KR102576409B1 - 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 저농도의 세포를 대상으로 할 수 있으며 종래 고점도 포매제(매립제)의 문제점을 해소한 알지네이트 비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (A) 세포가 알지네이트 비드에 고정된 세포고정비드를 제조하는 단계; (B) 상기 세포고정비드를 소정의 포매제에 매립하고 동결하여 세포블록을 제작하는 단계; 및 (C) 상기 세포블록을 소정의 두께로 절편화하는 단계;를 포함하는 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법에 관한 것이다.

Description

알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법{Method for preparing cell-section using alginate bead}
본 발명은 세포나 조직의 절편 제작방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 저농도의 세포를 대상으로 할 수 있으며 종래 고점도 포매제(매립제)의 문제점을 해소한 알지네이트 비드를 매개로 하는 세포절편 제작방법에 관한 것이다.
정확한 병리진단을 위해 조직의 병변과 조직 내부의 단백질, 유전자의 위치나 존재를 시각적으로 확인할 필요가 있는데, 이를 위해 세포나 조직의 형태 그대로 소정의 포매제(매립제)로 포매하여 블록으로 제작하고 이를 절편화하여 현미경으로 관찰할 수 있도록 하는 절편 제작방법이 활용되고 있다.
절편 제작방법은 크게 파라핀을 포매제로 하는 파라핀법과, 동결조직 포매제(OCT compound)에 포매하고 동결시키는 동결법으로 구분된다.
파라핀법이 상대적으로 과정이 복잡하고 여러 장비가 요구되는 불편함과 유기용재의 사용, 가열 등의 처리가 있기 때문에 세포내 단백질, 지질, 가용성 항원물질 등의 유출이나 실활 때문에 '있는 그대로'의 관찰은 다소 불리하다. 동결법은 시료를 OCT로 감싸 -10~-40℃로 동결한 다음 동결절편박절기(cryotome)로 미세절단하여 관찰하므로 '있는 그대로' 관찰에 유리하며 단순하고 간편하여 신속하게 진행할 수 있다는 장점이 있지만 보존시 실온보관이 안되며 -20℃ 이하로 보관해야 하는 단점이 있다.
나아가 이들 제작방법에 의하면 포매제(녹은 파라핀, OCT)가 매우 고점도이기 때문에 특히 적은 농도(수)의 세포를 대상으로 절편화하는 것은 불가능하며, 세포가 고농도일 경우에는 세포의 중첩 및 겹침으로 인하여 관찰하고자 하는 '특정(specific) 세포'가 다른 세포들에 의한 마스킹 때문에 관찰이 용이하지 않은 문제가 있다.
또한 상황에 따라 세포나 조직 블록 또는 절편에서 세포나 조직을 재회수할 필요성이 있는데, 파라핀법에 의한 것은 재회수가 불가능하며, 동결법에 의한 것도 고점도의 OCT포매제를 다루기 어렵고 겔내 세포가 편재되며 세포 재회수가 매우 어렵다.
공개특허 10-2001-0099854는 조직 블록을 절단하는 방법 및 장치에 관한 것인데, 조직을 용기(몰드)에 넣어 알긴산중합체-물 혼합물을 주입하여 매립한 다음 냉각하여 마이크로톰으로 절편화하는 방법이 제시되어 있다. 즉 ㉮ 상대적으로 매크로한 기관이나 조직을 대상으로 ㉯ 변형된 알긴산플라스틱중합체를 사용하며 ㉰ 경화된 알긴산플라스틱중합체가 기관이나 조직의 외곽을 둘러싸 블록을 형성하는 것을 제시하고 있을 뿐, 천연의 알지네이트를 사용하거나 매크로한 기관이나 조직이 아닌 미세한 세포의 고정과 그의 동결절편에 대한 것은 아니다.
중국 등록특허 CN 108956221(Method for carrying out pathological section production by using sodium alginate)에는 알긴산 비드에 조직세포를 고정한 다음 회수하여 거즈로 누르면서 액체를 제거하여 판상으로 제작한 다음 절편화하는 방법이 제시되어 있다. 그러나 이에 의하면 가압탈수하는 과정에서 시료(세포)의 구조적 손상이 초래되므로 '있는 그대로'의 세포를 관찰하기에는 미흡한 점이 있다.
공개특허 10-2001-0099854 중국 등록특허 CN 108956221
본 발명은 제작이 쉽고, 세포가 균일하게 분포하여 관찰과 분석에 용이하며, 세포 포집율(활용비율)이 우수하고 세포 재회수가 가능한 새로운 동결절편 제작방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은
(A) 세포가 알지네이트 비드에 고정된 세포고정비드를 제조하는 단계; (B) 상기 세포고정비드를 소정의 포매제에 매립하고 동결하여 세포블록을 제작하는 단계; 및 (C) 상기 세포블록을 소정의 두께로 절편화하는 단계;를 포함하는 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 세포를 OCT에 직접 포매하는 대신 alginate 비드를 매개로 간접적으로 포매하여 블록화-절편화함으로써 다루기 쉽고, 겔 내 세포 분포의 균일화, 세포 포집율 향상, 세포 재회수가 가능하고, 특히 저농도 세포도 쉽게 동결절편할 수 있는 장점이 있다.
따라서 본 발명에 의하면, 종래 통상적인 세포나 조직 동결절편 제작방법과 비교하여 세포 손실이 적고 제작시간이 단축되어 응급검사용으로 적절하며, 또한 저농도의 세포로도 동결절편이 가능하며 동결 후 세포 재회수가 용이하여 적은 샘플로 다양한 검사가 가능하게 된다.
도 1은 본 발명에 의한 세포절편 제작방법에 따른 과정을 보여주는 개념도와 사진.
도 2는 본 발명에 의한 제작방법에 따른 중간산물인 세포고정비드의 표면 전자현미경 사진.
도 3은 본 발명의 실시예에서 얻어진 세포절편의 H&E 염색 결과를 보여주는 현미경 사진.
도 4 본 발명의 실시예에서 얻어진 세포절편의 면역세포화학염색 결과를 보여주는 현미경 사진.
이하 첨부된 도면과 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
본 발명에서 절편화의 대상물은 당업계에서 절편화 가능한 것으로 인식되고 있는 '소정 이상 크기의' 조직이나 기관 수준이 아닌 수용액에 혼탁(suspension) 가능한 세포 또는 파편화된 조직처럼 복수의 세포로 이루어진 세포괴이다. 본 발명의 설명, 청구범위나 실시예에서는 편의를 위해 '세포'만을 언급하지만 이때 세포는 혼탁 가능한 크기의 세포괴를 포함하는 개념이다.
전술하였듯이 본 발명은, (A) 세포가 알지네이트 비드에 고정된 세포고정비드를 제조하는 단계; (B) 상기 세포고정비드를 소정의 포매제에 매립하고 동결하여 세포블록을 제작하는 단계; 및 (C) 상기 세포블록을 소정의 두께로 절편화하여 세포절편을 얻는 단계;를 포함하는 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 단계(A)는 다음의 두 가지 방법이 가능하다.
① (a) 1가이온 결합 알지네이트 수용액에 세포를 혼탁시켜 제1액을 제조하는 소단계; 및 (b) 상기 제1액의 액적을 다가양이온 수용액인 제2액에 가하여 세포고정비드를 제조하는 소단계;를 포함한다. 이때 제1액에서 세포와 알지네이트 농도는 세포나 세포괴의 크기나 특성, 목표로 하는 비드의 크기 등에 따라 적절하게 조절할 수 있을 것이다.
② (a) 1가이온 결합 알지네이트 수용액의 액적을 다가양이온 수용액에 가하여 알지네이트 비드를 제조하는 소단계; 및 (b) 상기 비드를 세포 혼탁액에 가하고 세포가 비드에 침투되도록 방치하여 세포고정비드를 제조하는 소단계;를 포함한다.
상기 단계(A)의 알지네이트 비드에 세포를 고정하는 방법은 당업계에서 널리 알려진 방법이므로 이에 대한 구체적이고 상세한 설명을 생략한다.
본 발명에서 상기 포매제는 동결절편 제작에 사용되는 통상의 OCT 화합물이다.
본 발명은, 종래 절편화할 수 없었던 단일세포 또는 미세 세포괴를 절편화할 수 있도록 하는 것에 특징이 있다. 특히 저농도의 단일세포 또는 미세 세포괴를 대상으로 할 때 본 발명의 장점이 더욱 발휘될 수 있다.
한편 종래 절편 제작법에 의하면, ㉮ 파라핀이나 OCT 화합물이 지성이고 고점도이기 때문에 수용액에 현탁된 세포를 '고르게' 분포되도록 하기 매우 어려움(군데군데 덩어리져서 존재하게 됨) ㉯ 세포를 비교적 '고르게' 분포되도록 하더라도 세포블록에서 세포가 위치하는 장소를 특정하기 어려워 이를 (전자)현미경으로 정확히 찾아내어 관찰하기에 많은 시간과 노력이 필요함 ㉰ (전자)현미경 관찰을 위해 세포절편을 슬라이드나 홀드에 안착시키고 '포매제 제거→세척→염색' 등의 과정을 거쳐야 하는데 포매제가 제거되고 나면 세포를 잡아주는 매체가 없어 세포가 씻겨 나가게 됨. 따라서 이러한 사정 때문에 실질적으로 '조직'이나 '기관'이외에 (특히 저농도의) 세포나 미세 세포괴를 절편화할 수 없었다.
이하 종래 절편 제작법에 대비하여 본 발명에 의한 세포절편 제작과정을 도 1을 참조하여 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명에 의하면 세포나 미세 세포괴가 직접 포매제에 매립되는 것이 아니라 일단 알지네이트 비드에 고정된다(도면에서는 위 ② 방법에 따라 고정됨). 이때 알지네이트 비드의 부피는 최종 포매제의 부피에 비해 매우 작고, 고정화 과정에서 세포가 수용액에 고르게 현탁되어 있거나, 세포가 비드에 고르게 침투하므로 세포는 비드의 전체 공간에 고르게 분포하고, 직접 포매제에 매립되는 것에 비해 고농도로 고정된다. 이렇게 통상의 절편제작방법에서 다루기에 충분한 크기와 양의 세포고정비드가 준비된다. (단계(A))
이어서 준비된 세포고정비드를 종래 알려진 동결법에 따라 동결용 포매제에 매립시키고 동결하여 세포블록을 얻고(단계(B)), 박절기를 이용하여 소정 두께의 세포절편을 얻는다(단계(C)).
이렇게 본 발명에 의한 제작방법에 따라 제작된 세포절편은, 슬라이드나 홀드에 안착된 다음 포매제가 제거되더라도 도 1의 단계(C)에 도시된 세포절편 개념도에서 볼 수 있듯이 비드(진한 타원형으로 표현된 부분)에 의해 세포가 고정된 상태이므로 이후 세척이나 염색 등의 작업을 하더라도 세포가 씻겨서 분실되는 현상이 크게 줄어든다.
본 발명에 의해 제작된 최종 세포절편을 (전자)현미경으로 관찰할 때 세포가 존재하는 위치 즉, 비드의 위치를 쉽게 파악할 수 있도록 세포고정비드가 소정의 색상으로 염색되어 있는 것도 좋을 것이다.
이하 본 발명에 의한 실시예를 설명한다.
[실시예]
1. 세포절편의 제작
① 멸균증류수에 Sodium alginate (제조사: Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA))를 넣어 5% (w/v) 농도로 맞추고 37도에서 stir하여 완전히 녹인다. 녹인 용액에 pellet으로 모은 세포들을 넣고 고르게 혼탁하여 제1액을 준비한다. 200 mL calcium chloride (CaCl2) 용액(제2액)에 200 μL pipette으로 구형의 비드 형태로 액적하고 1시간 동안 실온에서 교반하여 비드의 겔화를 유도하여 세포고정비드를 얻는다. 얻어진 세포고정비드 일예의 사진을 도 1에서 확인할 수 있다.
② 동결절편 몰드 바닥에 OCT compoud를 깔고 그 위에 세척한 세포고정비드를 고르게 안착시킨 다음 OCT compound로 덮고 -20도에서 충분히 동결시켜 동결 세포블록을 얻는다.
③ 이어서 동결절편기로 5~10㎛ 박절하여 세포절편을 얻는다.
2. 제작과정에서 얻어진 세포고정비드의 특성 검토
(1) 세포고정비드의 표면
위 1①에서 얻어진 세포고정비드의 표면형태를 SEM/EDS 장비(SU8200; Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다(도 2). 비교예는 세포를 첨가하지 않은 비드이다.
표현형태학은 2kV의 가속도 전압과 4.7 mm의 작동 거리에서 SEM 모드를 통해 얻었다. 모든 영상은 1K의 배율로 확대되었다. 준비된 비드 샘플은 열화 또는 충전효과를 방지하기 위해 SEM 스터브에 장착되고 오스뮴(두께 3.0nm)으로 코팅된 양면 접착 테이프에 부착되었다.
도 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 세포고정비드에서는 표면에 노출되거나 표면 부근에 잠겨져 있는 것으로 해석되는 세포들을 확인할 수 있다(도면에서 화살표 부분).
(2) 세포고정비드의 세포포획 비율 및 세포회수 가능성 확인
1.107 × 106 (세포수/ml)의 혈액세포 500㎕ [즉, 세포수 5.535 × 105 개]를 Sodium alginate 수용액 200㎕와 혼합한 제1액 모두를 calcium chloride (CaCl2) 용액(제2액)에 적하하여 세포고정비드를 만들었다.
세포고정비드를 회수하여 세척한 다음 EDTA(0.5M pH 8.0) 용액에 10분간 반응시켜 비드를 액화한 다음 1500rpm 3분간 원심분리로 4.660 × 105 개의 혈액세포를 회수하였다. 이때 회수된 세포수는 세포고정비드에 고정된 세포의 수와 같다고 볼 수 있다.
따라서 세포 고정율(=회수율)은 "회수된 세포수/제공된 세포수"로 84.2%였다. 그러므로, 본 발명에 의한 세포절편 제작방법에 의하면 제공되는 세포의 대부분을 고정하여 관찰에 활용할 수 있으며, 필요에 따라서는 재회수도 가능함을 알 수 있다.
3. 제작된 세포절편을 이용한 관찰 예
(1) 세포절편의 H&E 염색
위 1의 방식으로 얻은 폐암 세포주 A549와 H358의 세포절편으로 슬라이드를 제작한 후, 암세포 확인을 위한 H&E 염색을 진행하였다.
제작된 세포절편을 유리슬라이드에 부착하고, 4% paraformaldehyde 용액에 10 dip한다. 수돗물로 수세하고, Mayer's hematoxylin 2분염색, 수돗물 10 dip, eosin 1분염색, 70~100% 순으로 알코올 10회 dip한다. 이렇게 염색이 완료된 시료의 현미경사진을 도 3에 도시하였다.
사진에서 볼 수 있듯이 두 종의 암세포주 모두 H&E 염색을 통해 세포의 형태가 확인되고, 핵(진한 보라색)과 세포질(핑크색)이 구분되며 이에 따라 N/C ratio(핵과 세포질 비율)를 확인할 수 있다.
(2) 세포절편의 면역세포화학염색
조직학적 병리진단시에 H&E 염색 이후에 병변이 의심되는 부분을 여러 가지 추가 염색(ex 특수염색, 면역세포/조직 화학염색, 형광염색 등)을 진행하게 되는데, 이 중의 하나인 면역세포화학염색을 실시하였다. 면역염색을 위한 항체로는 TTF-anti1를 예시적으로 선택하였다.
위 1의 방식으로 얻은 폐암 세포주 A549와 H358의 세포절편을 유리슬라이드에 부착하고, 4% paraformaldehyde 용액에 10 dip한다. 수돗물로 수세하고 90도 이상 항원복구액 용액을 넣고 1시간 반응한다. sodium citrate 용액에 반응하고 항체 TTF-anti1을 1시간 동안 실온에서 반응한다. Wash buffer로 수세하고 2차항체를 40분동안 실온에서 반응한다. 수세하고 DAB 시약으로 실온에서 3분간 염색하고 mayer's hematoxylin으로 핵염색 1분동안 실온에서 반응한다. 이렇게 염색이 완료된 시료의 현미경사진을 도 3에 도시하였다.
도시된 사진에서 볼 수 있듯이, TTF-1 발현을 DAB염색제에 의하여 갈색계열로 염색되었음을 확인할 수 있다. 폐암세포주 A549와 H358 암종은 선암종 계열의 세포주로 상대적으로 TTF-1이 발현하는 세포주이다.

Claims (6)

  1. (A) 세포가 알지네이트 비드에 고정된 세포고정비드를 제조하는 단계;
    (B) 상기 세포고정비드를 소정의 포매제에 매립하고 동결하여 세포블록을 제작하는 단계;
    (C) 상기 세포블록을 소정의 두께로 절편화하는 단계;를
    포함하는 것을 특징으로 하는 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계(A)는,
    (a) 1가이온 결합 알지네이트 수용액에 세포를 혼탁시켜 제1액을 제조하는 소단계; 및 (b) 상기 제1액의 액적을 다가양이온 수용액인 제2액에 가하여 세포고정비드를 제조하는 소단계;를
    포함하는 것을 특징으로 하는 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계(A)는,
    (a) 1가이온 결합 알지네이트 수용액의 액적을 다가양이온 수용액에 가하여 알지네이트 비드를 제조하는 소단계; 및 (b) 상기 비드를 세포 혼탁액에 가하고 세포가 비드에 침투되도록 방치하여 세포고정비드를 제조하는 소단계;를
    포함하는 것을 특징으로 하는 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계(A)에서,
    상기 포매제는 OCT 화합물인 것을 특징으로 하는 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계(B)에서 세포는,
    단일세포이거나 복수의 세포로 이루어진 세포괴를 포함하는 것을 특징으로 하는 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법.
  6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계(A)에서 포매제와 구분되는 소정 색상의 염료가 추가되는 것을 특징으로 하는 알지네이트 비드 매개의 세포절편 제작방법.
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