KR102526386B1 - 알지네이트와 pva 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법 - Google Patents
알지네이트와 pva 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 종래 불가능했던 작은 대상물(세포 또는 작은 세포괴)에 적용할 수 있는 세포절편 제작방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포 또는 세포괴가 고정된 알지네이트-PVA 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세포나 세포괴의 세포절편 제작방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종래 불가능했던 작은 대상물(세포 또는 작은 세포괴)에 적용할 수 있는 세포절편 제작방법에 관한 것이다.
정확한 병리진단을 위해 조직의 병변과 조직 내부의 단백질, 유전자의 위치나 존재를 시각적으로 확인할 필요가 있는데, 이를 위해 세포나 조직의 형태 그대로 소정의 포매제(매립제)로 포매하여 블록으로 제작하고 이를 절편화하여 현미경으로 관찰할 수 있도록 하는 절편 제작방법이 활용되고 있다.
절편 제작방법은 크게 동결조직 포매제(OCT compound)에 포매하고 동결시키는 동결법과, 파라핀을 포매제로 하는 파라핀법으로 구분된다.
동결법은 시료를 OCT로 감싸 -10~-40℃로 동결한 다음 동결절편 박절기(cryotome)로 미세절단하여 관찰하므로 '있는 그대로' 관찰에 유리하며 단순하고 간편하여 신속하게 진행할 수 있다는 장점이 있지만 보존시 실온보관이 안되며 -20℃ 이하로 보관해야 하는 단점이 있다. 파라핀법은 유기용재의 사용, 가열 등의 처리로 인하여 세포내 단백질, 지질, 가용성 항원물질 등의 유출이나 실활 때문에 '있는 그대로'의 관찰은 다소 불리하지만 일단 제작된 블록이나 절편을 장기 보관할 수 있다는 장점이 있다.
한편 종래 절편 제작법에 의하면, ㉮ 파라핀이나 OCT 화합물이 지성이고 고점도이기 때문에 수용액에 현탁된 세포를 '고르게' 분포되도록 하기 매우 어려움(군데군데 덩어리져서 존재하게 됨) ㉯ 세포를 비교적 '고르게' 분포되도록 하더라도 세포블록에서 세포가 위치하는 장소를 특정하기 어려워 이를 (전자)현미경으로 정확히 찾아내어 관찰하기에 많은 시간과 노력이 필요함 ㉰ (전자)현미경 관찰을 위해 세포절편을 슬라이드나 홀드에 안착시키고 '포매제 제거→세척→염색' 등의 과정을 거쳐야 하는데 포매제가 제거되고 나면 세포를 잡아주는 매체가 없어 세포가 씻겨 나가게 됨. 따라서 이러한 사정 때문에 실질적으로 '조직'이나 '기관'이외에 (특히 저농도의) 세포나 미세 세포괴를 절편화할 수 없었다.
또한 이들 제작방법에 의하면 포매제(동결되지 않은 OCT 또는 녹은 파라핀)가 매우 고점도이므로 특히 낮은 농도(세포수)의 세포를 대상으로 절편화하는 것은 불가능하며, 세포가 고농도일 경우에는 세포의 중첩 및 겹침으로 인하여 관찰하고자 하는 '특정(specific) 세포'가 다른 세포들에 의해 마스킹되기 때문에 관찰이 용이하지 않은 문제가 있다.
공개특허 10-2001-0099854는 조직 블록을 절단하는 방법 및 장치에 관한 것인데, 조직을 용기(몰드)에 넣은 다음 알긴산중합체-물 혼합물을 주입하여 매립한 다음 냉각하여 마이크로톰으로 절편화하는 방법이 제시되어 있다. 즉, ㉮ 상대적으로 매크로한 기관이나 조직을 대상으로 ㉯ 변형된 알긴산플라스틱중합체를 사용하며 ㉰ 경화된 알긴산플라스틱중합체가 기관이나 조직의 외곽을 둘러싸 블록을 형성하는 것을 제시하고 있을 뿐, 천연의 알지네이트를 사용하는 것도 아니며, 매크로한 기관이나 조직이 아닌 미세한 세포의 고정과 그의 동결절편에 대한 것은 아니다. 또한 이에 의하면 시료의 장기보관이 불가능하며, 애초에 세포를 대상으로 하는 것도 아니다.
중국 등록특허 CN 108956221(Method for carrying out pathological section production by using sodium alginate)에는 알긴산 비드에 조직세포를 고정한 다음 회수하여 거즈로 누르면서 액체를 제거하여 판상으로 제작한 다음 절편화하는 방법이 제시되어 있다. 그러나 이에 의하면 가압탈수하는 과정에서 시료(세포)의 구조적 손상이 초래되므로 '있는 그대로'의 세포를 관찰하기에는 미흡한 점이 있다. 역시 이 선행기술에 의하면 시료의 장기보관이 불가능하다.
한편, 세포를 egg albumin, 피브리노젠 등의 첨가물과 혼합하여 고점도가 되도록 한 다음 파라핀법에 따라 세포블록을 제작하는 사례가 있다. 그러나 이에 의하면 수용액상으로는 불가능했던 세포고정이 가능하긴 하지만, 역시 고점도의 액체를 다루어야 하기 때문에 블록화에 어려움이 있다. 또한 이렇게 제작된 세포블록은 고형화된 파라핀 속에 고점도 액적이 있고 이 액적 속에 세포가 존재하는 구조이므로 이로부터 정교한 절편을 얻기도 어렵고, 절편에서 고점도 액적이 분리(흘러내림)되기 쉬워 세포절편을 얻는 것도 용이하지 않다.
본 발명은 매크로한 조직이 아닌 세포 또는 미세 조직(세포덩어리)을 블록화하고 절편화할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 세포 또는 미세 조직이 블록 또는 절편의 특정 부위에서 균일하게 분포되도록 하는 세포 또는 미세 조직(세포덩어리)을 블록화하고 절편화할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은
세포 또는 세포괴가 고정된 알지네이트-PVA 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 세포를 포매제에 직접 포매하는 대신 알지네이트 비드를 매개로 간접적으로 포매하여 블록화-절편화함으로써 다루기 쉽고, 겔 내 세포 분포의 균일화, 세포 포집율 향상이 가능하고, 특히 저농도 세포도 쉽게 절편화할 수 있는 장점이 있다.
따라서 본 발명에 의하면, 종래 통상적인 절편 제작방법으로는 불가능했던 (특히 저농도의) 세포나 세포괴(미세 조직)를 절편 제작할 수 있게 됨으로써 적은 샘플로부터 보다 다양한 검사가 가능하게 된다.
도 1은 본 발명에 의한 세포절편 제작방법에 따른 과정을 보여주는 개념도와 사진.
도 2는 본 발명에 의한 특정 세포에 대한 세포절편 제작방법의 진행과정의 예시적 흐름도.
도 3은 실시예에 사용된 수용액 및 제조된 복합비드 사진.
도 4는 본 발명의 실시예에서 얻어진 세포고정비드의 전자현미경 사진.
도 5는 본 발명에 의한 AP 비드 표면에 형광염색된 세포가 부착된 형광현미경 사진.
도 6은 본 발명의 실시예에서 제작된, 특정세포고정비드의 파라핀 세포블록 사진.
도 7은 본 발명의 실시예에서 제작된, 세포절편의 면역세포화학염색 결과를 보여주는 현미경 사진.
도 2는 본 발명에 의한 특정 세포에 대한 세포절편 제작방법의 진행과정의 예시적 흐름도.
도 3은 실시예에 사용된 수용액 및 제조된 복합비드 사진.
도 4는 본 발명의 실시예에서 얻어진 세포고정비드의 전자현미경 사진.
도 5는 본 발명에 의한 AP 비드 표면에 형광염색된 세포가 부착된 형광현미경 사진.
도 6은 본 발명의 실시예에서 제작된, 특정세포고정비드의 파라핀 세포블록 사진.
도 7은 본 발명의 실시예에서 제작된, 세포절편의 면역세포화학염색 결과를 보여주는 현미경 사진.
이하 첨부된 도면과 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
본 발명이 속하는 기술분야에서 포매법에 의한 블록화 또는 절편화가 가능한 것은 '소정 이상 크기의' 조직(tissue)이나 기관(organ) 수준의 것으로 알려져 있다. 이에 반하여 본 발명에서 블록화 또는 절편화의 대상물은, 수용액에 혼탁(suspension) 가능한 세포 또는 파편화된 조직처럼 복수의 세포로 이루어진 세포괴이다. 본 발명의 설명, 청구범위나 실시예에서는 편의를 위해 '세포'만을 언급하지만 이때 세포는 혼탁 가능한 크기의 세포괴를 포함하는 개념이다.
한편, 본 발명자들은 세포의 절편화와 관련하여 "알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법"을 개발하여 특허출원(출원번호 10-2021-0006921)한 바 있다. 본 발명은 이 앞선 발명의 단점(비드의 강도약화에 따른 취급 어려움)을 보완하고 적용성을 확대(특정 세포의 절편화)한 것이다.
전술하였듯이 본 발명은 세포 또는 세포괴가 고정된 알지네이트-PVA 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법을 기본으로 하는데, 임의의 세포를 대상으로 하는 것과, 특정 세포를 대상으로 하는 것으로 구분된다. 이하 차례로 설명한다.
(1) 임의의 세포 대상
본 발명은 임의의 세포를 블록화/절편화 하는 것에 관한 것이다.
보다 상세하게는, (A) 알지네이트-PVA 복합비드에 세포 또는 세포괴가 고정된 세포고정비드를 제조하는 단계; (B) 상기 세포고정비드를 포매제에 매립하여 세포블록을 제작하는 단계; (C) 상기 세포블록을 소정의 두께로 커팅하여 세포절편을 제작하는 단계;를 포함하는 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 단계(A)는 다음의 두 가지 방법이 가능하다.
① (a) 1가이온 결합 알지네이트와 PVA 혼합 수용액에 세포를 혼탁시켜 제1액을 제조하는 소단계; 및 (b) 상기 제1액의 액적을 다가양이온 수용액인 제2액에 가하여 세포고정비드를 제조하는 소단계;를 포함한다. 이때 제1액에서 세포와 알지네이트 농도는 세포나 세포괴의 크기나 특성, 목표로 하는 비드의 크기 등에 따라 적절하게 조절할 수 있을 것이다.
② (a) 1가이온 결합 알지네이트와 PVA 혼합 수용액의 액적을 다가양이온 수용액에 가하여 복합비드를 제조하는 소단계; 및 (b) 상기 복합비드를 세포 혼탁액에 가하고 세포가 비드에 침투되도록 방치하여 세포고정비드를 제조하는 소단계;를 포함한다.
상기 단계(A)의 알지네이트 비드에 세포를 고정하는 방법, 단계(B)(C)의 세포블럭 제작과 절편화하는 방법 등은 당업계에서 널리 알려진 방법에 준하는 것이므로 이에 대한 구체적이고 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 파라핀법 뿐 아니라 동결법에도 적용될 수 있다. 따라서 상기 포매제는 파라핀 또는 OCT 화합물일 수 있다.
이하 종래 절편 제작법과 대비하여 본 발명에 의한 세포절편 제작과정을 도 1을 참조하여 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명에 의하면 세포나 미세 세포괴가 직접 포매제에 매립되는 것이 아니라 일단 알지네이트-PVA 복합비드에 고정된다(도면에서는 위 ② 방법에 따라 고정됨). 이때 복합비드의 부피는 최종 포매제의 부피에 비해 매우 작고, 고정화 과정에서 세포가 수용액에 고르게 현탁되어 있거나, 세포가 비드에 고르게 침투하므로 세포는 비드의 전체 공간에 고르게 분포하고, 직접 포매제에 매립되는 것에 비해 고농도로 고정된다. 이렇게 통상의 절편제작방법에서 다루기에 충분한 크기와 양의 세포고정비드가 준비된다. (단계(A))
이어서 준비된 세포고정비드를 종래 알려진 동결법 또는 파라핀법에 따라 소정의 포매제에 매립시키고 고형화하여 세포블록을 얻고(단계(B)), 박절기를 이용하여 소정 두께의 세포절편을 얻는다(단계(C)).
이렇게 본 발명에 의한 제작방법에 따라 제작된 세포절편은, 슬라이드나 홀드에 안착된 다음 포매제가 제거되더라도, 도 1의 단계(C)에 도시된 세포절편 개념도에서 볼 수 있듯이 복합비드(진한 타원형으로 표현된 부분)에 의해 세포가 고정된 상태이므로 이후 세척이나 염색 등의 작업을 하더라도 세포가 씻겨서 분실되는 현상이 크게 줄어든다.
본 발명에 의해 제작된 최종 세포절편을 (전자)현미경으로 관찰할 때 세포가 존재하는 위치 즉, 비드의 위치를 쉽게 파악할 수 있도록 세포고정비드가 소정의 색상으로 염색되어 있는 것도 좋을 것이다.
본 발명은, 종래 절편화할 수 없었던 단일세포 또는 미세 세포괴를 절편화할 수 있도록 하는 것에 특징이 있다. 특히 저농도의 단일세포 또는 미세 세포괴를 대상으로 할 때 본 발명의 장점이 더욱 발휘될 수 있다.
(2) 특정 세포 대상
또 다른 본 발명은, 다양한 종류가 혼합된 세포 혼합액에서 원하는 특정 세포만을 블록화/절편화 하는 방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명에 의한 세포절편 제작방법의 진행과정의 예시적 흐름도를 도 2에 도시하였다.
상세하게는, (A) 알지네이트-PVA 복합비드를 제조하는 단계; (B) 상기 복합비드 표면에 특정 세포에 특이적인 항체를 부착하여 항체결합비드를 제조하는 단계; (C) 상기 항체결합비드에 특정 세포가 결합된 특정세포고정비드를 제조하는 단계; (D) 상기 특정세포고정비드를 포매제에 매립하여 세포블록을 제작하는 단계; 및 (E) 상기 세포블록을 소정의 두께로 커팅하여 세포절편을 제작하는 단계;를 포함하는, 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법에 관한 것이다. 구체적인 과정에 대해서 하기 실시예에서 상세히 설명한다.
전술한 (1)발명과 비교하여, 복합비드를 제조하고 그 표면에 항체를 부착하여 항체결합비드를 제조하여 사용한다는 점에서 차이가 있다. 실시예에서는 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule; 상피세포 결합분자) 항체를 사용하였으나 실제로는 분리하고자 하는 세포에 특이적인 적절한 항체를 선택할 수 있음은 당연하다. 복합비드를 제조하는 방법, 세포를 결합시키는 방법, 세포고정복합비드를 포매하고 절편화하는 방법, 포매제의 종류, 염료의 추가 등은 전술한 (1)과 동일하므로 반복 설명을 생략한다.
본 발명에서 복합비드 표면에 특정 세포에 특이적인 항체를 부착할 때 항체의 부착성을 높이기 위해 소정의 방법으로 복합비드 표면을 개질하는 것이 바람직하다. 구체적인 개질 예를 실시예에 기재하였다.
한편 상기 단계(C)에서 획득된 특정세포고정비드에서, 도 2의 특정세포고정비드의 확대도에서 개념적으로 확인할 수 있듯이, 특정세포는 비드의 표면에 노출되어 있다. 비드 표면에 노출된 세포는 이후 세포블록 제작단계에서 비드에서 탈락될 가능성이 있다. 이에 본 발명에서는 일단 비드에 결합된 세포의 탈락을 방지하기 위하여 특정세포고정비드를 알지네이트겔로 코팅하는 소단계를 둘 수 있다. 이에 대해서도 하기 실시예에 상세히 기재하였다.
[실시예]
1. 특정세포고정비드의 제작
(1) 세포고정비드의 제작
① 각각 2%(w/v)의 Sodium alginate 및 PVA 수용액을 같은 부피로 혼합하고 85℃에서 일정하게 저으면서 끓인 다음 실온까지 식혀서 제1액을 준비하였다. 압출기를 사용하여 제1액을 100mM calcium chloride (CaCl2) 용액(제2액)에 구형의 비드 형태로 액적하고 1시간 동안 실온에서 교반하여 비드의 겔화(경화)를 유도하여 복합비드를 얻었다. 복합비드는 탈이온수로 수회 세척한 다음 상온에서 PBS 완충액에 보관하여 필요할 때 사용하였다. 도 3에 각각 알지네이트 용액(①), PVA 용액(②), 알지네이트+PVA 혼합용액(③), EDC/NHS 용액(④) 및 제조된 복합비드(⑤) 사진을 첨부하였다.
② 복합비드를 4℃ 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] 카르보디이미드(EDC) 200 mM과 N-hydroxysulfosuccinimide(Sulfo-NHS) 200 mM 혼합액에 담가 실온에서 1시간동안 교반하여 복합비드의 표면에 EDC-NHS 커플링을 활성화하는 표면개질을 하였다. 표면개질된 복합비드를 PBS 완충 용액으로 세척하였다.
이어서 표변개질 복합비드를 4℃ EpCAM 항체 용액(0.5 mg/mL, 1: 100 diluted in PBS)에 가하고 1시간동안 교반하여 복합비드 표면에 항체가 결합되도록 유도하였다. 이어서 비드를 PBS 완충 용액으로 세척하여 항체결합비드를 제조하였다.
이와 별도로, 폐암세포주 H358을 10 μM of CellTracker (Invitrogen)로 30분 형광염색한 다음 완충용액으로 세척하여 형광염색된 폐암세포주 H358을 준비하였다.
③ EpCAM 항체결합비드를 각각 폐암세포주 A549(형광염색된 것)와 H358 액과 혼합하고 실온에서 1시간동안 교반하여 각각의 폐암세포주와 비드가 결합된 두 종류의 특정세포고정비드를 얻었다. 세포고정비드를 PBS 버퍼에 세 번 세척하였다.
폐암세포주 A549와 H358 암종은 선암종 계열이고, A549는 EGFR 발현 세포주이며, H358은 EGFR 발현이 적은 세포주이다.
(2) 세포고정비드의 표면 관찰
① 위에서 얻어진 세포고정비드의 표면형태를 SEM/EDS 장비(SU8200; Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다. 비교예는 항체와 세포가 결합되지 않은 위 (1)①에서 제작된 복합비드이다.
표현형태학은 2kV의 가속도 전압과 4.7 mm의 작동 거리에서 SEM 모드를 통해 얻었다. 모든 영상은 1K의 배율로 확대되었다. 준비된 비드 샘플은 열화 또는 충전효과를 방지하기 위해 SEM 스터브에 장착되고 오스뮴(두께 3.0nm)으로 코팅된 양면 접착 테이프에 부착되었다.
세포고정비드 표면 전자현미경 사진을 도 4에 도시하였다. 사진에서 볼 수 있듯이, 항체와 세포가 결합되지 않은 복합비드(비교예)의 표면이 대체적으로 평탄한 반면, 항체와 세포가 결합된 세포고정비드(실시예) 표면에는 세포가 결합되어 있는 것(사진에서 하늘색 사각형으로 표시한 부분)을 확인할 수 있다. 실시예에서 작은 지저분한 부분이 항체만 결합된 것으로 생각된다.
② 형광염색된 폐암세포주 H358이 결합된 세포고정비드의 형광현미경 촬영 사진을 도 5에 첨부하였다. 형광염색된 세포가 연두색 형광의 굵은 점으로 표시되어 있어 특정세포가 비드에 잘 고정되어 있음을 알 수 있다.
2. 세포블록과 세포절편의 제작
세포고정비드를 1%(w/v)의 Sodium alginate 수용액에 담갔다 꺼내서 알지네이트 코팅한 다음, 100mM calcium chloride (CaCl2) 용액에 담가 1시간 동안 방치하여 보호층을 추가하였다.
이렇게 제작된 보호층이 형성된 특정세포고정비드를 FFPE(Formalin Fixed Paraffin Embedded) 세포블록 제작 표준 절차에 따라 다음과 같이 파라핀 세포블록을 얻었다.
세포고정비드를 파라포름알데히드 4%, 에탄올 70%, 에탄올 80%, 에탄올 90%, 에탄올 95% 및 에탄올 100% 순으로 조심스럽게 고정/탈수하였다. 탈수된 비드를 중간 용매인 Histogel 액에 20분간 침지하는 것을 2회 반복하였다. 이어서 비드를 카세트에 장착하고 카세트를 액화 파라핀 왁스(55~60℃)에 6시간 담갔다가 꺼내서 약 4℃에서 고체화시켜 세포블록을 제작하였다. 제작된 세포블록 사진을 도 6에 첨부하였는데, 사진에서 볼 수 있듯이 세포고정비드(사진에서 붉은 점선으로 표시한 부분)가 파라핀 블록 내에 삽입되어 있다.
이어서 통상의 절편기로 얻어진 세포블록을 박절하여 5~10㎛ 두께의 세포절편을 얻었다.
3. 제작된 세포절편의 면역세포화학염색
조직학적 병리진단시에 H&E 염색 이후에 병변이 의심되는 부분을 여러 가지 추가 염색(ex 특수염색, 면역세포/조직 화학염색, 형광염색 등)을 진행하게 되는데, 이 중의 하나인 면역세포화학염색을 실시하였다. 면역염색을 위한 항체로는 p63, Napsin A, EGFR를 예시적으로 선택하였다.
위 1의 방식으로 얻은 폐암 세포주 A549와 H358의 세포절편을 유리슬라이드에 부착하고, 4% paraformaldehyde 용액에 10 dip한다. 수돗물로 수세하고, 90℃ 이상 항원복구액 용액을 넣고 1시간 반응한다. sodium citrate 용액에 반응하고 항체 TTF-anti1을 1시간 동안 실온에서 반응한다. Wash buffer로 수세하고 2차항체를 40분동안 실온에서 반응한다. 수세하고 DAB 시약으로 실온에서 3분간 염색하고 mayer's hematoxylin으로 핵염색 1분 동안 실온에서 반응한다. 이렇게 염색이 완료된 시료의 현미경사진을 도 7에 도시하였다.
도시된 사진에서 볼 수 있듯이, TTF-1 발현을 DAB염색제에 의하여 갈색계열로 염색되었음을 확인할 수 있다. 폐암세포주 A549와 H358 암종은 선암종 계열의 세포주이다. A549는 EGFR 발현 세포주이며, H358은 EGFR 발현이 적은 세포주이다.
Claims (9)
- 삭제
- (A) 알지네이트-PVA 복합비드에 세포 또는 세포괴가 고정된 세포고정비드를 제조하는 단계;
(B) 상기 세포고정비드를 포매제에 매립하여 세포블록을 제작하는 단계;
(C) 상기 세포블록을 소정의 두께로 커팅하여 세포절편을 제작하는 단계;를
포함하는 것을 특징으로 하는 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법.
- 청구항 2에 있어서,
상기 복합비드는 포매제와 구분되는 소정 색상의 염료가 추가되는 것을 특징으로 하는 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법.
- 청구항 2에 있어서,
상기 단계(A)는,
(a) 알지네이트-PVA 복합비드를 제조하는 소단계;
(b) 상기 복합비드 표면에 특정 세포에 특이적인 항체를 부착하여 항체결합비드를 제조하는 소단계;
(c) 상기 항체결합비드에 특정 세포가 결합된 특정세포고정비드를 제조하는 소단계;를
포함하는 것을 특징으로 하는 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법.
- 청구항 4에 있어서,
상기 소단계(a)는,
(a') 소정 농도의 1가이온 결합 알지네이트 및 PVA 혼합수용액을 제조하는 소단계와, (b') 상기 혼합수용액 액적을 다가양이온 수용액에 가하여 알지네이트-PVA 복합비드를 제조하는 소단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법.
- 청구항 4에 있어서,
상기 소단계(b)에서,
복합비드 표면을 개질한 후에 항체를 부착하는 것을 특징으로 하는 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법.
- 청구항 4에 있어서,
상기 소단계(c) 이후에,
특정세포고정비드를 알지네이트겔로 코팅하는 것을 특징으로 하는 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법.
- 청구항 4에 있어서,
상기 포매제는 파라핀 또는 OCT 화합물인 것을 특징으로 하는 복합비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법.
- 청구항 4에 있어서,
상기 소단계(a)에서 소정 색상의 염료가 추가되는 것을 특징으로 하는 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법.
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