormente justapostas. Um barcode pode compreender pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos consecutivos. Em algumas concretizações, um barcode compreende pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos consecutivos. Em algumas concretizações, pelo menos uma parte dos barcodes em uma população de ácidos nucleicos que compreendem barcodes é diferente. Em algumas concretizações, pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% dos barcodes são diferentes. Em mais concretizações, todos os barcodes são diferentes. A diversidade de diferentes barcodes em uma população de ácidos nucleicos que compreendem barcodes pode ser gerado aleatoriamente ou de modo não aleatório gerado.

[0052] Em algumas concretizações, uma sequência de transposon compreende, pelo menos, um barcode. Em algumas concretizações, tais como transposomes compreendendo duas sequências de transposons não-contíguas, a primeira sequência de transposon compreende um primeiro barcode, e a segunda sequência de transposon compreende um segundo barcode. Em algumas concretizações, tal como em transposomas enrolados, uma sequência de transposon compreende um barcode que compreende uma primeira sequência barcode e uma segunda sequência barcode. Em algumas das concretizações anteriores, a primeira sequência barcode pode ser identificado ou designadas para ser emparelhado com a segunda sequência de barcode. Por exemplo, uma primeira sequência conhecida barcode pode ser conhecida para ser emparelhada com uma segunda sequência barcode conhecida, utilizando uma tabela de referência que compreende uma pluralidade de primeira e segunda sequências barcode conhecidas a serem emparelhadas uma com a outra.

[0053] Em outro exemplo, a primeira sequência barcode pode compreender a mesma sequência que a segunda sequência barcode. Em outro exemplo, a primeira sequência barcode pode compreender o complemento inverso da segunda sequência de barcode. Em algumas concretizações, a primeira sequência barcode e a segunda sequência barcode são diferentes. As primeira e segunda sequências barcode pode compreender um bi- código.

[0054] Em algumas concretizações de composições e modos aqui descritos, os barcodes são usados na preparação de moldes de ácidos nucleicos. Como irá ser compreendido, o grande número de barcodes disponíveis permite que cada molécula de ácido nucleico molde possa compreender uma identificação única. A identificação única de cada molécula em uma mistura de ácidos nucleicos moldes que podem ser usados em várias aplicações. Por exemplo, as moléculas identificadas exclusivamente podem ser aplicadas para identificar molulas de idos nucleicos individuais, em amostras possuindo vários cromossomas, em genomas, em células, em tipos de células, em estados de doença da célula, e em espécies, por exemplo, no sequenciamento de haplótipos, em parental alelo discriminação, no sequenciamento metagenômico, e na sequenciamento de amostra de um genoma. As sequências de barcode exemplificativas incluem, mas não estão limitados a TATAGCCT, ATAGAGGC, CCTATCCT, GGCTCTGA, AGGCGAAG, TAATCTTA, CAGGACGT e GTACTGAC.

Ligantes

[0055] Algumas concretizações que compreendem transposomes looped incluem sequências de transposons compreendendo uma primeira sequência barcode e uma segunda sequência barcode que tem um ligante colocada entre elas. Em outras concretizações, o ligante pode estar ausente, ou pode ser o esqueleto de açúcar-fosfato que conecta um de nucleotídeos para o outro. O ligante pode compreender, por exemplo, um ou mais de um nucleotídeo, um ácido nucleico, uma porção química não-nucleotídeo, um análogo de nucleotídeo, aminoácido, peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Em concretizações preferidas, um agente de ligação compreende um ácido nucleico. O ligante pode compreender, pelo menos, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos. Em algumas concretizações, um ligante pode compreender, pelo menos, cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 ou mais nucleotídeos.

[0056] Em algumas concretizações, um ligante pode ser amplificado, por exemplo, por PCR, amplificação em círculo rolante, amplificação de deslocamento de cadeia, e semelhantes. Em outras concretizações, um ligante pode incluir porções não amplificáveis. Exemplos de ligantes não amplificáveis incluem ligantes químicos orgânicos, tais como alquilo, propilo, PEG; bases não naturais, tais como a ISOC, isoG; ou qualquer grupo que não amplificar em esquemas de amplificação à base de DNA. Por exemplo, transposons contendo ISOC, pares isoG pode ser amplificado com dNTPs misturas faltam uma isoG complementar e ISOC, assegurando que nenhuma amplificação ocorre entre os transposons inseridos.

[0057] Em algumas concretizações, o ligante compreende um ácido nucleico de cadeia simples. Em algumas concretizações, as sequências de ligantes casais transposons em uma orientação 5'-3', uma orientação 5'-5', uma orientação 3'-3'.

Marcadores de afinidade

[0058] Em algumas concretizações, uma sequência de transposon podem incluir um marcador de afinidade. Em algumas concretizações que compreendem transposomes loop, um ligante pode compreender uma marcador de afinidade. Os marcadores de afinidade podem ser úteis para uma variedade de aplicações, por exemplo, a separação de grandes quantidades de ácidos nucleicos alvo hibridadas com as marcadores de hibridação. Outras aplicações incluem, mas não estão limitados a, utilizando marcadores de afinidade para purificação de transposase / complexos de transposons e transpos inserido de DNA alvo, as proteínas alvo de RNA alvo ou, por exemplo. Tal como aqui utilizado, o termo "marcação de afinidade" e seus equivalentes gramaticais pode se referir a um componente de um complexo multi-componente, em que os componentes do complexo multi-componente de interagir especificamente com ou ligar-se um ao outro. Por exemplo, um tag de afinidade pode incluir biotina ou poli-His que pode ligar-se estreptavidina ou níquel, respectivamente. Outros exemplos de complexos de marcador de afinidade de vários componentes são listados, por exemplo, Pedido de Patente US Pub. No. 2012/0208705, pedido de patente US No. 2012/0208724 e Pedido de Patente Internacional N° WO 2012/061832, cada uma dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Suporte sólido

[0059] Um suporte sólido pode ser de duas ou três dimensões e pode compreender uma superfície plana (por exemplo, uma lâmina de vidro) ou pode ser moldada. Um suporte sólido pode incluir vidro (por exemplo, vidro de porosidade controlada (CPG)), de quartzo, de plástico (tal como poliestireno (baixo poliestireno reticulada com ligações cruzadas e elevado), policarbonato, polipropileno e poli (metacrilato de metilo)), copolímero acrílico, poliamida, de silício, de metal (por exemplo, ouro alcanetiolato derivatizada), celulose, nylon, o látex, o dextrano, a matriz de gel (por exemplo, gel de sílica), poliacroleína ou de materiais compósitos.

[0060] Os suportes sólidos tridimensionais adequados incluem, por exemplo, esferas, micropartículas, esferas, as nanopartículas, matrizes de polímeros, tais como agarose, poliacrilamida, alginato, membranas, lâminas, placas, aparas de micro maquinadas, tubos (por exemplo, tubos capilares), micropoços, dispositivos de microfluidos, canais, filtros, as células de fluxo, estruturas adequadas para a imobilização de um ácido nucleico, proteínas ou células. Um suporte sólido pode incluir matrizes planares ou matrizes capazes de ter regiões que incluem as populações de ácidos nucleicos moldes ou iniciadores. Exemplos incluem CPG e poliestireno lâminas de nucleosídeos derivatizados; diapositivos magnéticos derivados; poliestireno enxertado com polietilenoglicol, e semelhantes.

[0061] Em algumas concretizações, o suporte sólido compreende microesferas ou esferas. Por "microesferas" ou "contas" ou "partículas" ou equivalentes gramaticais entenda- se aqui partículas discretas pequenas. As composições grânulares adequados incluem, mas não estão limitados a, plásticos, cerâmicas, vidro, poliestireno, rene pocilga metilo, polímeros acrílicos, materiais paramagnéticos, tória solenóide, grafite de carbono, dióxido de titânio, látex ou dextranos reticulados tais como Sepharose, celulose, nylon, podem ser todos utilizados micelas e teflon com ligações cruzadas, bem como quaisquer outros materiais aqui descritos para os suportes sólidos. "Guia de Detecção de microesfera" de Bangs Laboratories, Fishers Ind. É um guia útil. Em certas concretizações, as microesferas são as microesferas magnéticas ou grânulos. Em algumas concretizações, as esferas podem ser codificadas por cores. Por exemplo, MicroPlex® Microesferas de Luminex, Austin, TX podem ser usados.

[0062] Os grânulos não precisam ser esféricos; podem ser usados partículas irregulares. Em alternativa ou adicionalmente, os grânulos podem ser porosos. Os tamanhos do grânulo variar de nanómetros, isto é, 100 nm, para milímetro, ou seja, de 1 mm, com grânulos de cerca de 0,2 micron a cerca de 200 micrómetros sendo preferido, e desde cerca de 0,5 a cerca de 5 micra sendo particularmente preferida, embora em algumas concretizações maiores ou menores pode ser usado contas. Em algumas concretizações, as esferas podem ser de cerca de 1, 1.5, 2, 2.5, 2.8, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10,5, 15, ou 20 μm de diâmetro.

[0063] Em algumas concretizações, as esferas podem compreender anticorpos ou de outras sondas de afinidade (ver imobilizada Biomoléculas em análise. A Practical Approach. Cass T, Ligler FS, eds. Oxford University Press, New York, 1998. pp 1-14, aqui incorporada por referência para protocolos típicos de fixação). Em algumas concretizações, os anticorpos podem ser monoclonais e em outras concretizações, os anticorpos podem ser policlonais. Em algumas concretizações, os anticorpos podem ser específicos para um epitopo de superfie celular. Em algumas concretizações, os anticorpos podem ser específicos para uma proteína dentro da célula.

[0064] Em algumas concretizações, o molde de ácido nucleico aqui proporcionado pode ser ligado a um suporte sólido. Vários métodos bem conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados para fixar, âncora ou imobilizar ácidos nucleicos para a superfície do suporte sólido. Analitos

[0065] Os analitos são biomoléculas cuja função, de composição, de identidade e / ou a sua fonte são investigados. Os analitos ilustrativos incluem, mas não se limitam a DNA, RNA, DNAc, proteínas, lipídeos, carboidratos, organelos celulares, (por exemplo, núcleos, aparelho de Golgi, ribossomas, mitocôndrias, retículo endoplasmático, cloroplasto, membrana celular, etc.), metabólitos celulares, seções teciduais, células, uma única célula, o conteúdo de células ou de uma única célula, o ácido nucleico isolado a partir de células ou de uma única célula, ou ácido nucleico isolado a partir de células ou de uma única célula e ainda modificado, ou de DNA isento de células (por exemplo, a partir de placenta de fluido ou de plasma).

Ácidos nucleicos alvo

[0066] Um ácido nucleico alvo pode incluir qualquer ácido nucleico de interesse. Em uma concretização, o ácido nucleico alvo pode incluir qualquer ácido nucleico de interesse contido, preso, incorporado, ou imobilizada dentro de CE, tal como uma matriz, gota, emulsão, suporte sólido, ou compartimento mantendo a contiguidade dos ácidos nucleicos dentro, mas permitindo que a acessibilidade aos líquidos e reagentes enzimáticos. Os ácidos nucleicos alvo podem incluir DNA, DNAc, produtos de WGA, RNA, PNA, ácido nucleico morfolino, o ácido nucleico trancado, o ácido nucleico glicol, treose ácido nucleico, as amostras mistas de ácidos nucleicos, DNA poliploidia (ou seja, o DNA das plantas), suas misturas, e híbridos dos mesmos. Em uma concretização preferida, os fragmentos de DNA genômico ou cópias amplificadas dos mesmos são usados como o ácido nucleico- alvo. Em outra concretização preferida, o DNAc, o DNA mitocondrial ou do cloroplasto de DNA é usado.

[0067] Um ácido nucleico alvo pode compreender qualquer sequência de nucleotídeos. Em algumas concretizações, o ácido nucleico alvo compreende sequências homopoliméricas. Um ácido nucleico alvo pode também incluir sequências de repetição. As sequências de repetição podem ser qualquer um de uma variedade de comprimentos, incluindo, por exemplo, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500 ou 1000 nucleotídeos ou mais. As sequências de repetição podem ser repetidas, quer de forma contígua ou não contígua, qualquer um de uma variedade de tempos, incluindo, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 vezes ou mais.

[0068] Algumas concretizações aqui descritas podem utilizar um único ácido nucleico alvo. Outras concretizações podem utilizar uma pluralidade de ácidos nucleicos alvo. Em tais concretizações, uma pluralidade de ácidos nucleicos alvo pode incluir uma pluralidade dos mesmos ácidos nucleicos alvo, uma pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvo em que alguns ácidos nucleicos alvo são o mesmo, ou uma pluralidade de ácidos nucleico alvo, onde todos os ácidos nucleicos alvo são diferentes. Concretizações que utilizam uma pluralidade de ácidos nucleicos alvo pode ser realizado em formatos de multiplex de modo que os reagentes são fornecidos em simultâneo para os ácidos nucleicos alvo, por exemplo, em uma ou mais caras ou sobre uma superfície da matriz. Em algumas concretizações, a pluralidade de ácidos nucleicos alvo pode incluir substancialmente todo o genoma de um determinado organismo. A pluralidade de ácidos nucleicos alvo pode incluir pelo menos uma porção do genoma de um determinado organismo, incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 95%, ou 99% do genoma. Em concretizações particulares a porção pode ter um limite superior que é, no máximo, cerca de 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% do genoma

[0069] Os ácidos nucleicos alvo podem ser obtidos a partir de qualquer fonte. Por exemplo, os ácidos nucleicos alvo podem ser preparados a partir de moléculas de ácidos nucleicos obtidos a partir de um único organismo ou a partir de populações de moléculas de ácidos nucleicos obtidos a partir de fontes naturais que incluem um ou mais organismos. Fontes de moléculas de ácidos nucleicos incluem, mas não estão limitados a, organelas, células, tecidos, órgãos ou organismos. As células que podem ser utilizadas como fontes de moléculas de ácido nucleico alvo pode ser procariótica (células bacterianas, por exemplo, Escherichia, Bacillus, Serratia, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Chlamydia, Neisseria, Treponema, Mycoplasma, Borrelia, Legionella, Pseudomonas, Mycobacterium, Helicobacter, Erwinia, Agrobacterium, Rhizobium e Streptomyces geros); archeaon, tais como Crenarchaeota, Nanoarchaeota ou euryarchaeotia; ou eucariota, tais como fungos, (por exemplo, leveduras), plantas, protozoários e outros parasitas, e animais (incluindo insetos (por exemplo, Drosophila spp.), os nemátodos (por exemplo, Caenorhabditis elegans), e mamíferos (por exemplo, rato, rato, primata não humano e humano).

[0070] Os ácidos nucleicos alvo e os ácidos nucleicos do molde podem ser enriquecidas para determinadas sequências de interesse utilizando vários métodos bem conhecidos na arte. Exemplos de tais métodos são fornecidos em Int. Bar. No. WO / 2012/108864, a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos podem ser adicionalmente enriquecidos durante a métodos de preparação de bibliotecas de modelo. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser enriquecidos para certas ssequências, antes da inserção de transposomes, após a inserção de transposomes, e / ou após a amplificação de ácidos nucleicos.

[0071] Além disso, em algumas concretizações, os ácidos nucleicos alvo e / ou ácidos nucleicos moldes pode ser altamente purificado, por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser, pelo menos, cerca de 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% livre de contaminantes antes do uso com os modos aqui proporcionados. Em algumas concretizações, é benéfica a utilização de métodos conhecidos na arte que se manter a qualidade e tamanho do ácido nucleico alvo, por exemplo, isolamento e / ou transposição directa de DNA alvo pode ser realizada utilizando tamps de agarose.

[0072] Em algumas concretizações, o ácido nucleico alvo pode ser obtido a partir de uma amostra biológica ou uma amostra do paciente. O termo "amostra biolica" ou "amostra do doente", tal como aqui utilizado, inclui as amostras, tais como uma ou mais células, tecidos ou fluidos corporais. "Fluidos corporais" podem incluir, mas não estão limitados a, sangue, soro, plasma, saliva, fluido cerebrospinal, fluido pleural, lágrimas, fluido duto lactal, linfa, saliva, urina, fluido amniótico, ou sêmen. A amostra pode incluir um fluido corporal que é "acelular". Um "fluido corporal acelular" inclui menos do que cerca de 1%> (w / w) de material celular inteira. Plasma ou soro são exemplos de fluidos corporais acelulares. Uma amostra pode incluir uma amostra de origem natural ou sintética (isto é, uma amostra celular feita para ser acelular).

[0073] O termo "plasma", tal como aqui utilizado refere-se ao fluido acelular encontrado no sangue. "Plasma" pode ser obtido a partir do sangue através da remoção de todo o material celular do sangue por meio de métodos conhecidos na arte (por exemplo, centrifugação, filtração e semelhantes).

Certos métodos de preparação de ácidos nucleicos moldes

[0074] Algumas concretizações incluem métodos de preparação de ácidos nucleicos moldes. Tal como aqui utilizado, "ácido nucleico molde" pode referir-se a um substrato para a obtenção de informação de sequência. Em algumas concretizações, um ácido nucleico molde pode incluir um ácido nucleico alvo, um seu fragmento, ou qualquer cópia do mesmo que compreende, pelo menos, uma sequência de transposon, um seu fragmento, ou qualquer cópia do mesmo. Em algumas concretizações, um ácido nucleico molde pode incluir um ido nucleico-alvo que compreende um adaptador de sequenciamento, tais como um local de sequenciamento. Em algumas concretizações, o EC pode compreender um ácido nucleico alvo.

[0075] Alguns métodos de preparação de ácidos nucleicos moldes incluem a inserção de uma sequência de transposon num ácido nucleico alvo, preparando-se assim um ácido nucleico molde. Alguns métodos de inserção incluem o contacto de uma sequência de transposon aqui proporcionado com um ácido nucleico alvo na presença de uma enzima, tal como uma transposase ou integrase, sob condições suficientes para a integração da sequência de transposon ou sequências no ácido nucleico alvo. Em algumas concretizações, um CE pode compreender tal ácido nucleico alvo.

[0076] Em algumas concretizações, a inserção de sequências de transposons para um ácido nucleico alvo pode ser não-aleatória. Em algumas concretizações, as sequências de transposons pode ser contactado com os ácidos nucleicos alvo, compreendendo as proteínas que inibem a integração em certos locais. Por exemplo, sequências de transposons pode ser inibida de integração em proteínas de DNA compreendendo genômicos, o DNA genômico compreendendo cromatina, o DNA genômico compreendendo nucleossomas, ou de DNA compreendendo histonas genómicas. Em algumas concretizações, as sequências de transposons pode ser associado com marcadores de afinidade, a fim de integrar a sequência de transposon a uma sequência particular em um ácido nucleico alvo. Por exemplo, uma sequência de transposon pode estar associada com uma proteína que tem como alvo as sequências específicas de ácido nucleico, por exemplo, histonas, proteas de ligao da cromatina, factores de transcrição, factores de iniciação, etc, e os anticorpos ou fragmentos de anticorpos que se ligam a um determinado nucleico especica de sequência -ácido proteínas de ligação a. Em uma concretização exemplar, uma sequência de transposon está associada com um marcador de afinidade, tal como biotina; marcador de afinidade pode ser associado com uma proteína de ligação de ácido nucleico. Em algumas concretizações, um CE pode compreender tal ácido nucleico alvo.

[0077] Será entendido que durante a integração de algumas sequências de transposons para um ácido nucleico alvo, vários nucleotídeos consecutivos do ácido nucleico alvo no sítio de integração são duplicados no produto integrado. Assim, o produto integrado pode incluir uma sequência duplicado em cada extremidade da sequência integrada no ácido nucleico alvo. Tal como aqui utilizado, o termo "marcador de hospedeiro" ou "g-tag" pode se referir a uma sequência de ácido nucleico alvo que é duplicada em cada uma das extremidades de uma sequência de transposon integrada. As porções de cadeia simples de ácidos nucleicos que podem ser geradas pela inserção de sequências de transposons pode ser reparada por uma variedade de métodos bem conhecidos na arte, por exemplo, utilizando ligases, oligonucleotídeos e / ou polimerases.

[0078] Em algumas concretizações, uma pluralidade das sequências de transpos aqui proporcionados é inserida um ácido nucleico alvo. Algumas concretizações incluem a selecção das condições suficientes para conseguir a integração de uma pluralidade de sequências de transposons para um ácido nucleico alvo de tal modo que a distância média entre cada sequência de transposon integrada compreende um certo número de nucleotídeos consecutivos no ácido nucleico alvo.

[0079] Algumas concretizações incluem as condições de seleção suficientes para conseguir a inserção de uma sequência de transposon ou sequências num ácido nucleico alvo, mas não na outra sequência ou sequências de transposons. Uma variedade de métodos pode ser usada para reduzir a probabilidade de que uma sequência de transposon insere na outra sequência de transposon. Exemplos de tais modos com as concretizações aqui proporcionadas podem ser encontrados em, por exemplo, no Pedido de Patente US No. 2012/0208705, pedido de patente US No. 2012/0208724 e Pedido de Patente Internacional N ° WO 2012/061832, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0080] Em algumas concretizações, as condições podem ser escolhidas, de modo que a distância média de um ácido nucleico alvo de entre as sequências de transposons integrados é, pelo menos, cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou mais nucleotídeos consecutivos. Em algumas concretizações, a distância média de um ácido nucleico alvo de entre as sequências de transposons integrados é, pelo menos, cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, ou mais nucleotídeos consecutivos. Em algumas concretizações, a distância média de um ácido nucleico alvo de entre as sequências de transposons integrados é, pelo menos, cerca de 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 90 kb, 100 kb, ou mais nucleotídeos consecutivos. Em algumas concretizações, a distância média de um ácido nucleico alvo entre sequências de transposons integrados é, pelo menos, cerca de 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 1000 kb, ou mais nucleotídeos consecutivos. Como será compreendido, algumas condições que podem ser seleccionados incluem o contacto de um ácido nucleico alvo com um certo número de sequências de transposons.

[0081] Algumas concretizações dos métodos aqui descritos incluem selecionar condições suficientes para conseguir a integração de pelo menos uma porção das sequências de transposons para um ácido nucleico alvo que são diferentes. Em concretizações preferenciais dos métodos e composições aqui descritos, cada sequência de transposon integrada num alvo de ácido nucleico é diferente. Algumas condições que podem ser seleccionados para conseguir a integração de uma certa porção de sequências de transposons em sequências alvo que são diferentes incluem seleccionar o grau de diversidade da população de sequências de transposons. Como será entendido, a diversidade de sequências de transposons surge em parte devido à diversidade dos barcodes de tais sequências de transposons. Consequentemente, algumas concretizações incluem o fornecimento de uma população de sequências de transposons, em que pelo menos uma parte dos barcodes são diferentes. Em algumas concretizações, pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de barcodes em uma população de sequências de transposons são diferentes. Em algumas concretizações, pelo menos uma porção das sequências de transposons integrados em um ácido nucleico alvo são o mesmo.

[0082] Algumas concretizações da preparação de um ácido nucleico matriz pode incluir copiando as sequências que compreendem o ácido nucleico alvo. Por exemplo, algumas concretizações incluem a hibridização de um primer para um local de iniciadores de uma sequência de transposon integrada no ácido nucleico alvo. Em algumas de tais concretizações, o iniciador pode ser hibridado com o local de iniciador e estendida. As sequências copiadas podem incluir pelo menos uma sequência barcode e pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo. Em algumas concretizações, as sequências copiadas podem incluir uma primeira sequência de barcode, uma segunda sequência de barcode, e pelo menos uma porção de um ácido nucleico alvo colocada entre elas. Em algumas concretizações, pelo menos um ácido nucleico copiado pode incluir pelo menos uma primeira sequência barcode de um ácido nucleico primeiro copiados que podem ser identificados ou designadas para ser emparelhado com uma segunda sequência barcode de um segundo ácido nucleico copiado. Em algumas concretizações, o iniciador pode incluir um iniciador de sequenciamento. Em algumas concretizações os dados de sequenciamento são obtidos utilizando o iniciador de sequenciamento. Em mais concretizações, os adaptadores compreendendo locais de iniciadores que pode ser ligado a cada extremidade de um ácido nucleico, e o ácido nucleico amplificado a partir de tais locais iniciadores.

[0083] Algumas concretizações da preparação de um ácido nucleico matriz pode incluir sequências de amplificação que compreendem pelo menos uma porção de uma ou mais sequências de transposons e pelo menos uma porção de um ácido nucleico alvo. Em algumas concretizações, pelo menos uma porção de um ácido nucleico alvo pode ser amplificado utilizando iniciadores que hibridizam com sequências de locais de iniciador de transpos integrada integrados num ácido nucleico alvo. Em algumas de tais concretizações, um ácido nucleico amplificado pode incluir uma primeira sequência barcode, e a segunda sequência barcode possuindo pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo colocada entre elas. Em algumas concretizações, pelo menos um ácido nucleico amplificado pode incluir pelo menos uma primeira sequência barcode de um primeiro ácido nucleico amplificado que pode ser identificado para ser emparelhado com uma segunda sequência barcode de uma segunda sequência amplificada.

[0084] Alguns métodos de preparação de ácidos nucleicos moldes incluem sequências de inserção de transposons, compreendendo ligantes de cadeia simples. Em um exemplo, sequências de transposons (ME-Pl-ligante-P2-Me; mosaico local-l-ligante do iniciador local final iniciador-2- mosaico de extremidade) são inseridos num ácido nucleico alvo. O ácido nucleico alvo tendo as sequências de transposons / ligantes inseridas pode ser estendida e amplificada.

[0085] Em uma concretização das composições e métodos aqui descritos, são utilizados transposomas que têm sequências finais simétricas transponível para produzir um fragmento de ácido nucleico marcado com final alvo (fragmento marcador ou de marcação). Por conseguinte, cada fragmento marcado contém extremidades idênticas, faltando direcionalidade. Um único iniciador de PCR, utilizando as sequências da extremidade transposon, pode, então, ser empregue para amplificar o número de cópias do molde a partir de 2n a 2n * 2 x em que x corresponde ao número de ciclos de PCR. Num passo subsequente, o PCR com os iniciadores pode adicionar sequências adicionais, tais como sequências adaptadoras de sequenciamento.

[0086] Em algumas concretizações, pode ser vantajoso para cada ácido nucleico molde para incorporar pelo menos um local iniciador universal. Por exemplo, um ácido nucleico molde pode incluir sequências primeira extremidade que compreende um primeiro local iniciador universal, e sequências segunda extremidade, que compreendem um segundo local iniciador universal. Os locais de iniciadores universais podem ter várias aplicações, tais como a utilização na amplificação, sequenciamento, e / ou a identificação de um ou mais moldes de ácidos nucleicos. Os primeiro e segundo locais de iniciadores universais podem ser o mesmo, substancialmente semelhante, semelhante ou diferente. Os locais de iniciadores universais podem ser introduzidos em ácidos nucleicos através de vários métodos bem conhecidos na arte, por exemplo, ligao de locais iniciadores para os ácidos nucleicos, a amplificação de ácidos nucleicos utilizando iniciadores atado, e a inserção de uma sequência de transposon compreendendo um local iniciador universal.

Transposomas

[0087] Um "transpossoma" compreende uma enzima, tal como uma integração de integrase ou de transposase, e um ácido nucleico compreendendo um local de reconhecimento de integração, tal como um local de reconhecimento da transposase. Em concretizações aqui proporcionadas, a transposase pode formar um complexo funcional com um local de reconhecimento da transposase que é capaz de catalisar uma reação de transposição. A transposase pode ligar-se ao sítio de reconhecimento da transposase e inserir o local de reconhecimento da transposase em um ácido nucleico alvo dentro do CE em um processo, por vezes denominado "marcação". Em algumas de tais eventos de inserção, uma cadeia do local de reconhecimento da transposase pode ser transferido para o ácido nucleico alvo. Em um exemplo, um transpossoma compreende uma transposase dimica que compreende duas subunidades, e duas sequências de transposons não contíguos. Num outro exemplo, uma transposase compreende uma transposase dimica que compreende duas subunidades, e uma sequência de transposon contígua.

[0088] Algumas concretizações podem incluir o uso de uma transposase Tn5 hiperactivo e um local de Tn5-tipo de reconhecimento pela transposase (Goryshin e Reznikoff, J. Biol Chem, 273:7367 (1998)), ou MuA transposase e um local de reconhecimento da transposase Mu compreendendo Rl e sequências da extremidade R2 (Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983; Savilahti, H, et al, EMBO J., 14: 4893, 1995). ME sequências também podem ser utilizados como optimizadas por um perito na arte. As referências anteriores são aqui incorporadas por referência.

[0089] Mais exemplos de sistemas de transposição que pode ser utilizados com certas concretizações das composições e métodos aqui proporcionados incluem Staphylococcus aureus Tn552 (Colegio et al., J. Bacteriol., 183: 2384-8, 2001; Kirby C et al., Mol. Microbiol., 43: 173-86, 2002), Ty1 (Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22: 3765-72, 1994 and International Publication WO 95/23875), Transposon Tn7 (Craig, N L, Science. 271: 1512, 1996; Craig, N L, Review in: Curr Top Microbiol Immunol., 204:27-48, 1996), Tn/O and IS10 (Kleckner N, et al., Curr Top Microbiol Immunol., 204:49-82, 1996), Mariner transposase (Lampe D J, et al., EMBO J., 15: 5470-9, 1996), Tc1 (Plasterk R H, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 204: 125-43, 1996), P Element (Gloor, G B, Methods Mol. Biol., 260: 97-114, 2004), Tn3 (Ichikawa & Ohtsubo, J Biol. Chem. 265:18829-32, 1990), bacterial insertion sequences (Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 1-26, 1996), retroviruses (Brown, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:2525-9, 1989). Mais exemplos incluem IS5, TnlO, Tn903, IS911, e versões modificadas de enzimas da família da transposase (Zhang et al, (2009) PLoS Genet 5: el000689 Epub 2009 16 de outubro; Wilson C. et al (2007) J. Microbiol. métodos 71:332-5). As referências anteriores são aqui incorporadas por referência.

[0090] Mais exemplos de integrases que podem ser utilizadas com os métodos e composições aqui proporcionados incluem integrases retrovirais e as sequências de reconhecimento para a integrase tais integrases retrovirais, tais como integrases de VIH-1, VIH-2, VIS, PFV-1, RSV. Sequências de transposons

[0091] Algumas concretizações das composições e métodos aqui proporcionados incluem sequências de transposons. Em algumas concretizações, uma sequência de transposon inclui pelo menos um local de reconhecimento da transposase. Em algumas concretizações, uma sequência de transposon inclui pelo menos um local de reconhecimento da transposase e, pelo menos, um barcode. As sequências de transposons úteis com os métodos e composições aqui proporcionados são fornecidos no pedido de patente US No. 2012/0208705, pedido de patente US No. 2012/0208724 e Pedido de Patente Internacional N° WO 2012/061832, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas concretizações, uma sequência de transposon inclui um primeiro local de reconhecimento da transposase, um segundo local de reconhecimento da transposase, e um barcode disposto entre os mesmos.

Transposomas com sequências de transposons não contíguas

[0092] Alguns transposomas aqui proporcionados incluem uma transposase que compreende duas sequências de transposons. Em algumas de tais concretizações, as duas sequências de transposons não estão ligadas um a outra, em outras palavras, as sequências de transposons não são contíguas uma com a outra. Exemplos de tais transposomas são conhecidos no estado da técnica, ver por exemplo, Pedido de Patente US No. 2010/0120098, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Estruturas em loop

[0093] Em algumas concretizações, um transpossoma compreende um ácido nucleico que se liga sequência de transpos duas subunidades de transposase para formar um "loop complexo" ou um "transpossoma loop". Em um exemplo, um transpossoma compreende uma transposase dimérica e uma sequência de transposon. Os complexos em loop podem garantir que transposons sejam inseridos no DNA alvo, mantendo a encomenda informação do DNA alvo original e sem fragmentar o DNA alvo. Como será apreciado, as estruturas em loop podem inserir iniciadores, barcodes, os índices e semelhantes, num ácido nucleico alvo, mantendo ao mesmo tempo a conectividade física do ácido nucleico alvo. Em algumas concretizações, o EC pode compreender o ácido nucleico alvo. Em algumas concretizações, a sequência de transposon de um transpossoma anelada pode incluir um local de fragmentação, tal que a sequência de transposon podem ser fragmentados para criar um transpossoma compreendendo duas sequências de transposons. Tais transposomes são úteis para assegurar que os vizinhos fragmentos de DNA alvo, em que a inserção de transposons, recebem combinação de códigos que podem ser montados de forma inequívoca a uma fase posterior do ensaio.

Certos métodos de preparação de sequências de transposons

[0094] As sequências de transposons aqui proporcionados podem ser preparados por uma variedade de métodos. Os modos exemplificativos incluem a síntese directa e métodos de extensão de gancho. Em algumas concretizações, as sequências de transposons pode ser preparado por síntese directa. Por exemplo, uma sequência de transpos que compreende um ácido nucleico podem ser preparados por métodos que compreendem a síntese química. Tais métodos são bem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, síntese em fase sólida utilizando fosforamideto precursores, tais como os derivados de protegidos 2'-desoxinucleósidos, ribonucleotídeos, ou anogos de nucleido. Exemplo métodos de preparação de sequenciamento do transpos podem ser encontrados em, por exemplo, Pedido de Patente US Pub. No. 2012/0208705, pedido de patente US Pub. No. 2012/0208724 e Int. Pedido de Patente Pub. N ° WO 2012/061832, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0095] Em algumas concretizações que compreendem transposomes laçados, sequências de transposons compreendendo um ico ligante cadeia simples pode ser preparada. Em algumas concretizações, os pares ligantes das sequências de transposons de uma transpossoma de tal modo que uma sequência de transpos que compreende uma primeira sequência de reconhecimento da transposase está acoplada a uma segunda sequência de transpos que compreende uma segunda sequência de reconhecimento da transposase na direcção 5' para 3'. Em algumas concretizações, os pares de sequências ligantes um transpos que compreende uma primeira sequência de reconhecimento da transposase a uma segunda sequência de transposons compreendendo uma segunda sequência de reconhecimento da transposase em 5' para 5' ou orientação em uma orientação 3' para 3'. Acoplamento sequências de transposons de uma transpossoma quer em uma orientação 5' para 5' ou em 3' para 3' pode ser vantajoso para impedir que os elementos de reconhecimento pela transposase, em particular os elementos de mosaico (ME ou M), a partir de interagir uma com a outra. As sequências de transposons acoplados pode ser preparado através da preparação de sequências de transposons compreendendo ou um grupo aldeído ou grupo oxiamina. Os grupos aldeído e oxiamina podem interagir para formar uma ligação covalente de acoplamento, assim, as sequências de transposons.

[0096] Em algumas concretizações, transposomes compreendendo sequências complementares podem ser preparados. Em uma concretização, uma transposase é carregado com sequências de transposons compreendendo caudas complementares. As caudas de hibridar para formar uma sequência de transposon ligada. A hibridação pode ocorrer em condições diluídas para diminuir a probabilidade de hibridação entre transposomes.

Inserção alvejada

[0097] Em algumas concretizações dos métodos e composições aqui proporcionados, sequências de transpos podem ser inseridas em determinadas sequências alvo de um ácido nucleico alvo.

[0098] Transposição para o dsDNA pode ser mais eficiente do que em metas ssDNA. Em algumas concretizações, DNAcd é desnaturada em DNAcs e recozido com sondas de oligonucleotídeos (20-200 bases). Estas sondas de criar locais de dsDNA que podem ser eficazmente utilizados como locais de integração com transposomes aqui proporcionados. Em algumas concretizações, dsDNA pode ser alvejado usando a formação de D-ciclo com sondas oligo recA-revestidos, e a subsequente formação de triplex. Em algumas de tais concretizações, o anel D é um substrato preferido para transposomes compreendendo Tn4430 de transposase. Em mais concretizações, as regíons de interesse em dsDNA pode ser alvo utilizando proteínas, tais como complexos de dedos de zinco, e outros ligandos de afinidade para regíons específicas de DNA de ligação ao DNA específica da sequência.

[0099] Em algumas concretizações, transposomas compreendendo uma transposase tendo um substrato preferido de posições desencontradas em um ácido nucleico alvo pode ser usado para alvejar a inserção no ácido nucleico alvo. Por exemplo, alguns transposases MUA, como HYPERMU (Epicenter), têm uma preferência por alvos incompatíveis. Em algumas de tais concretizações, as sondas de oligonucleotídeos compreendendo uma incompatibilidade são recozidos para um ácido nucleico alvo de cadeia simples. Transposomas compreendendo transposases mua, tal como HYPERMU, podem ser utilizados para direccionar as sequências desemparelhadas do ácido nucleico alvo.

Elemento de Preservação de Contigüidade (CE)

[00100] O Elemento de preservação de contiguidade (CE) é uma entidade física que preserva pelo menos dois, ou mais, ou todos os analitos em estreita proximidade (ou contiguidade) através de uma ou mais etapas de ensaio e fornece acesso a reagentes de ensaio e podem ser reunidas e divididas várias vezes sem perder a proximidade dos analitos.

[00101] Em algumas concretizações, o EC pode ser um suporte sólido. Em uma concretização, o EC pode ser uma emulsão ou uma gota. Em algumas concretizações, a CE é em gel, hidrogel, ou de esferas de gel. Em algumas concretizações, o EC pode compreender um suporte sólido tal como contas. Em algumas concretizações, as esferas podem compreender adicionalmente anticorpos, oligonucleotídeos, e / ou barcodes. Em outra concretização, a CE pode constituir um Nanoball DNA criado por WGA, a RCA, ou condensação de um reagente de ácido nucleico.

[00102] Em algumas concretizações, um CE pode ser feito através da incorporação do ácido nucleico a partir de células ou de uma única célula, ou o produto de amplificação do mesmo (em WGA, etc) em uma matriz de polímero, tal como agarose, poliacrilamida, alginato, etc. Em alguns concretizações, a contiguidade do conteúdo das células ou de uma única célula dentro de um CE são mantidas por preservar a proximidade física dos componentes uns aos outros por meio de encapsulamento (tal como em uma matriz de polímero), a imobilização sobre um grânulo ou aprisionamento, de forma eficaz mantendo informações contigüidade dentro da CE através de rondas repetidos de partilha e redistribuição. A característica de que uma colecção de CE pode ser reunida e divisão de forma independente, feito reagir com reagentes de ensaio, reunidas e novamente dividida, etc ainda mantendo a contiguidade dos analitos que constituam uma CE indivíduo permite a indexação combinatória através de diferentes passos de divisão e de piscina.

[00103] Em algumas concretizações, os analitos no elemento de preservação de contiguidade são acessíveis a reagentes de ensaio, incluindo soluções aquosas, enzimas (por exemplo, fragmentases, polimerases, ligases, transposases, quinases, endonucleases de restrição, proteases, fosfatases, lipases), adaptadores de ácidos nucleicos, ácidos nucleicos barcodes, marcadores.

[00104] Em algumas concretizações, a CE compreende células ou em uma única célula. Em algumas concretizações, a CE compreende ácido nucleico a partir de células ou de uma única célula, tal como DNA, RNAm, ou de cDNA; macromoléculas de células ou de uma única célula, incluindo as proteínas, polissacáridos, lipídeos e ácidos nucleicos, bem como pequenas moléculas, tais como os metabolitos primários, secundários e metabolitos produtos naturais a partir de células ou de uma única célula. Em algumas concretizações, o ácido nucleico é submetido a amplificação, tais como, PCR ou amplificao do genoma inteiro, antes de formar o CE que compreende o ácido nucleico. Em algumas concretizações, a análise do DNA e de RNAm pode ser realizada em paralelo.

[00105] Em algumas concretizações, um ou mais analitos de um CE é marcado com uma ou mais marcadores. Os marcadores exemplificativos incluem, mas não se limitam a barcodes de DNA ou índices, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, barcodes ou índices de RNA, marcadores radioativos, anticorpo que compreende um marcador, grânulos compreendendo uma marcação.

[00106] Em algumas concretizações, um modo pode incluir as etapas de (a) compartimentar o CE que compreende ácido nucleico alvo em uma pluralidade de primeiros recipiente; (B) proporcionar um primeiro índice para o ácido nucleico alvo de cada primeiro recipiente, obtendo-se assim um primeiro ácido nucleico indexada; (c) combinar os primeiros ácidos nucleicos indexados; (d) compartimentar os primeiros ácidos nucleicos moldes indexados dentro de uma pluralidade de segundo vasos; (e) fornecimento de um segundo índice do primeiro ácido nucleico molde indexado de cada segundo recipiente, obtendo-se assim um segundo ácido nucleico indexado. Os passos ae pode ser continuado com ciclos adicionais de uma ou mais etapas da série AE para derivar compartimentos virtuais adicionais. Este método de indexação combinatória pode ser usado para criar eficazmente um grande número de compartimentos virtuais a partir de um número limitado de compartimentos físicas.

[00107] Em algumas concretizações, um modo pode incluir as etapas (a) proporcionar um CE que compreende analitos não-ácido nucleico (por exemplo, proteases) com os repórteres de ácidos nucleicos ligados; (B) compartimentar a CE para uma pluralidade de primeiros vasos; (C) fornecimento de um primeiro índice para o alvo repórteres de ácidos nucleicos de cada primeiro recipiente, obtendo-se assim um primeiro repórter ácido nucleico alvo indexada; (c) combinar a primeira repórteres de ácido nucleico indexados; (d) compartimentar os primeiros EC indexados em uma pluralidade do segundo vasos, (e) fornecimento de um segundo índice para os primeiros repórteres de ácido nucleico indexados de cada segundo recipiente, obtendo-se, assim, um segundo repórter ácido nucleico indexado. As etapas a-e podem ser continuadas com ciclos adicionais de uma ou mais etapas da série AE para derivar compartimentos virtuais adicionais. A etapa compartimentalização pode ainda incluir a amplificação de ácido nucleico ou passo de captura, tal como PLA, PEA ou outra técnica que captura ou amplifica ácidos nucleicos.

[00108] Em algumas concretizações, a, embebidas em parafina de tecido fixado em formalina pode ser dividido em secções, com cada secção adicionado a uma CE. Cada CE pode ser posteriormente analisadas quanto ao teor ou a sequência e em um estágio posterior de um mapa 2D ou 3D pode ser obtido do conteúdo de cada lâmina.

[00109] Em algumas concretizações, um ácido nucleico ou ácidos nucleicos podem ser incorporados em uma matriz que limita os ácidos nucleicos a um espaço definido, mas permite acesso reagente para efectuar os passos, incluindo, mas não limitado a, a amplificação (RCP, a amplificação de todo o genoma, do iniciador aleatório extensão, etc.), ligação, transposição, hibridização, digestão de restrição e a mutagese de DNA. Exemplos de mutagénese incluem, mas não estão limitados a, extensão propenso a erros, alquilação, conversão de bissulfito, e desaminases (citidina) induzida por activação, etc.

[00110] Em algumas concretizações, métodos e composições que utilizam o EC pode ser combinado em conjunto com abordagens de montagem mutagénicos para melhorar grandemente a montagem da informação da sequência de DNA. O DNA genômico pode ser fragmentado e repartiu-se em pluralidade de EC, com cada EC que compreende uma fracção do genoma. Diferentes fracções do genoma de receber barcodes diferentes, permitindo que as fracções do genoma a ser montada de forma independente. Um dos maiores desafios é a montagem de repetições. Um método para montar repetições é descrito por Levy, D. e Wigler, M. (2014) de contagem sequência facilitado e montagem por mutagénese molde. Proc. do Natl. Acad. Sci., I ll (43). E4632-E4637. ISSN 0027-8424. abordagens de montagem também são discutidos em US20140024537, intitulado: métodos e sistemas para Determinar Haplotipos e faseamento de haplótipos e este pedido é incorporado por referência na sua totalidade. As referências anteriores são aqui incorporadas por referência.

[00111] Para os métodos que combinam particionamento de fragmentos de DNA com uma mutagénese ou particionamento abordagem relacionada pode ser realizada com CE, poços, índices índices virtuais, compartimentos físicas, gotas etc. A mutagénese pode ser realizada por vários métodos que incluem mas não estão limitados a propenso a erros extensão, alquilação, conversão de bissulfito, e desaminases (citidina) induzida por activação, etc. O método de particionamento de ácido nucleico para dentro de EC e abordagem de mutagénese pode ser útil onde os métodos convencionais torná-la difícil de montar repetições ou regíons difíceis.

[00112] Em algumas concretizações, os modos aqui apresentados podem ser utilizados para faseamento variante, (de novo) montagem do genoma, rastreio de populações de células para determinar heterogeneidade entre a população e determinar diferenças célula-a-célula.

[00113] Em algumas concretizações, de DNAc a partir de células ou de uma única célula é isolado em vasos e convertido para um CE que é indexada através da abordagem compartimentação virtual como descrito acima. Isso permite que a expressão do gene e de perfis transcrito a partir de 1000, 10.000', 100.000' s e ainda maior número de diferentes bibliotecas de células individuais indexados.

[00114] Em algumas concretizações, o número de células isoladas que pode ser analisado é de aproximadamente 10% do número total dos compartimentos virtuais devido à amostragem de Poisson. Para um esquema de indexação de quatro camadas com compartimentos de 96 poços em cada etapa, um total de 10% X96X96X96X96 = mais de 8 milhões de células simples podem ser analisadas em uma experiência utilizando um total de 4 X 96 = 384 compartimentos físicas. No exemplo da Fig. 3, quatro passos de diluição e de agrupamento combinatoric são usados para criar um grande número de compartimentos virtuais (um conjunto de moléculas ou elementos da biblioteca de DNA que contêm uma combinação única de índice). Neste exemplo, o recipiente de DNA contíguo é criado por encapsulação do conteúdo de uma única célula em uma matriz de polímero (por exemplo, PAM = poliacrilamida). Na concretização particular preferida para a análise genómica, o conteúdo de DNA genômico da célula única são amplificados por MDA (uma reação de amplificação WGA múltiplo de deslocamento). Este produto único celular MDA constitui o recipiente de DNA que prossegue através do esquema de indexação combinatória. Para expressão do gene, uma preparação de DNAc de célula única pode ser feita a partir do vaso de célula única como descrito por Picelli (Picelli, 2014). Na concretização preferida, os índices iniciais estão ligados ao DNA genômico ou DNAc através de técnicas de preparação de bibliotecas convencionais, utilizando fragmentação (enzimática) e ligação de adaptador, ou através marcação utilizando complexos de transposase. Na concretização preferida, os índices subsequentes estão ligados à biblioteca através de ligação ou de PCR. Ligadura é o preferido, pois é fácil de adicionar adaptadores indexados de uma forma sequencial. O passo final pode envolver apenas indexado PCR ou ligadura e PCR.

[00115] Em algumas concretizações, o ácido nucleico alvo é de histona / protegido-proteína (ver Buenrostro et al. Nature Methods 10, 1213-1218 (2013) doi: 10.1038 / nmeth.2688, aqui incorporada por referência). As aplicações incluem perfis epigenômicos, e a análise da cromatina aberta e proteínas de ligação de DNA e a posição do nucleossoma.

[00116] Em algumas concretizações, elementos de preservação de contiguidade podem compreender uma única célula e o ácido nucleico da célula pode ser amplificado. Subsequentemente, cada elemento de contiguidade preservando pode ser indexado de forma única por meio do esquema de indexação combinatória. O sequenciamento de leituras curtas pode ser agrupado com base no índice exclusivo. Longo sintético lê pode ser individualmente de novo montado com base no índice único (McCoy et al PlosOne 2014 (DOI: 10.1371 / revista pone.0106689) Illumina TruSeq sintético longo Lê capacitar De Novo Montagem e Resolver complexo, altamente repetitivo Transponíveis Elementos, aqui incorporada por referência)

[00117] Em algumas concretizações, CE pode compreender conteúdo de uma célula, por exemplo, proteínas, organelos, RNA, DNA, ribossomas, anticorpos, esteróides, estruturas especializadas, glicanos, lipídeos, moléculas pequenas, molulas que podem afectar uma via biológica, mono e polissacarídeos, alcalóides e metabólitos primários e secundários.

[00118] Em algumas concretizações, os organelos dentro da CE pode ser diferencialmente manchado. Exemplos de reagentes de coloração são organelos organelo alvo proteínas fluorescentes (Cellular Luzes ™), clássico manchas de organelos ou conjugados de corante que selectivamente ou não selectivamente pode rotular organelos ou estruturas celulares.

[00119] Em algumas concretizações, um analito de interesse em uma CE é uma proteína. As proteínas podem ser marcadas com barcodes ou marcadores alternativos. O barcode ou os marcadores podem ser lidos utilizando matrizes tradicionais ou métodos baseados em sequência. Proximidade abordagens de ligação e sequências de anticorpo de índice pode ser utilizado para detectar proteínas (Fredriksson et al Nature Biotechnology 20, 473 -. 477 (2002), aqui incorporado por referência) em conjunto com a detecção das sequências de barcode para determinar a identidade e a abundância de proteínas em cada célula individual. As proteínas podem ser marcadas por vários métodos (www.piercenet.com/cat/protein- antibody-labeling) conhecidos por um técnico versado no assunto, incluindo, in vivo e em estratégias de marcação química específicas do local in vitro.

[00120] Proximidade de ligação (Duo-ligação PLA, www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular- biology/molecular-biology-products.html?TablePage=l 12232138, Multiplexado proximidade ligadura ensaio EP 2714925 Al) é um exemplo para a detecção de proteínas, as interações proteína- proteína, e modificações pós-tradução que podem ser adaptados para utilização num elemento de preservação contiguidade. Este método pode ser usado para detectar e quantificar uma determinada proteína ou complexo de proteínas em um elemento de contiguidade preservação. Um exemplo de um fluxo de trabalho é o seguinte: (1) fazer contiguidade elemento ou elementos de preservar, (2) lavar e adicionar um par ou pares de anticorpos primários específicos para a proteína de interesse, (3) lavar e marcar com anticorpos marcados com barcodes. Cada população de elementos contiguidade preservando em um recipiente recebe um anticorpo marcado de barcode diferente. Através proximidade ligadura o par ou pares de anticorpos primários, produtos amplificáveis pode ser formado que contém um barcode único para uma proteína específica. Um barcode pode ser específica para a proteína de interesse, enquanto outros barcodes são usadas para atribuir a proteína a uma contiguidade específica elemento e ou célula preservar. Através de uma ou mais etapas de frações split- and-Pool podem ser diferencialmente marcadas. Como tal, o teor de elementos de preservação de contiguidade individuais pode ser analisado sem a necessidade de processar cada contiguidade preservando elementos individualmente em diversos passos paralelos. É particularmente uma grande vantagem para processar 10, 100, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000. 100000000 e mais elementos de preservação de contiguidade em uma tal maneira. Esteróides e moléculas pequenas pode ser detectados de um modo semelhante ao descrito para as proteínas. Os anticorpos de barcode marcado pode ser desenvolvido para esteróides (Hum Reprod 1988 Jan; 3 (l):63-8 Anticorpos contra esteróides Bosze P et al Alternativamente, conjugados de corante fluorescente e radioactivas foram descritos (www jenabioscience.eom / cm.. / en / l / / catálogo 2305_fluorescent_hormones. html). Estes conjugados de anticorpo para os esteróides podem ser processadas como descrito acima. Vários métodos podem ser usados para detectar um ou mais componentes da contiguidade elemento de preservação. Um ou mais componentes do elemento de preservação de contiguidade pode ser marcado com quimio- luminescentes, fluorescentes, sondas radioativas, de DNA- tags, barcodes e índices. As estratégias de amplificação podem ser utilizadas para melhorar o sinal. Por exemplo, a amplificação em círculo rolante (RCA) pode ser utilizado para detectar analitos. Os produtos RCA podem posteriormente ser detectados por sequenciamento, descodificadores fluorescentes (sondas). Além disso, micromatrizes, arrays de proteínas, sequenciamento, sequenciamento nano poros, sequenciamento da próxima geração, capilar de eletroforese, grânulo-matriz pode ser usado para leitura.

Estabelecimento de contiguidade do conteúdo de uma célula

[00121] Em algumas concretizações, a contiguidade do conteúdo das células ou a partir de uma única célula, por exemplo, mas não limitado a DNA, RNA, proteína, organelas, metabolitos, moléculas pequenas podem ser preservada num elemento de preservação de contiguidade (CE). Um CE pode ser criado por vários métodos, incluindo, mas não se limitando a encapsular o conteúdo dentro de uma gotícula, a incorporação do conteúdo em uma matriz polimérica (depois de encapsulação), e a fixação dos conteúdos para um grânulo. Na concretização preferida, o EC é permeável aos reagentes do ensaio, tais como tampões aquosos, enzimas (polimerases, ligases, transposases, etc.), nucleotídeos, oligonucleotídeos adaptadores, transposons, e iniciadores, etc. As bibliotecas indexadas são criadas a partir deste CE, tal como descrito acima. Ciclos repetidos de diluição em compartimentos físicas, fixação de índices específicos do compartimento, o agrupamento e rediluição em compartimentos adicionais leva a uma criação exponencial de vários compartimentos virtuais. Se desenhado apropriadamente, o conteúdo de cada EC, no fim, será praticamente indexado com um barcode único. Como um exemplo na Fig. 1, um esquema de indexação quatro camadas conduz a um grande número de compartimentos virtuais e os índices (> 84 milhões) com apenas 4X96 = 384 no total compartimentos físicas. Na concretização preferida, os índices específicos de compartimento são adicionados em cada camada compartimentalização através de marcação, ligação ou PCR. Na concretização preferida, cada compartimento físico em cada etapa tem um índice único. A compartimentalização subsequente pode usar os mesmos ou diferentes índices. Se os mesmos índices são usados a partir de uma camada de compartimentação para o outro, a posição do índice dentro da cadeia de sequência final irá identificar o compartimento e a camada de compartimentação.

Análise de componentes celulares que utilizam gotículas

[00122] Em uma concretização, o EC pode ser uma emulsão ou uma gota. Em uma concretização, o CE é uma gotícula em contato com o óleo. Em um exemplo, CE compreendendo ácido nucleico inclui a diluição e particionamento de uma amostra de ácido nucleico em gotas, compartimentos ou grânulos. Em uma concretização, a gotícula compreende células ou em uma única célula. Em uma concretização, o CE compreendendo células individuais inclui a diluição e particionamento de uma única célula em gotas, compartimentos ou grânulos.

[00123] Em algumas concretizações, uma "gota" pode ser um volume de líquido num atuador de gota que é pelo menos parcialmente delimitada por um fluido de enchimento. Por exemplo, uma gotícula pode ser completamente rodeada por fluido de enchimento ou pode ser delimitado por um fluido de enchimento e um ou mais superfícies de um actuador de gotícula. Gotículas pode assumir uma grande variedade de formas; os exemplos no limitativos incluem, geralmente, em forma de disco, em forma de bala, esfera truncada, elipsóide, esférica, esfera parcialmente comprimida, hemisférica, ovóide, cilíndrico, e várias formas formadas durante as operações de gota, tal como fusão ou divisão ou formada como um resultado do contacto de tais formas com uma ou mais superfícies de um actuador de gotícula.

[00124] Os atuadores de gotículas são utilizados para realizar uma grande variedade de operações de gotículas. Um atuador de gotículas inclui, tipicamente, dois substratos separados por um espaço. Os substratos incluem eletrodos para a realização de operações de gotículas. O espaço é geralmente preenchido com um fluido de enchimento que é imiscível com o líquido que é para ser manipulado sobre o actuador de gotícula. Superfícies expostas ao espaço são tipicamente hidrofóbicos. Análise do material genético (genômica) e a sua expressão (genica funcional), proteômica, análise de biblioteca combinatória e outras aplicações bioanaliticas multiplexados pode ser realizada em gotículas e as seguintes operações podem ser realizadas sobre o atuador análise de gotículas. Os métodos de manipulação de gotículas utilizando actuador de gotícula são divulgados nos Pedido US 20100130369 e US 20130203606, respectivamente, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.

[00125] "Atuador de gotículas " significa um dispositivo para a manipulação de gotículas. Para exemplos de actuadores de gotículas, ver Pamula et al., U.S. Patent No. 6,911,132, intitulado “Apparatus for Manipulating Droplets by Eletrowetting-Based Techniques” emitido em 28 de junho de 2005; Pamula et al., U.S. Patent Pub. No. 20060194331, intitulado “Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board” publicado em 31 de agosto de 2006; Pollack et al., International Patent Pub. No. WO/2007/120241, intitulado “Droplet-Based Biochemistry” publicado em 25 de outubro de 2007; Shenderov, U.S. Patent No. 6,773,566, intitulado “Eletrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same” emitido em 10 de agosto de 2004; Shenderov, U.S. Patent No. 6,565,727, intitulado “Actuators for Microfluidics Without Moving Parts” emitido em 20 de maio de 2003; Kim et al., U.S. Patent Pub. No. 20030205632, intitulado “Eletrowetting-driven Micropumping” publicado em 06 de novembro de 2003; Kim et al., U.S. Patent Pub. No. 20060164490, intitulado “Method and Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Drops from a Nozzle” publicado em 27 de julho de 2006; Kim et al., U.S. Patent Pub. No. 20070023292, intitulado “Small Object Moving on Printed Circuit Board” publicado em 01 de fevereiro de 2007; Shah et al., U.S. Patent Pub. No. 20090283407, intitulado “Method for Using Magnetic Particles in Droplet Microfluidics,” publicado em 19 de novembro de 2009; Kim et al., U.S. Patent Pub. No. 20100096266, intitulado “Method and Apparatus for Real-time Feedback Control of Eletrical Manipulation of Droplets on Chip” publicado em 22 de abril de 2010; Velev, U.S. Patent No. 7,547,380, intitulado “Droplet Transportation Devices and Methods Having a Fluid Surface” emitido em 16 de junho de 2009; Sterling et al., U.S. Patent No. 7,163,612, intitulado “Method, Apparatus and Article for Microfluidic Control via Eletrowetting, for Chemical, Biochemical and Biological Assays and the Like” emitido em 16 de janeiro de 2007; Becker et al., U.S. Patent No. 7,641,779, intitulado “Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing” emitido em 5 de janeiro de 2010; Becker et al., U.S. Patent No. 6,977,033, intitulado “Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing” emitido em 20 de dezembro de 2005; Decre et al., U.S. Patent No. 7,328,979, intitulado “System for Manipulation of a Body of Fluid” emitido em 12 de fevereiro de 2008; Yamakawa et al., U.S. Patent Pub. No. 20060039823, intitulado “Chemical Analysis Apparatus” publicado em 23 de fevereiro de 2006; Wu, U.S. Patent Pub. No. 20110048951, intitulado “Digital Microfluidics Based Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes” publicado em 3 de março de 2011; Fouillet et al., U.S. Patent Pub. No. 20090192044, intitulado “Eletrode Addressing Method” publicado em 30 de julho de 2009; Fouillet et al., U.S. Patent No. 7,052,244, intitulado “Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a Micro-catenary Line by Eletrostatic Forces” emitido em 30 de maio de 2006; Marchand et al., U.S. Patent Pub. No. 20080124252, intitulado “Droplet Microreactor,” publicado em 29 de maio de 2008; Adachi et al., U.S. Patent Pub. No. 20090321262, intitulado “Liquid Transfer Device,” publicado em 31 de dezembro de 2009; Roux et al., U.S. Patent Pub. No. 20050179746, intitulado “Device for Controlling the Displacement of a Drop Between Two or Several Solid Substrates,” publicado em 18 de agosto de 2005; and Dhindsa et al., “Virtual Eletrowetting Channels: Eletronic Liquid Transport with Continuous Channel Functionality” Lab Chip, 10:832-836 (2010), cujas descrições completas são aqui incorporadas por referência. Alguns atuadores de gotículas irão incluir um ou mais substratos dispostos com um intervalo entre as operações de gotículas e eletrodos associados com (por exemplo, em camadas sobre, ligados a, e / ou incorporado em) um ou mais substratos e disposto para realizar uma ou mais operações de gotículas. Por exemplo, certos actuadores de gotículas irá incluir um substrato de base (inferior ou), eletrodos de operações de gota associado com o substrato, uma ou mais camadas dieléctricas em cima do substrato e / ou eletrodos, e, opcionalmente, uma ou mais camadas hidrofóbicas por cima do substrato, camadas dielétricas e / ou os eletrodos de formar uma superfície de operações de gotículas. Um substrato de topo pode também ser fornecida, a qual está separado da superfície de operações de gotículas por um intervalo, vulgarmente referido como uma abertura operações de gotículas. Vários arranjos de eletrodos na parte superior e / ou substratos de fundo são discutidos nas patentes e pedidos acima referenciados e certos arranjos de eletrodos de novos são discutidas na descrição da presente divulgação. Durante as operações de gotículas prefere-se que gotículas permanecem em contacto permanente ou frequente contacto com um eletrodo de terra ou de referência. Um eletrodo de terra ou de referência pode ser associado com o substrato de topo voltada para a abertura, o substrato de fundo de frente para a abertura, na lacuna. Quando os eletrodos são fornecidos em ambos os substratos, contactos eltricos para acoplamento dos eletrodos para um actuador do instrumento gota para controlar ou monitorar os eletrodos podem ser associados com uma ou ambas as placas. Em alguns casos, os eletrodos sobre um substrato são acoplados eletricamente ao outro substrato, de modo que apenas um substrato está em contacto com o actuador de gotícula. Em uma concretização, um material condutor (por exemplo, um epoxi, tal como Sistema de Polímero MESTRE BOND ™ EP79, disponível a partir de Master Bond, Inc., Hackensack, NJ) proporciona a ligação eléctrica entre os eletrodos sobre um substrato e trajectórias eléctricas em outros substratos , por exemplo, um eletrodo de terra em um substrato de topo pode ser acoplado a um caminho eléctrico sobre um substrato de fundo por um tal material condutor. Quando são utilizados vários substratos, um espador pode ser fornecida entre os substratos para determinar a altura do intervalo entre elas e definem no actuador de distribuição reservatórios. A altura do espaçador pode, por exemplo, ser, pelo menos, cerca de 5 μm, 100 μm, 200 μm, 250 μm, 275 μm ou mais. Em alternativa ou adicionalmente, a altura do espador pode ser, no máximo, cerca de 600 μm, 400 μm, 350 μm, 300 μm, ou menos. O espaçador pode, por exemplo, ser formado de uma camada de projecções, formar os substratos superiores ou inferiores, e / ou um material inserido entre os substratos de topo e de fundo. Uma ou mais aberturas podem ser proporcionadas em um ou mais substratos para formar uma passagem de fluido através do qual o líquido pode ser emitido para dentro do intervalo operações de gotículas. A uma ou mais aberturas podem, em alguns casos, ser alinhada para a interacção com um ou mais eletrodos, por exemplo, alinhado de modo que o líquido flui através da abertura vai entrar em proximidade suficiente com um ou mais eletrodos de operações de gotas para permitir uma operação de gotícula de ser efectuada por os eletrodos de operações de gotículas através do líquido. A base (ou inferior) e substratos de topo pode, em alguns casos, ser formados como um componente integral. Um ou mais eletrodos de referência pode ser fornecida sobre a base (ou inferior) e / ou substratos de topo e / ou no espaço. Exemplos de arranjos de eletrodos de referência são fornecidos nas patentes e pedidos de patente referenciados acima. Em várias concretizações, a manipulação de gotículas por um actuador de gotícula pode ser mediada eletrodo, por exemplo, eletroumectação mediada ou dieletroforese mediada ou força de Coulomb mediada. Exemplos de outras técnicas para operações de gotículas de controlo que podem ser utilizados nos actuadores de gotículas da presente divulgao incluem o uso de dispositivos que induzem a pressão fluídica hidrodinâmico, tais como aqueles que operam com base em princípios mecânicos (por exemplo, bombas de seringa externos, bombas de membrana pneumáticos, vibrando bombas de membrana, dispositivos de vácuo, as forças centrífugas, bombas piezoelétricas / ultra- sónicos e as forças acústicas); princípios eléctricos ou magnéticos (por exemplo, fluxo eletro-osmótico, bombas eletrocinéticas, tampões ferrofluidic, bombas eletro, atracção ou repulsão utilizando forças magnéticas e bombas magnetohidrodinâmicas); princípios termodinâmicos (por exemplo, a geração de bolhas de gás de fase induzida por mudança de expansão / volume); outros tipos de princípios- molhagem de superfície (por exemplo, eletroumectação e optoeletrowetting, bem como gradientes de tensão superficial quimicamente, termicamente, induzidas estruturalmente e radioactivamente); gravidade; tensão de superfície (por exemplo, a acção capilar); forças eletrostáticas (por exemplo, fluxo eletro-osmótico); fluxo centrífugo (substrato disposto sobre um disco compacto e rodado); forças magnéticas (por exemplo, íons de oscilação faz com que o fluxo); forças magnetohidrodinâmicas; e vácuo ou pressão diferencial. Em certas concretizações, as combinações de duas ou mais das técnicas anteriores podem ser empregados para realizar uma operação de gotícula em um actuador gotícula da presente divulgação. Do mesmo modo, um ou mais dos anteriores podem ser utilizadas para entregar líquido para um fosso operações de gotas, por exemplo, a partir de um reservatório em outro dispositivo ou a partir de um reservatório externo do actuador de gotículas (por exemplo, um reservatório associado com um substrato gota actuador e um trajectória de escoamento a partir do reservatório para dentro do intervalo operações de gotículas). As operações de superfícies de gotículas de determinadas actuadores de gotículas da presente divulgao pode ser feita a partir de materiais hidrofóbicos ou pode ser revestido ou tratado para torná-los hidrofóbico. Por exemplo, em alguns casos, uma parte ou todas as superfícies de operações de gotículas podem ser derivatizados com materiais ou produtos químicos na superfície de baixa energia, por exemplo, por deposição ou utilizando na síntese in situ utilizando compostos tais como poli- ou per-fluorados compostos em solução ou monómeros polimerizáveis. Exemplos incluem TEFLON® AF (disponível a partir de DuPont, Wilmington, DE), os membros da família CYTOP de materiais, revestimentos na família FLUOROPEL® de revestimentos hidrofóbicos e hidrofóbicas (disponível a partir de Cytonix Corporation, Beltsville, MD), os revestimentos de silano, revestimentos fluorosilane, derivados de fosfonato hidrofóbicas (por exemplo, os vendidos por Aculon, Inc), e revestimentos eletrônicos NOVEC ™ (disponível a partir de 3M Company, St. Paul, MN), outros monómeros fluorados para deposição de vapor químico melhorado por plasma (PECVD), e (organossiloxano por exemplo, SiOC) por PECVD. Em alguns casos, a superfície de operações de gotículas pode incluir um revestimento hidrófobo ter uma espessura que varia de cerca de 10 nm a cerca de 1000 nm. Além disso, em algumas concretizações, o substrato de topo do actuador de gotícula inclui um polímero orgânico condutor de eletricidade, a qual é então revestida com um revestimento hidrofóbico ou de outro modo tratado para tornar as operações de gotículas superfície hidrofóbica. Por exemplo, o polímero orgânico eletricamente condutor que é depositada sobre um substrato de plástico pode ser poli (3,4-etilenodioxitiofeno) poli (estireno) (PEDOT: PSS). Outros exemplos de polímeros eletricamente condutores orgânicos e camadas condutoras alternativas são descritas na Pollack et al., Patente Internacional N° WO / 2011/002957, intitulado "Gota actuador Aparelhos e Métodos", publicado em 6 de Janeiro de 2011, toda a divulgação da qual é aqui incorporada por referência. Um ou ambos os substratos podem ser fabricados utilizando uma placa de circuito impresso (PCB), vidro, óxido de índio e estanho (ITO) de vidro revestidas com, e / ou materiais semicondutores como o substrato. Quando o substrato é vidro ITO revestido, o revestimento de ITO é de preferência uma espessura de pelo menos cerca de 20 nm, 50 nm, 75 nm, 100 nm ou mais. Em alternativa ou adicionalmente, a espessura pode ser, no máximo, cerca de 200 nm, 150 nm, 125 nm ou menos. Em alguns casos, a parte superior e / ou substrato de fundo inclui um substrato de PCB que é revestido com um dieléctrico, tal como um dieléctrico de poliimida, o qual pode, em alguns casos também ser revestidos ou de outro modo tratado para tornar as operações de gotículas superfície hidrofóbica. Quando o substrato inclui um PCB, os materiais seguintes são exemplos de materiais adequados: MITSUI ™ BN-300 (disponível a partir de Mitsui Chemicals America, Inc., San Jose CA); ARLON ™ da ONU (disponível a partir de Arlon, Inc, Santa Ana, CA) .; NELCO® N4000-6 e N5000-30 / 32 (disponível de Park Eletrochemical Corp., Melville, NY); ISOLA ™ FR406 (disponível a partir de Isola Group, Chandler, AZ), especialmente IS620; família de fluoropolímero (adequado para a detecção da fluorescência, uma vez que tem baixa fluorescência de fundo); poliimida família; poliéster; naftalato de polietileno; policarbonato; poliéter; polímero de cristal líquido; copolímero de ciclo-olefina (COC); polero de ciclo-olefina (COP); aramida; THERMOUNT® reforço não tecido de aramida (disponível a partir de DuPont, Wilmington, DE); fibra NOMEX® marca (disponível a partir de DuPont, Wilmington, DE); e papel. Vários materiais são também adequados para utilização como o componente dielétrico do substrato. Os exemplos incluem: O vapor depositado dieléctrico, tal como PARYLENE ™ C (especialmente em vidro), PARYLENE ™ N, e HT PARYLENE ™ (em alta temperatura, ~ 300 ° C) (disponível a partir de Parylene revestimento Services, Inc., Katy, TX) ; revestimentos de TEFLON® AF; CYTOP; soldermasks, tais como líquidos soldermasks photoimageable (por exemplo, no PCB) como a série TAIYO ™ PSR4000, PSR TAIYO ™ e série AUS (disponíveis a partir de Taiyo América, Inc. Carson City, NV) (boas características térmicas para aplicações envolvendo controlo térmico), e PROBIMER ™ 8165 (boas características térmicas para aplicações envolvendo controlo térmico (disponível a partir da Huntsman avançada Materiais Americas Inc., Los Angeles, CA); soldermask de película seca, tal como os da linha soldermask filme seco VACREL® (disponível a partir de DuPont, Wilmington, dE); dieléctricos de película, tais como a película de poliimida (por exemplo, filme de poliimida KAPTON®, disponível a partir de DuPont, Wilmington, dE), de polietileno, e polímeros de flúor (por exemplo, FEP), politetrafluoroetileno, poliéster; naftalato de polietileno; copolímero de ciclo-olefina (COC ); polero de ciclo-olefina (COP); qualquer outro material de substrato PWB listados acima; resina de matriz negra; polipropileno; e pretas materiais de circuitos flexíveis, tais como DuPont ™ Pyralux® HXC e DuPont ™ Kapton® MBC (ava ilable de DuPont, Wilmington, DE). A tensão de transporte de gotas e de frequência pode ser seleccionada para um desempenho com os reagentes utilizados em protocolos de ensaio específicos. parâmetros de concepção pode ser variada, por exemplo, o número e a colocação dos reservatórios sobre- actuador, o número de ligações dos eletrodos independentes, o tamanho (volume) de diferentes reservatórios, a colocação de imans / zonas de lavagem do grânulo, o tamanho do eletrodo, passo entre eletrodos, e a altura lacuna (entre a parte superior e inferior substratos) pode ser variado para utilização com reagentes específicos, protocolos, os volumes de gotas, etc. em alguns casos, um substrato da presente divulgação podem ser derivatizados com materiais ou produtos químicos na superfície de baixa energia, por exemplo, utilizando a deposição ou em síntese in situ utilizando os compostos poli- ou per-fluorados em solução ou monómeros polimerizáveis. Exemplos incluem revestimentos de TEFLON® AF e revestimentos FLUOROPEL® para imersão ou revestimento por pulverização, outros monómeros fluorados para deposição de vapor químico aumentada por plasma (PECVD), e organo-siloxano (por exemplo, SiOC) por PECVD. Além disso, em alguns casos, uma parte ou a totalidade da superfície de operações de gotículas pode ser revestido com uma substância para reduzir o ruído de fundo, tais como o fundo de fluorescência a partir de um substrato de PCB. Por exemplo, o revestimento redutor de ruído pode incluir uma resina de matriz negra, tais como as resinas de matriz negra disponíveis a partir de indústrias Toray, Inc., Japão. Os eletrodos de um atuador de gotícula são tipicamente controlada por um controlador ou um processador, que por si só é fornecida como parte de um sistema, que pode incluir as funções de processamento, bem como de dados e armazenamento de software e recursos de entrada e de saída. Os reagentes podem ser proporcionados no actuador gota a lacuna operações de gotas ou em um reservatório ligado hidraulicamente à lacuna operações de gotículas. Os reagentes podem estar na forma líquida, por exemplo, gotas, ou eles podem ser fornecidos em uma forma reconstituivel no intervalo operações de gotas ou em um reservatório ligado hidraulicamente à lacuna operações de gotículas. Os reagentes reconstituíveis podem normalmente ser combinadas com líquidos para reconstituição. Um exemplo de reagentes reconstituíveis adequados para uso com os métodos e aparelhos aqui estabelecido inclui os descritos em Meathrel et al., Patente US N ° 7.727.466, intitulada "Películas para diagnóstico desintegrável Devices", concedida em 1 de junho de 2010, toda a divulgação dos quais é aqui incorporado por referência.

[00126] "Operação de gotícula" significa qualquer manipulação de uma gotícula num actuador de gotícula. Uma operação de gotículas podem, por exemplo, incluem: o carregamento de uma gota para o actuador de gotículas; dispensar uma ou mais gotas de uma gota de fonte; divisão, separação ou dividindo uma gota em duas ou mais gotículas; o transporte de uma gotícula a partir de um local para outro, em qualquer direcção; fusão ou combinando duas ou mais gotículas em uma única gotícula; diluindo uma gotícula; mistura de uma gotícula; agitar uma gotícula; deformando uma gotícula; retenção de uma gotícula em posição; incubação de uma gotícula; aquecimento de uma gotícula; vaporizar uma gotícula; arrefecimento de uma gotícula; dispondo de uma gotícula; o transporte de uma gotícula de um actuador de gotículas; outras operações de gotículas aqui descrito; e / ou qualquer combinação dos anteriores. Os termos "Merge", "fusão", "combinar", "combinando" e similares são usadas para descrever a criação de uma gota de dois ou mais gotas. Deve entender-se que quando um tal termo é usado em referência a duas ou mais gotículas, pode ser utilizada qualquer combinação de operações de gotículas que são suficientes para resultar na combinação das duas ou mais gotas em uma gotícula. Por exemplo, "fusão de gota A com gotícula B", pode ser conseguida através do transporte gota uma em contacto com uma gotícula estacionária B, o transporte de gotícula B em contacto com uma gotícula estacionária A, ou o transporte de gotas de A e B em contacto uns com os outros. Os termos "separadoras", "separadoras" e "divisória" não pretendem implicar qualquer resultado específico no que diz respeito ao volume de gotículas resultantes (isto é, o volume das gotículas resultantes podem ser o mesmo ou diferente) ou o número de gotículas resultantes (o número de gotículas resultantes podem ser 2, 3, 4, 5 ou mais).

[00127] O termo "mistura" refere-se a gota operações que resultam na distribuição mais homogénea de um ou mais componentes dentro de uma gotícula. Os exemplos de operações de gotículas "carregamento" incluem o carregamento de microdiálise, pressão assistida carga, o carregamento robótico, carregamento passivo, e o carregamento pipeta. As operações de gotículas pode ser mediada por eletrodo.

[00128] Em alguns casos, as operações de gotículas são ainda mais facilitadas pelo uso de regíons hidrófilas e / ou hidrófobas nas superfícies e / ou por obstáculos físicos. Para exemplos de operações de gotículas, ver as patentes e pedidos de patente citados acima, sob a definição de "actuador gota." As técnicas de detecção de impedância ou capacitância ou de imagem, por vezes, pode ser utilizado para determinar ou confirmar o resultado de uma operação de gotícula. Exemplos de tais técnicas são descritas em Sturmer et al., Patente US Pub. No. 20100194408, intitulada "Detecção de capacitância em um Gota Actuador", publicada em 5 de agosto de 2010, toda a divulgação da qual é aqui incorporada por referência. De um modo geral, as técnicas de detecção ou de imagiologia podem ser utilizados para confirmar a presença ou ausência de uma gota em um eletrodo específico. Por exemplo, a presença de uma gotícula dispensado no eletrodo de destino na sequência de uma operação de distribuição de gotículas confirma que a operação de distribuição de gotículas era eficaz. De igual modo, a presença de uma gotícula num local de detecção num passo apropriado num protocolo de ensaio pode confirmar que um conjunto anterior de operações de gotículas tem sucesso na produção de uma gota para detecção. O tempo de transporte de gotículas pode ser bastante rápido. Por exemplo, em diversas concretizações, o transporte de uma gotícula a partir de um eletrodo para o outro pode ser superior a cerca de 1 segundo, ou cerca de 0,1 segundos, ou cerca de 0,01 segundos, ou cerca de 0,001 seg. Em uma concretização, o eletrodo é operado no modo de corrente alternada, mas é comutada para o modo de DC para imagiologia. É útil para a realização de operações de gotas para a área da pegada de gota para ser semelhante a área eletrowetting; em outras palavras, lx-, 2x- 3x-gotas são utilmente controladas operadas com 1, 2, e 3 eletrodos, respectivamente. Se a pegada gotícula é maior do que o número de eletrodos disponíveis para a realização de uma operação de gotícula em um dado momento, a diferença entre o tamanho das gotículas e o número de eletrodos normalmente não deve ser maior do que 1; em outras palavras, uma gotícula 2x é utilmente controlada utilizando um eletrodo e uma gota 3x é utilmente controlada usando 2 eletrodos. Quando as gotas incluem grânulos, é útil para o tamanho das gotas a ser igual ao número de eletrodos de controle da gotícula, por exemplo, transportar a gota.

[00129] Em alguns aspectos, uma biblioteca de ácido nucleico pode ser preparada a partir de células ou de uma única célula utilizando EC, tais como gotas. Em algumas concretizações, as células podem ser suspensas num tampão. Em algumas concretizações, a suspens de culas pode ser introduzido a um actuador de gotícula. Usando eletrodo mediada matriz operações de gotículas de gotículas contendo suspensão de células pode ser dispensado de tal modo que cada gotícula compreende uma única célula. Usando operações de gotículas de eletrodos mediada, matriz de gotas de reagente compreendendo tampão de lise de células pode ser dispensado (gotas de tampão de lise). As gotas de tampão de lise e a matriz de suspensão de células gotículas contendo as células individuais podem ser combinados usando operações de eletrodos mediada para formar uma gota de lisado celular de tal modo que a gotícula lisado celular compreendem componentes das células individuais. Os reagentes de reação que compreendem barcodes único de ácido nucleico, transposons e enzimas adequadas (por exemplo, fragmentases, polimerases, ligases, transposases, reverse transcriptases etc.) pode ser apresentado a um actuador de gotícula. Em algumas concretizações, os transposons e / ou os barcodes podem compreender locais de ligação de iniciadores. Usando operações de gotículas de eletrodos mediada por uma série de gotas de reagente compreendendo os reagentes da reação podem ser dispensados, de tal modo que cada gotícula compreende reagente de barcodes de ácido nucleico únicas e enzimas adequadas. As gotículas de lisado celular e as gotículas de reagentes podem ser combinados usando operações de eletrodos mediada para formar uma matriz de primeira gota de barcode em que o ácido nucleico a partir de uma única célula são actuadas pelas enzimas a partir das gotas de reagente de modo a que os ácidos nucleicos que compreendem um barcode. Em algumas concretizações, o RNAm dentro das gotículas de lisado celular pode ser transcrito de forma inversa, quando gotas de lisado celular e as gotículas de reagentes são combinados e o DNAc podem compreender barcodes. Em algumas concretizações, os barcodes podem compreender locais de ligação de iniciadores e índices moleculares únicas. Usando operações de gotículas de eletrodos mediada, a primeira gota de barcode podem ser combinados adicionalmente várias vezes com gotículas de reagente para gerar conjuntos de segundos de gotículas de barcode, gotas terceiro barcodes, etc. Em algumas concretizações, para cada ciclo de combinação, os barcodes são diferentes. Deste modo múltiplos ciclos de combinar as gotículas de barcode com as gotas de reagente vai gerar barcodes de combinatória. No final do ácido nucleico a partir das diferentes gotículas podem ser reunidas e sequenciado. A informação de sequenciamento pode revelar informação de sequenciamento do ácido nucleico a partir da cula, e, opcionalmente, também identificar a fonte de ácidos nucleicos (por exemplo, células ou de uma única célula). Tal informação é útil se o ácido nucleico compreende uma mutao associada com uma doença como a doença genética hereditária, ou cancro.

[00130] Em alguns aspectos, os modos do presente pedido podem ser aplicados para proteômica. Uma matriz de talão contendo gotículas pode ser feito através da introdução de suspensão grânulos a um actuador de gotícula para dispensar uma matriz de gotículas da suspensão de esferas de modo que cada gotícula na gama de gotículas compreender um único cordão (ver Pedido de Patente US Publicação 20100130369, aqui incorporado por referência). Os grânulos podem compreender anticorpos ou outras sondas de afinidade (ver imobilizada Biomoléculas em análise. A Practical Approach. Cass T, Ligler FS, eds. Oxford University Press, New York, 1998. pp 1-14, aqui incorporada por referência, para a fixação típico protocolos). Em algumas concretizações, os anticorpos podem ser específicos para os epítopos de superfície celular. Em algumas concretizações, os anticorpos podem ser monoclonais e em outras concretizações, os anticorpos podem ser policlonais. Usando operações de gotículas de eletrodos mediada, uma matriz de gotas de suspensão de esferas pode ser combinada com uma matriz de gotículas contendo as células individuais para se obter uma matriz de células em gotículas de talão de tal modo que os anticorpos nas pérolas se ligam às proteínas da superfície celular. Em algumas concretizações, os anticorpos podem ser específicos para a proteína dentro de uma célula. Usando operações de gotículas de eletrodos mediada, uma matriz de gotas de suspensão de esferas pode ser combinada com uma matriz de gotículas contendo lisados celulares individuais de tal modo que os anticorpos nas pérolas se ligam às proteínas dentro de uma célula para produzir uma matriz de proteína em gotículas de grânulo. Opcionalmente, utilizando operações de gotículas de eletrodos mediada, a matriz de proteína em gotículas de grânulo pode ser combinada com uma série de gotas de reagente compreendendo os reagentes de marcação de proteínas, tais que as proteínas podem ser marcadas de forma única. As proteas ligadas podem ser detectados a partir dos marcadores associados ou por outros meios (eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, ELISA, etc.). A identidade da proteína e a fonte da proteína pode ser determinada. Em algumas concretizações, os dados de proteômica pode ser correlacionado com os dados de sequenciamento.

[00131] Em algumas concretizações, os anticorpos podem ser específicos para outras biomoléculas e não se limitando a uma proteína. Tais biomoléculas podem incluir, mas não estão limitados a polissacarídeos ou lipídeos. Em algumas concretizações, a identidade e a fonte de tais biomoléculas pode ser correlacionada com os sequence data gerados acima. Análise celular in situ

[00132] Em algumas concretizações, as células e os seus componentes podem ser analisados in situ. Em algumas concretizações, as células podem ser autorizadas a passar através de uma célula de fluxo.

[00133] Tal como aqui utilizado, o termo "célula de fluxo" é entendido significar uma câmara que possui uma superfície através da qual um ou mais dos fluidos reagentes pode ser vertido. De um modo geral, uma célula de fluxo terá uma abertura de entrada e uma abertura de saída para facilitar o fluxo de fluido. Exemplos de células de fluxo e sistemas relacionados fluídicos e plataformas de detecção que podem ser prontamente utilizados nos métodos da presente divulgação são descritas, por exemplo, em Bentley et al, Nature 456: 53-59 (2008), documento WO 04/018497; US 7057026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7329492; US 7211414; US 7315019; US 7.405.281, e US 2008/0108082, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.

[00134] Em algumas concretizações, as células de fluxo podem albergar matrizes. As matrizes utilizadas para a sequenciamento de ácido nucleico têm, frequentemente, padrões espaciais aleatórios de características de ácidos nucleicos. Por exemplo, HiSeq ™ ou plataformas de sequenciamento MiSeq ™ disponível a partir de Illumina Inc. (San Diego, CA) utiliza células de fluxo em que as matrizes de ácidos nucleicos são formadas por nucleação aleatório seguido por amplificação ponte. No entanto, as matrizes estampadas também podem ser utilizadas para a sequenciamento de ácidos nucleicos ou de outras aplicações analíticas. As matrizes modelado exemplificativos, métodos para a sua produção e métodos para a sua utilização são apresentados em US Ser. No. 13 / 787,396; US Ser. No. 13 / 783,043; US Ser. No. 13 / 784,368; US Pat. Aplicativo. Bar. No. 2013/0116153 Al; e US Pat. Aplicativo. Bar. No. 2012/0316086 Al, cada uma das quais é aqui incorporada por referência. As características de tais matrizes estampadas podem ser usadas para capturar uma única molécula molde de ácido nucleico para semear subsequente formação de uma colónia homogénea, por exemplo, através de amplificação de ponte. Tais matrizes estampadas são particularmente úteis para aplicações de sequenciamento de ácidos nucleicos.

[00135] Em algumas concretizações, a superfície da célula de fluxo pode compreender porções de captura, tais como anticorpos para imobilizar as células que passam através dela sobre a superfície da célula de fluxo. Em algumas concretizações, os anticorpos de superfície da célula de fluxo podem ligar-se especificamente para a célula proteínas de superfície. Em algumas concretizações, os anticorpos podem ligar-se especificamente para a célula proteínas da superfície de células cancerosas, enriquecendo assim as células cancerosas na superfície da célula de fluxo.

[00136] Em algumas concretizações, as células podem ser classificadas em vários tipos de tecnologia de separação de células conhecidos na técnica antes de passar as células para dentro da célula de fluxo. a tecnologia de separação de células exemplares incluem, mas não estão limitados a selecção de células activadas fluorescentes, ou por FACS que utiliza a citometria de fluxo, de células Magnética-activado triagem (MACS) (Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA), ou pela técnica de separação de células sem coluna em que um tubo de células marcadas é colocado dentro de um campo magnético. As células positivamente selecionadas são retidas no tubo, enquanto as células seleccionadas negativamente estão em suspensão líquida (STEMCELL Technologies Inc., Vancouver, BC, Canadá).

[00137] Em algumas concretizações, as células que passam através da célula de fluxo podem ser lisadas dentro da célula de fluxo e libertando assim o ácido nucleico de células (DNA e RNA) na célula de fluxo. Em algumas concretizações, as células são imobilizadas na célula de fluxo antes da lise. Os métodos de lise celular são conhecidos no estado da técnica que incluem, mas não se limitando a ultra-sons, tratamento com protease, por choque osmótico, tratamento de alto teor salino. Em algumas concretizações, o RNA inteira pode ser transcrito de modo reverso. Em algumas concretizações, barcodes único podem ser introduzidos para o ácido nucleico a partir das células, por exemplo, o DNA, RNA ou DNAc. Métodos de introdução de barcodes para um ácido nucleico são discutidos acima e incluem, mas não estão limitados a marcação usando tecnologia Nextera™, ligases, polimerases. Em algumas concretizações, os barcodes pode ser útil para identificação da fonte celular. Em algumas concretizações, os barcodes podem ter sítios de ligação de iniciadores. Em algumas concretizações pode ser introduzida no ácido nucleico múltiplos barcodes. Em algumas concretizações, os vários barcodes são diferentes uns dos outros. Em algumas concretizações, o ácido nucleico com barcodes pode ser difundido; reunidas novamente e podem ser introduzidos barcodes adicionais. Em algumas concretizações, durante ou após a introdução dos barcodes, o ácido nucleico pode ser fragmentado. Em algumas concretizações, o ácido nucleico fragmentado pode ser amplificado antes da difusão na célula de fluxo. Em algumas concretizações, o ácido nucleico fragmentado compreendendo os barcodes pode ser difundido para uma parte diferente das sondas de captura compreendendo célula de fluxo e imobilizada na cula de fluxo. Em algumas concretizações, o ácido nucleico imobilizado fragmentado pode ser submetido a ponte de amplificação.

[00138] Em algumas concretizações dos aspectos acima, a célula passar através da célula de fluxo é de uma única célula. Em algumas concretizações, todo o transcriptoma pode ser avaliada. Em algumas concretizações, o DNA e o RNA a partir de células ou de uma única célula pode ser avaliada simultaneamente para a informação da sequência. Em algumas concretizações, as proteínas a partir de células ou de uma única célula pode ser avaliada para a identidade e informação de sequência. Em algumas concretizações, outros analitos a partir de células ou de uma única célula, tais como, lipídeos, carboidratos, organelas celulares podem ser avaliadas.

Fragmentando ácidos nucleicos moldes

[00139] Algumas concretizações da preparação de um ácido nucleico matriz pode incluir fragmentando um ácido nucleico alvo. Em algumas concretizações, os adaptadores de barcode ou indexadas estão ligados ao ácido nucleico alvo fragmentado. Os adaptadores podem ser ligados usando qualquer número de métodos bem conhecidos na técnica, tais como ligação (enzimática ou química), marcação, extensão de polimerase, e assim por diante. Em algumas concretizações, a inserção de transposomes compreendendo sequências de transposons não-contíguos podem resultar em fragmentação de um ácido nucleico alvo. Em algumas concretizações que compreendem loop de transposomas, um ácido nucleico alvo compreendendo sequências de transposons pode ser fragmentado nos locais de fragmentação das sequências de transposons. Outros exemplos de método útil para ácidos nucleicos alvo fragmento com as concretizações aqui proporcionadas podem ser encontrados em, por exemplo, Pedido de Patente US Pub. No. 2012/0208705, pedido de patente US Pub. No. 2012/0208724 e Int. Pedido de Patente Pub. N ° WO 2012/061832, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Marcação de moléculas individuais

[00140] A presente invenção fornece métodos para marcação de moléculas de modo que as moléculas individuais podem ser rastreadas e identificadas. Os dados em massa podem então ser deconvoluídos e convertido de volta para a molécula individual. A capacidade para distinguir as moléculas individuais e relacionar a informação para trás para a molécula de origem é especialmente importante quando os processos de molécula original ao produto final alterar a representação (estequiométrica) da população original. Por exemplo, a amplificação leva a uma duplicação (por exemplo, PCR ou amplificao duplicados tendenciosa) que pode distorcer a representação inicial. Isto pode alterar o estado de metilação de chamada, número de cópias, proporção alélica devido à amplificação não uniforme e / ou amplificação de polarização. Através da identificação de moléculas individuais, o código de codificação distingue entre moléculas idênticas após o processamento. Como tal, duplicações, e polarização de amplificação pode ser filtrada para fora, permitindo a determinação exacta da representação original de uma molécula ou população de moléculas.

[00141] Uma vantagem de moléculas individuais exclusivamente de marcação é que as moléculas idênticas no pool original tornaram identificada exclusivamente em virtude de sua marcação. De acordo com outras análises a jusante, estas moléculas marcadas de forma única podem agora ser distinguidos. Esta técnica pode ser explorada em esquemas de ensaio no qual é empregada a amplificação. Por exemplo, a amplificação é conhecida para distorcer a representação original de uma população mista de moléculas. Se a marcação original não foi empregada, a representação inicial (tal como o número da cópia ou proporção alélica) seria necessário ter em conta as tendências (conhecido ou desconhecido) para cada molécula na representação. Com a marcação única, a representação com precisão pode ser determinada através da remoção de duplicados e contando a representação inicial de moléculas, cada uma tendo uma marcação singular. Assim, os DNAc que pode ser amplificado e sequenciado, sem medo de viés, porque os dados podem ser filtrados de modo a que apenas a sequências ou sequências autênticas de interesse são seleccionados para posterior análise. A leitura precisa pode ser construída tomando o consenso em toda a muitas leituras com o mesmo barcode.

[00142] Em algumas concretizações das composições e métodos aqui descritos, é preferido para marcar a população original, nos estágios iniciais do ensaio, embora de marcadorgem pode ocorrer em fases posteriores, se os passos anteriores não introduzir viés ou não são importantes. Em qualquer uma dessas aplicações, a complexidade das sequências de barcode deve ser maior do que o número de moléculas individuais a ser marcado. Isto assegura que as moléculas alvo diferentes receber marcas diferentes e únicos. Como tal, um conjunto de oligonucleotídeos aleatórios de um certo comprimento (por exemplo, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 ou 200 nucleotídeos de comprimento) é desejável. Uma associação aleatória de marcadores representa uma grande complexidade de marcadores com espaço código de 4" em que n é o número de nucleotídeos. Os códigos adicionais (se concebidos ou aleatória) pode ser incorporado em diferentes fases para servir como um controlo adicional, tal como uma verificação de paridade para correção de erro.

[00143] Em uma concretização das composições e métodos aqui descritos, as moléculas individuais (tais como DNA alvo) estão ligados a marcadores únicos, tais como sequências e / ou barcodes oligo exclusivos. Fixação dos marcadores pode ocorrer através de ligação, a química de acoplamento, de adsorção, a inserção de sequências de transposons, etc. Outros meios incluem amplificação (por exemplo, por PCR, LCR ou RCA), a cópia (tais como a adição de uma polimerase) e interações não-covalentes.

[00144] Os métodos específicos compreendem, incluindo barcodes {por exemplo, concebidos ou sequências aleatórias) para iniciadores de PCR de modo a que cada molde vai receber um código individual no interior do espaço de código, obtendo-se desse modo produtos de amplificação únicos que podem ser discriminados a partir de outros produtos de amplificação. Este conceito pode ser aplicado a qualquer método que utiliza amplificação da polimerase, tais como ensaios e ensaios ™ GoldenGate divulgados na Patente US N° 7.582.420, N° 7.955.794 e No. 8.003.354, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. As sequências alvo marcadas com códigos podem ser circularizado e amplificadas por métodos de amplificação, tais como a laminagem-circular para produzir amplics de código-marcado. Da mesma forma, o código pode também ser adicionado ao RNA Métodos de ácidos nucleicos de análise modelo

[00145] Algumas concretizações da tecnologia descrita na presente invenção incluem os métodos de análise de ácidos nucleicos moldes. Em tais concretizações, a informação de sequenciamento pode ser obtida a partir de ácidos nucleicos moldes e esta informação pode ser utilizada para gerar uma representação de sequência de um ou mais ácidos nucleicos alvo.

[00146] Em algumas concretizações dos métodos de sequenciamento descritos no presente documento, pode ser utilizada uma estratégia ler ligado. A estratégia de ler ligada pode incluir dados de identificação seqüenciamento que liga pelo menos duas leituras de sequenciamento. Por exemplo, uma primeira leitura de sequenciamento pode conter um primeiro marcador, e uma segunda leitura de sequenciamento pode conter um segundo marcador. Os primeiro e segundo marcadores pode identificar os dados de sequenciamento de cada sequenciamento ler para ser adjacente em uma representação sequência do ácido nucleico alvo. Em algumas concretizações das composições e métodos aqui descritos, os marcadores podem compreender uma primeira sequência barcode e uma segunda sequência barcode, em que a primeira sequência barcode pode ser emparelhado com a segunda sequência de barcode. Em outras concretizações, os marcadores podem compreender um primeiro tag hospedeiro e um segundo tag hospedeiro. Em mais concretizações, os marcadores podem compreender uma primeira sequência barcode com um primeiro tag hospedeira, e uma segunda sequência barcode com um segundo tag hospedeiro.

[00147] Uma concretização exemplar de um método para a sequenciamento de um ácido nucleico matriz pode compreender os seguintes passos: (a) sequência da primeira sequência barcode utilizando um iniciador que hibrida sequenciamento ao local primeiro iniciador; e (b) sequência da segunda sequência barcode utilizando um iniciador de sequenciamento se hibridar com o segundo iniciador. O resultado é que duas leituras de sequência de ligação ajuda o ácido nucleico molde para os seus vizinhos genômicas. Os fragmentos de biblioteca suficientes dado o tempo suficiente de leitura, e curtas, estas duas leituras podem ser mescladas informaticamente para fazer uma leitura longa que cobre todo o fragmento. Usando a sequência barcode e leiturada sequência de nucleotídeos duplicada presente a partir da inserção, as leituras podem agora ser ligadas aos seus vizinhos genômicos para formar muito mais tempo "leitura ligada" in silico.

[00148] Tal como será entendido, uma biblioteca compreendendo ácidos nucleicos moldes podem incluir fragmentos de ácidos nucleicos em duplicado. Sequenciamento de fragmentos de ácido nucleico é duplicado vantajosamente em métodos que incluem a criação de uma sequência de consenso para fragmentos duplicados. Tais métodos podem aumentar a precisão para proporcionar uma sequência de consenso para um ácido nucleico molde e / ou biblioteca de ácidos nucleicos moldes.

[00149] Em algumas concretizações da tecnologia de sequenciamento aqui descrito, a análise da sequência é executada em tempo real. Por exemplo, a sequenciamento em tempo real pode ser realizada através da aquisição e análise de dados de sequenciamento simultaneamente. Em algumas concretizações, um processo de sequenciamento para se obter dados de sequenciamento pode ser encerrado em vários pontos, incluindo após, pelo menos, uma porção de um conjunto de dados de sequência de ácido nucleico alvo é obtido ou antes de toda a leitura do ácido nucleico é sequenciado. Métodos exemplares, sistemas, e outras concretizações são fornecidas na Publicação internacional de patente WO 2010/062913, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[00150] Em uma concretização exemplificativas de um método para a montagem de curto sequenciamento leituras utilizando uma estratégia de leitura ligado, sequências de transposons compreendendo barcodes são inseridos no DNA genômico, uma biblioteca é preparada e os dados de sequenciamento é obtida para a biblioteca de ácidos nucleicos moldes. Blocos de modelos podem ser montados através da identificação de barcodes emparelhados e depois contigs maiores são montados. Em uma concretização, o conjunto de leituras podem ainda ser montadas em sequências contuas maiores por meio de código de emparelhamento utilizando sobreposição lê.

[00151] Algumas concretizações da tecnologia de sequenciamento aqui descritos incluem funções de detecção e correcção de erros. Exemplos de erros podem incluir erros de chamadas de base durante o processo de sequenciamento, e erros na montagem de fragmentos em contigs maiores. Como seria entendido, a detecção de erro pode incluir detectar a presença ou a probabilidade de erros de um conjunto de dados, e como tal, a detecção da localização de um erro ou o número de erros pode não ser necessária. Para correção de erro, informações sobre a localização de um erro e / ou o número de erros em um conjunto de dados é útil. Métodos para correção de erros são bem conhecidos na arte. Exemplos incluem o uso de Hamming distâncias, e o uso de um algoritmo de soma de verificação (Ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US No. 2010/0323348; A Patente US N ° 7.574.305; e Patente US N ° 6.654.696, as revelações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade).

Bibliotecas aninhadas

[00152] Um método alternativo envolve os métodos de junção de marcação acima e preparação de bibliotecas de sequenciamento aninhados. As sub-bibliotecas aninhados são criadas a partir de fragmentos de DNA marcado com código. Isto pode permitir a marcadorgem do transpos menos frequente em todo o genoma. Ele também pode criar uma maior diversidade de (nested) sequenciamento lê. Esses fatores podem levar a uma melhor cobertura e precisão.

[00153] Sub-amostragem e a amplificação do genoma completo pode criar muitas cópias de uma determinada população de moléculas de partida. Os fragmentos de DNA são em seguida gerados por fragmentação específica do transposon, em que cada fragmento recebe um código que permite um para ligar o fragmento de volta para o vizinho original tendo um código correspondente (quer sejam idênticas, complementar ou de outra forma ligada informaticamente). Os fragmentos marcados são fragmentados, pelo menos, uma segunda vez por métodos aleatórios ou métodos específicos para a sequência, tais como digestão enzimática, de cisalhamento aleatório, de corte à base de transposon, ou outros métodos, criando desse modo sub-bibliotecas de fragmentos de DNA marcado com código. Em uma variação útil do método anteriormente descrito, os fragmentos marcados de código podem ser preferencialmente isolados utilizando transposons que contêm uma biotina ou outra funcionalidade de afinidade para fins de enriquecimento a jusante. Preparação subsequente biblioteca converte os fragmentos de DNA aninhadas em modelos de sequenciamento. - End emparelhado sequenciamento resulta na determinação da sequência do código-tag dos fragmentos de DNA e de DNA alvo. Desde bibliotecas aninhadas para o mesmo código-tag são criados, fragmentos de DNA longos podem ser seqüenciado com leitura curta.

Métodos de sequenciamento

[00154] Os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados em conjunto com uma variedade de técnicas de sequenciamento. Em algumas concretizações, o processo para determinar a sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo pode ser um processo automatizado.

[00155] Algumas concretizações dos métodos de sequenciamento descritos neste documento incluem a sequenciamento por tecnologias de síntese (SBS), por exemplo, técnicas de pirossequenciao. Pirossequenciao detecta a libertao de pirofosfato inorgânico (PPi) como nucleotídeos particulares são incorporados na cadeia nascente (Ronaghi et al, Analytical Biochemistry 242 (1): 84-9 (1996); Ronaghi, M. Genome Res 11 (1): 3-11 (2001); Ronaghi et al, Science 281 (5375): 363 (1998); US Patent No. 6210891; Patente dos EUA No. 6.258.568 e Patente dos EUA No. 6.274.320, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade).

[00156] Em outro exemplo do tipo SBS, sequenciamento de ciclo é realizado pela adição passo a passo de nucleotídeos terminadores reversíveis que contenham, por exemplo, um marcador clivel corante ou fotobranqueador como descrito, por exemplo, na Patente US N ° 7,427,67, Patente US N ° 7,414, 1163 e Patente US N ° 7.057.026, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Esta abordagem, que está a ser comercializado por Illumina Inc., é também descrita no Pedido de Patente Internacional Publicação N° s. WO 91/06678 e WO 07/123744, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A disponibilidade de terminadores fluorescentemente marcado, em que tanto o encerramento pode ser invertido e o marcador fluorescente clivado, facilita a sequenciamento de terminação eficiente reversível cíclico (CRT). Polimerases podem também ser co-manipulados para incorporar de forma eficiente e se estendem a partir destes nucleotídeos modificados.

[00157] sistemas de SBS exemplificativos adicionais e métodos que podem ser utilizados com os métodos e composições aqui descritos são descritos na Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2007/0166705, Publicao do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2006/0188901, Patente US N ° 7057026, Publicação de Pedido de Patente US No. 2006/0240439, do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2006/0281109, PCT WO 05/065814, publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2005/0100900, Publicao PCT NWO 06/064199 e publicação PCT N ° WO 07 / 010,251, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[00158] Algumas concretizações da tecnologia de sequenciamento aqui descrito podem utilizar a sequenciamento por meio de técnicas de ligação. Tais técnicas utilizar ligase de DNA para incorporar nucleotídeos e identificar a incorporação de tais nucleotídeos. Os sistemas e métodos exemplificativos SBS que podem ser utilizados com as composições e métodos aqui descritos são descritos na Patente dos Estados Unidos No. 6.969.488, Patente dos EUA No. 6.172.218, e na Patente US N ° 6.306.597, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[00159] Os métodos de sequenciamento aqui descritos podem ser vantajosamente realizados em formatos multiplex de modo que múltiplos ácidos nucleicos alvo diferentes são manipulados simultaneamente. Em concretizações particulares, os ácidos nucleicos alvo diferente pode ser tratada em um vaso de reação comum ou sobre uma superfície de um substrato particular. Isto permite a administração conveniente de reagentes de sequenciamento, a remoção de reagentes que não reagiram e de detecção de eventos de incorporação de um modo multiplex. Em concretizações que utilizam ácidos nucleicos alvo ligadas à superfície, os ácidos nucleicos alvo pode estar num formato de matriz. Num formato de matriz, os ácidos nucleicos alvo pode ser normalmente acoplado a uma superfície de uma maneira espacialmente distinguíveis. Por exemplo, os ácidos nucleicos alvo pode ser ligada por ligação covalente directa, ligação a uma esfera ou outra partícula ou associada com uma polimerase ou outra molécula que é ligado à superfície. O array pode incluir uma única cópia de um ácido nucleico alvo em cada local (também referida como uma característica) ou cópias múltiplas que têm a mesma sequência pode estar presente em cada local ou característica. Múltiplas cópias podem ser produzidas por métodos de amplificação tais como, amplificação ponte ou emulsão de PCR como descrito em mais detalhe aqui.

[00160] Os modos aqui apresentados podem utilizar matrizes tendo características em qualquer de uma variedade de densidades, incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 10 características / cm2, 100 apresenta / cm2, de 500 facilidades / cm2, 1.000 características / cm2, 5000 características / cm2, 10.000 elementos / cm2, 50.000 características / cm2, 100.000 características / cm2, 1.000.000 características / cm 2, 5.000.000 características / cm2 , 107 características / cm 2, 5 x 107 características / cm2, 108 características / cm2, 5x 108 características / cm2 , 109 características / cm 2, 5 x 109 características / cm2 ou mais elevadas.

Métodos para reduzir as taxas de erro nos dados de sequenciamento

[00161] Algumas concretizações dos métodos e composições aqui proporcionados incluem reduzir as taxas de erro nos dados de sequenciamento. Em algumas de tais concretizações, as cadeias de sentido e anti-sentido de um ácido nucleico alvo de cadeia dupla são, cada um associado com um barcode diferente. Cada fio é amplificado, informação da sequência é obtida a partir de múltiplas cópias dos fios amplificados, e uma representação da sequência de consenso do ácido nucleico alvo é gerado a partir da informação de sequência redundante. Assim, informação sobre a sequência pode originar e ser identificados a partir de cada cadeia. Consequentemente, os erros de sequência podem ser identificadas e reduzidas onde informação da sequência proveniente de um filamento é inconsistente com a informação de sequência a partir da outra cadeia.

[00162] Em algumas concretizações, as cadeias de sentido e anti-sentido de um ácido nucleico alvo está associada com um barcode diferente. Os barcodes pode ser associado com o ácido nucleico-alvo por uma variedade de métodos, incluindo a ligação de adaptadores e a inserção de sequências de transposons. Em algumas de tais concretizações, um adaptador em Y pode ser ligada a pelo menos uma extremidade de um ácido nucleico alvo. O adaptador em Y pode incluir uma sequência de cadeia dupla, e cadeias não complementares, cada cadeia, compreendendo um barcode diferente. O ácido nucleico alvo ligado com adaptador em Y pode ser amplificado e sequenciado, de tal modo que cada barcode pode ser usado para identificar as cadeias sentido ou anti-originais. Um método semelhante é descrito na Kinde I. et al, (2011) PNAS 108:9530-9535, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas concretizações, as cadeias de sentido e anti-sentido de um ácido nucleico alvo está associada com um barcode diferente através da inserção de sequências de transposons aqui proporcionados. Em algumas de tais concretizações, as sequências de transposons podem compreender barcodes não complementares.

[00163] Algumas concretizações de tais métodos incluem a obtenção de informação de sequência a partir de uma cadeia de um ácido nucleico de cadeia dupla alvo que compreende (a) a obtenção de sequence data a partir de um ácido nucleico molde que compreende uma primeira placa de sequenciamento e uma segunda placa de sequenciamento que possui pelo menos uma porção da dupla ácido nucleico alvo -cordas disposto entre os mesmos, em que: (i) o primeiro adaptador de sequenciamento compreende um primeiro barcode de cadeia dupla, um local iniciador primeiro de cadeia simples e um segundo local de iniciador de cadeia simples, em que os primeiro e segundo locais iniciadores são não -complementary, e (ii) o segundo adaptador de sequenciamento que compreende um segundo barcode de cadeia dupla, um local de cadeia simples do iniciador terceiro e um quarto local de iniciadores de cadeia simples, em que o terceiro e quarto locais iniciadores são não- complementar. Em algumas concretizações, o primeiro sítio de iniciador da cadeia codificadora do ácido nucleico da matriz e o terceiro local de iniciador de cadeia anti-sentido do ácido nucleico matriz compreendem a mesma sequência. Em algumas concretizações, cada barcode é diferente. Em algumas concretizações, o primeiro adaptador de sequenciamento compreende um gancho de cabelo de cadeia simples acoplando o primeiro local de iniciador e segundo local iniciador.

[00164] Em outra concretização, cada extremidade de um ácido nucleico alvo estar associada com um adaptador que compreende um barcode diferente de tal modo que os produtos de extensão a partir do sentido e anti-sentido de cadeia de um ácido nucleico podem ser distinguidos umas das outras. Em algumas concretizações, as sequências do sítio de iniciadores e barcodes são seleccionados de tal modo que a extensão de um iniciador hibridado com os produtos de cadeia de sentido rendimentos que podem ser distinguidas a partir de produtos de extensão de um iniciador hibridado para a cadeia anti- sentido. Em um exemplo, a 3' local iniciador de sentido é o mesmo que o 3' local de iniciador anti-sentido, mas diferente de ambos o sentido e 5' 5' locais iniciadores anti-sentido. Extensão de iniciadores emparelhados para o local de iniciador de sentido e a 3' 3' sítio iniciador anti-sentido iria produzir os seguintes produtos a partir de cada cadeia: cadeia de sentido directo: (5') de barcode 2 - [sequência alvo] - barcode 1 (3') cadeia anti-sentido: (5 ') do barcode 1 - [sequência alvo] - barcode 2 (3') Assim, os produtos de extensão a partir do sentido e anti-sentido de cadeia de um ácido nucleico podem ser distinguidos umas das outras. Um método exemplar é ilustrado na Schmitt MW, et al, PNAS (2012) 109:14508-13, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Nalguns desses modos, o barcode e locais de iniciadores pode estar associada com o ácido nucleico alvo por uma variedade de métodos, incluindo a ligação de adaptadores e a inserção de sequências de transposons. Em algumas concretizações, as sequências de transposons pode ser concebida para fornecer os adaptadores com grampos. Gancho de cabelo proporcionar a capacidade de manter a contiguidade física do sentido e anti-sentido cadeias de um ácido nucleico alvo. Um ácido nucleico molde podem ser preparados compreendendo grampos utilizando sequências de transposons compreendendo ligantes aqui descritos. Exemplos de ligantes incluem ácidos nucleicos de cadeia simples.

[00165] Algumas concretizações da preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos do molde para a obtenção de informação de sequência de cada cadeia de um ácido nucleico alvo de cadeia dupla incluem (a) proporcionar uma população de transposomes compreendendo uma transposase e uma primeira sequência de transpos que compreende: (i) um primeiro transposase local de reconhecimento, um local de primeiro iniciador, e um primeiro barcode, e (ii) uma segunda sequência de transpos que compreende um segundo local de reconhecimento da transposase, um segundo local de iniciador, e um segundo barcode, em que a primeira sequência de transposon não é contíguo com a segunda sequência de transposon; e (b) fazer contactar as transposomes com um ácido nucleico de cadeia dupla sob condições tais que os referidos primeira e segunda sequências de transposons inserir o ácido nucleico alvo de cadeia dupla, preparando deste modo uma biblioteca de ácidos nucleicos do molde para a obtenção de informação de sequência a partir de cada uma das cadeias o ácido nucleico alvo de cadeia dupla. Em algumas concretizações, a população de transposomes compreende ainda transposomes compreendendo uma transposase e uma sequência de transpos que compreende um terceiro local de reconhecimento da transposase e um quarto local de reconhecimento da transposase que tem uma sequência barcode disposto entre os mesmos, a referida sequência barcode que compreende um terceiro barcode e um quarto barcode que tem uma adaptador sequenciamento disposto entre os mesmos, compreendendo o referido adaptador de sequenciamento de um terceiro local de iniciador e um sítio iniciador quarto que tem um ligante disposto entre os mesmos. Em algumas concretizações, o primeiro sítio de iniciador da cadeia codificadora do ácido nucleico da matriz e o terceiro local de iniciador de cadeia de orientação anti-sentido do ácido nucleico matriz compreendem a mesma sequência. Algumas concretizações incluem também um passo (c) selecionar para ácidos nucleicos moldes que compreende sequências de transposons, em que a primeira sequência de transposon não é contígua com as segundas sequências de sequências de transposons e transposons compreendendo um ligante. Em algumas concretizações, o ligante compreende um tag de afinidade adaptada para se ligar com uma sonda de captura. Em algumas concretizações, o tag de afinidade é seleccionado a partir do grupo que consiste em His, biotina e estreptavidina. Em algumas concretizações, cada barcode é diferente. Em algumas concretizações, o ligante compreende um ácido nucleico de cadeia simples. Em algumas concretizações, o ácido nucleico alvo compreende DNA genômico.

Métodos para obtenção de informações haplótipa

[00166] Algumas concretizações dos métodos e composições aqui proporcionados incluem métodos de obtenção de informação de haplótipos a partir de um ácido nucleico alvo. A informação haplótipa pode incluir a determinação da presença ou ausência de sequências diferentes em loci especificados em um ácido nucleico alvo, tal como um genoma. Por exemplo, informação de sequência pode ser obtida de cópias maternos e paternos de um alelo. Em um organismo poliplóide, informação de sequência pode ser obtida por pelo menos um haplótipo. Tais métodos são também úteis na redução da taxa de erro na obtenção de informação de sequência de ácido nucleico alvo.

[00167] Geralmente, os métodos para obter informação haplótipo incluem a distribuição de um ácido nucleico em um ou mais compartimentos de tal modo que cada compartimento compreende uma quantidade de equivalente de ácido nucleico até cerca de um haplótipo do ácido nucleico, ou o equivalente a menos do que cerca de um haplótipo do ácido nucleico. A informação da sequência pode então ser obtido a partir de cada compartimento, obtendo-se assim informação de haplótipos. A distribuição do ácido nucleico molde em uma pluralidade de vasos, aumenta a probabilidade de que um único vaso inclui uma única cópia de um alelo ou SP, ou que a informação sequência de consenso obtida a partir de um único vaso reflete a informação da sequência de um alelo ou SNP. Como será entendido, em algumas de tais concretizações, um ácido nucleico molde podem ser diluídas antes de compartimentar o ácido nucleico molde para uma multiplicidade de recipientes. Por exemplo, cada recipiente pode conter uma quantidade de ácidos nucleicos-alvo iguais a cerca de um haplótipo equivalente do ácido nucleico alvo. Em algumas concretizações, um recipiente pode incluir menos do que cerca de um haplótipo equivalente de um ácido nucleico alvo.

[00168] Os métodos de determinação de haplótipos informações, método de haplotipagem com compartimentos virtuais, métodos de preparação de ácidos nucleicos alvo para haplotipagem estão descritos na publicação da OMPI WO / 2014/142850, a qual é aqui incorporada por referência.

EXEMPLOS Exemplo 1- Manter o molde de contiguidade

[00169] Este exemplo ilustra um método para a manutenção da informação de contiguidade de um ácido nucleico molde dentro de um CE. O ácido nucleico matriz é preparado usando transposomas compreendendo sequências de transposons não contíguas em que Tn5 transposase permanece ligado ao DNA molde de pós-transposição. O ácido nucleico alvo é posta em contacto com transposomes compreendendo Tn5 transposase, e as sequências de transposons não contíguas. As amostras que são posteriormente tratados com SDS pode aparecer como uma mancha de vários fragmentos de ácido nucleico modelo; As amostras não tratadas com SDS pode mostrar a retenção do ácido nucleico putativo molecular elevado peso molde. Assim, mesmo que um ácido nucleico pode ser fragmentado, sequências adjacentes podem ainda ser associadas com uma outra pela transposase.

[00170] Em ainda outro modo exemplificativo, uma biblioteca de ácidos nucleicos moldes é preparado usando transposomes compreendendo sequências de transposons não contíguas com o ácido nucleico-alvo que compreende o cromossoma humano. A CE compreende o ácido nucleico alvo. Os blocos de haplótipos acima de DNA pode ser observado para as amostras em que a transposase é removido por SDS pós- diluição. Assim, praticando métodos como aqui descritos os ácidos nucleicos alvo podem manter a integridade alvo quando transposto, ser diluído, e ser transformado em bibliotecas de sequenciamento.

[00171] O termo "compreendendo", tal como aqui utilizado é sinónimo de "incluindo", "contendo", ou "caracterizado por" e é inclusivo ou aberto e não exclui, elementos não mencionados adicionais ou etapas de método.

[00172] Todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condies reaccionais, e assim por diante utilizados na especificação são para ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Por conseguinte, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos aqui estabelecidos são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas procurou ser obtido. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao bito de quaisquer reivindicações em qualquer aplicação que reivindica prioridade para o presente pedido, cada parâmetro numérico deve ser interpretado à luz do número de algarismos significativos e abordagens de arredondamento comuns.

[00173] A descrição anterior descreve vários métodos e materiais do presente invento. Este invento é susceptível a modificações nos métodos e materiais, bem como alterações nos métodos e equipamentos de fabrico. Tais modificações serão evidentes para os peritos na arte a partir de uma consideração da presente memória descritiva ou prática do invento aqui divulgado. Por conseguinte, não se pretende que a presente invenção seja limitada às concretizações específicas aqui descritas, mas que ela cobrir todas as modificações e alternativas abrangidas pelo verdadeiro escopo e espírito da invenção.

[00174] Todas as referências aqui citadas, incluindo, mas não limitado a aplicações publicadas e não publicadas, patentes, e referências da literatura, são aqui incorporadas por referência na sua totalidade e que passam a uma parte desta especificação. Para as publicações de extensão e patentes ou pedidos de patente incorporados por referência contradizer a divulgação contida na especificação, esta destina-se a substituir e / ou ter precedência sobre qualquer tipo de material contraditórias.

Exemplo 2- Sequenciamento do transcriptoma de única célula inteira

[00175] Este exemplo descreve um método para o barcode de forma uniforme ao longo de todo o comprimento de um DNAc e utilizando os barcodes para determinar a informação de contiguidade de DNAc bem como para identificar a fonte celular, ou seja, identificar a célula única associada com o RNAm.

[00176] Este exemplo ilustra um método para o sequenciamento do transcriptoma de uma única célula. Neste exemplo, gota microfluídica é usada para capturar o transcriptoma de várias células individuais em pérolas de captura individuais e contiguidade preservando transposição e indexação combinatória (CPT-SEQ) é então utilizado para o barcode de cDNA derivado do transcriptoma de cada única célula. Em uma concretização, o método da invenção utiliza um processo de barcode para múltiplos índice de cDNA de cula ica em que um primeiro barcode é adicionado em uma reação marcação e um segundo barcode é adicionado em uma reação de amplificação por PCR.

[00177] Em um exemplo, o poli-A + RNA é capturada a partir de células individuais e a capturado poli-A + RNA é processado em grandes quantidades para a geração de uma biblioteca de sequenciamento multiplexado.

[00178] O método pode incluir as seguintes etapas. Numa etapa 1, o RNA a partir de uma única célula é capturado em uma pérola de captura. Por exemplo, várias células individuais (por exemplo, cerca de 1000 células individuais) são encapsuladas em goticulas individuais (isto é, em média, uma célula e um talão por gotícula) que compreende um tampão de lise e uma pérola de captura. Imobilizada na superfície da pérola de captura é uma pluralidade de sondas de captura que incluem uma sequência de captura de poli-dT e uma sequência iniciadora de PCR. A composição do tampão de lise da gotícula dissocia da membrana citoplasmática da célula única de libertação de RNA citoplasmático. A Autorização de poli-A + de RNA é capturado por hibridação das sequências + poli-A no RNA para as sequências de captura de oligo-dT imobilizados na superfície da pérola de captura de co-encapsulados. Cada pérola de captura agora inclui poli-A + RNA a partir do transcriptoma de uma única célula. Todos os poli-A + RNA a partir de uma única célula é mantida em proximidade um do outro na pérola de captura.

[00179] Numa etapa 2, as esferas de captura com uma única célula nela poli-A + RNA são reunidos a partir de múltiplas gotículas (por exemplo, cerca de 1000 esferas de captura) e o cDNA de cadeia dupla é sintetizado. Por exemplo, as pérolas de captura são reunidas, lavadas, e o DNAc da primeira cadeia é sintetizada usando uma RNAse H da transcriptase menos que é capaz de reverter a mudança de cadeia. Um iniciador de desvio de cadeia é incluído durante a síntese da primeira cadeia de cDNA, permitindo a colocação de um local iniciador universal na extremidade 3' do DNAc. CDNA de cadeia dupla é, então, preparada usando um iniciador universal e uma polimerase DNA de alta fidelidade em uma reação de PCR (por exemplo, 1 a 2 ciclos de PCR). Cada pérola de captura inclui agora DNAc reversamente transcrito a partir de poli-A + RNA a partir de uma única célula.

[00180] Em uma etapa 3, pérolas de captura com nela cDNA de cadeia dupla são distribuídas em poços de uma placa de 96 poços de modo a que haja cerca de 10 esferas por po de captura.

[00181] Numa etapa 4, de cadeia dupla de cDNA em cada poço é marcado usando 96 transposomes exclusivamente indexados. Marcação é usada para modificar o DNAc com sequências de adaptador e de índice preservando contiguidade de uma única célula. A montagem dos complexos 96 transpossoma exclusivamente indexados utilizados na reação marcação é descrito em mais detalhe abaixo. A reação marcação adiciona a primeira parte de um barcode bipartido para cada fragmento de DNAc futuro. Cada pérola de captura agora inclui DNAc marcado a partir de uma única célula.

[00182] Numa etapa 5, os grânulos de captura em todos os poços são colhidos, agrupados, lavados, e redistribuídos em poços de outra placa de 96 poços, de modo a que haja cerca de 10 esferas por po de captura. O RNAm / DNAc a partir de uma célula individual permanece sobre a superfície de um grânulo individual e a transposase permanece ligada ao DNAc fragmentados e mantém os fragmentos de dissociação.

[00183] Em uma etapa 6, transposase e cDNA marcado são liberados das pérolas de captura. Por exemplo, uma alíquota de uma solução de SDS (SDS a 1%) é adicionado a cada poço para liberar a transposase ligada e DNAc marcado a partir das pérolas de captura.

[00184] Em uma etapa 7, DNAc marcado em cada poço é amplificado utilizando iniciadores de PCR que incluem um ou P5 sequência P7 e uma sequência barcode único. Por exemplo, um em cada 96 combinações únicas de P5 com barcode e os iniciadores P7 PCR é adicionado a cada poço e os fragmentos de DNAc marcado são amplificados. A reação de PCR adiciona a parte restante do barcode bipartido para cada fragmento de DNAc. Cada fragmento de DNAc agora inclui sequências de barcode 4: duas sequências adicionados na reação marcação e 2 sequências adicionados durante a amplificação por PCR. Assim RNAm / DNAc a partir de uma célula individual é identificada pela combinação do índice marcação e o índice de PCR adicionado através do passo de amplificação.

[00185] Em uma etapa 8, os fragmentos de DNAc de barcode a partir de cada cavidade foram reunidos e sequenciados.

[00186] Neste exemplo,uma indexação combinatória de 96 x 96 é usada para barcode 1000 sobre células individuais, com cerca de 5% de probabilidade de duas células que possuem os mesmos barcodes. O rendimento pode ser facilmente aumentado a escala, aumentando o número de "compartimentos". Por exemplo, através da utilização de 384 x 384 combinatória barcode (cerca de 147456 compartimentos virtuais), cerca de 10000 células individuais podem ser barcodes individualmente em paralelo com cerca de 3% de chance de duas células que têm o mesmo barcode.

[00187] Este exemplo também descreve um processo de montagem de 96 complexos transpossoma barcode único para adicionar a primeira parte de um barcode bipartido em um protocolo de barcode combinatória. O processo inclui, mas não está limitado a, as seguintes etapas.

[00188] Na etapa A, 20 transposons indexados exclusivamente são formados por emparelhamento dos oligonucleotídeos indexados individuais, cada uma contendo a Tn5 mosaico Fim (ME) sequência na sua extremidade 3', para um 5' universal fosforilada ME oligonucleotídeo complementar (pMENTS). Por exemplo, um oligonucleotídeo indexada 1110 que inclui sequências P5, uma única base de 8 "i5" sequência de índice, uma sequência de conector universal Universal conector A-C15: e uma sequência de ME é hibridado com uma sequência complementar ME 1115. ME sequência complementar 1115 é um oligonucleotídeo 5' fosforilado universal (pMENTS) que é complementar para as sequências de ME no oligonucleotídeo indexada 1110. A sequência de conector universal a-C15 é usada mais tarde para o índice do costume anelamento 2 sequenciamento.

[00189] Um segundo conjunto de reações de recozimento (isto é, 12 reações de recozimento individuais) é realizada de modo a formar um segundo conjunto de 12 de transposon que incluem, cada uma 8 base de "i7" sequência índice único adjacente a uma sequência de P7. Por exemplo, um oligonucleotídeo indexada 1120 que inclui sequências de P7, uma sequência única de índice i7 8 de base, uma sequência de conector B-D15 universal e uma sequência de ME é recozido a ME sequência complementar 1115. Universal sequência conector B-D15 é usado mais tarde para recozimento índice personalizado um iniciador de sequenciamento.

[00190] Na etapa B, recozido transposons P5_i5 1125 (isto é, 8 P5_i5 transposons de 1125, cada um com uma sequência única de índice i5 8 base) e recozidos transposons P7_i7 1130 (ou seja, 12 transposons de 1130, cada um com uma sequência única de índice i7 8 de base) estão montados no indivíduo reações com Tn5 transposase para formar transpossoma complexos. Por exemplo, cada recozido P5_i5 transposon 1125 é incubada com Tn5 transposase 1135 a cerca de 37 ° C durante cerca de 1 hora para formar um complexo P5_i5 transpossoma 1140. Da mesma forma, cada recozido P7_i7 transposon 1130 é incubada com Tn5 transposase 1135 a cerca de 37 ° C durante cerca de 1 hora para formar um complexo P7_i7 transpossoma 1145.

[00191] Na etapa C, 96 complexos transpossoma únicas são feitos através da combinação de aliquotas de P5_i5 transpossoma complexos 1140 com alíquotas de P7_i7 transpossoma complexos de 1145. Por exemplo, P5_i5 transpossoma complexos 1140 são aliquotadas em filas A a H de uma placa de 96 poços e P7_i7 transpossoma complexos 1145 são aliquotadas em colunas de 1 a 12 da mesma placa de 96 poços. A combinação de 8 P5_i5 complexos transpossoma 1140 e 12 P7_i7 complexos transpossoma 1145 cria 96 diferentes combinações de índice.

[00192] Para avaliar os complexos transpossoma montadas, uma biblioteca de sequenciamento a partir de 10 células individuais foi preparada utilizando uma única reação marcação e uma única reação de PCR. Dez pérolas de captura compreendendo DNAc a partir de 10 células individuais foram reunidas e marcado usando o P5_i5_l mais P7_i7_l transpossoma misturar. O cDNA marcado foi então libertado a partir das esferas de captura e amplificado por PCR usando barcode P5 e P7 iniciadores para gerar uma biblioteca de sequenciamento. A distribuição de tamanho de fragmento na biblioteca sequenciamento foi em seguida analisada utilizando um Bioanalyzer. Em algumas concretizações, a limpeza é executada depois de PCR. Em algumas concretizações, o segundo SPRI limpar é executada depois da primeira SPRI limpar. Em algumas concretizações, a amostra é diluída 10 vezes antes da análise num Bioanalyzer.

[00193] Em outro exemplo, duas misturas complexas diferente transpossoma foram usadas para preparar uma biblioteca de sequenciamento a partir de 100 células individuais. Neste exemplo, um protocolo de divisão e piscina foi utilizado para avaliar os complexos transpossoma. Cem pérolas de captura compreendendo cDNA a partir de 100 células individuais foram distribuídos em duas reações marcação, uma reação marcação foi realizada utilizando o P5_i5_2 mais P7 17 2 mistura transpossoma e uma segunda reação marcação foi realizada utilizando o P5 15 3 mais P7 17 3 transpossoma mistura de. Após as reações marcação, as pérolas de captura de cada reação foram combinadas e redistribuídas por amplificao por PCR utilizando dois combinações únicas de P5 com barcode e os iniciadores P7 PCR (isto é, uma primeira combinação de iniciadores P5 e P7 de PCR e uma segunda combinação de P5 e P7 PCR iniciadores) para gerar duas bibliotecas de sequenciamento. A distribuição de tamanho de fragmento em cada biblioteca a sequenciamento foi em seguida analisada utilizando um Bioanalyzer. A biblioteca de barcode foi analisada após um único passo de 0,7x SPRI limpeza.

Claims

1. Método de análise de, pelo menos, dois ou mais analitos de uma pluralidade de células individuais caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: (a) fornecer uma pluralidade de elementos de preservação de contiguidade (CE), em que cada CE compreende uma célula individual; (b) lisar as referidas células individuais dentro de cada CE, em que os analitos no interior da referida célula individual são liberados no interior de cada CE; (c) fornecer uma primeira porção repórter para um primeiro analito dentro da referida célula individual de cada CE; (d) fornecer uma segunda porção repórter para um segundo analito no interior da referida célula individual de cada CE; (e) modificar os referidos analitos, de tal modo que, pelo menos, alguns dos referidos primeiro e segundo analitos do referido CE compreendem as referidas primeira e segunda porções repórter, respectivamente; (f) combinar o CE que compreende os referidos analitos que compreendem as referidas porções repórter; (g) compartimentar o CE que compreende o referido primeiro e segundo analitos compreendendo as referidas primeira e segunda porções repórter, respectivamente em uma pluralidade de compartimentos; (h) fornecer uma terceira porção repórter para o referido primeiro analito, compreendendo a referida primeira porção repórter de cada CE dentro do dito compartimento; (i) fornecer uma quarta porção repórter para o referido segundo analito, compreendendo a referida segunda porção repórter de cada CE dentro do dito compartimento; (j) modificar ainda os referidos analitos, de tal modo que pelo menos alguns dos primeiros analitos compreendem as referidas primeira e terceira porções repórter e, pelo menos, alguns dos segundos analitos compreendem as referidas segunda e quarta porções repórter; (k) analisar o referido analito compreendendo as referidas porções repórter de cada compartimento, em que tal análise detecta os analitos de uma célula individual, a qual e a fonte de cada analito.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida primeira e segunda porções repórter identificam a fonte dos referidos analitos, ou em que a combinação das referidas porções repórter identifica a fonte dos referidos analitos.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 2, caracterizado pelo fato de que a detecção dos referidos analitos é feita simultaneamente.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro analito é DNA genômico e o segundo analito é cDNA ou RNA, e em que a modificação de pelo menos algumas dos DNA genômico, cDNA ou RNA que compreendem primeira e segunda porções repórter compreende o contato do DNA gnômico, cDNA ou RNA com uma pluralidade de transpossomas, cada transpossoma compreendendo uma transposase e um sequência de transposon compreendendo a primeira porção repórter ou uma segunda porção repórter sob condições, tais que pelo menos algumas das sequências de transposons são inseridas no DNA genômico, cDNA ou RNA.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que (i) a etapa (g) compreende ainda a remoção da transposase a partir do DNA genômico, cDNA ou RNA; opcionalmente, em que a transposase é removida subsequente para modificar os referidos analitos na etapa (e), opcionalmente, em que a remoção da transposase compreende um método selecionado a partir do grupo que consiste em adicionar um detergente, mudança de temperatura, alteração do pH, adição de uma protease, adição de uma chaperona, alteração da concentração de sal, e adição de uma polimerase de deslocamento de cadeia, ou (ii) a etapa (e) compreende o contato do ácido nucleico alvo com uma pluralidade de transposomas, cada um transposon que compreende uma primeira sequência de transposons que compreende uma primeira porção repórter, uma segunda sequência de transposon não contígua com a referida primeira sequência de transposon, e uma transposase associada com a primeira sequência de transposon e a segunda sequência de transposon.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência de transposon compreende um primeiro local de iniciador e a segunda sequência de transposon compreende um segundo local de iniciador, opcionalmente, em que o primeiro local de iniciador compreende ainda um primeiro barcode e o segundo local de iniciador compreende ainda um segundo barcode.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um analito é proteína, e opcionalmente, em que a proteína é marcada com uma porção repórter de ácido nucleico, e ainda, opcionalmente, em que a porção repórter de ácido nucleico compreende um conjunto de barcodes combinatoriamente derivados, em que a referida proteína é a partir de uma célula individual.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as etapas (c) - (j) são repetidas pelo menos mais uma vez, opcionalmente, em que as porções adicionais repórter em cada uma das etapas adicionais são diferentes das referidas primeira, segunda, terceira e quarto porções repórter.

9. Método de análise de analitos de uma pluralidade de células individuais caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: (a) fornecer elementos de preservação de contiguidade (CE), em que cada CE compreende, pelo menos, um analito, em que o dito pelo menos um analito de cada CE são componentes de uma célula individual; (b) compartimentar o dito CE compreendendo o referido pelo menos um analito numa pluralidade de primeiros compartimentos; (c) fornecer um primeiro conjunto de porções repórter para o analito de cada CE na referida pluralidade de primeiros compartimentos, em que o referido primeiro conjunto de porções repórter identifica o CE, em que uma primeira porção repórter do referido primeiro conjunto de porções repórter fornecida ao analito de cada CE é diferente da primeira porção repórter fornecida ao analito de cada uma das outras CEs e é exclusiva para cada célula; (d) modificar o referido analito, de tal modo que, pelo menos, alguns dos referidos analitos do dito CE compreendem uma primeira porção repórter; (e) combinar o CE que compreende o referido analito compreendendo a referida primeira fração repórter; (f) compartimentar o CE que compreende o referido analito compreendendo a referida primeira porção repórter em uma pluralidade de segundo compartimento; (g) fornecer um segundo conjunto de porções repórter para que o referido analito compreendendo a referida primeira porção repórter de cada CE; (h) modificar ainda o referido analito, de tal modo que, pelo menos, alguns analitos compreendem uma segunda porção repórter do dito segundo conjunto de porções repórter; (i) analisar o referido analito compreendendo as referidas primeira e segunda porções repórter de cada segundo compartimentos E, em que as referidas primeiras e, opcionalmente, as referidas segundas porções repórteres identificam cada célula individual.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido analito compreende um ácido nucleico, e, em que: (i) a etapa (d) compreende o contato do ácido nucleico com uma pluralidade de transposomas, cada uma compreendendo uma transposase e uma sequência de transposon, compreendendo a primeira porção repórter sob condições, tais que pelo menos algumas das sequências de transposons inserem dentro do ácido nucleico; ou (ii) a etapa (d) compreende o contato do ácido nucleico alvo com uma pluralidade de transposomas, cada transposoma compreendendo uma primeira sequência de transposon que compreende uma primeira porção repórter, uma segunda sequência de transposon não contígua com a referida primeira sequência de transposon, e uma transposase associada com a primeira sequência de transposon e a segunda sequência de transposon.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito analito compreende um ácido nucleico, e em que a etapa (f) compreende a remoção da transposase a partir do CE compreendendo os ditos ácidos nucleicos compreendendo a dita primeira porção repórter, e opcionalmente, em que: (a) a transposase é removida a seguir a etapa (d), (b) a transposase é removida antes da etapa (i), ou (c) a remoção da transposase compreende um método selecionado a partir do grupo que consiste em adicionar um detergente, mudança de temperatura, alteração do pH, a adição de uma protease, a adição de uma chaperona, alteração da concentração de sal e adição de uma polimerase de deslocamento de cadeia.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-11, caracterizado pelo fato de que as primeiras sequências de transposons compreende um primeiro local de iniciador e as segundas sequências de transposons compreende um segundo local de iniciador, opcionalmente, em que o primeiro local de iniciador compreende ainda um primeiro barcode e o segundo local de iniciador compreende ainda um segundo barcode.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito analito compreende um ácido nucelico, em que a referida primeira porção repórter compreende um iniciador, e, em que a etapa (d) compreende amplificar o referido ácido nucleico com, pelo menos, um iniciador, ou em que a referida primeira porção repórter compreende um iniciador, e, em que a etapa (d) compreende ligar o referido ácido nucleico com, pelo menos, um iniciador.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o fornecimento de um plasmídeo para a referida CE na etapa (c), em que o referido plasmídeo é modificado para conter as referidas primeira e / ou segunda porções repórter nas etapas (d) - (h), em que o referido plasmídeo compreende a referida primeira ou referidas segunda porções repórter identifica o referido CE.

15. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido analito é proteína, opcionalmente, em que a referida proteína é a partir de uma célula individual.

16. Método, de acordo com a reivindicação 9 a 15, caracterizado pelo fato de que as etapas (c) - (h) são repetidas pelo menos mais uma vez, opcionalmente, em que os conjuntos adicionais de porções repórter em cada uma das etapas adicionais são diferentes do que o referido primeiro e segundo conjuntos de porções repórter.

17. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido analito é RNAm ou cDNA, opcionalmente, em que os referidos primeiro e segundo porções repórteres identificam a fonte dos referidos analitos; ou, em que a combinação das referidas porções repórteres identifica a fonte dos referidos analitos.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que: (i) o referido primeiro conjunto de porções repórter compreendem uma primeira sequência barcode e/ou em que o referido segundo conjunto de porções repórter compreendem uma segunda sequência barcode, ou (ii) a etapa (d) compreende o contato do ácido nucleico com uma pluralidade de transposomas, cada uma compreendendo uma transposase e uma sequência de transposon, compreendendo a primeira porção repórter sob condições, tais que pelo menos alguns das sequências de transposon inserem o ácido nucleico, ou (iii) a etapa (d) compreende o contato do ácido nucleico alvo com uma pluralidade de transposomes, cada transposoma que compreende uma primeira sequência de transposon que compreende uma primeira porção repórter, uma segunda sequência de transposon não contígua com a referida primeira sequência de transposon, e uma transposase associada com a primeira sequência de transposon e a segunda sequência de transposon; em que na opção (ii) ou opção (iii) a etapa (f), opcionalmente, compreende a remoção da transposase a partir do CE compartimentado compreendendo o ácido nucleico compreendendo a dita primeira porção repórter, opcionalmente, em que: (a) a transposase é removida a subsequente a etapa (d), ou (b) a transposase é removida antes da etapa (i), ou (c) a remoção da transposase compreende um método selecionado a partir do grupo que consiste em adicionar um detergente, mudança de temperatura, alteração do pH, adição de uma protease, a adição de um chaperona, alteração da concentração de sal, e adição de uma polimerase de deslocamento de cadeia.