WO2011027089A1 - Extraction rapide des hepatotoxines cellulaires - Google Patents

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WO2011027089A1
WO2011027089A1 PCT/FR2010/051848 FR2010051848W WO2011027089A1 WO 2011027089 A1 WO2011027089 A1 WO 2011027089A1 FR 2010051848 W FR2010051848 W FR 2010051848W WO 2011027089 A1 WO2011027089 A1 WO 2011027089A1
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extraction
composition
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water
hepatotoxins
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PCT/FR2010/051848
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Bernard Lagoutte
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Commissariat Al'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S)
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Publication date
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    • G01N2001/4061—Solvent extraction

Definitions

  • the present invention relates to a simple and robust reagent capable of very efficiently extracting cellular hepatotoxins from toxic cyanobacteria.
  • the reagent is an aqueous mixture of an organic solvent and a nonionic detergent maintained at a controlled acidic pH.
  • the invention also relates to a method for extracting cellular hepatotoxins from toxic cyanobacteria using this reagent, in particular by direct extraction in a liquid medium or by cell extraction on a filter after a concentration step. This method is adapted to the implementation of implementation of rapid water quality controls in the field.
  • Cyanobacteria formerly known as blue-green algae, are unicellular or multicellular photosynthetic bacteria. Different genera are able to synthesize and excrete partially in the external environment toxic substances. These organisms are more and more widespread around the world, and frequently generate characteristic blooms on the surface of water bodies ("blooms"). Microcystins are the most uniform class of cyanotoxins found. Cyanobacterial blooms mainly contaminate stagnant water such as pools, lakes (natural or retention), bathing waters and reservoirs; these contaminations are likely to cause acute health problems in both humans and animals (Toxic Cyanobacteria in Water: A Guide to their Public Health Consequences, Monitoring and Management, Chapter 2. Cyanobacteria in the environment.
  • Hepatotoxins currently fall into two families: microcystins and nodularins. These two families consist of very close cyclic peptides, comprising respectively 7 or 5 amino acids, including a particular 3-C20 residue called Adda (3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldecanic acid). -4,6-dienoic):
  • microcystins have a cyclic heptapeptide ring structure of cyclo (-D-Ala-L- -D-erythro-3-methylisoAsp-L-V-Adda-D-iso-Glu-N-methylmühyrdoAla) sequence where X and Y are two variable amino acids in L configuration.
  • microcystin-LR is called a microcystin comprising a leucine in position X and an arginine in position Y.
  • Nodularines are pentapeptides consisting of Adda, D-erythro-3-methylaspartic acid, D-glutamic acid, L-arginine, N-methyl-2-dehydrobutyrin and a variable amino acid.
  • toxins are inhibitors of eukaryotic cell phosphatases 1 and 2A (MacKintosh et al (1990) FEBS Lett 264, 187-192). In vertebrates, they are rapidly sequestered in hepatocytes and can cause severe liver damage (Nishiwaki-Matsushima et al (1992) J. Cancer Res., Clin., Oncol.1181, 420-424).
  • microcystins In the case of microcystins, it is likely that the multiplicity of variants of these toxins, due to methylations and many possible amino acid substitutions at two variable sites, lead to different solubility characteristics of the microcystins. Indeed, more than 70 Microcystin variants have been identified (MacKintosh et al (1990) FEBS Lett 264, 187-192).
  • Metcalf J.S. and Codd G.A. 2000, FEMS Microbiology Letters 184, 241-246 have described a method for extracting microcystins and nodularins from cyanobacteria by incubation in boiling water for 1 min or by microwave treatment. These two extraction methods are presented as alternatives to organic solvent-based methods that may subsequently interfere with sensitive detection methods for microcystins and nodularins, such as immunoassays.
  • microcystins and nodularins can be separated by HPLC and identified by their UV absorption spectrum (characteristic maximum at 238 nm). Mass spectrometry must then be implemented for a complete characterization.
  • the invention relates to a hepatotoxin extraction reagent for cyanobacteria, in particular microcystins and / or nodularins, which comprises an alcohol / water mixture, a detergent and an acidifier.
  • the cyanobacterial hepatotoxin extraction reagent is a composition comprising:
  • This composition is very effective for extracting hepatoxins from the most common cyanobacteria, such as Microcystis aeruginosa.
  • some cyanobacteria require an acidic pH for the extraction of hepatoxins to be efficiently performed; this is particularly the case for the genus Planktothrix.
  • the composition may furthermore comprise an acidifying agent, the acidifying agent being present in sufficient quantity for the composition to be diluted by a factor of 2 with water, has a pH between 1, 8 and 2.5.
  • the composition consists of the mixture of 20 to 60%, advantageously 20 to 50% (volume: volume: v: v) of alcohol of C3, of 0.1 to 2% (weight: volume: v)) at least one detergent, optionally an acidifying agent, if present, in an amount sufficient so that the composition, after dilution by a factor of 2 with water, has a pH between 1 , 8 and 2.5, and water qs 100%.
  • the alcohol is a C3 aliphatic alcohol, ie the alcohol is selected from the group consisting of propanol and isopropanol.
  • the use of a mixture of these C 3 aliphatic alcohols is possible.
  • a 1: 1 mixture of propanol and isopropanol led, for example, to an extraction yield substantially similar to the yield obtained with propanol or isopropanol alone.
  • the alcohol is propanol, the latter having generally shown the best extraction yields from Microcystis aeruginosa which is the most widespread toxic reference cyanobacterium.
  • the use of aliphatic alcohol having a carbon chain C4 or more is extremely difficult because of miscibility problems of alcohols with water, except to use a more complex mixture.
  • the maximum content of alcohol in the reagent was ideally set at 60% so that the final content in the extraction medium, after dilution by half with a sample of water to be analyzed, does not exceed 30%. Higher levels of alcohol are possible but are likely to interfere with the subsequent implementation of immunological tests to detect hepatotoxins, which would then require diluting the samples extracted before analysis, so as to reduce their content. in alcohol.
  • the composition comprises 20 to 60% (v: v), more preferably 30 to 50% (v: v), advantageously 40 to 50% (v: v), or 20 to 40% (v: v). more preferably 30 to 40% (v: v) of C3 aliphatic alcohol.
  • the detergent may be any detergent customary in biology or detergent mixture. It may be for example a zwitterionic detergent, such as CHAPS, a nonionic detergent, for example Nonidet P-40 (NP-40), the Triton series, glycosylated surfactants, the Tween series, or an ionic detergent such as SDS. All detergents tested (CHAPS, Nonidet P40, Triton X100, n-Dodecyl-3-D-Maltoside, and Tween 20) have indeed led to a very significant increase in the amount of microcystins extracted relative to the non-alcohol / water mixture. added detergent.
  • a zwitterionic detergent such as CHAPS
  • a nonionic detergent for example Nonidet P-40 (NP-40)
  • NP-40 Nonidet P-40
  • SDS ionic detergent
  • All detergents tested have indeed led to a very significant increase in the amount of microcystins extracted relative to the non-alcohol / water mixture
  • the choice of detergent may however be dictated by the compatibility of the detergent with the method of detecting hepatoxins then used.
  • the detergent will preferably be compatible with direct detection of hepatoxins by immunological methods: it is preferably a zwitterionic or nonionic detergent, for example CHAPS, NP-40 or Tween 20, the ionic detergents are generally incompatible with immunological methods, except to use high dilutions after extraction, as may be the case for EIA assays.
  • a preferred detergent is Tween 20 since it is very classically used in immunoassays.
  • the proportion of detergent in the composition according to the invention is preferably between 0.2 and 0.5% (p: v), more preferably between 0.3 and 0.4% (p: v).
  • the acidifying agent is preferably a strong acid, usually used for biochemical analyzes, for example hydrochloric acid or trifluoroacetic acid.
  • the acidifier is trifluoroacetic acid.
  • Acidification of the extraction medium that is to say the mixture water / propanol / Tween 20 diluted volume to volume with a sample
  • trifluoroacetic acid has in fact led to a greater increase.
  • strong level of extraction of microcystins from the species Planktothrix agardhii compared to 0.01 N hydrochloric acid (final pH of 2.1 in both cases).
  • the genus Planktothrix is an example of cyanobacteria for which microcystin extraction yields are low when the extraction is carried out in a neutral medium.
  • the composition according to the invention comprises between 0.1 and 0.4% (volume: volume), preferably 0.2% (v: v), of trifluoroacetic acid.
  • composition may also comprise between 0.01 and 0.04 N, preferably 0.02 N, of hydrochloric acid.
  • composition comprises or consists of:
  • a detergent compatible with immunological methods preferably CHAPS, NP-40 or Tween 20, more preferably Tween 20,
  • the composition comprises or consists of 40-50%, preferably 30-50%, or 30-40% propanol (vol: vol), 0.3 to 0.4% (weight : vol) of a detergent compatible with the immunological methods as defined above, preferably Tween 20, 0.1 to 0.4% (vol: vol) of trifluoroacetic acid, and water qs 100%.
  • composition or reagent according to the invention can be provided in the form of a two-solution kit since the complete reagent can have an insufficiently long storage time at room temperature when the acidifying agent is present.
  • the kit then comprises a first aqueous composition comprising the alcohol and the detergent and a second aqueous composition comprising the acidifying agent.
  • the respective contents of alcohol and detergent, on the one hand, and the acidifying agent, on the other hand, are such that, by mixing x volume (s) of the first aqueous composition with the volume (s) of the second aqueous composition, an aqueous composition is reconstituted comprising 20 to 60%, preferably 20 to 50% (v: v) of an alcohol selected from the group consisting of propanol and isopropanol, or a mixture thereof, and 0.1 to 2% (p: v) of at least one detergent.
  • kit could be: a) a first composition comprising or consisting of:
  • x and y are positive numbers, and y is preferably between x / 2 and x / 9.
  • the kit includes:
  • a) a first composition comprising or consisting of:
  • the first and second compositions are stable at room temperature. However, it may be preferred to keep them at 4 ° C.
  • the extraction reagent is reconstituted by mixing the first composition and the second composition on the day of the analysis.
  • the kit may further include:
  • the kit may comprise instructions for mixing x volumes of said first composition with y volumes of said second composition to constitute a cyanobacterial hepatotoxin extraction reagent; and or
  • polypropylene or glass tubes for example ependorf tubes of 2 ml or graduated tubes with screw cap of greater volume; and or
  • the alcohols, detergents and acidifiers used in the composition of the kit are as defined in the extraction reagent according to the invention. Reagent use and extraction method
  • the invention also relates to the use of the extraction reagent as defined above, after dilution by half with water or a sample to be analyzed, for the extraction of cyanobacterial hepatotoxins, in particular for the extraction of microcystins and / or nodularins.
  • composition thus prepared from the extraction reagent according to the invention makes it possible to extract the hepatotoxins associated with cyanobacteria, and thus to quantify the associated hepatotoxins and possibly the total hepatotoxins of a sample of liquid likely to contain a cell suspension of cyanobacteria from a sample taken from a lake, pond, pond or other.
  • Total hepatotoxins means the associated and free hepatotoxins present in the sample.
  • the contents of the constituents of the extraction reagent according to the invention have been set for optimum use based on a mixture of volume of the reagent with a liquid sample containing a cell suspension of cyanobacteria.
  • a concentration of the sample can be carried out prior to extraction.
  • the invention therefore relates to the use of a composition comprising or consisting of:
  • an acidifying agent in an amount sufficient for the composition to have a pH of between 1.8 and 2.5;
  • the invention also relates to a method for extracting hepatotoxins from cyanobacteria which comprises the following steps:
  • composition comprising or consisting of:
  • the composition used is obtained by half dilution of the extraction reagent according to the invention, either with water or with a cell suspension to be analyzed, such as explained below.
  • Constituents likely to be part of the composition used for the extraction, and particularly the preferred embodiments, are therefore as described above in the section "extraction reagent", except that the concentrations of the various constituents (except water) indicated in relation with the extraction reagent are halved as regards composition implemented in the extraction method according to the invention.
  • the extraction reagent comprises 20 to 60% (v: v), preferably 30 to 50% (v: v), preferably 40 to 50% (v: v), or 20 to 40% (v: v), preferably 30 to 40% (v: v), aliphatic alcohol C3, in the use and the extraction method according to the invention, the composition placed in contact with cyanobacteria will comprise 10 to 30% (v: v), preferably 15 to 25% (v: v), advantageously 20 to 25% (v: v), or 10 to 20% (v: v), preferably 15 to 20% of C3 aliphatic alcohol.
  • the alcohol is preferably propanol or isopropanol.
  • the composition preferably comprises between 0.1 and 0.25% (p: v), more preferably between 0.15 and 0.2 % (p: v) of at least one detergent, the detergent being as previously defined.
  • the composition may comprise between 0.05 and 0.2% (v: v), preferably 0.1% (v: v ), trifluoroacetic acid; or between 0.005 and 0.02 N, preferably 0.01 N hydrochloric acid, as acidifying agent.
  • the composition comprises or is thus constituted preferentially:
  • a detergent compatible with immunological methods preferably CHAPS, NP-40 or Tween 20, more preferably Tween 20,
  • the extraction composition comprises or consists of 10 to 30% (v: v), more preferably 15 to 25% (v: v), more preferably 20 to 25% (v: v), or alternatively 15-20% propanol (vol: vol), 0.15 to 0.2% (weight: vol) of a detergent compatible with the immunological methods as defined above, for example CHAPS, NP-40 or Tween 20, preferably Tween 20, 0.05 to 0.2% (vol: vol) trifluoroacetic acid and water qs 100%.
  • a detergent compatible with the immunological methods as defined above for example CHAPS, NP-40 or Tween 20, preferably Tween 20, 0.05 to 0.2% (vol: vol) trifluoroacetic acid and water qs 100%.
  • the extraction method according to the invention is implemented on a cell suspension capable of containing cyanobacteria.
  • the method then applies directly to the liquid sample and includes the following steps:
  • step b) incubating the mixture of the cell suspension containing cyanobacteria and extraction reagent according to the invention (ie the extraction mixture obtained in step a)) for a time sufficient to obtain the extraction of hepatotoxins.
  • the extraction reagent is mixed volume to volume with the water sample likely to contain cyanobacteria (the cell suspension of cyanobacteria).
  • the mixture is advantageously stirred for a few seconds, for example for at least 5 seconds, preferably at least 10 seconds, in particular for 10 to 15 seconds.
  • the mixture may be incubated for example at least 3 minutes, preferably at least 5 minutes, for example between 3 and 10 minutes.
  • the hepatotoxins of extracted cyanobacteria being stable in the reaction medium, the incubation can be continued as long as desired.
  • the method may advantageously comprise a step of filtration of all or part of the extraction mixture (more reactive cell suspension), to harvest said extraction mixture, in order to eliminate the cells and particles may interfere with subsequent dosing.
  • the sizes of the cyanobacteria producing hepatotoxins can range from 2.5 ⁇ (Microcystis aeruginosa) to several tens of ⁇ for multicellular (Planktothrix and Nodularia).
  • the filter used must therefore preferably have an effective porosity adapted to the retention of cells of 2 ⁇ in diameter and also be inert to C3 alcohols, detergents and acids.
  • An inert support of mixed porosity of 0.8 to 8 ⁇ can for example be used.
  • borosilicate glass fiber filters and mixed porosity of 0.8 to 8 ⁇ are used; these filters have a high capacity and a high flow rate. Filters with a narrower porosity, with a threshold greater than or equal to 1 ⁇ can also be used for low density cell suspensions.
  • the filtrate obtained containing the total hepatotoxins can be adjusted to pH by dilution in a buffer suitable for immunological measurements and analyzed directly, for example by enzyme-linked immunosorbent assay or hepatotoxin test strips.
  • these methods can advantageously use a monoclonal antibody specific for the Adda residue of microcystins and nodularins, for example the monoclonal antibody MC-159 described by Kreich et al. (2009, Toxicon, 53, 551-559).
  • the method for extracting hepatotoxins is implemented from a concentrated cell deposit on a filter, using the filtration system described above.
  • the filtrate consisting solely of the extracellular medium, makes it possible to measure the free hepatotoxins.
  • the direct extraction of the cells immobilized on the filter is carried out by diluting the extracting reagent according to the invention in half with water.
  • the direct extraction of the cells immobilized on the filter gives the cellular content of hepatotoxins, the addition of this content with the content of free hepatotoxins giving the total content of hepatotoxins.
  • the cyanobacteria contacted with said composition may be in the form of a retentate obtained by filtration of a cell suspension containing cyanobacteria (in particular a sample to be analyzed).
  • the extraction method according to the invention comprises the steps of:
  • step b) contacting the retentate containing the cyanobacteria obtained by filtration in step a) with a composition comprising or consisting of:
  • an acidifying agent in an amount sufficient for the composition to have a pH of between 1.8 and 2.5;
  • the filtration is preferably carried out on an inert support of mixed porosity of 0.8 to 8 ⁇ , for example on borosilicate glass fiber filters with mixed porosity of 0.8 to 8 ⁇ .
  • the extraction composition can be prepared the same day by mixing a volume of water with a volume of extraction reagent, the extraction reagent having been reconstituted the same day as well.
  • the contacting of the composition with the cyanobacteria can be carried out by depositing the composition on the filter used for the filtration of a cell suspension containing cyanobacteria.
  • 2 ml of composition can be used for 20 ml of sample to be analyzed, the cells of which have been concentrated by filter retention.
  • Part of the composition may initially be passed through the filter to ensure homogenous contacting of the composition with the concentrated cyanobacteria.
  • the filter on which the composition has been deposited can then be incubated, for example at least 3 minutes, preferably at least 5 minutes, for example between 3 and 10 minutes, before passing the rest of the composition through the filter.
  • the filtrate that contains the extracted hepatotoxins is harvested.
  • the implementation of the extraction method according to the invention may be associated with a method for detecting and / or quantifying cyanobacterial hepatotoxins comprising the steps of detecting and / or quantifying the cyanobacterium hepatotoxins in an extract of hepatotoxins obtained by an extraction method according to the invention.
  • a person skilled in the art can carry out a direct analysis of free hepatotoxins by taking a determined volume of liquid to be analyzed, for example 2 ml using a polypropylene syringe.
  • the volume taken can be filtered and the filtrate containing the free hepatotoxins subjected to analysis, for example by ELISA, dipstick, or any other appropriate method (chromatography, mass spectrometry, etc.).
  • filtration can be easily performed by fitting a filter unit (eg Swinnex filter holder and seal, SX0001300 and SX0001301, diameter 13 mm) to the syringe available from the Millipore company, and 0.8 / 8 ⁇ filter in micro borosilicate glass fibers (Millipore, AP2501300)).
  • the filtration is carried out drop by drop, in a vertical position, preferably without exceeding 4/5 drops per second.
  • the filtrate can be collected in a 2 ml propylene tube (for example ependorf type) and subjected directly to the hepatotoxin assay.
  • Those skilled in the art can perform a total hepatotoxin assay by mixing a volume of the extraction reagent with a volume of the liquid to be analyzed, for example in a closed container of polypropylene or glass.
  • Ependorf 2ml tubes can be used for small volumes. It may be more practical to use graduated tubes of higher volume with screw cap and volumes of 2 to 5 ml.
  • the sealed tube may be shaken vigorously for about 10 seconds and allowed to stand for about 5 minutes before shaking again for about 10 seconds.
  • 1.5 to 2 ml of the liquid can be removed using a polypropylene syringe and filtered as explained above, preferably not exceeding 2/3 drops per second. The filtrate is collected, for example, in a 2 ml polypropylene ependorf tube.
  • the volume of extract required can then be diluted N times in a buffer adapted to the immunoassay chosen for the detection / quantification of hepatotoxins.
  • the dilution factor is easily determined by the operator according to the analytical method used. For the use of test strips, dilution of a factor of 2 is usually necessary. If an ELISA method is used, much larger dilution factors can be adopted.
  • a suitable dilution buffer may be 100 mM sodium phosphate pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin (final concentrations) (p: v).
  • a 75 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, 30 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin. with addition of 0.1% Tween 20 (p: v) can be used (final concentrations).
  • the concentration of total hepatotoxins in the liquid sample is determined by multiplying by 2N the analysis result, to correct the effect of the successive dilutions.
  • a) Take 20 ml of liquid to be analyzed using a graduated syringe; b) Slowly filter in a vertical position, for example on cartridges based on a filter holder and Swinnex seal (SX0001300 and SX0001301) available from Millipore, and 0.8 / 8 ⁇ filter in micro borosilicate glass fibers (Millipore, AP2501300), preferably not exceeding 4/5 drops per second.
  • the cartridge can be purged with a little air to ensure complete filtration.
  • the cell deposit obtained is preferably homogeneous.
  • c) Dilute volume-to-volume extraction reagent with water and draw 2 ml of the mixture using a small polypropylene syringe.
  • the flow of extraction reagent is fast at the very beginning for a uniform wetting of the filter and then carried out drop by drop (for example 2/3 drops per second). It is best to avoid purging the cartridge with air, which allows the filter to stay in contact with the reagent.
  • the filter is allowed to incubate for about 5 minutes and the extraction is complete with the remainder of the reagent.
  • the filtrate can be recovered with the same syringe to extract the filter a second time in a single step. As an indication, a filtration of 1 ml ideally lasts about 20 seconds.
  • d) Dilute the necessary volume of filtrate by an N factor in the appropriate buffer (eg phosphate buffered saline: 100 mM sodium phosphate pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin or 75 mM sodium pH 7.4, 30 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin with addition of 0.1% Tween 20 (p: v) for immunochromatographic tests) and assay.
  • appropriate buffer eg phosphate buffered saline: 100 mM sodium phosphate pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin or 75 mM sodium pH 7.4, 30 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin with addition of 0.1% Tween 20 (p: v) for immunochromatographic tests
  • the concentration of hepatotoxins associated with the cells in the liquid sample is determined by multiplying the measured concentration by N / 10, the sample having been concentrated 10 times in steps b and c and then diluted N times in step d).
  • Figure 1 illustrates the protocol for extracting hepatotoxins from cyanobacteria.
  • Figure 2 shows the microcystin extraction yields associated with Microcystis aeruginosa cells obtained with the following alcohols: M: methanol, E: ethanol, P: propanol, isP: isopropanol and Pdi: propanediol.
  • Figure 3 illustrates the potentiation of the extraction by propanol obtained by addition of detergents.
  • Figure 4 illustrates the effects of the propanol concentration in the presence of 0.2% Tween 20 (weight: vol).
  • Figure 5 illustrates the effects of acidification of the extraction medium on extraction yields for the Planktothrix agardhii strain.
  • Figure 6 shows the results of comparative extractions on different laboratory cultures of the Anabaena flos-aquae PCC 9349 and Planktothrix agardhii strains using the ToxXtract or Abraxis procedures.
  • FIG. 7 shows the extraction yields of microcystins associated with Microcystis aeruginosa cells obtained using compositions according to the invention (0.2% Tween 20, 0.1% TFA and 20% alcohol) in which the alcohol is propanol ("P"), isopropanol (“isP”) or propane diol (“Pdi”).
  • Figure 8 shows the results of analysis of a sample taken in Lake Bourget (Savoie, France).
  • Microcystis aeruginosa PCC Pulsteur Cyanobacteria Collection
  • Anabaena flos-aquae PCC 9349 and Planktothrix agardhii, a species filamentary originally named Oscillatoria 223 but now assimilated to Planktothrix agardhii (gift of K. Sivonen, University of Helsinki, Luukkainen et al (1993) Appl., Environ Microbiol 59, 2204-2209).
  • Nodularia PCC 7804 Another multicellular strain, Nodularia PCC 7804, produces nodularins which are smaller microcystin analogs (cyclic peptides of 5 amino acids instead of 7).
  • samples of blooms from different lakes retention and natural, donations from Mr. J-F Humbert, Institut Pasteur, Paris
  • reagent A 44% propanol, 0.45% Tween 20 in water
  • reagent B 2% trifluoroacetic acid in water
  • Reagents A and B are stable at room temperature; however, it is best to keep them at 4 ° C.
  • the filters are made of borosilicate glass micro fibers (ref AP2501300). Cartridges and seals can be reused after thorough cleaning.
  • ToxXtract for all scheduled tests. Add 1 volume of ToxXtract to 1 volume of the liquid to be analyzed in a closed container of polypropylene or glass. Ependorf tubes of 2 ml can be used for small volumes. It may be more practical to use graduated tubes with screw caps of higher volume for volumes of 2 to 5 ml.
  • a dilution of a factor of 2 minimum is recommended (for EIA assays, a suitable buffer is 100 mM sodium phosphate pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin 75 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, 30 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% Tween-20 is used for immunochromatography). The result obtained is multiplied by 2N to correct the effect of the successive dilutions.
  • c) Dilute the volume-to-volume ToxXtract reagent with water and take 2 ml of the mixture using a small polypropylene syringe. Spend half the volume (1 ml) on the cartridge, in a vertical position, recovering the filtrate in a 2 ml polypropylene tube.
  • the flow of reagent should preferably be rapid at the very beginning for a uniform wetting of the filter (visual control) and then carried out drop by drop (2/3 drops per second). Do not purge the cartridge with air; the filter must remain in contact with the reagent. Allow the filter to incubate for 5 minutes and finish the extraction with the remaining reagent. Recover the filtrate with the same syringe to extract the filter a second time in one step. For indication, the 1 ml filtration should last about 20 seconds.
  • d) Dilute the necessary volume of filtrate by an N factor in the appropriate buffer (for EIA assays, a suitable buffer is 100 mM sodium phosphate pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin; 75 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, 30 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% Tween-20 is used for the immunochromatography) and proceed to the assay.
  • a suitable buffer is 100 mM sodium phosphate pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin; 75 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, 30 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% Tween-20 is used for the immunochromatography
  • the cell microcystin concentration of the starting medium will be the measured concentration x N / 10 (10-fold concentration in steps b / c, N-dilution in step d)
  • step b In case of excessive cell concentration, premature saturation of the filter in step b may occur. Then measure the volume actually filtered and extract the filter with 1/10 of this volume of mixture ToxXtract (step c). It is not recommended to use less than 1 ml at this stage.
  • Microcystis aeruginosa one of the most widespread in natural blooms. This unicellular strain has a good growth rate in laboratory cultures.
  • Alcohol / water mixtures were selected on the basis of all previous work which often uses a high percentage of methanol.
  • the series of aliphatic alcohols compatible with an aqueous mixture (up to 3 carbons) was evaluated; a content of 20% in alcohol was considered as a maximum in order to avoid a too great subsequent dilution of the extracts in the use of immunochromatographic techniques.
  • Propanol thus appears to be the most effective alcohol for the extraction: the extraction in the presence of a 20% aqueous mixture of propanol makes it possible to extract approximately 460 ng / ml of microcystin (against approximately 810 ng / ml). ml with the freeze / thaw technique (see column “reference”) and about 740 ng / ml for lyophilization followed by methanolic acid extraction (methanol composition: water 75% (v: v), TFA 0.05% (v: v)) with sonication (see column “reference").
  • CHAPS which is a zwitterionic detergent (cholamidopropyl-dimethylammonio propane sulphonate)
  • Nonidet P40 and Triton X100 are octlyphenyl polyethylene glycol of different length; 3DM and Tween 20 are derivatives of a C12 aliphatic chain (n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside and polyoxyethylene sorbitan monolaurate respectively).
  • the effect of the detergent is spectacular since one gets with each of the detergents a yield of extraction well above the reference value ( Figure 3).
  • Triton X100 gives the most marked effect, but it is not compatible with immuno-chromatographic techniques involving liposomes. Since the other four detergents have an equivalent effect, Tween 20 has been selected for the rest of the tests since it is conventionally used in many immunological reactions.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the final concentrations of reagents in the extraction medium are as follows: 20% propanol (vol: vol), 0.2% Tween 20 (weight: vol) and 0.1% TFA (vol: vol).
  • Cell-associated hepatotoxins were measured on laboratory cultures of the four selected strains. The two techniques developed, Direct Extraction (Protocol 2) and Filter Extraction (Protocol 3) were compared to the QuickLyse TM Kit from Abraxis (Abx). The highest value obtained with conventional techniques (most often lyophilization / methanolic extraction) was retained as 100% reference.
  • Table 1 gives the average values for 3 to 7 different cultures of each strain, the immunological quantification being itself duplicated. The results are expressed in% of the reference.
  • Table 1 Comparison of the relative extraction yield of microcystins by the ToxXtract protocols according to the invention or by the QuickLyse TM kit from Abraxis (Abx)
  • Microcystis aeruginosa was treated according to the direct extraction technique (protocol 2) using a composition consisting of 0.2% Tween 20, 0.1% TFA and 20% alcohol, the alcohol being propanol (“P"), isopropanol (“isP”) or propane diol (“Pdi”).
  • composition according to the invention comprising a final concentration of 25% of propanol or of isopropanol in the extraction medium is sometimes preferable, in particular for extracting microcystins from strong hydrophobicity present in certain kinds of cyanobacteria.
  • the final concentration of propanol or isopropanol in the extraction medium is preferably %.
  • Example 4 Extractions of microcystins from natural blooms - comparison with the reference method
  • the direct extraction procedure (ToxXtract Protocol 2) is carried out by simple volume-to-volume mixing of the reagent with the sample. It was once again slightly superior in effectiveness to the reference technique most conventionally implemented in the laboratory: lyophilization of the sample followed by extraction in methanol 75% under sonication (Lyoph / MetOH). This corroborates again the whole of the results of the complete study on the laboratory strains and the four previous samples.
  • the filter concentration procedure (ToxXtact protocol 3) is almost equivalent to the most common procedures. It makes it possible to validate values which would be at the limit of detection of the field tests.
  • 2 ml of the starting sample are diluted in 20 ml of water (artificial dilution by a factor of 10); the suspension obtained is filtered and the cells retained on the filter are extracted in situ by passing 2 ml of the ToxXtract reagent; which thus brings a concentration factor of 10 relative to the diluted solution and allows a direct comparison with the initial solution. In the present case, it is therefore expected to find the value of the direct extraction, which is practically the same. case.

Abstract

L'invention concerne un réactif simple et robuste capable d'extraire très efficacement les hépatotoxines cellulaires de cyanobactéries toxiques. Le réactif est un mélange aqueux d'un solvant organique et d'un détergent non ionique maintenu à un pH acide contrôlé. L'invention est également relative à un procédé d'extraction d'hépatotoxines cellulaires de cyanobactéries toxiques utilisant ce réactif, en particulier par extraction directe en milieu liquide ou par extraction cellulaire sur filtre après une étape de concentration. Ce procédé est adapté à la mise en œuvre de contrôles rapides de la qualité de l'eau sur le terrain.

Description

EXTRACTION RAPIDE DES HEPATOTOXINES CELLULAIRES
L'invention concerne un réactif simple et robuste capable d'extraire très efficacement les hépatotoxines cellulaires de cyanobactéries toxiques. Le réactif est un mélange aqueux d'un solvant organique et d'un détergent non ionique maintenu à un pH acide contrôlé. L'invention est également relative à un procédé d'extraction d'hépatotoxines cellulaires de cyanobactéries toxiques utilisant ce réactif, en particulier par extraction directe en milieu liquide ou par extraction cellulaire sur filtre après une étape de concentration Ce procédé est adapté à la mise en œuvre de contrôles rapides de la qualité de l'eau sur le terrain.
Les cyanobactéries, anciennement connues sous le nom d'algues bleues, sont des bactéries photosynthétiques unicellulaires ou multicellulaires. Différents genres sont capables de synthétiser et d'excréter partiellement dans le milieu extérieur des substances toxiques. Ces organismes sont de plus en plus répandus de part le monde, et génèrent fréquemment des efflorescences caractéristiques à la surface des plans d'eau (« blooms »). Les microcystines constituent la classe de cyanotoxines la plus uniformément retrouvée. Les « blooms » de cyanobactéries contaminent essentiellement les eaux stagnantes comme les mares, les lacs (naturels ou de rétention), les eaux de baignades ainsi que les réservoirs; ces contaminations sont susceptibles de générer des problèmes aigus de santé, aussi bien chez l'homme que chez les animaux (Toxic cyanobacteria in water: A guide to their public Health Conséquences, monitoring and management. Chapter 2. Cyanobacteria in the environment. Chapter 4. Human Health Aspects. Ingrid Chorus and Jamie Bartram eds. (www.who.int/) ; Evaluation of Analytical Methods for Détection & Quantification of Cyanotoxins in Relation to Australian Drinking Water Guidelines (2001 ), Brenton C. Nicholson and Michael D. Burch editors, (www.nhmrc.gov.au/publications)).
Les hépatotoxines se classent actuellement en deux familles : les microcystines et les nodularines. Ces deux familles sont constituées de peptides cycliques très voisins, comprenant respectivement 7 ou 5 acides aminés, dont un résidu particulier 3-C20 appelé Adda (acide 3-amino-9-méthoxy-2,6,8-triméthyl- 1 0-phényldéca-4,6-diénoïque) :
Figure imgf000003_0001
Plus spécifiquement, les microcystines possèdent une structure cyclique heptapeptidique de séquence cyclo(-D-Ala-L- -D-érythro-3-méthylisoAsp-L- V- Adda-D-iso-Glu-N-méthyldéhyrdoAla) où X et Y sont deux acides aminés variables en configuration L. On appelle par exemple microcystine-LR, une microcystine comportant une leucine en position X et une arginine en position Y.
Les nodularines sont des pentapeptides constitués de Adda, d'acide D- érythro-3-méthylaspartique, d'acide D-glutamique, de L-arginine, de N-méthyl-Z- déhydrobutyrine et d'un acide aminé variable.
Ces toxines sont des inhibiteurs des phosphatases 1 et 2A des cellules eucaryotes (MacKintosh et al. (1990) FEBS Lett. 264, 187-192). Chez les vertébrés, elles sont rapidement séquestrées dans les hépatocytes et peuvent entraîner de graves dommages au foie (Nishiwaki-Matsushima et al. (1992) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1 181 , 420-424).
Le relargage de ces toxines dans le milieu a surtout lieu durant la sénescence cellulaire, la fraction la plus importante des toxines restant associée aux cellules en conditions de croissance normales. Il est donc très important de surveiller à la fois les niveaux extra- et intra-cellulaires de toxines pour mettre en œuvre les stratégies les mieux adaptées à la protection de la santé.
Différentes techniques de laboratoire plus ou moins sophistiquées ont été mises au point qui permettent une bonne extraction de ces toxines associées aux cyanobactéries, mais il n'existe pas actuellement de consensus pour une technique standard.
Dans le cas des microcystines, il est vraisemblable que la multiplicité des variants de ces toxines, du fait de méthylations et de nombreuses substitutions possibles d'acides aminés au niveau de deux sites variables, conduise à des caractéristiques de solubilité différentes des microcystines. En effet, plus de 70 variants de microcystines ont été identifiés (MacKintosh et al. (1990) FEBS Lett. 264, 187-192).
Ward et al. (1997, FEMS Microbiology Letters 153, 465-473) ont décrit l'extraction des microcystines avec un mélange méthanol/eau (70/30 v/v) et une détection basée sur un test colorimétrique d'inhibition de la protéine phosphatase 1 , la lecture étant effectuée à l'aide d'un spectrophotomètre.
Fastner et al. (1998, Water Research, 31 , 3177-3181 ) ont mis au point une méthode optimisée d'extraction de microcystines utilisant un mélange méthanol/eau (75/ v/v) ou une extraction séquentielle avec du méthanol puis de l'eau.
Metcalf J.S. et Codd G. A. (2000, FEMS Microbiology Letters 184, 241 - 246) ont décrit une méthode d'extraction des microcystines et nodularines de cyanobactéries par incubation dans de l'eau en ébullition pendant 1 min ou par traitement aux micro-ondes. Ces deux méthodes d'extraction sont présentées comme des alternatives aux méthodes à base de solvants organiques qui sont susceptibles d'interférer ensuite avec les méthodes sensibles de détection des microcystines et nodularines, telles que les immunoessais.
Lawton L.A. et Edwards C. (2001 , J. Chromatography A 912, 191 -209) ont plus tard passé en revue les différentes méthodes décrites dans l'état de la technique pour l'extraction des microcystines. Les solvants couramment utilisés pour une extraction globale de l'ensemble des variants de microcystines incluent le méthanol, l'eau et des mélanges de ceux-ci, ou l'acide acétique 5%. La purification et la quantification des microcystines sont ensuite réalisées en concentrant les échantillons extraits, puis en réalisant une séparation, par chromatographie d'exclusion de taille, chromatographie échangeuse d'ions, chromatographie en couche mince, chromatographie flash/colonne, ou encore HPLC préparative.
Barco et al. (2005, J. Chromatography A 1074, 23-30) ont comparé l'efficacité d'extraction de microcystines, à partir de cellules de Microcystis aeruginosa lyophilisées, à l'aide d'un mélange butanol-méthanol-eau (1 :4 :15), d'acide acétique 5%, de méthanol aqueux 10-90%, de méthanol, de méthanol acidifié (0,1 % acide trifluoroacétique, TFA), d'hydrogénocarbonate d'ammonium 0,1 M, par différentes séquences d'extraction utilisant du méthanol et de l'eau, ou à l'aide de Triton X-1 00 0, 1 % ou de Tween-20 0,1 %. La plus grande efficacité d'extraction a été obtenue avec du méthanol acidifié à pH~1 (0,5% TFA) mais s'accompagne également d'une dégradation des microcystines après 48h, dégradation qui n'est plus observée avec un pH ~2. La sonication du mélange d'extraction permet en outre de réduire le temps d'extraction de 45 min à 1 5 min. Une extraction presque complète des microcystines à partir de cyanobactéries lyophilisées a ainsi pu être réalisée en accomplissant trois cycles d'extraction successifs à l'aide de méthanol acidifié à pH ~2 sous sonication.
Parmi les techniques les plus efficaces pour extraire les toxines, on peut citer:
- la lyophilisation des cellules suivie d'une extraction en méthanol/eau (75%), une sonication pouvant être ajoutée à cette étape;
- plusieurs cycles de congélation/ décongélation (classiquement 3).
Une fois extraites, microcystines et nodularines peuvent être séparées par HPLC et identifiées par leur spectre d'absorption UV (maximum caractéristique à 238 nm). La spectrométrie de masse doit ensuite être mise en œuvre pour une caractérisation complète.
Un point commun à toutes ces techniques d'analyse est le recourt à des équipements de laboratoire, en particulier lors de la première étape, l'utilisation d'équipements permettant d'obtenir des échantillons solides par dessiccation des prélèvements liquides à analyser, ce qui rend ces techniques incompatibles avec une détection et une quantification sur le terrain des hépatotoxines.
De plus, pour les méthodes d'extraction à base de solvants organiques, la nécessité d'utiliser du méthanol (notamment) à forte concentration oblige à des dilutions importantes avant de pratiquer des essais immunologiques, dilution particulièrement critique dans le cas des tests immuno-chromatographiques bien adaptés aux essais rapides (« strips » ou bandelettes).
A ce jour, aucune procédure d'extraction simple et efficace applicable sur le terrain n'a été décrite. Il y a donc à ce niveau un besoin clairement défini d'une technique qui puisse permettre de doser l'ensemble des hépatotoxines présentes dans des prélèvements d'eau, et qui soit compatible avec les techniques immuno- chromatographiques. Un kit d'extraction a été récemment commercialisé par la Société Abraxis (QuickLyse™ Cell Lysis for Microcystins/Nodularins ELISA Microtiter Plate), mais la composition des réactifs d'extraction n'est pas détaillée. Ce kit a été utilisé dans une série complète d'essais comparatifs.
Réactif d'extraction
L'invention est relative à un réactif d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries, en particulier de microcystines et/ou nodularines, qui comprend un mélange alcool / eau, un détergent et un acidifiant.
Plus spécifiquement le réactif d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries est une composition comprenant :
20 à 60 %, de préférence 20 à 50 % (volume:volume (v:v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci ;
- 0,1 à 2 % (poids : volume (p :v)) d'au moins un détergent ; et
de l'eau en quantité suffisante pour 100%.
Cette composition est très efficace pour effectuer une extraction des hépatoxines des cyanobactéries les plus répandues, comme Microcystis aeruginosa. Cependant, certaines cyanobactéries nécessitent un pH acide pour que l'extraction des hépatoxines puisse être efficacement réalisée ; c'est le cas notamment pour le genre Planktothrix.
Ainsi pour avoir un réactif d'extraction d'efficacité la plus large possible, la composition peut comprendre en outre un agent acidifiant, l'agent acidifiant étant présent en quantité suffisante pour que la composition, après dilution d'un facteur 2 avec de l'eau, ait un pH compris entre 1 ,8 et 2,5.
La proportion de chacun des constituants a été l'objet d'une optimisation systématique, notamment en vue d'une utilisation du réactif d'extraction sur le terrain qui reste compatible avec une détection des hépatoxines par des méthodes immuno-chromatographiques (bandelettes). Ce réactif a été testé avec succès sur des cellules en culture de quatre espèces représentatives des quatre genres de cyanobactéries principales productrices d'hépatotoxines, ainsi que sur quatre prélèvements de terrain. Préférentiellement, la composition est constituée du mélange de 20 à 60 %, avantageusement de 20 à 50 % (volume:volume (v:v)) d'alcool en C3, de 0,1 à 2% (poids :volume (p:v)) d'au moins un détergent, éventuellement d'un agent acidifiant, s'il est présent, en quantité suffisante pour que la composition, après dilution d'un facteur 2 avec de l'eau, ait un pH compris entre 1 ,8 et 2,5, et d'eau q.s.p. 100%.
L'alcool est un alcool aliphatique en C3, c'est à dire que l'alcool est sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol. L'utilisation d'un mélange de ces alcools aliphatiques en C3 est possible. Un mélange 1 :1 de propanol et d'isopropanol a conduit par exemple à un rendement d'extraction sensiblement similaire au rendement obtenu avec le propanol ou l'isopropanol seul. De préférence, l'alcool est le propanol, ce dernier ayant généralement montré les meilleurs rendements d'extraction à partir de Microcystis aeruginosa qui est la cyanobactérie toxique de référence la plus répandue.
L'utilisation d'alcools aliphatiques ayant une chaîne carbonée plus courte, méthanol ou éthanol, conduit à une baisse de l'efficacité du réactif d'extraction.
Par ailleurs, comme il est souhaitable d'atteindre une teneur minimale en alcool de 20%, l'utilisation d'alcool aliphatique ayant une chaîne carbonée en C4 ou plus est extrêmement difficile en raison de problèmes de miscibilité des alcools avec l'eau, sauf à utiliser un mélange plus complexe. La teneur maximale en alcool dans le réactif a été fixée idéalement à 60% de manière à ce que la teneur finale dans le milieu d'extraction, après dilution de moitié avec un prélèvement d'eau à analyser, ne dépasse pas 30%. Des teneurs plus élevées en alcool sont possibles mais sont susceptibles d'interférer avec la mise en œuvre, par la suite, de tests immunologiques pour détecter les hépatotoxines, ce qui imposerait alors de diluer les échantillons extraits avant analyse, de manière à diminuer leur teneur en alcool.
De préférence, la composition comprend 20 à 60% (v :v), plus préférentiellement 30 à 50% (v :v), avantageusement 40 à 50% (v:v), ou encore 20 à 40% (v :v), de préférence encore 30 à 40% (v :v), d'alcool aliphatique en C3.
Le détergent peut être n'importe quel détergent usuel en biologie ou mélange de détergents. Il peut s'agir par exemple d'un détergent zwitterionique, tel que le CHAPS, d'un détergent non-ionique, par exemple Nonidet P-40 (NP-40), la série des Triton, les tensioactifs glycosylés, la série des Tween, ou d'un détergent ionique tel que le SDS. Tous les détergents testés (CHAPS, Nonidet P40, Triton X100, n-Dodecyl-3-D-Maltoside, et Tween 20) ont en effet conduit à une augmentation très significative de la quantité de microcystines extraites par rapport au mélange alcool / eau non additionné de détergent. Le choix du détergent pourra cependant être dicté par la compatibilité du détergent avec la méthode de détection des hépatoxines ensuite utilisée. En particulier, le détergent sera préférentiellement compatible avec une détection directe des hépatoxines par des méthodes immunologiques : il s'agit de préférence d'un détergent zwitterionique ou non-ionique, par exemple le CHAPS, le NP-40 ou le Tween 20, les détergents ioniques étant généralement incompatibles avec les méthodes immunologiques, sauf à utiliser de fortes dilutions après extraction, comme cela peut être le cas pour les dosages EIA. Un détergent préféré est le Tween 20 puisque celui-ci est très classiquement utilisé dans les tests immunologiques.
La proportion de détergent dans la composition selon l'invention est de préférence comprise entre 0,2 et 0,5% (p :v), de préférence encore entre 0,3 et 0,4% (p :v).
L'agent acidifiant est préférentiellement un acide fort, habituellement utilisé pour les analyses biochimiques, comme par exemple l'acide chlorhydrique ou l'acide trifluoroacétique. De préférence, l'acidifiant est l'acide trifluoroacétique. L'acidification du milieu d'extraction (c'est-à-dire le mélange eau / propanol / Tween 20 dilué volume à volume avec un échantillon) par de l'acide trifluoroacétique 0,1 % a en effet conduit à une augmentation plus forte du niveau d'extraction des microcystines à partir de l'espèce Planktothrix agardhii, comparativement à l'acide chlorhydrique 0,01 N (pH final de 2,1 dans les deux cas). Le genre Planktothrix est un exemple de cyanobactéries pour lesquelles les rendements d'extraction des microcystines sont faibles lorsque l'extraction est effectuée en milieu neutre.
Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend entre 0,1 et 0,4% (volume :volume), de préférence 0,2% (v :v), d'acide trifluoroacétique.
La composition peut aussi comprendre entre 0,01 et 0,04N, de préférence 0,02N, d'acide chlorhydrique. Selon des modes de réalisation particuliers, la composition comprend ou est constituée de :
20 à 60 % (v :v), de préférence 20 à 50 % (v :v), plus préférentiellement 30 à 50 % (v :v), et avantageusement 40 à 50% (v :v), ou encore 30 à 40% (v :v), de propanol ou isopropanol,
0,1 à 2% (p :v), de préférence 0,2 à 0,5% de préférence encore 0,3 à 0,4%, d'un détergent compatible avec les méthodes immunologiques, de préférence le CHAPS, le NP-40 ou le Tween 20, plus préférentiellement le Tween 20,
- éventuellement 0,1 à 0,4% (v:v), de préférence 0,2% d'acide trifluoroacétique, et
- d'eau q.s.p. 100%.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition comprend ou est constituée de 40-50%, préférentiellement 30-50%, ou encore 30- 40% de propanol (vol:vol), 0,3 à 0,4% (poids:vol) d'un détergent compatible avec les méthodes immunologiques tel que défini plus haut, de préférence le Tween 20, 0,1 à 0,4% (vol:vol) d'acide trifluoroacétique, et d'eau q.s.p. 100%.
Kit d'extraction
La composition ou réactif selon l'invention peut être fournie sous forme d'un kit de deux solutions car le réactif complet peut avoir une durée de conservation insuffisamment longue à température ambiante lorsque l'agent acidifiant est présent.
Le kit comprend alors une première composition aqueuse comprenant l'alcool et le détergent et une seconde composition aqueuse comprenant l'agent acidifiant. Les teneurs respectives en alcool et détergent, d'une part, et en agent acidifiant d'autre part sont telles, que par mélange de x volume(s) de la première composition aqueuse avec y volume(s) de la seconde composition aqueuse, on reconstitue une composition aqueuse comprenant 20 à 60 %, de préférence 20 à 50% (v :v) d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci, et 0,1 à 2 % (p :v) d'au moins un détergent.
La définition générale du kit pourrait être la suivante: a) une première composition comprenant ou constituée de :
- 20*(x+y)/x à 60*(x+y)/x % (v :v), de préférence 20*(x+y)/x à 50*(x+y)/x % (v :v), plus préférentiellement 30*(x+y)/x à 50*(x+y)/x % (v :v), et avantageusement 40*(x+y)/x à 50*(x+y)/x % (v :v), ou encore 30*(x+y)/x à 40*(x+y)/x % (v :v), d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci,
- 0,1 *(x+y)/x à 2*(x+y)/x % (p :v), de préférence 0,2*(x+y)/x à 0,5*(x+y)/x % de préférence encore 0,3*(x+y)/x à 0,4*(x+y)/x %, d'au moins un détergent ;
- et de l'eau q.s.p. 100% ; et
b) une seconde composition comprenant ou constituée de :
- 0,1 *(x+y)/y à 0,4*(x+y)/y % (v :v), de préférence 0,2 *(x+y)/y % d'acide trifluoroacétique; et
- de l'eau q.s.p 100% ;
où x et y sont des nombres positifs, et y est préférentiellement compris entre x/2 et x/9.
Idéalement, 9 volumes de la première composition sont mélangés à 1 volume de la seconde composition, alors x = 9 et y = 1 . Dans ce cas, le kit comprend :
a) une première composition comprenant ou constituée de :
- environ 22,22 à environ 66,66 % (v :v), de préférence environ 22,22 à environ 55,55 % (v :v), de préférence encore environ 33,33 à environ 55,55% (v :v), préférentiellement environ 44,44 à 55,55% (v :v), ou encore environ 33,33 à environ 44,44 % (v :v), d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci,
- environ 0,1 1 à 2,22% (p :v), de préférence 0,22 à 0,56 % de préférence encore 0,33 à 0,45%, d'au moins un détergent ;
- et de l'eau q.s.p. 100% ; et
b) une seconde composition comprenant ou constituée de :
- 1 à 4 % (v :v), de préférence 2 % d'acide trifluoroacétique; et
- de l'eau q.s.p. 100% ;
Les première et seconde compositions sont stables à température ambiante. On peut toutefois préférer les conserver à 4°C. Préférentiellement, le réactif d'extraction est reconstitué par mélange de la première composition et de la seconde composition le jour de l'analyse.
Le kit peut comprendre en outre :
des instructions d'utilisation pour l'extraction des hépatotoxines de cyanobactéries, en particulier de microcystines et/ou nodularines. En particulier, le kit peut comprendre des instructions pour mélanger x volumes de ladite première composition avec y volumes de ladite seconde composition pour constituer un réactif d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries ; et/ou
un ou plusieurs tubes en polypropylène ou verre, par exemple des tubes ependorf de 2 ml ou des tubes gradués à bouchon vissant de volume supérieur ; et/ou
une ou plusieurs seringues en polypropylène ; et/ou
des moyens de filtration à maille mixte de 0,8 à 8 μιτι tel que décrits plus bas ; et/ou
- des bandelettes d'analyse des hépatotoxines et les réactifs appropriés.
Les alcools, détergents et acidifiants entrant dans la composition du kit sont tels que définis dans le réactif d'extraction selon l'invention. Utilisation du réactif et méthode d'extraction
L'invention concerne également l'utilisation du réactif d'extraction tel que défini plus haut, après dilution de moitié avec de l'eau ou un échantillon de prélèvement à analyser, pour l'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries, en particulier pour l'extraction de microcystines et/ou nodularines.
L'utilisation de la composition ainsi préparée à partir du réactif d'extraction selon l'invention permet d'extraire les hépatotoxines associées aux cyanobactéries, et ainsi de quantifier les hépatotoxines associées et éventuellement les hépatotoxines totales d'un échantillon de liquide susceptible de contenir une suspension cellulaire de cyanobactéries, issu d'un prélèvement dans un lac, étang, mare ou autre. Par «hépatotoxines totales » on entend les hépatotoxines associées et libres présentes dans l'échantillon.
Les teneurs des constituants du réactif d'extraction selon l'invention ont été fixées en vue d'une utilisation optimale basée sur un mélange volume à volume du réactif avec un échantillon de liquide contenant une suspension cellulaire de cyanobactéries. Dans le cas d'une faible concentration en cyanobactéries risquant de conduire à une teneur en hépatotoxines en dessous du seuil de sensibilité de la méthode choisie pour la détection des hépatotoxines, une concentration de l'échantillon peut être réalisée préalablement à l'extraction.
L'invention concerne donc l'utilisation d'une composition comprenant ou constituée de :
10 à 30 %, de préférence 10 à 25 %, (volume :volume (v :v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci ;
0,05 à 1 % (poids :volume (p :v)) d'au moins un détergent ;
- éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1 ,8 et 2,5 ; et
- d'eau q.s.p. 100% ;
pour l'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries, en particulier pour l'extraction de microcystines et/ou nodularines.
L'invention concerne aussi une méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries qui comprend les étapes suivantes :
a) mise en contact de cyanobactéries avec une composition comprenant ou constituée de :
10 à 30 %, de préférence 10 à 25 % (volume:volume (v:v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci ;
0,05 à 1 % (poids:volume (p :v)) d'au moins un détergent ; - éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1 ,8 et 2,5 ; et
d'eau q.s.p. 100% ;
b) incubation des cyanobactéries au contact de la composition pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines.
Dans l'utilisation de la méthode d'extraction selon l'invention, la composition utilisée est obtenue par dilution de moitié du réactif d'extraction selon l'invention, soit par de l'eau, soit par une suspension cellulaire à analyser, comme expliqué ci-dessous. Les constituants susceptibles d'entrer dans la composition utilisée pour l'extraction, et en particulier les modes préférés de réalisation, sont donc tels que décrits plus haut dans la section « Réactif d'extraction », à ceci près que les concentrations des différents constituants (hormis l'eau) indiquées en relation avec le réactif d'extraction sont divisées par deux s'agissant de composition mise en œuvre dans la méthode d'extraction selon l'invention.
Ainsi, par exemple, alors que le réactif d'extraction comprend 20 à 60% (v :v), de préférence 30 à 50% (v :v), avantageusement 40 à 50% (v:v), ou encore 20 à 40% (v :v), de préférence 30 à 40% (v:v), d'alcool aliphatique en C3, dans l'utilisation et la méthode d'extraction selon l'invention, la composition mise au contact des cyanobactéries comprendra 10 à 30% (v :v), de préférence 15 à 25% (v :v), avantageusement 20 à 25% (v:v), ou encore de 10 à 20% (v :v), de préférence 15 à 20%, d'alcool aliphatique en C3. Comme indiqué dans la section « Réactif d'extraction », l'alcool est de préférence le propanol ou l'isopropanol.
De manière similaire, pour l'utilisation et la méthode d'extraction selon l'invention, la composition comprend de préférence entre 0,1 et 0,25% (p :v), de préférence encore entre 0,15 et 0,2% (p :v) d'au moins un détergent, le détergent étant tel que défini précédemment.
De manière à ce que le pH de la composition soit compris entre 1 ,8 et 2,5, la composition peut comprendre entre 0,05 et 0,2% (v :v), de préférence 0,1 % (v :v), d'acide trifluoroacétique ; ou bien entre 0,005 et 0,02N, de préférence 0,01 N d'acide chlorhydrique, à titre d'agent acidifiant.
Pour réaliser l'extraction des hépatotoxines, la composition comprend ou est constituée ainsi préférentiellement:
10 à 30% (v :v), plus préférentiellement 15 à 25% (v :v), avantageusement 20 à 25% (v :v), ou encore 10 à 25 % (v :v), de préférence 15 à 20% (v :v), de propanol ou isopropanol,
0,05 à 1 % (p :v), de préférence 0,1 à 0,25% de préférence encore 0,15 à 0,2%, d'un détergent compatible avec les méthodes immunologiques, de préférence le CHAPS, le NP-40 ou le Tween 20, plus préférentiellement le Tween 20,
éventuellement 0,05 à 0,2% (v :v), de préférence 0,1 % d'acide trifluoroacétique, et
- de l'eau en quantité suffisante pour 100%. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition d'extraction comprend ou est constituée de 10 à 30% (v :v), plus préférentiellement 15 à 25% (v :v), de préférence encore 20 à 25% (v :v), ou encore 15-20% propanol (vol:vol), 0,15 à 0,2% (poids:vol) d'un détergent compatible avec les méthodes immunologiques tel que défini plus haut, par exemple le CHAPS, le NP-40 ou le Tween 20, de préférence le Tween 20, 0,05 à 0,2% (vol:vol) d'acide trifluoroacétique et de l'eau q.s.p. 100%.
Selon un mode de réalisation, la méthode d'extraction selon l'invention est mise en œuvre sur une suspension cellulaire susceptible de contenir des cyanobactéries. La méthode s'applique alors directement au prélèvement liquide et comprend les étapes suivantes:
a) mélange du réactif d'extraction selon l'invention avec une suspension cellulaire contenant des cyanobactéries ; et
b) incubation du mélange de la suspension cellulaire contenant des cyanobactéries et du réactif d'extraction selon l'invention (soit le mélange d'extraction obtenu à l'étape a)) pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines.
De préférence, le réactif d'extraction est mélangé volume à volume avec l'échantillon d'eau susceptible de contenir des cyanobactéries (la suspension cellulaire de cyanobactéries). Pour assurer un bon mélange du réactif d'extraction et de l'échantillon, le mélange est avantageusement agité pendant quelques secondes, par exemple pendant au moins 5 secondes, de préférence au moins 10 secondes, en particulier pendant 10 à 15 secondes.
Le mélange peut être incubé par exemple au moins 3 minutes, de préférence au moins 5 minutes, par exemple entre 3 et 10 minutes. Les hépatotoxines de cyanobactéries extraites étant stables dans le milieu réactionnel, l'incubation peut être poursuivie aussi longtemps que désiré.
Après l'étape d'incubation, la méthode peut comprendre avantageusement une étape de filtration de tout ou partie du mélange d'extraction (suspension cellulaire plus réactif), pour récolter ledit mélange d'extraction, ceci afin d'éliminer les cellules et particules pouvant interférer avec les dosages ultérieurs. Les tailles des cyanobactéries productrices d'hépatotoxines peuvent aller de 2,5 μιτι (Microcystis aeruginosa) à plusieurs dizaines de μιτι pour les pluricellulaires (Planktothrix et Nodularia). Le filtre utilisé doit donc de préférence présenter une porosité effective adaptée à la rétention de cellules de 2 μιη de diamètre et de plus être inerte aux alcools en C3, aux détergents et aux acides. Un support inerte de porosité mixte de 0,8 à 8 μιτι peut par exemple être utilisé. Avantageusement, des filtres en fibres de verre borosilicaté et porosité mixte de 0,8 à 8 μιτι sont utilisés ; ces filtres ont une haute capacité et un fort débit. Des filtres à porosité plus étroite, avec un seuil supérieur ou égal à 1 μιτι peuvent également être utilisés pour les suspensions cellulaires de faible densité.
Le filtrat obtenu contenant les hépatotoxines totales (cellulaires et extra- cellulaires) peut être ajusté en pH par dilution dans un tampon approprié aux mesures immunologiques et analysé directement par exemple par essai immuno- enzymatique ou bandelettes d'analyse des hépatotoxines. En particulier, ces méthodes peuvent avantageusement utiliser un anticorps monoclonal spécifique du résidu Adda des microcystines et nodularines, par exemple l'anticorps monoclonal MC-159 décrit par Kreich et al. (2009, Toxicon, 53, 551 -559).
L'extraction des hépatotoxines directement à partir d'un échantillon d'eau susceptible de contenir des cyanobactéries, permet ainsi de mesurer les hépatotoxines totales de l'échantillon. L'analyse directe d'un filtrat de la même suspension cellulaire non incubée avec le réactif permet d'accéder exclusivement à la teneur extracellulaire en hépatotoxines.
Selon un deuxième mode de réalisation, la méthode d'extraction des hépatotoxines est mise en œuvre à partir d'un dépôt concentré de cellules sur filtre, en utilisant le système de filtration décrit ci-dessus. Le filtrat, constitué uniquement du milieu extra-cellulaire, permet de mesurer les hépatotoxines libres. L'extraction directe des cellules immobilisées sur le filtre est effectuée en diluant le réactif d'extraction selon l'invention de moitié avec de l'eau. L'extraction directe des cellules immobilisées sur le filtre donne la teneur cellulaire en hépatotoxines, l'addition de cette teneur avec la teneur en hépatotoxines libres donnant la teneur totale en hépatotoxines. Par cette méthode, en ajustant le volume de suspension cellulaire filtré et le volume de réactif éluant, il est possible de générer un facteur de concentration d'un ou plusieurs ordres de grandeur, et donc d'augmenter d'autant la sensibilité des détections. Ainsi, dans la méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries, dans l'étape a), les cyanobactéries mises en contact avec ladite composition peuvent être sous forme d'un retentât obtenu par filtration d'une suspension cellulaire contenant des cyanobactéries (en particulier un prélèvement à analyser).
Selon ce deuxième mode de réalisation, la méthode d'extraction selon l'invention comprend les étapes consistant à :
a) concentrer les cyanobactéries d'un échantillon à analyser par filtration ;
b) mettre en contact le retentât contenant les cyanobactéries obtenu par filtration à l'étape a) avec une composition comprenant ou constituée de :
10 à 30% (v :v), de préférence 15 à 25% (v :v), plus préférentiellement 20 à 25% (v :v), ou encore 10 à 25 % (volume :volume (v :v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci ;
- 0,05 à 1 % (poids :volume (p :v)) d'au moins un détergent ;
éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1 ,8 et 2,5 ; et
d'eau q.s.p. 100% ;
c) incuber le retentât contenant les cyanobactéries au contact de ladite composition pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines.
Comme décrit ci-dessus, la filtration est de préférence mise en œuvre sur un support inerte de porosité mixte de 0,8 à 8 μιτι, par exemple sur des filtres en fibres de verre borosilicaté à porosité mixte de 0,8 à 8 μιτι.
La composition pour l'extraction peut être préparée le jour même en mélangeant un volume d'eau avec un volume de réactif d'extraction, le réactif d'extraction ayant été reconstitué le jour même lui aussi.
La mise en contact de la composition avec les cyanobactéries peut être effectuée en déposant la composition sur le filtre ayant servi à la filtration d'une suspension cellulaire contenant des cyanobactéries. Par exemple 2 ml de composition peuvent être utilisés pour 20 ml de prélèvement à analyser dont les cellules auront été concentrées par rétention sur filtre. Une partie de la composition peut être initialement passée à travers le filtre de manière à assurer une mise en contact homogène de la composition avec les cyanobactéries concentrées. Le filtre sur lequel a été déposé la composition peut ensuite être incubé, par exemple au moins 3 minutes, de préférence au moins 5 minutes, par exemple entre 3 et 10 minutes, avant de faire passer le reste de la composition à travers le filtre. Le filtrat qui contient les hépatotoxines extraites est récolté.
La mise en œuvre de la méthode d'extraction selon l'invention peut être associée à une méthode de détection et/ou quantification d'hépatotoxines de cyanobactéries comprenant les étapes consistant à détecter et/ou quantifier les hépatotoxines de cyanobactérie dans un extrait d'hépatotoxines obtenu par une méthode d'extraction selon l'invention.
A titre d'exemple, l'homme du métier peut réaliser une analyse directe des hépatotoxines libres en prélevant un volume déterminé de liquide à analyser, par exemple 2 ml à l'aide d'une seringue en polypropylène. Le volume prélevé peut être filtré et le filtrat contenant les hépatotoxines libres soumis à analyse, par exemple par ELISA, bandelette, ou toute autre méthode appropriée (chromatographie, spectrométrie de masse...). Si une seringue a été utilisée pour prélever le volume à analyser, la filtration peut être aisément réalisée en ajustant sur la seringue une unité de filtration (par exemple porte-filtre et joint Swinnex, SX0001300 et SX0001301 , diamètre 13 mm) disponibles auprès de la société Millipore, et filtre 0,8 / 8 μιτι en micro fibres de verre borosilicaté (Millipore, AP2501300)). La filtration est réalisée en goutte à goutte, en position verticale, de préférence sans dépasser 4/5 gouttes par seconde. Le filtrat peut être collecté dans un tube propylène de 2 ml (par exemple type ependorf) et soumis directement au dosage des hépatotoxines.
L'homme du métier peut réaliser une analyse des hépatotoxines totales en mélangeant un volume du réactif d'extraction avec un volume du liquide à analyser, par exemple dans un récipient fermé en polypropylène ou en verre. Des tubes ependorf de 2ml peuvent être utilisés pour des petits volumes. Il peut être plus pratique d'utiliser des tubes gradués de volume supérieur avec bouchon vissant et des volumes de 2 à 5 ml. Le tube fermé hermétiquement peut être agité vigoureusement pendant environ 10 secondes et laissé à reposer pendant environ 5 minutes, avant d'agiter à nouveau pendant environ 10 secondes. 1 ,5 à 2 ml du liquide peuvent être prélevé à l'aide d'une seringue en polypropylène et filtré comme expliqué ci-dessus, sans dépasser de préférence 2/3 gouttes par seconde. Le filtrat est collecté par exemple dans un tube ependorf de 2 ml en polypropylène. On peut alors diluer N fois le volume d'extrait nécessaire dans un tampon adapté au dosage immunologique choisi pour la détection/quantification des hépatotoxines. Le facteur de dilution est aisément déterminé par l'opérateur en fonction de la méthode d'analyse utilisée. Pour l'utilisation de tests bandelettes, une dilution d'un facteur 2 est généralement nécessaire. Si une méthode de type ELISA est utilisée, des facteurs de dilution beaucoup plus importants peuvent être adoptés. Pour les dosages immunoenzymatiques, un tampon de dilution approprié peut être le phosphate de sodium 100 mM pH 7,4, NaCI 150 mM, sérum albumine bovine 0,1 % (concentrations finales) (p :v). Pour les tests en bandelette, un tampon phosphate de sodium 75 mM pH 7,4, NaCI 30 mM, sérum albumine bovine 0,1 %. avec addition de Tween 20 à 0,1 % (p :v) peut être utilisé (concentrations finales). La concentration en hépatotoxines totales dans l'échantillon liquide est déterminée en multipliant par 2N le résultat d'analyse, pour corriger l'effet des dilutions successives.
Une augmentation inégalée de la sensibilité d'un ordre de grandeur ou plus est possible grâce à la procédure très simple et rapide d'extraction d'un dépôt cellulaire concentré sur filtre comme détaillé ci-après. Ceci est particulièrement utile si l'analyse directe des hépatotoxines totales donne une valeur à la limite du seuil de détection de la méthode d'analyse utilisée. Seule sera mesurée dans ce cas la fraction de toxines associée aux cellules, généralement la plus importante quantitativement. A titre d'exemple, on considère qu'en phase de croissance de Microcystis aeruginosa, 80 à 90% des toxines sont associées aux cellules.
Par exemple pour réaliser une concentration d'un facteur 10, il est possible de procéder comme suit:
a) Prélever 20 ml de liquide à analyser à l'aide d'une seringue graduée ; b) Filtrer lentement en position verticale, par exemple sur cartouches à base de porte-filtre et joint Swinnex (SX0001300 et SX0001301 ) disponibles auprès de la société Millipore, et filtre 0,8 / 8 μιτι en micro fibres de verre borosilicaté (Millipore, AP2501300), de préférence sans dépasser 4/5 gouttes par seconde. La cartouche peut être purgée avec un peu d'air pour assurer une filtration complète. Le dépôt cellulaire obtenu est préférentiellement homogène. c) Diluer le réactif d'extraction volume à volume avec de l'eau et prélever 2 ml du mélange à l'aide d'une petite seringue en polypropylène. Passer la moitié du volume (1 ml) sur la cartouche, en position verticale, en récupérant le filtrat dans un tube polypropylène de 2 ml. De préférence, le flux de réactif d'extraction est rapide au tout début pour un mouillage homogène du filtre puis effectué ensuite au goutte à goutte (par exemple 2/3 gouttes par seconde). Il est préférable d'éviter de purger la cartouche avec de l'air, ce qui permet au filtre de rester en contact avec le réactif. Le filtre est laissé à incuber pendant environ 5 minutes et l'extraction est terminée avec le restant du réactif. Le filtrat peut être récupéré avec la même seringue pour extraire le filtre une seconde fois en une seule étape. A titre indicatif, une filtration de 1 ml dure idéalement environ 20 secondes.
d) Diluer le volume nécessaire de filtrat d'un facteur N dans le tampon approprié (par exemple un tampon phosphate salin : phosphate de sodium 100 mM pH 7,4, NaCI 150 mM, sérum albumine bovine 0,1 % ou de phosphate de sodium 75 mM pH 7,4, NaCI 30 mM, sérum albumine bovine 0,1 %. avec addition de Tween 20 à 0,1 % (p :v) pour les tests immuno-chromatographiques) et procéder au dosage.
La concentration en hépatotoxines associées au cellules dans l'échantillon liquide est déterminée en multipliant la concentration mesurée par N/10, l'échantillon ayant été concentré 10 fois aux étapes b et c puis dilué N fois à l'étape d).
Les différents protocoles décrits ont été élaborés dans l'optique d'une utilisation de terrain, en association avec une technique de test bandelettes, en particulier avec un système d'immuno-liposomes fluorescents récemment décrit dans la demande de brevet internationale WO 2009007858. Ces protocoles sont tout spécialement adaptés à la détection rapide des hépatotoxines dans la limite de 1 μg par litre recommandée pour l'eau de boisson par l'OMS. La limite de 10 μg par litre pour les eaux de baignade peut être facilement mesurée par la technique plus classique des bandelettes à l'or colloïdal.
L'invention sera illustrée davantage au vu des figures et des exemples suivants. FIGURES
La Figure 1 illustre le protocole d'extraction des hépatotoxines de cyanobactéries.
La Figure 2 montre les rendements d'extraction des microcystines associées aux cellules de Microcystis aeruginosa obtenus avec les alcools suivants : M: méthanol, E: éthanol, P: propanol, isP: isopropanol et Pdi: propane- diol.
La Figure 3 illustre la potentialisation de l'extraction par le propanol obtenue par addition de détergents.
La Figure 4 illustre les effets de la concentration en propanol en présence de Tween 20 à 0,2% (poids:vol).
La Figure 5 illustre les effets de l'acidification du milieu d'extraction sur les rendements d'extraction pour la souche Planktothrix agardhii.
La Figure 6 montre les résultats d'extractions comparées sur différentes cultures de laboratoire des souches Anabaena flos-aquae PCC 9349 et Planktothrix agardhii en utilisant les procédures ToxXtract ou Abraxis.
La Figure 7 montre les rendements d'extraction des microcystines associées aux cellules de Microcystis aeruginosa obtenus en utilisant des compositions selon l'invention (Tween 20 à 0,2%, TFA à 0,1 % et 20% d'alcool) dans lesquelles l'alcool est le propanol (« P »), l'isopropanol (« isP ») ou le propane-diol (« Pdi »).
La Figure 8 montre les résultats d'analyse d'un prélèvement effectué dans le lac du Bourget (Savoie, France). EXEMPLES
Exemple 1 : Matériels et méthodes
Souches de cyanobactéries utilisées
Quatre souches productrices d'hépatotoxines de caractéristiques différentes ont été cultivées afin de valider la procédure d'extraction mise au point.
Trois d'entre elles produisent différents variants de microcystines : il s'agit de Microcystis aeruginosa PCC (Pasteur Cyanobacteria Collection) 7820, Anabaena flos-aquae PCC 9349, et Planktothrix agardhii, une espèce filamenteuse originalement appelée Oscillatoria 223 mais maintenant assimilée à Planktothrix agardhii (don de K. Sivonen, Université d'Helsinki ; Luukkainen et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59, 2204-2209).
Une autre souche multicellulaire, Nodularia PCC 7804, produit des nodularines qui sont des analogues des microcystines de moindre taille (peptides cycliques de 5 acides aminés à la place de 7). Par ailleurs, des prélèvements de blooms de différents lacs (de rétention et naturel, dons de M. J-F Humbert, Institut Pasteur, Paris) ont été également extraits avec le même protocole. Dosage des hépatotoxines extraites
Des mesures immunologiques par compétition ont été mises en œuvre pour doser les hépatotoxines extraites. La partie spécifique de la phase solide est constituée d'un anticorps monoclonal de souris sélectionné comme reconnaissant le résidu Adda, acide aminé caractéristique commun à toutes les hépatotoxines. La compétition est réalisée avec un analogue de synthèse de ce résidu et les courbes standardisées avec de la microcystine-L-R (Khreich et al. (2009) Toxicon 53, 551 -559)
Protocoles d'extractions
Réactif d'extractions (Réactif ToxXtract)
9 volumes de réactif A (44% propanol, 0,45% Tween 20 dans l'eau) sont mélangés à 1 volume de réactif B (2% acide trifluoroacétique dans l'eau) pour former la solution ToxXtract. La solution obtenue est compatible avec le polypropylène. ToxXtract est préparé le jour des analyses.
Les réactifs A et B sont stables à température ambiante; il est toutefois préférable de les conserver à 4°C.
Cartouches de Filtration :
Les filtres et supports de filtration utilisés proviennent de la Société Millipore :
- cartouches réutilisables Swinnex, 13 mm de diamètre (porte-filtre réf. SX0001300; et joints en silicone réf. SX0001301 )
- les filtres sont en micro fibres de verre borosilicaté (réf. AP2501300). Les cartouches et joints peuvent être réutilisés après un nettoyage minutieux.
Analyse directe des microcystines libres (protocole 1)
Prélever 2 ml du liquide à analyser à l'aide d'une seringue en polypropylène. Mettre en place un joint silicone et un filtre en fibres de verre dans la cartouche porte-filtre. Pour plus de commodité, il est préférable de préparer à l'avance l'ensemble des cartouches nécessaires. Ajuster fermement la seringue sur l'unité de filtration et filtrer goutte à goutte en position verticale (ne pas dépasser 4/5 gouttes par seconde). Collecter le filtrat dans un tube propylène de 2ml (type ependorf).
Procéder directement au dosage des microcystines par ELISA ou bandelettes. Analyse des microcystines totales (protocole 2)
Préparer un volume approprié de ToxXtract pour tous les essais prévus. Ajouter 1 volume de ToxXtract à 1 volume du liquide à analyser dans un récipient fermé en polypropylène ou en verre. Des tubes ependorf de 2 ml peuvent être utilisés pour des petits volumes. Il peut être plus pratique d'utiliser des tubes gradués avec bouchon vissant de volume supérieur pour des volumes de 2 à 5 ml.
Fermer hermétiquement le tube et agiter vigoureusement 10 secondes; laisser reposer 5 minutes. Agiter à nouveau 10 secondes puis prélever 1 ,5 à 2 ml du liquide à l'aide d'une seringue en polypropylène et ajuster fermement la seringue sur une unité de filtration et filtrer goutte à goutte en position verticale (ne pas dépasser 2/3 gouttes par seconde).
Collecter le filtrat dans un tube ependorf de 2ml en polypropylène.
Diluer N fois le volume d'extrait nécessaire dans le tampon adapté au dosage immunologique choisi pour l'étape finale. Pour l'utilisation de tests bandelettes, une dilution d'un facteur 2 au minimum est recommandée (pour les dosages EIA, un tampon approprié est le phosphate de sodium 100 mM pH 7,4, NaCI 150mM, sérum albumine bovine 0,1 %; un tampon phosphate de sodium 75 mM pH 7,4, NaCI 30 mM, sérum albumine bovine 0,1 %, Tween-20 0,1 % est utilisé pour les immuno-chromatographies). Le résultat obtenu est multiplié par 2N pour corriger l'effet des dilutions successives.
Analyse après une étape de concentration (protocole 3)
Si l'analyse directe donne une valeur à la limite du seuil de détection, une confirmation peut être obtenue après une étape pratique de concentration d'un facteur 10 (ou plus). Seule la fraction de toxines associée aux cellules sera mesurée dans ce cas. Cette procédure complémentaire peut toutefois s'avérer difficile à appliquer aux suspensions cellulaires très concentrées.
Par exemple, pour un facteur de concentration de 10:
a) Prélever 20 ml du milieu à analyser à l'aide d'une seringue graduée. b) Filtrer lentement en position verticale sur les mêmes cartouches que dans la procédure A (ne pas dépasser 4/5 gouttes par seconde). Purger la cartouche avec un peu d'air pour assurer une filtration complète. Le dépôt cellulaire doit être homogène.
c) Diluer le réactif ToxXtract volume à volume avec de l'eau et prélever 2 ml du mélange à l'aide d'une petite seringue en polypropylène. Passer la moitié du volume (1 ml) sur la cartouche, en position verticale, en récupérant le filtrat dans un tube polypropylène de 2 ml. Le flux de réactif doit de préférence être rapide au tout début pour un mouillage homogène du filtre (contrôle visuel) puis effectué au goutte à goutte (2/3 gouttes par seconde). Ne pas purger la cartouche avec de l'air; le filtre doit rester en contact avec le réactif. Laisser le filtre incuber 5 minutes et terminer l'extraction avec le restant du réactif. Récupérer le filtrat avec la même seringue pour extraire le filtre une seconde fois en une seule étape. Pour indication, la filtration de 1 ml devrait durer environ 20 secondes.
d) Diluer le volume nécessaire de filtrat d'un facteur N dans le tampon approprié (pour les dosages EIA, un tampon approprié est le phosphate de sodium 100 mM pH 7,4, NaCI 150mM, sérum albumine bovine 0,1 %; un tampon phosphate de sodium 75 mM pH 7,4, NaCI 30 mM, sérum albumine bovine 0,1 %, Tween-20 0,1 % est utilisé pour les immuno-chromatographies) et procéder au dosage. Note 1 : la concentration en microcystines cellulaires du milieu de départ sera la concentration mesurée x N/10 (concentration 10 fois aux étapes b / c; dilution N fois à l'étape d)
Note 2 : en cas de concentration cellulaire trop forte, il peut se produire une saturation prématurée du filtre à l'étape b. Mesurer alors le volume réellement filtré et extraire le filtre avec 1 /10 de ce volume de mélange ToxXtract (step c). Il n'est pas recommandé d'utiliser moins de 1 ml à cette étape.
Exemple 2 : Optimisations des paramètres d'extraction
L'optimisation de la technique d'extraction a été réalisée sur la souche
Microcystis aeruginosa, l'une des plus répandue dans les blooms naturels. Cette souche unicellulaire présente une bonne vitesse de croissance en cultures de laboratoire.
Trois des techniques d'extraction les plus courantes en laboratoire ont été systématiquement utilisées comme contrôles:
i) lyophilisation suivie d'une extraction méthanolique acide avec sonication (méthanol:eau 75% (v:v), TFA 0,05% (v:v));
ii) incubation 3 minutes à 100°C;
iii) congélations / décongélations répétées 3 fois.
Dans les expériences présentées ci-après, les trois techniques ont systématiquement été utilisées et le meilleur résultat d'extraction obtenu avec une de ces techniques a été retenu comme valeur de référence.
Les valeurs dans les différents graphiques ci-dessous sont la moyenne systématique de trois expériences, chaque dosage immunologique étant lui-même dupliqué; la déviation standard moyenne n'excède pas 5%.
La valeur des microcystines extra-cellulaires est mesurée en utilisant le protocole 1 et soustraite de la valeur des microcystines totales de manière à obtenir la fraction associée aux cellules. La concentration est donnée en équivalent de microcystine L-R. Les cultures pour les différents essais n'ont pas été nécessairement collectées à la même densité cellulaire, ce qui explique les différences dans les teneurs en microcystines. 2.1 ) Sélection du meilleur solvant
Des mélanges alcool / eau ont été retenus sur la base de l'ensemble des travaux antérieurs qui utilisent souvent un pourcentage élevé de méthanol. La série d'alcools aliphatiques compatibles avec un mélange aqueux (jusqu'à 3 carbones) a été évaluée; une teneur de 20% en alcool a été considérée comme un maximum afin d'éviter une trop grande dilution ultérieure des extraits dans l'utilisation des techniques immuno-chromatographiques.
Les résultats de cette étude sont présentés à la Figure 2.
Comme il était prévisible, les résultats montrent qu'une faible teneur en alcool entraîne une faible efficacité d'extraction des microcystines (les concentrations en méthanol sont classiquement de 75 à 80%). Par contre, l'efficacité augmente avec la longueur de la chaîne carbonée (Figure 2).
Le propanol apparaît ainsi comme étant l'alcool le plus efficace pour l'extraction : l'extraction en présence d'un mélange aqueux à 20% de propanol permet d'extraire environ environ 460 ng/ml de microcystine (contre environ 810 ng/ml avec la technique de congélation / décongélation (cf. colonne « référence ») et environ 740 ng/ml pour la lyophilisation suivie d'une extraction méthanolique acide (composition méthanol :eau 75% (v:v), TFA 0,05% (v:v)) avec sonication (cf. colonne « référence »).
Le propanol a donc été sélectionné pour la suite des essais.
2.2) Addition d'un détergent
L'éventuel effet détergent dans le mélange alcool/eau a ensuite été étudié. Cinq détergents usuels en biologie ont été ajoutés au mélange alcool / eau à des concentrations finales de 0,2% (poids/vol):
- le CHAPS qui est un détergent zwiterionique (cholamidopropyl-diméthyl- ammonio propane sulfonate)
- les autres détergents sont des détergents non-ioniques: Nonidet P40 et Triton X100 sont des octlyphenyl-polyéthylene glycol de longueur différente; 3DM et Tween 20 sont des dérivés d'une chaîne aliphatique en C12 (n-dodécyl- β-D- maltoside et polyoxyéthylène sorbitan monolaurate respectivement). L'effet du détergent est spectaculaire puisqu'on obtient avec chacun des détergents un rendement d'extraction bien supérieur à la valeur de référence (Figure 3). Le Triton X100 donne l'effet le plus marqué, mais il n'est pas compatible avec les techniques immuno-chromatographiques impliquant des liposomes. Les quatre autres détergents ayant un effet équivalent, le Tween 20 a été sélectionné pour la suite des tests puisqu'il est classiquement utilisé dans beaucoup de réactions immunologiques.
La concentration optimale de propanol a été ensuite contrôlée à nouveau en présence de 0,2% de Tween 20. Appliquée aux cellules de Microcystis aeruginosa, une teneur de 10% en propanol donne un effet quasi maximum, avec peu de différence significative aux concentrations supérieures (Figure 4).
Cependant, un effet plus marqué jusqu'à 20% a été constaté avec la souche filamenteuse plus résistante Planktothrix agardhii.
La concentration de 20% propanol a donc été adoptée pour la suite des essais. Cette concentration s'est d'ailleurs avérée également plus efficace pour les extractions directes sur filtre (protocole 3).
2.3) Acidification du milieu
Comme il a été rapporté dans la littérature, certains variants de microcystines sont mieux extraits en milieu acide. Il a effectivement été remarqué que l'effet du pH est particulièrement marqué pour la souche Planktothrix agardhii, puisque le rendement d'extraction à partir de cette souche était très faible en milieu neutre (Figure 5).
L'acide trifluoroacétique (TFA) 0,1 %, qui procure un pH final de 2,0 dans le milieu, a un effet plus marqué que le chlorure d'hydrogène (même pH) sur l'efficacité d'extraction; il est utilisé à cette concentration dans le mélange final.
Exemple 3 : Application du protocole d'extraction optimisé aux quatre souches témoins
Les concentrations finales de réactifs dans le milieu d'extraction sont les suivantes: 20% propanol (vol:vol), 0,2% Tween 20 (poids:vol) et 0,1 % TFA (vol:vol). Les hépatotoxines associées aux cellules ont été mesurées sur des cultures de laboratoire des quatre souches sélectionnées. Les deux techniques mises au point, extraction directe (protocole 2) et extraction sur filtre (protocole 3) ont été comparées au kit QuickLyse™ de la Société Abraxis (Abx). La valeur la plus élevée obtenue avec les techniques classiques (le plus souvent lyophilisation / extraction méthanolique) a été retenue comme référence 100%.
Le Tableau 1 ci-dessous donne les valeurs moyennes pour 3 à 7 cultures différentes de chaque souche, la quantification immunologique étant elle-même dupliquée. Les résultats sont exprimés en % de la référence.
Tableau 1 : comparaison du rendement d'extraction relatif des microcystines par les protocoles ToxXtract selon l'invention ou par le kit QuickLyse™ de la société Abraxis (Abx)
Figure imgf000027_0001
L'extraction directe selon le protocole 2 donne des concentrations en microcystines systématiquement supérieures à la meilleure des techniques classiques, parfois dans une large mesure (voir Anabaena flos-aquae). Ces valeurs sont également supérieures à celles obtenues avec le kit QuickLyse™ de Abraxis; cette différence est notoirement importante pour Planktothrix agardhii, une souche filamenteuse résistante.
La technique un peu moins efficace d'extraction sur filtre (protocole 3) donne 60 à 80 % des valeurs maximums obtenues avec la technique directe (protocole 2), mais néanmoins proches des valeurs de référence; ces valeurs doivent être considérées comme une limite inférieure et corroborées par une technique classique si nécessaire. La Figure 6 illustre la reproductibilité des procédures d'extraction ToxXtract (protocole 2) et Abraxis pour deux souches: Anabaena flos-aquae, pour laquelle les deux méthodes montrent des résultats comparables, et Planktothrix agardhi pour laquelle la procédure ToxXtract est de loin la meilleure méthode.
L'impact du choix de l'alcool en C3 dans une composition selon l'invention sur le rendement d'extraction des microcystines a ensuite été évalué.
Pour ce faire, une culture de Microcystis aeruginosa a été traitée selon la technique d'extraction directe (protocole 2) à l'aide d'une composition constituée de Tween 20 à 0,2%, de TFA à 0,1 % et de 20% d'alcool, l'alcool étant le propanol (« P »), l'isopropanol (« isP ») ou le propane-diol (« Pdi »).
Les résultats de cette expérience sont représentés à la Figure 7.
Ces résultats montrent que l'extraction est équivalente lorsque le propanol ou l'isopropanol sont utilisés, alors que l'extraction est environ deux fois moins efficace lorsque le propane-diol est utilisé.
Il est à noter qu'une extraction réalisée à l'aide d'une composition selon l'invention comprenant une concentration finale de 25 % de propanol ou d'isopropanol dans le milieu d'extraction est parfois préférable, notamment pour extraire des microcystines de forte hydrophobicité présentes chez certains genres de cyanobactéries.
Ainsi, afin de s'assurer que les microcystines de l'ensemble des genres de cyanobactéries susceptibles d'être présentes dans un échantillon à analyser sont extraites, la concentration finale de propanol ou d'isopropanol dans le milieu d'extraction est de préférence 25 %.
Exemple 4 : Extractions de microcystines à partir de blooms naturels - comparaison avec la méthode de référence
Le protocole 2 d'extraction a été utilisé pour effectuer des extractions directes de blooms naturels. Les modes opératoires et l'exploitation des résultats sont les mêmes que pour les cultures de laboratoire. Tableau 2 : efficacités relatives d'extraction des microcystines par la méthode de référence ou par le protocole 2 ToxXtract
Figure imgf000029_0001
souvent lyophilisation / extraction méthanolique) a été retenue comme référence 100%.
La nouvelle procédure d'extraction des hépatotoxines décrite dans la demande s'est avérée systématiquement plus efficace que les différentes techniques de laboratoire décrites dans l'état de la technique. Elle est également plus efficace que le procédé mis en œuvre à l'aide du kit d'extraction QuickLyse™ de la Société Abraxis, récemment commercialisé pour le même usage. Cette efficacité s'est révélée particulièrement décisive pour la souche Planktothrix agardhii, une souche filamenteuse résistante couramment rencontrée dans les blooms et qui produit également d'autres toxines que les hépatotoxines (neurotoxines).
Exemple 5 : Comparaison de l'analyse du bloom du lac du Bourget par le procédé ToxXtract et par le kit d'extraction QuickLyse™ de la Société Abraxis
Le prélèvement effectué en mars 2009 dans le lac du Bourget a permis d'effectuer une comparaison avec le kit QuickLyse™ de la société Abraxis (Abx) qui n'était pas disponible lors des premiers essais terrains. L'efficacité de ce dernier s'est révélée extrêmement faible en comparaison des procédés ToxXtract décrits dans le document complet (Figure 8).
Toutes les analyses quantitatives après extraction ont été effectuées par dosages enzymo-immunologiques via un anticorps monoclonal spécifique du résidu Adda commun à toutes les hépatotoxines (laboratoire SPI/LERI, Saclay). La concentration en toxines dans le milieu est mesurée directement après filtration appropriée pour éliminer l'ensemble des cellules présentes; cette valeur est déduite des valeurs globales obtenues avec les différentes procédures afin de comparer strictement l'efficacité de l'extraction des hépatotoxines cellulaires (sauf pour ToxXtract protocole 3, où le milieu est déjà éliminé avant l'extraction).
La procédure d'extraction directe (ToxXtract protocole 2) s'effectue par simple mélange volume à volume du réactif avec le prélèvement. Elle s'est à nouveau montrée légèrement supérieure en efficacité à la technique de référence la plus classiquement mise en œuvre au laboratoire: lyophilisation de l'échantillon suivi d'une extraction en méthanol 75% sous sonication (Lyoph/MetOH). Ceci corrobore à nouveau l'ensemble des résultats de l'étude complète sur les souches de laboratoires et les quatre prélèvements précédents.
De même la procédure de concentration sur filtre (ToxXtact protocole 3) s'avère quasiment équivalente aux procédures les plus courantes. Elle permet de valider des valeurs qui seraient à la limite de détection des tests terrain. Dans le cas présent, 2 ml de l'échantillon de départ sont dilués dans 20 ml d'eau (dilution artificielle d'un facteur 10); la suspension obtenue est filtrée et les cellules retenues sur le filtre sont extraites in situ par passage de 2 ml du réactif ToxXtract; ce qui apporte donc un facteur de concentration de 10 par rapport à la solution diluée et permet une comparaison directe avec la solution initiale Dans le cas présent, on s'attend donc à retrouver la valeur de l'extraction directe, ce qui est pratiquement le cas.
Une analyse microscopique de l'échantillon a montré la présence d'une cyanobactérie multicellulaire filiforme du genre Planktothrix (productrice probable des microcystines détectées ci-dessus), mais également de deux diatomées en grand nombre: Asterionella, et Fragilaria crotonensis (indicateur de pollution). Cette analyse microscopique montre que la dominance d'autres espèces cellulaires dans le milieu n'affecte pas l'efficacité du procédé ToxXtract. La valeur trouvée ici, environ 200 μ9/Ι, est bien au-dessus des seuils édictés par l'OMS (10 μ9/Ι pour l'eau de baignade, 1 μ9/Ι pour l'eau de consommation).

Claims

Revendications
1 . Composition comprenant :
20 à 60 % (volume:volume) d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci, et
- 0,1 à 2% (poids:volume) d'au moins un détergent ;
un agent acidifiant présent en quantité suffisante pour que la composition, après dilution d'un facteur 2 avec de l'eau, ait un pH compris entre 1 ,8 et 2,5 ; et
de l'eau en quantité suffisante pour (q.s.p.) 100%.
2. Composition selon la revendication 1 , comprenant :
30 à 50% (v:v) de propanol ou isopropanol,
0,2 à 0,5% (p:v) d'un détergent sélectionné dans le groupe constitué de CHAPS, NP-40 et Tween 20,
0,1 à 0,4% (v:v) d'acide trifluoroacétique, et
de l'eau en quantité suffisante pour 100%.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, qui est constituée de :
- 40 à 50% (v :v) de propanol ou isopropanol,
0,2 à 0,5% (p :v) d'un détergent sélectionné dans le groupe constitué de CHAPS, NP-40 et Tween 20,
0,1 à 0,4% (v :v) d'acide trifluoroacétique, et
de l'eau en quantité suffisante pour 100%.
4. Kit comprenant :
a) une première composition comprenant ou constituée de :
- 20*(x+y)/x à 60*(x+y)/x % (v :v), de préférence 30*(x+y)/x à 50*(x+y)/x % (v :v), d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci,
- 0,1 *(x+y)/x à 2*(x+y)/x % (p :v), de préférence 0,2*(x+y)/x à 0,5*(x+y)/x % de préférence encore 0,3*(x+y)/x à 0,4*(x+y)/x %, d'au moins un détergent ;
- et de l'eau q.s.p. 100% ; et b) une seconde composition comprenant ou constituée de :
- 0,1 *(x+y)/y à 0,4*(x+y)/y % (v :v), de préférence 0,2 *(x+y)/y % d'acide trifluoroacétique; et
- de l'eau q.s.p 100% ;
où x et y sont des nombres positifs, et y est préférentiellement compris entre x/2 et x/9.
5. Kit selon la revendication 4, qui comprend en outre des instructions pour mélanger x volumes de ladite première composition avec y volumes de ladite seconde composition pour constituer un réactif d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries.
6. Kit selon la revendication 4 ou 5 comprenant :
a) une première composition comprenant :
- environ 22,22 à environ 66,66 % (v :v), de préférence environ 33,33 à environ 55,55 % (v :v), d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci,
- environ 0,1 1 à 2,22 % (p:v), de préférence 0,22 à 0,56 % de préférence encore 0,33 à 0,45%, d'au moins un détergent ;
- et de l'eau q.s.p. 100% ; et
b) une seconde composition comprenant :
- 1 à 4 % (v:v), de préférence 2 % d'acide trifluoroacétique; et
- de l'eau q.s.p. 100%.
7. Utilisation d'une composition comprenant :
10 à 30 % (volume:volume (v :v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci ;
0,05 à 1 % (poids:volume (p :v)) d'au moins un détergent ;
- éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1 ,8 et 2,5 ; et
- de l'eau q.s.p. 100% ;
pour l'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries.
8. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle le détergent est un détergent compatible avec les méthodes immunologiques.
9. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle ladite composition comprend entre 0,05 et 0,2% (volume:volume) d'acide trifluoroacétique ou entre
0,005 et 0,02N d'acide chlorhydrique, à titre d'agent acidifiant.
1 0. Méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries comprenant les étapes consistant à :
a) mettre en contact des cyanobactéries avec une composition comprenant :
1 0 à 30 % (volume :volume (v :v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci ;
0,05 à 1 % (poids:volume (p :v)) d'au moins un détergent ;
- éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1 ,8 et 2,5 ; et
de l'eau q.s.p. 1 00% ;
b) incuber les cyanobactéries au contact de ladite composition pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines.
1 1 . Méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries selon la revendication 1 0, comprenant les étapes consistant à :
a) mélanger un volume de composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 avec un volume de suspension cellulaire contenant des cyanobactéries; et
b) incuber le mélange d'extraction obtenu à l'étape a) pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines.
1 2. Méthode selon la revendication 1 1 , qui comprend en outre, après l'étape b), une étape consistant à filtrer tout ou partie du mélange d'extraction pour récolter le mélange d'extraction.
13. Méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries selon la revendication 10, comprenant les étapes consistant à :
a) concentrer les cyanobactéries d'un échantillon à analyser par filtration ; b) mettre en contact le retentât contenant les cyanobactéries obtenu par filtration à l'étape a) avec une composition comprenant :
10 à 30 % (volume:volume (v :v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol et de l'isopropanol, ou d'un mélange de ceux-ci ;
0,05 à 1 % (poids:volume (p :v)) d'au moins un détergent ;
éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1 ,8 et 2,5 ; et
de l'eau q.s.p. 100% ;
c) incuber le retentât contenant les cyanobactéries au contact de ladite composition pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines.
14. Méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries selon la revendication 13, dans laquelle la filtration est mise en œuvre sur un support inerte de porosité mixte de 0,8 à 8 μιτι.
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