JP2017521642A - 細胞含有液体サンプルのための固定用組成物 - Google Patents
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Classifications
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- G01N2001/307—Fixative compositions non-toxic, no Hg, no formaldehyde
Abstract
Description
i)エタノールもしくはイソプロパノールから選択される、30〜70容積%のアルコール、
ii)2〜15%の有機酸、
iii)i)とは異なる10〜30%のヒドロキシル化合物、
iv)少なくとも10容積%、好ましくは少なくとも15容積%の水、
を含み、2〜5の範囲のpHを有する組成物によって表される。
a)液体サンプルを集める工程、
b)上記液体サンプルのうちの少なくとも一部と、先に記載されるとおりの固定用組成物とを接触させる工程、
c)上記工程b)のサンプルを混合する工程、
d)必要に応じて、上記サンプルを貯蔵する工程。
A)液体サンプルを集めるための手段、好ましくは、シリンジ、チューブ、容器、カップ、ニードル、穿刺もしくは吸引デバイス、
B)上記サンプル中に含まれる細胞の調査のための手段、好ましくは、スライド、ピペット、膜、フィルタ、
C)生体分子単離のための手段および/もしくは溶液、
D)細胞染色のための手段および/もしくは溶液、
E)サンプル包埋もしくは浸透のための手段および/もしくは溶液。
以下の実施例は、本明細書で記載されるとおりの組成物および方法を使用することによる、細胞含有液体サンプルの調査法および結果を記載している。上記実施例は、本発明を例証すると理解されるものとするが、本発明を具体的に示される実施形態に限定するとは理解されないものとする。
別段記載されなければ、以下の実施例のサンプルを、以下のとおり調製および処理した:
ヒト卵巣腺癌(SK−OV3)細胞を、単層として、McCoy’s 5A改変培地中で増殖させた。採取するために、細胞をPBSで洗浄し、EDTAでの一般的処理によってプレートから剥がし、McCoy’s培地で再懸濁した。細胞数を、Neubauer−Zaehlkammerで細胞を計数することによって決定した。細胞を培地でさらに希釈して、計算した濃度(例えば、106/ml)に達するようにした。細胞のアリコート(例えば、1ml)を遠心分離し、そのペレットを、ある容積の液体(例えば、100μl 培地、全血もしくは血漿)中で再懸濁して、上記液体固定用組成物でのその後の固定のために、液体中に計算した細胞数(例えば、106 細胞)を受けた。
切除の直ぐ後に、ラット組織を、標準的生検カセットのグリッドを通して押し込み、150μl PBS(リン酸緩衝化食塩水)と穏やかに混合した。あるいは、組織を、小片へと切り刻んだ。
上記最終サンプル組成物(FNA固定剤および上記生物学的物質含有サンプルの混合物)のうちの1mlまでを、EZ漏斗の中に満たし、サイトスピン4細胞遠心分離機(Cytospin 4 cytocentrifuge)(Shandon)で顕微鏡用スライド上に直接遠心分離した。スライドを数秒間風乾し、パパニコロウに従う染色(パパニコロウ・ヘマトキシリンで1分間核染色、パパニコロウ Lsg OG6(2a)で3分間ケラチン染色およびパパニコロウ Lsg EA50で3分間細胞質染色)、またはMerckのキットもしくは染色試薬を使用するH&E染色(30秒間ヘマトキシリンおよび1分間エオシン)による染色に使用した。
上記最終サンプル組成物のうちの1mlまでを、遠心分離した。そのペレットを、RNeasy溶解緩衝液RLTで再懸濁し、QIAShredderでホモジナイズした。エチル−アルコールで結合条件を調節した後、上記溶解物をRNeasyミニカラムに載せ、RNAを、遠心分離によって上記カラムのシリカ膜に結合させた。数回の洗浄工程および任意選択の、DNaseでのカラム上での消化の後に、上記RNAを水で溶離した。
ラット組織を、最大厚1〜2mmを有する小片へと切り出した。固定を、生検カセット中で行った。加工処理を、80%、90%、99%(2回) エタノール、続いて、イソプロパノール(2回)、キシレン(2回)、低融点パラフィンと1:1混合したキシレン中でのインキュベーション、浸透および低融点パラフィン中の包埋によって、Leica TP1020自動化プロセッサー(Leica,Wetzlar,Germany)上で行った。4μm厚を有する切片をスライドに載せ、脱パラフィンし、再び湿潤化(rehydrate)し、顕微鏡分析のために染色した。
上記最終サンプル組成物(FNA固定剤および上記生物学的物質を含むサンプルの混合物)のうちの1mlのアリコートを、遠心分離した。その得られたペレットを、1滴の融解したアガロース(5% 低融点超純粋アガロース(live technologies製))、すなわち、約50〜100μlと混合した。硬化させた後、上記アガロースブロックとその封入された生物学的物質を、標準的カセットの中へと移し、加工処理し、上記で記載されるとおりにパラフィン包埋し、切片にし、H&Eで染色した。
実施例1は、図1に示されるとおりのいくつかの分析方法でのサンプルの考えられる取り扱いを記載する。
細針吸引標本をシリンジの中に集め、スライド上の塗抹物を、風乾もしくはアルコール固定、続いて、細胞学的染色のために調製した後、その残りのサンプルを、細胞形態および生体分子の保存のために、本発明に従う固定用組成物を含むチューブへと直接分与した。上記生物学的サンプルを、上記チューブを10回転倒混和(inverting)することによって、または短時間のボルテックス工程によって、上記固定用組成物と混合した。このようにして作業することによって、分子に都合の良い新たな固定剤での固定は、従来の診断に干渉しない。
1.FNA標本を集める。
2.吸引物の適切なサンプルをスライドに分与する。
3.塗抹物を調製し、風乾もしくはアルコールで固定し、従来の細胞学的検査のために染色する。
4.残りのFNA標本を、上記液体生物学的サンプル中の細胞形態および生体分子の保存のために、上記固定用組成物で満たされたチューブもしくは容器の中に分与する。上記固定されたFNA標本を輸送および/もしくは貯蔵する。
5.上記固定されたFNAサンプルのアリコートの細胞遠心分離を行い、細胞学的検査のために染色する。
6.生体分子を別のアリコートから抽出する。
7.任意選択:パラフィン包埋細胞ブロックの調製のためにアリコートを使用する。
15mlファルコンチューブの中に、5ml 固定用溶液(1〜4)を、100μl ヒト全血と混合し、上記混合物を、室温で静置して貯蔵した。上記固定用組成物は、以下のとおりであった:
(1)PAXgene Tissue Fix(PreAnalytics)
(2)PreservCyt(Cytyc)
(3)95% エタノール p.a.
(4)本発明に従う固定用組成物: 50% EtOH、6% 酢酸、20% DEGMEA、ad 100% ddH2O。
カップの中で、1mlの固定用組成物(1〜6)をそれぞれ、全血由来の50μlのヒト血漿および2×105 培養ヒト卵巣腺癌(SK−OV3)細胞と混合した;室温で24時間後、顕微鏡用スライド上でのサイトスピン遠心分離機での遠心分離およびパパニコロウに従う染色を行った。図3において、上記細胞を400×の元の倍率で示す。使用した固定用組成物:(1)Surepath(BD)、(2)PreservCyt(Cytyc)、(3)95% エタノール p.a.、(4)PAXgene Tissue FIX(PreAnalytics)、(5)本発明に従う固定用組成物(60%[v/v] エタノール、10%[v/v] 酢酸、20%[v/v] エチレングリコール、ddH2Oでad 100%)、(6)本発明に従う固定用組成物(60%[v/v] エタノール、10%[v/v] 酢酸、10%[v/v] エチレングリコール、ddH2Oでad 100%)。
106 培養ヒト卵巣腺癌(SK−OV3)細胞の細胞ペレットを、100μlの細胞培養培地で再懸濁し、(1)〜(11)として以下で記載されるとおりの種々の成分(iii)を含む、本発明に従う4mlの固定用組成物と混合し、4日間、室温で貯蔵した。100μlのアリコート各々を、細胞遠心分離機で顕微鏡用スライド上に遠心分離し、パパニコロウに従って染色した(1000×の元の倍率で図4に示す)。さらに、同じ最終サンプル組成物のうちの1mlのアリコート各々を遠心分離し、そのペレットを、溶解緩衝液中に再懸濁し、RNAを上記に記載されるとおりに抽出した。RNAを、Agilent Bioanalyzerで分析した(ゲル画像を、3回の独立した複製物に関して、それぞれ細胞画像の右側に示す)。
2×105 培養ヒト卵巣腺癌(SK−OV3)細胞の細胞ペレットを、50μlのヒト血漿で再懸濁し、種々の量のアルコール、水および酸を有する1mlの固定用組成物(1)〜(7)と混合し、周囲温度で貯蔵した。1時間の貯蔵後、複製物を、サイトスピンで顕微鏡用スライド上に遠心分離し、パパニコロウに従って染色した(図5に400×の元の倍率で示される);独立して、複製物を6日間貯蔵し、遠心分離し、ペレットを、溶解緩衝液中に再懸濁し、RNAを上記に記載されるとおりに抽出した。RNAをAgilent Bioanalyzerで分析した(ゲル画像は、2回の独立した複製物に関して図5に示される)。
(1)60%[v/v] エタノール、10%[v/v] 酢酸、20%[v/v] 水、および10%[v/v] エチレングリコール、
(2)60%[v/v] エタノール、10%[v/v] 酢酸、10%[v/v] 水、および20%[v/v] エチレングリコール、
(3)60%[v/v] エタノール、10%[v/v] 酢酸、30%[v/v] エチレングリコール、
(4)60%[v/v] エタノール、15%[v/v] 酢酸、10%[v/v] 水、および15%[v/v] エチレングリコール、
(5)60%[v/v] エタノール、15%[v/v] 酢酸、および25%[v/v] エチレングリコール、
(6)70%[v/v] エタノール、15%[v/v] 酢酸、および15%[v/v] 水、
(7)70%[v/v] エタノール、15%[v/v] 酢酸、および15%[v/v] エチレングリコール。
106 培養ヒト卵巣腺癌(SK−OV3)細胞の細胞ペレットを、50μlの細胞培養培地で再懸濁し、40μl ヒト血漿および8μl ヒト全血の添加なし(図6: 1〜3)もしくは添加あり(図6: 4〜6)のいずれかで、(1)〜(3)として以下で記載されるとおりの種々の成分を含む本発明に従う4mlの固定用組成物と混合した。培養細胞および固定剤の混合物、または培養細胞、血漿、全血および固定剤の混合物を、7日間、室温で貯蔵した。貯蔵後に、1mlのアリコート各々を、細胞遠心分離機で顕微鏡用スライド上に遠心分離し、パパニコロウに従って染色した(図6: 1〜6)(400×の元の倍率)。
(1)50%[v/v] エタノール、10%[v/v] 酢酸、20%[v/v] 水、および20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、
(2)50%[v/v] エタノール、5%[v/v] 酢酸、25%[v/v] 水、および20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、
(3)50%[v/v] エタノール、2%[v/v] 酢酸、28%[v/v] 水、および20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート。
本発明に従う5mlの種々の固定用組成物(1)〜(6)を、106 培養ヒト卵巣腺癌(SK−OV3)細胞および100μlのヒト全血と、それぞれ混合した。固定された細胞および血液の混合物を、周囲温度で7日間貯蔵した。100μlのアリコート各々を、細胞遠心分離機で顕微鏡用スライド上に遠心分離し、パパニコロウに従って染色した(図7に400×の元の倍率で示される);さらに1mlのアリコートを遠心分離し、そのペレットを溶解緩衝液中に再懸濁し、RNAを上記に記載されるとおりに抽出した。RNAを、Agilent Bioanalyzerで分析した(ゲル画像を、3回の独立した複製物に関して図7に示す)。
(1)25%[v/v] 水、6%[w/v] 酢酸、20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ad 100%[v/v]エチルアルコール、
(2)25%[v/v] 水、6%[w/v] 酢酸、25%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ad 100%[v/v]エチルアルコール、
(3)20%[v/v] 水、6%[w/v] 酢酸、25%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ad 100%[v/v]エチルアルコール、
(4)20%[v/v] 水、10%[w/v] 酢酸、20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ad 100%[v/v]エチルアルコール、
(5)25%[v/v] 水、10%[w/v] 酢酸、20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ad 100%[v/v]エチルアルコール、
(6)25%[v/v] 水、10%[w/v] 酢酸、15%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ad 100%[v/v]エチルアルコール。
種々のpH(水酸化ナトリウムで調節)を有する本発明に従う5mlの固定用組成物(1)〜(3)を、100μl ヒト全血および106 培養ヒト卵巣腺癌(SK−OV3)細胞と混合し、7日間貯蔵した。
(1)「FNA−1」: 50%[v/v] エタノール、6%[w/v] 酢酸、20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、pH未調節、ddH2Oでad 100%、
(2)「FNA−2」: 50%[v/v] エタノール、6%[w/v] 酢酸、20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、pH3、ddH2Oでad 100%、
(3)「FNA−3」: 50%[v/v] エタノール、6%[w/v] 酢酸、20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、pH3.3、ddH2Oでad 100%。
1mlの3つの複製物各々を、遠心分離し、その得られたペレットを、溶解緩衝液RLT中で再懸濁し、RNAを上記に記載されるとおりに抽出した。RNAを、Agilent Bioanalyzerで分析した(図8B)。
本発明に従う5mlの固定用組成物(50%[v/v] エタノール、6%[w/v] 酢酸、20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ddH2Oでad 100%、pH未調節)を、50μl ラット全血、100μl ラット脾臓抽出物および106 培養ヒト卵巣腺癌(SK−OV3)細胞と混合し、7日間貯蔵した。
1mlの3つの複製物各々を遠心分離し、そのペレットを、溶解緩衝液RLT中に再懸濁し、RNAを上記に記載されるとおりに抽出した。RNAを、Agilent Bioanalyzerで分析した(図9B)。
ラット組織(1.脾臓、2.食道、3.腸)を、約1〜2mmの最大厚を有する小片へと切り出し、24時間、室温で、10mlの本発明に従う固定用組成物(50%[v/v] エタノール、6%[w/v] 酢酸、20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ddH2Oでad 100%、pH未調節(図10中の「FNA−固定」))または中性緩衝化ホルマリン(「NBF」)中で固定した。固定した組織をカセットの中に入れ、加工処理し、Leica TP1020自動化組織プロセッサーでパラフィン包埋した。4μm厚を有する切片を脱パラフィンし、H&Eで染色し、顕微鏡で分析した(結果は、図10、400×の元の倍率に示される)。
RT−qPCRにおける相対的転写物レベルの決定のために、RNAを、106 培養ヒト卵巣腺癌(SK−OV3)細胞から単離し、1mlの本発明に従う固定用組成物(50%[v/v] エタノール、6%[w/v] 酢酸、20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ddH2Oでad 100%、pH未調節)の中で固定した。5分後、10分後、20分後もしくは60分後に、RNAを上記細胞から単離した。デルタCt値計算の参照として、RNAを、上記固定用組成物中でのインキュベーションなしでRNeasy溶解緩衝液RLT(Qiagen)中で直接溶解した106 細胞の細胞ペレットからも単離した。
5mlの本発明に従う固定用組成物(50%[v/v] エタノール、6%[w/v] 酢酸、20%[v/v] ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ddH2Oでad 100%)(pH未調節(A)もしくは水酸化ナトリウムでpH3に調節(B))を、100μl ラット全血、ラット肝臓抽出物および106 培養ヒト卵巣腺癌(SK−OV3)細胞と混合した。7日間、周囲温度で貯蔵した後、1mlのアリコート各々を遠心分離し、パラフィン中の細胞ブロックを、上記で記載されるとおりに調製した。4μmの切片を脱パラフィンし、H&Eで染色した(図12:400×の元の倍率)。
Claims (15)
- ホルマリン非含有固定用組成物であって、前記組成物は、
i)エタノールもしくはイソプロパノールから選択される、30〜70容積%のアルコール、
ii)2〜15%の有機酸、
iii)i)とは異なる10〜30%のヒドロキシル化合物
iv)少なくとも10容積%の水、
を含み、2〜5の範囲のpHを有する、固定用組成物。 - 成分i)〜iv)および必要に応じてpH調節因子から本質的になる、請求項1に記載の固定用組成物。
- 前記化合物iii)は、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート(DEGMEA)、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、またはジオールもしくはトリオールであり、前記ジオールもしくはトリオールは、好ましくは、エチレングリコール、ジエチレングリコール、グリセロール、ヘキサントリオール、1,3−ブタンジオール、2,3−ブタンジオール、1,3−プロパンジオール、1,5−ペンタンジオール、2−メチル−2,4−ペンタンジオール、およびジプロピルグリコールから選択される、請求項1または2に記載の固定用組成物。
- ii)前記有機酸は、酢酸もしくはプロピオン酸である、請求項1〜3のいずれかに記載の固定用組成物。
- 前記組成物は、
ii)40〜60容積% エタノールもしくはイソプロパノール、好ましくはエタノール、
iii)4〜10%の有機酸、好ましくは酢酸、
iv)i)とは異なる15〜30%のヒドロキシル化合物、
v)少なくとも10容積%、好ましくは少なくとも20容積%の水、
を含むか、好ましくは、これらからなる、2〜5の範囲のpHを有する、請求項1〜4のいずれかに記載の固定用組成物。 - 生物学的細胞含有サンプル、好ましくは液体細胞含有サンプル、特に、細針吸引サンプルの処理および/もしくは貯蔵のための、請求項1〜5のいずれかに記載の固定用組成物の使用。
- 細胞含有液体サンプルの処理のための方法であって、前記方法は、
a)液体サンプルを集める工程、
b)前記液体サンプルのうちの少なくとも一部と、請求項1〜5のいずれかに記載の固定用組成物とを接触させる工程、
c)工程b)の前記サンプルを混合する工程、
d)必要に応じて、前記サンプルを貯蔵する工程、
を包含する、方法。 - 工程c)の後もしくは工程d)の後の前記サンプルもしくは前記サンプルのうちの少なくとも一部は、以下の方法:細胞学的調査、生体分子単離、濾過・浸透および/もしくは包埋物質での前記細胞の包埋、のうちの少なくとも1つによってさらに処理される、請求項7に記載の方法。
- 前記方法のうちの1種より多くが、同じサンプルのアリコートで行われる、請求項8に記載の方法。
- 以下の特徴:
i)前記細胞学的調査は、セルソーティング、細胞遠心分離、塗抹法もしくは膜濾過、細胞染色、解剖、ハイブリダイゼーション法もしくは免疫組織化学法および顕微鏡検査のうちの少なくとも1つ
を含む;
ii)前記生体分子単離は、核酸、タンパク質、ペプチド、ペプチド−核酸のうちの少なくとも1つの単離を含む;
iii)前記浸透もしくは包埋物質は、パラフィン、鉱油、非水溶性ワックス、セロイジン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、アガー、ゼラチン、ニトロセルロース、メタクリレート樹脂、エポキシ樹脂、もしくは他のプラスチック媒体から選択される、
のうちの1つもしくはより多くによって特徴付けられる、請求項8または9に記載の方法。 - 前記細胞含有液体サンプルは、水性溶液、好ましくは緩衝液もしくは細胞培養培地;任意の体液、好ましくは血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、精液、リンパ液、涙液、唾液、痰、滲出液、腹水;環境水サンプル;食品もしくは飲料サンプル中の細胞を含み、最も好ましいサンプルは、細針吸引物である、請求項6に記載の使用または請求項7〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞は、ヒトもしくは動物、特に、哺乳動物もしくは昆虫細胞;植物細胞;または微生物、特に、細菌、酵母、原生生物、藻類もしくは真菌に由来する、請求項6に記載の使用または請求項7〜11のいずれかに記載の方法。
- 細胞含有液体サンプルの保存のためのキットであって、前記キットは、請求項1〜5に記載の固定用組成物、および必要に応じてさらに、以下のさらなる成分:
A)液体サンプルを集めるための手段、好ましくはシリンジ、チューブ、容器、カップ、ニードル、穿刺もしくは吸引デバイス、
B)前記サンプル中に含まれる細胞の調査のための手段、好ましくはスライド、ピペット、膜、フィルタ、
C)生体分子単離のための手段および/もしくは溶液、
D)細胞染色のための手段および/もしくは溶液、
E)サンプル包埋のための手段および/もしくは溶液、
のうちの少なくとも1つを含み、ここでさらなる成分としてA)が好ましい、キット。 - 生体分子単離、サンプル/細胞染色またはサンプル包埋もしくは浸透のための、請求項1〜5のいずれかに記載の固定用組成物との接触後の、または請求項7〜11のいずれかに記載の方法で処理された、生物学的サンプルの使用。
- 生体の外側にある生物学的物質の分析のための方法であって、ここで請求項1〜5のいずれかに記載の組成物、請求項7〜12のいずれかに記載の方法、または請求項13に記載のキットが使用される、方法。
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