JP5793085B2 - Ｌｉｓｔｅｒｉａを検出およびモニターするための組成物、キットおよび関連する方法 - Google Patents

Ｌｉｓｔｅｒｉａを検出およびモニターするための組成物、キットおよび関連する方法 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００８年１２月３０日に出願された米国出願第６１／１４１，６５１号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
発明の分野
本発明は、微生物に、ならびにそれらの検出のための組成物およびメカニズムに関する。
発明の背景
本出願は、Ｌｉｓｔｅｒｉａを検出するための組成物および方法に関する。一定の態様および実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ １６Ｓ ｒＲＮＡの特定の領域を、核酸増幅反応の好ましいターゲットとして同定した。
Ｌｉｓｔｅｒｉａは、土壌および水中で見つけられるグラム陽性菌である。野菜は、土壌からまたは肥料として使用される堆肥から汚染をきたすことがある。動物は、病気に見えずとも細菌を保有することがあり、肉および乳製品などの動物由来の食品を汚染することがある。リステリア症（細菌Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで汚染された食品を食することにより引き起こされる重篤感染症）は、米国において、最近、重要な公衆衛生問題として受けとめられている。米国では、毎年、推定２，５００人が、リステリア症で重病になる。これらのうち、５００人が死亡する。妊婦、新生児、免疫系が弱っている人、癌、糖尿病または腎臓病の人、ＡＩＤＳの人、グルココルチコステロイドの投薬を受けている人、および老人は、危険性が高い。種としては、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、およびＬ．ｍｕｒｒａｙｉが挙げられる。
Ｌｉｓｔｅｒｉａ生物の存在を検出およびモニターするための高感度で迅速な方法が捜し続けられている。Ｌｉｓｔｅｒｉａの迅速で正確な検出および／または定量は非常に望ましいが、従来の試薬および技術を用いて達成することは実際には難しい。典型的な方法は、実験室培養技術を用いるものであり、この技術は、サンプルを２４〜４８時間インキュベートして、生物を肉眼検出可能レベルに増殖させることを含むだろう。その後、生理的および生化学的試験により、または診断アッセイキットの使用により、同定を果たすことができる。しかし、最近の市販核酸プローブ試験でさえ、培養とＰＣＲ増幅を併用し、完了に８時間を要する。従って、関心のあるサンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａを同定することができる迅速で頑強な検出方法が、依然として必要とされている。本明細書において説明するように、本発明は、これらの要求を満たし、他の関連した利点を提供する。
本発明は、Ｌｉｓｔｅｒｉａの検出に使用するための組成物、キットおよび方法に関する。本発明は、一定のＬｉｓｔｅｒｉａ配列が、Ｌｉｓｔｅｒｉａの検出に驚くほど効果的であるという発見に、一部、基づく。一定の態様および実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ １６Ｓ ｒＲＮＡの特定の領域を、検出の特異性、感度または速度ならびに他の利点に関して改善をもたらす核酸増幅反応の好ましいターゲットとして同定した。
一部の好ましい態様において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ転写媒介増幅アッセイ（以後「ＴＭＡ」）において使用するための組成物を提供する。一部の好ましい態様において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ転写媒介増幅アッセイを行うためのキットを提供する。一部の好ましい態様において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ転写媒介増幅アッセイを行うための方法を提供する。一定の好ましい実施形態において、前記組成物、キット、および／または方法は、１つ以上のオリゴヌクレオチド、例えば、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチド、検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、トーチ（Ｔｏｒｃｈ）オリゴヌクレオチド、およびこれらに類するものを含むまたは使用することがある。
従って、１つの態様に従って、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するための組成物を提供する。一定の好ましい実施形態において、前記組成物は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み；この場合、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡの約３６４−４４０のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、および該プライマーオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、前記増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅すべきＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列の逆ストランドをターゲットにする。
第二の態様では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するための組成物を提供する。一定の好ましい実施形態において、前記組成物は、配列番号１３の配列または相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有する第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、および配列番号１４の配列または相補配列を有する第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２３の配列または相補配列を有する。
第三の態様では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するための組成物を提供する。一定の好ましい実施形態において、前記組成物は、２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドを含む。一定の好ましい実施形態において、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下でＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ、およびＬ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉが増幅されるように、構成および配列（ａｒｒａｎｇｅ）される。一定の好ましい実施形態において、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下でＢｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅが実質的に増幅されないように、構成および配列される。
第四の態様では、本明細書において提供する組成物を含むキットを提供する。本明細書において提供する態様の一定の好ましい実施形態において、前記キットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み、この場合、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３６４−４４０のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、および該プライマーオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、前記増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅すべきＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列の逆ストランドをターゲットにする。
第五の態様では、本明細書において提供する組成物を含むキットを提供する。本明細書において提供する態様の一定の好ましい実施形態において、前記キットは、配列番号１３の配列または相補配列を有する第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、および配列番号１４の配列または相補配列を有する第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドを含む。もう一つの好ましい実施形態において、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２３の配列または相補配列を有する。
第六の態様では、本明細書において提供する組成物を含むキットを提供する。本明細書において提供する態様の一定の好ましい実施形態において、前記キットは、２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、および１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドを含む。一定の好ましい実施形態において、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下でＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ、およびＬ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉが増幅されるように、構成および配列される。一定の好ましい実施形態において、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下でＢｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅが実質的に増幅されないように、構成および配列される。
第七の態様では、本明細書において提供する組成物および／またはキットを使用してサンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａの存在を検出するための方法を提供する。本明細書において提供する態様の一定の好ましい実施形態において、前記方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用し、この場合、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３６４−４４０のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、および該プライマーオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、前記増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅すべきＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列の逆ストランドをターゲットにする。
第八の態様では、本明細書において提供する組成物および／またはキットを使用してサンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａの存在を検出するための方法を提供する。本明細書において提供する態様の一定の好ましい実施形態において、前記方法は、配列番号１３の配列または相補配列を有する第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、および配列番号１４の配列または相補配列を有する第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドを使用する。もう１つの好ましい実施形態において、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２３の配列または相補配列を有する。
第九の態様では、本明細書において提供する組成物および／またはキットを使用してサンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａの存在を検出するための方法を提供する。本明細書において提供する態様の一定の好ましい実施形態において、前記方法は、２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドを使用する。一定の好ましい実施形態において、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下でＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ、およびＬ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉが増幅されるように、構成および配列される。一定の好ましい実施形態において、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下でＢｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅが実質的に増幅されないように、構成および配列される。
本明細書において提供する態様の１つの特に好ましい実施形態において、前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを有する。本明細書において提供する態様のもう１つの特に好ましい実施形態において、前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを有する。１つの好ましい実施形態において、前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の配列または相補配列から選択される配列を有する。本明細書において提供する態様の特に好ましい実施形態において、前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする。本明細書において提供する態様の１つの特に好ましい実施形態において、前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の配列または相補配列を含む。本明細書において提供する態様のもう１つの特に好ましい実施形態において、前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、配列番号１４の配列または相補配列を含む。
本明細書において提供する態様のもう１つの特に好ましい実施形態において、前記組成物は、第二のＴ７プロバイダーをさらに含む。本明細書において提供する態様の１つの特に好ましい実施形態において、前記組成物は、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを有する第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、および大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを有する第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の配列または相補配列から選択される配列を有する。本明細書において提供する態様の１つの好ましい実施形態において、前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする。前記組成物が第一および第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドを含む、本明細書において提供する態様のもう１つの特の好ましい実施形態において、該第一および第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列を、それぞれがターゲットにする。前記組成物が第一および第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドを含む、本明細書において提供する態様の他の特に好ましい実施形態において、該第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の配列または相補配列を含み、および該第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、配列番号１４の配列または相補配列を含む。
本明細書において提供する態様の１つの好ましい実施形態において、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４３９−５０５のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする。好ましい実施形態において、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４８０−５０１のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする。さらにもう１つの好ましい実施形態において、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３の配列または相補配列から選択される配列を有する。特に好ましい実施形態において、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２３の配列または相補配列を含む。
本明細書において提供する態様の一定の好ましい実施形態において、前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、ターゲットとなるＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に少なくとも７０％；または７５％；または８０％；または８５％；または９０％；または１００％相補的である１５〜３５のヌクレオチドを含む。一定の好ましい実施形態において、前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、１５〜３５のヌクレオチドであって、前記ターゲットとなるＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的であるが、該ターゲットとなる核酸配列と比較して１つのミスマッチ；または２つのミスマッチ；または３つのミスマッチ；または４つのミスマッチ；または５つのミスマッチを該１５〜３５の相補性ヌクレオチド中に有するものである、１５〜３５のヌクレオチドを含む。
本明細書において提供する態様の一部の好ましい実施形態では、前記転写媒介増幅反応の１つ以上の態様を助長するまたは改善するために役立つ１つ以上の追加のオリゴヌクレオチドタイプおよび／または他の増幅試薬を含むことがある。例えば、好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーオリゴヌクレオチドに加えて、追加のオリゴヌクレオチドは、検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチド、およびこれらに類するもののうちの１つ以上をさらに含むことがある。
本明細書において提供する態様の一部の好ましい実施形態において、前記組成物、キットおよび／または方法は、検出オリゴヌクレオチド、好ましくはトーチオリゴヌクレオチドまたはアクリジニウムエステルプローブ、をさらに含むまたは使用することがある。１つの好ましい実施形態において、前記検出オリゴヌクレオチドは、配列番号２４〜２８の配列または相補配列から選択されるトーチオリゴヌクレオチドである。特に好ましい実施形態において、前記検出オリゴヌクレオチドは、配列番号２７の配列または相補配列を有するトーチオリゴヌクレオチドである。
本明細書において提供する態様の一部の好ましい実施形態において、前記組成物、キットおよび／または方法は、ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含むまたは使用することがある。１つの好ましい実施形態において、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７の配列または相補配列から選択される。特に好ましい実施形態において、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列番号６の配列または相補配列を有する。
本明細書において提供する態様の一部の好ましい実施形態において、前記組成物、キット、および／または方法は、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含むまたは使用することがある。１つの実施形態において、前記ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号２９〜３６の配列または相補配列から選択される。特に好ましい実施形態において、前記ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号３１の配列または相補配列を有する。
本明細書において提供する態様の一部の好ましい実施形態において、前記組成物、キット、および／または方法は、ヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含むまたは使用することがある。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３６４−４４０のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、および
前記増幅アッセイにおいて使用される前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅すべき前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列の逆ストランドをターゲットにする、オリゴヌクレオチドのセット。
（項目２）
第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドであって、その配列が、第一のＴ７プロバイダーと一部重複するが、１つ以上のＬｉｓｔｅｒｉａ種の塩基配列間でミスマッチが存在する位置において１つ以上の塩基が異なるものである第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第一のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含み、および
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第二のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、
項目２に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目４）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目２または３に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目５）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの塩基配列が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目２に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目６）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目２〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目７）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む、項目２〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目８）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの前記第一のものの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの前記第二のものの塩基配列が、配列番号１４の配列塩基またはその相補配列を含む、項目３に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目９）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４３９−５０５のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１０）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４８０−５０１のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１１）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１２）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１３）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１４）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号２３の配列またはその相補配列を含む、項目２または３に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１５）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１６）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目２または３に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１７）
検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１８）
前記検出オリゴヌクレオチドが、トーチオリゴヌクレオチドまたはアクリジニウムエステルプローブである、項目１７に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１９）
前記トーチオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、２５、２６、２７、２８の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目１８に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目２０）
ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目２１）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目２０に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目２２）
ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目２３）
前記ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目２２に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目２４）
ヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目２５）
配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含む第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドとを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するためのオリゴヌクレオチドのセット。
（項目２６）
検出オリゴヌクレオチドをさらに含み、前記検出オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２７の塩基配列またはその相補配列を含む、項目２５に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目２７）
ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号６の塩基配列またはその相補配列を含む、項目２５または２６に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目２８）
ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含み、前記ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが、配列番号３１の塩基配列またはその相補配列を含む、項目２５〜２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目２９）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に少なくとも９０％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１、１３、および１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３０）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に少なくとも９０％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目２〜８、１４、１６、または２５〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３１）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に１００％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１、１３、および１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３２）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に１００％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目２〜８、１４、１６、または２５〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３３）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、１つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１、１３、および１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３４）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、１つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目２〜８、１４、１６、または２５〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３５）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、２つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１、１３、および１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３６）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、２つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチドを含む、項目２〜８、１４、１６、または２５〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３７）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、３つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１、１３、および１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３８）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、３つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目２〜８、１４、１６、または２５〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目３９）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、４つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１、１３、および１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目４０）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、４つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目２〜８、１４、１６、または２５〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目４１）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、５つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１、１３、および１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目４２）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、５つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目２〜８、１４、１６、または２５〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目４３）
２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ、およびＬ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉが、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下で増幅されるように、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドが構成および配列され；
Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅが、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下で実質的に増幅されないように、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドが構成および配列される、オリゴヌクレオチドのセット。
（項目４４）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第一のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含み、および
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第二のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、
項目４３に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目４５）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの塩基配列が、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目４３または４４に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目４６）
前記第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む、項目４４に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目４７）
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４８０−５０１のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目４３〜４６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目４８）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目４３〜４７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目４９）
検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目４３〜４８に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目５０）
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するためのキットであって、
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３６４−４４０のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、および
前記増幅アッセイにおいて使用される前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅すべき前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列の逆ストランドをターゲットにする、キット。
（項目５１）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含む、項目５０に記載のキット。
（項目５２）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、項目５０に記載のキット。
（項目５３）
第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目５０に記載のキット。
（項目５４）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含む、項目５３に記載のキット。
（項目５５）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、項目５３に記載のキット。
（項目５６）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第一のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含み、および
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第二のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、
項目５３に記載のキット。
（項目５７）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目５０〜５２のいずれか一項に記載のキット。
（項目５８）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目５３〜５６に記載のキット。
（項目５９）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの塩基配列が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目５３に記載のキット。
（項目６０）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目５３、５４または５６のいずれか一項に記載のキット。
（項目６１）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む、項目５３、５５または５６のいずれか一項に記載のキット。
（項目６２）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの前記第一のものの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの前記第二のものの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む、項目５６に記載のキット。
（項目６３）
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４３９−５０５のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目５０〜６２のいずれか一項に記載のキット。
（項目６４）
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４８０−５０１のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目５０〜６３のいずれか一項に記載のキット。
（項目６５）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目５０〜６３のいずれか一項に記載のキット。
（項目６６）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目５０〜６５のいずれか一項に記載のキット。
（項目６７）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目５０〜５２のいずれか一項に記載のキット。
（項目６８）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目５３、５４および５６のいずれか一項に記載のキット。
（項目６９）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目５０〜５２のいずれか一項に記載のキット。
（項目７０）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目５３、５５および５６のいずれか一項に記載のキット。
（項目７１）
検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目５０〜７０のいずれか一項に記載のキット。
（項目７２）
前記検出オリゴヌクレオチドが、トーチオリゴヌクレオチドまたはアクリジニウムエステルプローブである、項目７１に記載のキット。
（項目７３）
前記トーチオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、２５、２６、２７、２８の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目７２に記載のキット。
（項目７４）
ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目５０〜７３のいずれか一項に記載のキット。
（項目７５）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目７４に記載のキット。
（項目７６）
ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目５０〜７５のいずれか一項に記載のキット。
（項目７７）
前記ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目７６に記載のキット。
（項目７８）
ヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目５０〜７７のいずれか一項に記載のキット。
（項目７９）
配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含む第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドとを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するためのキット。
（項目８０）
配列番号２７の塩基配列またはその相補配列を含む検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目７９に記載のキット。
（項目８１）
配列番号６の塩基配列またはその相補配列を含むブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目７９または８０に記載のキット。
（項目８２）
配列番号３１の塩基配列またはその相補配列を含むターゲット捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目７９〜８１のいずれか一項に記載のキット。
（項目８３）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に少なくとも９０％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５０〜５２、５７、６７、および６９のいずれか一項に記載のキット。
（項目８４）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に１００％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５０〜５２、５７、６７、および６９のいずれか一項に記載のキット。
（項目８５）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、１つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５０〜５２、５７、６７、または６９のいずれか一項に記載のキット。
（項目８６）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、２つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５０〜５２、５７、６７、または６９のいずれか一項に記載のキット。
（項目８７）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、３つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５０〜５２、５７、６７、または６９のいずれか一項に記載のキット。
（項目８８）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、４つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５０〜５２、５７、６７、または６９のいずれか一項に記載のキット。
（項目８９）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、５つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５０〜５２、５７、６７、または６９のいずれか一項に記載のキット。
（項目９０）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に少なくとも９０％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５３〜５６、５８〜６２、６８、７０、または７９〜８２のいずれか一項に記載のキット。
（項目９１）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に１００％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５３〜５６、５８〜６２、６８、７０、７９〜８２、または９０のいずれか一項に記載のキット。
（項目９２）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、１つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５３〜５６、５８〜６２、６８、７０、７９〜８２、または９０のいずれか一項に記載のキット。
（項目９３）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、２つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５３〜５６、５８〜６２、６８、７０、７９〜８２、または９０のいずれか一項に記載のキット。
（項目９４）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、３つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５３〜５６、５８〜６２、６８、７０、７９〜８２、または９０のいずれか一項に記載のキット。
（項目９５）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、４つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５３〜５６、５８〜６２、６８、７０、７９〜８２、または９０のいずれか一項に記載のキット。
（項目９６）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、５つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目５３〜５６、５８〜６２、６８、７０、７９〜８２、または９０のいずれか一項に記載のキット。
（項目９７）
２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するためのキットであって、
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ、およびＬ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉが、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下で増幅されるように、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドが構成および配列され；
Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅが、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下で実質的に増幅されないように、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドが構成および配列される、キット。
（項目９８）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第一のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含み、および
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第二のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、
項目９７に記載のキット。
（項目９９）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目９７または９８に記載のキット。
（項目１００）
前記第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む、項目９８に記載のキット。
（項目１０１）
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４８０−５０１のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目９７〜１００のいずれか一項に記載のキット。
（項目１０２）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目９７〜１０１のいずれか一項に記載のキット。
（項目１０３）
検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目９７〜１０２のいずれか一項に記載のキット。
（項目１０４）
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを行うことを含む、サンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａを検出するための方法であって、
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３６４−４４０のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、および
前記増幅アッセイにおいて使用される前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅すべき前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列の逆ストランドをターゲットにする、方法。
（項目１０５）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０７）
第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０８）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１１０）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第一のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含み、および
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第二のものが大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１１１）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目１０４〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目１０７〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの塩基配列が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１１４）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１０７、１０８、または１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１０７、１０９、または１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの前記第一のものの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの前記第二のものの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１７）
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４３９−５０５のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目１０４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４８０−５０１のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目１０４〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１９）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目１０４〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１０４〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列または相補配列を含む、項目１０４〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１０７、１０８、および１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１０４、１０５、および１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの１つの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１０７、１０９、および１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２５）
検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１０４〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記検出オリゴヌクレオチドが、トーチオリゴヌクレオチドまたはアクリジニウムエステルプローブである、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記トーチオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、２５、２６、２７、２８の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１０４〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１０４〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３１）
前記ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
ヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１０４〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３３）
配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含む第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドとを使用して核酸増幅アッセイを行うことを含む、サンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａを検出するための方法。
（項目１３４）
配列番号２７の塩基配列またはその相補配列を含む検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
配列番号６の塩基配列またはその相補配列を含むブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１３３または１３４に記載の方法。
（項目１３６）
配列番号３１の塩基配列またはその相補配列を含むターゲット捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含む項目１３３〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に少なくとも９０％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０４、１０５、１０６、１１１、１２１、または１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に１００％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０４〜１０６、１１１、１２１、または１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、１つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０４〜１０６、１１１、１２１、または１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、２つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０４〜１０６、１１１、１２１、または１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、３つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０４〜１０６、１１１、１２１、または１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４２）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、４つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０４〜１０６、１１１、１２１、または１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４３）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、５つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０４〜１０６、１１１、１２１、または１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４４）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に少なくとも９０％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０７〜１１０、１１２〜１１６、１２２、１２４、または１３３〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４５）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に１００％相補的である１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０７〜１１０、１１２〜１１６、１２２、１２４、１３３〜１３６、または１４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４６）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、１つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０７〜１１０、１１２〜１１６、１２２、１２４、１３３〜１３６、または１４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４７）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、２つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０７〜１１０、１１２〜１１６、１２２、１２４、１３３〜１３６、または１４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４８）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、３つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０７〜１１０、１１２〜１１６、１２２、１２４、１３３〜１３６、または１４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４９）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、４つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０７〜１１０、１１２〜１１６、１２２、１２４、１３３〜１３６、または１４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５０）
ターゲットとなる前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に相補的である前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、５つのミスマッチを伴う１５〜３５のヌクレオチド塩基を含む、項目１０７〜１１０、１１２〜１１６、１２２、１２４、１３３〜１３６、または１４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５１）
２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを行うことを含む、サンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａを検出するための方法であって、
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ、およびＬ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉが、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下で増幅されるように、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドが構成および配列され；
Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅが、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下で実質的に増幅されないように、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドが構成および配列される、方法。
（項目１５２）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第一のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含み、および
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第二のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、
項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目１５１または１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５５）
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約４８０−５０１のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、項目１５１〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５６）
前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、項目１５１〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５７）
検出オリゴヌクレオチドをさらに含む項目１５１〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５８）
増幅された前記核酸の検出が、リアルタイムで行われる、項目１０４、１３３、または１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５９）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ １６Ｓリボソーム核酸の４５０領域のフラグメントを増幅するように計画された２つ以上の増幅オリゴヌクレオチドを含む、サンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａを検出するためのオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１６０）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ １６Ｓリボソーム核酸を検出するための１つ以上のプローブをさらに含む、項目１５９に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
（項目１６１）
項目１５９に記載の増幅オリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを行うこと、および増幅された核酸を項目１６０に記載の１つ以上のプローブで検出することを含む、サンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａの存在を検出するための方法。
（項目１６２）
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記プライマーが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約１１８０−１３７０のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、ならびに
前記増幅アッセイにおいて使用される前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅すべき前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列の逆ストランドをターゲットにする、オリゴヌクレオチドのセット。
（項目１６３）
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するためのキットであって、
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記プライマーが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約１１８０−１３７０のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、ならびに
前記増幅アッセイにおいて使用される前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅すべき前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列の逆ストランドをターゲットにする、キット。
（項目１６４）
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを行うことを含む、サンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａを検出するための方法であって、
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記プライマーが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの約１１８０−１３７０のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、ならびに
前記増幅アッセイにおいて使用される前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅すべき前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列の逆ストランドをターゲットにする、方法。
本発明の用語および概念は、そうでないと明確に述べていない限り、および／または文脈が特に別様に指示していない限り、本明細書において説明するとおりの意味を有する。別様に定義されていない限り、本明細書において用いる学術および専門用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。一般的な定義は、分子生物学技術に関連した専門書、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，１９９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）またはＴｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，１９９１，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）において見つけることができる。別様に述べていない限り、本明細書の中で用いているまたは考える技術は、通常の当業者に周知の標準的な方法論である。本明細書に含める実施例は、一部の好ましい実施形態を例証するものである。本明細書において引用するそれぞれの参考文献は、その全体が参照により本明細書に特に組み込まれている。
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」エンティティーは、そのエンティティーの１つ以上を指す；例えば、「１つの（ａ）核酸」は、１つ以上の核酸を表すと解することに注意する。従って、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」を本明細書では交換可能に用いることができる。
本明細書において用いる場合の用語「核酸」は、単数の「核酸」ばかりでなく複数の「核酸」も包含し、ならびに互いに共有結合した２つ以上のヌクレオチド、ヌクレオシドまたは核酸塩基（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）の任意の鎖を指す。核酸としては、ウイルスゲノム、もしくはそれらの部分、ＤＮＡもしくはＲＮＡいずれか、細菌ゲノム、もしくはそれらの部分、真菌、植物もしくは動物ゲノム、もしくはそれらの部分、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または合成ＤＮＡもしくはＲＮＡが挙げられるが、それらに限定されない。核酸は、線形形態（例えば、ｍＲＮＡ）、環状形態（例えば、プラスミド）、または分枝形態、ならびに二本鎖または一本鎖形態で提供されることがある。核酸は、その核酸の機能または挙動を改変するために修飾塩基、例えば、追加のヌクレオチドがその核酸に付加されることを阻止するために３’末端ジデオキシヌクレオチドの付加、を含むことがある。本明細書において用いる場合、核酸の「配列」は、核酸を構成する塩基の配列を指す。
本明細書において用いる場合の用語「ポリヌクレオチド」は、核酸鎖を示す。本出願を通して、核酸を５’末端から３’末端で示す。標準的な核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ、は、概して、「３’から５’へ」合成される、すなわち、成長核酸の５’末端へのヌクレオチド付加によるものである。
本明細書において用いる場合の「ヌクレオチド」は、リン酸基と５炭素糖と窒素含有塩基とからなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡにおいて見出される５炭素糖は、リボースである。ＤＮＡにおいて、５炭素糖は、２’−デオキシリボースである。この用語は、そのようなサブユニットの類似体、例えば、リボースの２’位のメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）も含む。本明細書において用いる場合、「Ｔ」残基を含有するメトキシオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース部分の２’位にメトキシ基をおよび塩基位置にウラシルを有する。
本明細書において用いる場合の「非ヌクレオチド単位」は、ポリマーのハイブリダイゼーションに有意に関与しない単位である。そのような単位は、例えば、ヌクレオチドとのいずれの有意な水素結合にも関与してはならず、および５つのヌクレオチド塩基またはそれらの類似体のうちの１つを成分として有する単位を含まないだろう。
本明細書において用いる場合の「ターゲット核酸」は、増幅すべき「ターゲット配列」を含む核酸である。ターゲット核酸は、本明細書において説明するようにＤＮＡまたはＲＮＡであることがあり、および一本鎖であることもあり、または二本鎖であることもある。ターゲット核酸は、増幅されないだろうターゲット配列に加えて、他の配列を含むことがある。典型的なターゲット核酸としては、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、ウイルス、細菌もしくは真核細胞からのｒＲＮＡ、ｔＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または染色体ＤＮＡが挙げられる。
「単離される」とは、ターゲット核酸を含有するサンプルがその天然環境から取られることを意味するが、この用語は、いずれの精製度も暗示しない。
本明細書において用いる場合の用語「ターゲット配列」は、増幅すべきであるターゲット核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「ターゲット配列」は、ＴＭＡプロセス中にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合体化する、複合体形成性配列を含む。ターゲット核酸が、元々、一本鎖である場合、用語「ターゲット配列」は、ターゲット核酸中に存在するような「ターゲット配列」に相補的な配列も指すだろう。「ターゲット核酸」が、元々、二本鎖である場合、用語「ターゲット配列」は、センス（＋）鎖とアンチセンス（−）鎖の両方を指す。ターゲット配列を選択する際、関連のないターゲット核酸と密接に関連したターゲット核酸とを区別するために「ユニーク」配列を選択すべきであることは、当業者には理解されるだろう。
Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸領域に関して本明細書において用いる場合の用語「配列をターゲットにする」は、本明細書において説明するような増幅および検出を可能にするように、オリゴヌクレオチドがターゲット配列にハイブリダイズするプロセスを指す。１つの好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、ターゲットとなるＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列と相補的であり、ミスマッチを含有しない。もう１つの好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、ターゲットとなるＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列と相補的であるが、１つ；または２つ；または３つ；または４つ；または５つのミスマッチを含有する。好ましくは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、ターゲット配列に相補的なヌクレオチドを少なくとも１０から５０；または１２から４５；または１４から４０；または１５〜３５含む。
ターゲットとなるＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列に関して本明細書において用いる場合の用語「フラグメント」または「領域」は、連続した核酸の断片を指す。一定の実施形態において、フラグメントは、２５；または５０；または７５；または１００；または１２５；または１５０；または１７５；または２００；または２２５；または２５０；または３００；または３５０；または４００；または４５０；または５００；または７５０；または１０００；または２０００；または３０００のヌクレオチドを含む。
本明細書において用いる場合、用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」または「オリゴマー」は、単数の「オリゴヌクレオチド」ばかりでなく複数の「オリゴヌクレオチド」も包含し、ならびに本明細書において開示する増幅方法およびその後の検出方法において試薬として使用される２つ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基または関連化合物の任意のポリマーを指すことを意図する。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはそれらの類似体である場合がある。用語オリゴヌクレオチドは、試薬に対するいずれの特定の機能も示さず、むしろ、本明細書に記載するすべてのそのような試薬を包含するように包括的に用いている。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たすことができ；例えば、それは、相補鎖に対して特異的であり、相補鎖にハイブリダイズでき、およびさらに、核酸ポリメラーゼ存在下で伸長され得る場合には、プライマーとして機能することができ；それは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含有し、転写を可能にする場合には、プロモーターを提供することができ（例えば、Ｔ７プロバイダー）；ならびにそれは、適切な位置にあるおよび／または適切に修飾されている場合には、ハイブリダイゼーションを防止するまたはプライマー伸長を妨げるように機能することができる。
本明細書において用いる場合、一群の特定の配列から選択される配列「を含む」または「からなる」または「から本質的になる」核酸配列を有するオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドが、基本および新規特性として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記群のリストされた核酸配列の１つについての正確な相補配列を有する核酸に安定してハイブリダイズできることを意味する。正確な相補配列としては、対応するＤＮＡまたはＲＮＡ配列が挙げられる。
本明細書において用いる場合、指定の核酸配列「に実質的に対応する」オリゴヌクレオチドは、言及するオリゴヌクレオチドが、参照核酸配列に、該オリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じターゲット核酸配列とハイブリダイズする点で該参照核酸配列に類似したハイブリダイゼーション特性を有するために十分に類似したものであることを意味する。「実質的に対応するオリゴヌクレオチド」が、参照する配列と異なることがあること、および同じターゲット核酸配列に尚ハイブリダイズすることができることは、当業者には理解されるだろう。その核酸とのこの差を、配列内の同一の塩基の百分率によって述べることがあり、またはプローブもしくはプライマーとそのターゲット配列間での完全相補塩基の百分率によって述べることがある。例えば、これらの塩基同一性または相補性百分率が１００％から約８０％である場合、オリゴヌクレオチドは、参照核酸配列に「実質的に対応する」。好ましい実施形態において、前記百分率は、１００％から約８５％である。さらに好ましい実施形態において、この百分率は、１００％から約９０％であり得；他の好ましい実施形態において、この百分率は、１００％から約９５％である。当業者には、許容できない非特異的ハイブリダイゼーションレベルを生じさせることなく特定のターゲット配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために様々な相補性百分率で必要とされ得るハイブリダイゼーション条件への様々な修飾がわかるであろう。
「ヘルパーオリゴヌクレオチド」または「ヘルパー」は、例えば米国特許第５，０３０，５５７号（この特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているような、ターゲットとなる核酸と検出プローブまたは他のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの速度および程度を増加させるために、ターゲット核酸に結合してそのターゲットに異なる二次および／または三次構造を付与するように設計されたオリゴヌクレオチドを指す。ヘルパーは、ターゲット核酸配列へのハイブリダイゼーションならびにプライマー、ターゲット捕捉および他のオリゴヌクレオチドの機能を助長するために使用することもできる。
本明細書において用いる場合、「ブロッキング部分」は、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の３’末端を、それが核酸ポリメラーゼによって効率的に伸長され得ないように「ブロックする」ために使用される物質である。
本明細書において用いる場合、「プライマーオリゴヌクレオチド」または「プライマー」は、少なくともその３’末端が核酸テンプレートに相補的であるオリゴヌクレオチドであって、該テンプレートと（水素結合またはハイブリダイゼーションによって）複合体化して、ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始に適するプライマー：テンプレート複合体を生じさせるオリゴヌクレオチドである。
本明細書において用いる場合、「プロモーター」は、核酸に結合して特定の部位でＲＮＡの転写を開始させるシグナルとしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「トランスクリプターゼ」）により認識される特定の核酸配列である。
本明細書において用いる場合、「プロモーター−プロバイダー」または「プロバイダー」は、第一および第二の領域を含むオリゴヌクレオチドであって、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾されているオリゴヌクレオチドを指す。プロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドの「第一領域」は、ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズする塩基配列を含み、この場合、ハイブリダイズ配列は、３’に位置するが、必ずしもプロモーター領域に近接しているとは限らない。プロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部分は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、および１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド以上の長さに達することがある。「第二の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む。プロモーターオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばリバース・トランスクリプターゼ、好ましくは上で説明したようなその３’末端にブロッキング部分を含むもの、によって伸長され得ないように遺伝子工学で作られる。本明細書において言及する場合、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供する、ブロックされたプロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドである。
本明細書において用いる場合、「終結オリゴヌクレオチド」または「ブロッカーオリゴヌクレオチド」は、ターゲット配列の５’端付近のターゲット核酸領域に相補的である塩基配列を含むので、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終結させ」、それにより、該新生核酸鎖に被定義３’末端をもたらす、オリゴヌクレオチドである。
本明細書において用いる場合、「エキステンダーオリゴヌクレオチド」または「エキステンドオリゴ」は、Ｔ７プロバイダーと同じ意味であるオリゴヌクレオチドであって、構造を開くまたは特異性を向上させるヘルパーオリゴヌクレオチドとして作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書において用いる場合、「検出オリゴヌクレオチド」は、ターゲット核酸の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、ターゲット配列（増幅された配列を含む）に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴヌクレオチドを指す。「プローブオリゴヌクレオチド」または「検出プローブ」とは、検出しようとしているターゲット配列の領域に部分的にまたは完全に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むので、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれにハイブリダイズする、分子を意味する。
「安定な」または「検出に安定な」は、反応混合物の温度が核酸デュプレックスの融解温度より少なくとも２℃下であることを意味する。
「増幅」または「核酸増幅」は、本明細書においてさらに説明する、所期の特定のターゲット核酸配列の少なくとも一部分を含有する、ターゲット核酸の多数のコピーの生産を意味する。それらの多数のコピーをアンプリコンまたは増幅産物と呼ぶことがある。
本明細書において用いる場合、用語「アンプリコン」は、ターゲット配列に含まれている配列に相補的または相同である、増幅手順中に生成される核酸分子を指す。
「優先的にハイブリダイズする」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、プローブがそれらのターゲット配列、またはそれらの複製物、にハイブリダイズして安定なプローブ：ターゲットハイブリッドを形成しながら、同時に、安定なプローブ：非ターゲットハイブリッドの形成を最少にすることを意味する。従って、プローブは、ターゲット配列またはその複製物に、非ターゲット配列より十分大きい程度にハイブリダイズし、それにより当業者は、増幅中に形成されるターゲット配列のＲＮＡ複製物または相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を正確に定量することができる。
「特異的ハイブリダイゼーション」は、２つの配列が高い相補度を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、許容アニーリング条件下で形成し、任意の後続の洗浄工程後にハイブリダイズしたままである。核酸配列のアニーリングのための許容条件は、通常の当業者が常例的に決定できるものであり、例えば、約６×ＳＳＣの存在下、６５℃で見受けられるものであり得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、一部分、洗浄工程を行う温度に関して表現されることがある。そのような温度は、被定義イオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃から２０℃低くなるように概して選択される。Ｔｍは、完全にマッチしたプローブにターゲット配列の５０％がハイブリダイズする（被定義イオン強度およびｐＨ下での）温度である。核酸ハイブリダイゼーションについてのＴｍおよび条件を算出するための方程式は、当該技術分野において公知である。
「相補的」とは、２つの一本鎖核酸の類似した領域のヌクレオチド配列、または同じ一本鎖核酸の異なる領域に対するヌクレオチド配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーションまたは増幅条件下で安定な二本鎖水素結合領域内で該一本鎖領域が互いにハイブリダイズすることを可能にするヌクレオチド塩基組成を有することを意味する。１つの一本鎖領域のヌクレオチドの連続配列が、他の一本鎖領域のヌクレオチドの類似した配列と、ＡがＵまたはＴと対合されＣがＧと対合されるような一連の「カノニカル」水素結合塩基対を形成できるとき、それらのヌクレオチドの配列は、「完全に」相補的である。
「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」または「デュプレックス」は、二本鎖、水素結合領域を含有する核酸構造を意味し、この場合、それぞれの鎖は互いに相補的であり、および該領域は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、化学発光もしくは蛍光検出、オートラジオグラフィーまたはゲル電気泳動をはじめとする（しかし、これらに限定されない）手段によって検出するために十分に安定している。そのようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡデュプレックス分子を含むことがある。
本明細書において用いる場合、「テーゲット捕捉オリゴヌクレオチド」は、標準的な塩基対合によりターゲット核酸内のターゲット配列に特異的にハイブリダイズし、固定されたプローブ上の結合パートナーに連結して該ターゲット核酸を支持体に捕捉する、核酸オリゴマーを指す。ターゲット捕捉オリゴマーの一例は、通常は同じオリゴマー上に、２つの結合領域：配列結合領域（すなわち、ターゲット特異的部分）と固定されたプローブ結合領域、を含むが、該２つの領域が、１つ以上のリンカーによって互いに連結された２つの異なるオリゴマー上に存在することもある。
本明細書において用いる場合、「固定されたオリゴヌクレオチド」、「固定されたプローブ」または「固定された核酸」は、ターゲット捕捉オリゴマーを支持体に直接または間接的に連結する核酸結合パートナーを指す。支持体に連結された固体化オリゴヌクレオチドは、サンプル中の未結合材料からのターゲット捕捉結合ターゲットの分離を助長する。
本明細書において用いる場合、「標識」は、検出されるまたは検出可能シグナルをもたらすプローブに直接または間接的に連結される部分または化合物を指す。
本明細書において用いる場合、「分子トーチ」と呼ぶ構造は、連結領域によって接続される、および所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、（「ターゲット結合ドメイン」および「ターゲット閉鎖ドメイン」を作る）異なる自己相補性領域を含むように設計される。
本明細書において用いる場合、「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡテンプレートから相補ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例は、大腸菌からのＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、またはバクテリオファージＴ４、Ｐｈｉ−２９、Ｍ２もしくはＴ５からのＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、細菌もしくはバクテリオファージから単離された自然に存在する酵素である場合もあり、または組換え発現される場合もあり、あるいは一定の望ましい特性、例えば、熱安定性、またはＤＮＡ鎖を認識もしくは合成する能力を有するように様々な修飾テンプレートから遺伝子工学で作り変えられた修飾または「進化」形である場合もある。すべての公知ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始させるために相補プライマーを必要とする。適する条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡテンプレートから相補ＤＮＡコピーを合成できることは、公知である。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼも、一般にはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
本明細書において用いる場合、「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「トランスクリプターゼ」は、通常は二本鎖であるプロモーター配列を有する二本鎖または部分二本鎖ＤＮＡ分子から多数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。ＲＮＡ分子（「転写産物」）は、プロモーターのすぐ下流の特定の位置で始まって５’から３’の方向で合成される。トランスクリプターゼの例は、大腸菌ならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６からのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
本明細書において用いる場合、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「リバース・トランスクリプターゼ」（「ＲＴ」）は、ＲＮＡテンプレートから相補ＤＮＡコピーを合成する酵素である。すべての公知リバース・トランスクリプターゼは、ＤＮＡテンプレートから相補ＤＮＡコピーを作る能力も有する；従って、それらは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでもあり、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでもある。ＲＴは、ＲＮアーゼＨ活性も有することがある。ＲＮＡテンプレートででも、ＤＮＡテンプレートででも、合成を開始させるためにプライマーを必要とする。
本明細書において用いる場合、「選択的ＲＮアーゼ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡ部分を分解するが、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを分解しない酵素である。例示的選択的ＲＮアーゼは、ＲＮアーゼＨである。同じまたは類似した活性を有するＲＮアーゼＨ以外の酵素も使用することができる。選択的ＲＮアーゼは、エンドヌクレアーゼである場合もあり、またはエキソヌクレアーゼである場合もある。大部分のリバース・トランスクリプターゼ酵素は、それらのポリメラーゼ活性に加えて、ＲＮアーゼＨ活性を含有する。しかし、他のＮＲアーゼＨ源を、随伴ポリメラーゼ活性なしで利用することができる。その分解は、結果として、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からのＲＮＡの分離を生じさせる。あるいは、選択的ＲＮアーゼは、ＲＮＡ部分が溶融するまたは酵素にＲＮＡ部分を巻き戻させるように、様々な位置でＲＮＡを単に切断することができる。本発明のＲＮＡターゲット配列またはＲＮＡ産物を選択的に分解する他の酵素は、通常の当業者には容易にわかるであろう。
増幅系の文脈での用語「特異性」は、配列およびアッセイ条件に依存してターゲット配列と非ターゲット配列を区別するその能力を表す増幅系の特性を指すために本明細書では用いている。核酸増幅に関して、特異性は、生産される特定のアプリコン数の副産物数に対する比（すなわち、シグナル対ノイズ比）を一般に指す。
用語「感度」は、核酸増幅反応を検出または定量することができる精度を本明細書では指す。増幅反応の感度は、一般に、増幅系中の確実に検出することができるターゲット核酸の最少コピー数の測度であり、ならびに例えば、用いられる検出アッセイ、および増幅反応の特異性、すなわち、特定のアプリコンの副産物に対する比、に依存するであろう。
本明細書において用いる場合、「コロニー形成単位（「ＣＦＵ」）」は、サンプル中の生存可能微生物の測度として用いている。ＣＦＵは、目に見えるコロニーを固体培地上で形成することができる個々の生細胞であり、その個々の細胞は、１つの親細胞から細胞分裂によって得られる。１ＣＦＵは、ｒＲＮＡの約１０００コピーに相当する。
本明細書において用いる場合、用語「ＴＴｉｍｅ」は、アッセイデータのリアルタイムプロットにおけるシグナルの出現の閾時間または時間である。リアルタイム増幅反応においてアプリコン生産を示す特定の閾値を通過する時間がＴＴｉｍｅ値によって推定される。ＴＴｉｍｅ、ならびにＴＴｉｍｅ値を算出および使用するためのアルゴリズムは、Ｌｉｇｈｔら、米国特許公開第２００６／０２７９７２号、パラグラフ［０５１７］から［０５３８］に記載されており、この開示は本明細書における参照により本明細書に組み込まれている。正規化およびバックグラウンド調整データに曲線あてはめ手順を適用する。曲線のあてはめは、所定のローバンドとハイバンドの間のデータ部分のみについて行う。データをあてはめる曲線を見つけた後の目的は、該曲線またはその投影図が定義済み閾値を交差する点に対応する時間を推定することである。１つの実施形態において、正規化データについての閾値は、０．１１である。前記ハイおよびローバンドは、曲線が様々な対照データセットにあてはまる範囲が、所与の閾値と結び付けられる時間に関して最小の変動を示すように、実験的に決定される。例えば、１つの実施形態において、ローバンドは０．０４であり、ハイバンドは０．３６である。ローバンドより下の第一データ点からハイバンドを通過する第一データ点までにわたって、データに曲線をあてはめる。次に、そのあてはめの傾きが、統計的に有意であるかどうかの判定を行う。例えば、一次係数のｐ値が０．０５未満である場合、そのあてはめは、有意であると考え、処理を継続する。そうでない場合には処理を停止する。あるいは、Ｒ２値によってデータの妥当性を判定することができる。当てはめた曲線について、線形曲線ｙ＝ｍｘ＋ｂの傾きｍおよび切片ｂを決定する。その情報と共に、下記方程式を用いて、ＴＴｉｍｅを決定することができる：
ＴＴｉｍｅ ＝ （閾値−ｂ）／ｍ
本明細書において用いる場合、用語「相対蛍光単位（「ＲＦＵ」）」は、蛍光強度の測定の任意単位である。ＲＦＵは、測定に用いられる検出手段の特徴によって異なる。
本明細書において用いる場合、用語「リアルタイムＴＭＡ」は、リアルタイム検出手段によってモニターされる、ターゲット核酸の単一プライマー転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）を指す。
ヌクレオチド位置に関連して本明細書において用いる場合、用語「約」は、所期の位置±１ヌクレオチド；または±２ヌクレオチド；または±３ヌクレオチド；または±４ヌクレオチド；または±５ヌクレオチドを意味する。
図１Ａ〜Ｃは、（１Ａ）「不良な」、（１Ｂ）「より良好な」、および（１Ｃ）「良好な」アッセイ性能を示す、分析物についての増幅チャートの一般例を示すものである。 図２は、（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ、アクセッション番号Ｊ０１８５９、のｂｐ３５０−５０５に対応する）Ｌｉｓｔｅｒｉａ「４５０」増幅および検出領域を包含する配列を示すものである。 図３は、（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ、アクセッション番号Ｊ０１８５９、のｂｐ１１８０−１３７０に対応する）Ｌｉｓｔｅｒｉａ「１２７５」増幅および検出領域を包含する配列を示すものである。 図３は、（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ、アクセッション番号Ｊ０１８５９、のｂｐ１１８０−１３７０に対応する）Ｌｉｓｔｅｒｉａ「１２７５」増幅および検出領域を包含する配列を示すものである。
一定の態様および実施形態において、本発明は、試験のために、例えば、診断試験のために、血液製剤のスクリーニングのために、バイオプロセス、食品、水、工業または環境サンプルにおける微生物検出のために、および他の目的のために、採取されるサンプル中の、単独で存在することもあり、または核酸の均質もしくは不均質混合物の大きなまたは小さな成分として存在することもある、Ｌｉｓｔｅｒｉａの同定、検出、および／または定量のための組成物、方法およびキットに関する。本明細書において開示する特定の方法、組成物およびキットは、増幅ベースのＬｉｓｔｅｒｉａ検出に検出感度、特異性または速度向上をもたらす。ＬｉｓｔｅｒｉａリボソームＲＮＡは、Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅのｒＲＮＡに非常に近い関係にある。従って、本発明の一定の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａアッセイは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属のほぼすべての種、亜種および血清型に共通のｒＲＮＡ配列を同定し、ならびにＬｉｓｔｅｒｉａと他の近縁種とを識別する。そのような識別に有用な領域は、１６Ｓ ｒＲＮＡの４５０領域である。そのような識別のための代替領域は、１６Ｓ ｒＲＮＡの１２７５領域である。
Ｌｉｓｔｅｒｉａに特異的な増幅オリゴヌクレオチドの広範な分析の結果として、大腸菌（アクセッション番号Ｊ０１８５９）１６Ｓ ｒＲＮＡ参照配列の約３５０から約５０５ｂｐの領域に対応するＬｉｓｔｅｒｉａの特定の領域、以後「４５０領域」と呼ぶ、を、増幅ベースのＬｉｓｔｅｒｉａ検出のための好ましいターゲットとして同定した。従って、本発明は、関心のあるサンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａの検出方法、増幅オリゴヌクレオチド、組成物、反応混合物、キット、およびこれらに類するものに関する。
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ属アッセイは、公知Ｌｉｓｔｅｒｉａ種に特異的なリボソームＲＮＡ配列を検出するものである。それは、逆ＴＭＡを用いてターゲット特異的配列を増幅し、プローブを使用して増幅産物をそれらが生産されるにつれて検出する、リアルタイムＴＭＡ技術を利用する。ターゲット検出を内部対照の増幅および検出と同時に行って、結果の信頼性を確認する。前記アッセイの結果は、Ｌｉｓｔｅｒｉａの存在または不在について陽性または陰性としてサンプルを分類することからなる。前記アッセイにより、１つより多くのＬｉｓｔｅｒｉａ種の増幅が可能である。一部の好ましい実施形態では、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、およびＬ．ｍｕｒｒａｙｉからなる群より選択される２つ以上のＬｉｓｔｅｒｉａ種を増幅する。他の好ましい実施形態では、前記種のすべてを増幅する。
１つの実施形態において、サンプルは、Ｌｉｓｔｅｒｉａが既知のまたは疑われる汚染物質である、生物製剤プロセス（バイオプロセス）流である。本明細書において用いる場合、「バイオプロセス」は、意図されたものであるまたは意図されたものでない、生きている細胞もしくは生物またはそれらの成分が存在する、任意のプロセスを一般に指す。例えば、１つ以上のサンプルまたはサンプル流であって、それらのうちの少なくとも１つが、生きている細胞、生物、もしくはそれらの成分を含有するものである、または意図されたものでない汚染の結果としてそのような細胞、生物もしくは成分を含有するものであるサンプルまたはサンプル流を利用する本質的にいずれの製造または他のプロセスも、バイオプロセスとみなされる。多くのそのようなプロセスでは、プロセス内の生きている細胞、生物またはそれらの成分の存在および／または供給源を検出する、特定するおよび／または制御する能力を有することが望ましい。本明細書において開示する方法を用いて、例えば、１つ以上のバイプロセスサンプルおよび／または流中のＬｉｓｔｅｒｉａの存在および／または供給源を、迅速におよび高感度でモニターすることができる。
ターゲット核酸／ターゲット配列
行われる増幅アッセイの目的に基づいて任意の数の供給源からターゲット核酸を単離することができる。ターゲット核酸の供給源としては、犯罪の証拠からの、環境サンプル、例えば水もしくは土壌サンプル、からの、食品からの、工業サンプルからの、ｃＤＮＡライブラリーからの、または全細胞ＲＮＡからの、臨床検査材料、例えば血液、尿、唾液、糞便、精液または脊髄液が挙げられるが、それらに限定されない。必要な場合には、ターゲット核酸を、様々なオリゴヌクレオチドとの相互作用に利用できるようにする。これは、例えば、細胞からターゲット核酸を放出させるための細胞溶解または細胞透過性化を含むことがあり、その後、１つ以上の精製工程、例えば一連の単離および洗浄工程、を続いて行うことがある。例えば、Ｃｌａｒｋら、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ａ Ｗｉｄｅ Ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、米国特許第５，７８６，２０８号参照（この内容は、本明細書における参照により本明細書に組み込まれている）。これは、サンプルが、例えば血液サンプル中に存在するヘムなどの、増幅反応に干渉し得る成分を含有する場合、特に重要である。Ｒｙｄｅｒら、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｒｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｇｅｎｔｓ」、米国特許第５，６３９，５９９号参照（この内容は、本明細書における参照により本明細書に組み込まれている）。様々な増幅源からターゲット核酸を調製する方法は、通常の当業者に周知である。本明細書に記載する増幅反応の前にターゲット核酸をある程度精製することがあるが、他の場合には、サンプルをさらに一切操作せずに増幅反応に加える。
通常の当業者には理解されるであろうが、「ユニーク」配列は、試験環境から判断される。一部の実施形態において、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロバイダーオリゴヌクレオチドによって認識される配列は、試験される環境でユニークでなければならないが、可能性のあるすべての配列の母集団の中でユニークである必要はない。他の実施形態において、検出プローブによって認識される配列は、試験される環境でユニークでなければならないが、可能性のあるすべての配列の母集団の中でユニークである必要はない。ターゲット配列が、検出プローブによる認識のための「ユニーク」配列を含有することがあったとしても、それは、必ずしも、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロバイダーオリゴヌクレオチドが「ユニーク」配列を認識する場合であるとは限らない。一部の実施形態では、類縁生物のファミリーに共通であるターゲット配列を選択することが望ましいことがある。他の状況では、超高特異的ターゲット配列、すなわち、検出プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドによって認識される高特異的領域を少なくとも有するターゲット配列、が、近縁生物間の区別のために選択されるだろう。
ターゲット配列は、任意の実用的長さのものであり得る。最小ターゲット配列は、プライミングオリゴヌクレオチド（またはその相補配列）にハイブリダイズする領域と、プロバイダーオリゴヌクレオチド（またはその相補配列）のハイブリダイズ領域にハイブリダイズする領域と、検出に用いられる領域、例えば検出プローブにハイブリダイズする領域と、を含む。検出プローブとハイブリダイズする領域は、プライミングオリゴヌクレオチド（もしくはその相補配列）とハイブリダイズする領域、またはプロバイダーオリゴヌクレオチド（もしくはその相補配列）のハイブリダイズ領域とハイブリダイズする領域と、一部重複することがあり、または該領域内に含まれていることがある。前記の最小限の要件に加えて、ターゲット配列の最適な長さは、多数の考慮事項、例えば、二次構造の量、または配列内の自己ハイブリダイズ領域に依存する。典型的には、ターゲット配列は、３０ヌクレオチドの長さから約３００ヌクレオチドの長さにわたる。最適なまたは好ましい長さは、本明細書に記載する方法に従って決定することができる様々な条件によって変わるだろう。
核酸「同一性」
一定の実施形態において、核酸は、参照核酸の連続塩基領域と少なくとも７０％；または７５％；または８０％，または８５％または９０％，または９５％；または１００％同一である連続塩基領域を含む。短い核酸については、「クエリー」核酸の塩基領域と参照核酸の塩基領域との同一度を手作業でのアラインメントによって決定することができる。「同一性」は、比較する核酸の糖および主鎖領域に関係なく、窒素含有塩基の配列をただ比較することによって決定される。従って、クエリー：参照塩基配列アラインメントは、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせもしくは類似体であり得る。（ＲＮＡにおける）Ｕを（ＤＮＡにおける）Ｔに変換することによって、当量ＲＮＡおよびＤＮＡ塩基配列を比較することができる。
オリゴヌクレオチドおよびプライマー
オリゴヌクレオチドは、増幅反応におけるまたは増幅反応の増幅産物の検出におけるその具体的な機能によって唯一制限される、事実上、任意の長さであり得る。しかし、一定の実施形態において、好ましいオリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸配列またはその相補鎖の１領域に相補的である、少なくとも約１０；または１２；または１４；または１６；または１８；または２０；または２２；または２４；または２６；または２８；または３０；または３２；または３４；または３６；または３８；または４０；または４２；または４４；または４６；または４８；または５０；または５２；または５４；または５６の連続する塩基を含有するだろう。前記連続塩基は、好ましくは、そのオリゴヌクレオチドが結合するターゲット配列に、少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは完全に相補的である。一定の好ましいオリゴヌクレオチドは、一般に約１０〜１００；または１２〜７５；または１４〜５０；または１５〜４０の間の塩基長の長さのものであり、場合により、修飾ヌクレオチドを含むことがある。
通常の当業者に公知の技術により、例えば、化学または生化学合成により、および組換え核酸分子、例えば細菌またはウイルスベクター、からのインビトロまたはインビボ発現によって、被定義配列および化学構造のオリゴヌクレオチドを生産することができる。本開示による意図によると、オリゴヌクレオチドは、野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写産物のみからならない。
オリゴヌクレオチドをいずれの方法で修飾してもよいが、所与の修飾が所与のオリゴヌクレオチドの望ましい機能と適合性である場合に限る。当業者は、所与の修飾が任意の所与のオリゴヌクレオチドに適するまたは望ましいかどうかを、容易に判定することができる。修飾としては、塩基修飾、糖修飾または主鎖修飾が挙げられる。塩基修飾としては、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンに加えて、次の塩基の使用が挙げられるが、それらに限定されない：Ｃ−５プロピン、２−アミノアデニン、５−メチルシチジン、イノシン、ならびにｄＰおよびｄＫ塩基。ヌクレオシドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボースおよびそれらの類似体（例えば、リボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む）であり得る。Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第６，１３０，０３８号参照。他の糖修飾としては、２’−アミノ、２’−フルオロ、（Ｌ）−アルファ−トレオフラノシル、およびペントピラノシル修飾が挙げられるが、それらに限定されない。ホスホジエステルリンケージ、修飾リンケージなどのリンケージによって、またはオリゴヌクレオチドのその相補ターゲット核酸配列へのハイブリダイゼーションを妨げない非ヌクレオチド部分によって、ヌクレオシドサブユニットを連結することができる。修飾リンケージとしては、標準的なホスホジエステルリンケージを異なるリンケージで置換するリンケージ、例えば、チオリン酸リンケージまたはメチルホスホン酸リンケージが挙げられる。例えば、核酸塩基サブユニットをカルボキシメチルリンカーによって中央の第二級アミンにカップリングさせる２−アミノエチルグリシン主鎖などの擬似ペプチド主鎖でのＤＮＡの天然デオキシリボースリン酸主鎖の置換により、核酸塩基サブユニットを連結させることができる。擬似ペプチド主鎖を有するＤＮＡ類似体は、一般に、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」と呼ばれ、Ｎｉｅｌｓｅｎら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」、米国特許第５，５３９，０８２号によって開示されている。他のリンケージ修飾としては、モルホリノ結合が挙げられるが、これに限定されない。
本明細書において考えられるオリゴヌクレオチドまたはオリゴの非限定的な例としては、二環式および三環式ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸類似体（ＬＮＡ）が挙げられる。Ｉｍａｎｉｓｈｉら、米国特許第６，２６８，４９０号；およびＷｅｎｇｅｌら、米国特許第６，６７０，４６１号参照。修飾オリゴヌクレオチドが、その所期の機能を果たすことができる、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件もしくは増幅条件下でターゲット核酸にハイブリダイズすることができる、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼと相互作用し、それによって伸長もしくは転写を開始させることができるのであれば、いずれの核酸類似体も本発明によって考えられる。検出プローブの場合、修飾オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でターゲット核酸にも優先的にハイブリダイズできなければならない。
オリゴヌクレオチドの設計および配列は、下で説明するようなそれらの機能に依存する。考慮に入れる幾つかの変項としては、長さ、融解温度（Ｔｍ）、特異性、その系内の他のオリゴヌクレオチドとの相補性、Ｇ／Ｃ含有率、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）またはポリプリン（Ａ、Ｇ）ストレッチ、および３’端配列が挙げられる。これらおよび他の変項についての制御は、オリゴヌクレオチド設計の標準的で周知の態様であり、ならびに多数の可能性のあるオリゴヌクレオチドを最初にスクリーニングするために様々なコンピュータープログラムを容易に利用することができる。
下で説明するようなブロッキング部分を使用して様々な方法でオリゴヌクレオチド（または他の核酸）の３’末端をブロックすることができる。「ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの相補鎖を生産するように、ＤＮＡ依存性またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、ヌクレオチドのその３’末端への付加によって効率的に伸長されない。従って、「ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、「プライマー」であり得ない。
ブロッキング部分
ブロッキング部分は、小分子、例えばリン酸基またはアンモニウム基、である場合もあり、あるいは修飾ヌクレオチド、例えば、３’２’ジデオキシヌクレオチドもしくは３’デオキシアデノシン５’リン酸（コルジセピン）、または他の修飾ヌクレオチドである場合もある。追加のブロッキング部分は、例えば、３’末端に遊離ヒドロキシル基が存在しないように、３’から５’への配向を有するヌクレオチドもしくは短鎖ヌクレオチド配列の使用、３’アルキル基の使用、３’非ヌクレオチド部分（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、「Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」、米国特許第６，０３１，０９１号参照；この内容は、本明細書における参照により本明細書に組み込まれている）、チオリン酸塩、アルカン−ジオール残基、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、３’末端に３’ヒドロキシル基がないヌクレオチド残基、または核酸結合タンパク質を含む。好ましくは、３’ブロッキング部分は、３’から５’への配向を有する、または３’非ヌクレオチド部分を有する、および３’２’−ジデオキシヌクレオチドを有さない、または遊離ヒドロキシル基を有する３’末端を有さない、ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む。３’ブロッキングオリゴヌクレオチドを調製するための追加の方法は、通常の当業者に周知である。
プライミングオリゴヌクレオチドまたはプライマー
プライミングオリゴヌクレオチドは、そのテンプレートに相補的である共有結合したヌクレオチド塩基のその３’末端への付加によって伸長される。その結果がプライマー伸長産物である。適する好ましいプライミングオリゴヌクレオチドを本明細書に記載する。公知である事実上すべてのＤＮＡポリメラーゼ（リバース・トランスクリプターゼを含む）は、ＤＮＡ合成を開始させるためにオリゴヌクレオチドの一本鎖テンプレートへの複合体化（「プライミング」）を必要とするが、ＲＮＡ複製および転写（ＤＮＡからのＲＮＡのコピー形成）は、一般にプライマーを必要としない。ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるまさしくその特質のため、プライミングオリゴヌクレオチドは、３’ブロッキング部分を含まない。
プロモーターオリゴヌクレオチド／プロモーター配列
結合のために、そのようなトランスクリプターゼは、伸長反応によりプロモーター配列を含む領域内が二本鎖にされたＤＮＡを必要とすると一般に考えられた。しかし、ＲＮＡの効率的な転写は、二本鎖プロモーターがテンプレート核酸との伸長反応によって形成されない条件下でさえ起こり得ることが確認された。テンプレート核酸（転写される配列）が二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写を促進する点でのそれらの効率が著しく異なり得る、様々な異なるプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始させるとき、そのプロモーター配列は、転写される配列の一部ではない。従って、それによって生産されるＲＮＡ転写産物は、その配列を含まないだろう。
終結オリゴヌクレオチド
終結オリゴヌクレオチドまたは「ブロッカー」は、新生核酸鎖にとって望ましい３’端を実現するために十分な位置でターゲット核酸にハイブリダイズするように設計される。終結オリゴヌクレオチドの位置は、その設計に依存して自由に変えられる。終結オリゴヌクレオチドは、修飾されることもあり、または未修飾である場合もある。一定の実施形態において、終結オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いて合成される。これらの修飾ヌクレオチドは、相補デュプレックスのより高い熱安定性を明示した。この２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性を増加させるようにも機能し、その結果、その修飾オリゴヌクレオチドの半減期が増加する。例えば、Ｍａｊｌｅｓｓｉら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，２２２４−９参照（この内容は、本明細書における参照により本明細書に組み込まれている）。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに加えて、またはその代わりに、本明細書の他の箇所において説明するような他の修飾を利用することができる。例えば、終結オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡまたはＬＮＡを含むことがある。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３，４４−５３参照（この内容は、本明細書における参照により本明細書に組み込まれている）。典型的に、終結オリゴヌクレオチドは、伸長を防止するためにその３’末端にブロッキング部分を含む。終結オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる新生核酸鎖のさらなる伸長を終結させるために、そのオリゴヌクレオチドに連結されたタンパク質またはペプチドも含むことがある。適する好ましい終結オリゴヌクレオチドを本明細書に記載する。終結オリゴヌクレオチドは、典型的にまたは必然的に、３’ブロッキング部分を含むが、「３’がブロックされた」オリゴヌクレオチドが、必ずしも終結オリゴヌクレオチドとは限らないことに注意する。本明細書において開示する他のオリゴヌクレオチド、例えばプロバイダーオリゴヌクレオチドおよびキャッピングオリゴヌクレオチドも、典型的にまたは必然的に、３’がブロックされている。
エキステンダーオリゴヌクレオチド
エキステンダーオリゴヌクレオチドは、プロモーターオリゴヌクレオチドの第一の領域の３’末端に隣接するまたは該３’端付近のＤＮＡテンプレートにハイブリダイズする。好ましくは、エキステンダーオリゴヌクレオチドは、該エキステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基がプロバイダーオリゴヌクレオチドの３’末端塩基の３、２または１塩基以内にあるように、ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズする。最も好ましくは、エキステンダーオリゴヌクレオチドおよびプロバイダーオリゴヌクレオチドがＤＮＡテンプレートにハイブリダイズするとき、該エキステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基は、該プロバイダーオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に隣接する。エキステンダーオリゴヌクレオチドの伸長を防止するために、３’末端ブロッキング部分を典型的に含める。
プローブ
通常の当業者に理解されているであろうが、プローブは、人間の介入なしで自然には見いだされない（例えば、外来核酸で組み換えられた、単離された、またはある程度精製された）形態の単離された核酸分子またはその類似体を含む。プローブは、ターゲットとなる領域外に追加のヌクレオシドまたは核酸塩基を有することがあるが、そのようなヌクレオシドまたは核酸塩基がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションに実質的に影響を及ぼさない、および検出プローブの場合にはターゲット核酸への優先的ハイブリダイゼーションを妨げない場合に限る。非相補配列、例えば、ターゲット捕捉配列（一般に、ホモポリマートラクト、例えばポリ−Ａ、ポリ−Ｔまたはポリ−Ｕテール）、プロモーター配列、ＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、も含むことがあり、またはプローブ、ターゲット核酸または両方に所望の二次もしくは三次構造、例えば触媒活性部位もしくはヘアピン構造を付与するであろう配列を含有することがある。
プローブは、好ましくは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。前記標識は、放射性同位体、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発色団、述べられている条件下でターゲット核酸に安定してハイブリダイズすることができない塩基配列領域、およびこれらの混合物をはじめとする（しかし、それらに限定されない）、任意の適する標識物質であり得る。１つの特に好ましい実施形態において、前記標識は、アクリジニウムエステルである。本明細書において開示する一定のプローブは、標識を含まない。例えば、非標識「捕捉」プローブを使用して、ターゲット配列またはそれらの複製物を濃縮することができ、その後、それらを第二の「検出」プローブによって検出することができる。例えば、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら、「Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」、米国特許第６，５３４，２７３号参照（この内容は、本明細書における参照により本明細書に組み込まれている）。検出プローブは、概して標識されるが、一定の検出技術は、プローブを標識することを必要としない。例えば、Ｎｙｇｒｅｎら、「Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、米国特許第６，０６０，２３７号参照。
被定義配列のプローブを、通常の当業者に公知の技術により、例えば、化学合成により、および組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現により、生産することができる。好ましくは、プローブは、１０から１００ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは１２から５０塩基の長さ、およびさらにいっそう好ましくは１２から３５塩基の長さである。
ハイブリダイズ／ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションは、完全または部分的に相補的なヌクレオチド配列を有する２つの核酸鎖が所定の反応条件下で一緒になって安定な二本鎖ハイブリッドを形成するプロセスである。いずれかの核酸鎖は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）またはそれらの類似体である場合がある。従って、ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはそれらの類似体を伴うことがある。時としてハイブリッドと呼ばれるこの二本鎖構造の２つの成分鎖は、水素結合によって一緒に保持される。これらの水素結合は、最も一般的には、単一の核酸鎖上に塩基アデニンを含有するヌクレオチドとチミンもしくはウラシルを含有するヌクレオチド（ＡとＴもしくはＵ）またはシトシンを含有するヌクレオチドとグアニンを含有するヌクレオチド（ＣとＧ）の間で形成するが、これらの「カノニカル」ペアのメンバーでない塩基間で形成する場合もある。非カノニカル塩基対合は、当該技術分野において周知である。（例えば、Ｒｏｇｅｒ Ｌ．Ｐ． Ａｄａｍｓら、「Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」（第１１版、１９９２）参照）。
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーションアッセイ条件は、特定の検出プローブが、その試験サンプル中に存在する他の核酸よりターゲット核酸とハイブリダイズすることができる条件を指す。これらの条件は、ＧＣ含有率およびプローブの長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、および探究するハイブリダイゼーション特異度をはじめとする要因に依存して変わり得ることは理解されるであろう。具体的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本開示において下で提供する。
核酸増幅
多くの周知核酸増幅法は、二本鎖核酸を交互に変性させ、プライマーをハイブリダイズするために熱循環を必要とするが、他の周知核酸増幅法は、等温性である。一般にＰＣＲと呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号）は、変性、逆ストランドへのプライマーペアのアニーリング、およびプライマー伸長の、多数のサイクルを用いて、ターゲット配列のコピー数を指数関数的に増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変形では、リバース・トランスクリプターゼ（ＲＴ）を使用して、ｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作り、その後、ＰＣＲによってそのｃＤＮＡを増幅して多数のＤＮＡコピーを生産する。一般のＬＣＲと呼ばれるリガーゼ連鎖反応（Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４；１２９２）は、ターゲット核酸の近接領域にハイブリダイズする２セットの相補ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する。熱変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルでＤＮＡリガーゼによりそれらのＤＮＡオリゴヌクレオチドを共有結合でつないで、検出可能な二本鎖のライゲートされたオリゴヌクレオチド産物を生産する。もう１つの方法は、一般にＳＤＡと呼ばれる鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．ら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６；米国特許第５，２７０，１８４号および同第５，４５５，１６６号）であり、これは、ターゲット配列の逆ストランドへのプライマー配列ペアのアニーリング；デュプレックス半チオリン酸化プライマー伸長産物を生産するためのｄＮＴＰαＳの存在下でのプライマー伸長；半変性制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介ニッキング；そして既存の鎖を置換し、次のプライマーアニーリング、ニッキングおよび鎖置換ラウンド用の鎖を生産するための前記ニックの３’端からのポリメラーゼ媒介プライマー伸長というサイクルを用い、結果として産物の幾何学的増幅を生じさせる。好熱性（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ）ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、本質的に同じ方法において、より高温で、好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用する（欧州特許第０ ６８４ ３１５号）。他の増幅方法としては、一般にＮＡＳＢＡと呼ばれる、核酸配列ベース増幅（米国特許第５，１３０，２３８号）；一般にＱ−βレプリカーゼと呼ばれる、ＲＮＡレプリカーゼを使用してプローブ分子それ自体を増幅するもの（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．ら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６：１１９７−１２０２）；転写ベース増幅法（Ｋｗｏｈ，Ｄ．ら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）；自己持続型（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．ら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）；および、一般にＴＭＡと呼ばれる、転写媒介増幅（米国特許第５，４８０，７８４号および同第５，３９８，４９１号）が挙げられる。公知増幅方法のさらなる論考については、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら編集）、５１−８７頁（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）におけるＰｅｒｓｉｎｇ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．，１９９３，「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」を参照のこと。
好ましい実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、転写ベース増幅技術によって検出される。１つの好ましい転写ベース増幅系は、ＲＮＡポリメラーゼを利用してターゲット領域の多数のＲＮＡ転写産物を生産する、転写媒介増幅（ＴＭＡ）である。例示的ＴＭＡ増幅法は、米国特許第５，４８０，７８４号、同第５，３９９，４９１号、同第７，３７４，８８５号、およびそれらに引用されている参考文献に記載されており、それらの内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＴＭＡは、リバース・トランスクリプターゼおよびＲＮＡポリメラーゼの存在下でターゲット核酸にハイブリダイズして二本鎖プロモーターを形成する「プロモーター−プライマー」を使用し、ＲＮＡポリメラーゼは、該二本鎖プロモーターからＲＮＡ転写産物を生産する。これらの転写産物は、ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズすることができる第二のプライマーの存在下でのＴＭＡのさらなるラウンドのためのテンプレートとなることができる。熱変性を必要とするＰＣＲ、ＬＣＲまたは他の方法とは異なり、ＴＭＡは、ＲＮアーゼＨ活性を使用してＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化し、それによって、プライマーまたはプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションに利用できるＤＮＡ鎖を作る、等温法である。一般に、増幅のために供給されるリバース・トランスクリプターゼに随伴するＲＮアーゼＨ活性を用いる。
ＴＭＡ法の１つの変型において、１つの増幅プライマーは、増幅すべき配列に対して位置３’でターゲットＲＮＡの結合部位にハイブリダイズすることができる、ターゲット結合配列の５’に位置する、二本鎖のときに機能性になる１つのプロモーター配列を含む、オリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーである。プロモーター−プライマーは、それがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識に特有のものであるとき、「Ｔ７−プライマー」と呼ぶことができる。一定の状況下では、プロモーター−プライマー、またはそのようなプロモーター−プライマーの亜集団、の３’端を修飾して、プロモーター−プライマー伸長をブロックするまたは減少させることがある。未修飾プロモーター−プライマーからリバース・トランスクリプターゼがターゲットＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作り出し、その一方でＲＮアーゼＨ活性がターゲットＲＮＡを分解する。すると、第二の増幅プライマーがそのｃＤＮＡコピーに結合する。このプライマーは、「Ｔ７−プライマー」と区別するために、「非Ｔ７プライマー」と呼ばれることがある。この第二の増幅プライマーからリバース・トランスクリプターゼが別のＤＮＡ鎖を作り出し、その結果、一端に機能性プロモーターを有する二本鎖ＤＮＡが生じる。二本鎖のとき、プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、そのプロモーター−プライマーがハイブリダイズするターゲット配列の転写を開始させることができる。ＲＮＡポリメラーゼは、このプロモーター配列を使用して、多数のＲＮＡ転写産物（すなわち、アンプリコン）、一般に約１００から１，０００コピー、を生産する。それぞれの新たに合成されたアンプリコンは、第二の増幅プライマーとアニールすることができる。すると、リバース・トランスクリプターゼはＤＮＡコピーを作り出すことができ、その一方でＲＮアーゼＨ活性は、このＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡを分解する。すると、プロモーター−プライマーは、新たに合成されたＤＮＡに結合して、リバース・トランスクリプターゼに二本鎖ＤＮＡを作り出させることができ、その二本鎖ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼが多数のアンプリコンを生産する。このようにして、２つの増幅プライマーを使用して１０億倍等温増幅を実現することができる。
ＴＭＡのもう１つの変型は、１つのプライマーおよび１つ以上の追加の増幅オリゴマーを使用して、核酸をインビトロで増幅し、それによって、サンプル中のターゲット配列の存在を示す転写産物（アンプリコン）を作る（Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第７，３７４，８８５号に記載されており、その詳細は本明細書における参照により本明細書に組み込まれている）。簡単に言うと、この単一プライマーＴＭＡ法は、プライマー（または「プライミングオリゴマー」）と、（例えば、３’ブロッキング部分を含めることにより）その３’端からのＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾されている修飾プロモーターオリゴマー（または「プロモーター−プロバイダー」）と、場合により、ターゲット鎖からのｃＤＮＡの延長を終結させるための結合分子（例えば、３’がブロックされたエキステンダーオリゴマー）とを使用する。本明細書において言及する場合、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供する、ブロックされたプロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドである。この方法は、ターゲット配列の多数のコピーを合成するものであり、ターゲット配列を含有するターゲットＲＮＡをプライミングオリゴマーおよび結合分子で処理する工程を含み、この工程で、該プライマーはターゲット鎖の３’端にハイブリダイズする。ＲＴが前記プライマーの３’端からのプライマー伸長を開始させて、前記ターゲット鎖とのデュプレックス（例えば、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ）の状態であるｃＤＮＡを生産する。結合分子、例えば３’がブロックされたエキステンダーオリゴマー、を前記反応において使用すると、それは、ターゲット配列の５’端付近の近接するターゲット核酸に結合する。すなわち、前記結合分子は、増幅すべきターゲット配列の５’端に隣接するターゲット鎖に結合する。前記プライマーをＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長してｃＤＮＡを生産するとき、該ｃＤＮＡの３’末端は、前記結合分子の位置によって決まる。プライマー伸長産物が、ターゲット鎖に結合した結合分子に達すると重合は停止するからである。従って、前記ｃＤＮＡの３’端は、前記ターゲット配列の５’端に相補的である。ＲＮＡ：ｃＤＮＡデュプレックスは、ＲＮアーゼ（例えば、ＲＴのＲＮアーゼＨ）がＲＮＡ鎖を分解すると分離されるが、当業者にはいずれの鎖分離形態を用いてもよいことは理解されるであろう。次に、前記プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、ｃＤＮＡ鎖の３’端付近のｃＤＮＡにハイブリダイズする。前記プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、ＲＮＡポリメラーゼについての５’プロモーター配列と、ｃＤＮＡの３’領域内の配列に相補的な３’領域とを含む。前記プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、該プロモーター−プロバイダーオリゴマーの３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防止するブロッキング部分を含む修飾３’端も有する。プロモーター−プロバイダー：ｃＤＮＡデュプレックスの場合、プロモーターオリゴマーをテンプレートとして使用してＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性により該ｃＤＮＡの３’端を伸長して、該ｃＤＮＡにプロモーター配列を付加させ、機能性二本鎖プロモーターを作り出す。そのとき、そのプロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼが、前記機能性プロモーターに結合し、前記ｃＤＮＡに相補的な、および最初のターゲット鎖から増幅されたターゲット領域配列と実質的に同一の、多数のＲＮＡ転写産物を転写する。その後、その結果として生じた増幅ＲＮＡは、プライマーを結合することおよびさらなるｃＤＮＡ生産のためのテンプレートとしての機能を果たすことにより、再びそのプロセスを循環することができ、結局、サンプル中に存在する最初のターゲット核酸から多数のアンプリコンを生産することができる。単一プライマー転写関連増幅法の一部の実施形態は、結合分子を含まず、従って、プライマーから作られるｃＤＮＡ産物は、未定３’端を有するが、増幅工程は、すべての他の工程について、実質的に上で説明したとおりに進行する。
本開示にかんがみて、当業者は、適する増幅条件を容易に決定することができる。本明細書に開示するような「増幅条件」は、核酸増幅を可能にする条件を指す。増幅条件は、一部の実施形態において、本明細書に記載するような「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」よりストリンジェントでないことがある。本明細書において開示するような増幅反応において使用するオリゴヌクレオチドは、増幅条件下でそれらの所期のターゲットに特異的であり得、ハイブリダイズすることができるが、一定の実施形態において、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ではハイブリダイズできることもあり、またはできないこともある。一方、検出プローブは、一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。下の実施例セクションは、ターゲット核酸配列を増幅するために好ましい増幅条件を提供するが、通常の当業者は、核酸増幅を行うための他の許容される条件を、用いる特定の増幅法に依存して容易に突き止めることができよう。
一定の実施形態において、本明細書に開示するような増幅方法は、好ましくは、増幅反応の感度、選択性、効率などの向上に有効である１つ以上の他のタイプのオリゴヌクレオチドの使用も用いる。これらとしては、例えば、終結オリゴヌクレオチド、エキステンダー、および／またはヘルパーオリゴヌクレオチド、ならびにこれらに類するものを挙げることができる。
ターゲット捕捉
一定の実施形態では、増幅前に、例えばターゲット捕捉アプローチを用いて、サンプルからターゲット核酸を精製または濃縮することが好ましいことがある。「ターゲット捕捉」（ＴＣ）は、磁着可能粒子などの固体支持体上にターゲットポリヌクレオチドを捕捉することを一般には指し、この場合、前記固体支持体が、前記ターゲットポリヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチド精製手順の１つ以上の洗浄工程中、保持する。このようにして、ターゲットポリヌクレオチドを、後続の核酸増幅工程に先立ち、実質的に精製する。非常に多数のターゲット捕捉法が公知であり、本明細書に記載する方法との併用に適する。
様々な材料、例えばナイロン、ニトロセルロース、ガラス、ポリアクリラート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレンまたは金属、のいずれで製造されていてもよい、任意の支持体、例えば、マトリックス、または溶液中で遊離した状態の粒子を使用することができる。例証となる例は、磁着可能粒子である支持体、例えば、固定されたプローブが直接（例えば、共有結合性リンケージ、キレート化、もしくはイオン相互作用により）または間接的に（例えば、リンカーにより）連結されており、その連結が核酸ハイブリダイゼーション条件の間、安定している、単分散常磁性粒子（均一サイズ＋−．５％）、を使用する。
例えば、米国特許出願公開第２００６００６８４１７号に記載されているような、１つの例証となるアプローチは、ターゲット相補領域と、捕捉支持体上に固定されたプローブにターゲット核酸を取り付ける、そのようにして捕捉ハイブリッドを形成する、特定の結合ペアのメンバーとを含有する、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴヌクレオチドを使用するものであり、前記捕捉ハイブリッドは、ターゲット核酸が該捕捉支持体から放出される前に他のサンプル成分から分離される。
もう１つの例証となる方法に関して、Ｗｅｉｂｕｒｇらは、捕捉プローブと、好ましくは温度のみが異なる２つの異なるハイブリダイゼーション条件とを用いることによる、プローブが取り付けられ固定された固体支持体、例えば磁着可能粒子、にサンプル中のターゲットポリヌクレオチドを捕捉するための方法を米国特許第６，１１０，６７８号に記載している。前記２つのハイブリダイゼーション条件によってハイブリダイゼーションの順序が制御され、この場合、第一のハイブリダイゼーション条件は、ターゲットポリヌクレオチドへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、第二のハイブリダイゼーション条件は、固定されたプローブへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にする。この方法を用いて、捕捉されたターゲットポリヌクレオチドまたは増幅されたターゲットポリヌクレオチドを検出することにより、サンプル中のターゲットポリヌクレオチドの存在を検出することができる。
もう１つの例証となるターゲット捕捉技術（米国特許第４，４８６，５３９号）は、ターゲットポリヌクレオチドを捕捉するためのおよびターゲットポリヌクレオチドの存在を検出するためのハイブリダイゼーションサンドイッチ技術を含む。この技術は、固体支持体に結合したプローブによるターゲットポリヌクレオチドの捕捉、および捕捉されたターゲットポリヌクレオチドへの検出プローブのハイブリダイゼーションを含む。ターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズしていない検出プローブは、固体支持体から容易に洗い落される。従って、残存する標識は、サンプル中に最初に存在するターゲットポリヌクレオチドに関係づけられる。
もう１つの例証となるターゲット捕捉技術（米国特許第４，７５１，１７７号）は、ターゲットポリヌクレオチドにも、固体支持体上に固定されたポリヌクレオチドにもハイブリダイズするメディエイターポリヌクレオチドを使用する方法である。このメディエイターポリヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドを固体支持体に連結させて、結合したターゲットを生じさせる。その結合したターゲットに標識プローブをハイブリダイズさせることができ、未結合の標識プローブは、固体支持体から洗い落すことができる。
さらにもう１つの例証となるターゲット捕捉技術は、ターゲットポリヌクレオチドの検出方法を記載している米国特許第４，８９４，３２４号および同第５，２８８，６０９号に記載されている。この方法は、ターゲットの同じまたは反対の鎖に相補的な２つの一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを利用するものであり、結果として、ターゲットポリヌクレオチドとのダブルハイブリッドが形成される。１つの実施形態において、前記ハイブリッドは、支持体上に捕捉される。
もう１つの例証となるターゲット捕捉技術、欧州特許公開第０ ３７０ ６９４号における核酸を検出するための方法およびキットは、特定の結合パートナーで標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマーおよびプライマー伸長産物を固定させる。この標識は、固体支持体に結合しているその受容体と特異的に複合体化する。
上記捕捉技術は、単に例証となるものであり、限定的なものではない。実際、当業者が利用できる本質的にいずれの技術も、それが、関心のあるターゲット核酸配列の増幅前の精製に有効であるならば、用いることができる。
核酸検出
特定の核酸ハイブリダイゼーションをモニターするために用いることができる本質的にいずれの標識および／または検出系も、Ｌｉｓｔｅｒｉａアンプリコンを検出するために併用することができる。多くのそのような系が公知であり、当業者に利用可能である。それらの例証となる例を下で簡単に論じる。
検出系は、関心のあるターゲット核酸の検出を助長するために１つのタイプまたは別のタイプの検出オリゴヌクレオチドを概して利用する。検出は、直接的（すなわち、ターゲットに直接ハイブリダイズしたプローブ）である場合もあり、または間接的（すなわち、プローブをターゲットにつなぐ中間構造にハイブリダイズしたプローブ）である場合もある。プローブのターゲット配列は、該プローブが特異的にハイブリダイズする、より大きな配列内の特定の配列を一般には指す。検出プローブは、ターゲット配列が存在するかどうかに依存して、ターゲット特異的配列、およびプローブの三次元構造に寄与する他の配列または構造を含むことがある（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８３５，５４２号、および同第６，８４９，４１２号）。
検出を助長するために、多数の周知標識系のいずれを使用してもよい。直接連結は、共有結合または非共有結合性相互作用（例えば、水素結合、疎水性もしくはイオン相互作用、およびキレートもしくは配位複合体形成）を用いことがあり、これに対して間接的連結は、架橋部分またはリンカーを用いる（例えば、検出可能シグナルを増幅する、抗体もしくは追加のオリゴヌクレオチド（単数もしくは複数）による）ことがある。任意の検出可能部分、例えば、放射性核種、リガンド、例えばビオチンまたはアビジン、酵素、酵素基質、反応性基、検出可能な色を付与する発色団、例えば色素または粒子（例えば、ラテックスもしくは金属ビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光または化学発光化合物）、および蛍光化合物を使用することができる。好ましい実施形態は、混合物中の結合した標識プローブが、未結合の標識プローブと比較して検出可能な変化を示し、それにより、ハイブリダイズしていない標識プローブからハイブリダイズした標識プローブを物理的に回収することなく標識を検出することができる、均一系において検出可能である「均一検出可能標識」を含む（例えば、米国特許第６，００４，７４５号、同第５，６５６，２０７号および同第５，６５８，７３７号）。好ましい均一検出可能標識としては、化学発光化合物、さらに好ましくはアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、周知である（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，９４８，８９９号）標準的なＡＥまたはＡＥ誘導体が挙げられる。標識を合成する方法、標識を核酸に取り付る方法、および標識からシグナルを検出する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）ａｔ Ｃｈａｐｔｅｒ．１０、ならびに米国特許第６，４１４，１５２号、同第５，１８５，４３９号、同第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，６３９，６０４号、同第４，５８１，３３３号、および同第５，７３１，１４８号）。ＡＥ化合物を核酸につなぐ好ましい方法は、公知である（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および米国特許第５，６３９，６０４号、第１０カラム、６行目から第１１カラム、３行目、および実施例８参照）。好ましいＡＥ標識位置は、プローブの中央領域およびＡ／Ｔ塩基対の、プローブの３’もしくは５’末端の、領域付近、または所望のターゲット配列と比較してプローブが検出しないだろう公知配列とのミスマッチ部位もしくはその付近である。
好ましい実施形態において、ハイブリダイズしていないプローブを検出前に最初に除去する必要なく試験サンプル中のプローブ：ターゲットデュプレックスの検出を助長するために、少なくともある程度の自己相補性を示すオリゴヌクレオチドが望ましい。例として、変性条件に暴露されると、分子トーチの２つの相補領域（これらは、完全に相補的であることもあり、または部分的に相補的であることもある）は融解し、その所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件が回復されると、ターゲット配列へのハイブリダイゼーションに利用できるターゲット結合ドメインを放出させる。分子トーチは、ターゲット結合ドメインが、ターゲット閉鎖ドメインよりターゲット配列へのハイブリダイゼーションに有利であるように設計される。分子トーチのターゲット結合ドメインおよびターゲット閉鎖ドメインは、該分子トーチがターゲット核酸にハイブリダイズするときとは対照的に該分子トーチが自己ハイブリダイズするときに異なるシグナルが生成されるように位置する相互作用性標識（例えば、蛍光／クエンチャーペア）を含み、それによって、可視標識を随伴するハイブリダイズしていないプローブの存在下で試験サンプル中のプローブ：ターゲットデュプレックスを検出することができる。分子トーチは、米国特許第６，３６１，９４５号に詳しく記載されており、その開示は本明細書における参照により本明細書に組み込まれている。
使用することができる自己相補性ハイブリダイゼーションアッセイプローブのもう１つの例は、「分子ビーコン」と一般に呼ばれる構造である。分子ビーコンは、ターゲット相補的配列と、ターゲット核酸配列不在下、閉構造でプローブを保持する親和性ペア（または核酸アーム）と、プローブが閉構造であるときに相互作用する標識ペアとを有する核酸分子を含む。ターゲット核酸への分子ビーコンターゲット相補配列のハイブリダイゼーションは、親和性ペアのメンバーを分離し、それによってプローブを開構造にシフトさせる。この開構造へのシフトは、標識ペアの相互作用減少のため検出可能であり、該標識ペアは、例えば、蛍光体およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であり得る。分子ビーコンは、米国特許第５，９２５，５１７号に詳しく記載されており、その開示は本明細書における参照により本明細書に組み込まれている。特定の核酸配列の検出に有用な分子ビーコンは、本明細書において開示するプローブ配列の１つのいずれかの端に、蛍光体を含む第一の核酸アームと、クエンチャー部分を含む第二の核酸アームとを追加することによって、作り出すことができる。この構造でのＬｉｓｔｅｒｉａ特異的プローブ配列は、結果として生ずる分子ビーコンのターゲット相補的「ループ」部分として役立つだろう。
分子ビーコンは、好ましくは、相互作用性の検出可能標識ペアで標識される。好ましい検出可能標識は、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴエネルギー移動メカニズムによって互いに相互作用する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、原子間距離よりかなり長い距離にわたっての、熱エネルギーへの変換を伴わない、および運動衝突状態になるドナーとアクセプターを伴わない、発色団間の共鳴相互作用による吸収部位から分子または分子系内のその利用部位へのエネルギー量子の無放射伝達を含む。「ドナー」は、エネルギーを最初に吸収する部分であり、「アクセプター」は、その後、そのエネルギーが移動される部分である。ＦＲＥＴに加えて、ドナーからアクセプター分子に励起エネルギーを移動することができる、少なくとも３つの他の「非ＦＲＥＴ」エネルギー移動プロセスがある。
ＦＲＥＴメカニズムによるにせよ、非ＦＲＥＴメカニズムによるにせよ、一方の標識によって放出されたエネルギーを第二の標識によって受け取るまたは吸収することができるように十分近くに２つの標識が保持されているとき、それら２つの標識は、「エネルギー移動関係」にあると言われる。これは、例えば、分子ビーコンが、幹デュプレックスの形成により閉状態で維持され、該分子ビーコンの一方のアームに取り付けられた蛍光体から放出された蛍光が、他方のアーム上のクエンチャー部分によって消光される場合である。
分子ビーコンのための例証となる標識部分は、蛍光体と蛍光消光特性を有する第二の部分（すなわち、「クエンチャー」）とを含む。この実施形態において、特性シグナルは、特定の波長の蛍光である可能性が高いが、代替的に、可視光シグナルである場合もあるだろう。蛍光が関与するとき、放出の変化は、好ましくは、ＦＲＥＴに、または放射性エネルギー移動もしくは非ＦＲＥＴモードによる。閉状態での不活性標識ペアを有する分子ビーコンが適切な周波数の光によって刺激されると、蛍光シグナルが第一のレベルで生成され、この第一のレベルは、非常に低いだろう。この同じ分子ビーコンが開状態にあり、適切な周波数の光によって刺激されると、蛍光体およびクエンチャー部分は、互いに十分に離隔されるので、それらの間でのエネルギー移動が実質的に妨げられる。その条件下では、クエンチャー部分は、蛍光部分からの蛍光を消光できない。蛍光体が、適切な波長の光エネルギーによって刺激されると、第一のレベルより高い第二のレベルの蛍光シグナルが生成されるだろう。これら２つの蛍光レベル間の差は、検出可能であり、測定可能である。この要領で蛍光体およびクエンチャー部分を使用すると、分子ビーコンは、「開」状態でのみ「オン」であり、ならびに容易に検出可能なシグナルを発することによりプローブがターゲットに結合されていることを示す。このプローブの構造状態が、標識部分間の相互作用を調節することによって、そのプローブから生成されるシグナルを変える。
ＦＲＥＴと非ＦＲＥＴペアを区別しようとせずに使用することができるドナー／アクセプター標識ペアの例としては、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エシスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられる。ドナー色素とアクセプター色素が異なるとき、アクセプターの増感蛍光の出現によりまたはドナー蛍光の消光によりエネルギー移動を検出できることは、通常の当業者には理解されるであろう。ドナー化学種とアクセプター化学種が同じであるときには、結果として生ずる蛍光脱分極によってエネルギーを検出することができる。非蛍光アクセプター、例えばＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＹ７色素は、有利なことに、直接（すなわち、非増感）アクセプター励起に起因するバックグラウンド蛍光の潜在的問題をなくす。ドナー−アクセプターペアの一方のメンバーとして使用することができる好ましい蛍光体部分としては、フルオレセイン、ＲＯＸ、およびＣＹ色素（例えばＣＹ５）が挙げられる。ドナー−アクセプターペアのもう一方のメンバーとして使用することができる非常に好ましいクエンチャー部分としては、ＤＡＢＣＹＬおよびＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ部分が挙げられ、これらは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、Ｎｏｖａｔｏ）から入手できる。
合成技術ならびに核酸に標識を取り付けるおよび標識を検出する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、Ｃｈａｐｔｅｒ １０；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，１８５，４３９号および同第６，００４，７４５号；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号；ならびにＢｅｃｋｅｒら、米国特許第５，７３１，１４８号参照）。
好ましいＬｉｓｔｅｒｉａオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドのセット
本明細書に記載するように、本明細書において開示するようなＬｉｓｔｅｒｉａ核酸の増幅および検出に好ましい部位は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ １６Ｓ ｒＲＮＡの４５０領域内にあることが判明した。さらに、この領域内で特に好ましいオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドのセットを、改善された感度、選択性および特異性でＬｉｓｔｅｒｉａ １６Ｓを増幅するために同定した。本明細書において開示するオリゴヌクレオチドが、高い特異性でＬｉｓｔｅｒｉａターゲット配列にハイブリダイズできること、その結果として、サンプル中の１つ以上のＬｉｓｔｅｒｉａ種の存在および／またはレベルを検出するためにならびにそれを他の近縁種の存在と区別するために用いることができる核酸増幅反応に関与できることは、理解されるであろう。
例えば、１つの実施形態において、前記増幅オリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドを含み、前記第一および第二のオリゴヌクレオチドは、高い特異度でＬｉｓｔｅｒｉａ １６Ｓ ｒＲＮＡの４５０領域をターゲットにする。
本明細書において開示する増幅オリゴヌクレオチドは、転写ベース増幅反応、好ましくはリアルタイム転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応、でのＬｉｓｔｅｒｉａのターゲット核酸配列の増幅に特に有効である。
増幅反応に使用される特定のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドに加えて、一般に、追加のオリゴヌクレオチドも該増幅反応と併用されるだろうことは理解されるであろう。例えば、一定の実施形態において、前記増幅反応は、検出オリゴヌクレオチド（例えば、トーチオリゴヌクレオチドまたはアクリジニウムエステルプローブ）およびブロッカーオリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の使用も用いるであろう。
表１は、本発明により４５０領域について同定されたＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチドおよび他の補助的オリゴヌクレオチド（例えば、ブロッカー、トーチ、ターゲット捕捉、ＡＥプローブ、およびヘルパーオリゴヌクレオチド）の具体的な例を提示するものである。
加えて、表２は、本明細書において開示するような組成物、キットおよび方法において使用するための２つの特に好ましいオリゴヌクレオチドのセットを同定するものである。
優れたアッセイ性能をもたらす、４５０領域に由来する特に好ましい増幅オリゴヌクレオチドを同定したが、４５０領域に由来する他のオリゴヌクレオチドであって、本明細書に具体的に記載するものからの実質的でない修飾を有する他のオリゴヌクレオチドも、同じまたは同様の性能目標が達成されるのであれば、用いることができることは、理解されるであろう。例えば、４５０領域に由来するオリゴヌクレオチドであって、本明細書に開示する増幅反応において有用なオリゴヌクレオチドは、増幅および／または検出手順に実質的な影響を及ぼさないことを条件に、本明細書において同定するものと異なる長さを有することができる。前記好ましいオリゴヌクレオチドへのこれらおよび他の常例的および非実質的修飾は、従来の技術を用いて行うことができ、ならびにそのような修飾が本明細書において提供する１つ以上の利点を維持するのであればそれらは本発明の精神および範囲内とみなされる。
本明細書において開示する一般原理は、以下の非限定的実施例への参照により、より十分に理解することができる。
一定の態様および実施形態を例証する実施例を下に提供する。下の実施例は、実際に行った実験の詳細を正確に表すと考えられるが、実際に行った作業と下に示す実験の詳細の間に、これらの実験の結論またはそれらを実行する当業者の能力に影響を及ぼさない何らかの小さな食い違いが存在する可能性がある。これらの実施例が、本明細書に記載する特定の実施形態に本発明を限定するためのものでないことは、当業者には理解されるであろう。加えて、当業者は、本明細書に記載する技術、材料および方法を用いて、これらのおよび関連した方法を行うための代替増幅系であって、尚、本発明の精神および範囲内のものである系を容易に考案および最適化できるだろう。
別の指示がない限り、以下の実施例におけるオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成したものであり、これについての様々な方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、１５４ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２８７（１９８７）参照（この内容は、本明細書における参照により本明細書に組み込まれている）。本明細書において別様に述べていない限り、修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであり、それらをそれらのホスホラミダイト類似体として合成に使用した。単一プライマー増幅（本明細書における参照により本明細書に組み込まれている、Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第７，３７４，８８５号）において用いた、ブロックされたオリゴヌクレオチドについて、その３’末端ブロッキング部分は、３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２０−０１０２−０１）を使用して調製した「逆Ｃ］３’対３’リンケージからなった。分子トーチ（本明細書における参照により本明細書に組み込まれている、Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第６，８４９，４１２号参照）は、標準的な方法によってオリゴヌクレオチドに取り付けたＣ９非ヌクレオチド（トリエチレングリコール）リンカー連結領域（Ｓｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ９、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０−１９０９−ｘｘ）、５’−フルオレセイン（「Ｆ」）蛍光体および３’−ダブシル（「Ｄ」）クエンチャー部分を用いて調製した。
下の実施例において述べるように、多種多様な増幅試薬および条件の分析により、Ｌｉｓｔｅｒｉａの検出のための非常に高感度で選択的な増幅プロセスの開発に至った。
実施例１
例証となるアッセイ試薬、装置および材料の説明
以下の実施例は、本明細書に記載するリアルタイムＴＭＡ装置において使用した代表的なアッセイ試薬、プロトコル、条件およびこれらに類するものを説明するものである。そうでないと明記していない限り、試薬調製、装置準備およびアッセイプロトコルは、本質的に、下に示すとおりに行った。
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ＡＴＣＣ ３５１５２、をすべてのランにおいて陽性対照として使用した。前もって増幅試薬を作った。
Ａ．試薬およびサンプル
１．増幅試薬。「増幅試薬」または「Ａｍｐ試薬」は、次の成分の近似濃度を含んだ：ｐＨ７．７の、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中の、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、１０ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１２．７ｍＭ ＵＴＰ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および３３ｍＭ ＫＣｌ。プライマーおよび他のオリゴヌクレオチドを前記Ａｍｐ試薬に添加した。
２．酵素試薬。「酵素試薬」は、次の成分の近似濃度を含んだ：ｐＨ７．０の、１２０ｍＭ ＫＣｌ、１０％ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１６０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、１１８０ＲＴＵ／μＬ モロニー・マウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）リバース・トランスクリプターゼ（「ＲＴ」）および２６０ＰＵ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（この場合、１ＲＴＵのＲＴ活性は、３７℃で２０分間に１ｎｍｏｌのｄＴを基質に組み込み、および１ＰＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ活性は、３７℃で２０分間に５ｆｍｏｌのＲＮＡ転写産物を生産する）。
３．洗浄溶液。「洗浄溶液」は、ｐＨ７．５の、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中の、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ。
４．ターゲット捕捉試薬。「ターゲット捕捉試薬」（ＴＣＲ）は、次の成分の近似濃度を含んだ：ｐＨ６．５の、６０ｐｍｏｌ／ｍＬ［ｄＴ３ｄＡ３０テールを有する１つ以上の捕捉プローブおよび自由選択の捕捉ヘルパープローブの各々］、２５０から３００ｕｇ／ｍＬ 常磁性オリゴ−（ｄＴ）１４微粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）、２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＥＤＴＡおよび１．８８Ｍ ＬｉＣｌ。
５．溶解試薬。「溶解緩衝液」は、ｐＨ６．５の、１００ｍＭ ｔｒｉｓ、２．５ｍＭコハク酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５００ｍＭ ＬｉＣｌを含有する緩衝液中の、１％ラウリル硫酸リチウムを含んだ。
６．ターゲットｒＲＮＡサンプル。ｒＲＮＡサンプルは、本明細書に記載する実験において使用する前、水、０．１％ ＬｉＬＳまたは溶解試薬中で保管した。
Ｂ．装置および材料
●ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）９６ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（「ＫＦ９６」）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。
●ＤＷマグネット用のＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）９６チップコーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号９７００２５３４）。
●ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）９６ ＫＦプレート（２００マイクロリットル）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号９７００２５４０）。
●Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｓｋｉｒｔｅｄ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ、着色シェル／白色ウエル（「ＭＪプレート」）（カタログ番号：ＨＳＰ−９６１５、ＨＳＰ−９６２５、ＨＳＰ−９６３５、カリフォルニア州、ＨｅｒｃｕｌｅｓのＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
●ＤＷ ９６プレート、Ｖ底、ポリプロピレン、滅菌２５ピース／ケース（Ａｘｙｇｅｎカタログ番号Ｐ−２ＭＬ−ＳＱ−Ｃ−Ｓ；ＶＷＲカタログ番号４７７４９−８７４；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号９５０４０４６０）。
●カタログ番号０２２６７０５６５ ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋを有するエッペンドルフＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（登録商標）Ｒ Ｄｒｙ Ｂｌｏｃｋ Ｈｅａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｏｌｉｎｇ Ｓｈａｋｅｒ（ニューヨーク州、ＷｅｓｔｂｕｒｙのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
●ＦＬＵＯｓｔａｒ蛍光マイクロプレートリーダー（ノースカロライナ州、ＣａｒｙのＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）。
●ＰＴＩ（登録商標）ＦｌｕｏＤｉａ（登録商標）Ｔ７０マイクロプレートフルオロメーター（ニュージャージー州、ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＰｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）。
実施例２
Ｌｉｓｔｅｒｉａオリゴヌクレオチドのセットの設計および評価
大腸菌ｒＲＮＡ配列の４５０領域（図２）に対応する領域を用いて、幾つかのＴ７プロバイダー、ブロッカー、プライマーおよびトーチを設計した。
Ａ．スクリーニング
分析物および内部対照の同時増幅および検出のために、リアルタイムＴＭＡ増幅反応を本質的に次のように行った。再構成した無オリゴ増幅試薬（Ａｍｐ試薬）中のＴ７プロバイダー（．５ｐｍｏｌ／μＬ）、プライマー（．５ｐｍｏｌ／μＬ）およびブロッカー（．０５ｐｍｏｌ／μＬ）を含有する「マスタープレート」を作った。それぞれのマスタープレートウエルは、オリゴの異なる組み合わせ２００μＬを含有した。試験のために、それぞれのマスタープレートウエル混合物１０μＬを、増幅用ＭＪプレートに配置した。無オリゴ増幅試薬中のターゲット核酸２０μＬをそのプレートに添加した。ターゲットを伴わない増幅試薬を陰性対照として使用した。増幅プレートにカバーをかぶせ、６０℃のＴＨＥＲＭＯＭＩＸＥＲ装置に１０分間載せて、プライマーをアニールした。それらのプレートをそのＴＨＥＲＭＯＭＩＸＥＲ装置上で４２℃に冷却し、さらに１５分間、インキュベートした。その後、プレートのカバーをはずし、約１ｐｍｏｌ／μＬの濃度の検出プローブを含有する酵素試薬１０μＬをそれぞれの増幅反応ウエルに添加した。それらのプレートにカバーをかぶせ、ＴＨＥＲＭＯＭＩＸＥＲ装置で１分間、１４００ｒｐｍで混合した。直ちにそれらのプレートをＢＭＧマイクロプレートフルオロメーター内に配置し、アッセイを実行した。７２秒ごとに合計６３回の読み取りを行った。それぞれの間隔に２色を読み取った。リアルタイムＴＭＡアッセイ曲線の例を図１に示す。アッセイ曲線プロットおよびＴＴｉｍｅ分析を用いてデータを分析した。
Ｂ．最良の組み合わせ
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでのスクリーニングからの最良の組み合わせを表３に示す。蛍光発生時間および最大蛍光シグナルに基づいてそれらを選択した。その後、それらのオリゴヌクレオチドのセットを、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ、およびＬ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉで感度について試験した。それらのオリゴヌクレオチドのセットを、Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅに対する特異性についても試験した。それぞれのターゲットを、０または１Ｅ５コピー／アッセイのターゲットレベルで試験した。
さらなる評価にセット＃３を選択した。セット＃６を、これはプライマー成分の選択のみが異なるので、バックアップとして選択した。このバックアップセットは、最近接のいずれとも交差反応を有さず、Ｌ．ｇｒａｙｉおよびＬ．ｍｕｒｒａｙｉ種に対しても機能しなかった。他のセットは、すべてのＬｉｓｔｅｒｉａ種に対する不良な性能、またはＥ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅもしくはＢ．ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａのいずれかにおいて観察された交差反応、いずれかに基づいて除外した。
実施例３
ターゲット捕捉組み込みの評価
大腸菌ｒＲＮＡの約２３０から３５５および約４９０から約２５２ｂｐに対応する領域内のターゲットｒＲＮＡを捕捉するように、Ｌｉｓｔｅｒｉａ １６Ｓ ｒＲＮＡについてのターゲット捕捉オリゴ（ＴＣＯ）を設計した。８つのオリゴ（表１参照）を設計し、合成し、試験した。これらのＴＣＯに特異性は組み込まれず、従って、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＬ．ｇｒａｙｉ ＲＮＡのみを使用してそれらをスクリーニングした。ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ ９６プロセッサー（「ＫＦ９６」）を大きなマグネットと共に使用した。Ａｘｙｇｅｎディープウエル（ＤＷ９６）プレートを使用し、１ｍＬサンプル容積を用いて、ターゲット捕捉を行った。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ捕捉の分析は、ＴＣＯ ２、３、６および７が、ＴＣＯ １、４、５および８よりわずかに良好であることを示した。さらなる評価は、ＴＣＯ ２、３、６および７すべてが許容可能に十分に作用することを明示した。従って、食品研究のためにＴＣＯ ２をスケールアップすることを決めた。
ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ ９６プロセッサーでのターゲット捕捉の方法を表４に要約する。簡単に言うと、サンプルを溶解試薬と混合して、ターゲットを放出させ、ｒＲＮＡを安定させた。ターゲット捕捉試薬を添加した。ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ ９６精製システムを用いて、リボソームＲＮＡターゲットを捕捉し、磁性粒子で精製した。分析物については６−カルボキシフルオレセイン（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｏｓｅｉｎ）（「ＦＡＭ」）標識トーチを含有する増幅試薬、および内部対照については６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（「ＴＡＭＲＡ」）標識トーチを含有する増幅試薬に、粒子を再懸濁させた。後続の増幅のために核酸サンプルを精製および調製するための典型的なターゲット捕捉手順を、本質的に、下で説明するように行った。１００μＬの試験サンプルと、５０μＬのターゲット捕捉オリゴヌクレオチド含有ＴＣＲと、１ｍＬの溶解試薬とを併せ、６０℃で１５分間インキュベートした。洗浄溶液ならびに適する磁性粒子洗浄および分離装置（例えば、磁性分離ラック、ＧＥＮ−ＰＲＯＢＥ Ｔａｒｇｅｔ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．５２０７）またはＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ磁性粒子プロセッサーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）を使用して、その処理した反応混合物からＴＣＲ磁性粒子を捕捉し、洗浄した。洗浄後、それらの磁性粒子を１００μＬの増幅試薬に再び懸濁させた。
具体的には、冷凍された増幅試薬を解凍し、凍結乾燥された酵素試薬を再構成した。ＫＦ２００プレートに２００μＬ／ウエルの洗浄溶液を満たすことにより、洗浄プレートを準備した。別のＫＦ２００プレートに１００μＬ／ウエルの増幅試薬を満たすことにより、ａｍｐプレートを準備した。使用するまで、ａｍｐプレートと洗浄プレートの両方にカバーをかぶせた。５０μＬの非特異的ＴＣＲ／ウエルを２ｍＬディープ・ウエル・プレート（Ａｘｙｇｅｎ）に添加することにより、サンプルプレートを準備した。１０μＬの溶解溶液中で必要濃度にターゲットを希釈した。１ｍＬの溶解溶液をそのサンプルプレートのそれぞれのウエルに添加した。リピートピペッターを用いて、１０μＬのターゲット溶液を適切なディープウエルに添加した。ディープウエルチップ−コームをそのサンプルプレートに配置した。洗浄およびａｍｐプレートのカバーをはずした。ＫＦ９６プロトコルを開始し、３つすべてのプレートをＫＦ９６機器上に配置した。ａｍｐプレートを位置３に、洗浄プレートを位置２に、およびサンプルプレート（ディープ・ウエル・プレート）を位置１に配置した。プレートを負荷すると、ＫＦ９６機器は、ターゲット捕捉工程を開始した。ＫＦ９６ランが完了したら、プレートを除去した。ａｍｐプレートからは、マルチチャネルピペッターを使用してそれぞれのウエルから３０μＬを取り出し、ＭＪ９６ウエルＰＣＲプレートに移した。
実施例４：感度、特異性、および干渉評価
感度
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ３５１５２）、Ｌ．ｇｒａｙｉ（ＡＴＣＣ１９１２０）、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ（ＡＴＣＣ３３０９０）、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ（Ｆ４０８１）、Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ（Ｆ４０７６）、Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ（Ｆ４０８８）、およびＬ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ（Ｆ４０８２）を１Ｅ５コピー／反応でアッセイした。溶解緩衝液を陰性対照として使用した。ターゲット捕捉のためにＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ ９６機器をおよび検出のためにＢＭＧリーダーを使用して、それぞれについての２０の反応を試験した。それぞれの反応から、１つの３０ｕＬ反復試験試料を増幅した。陽性基準は、３０００ＲＦＵであった。１９の２０反復試験試料を＞９５％陽性率で検出することができた。感度についての試験結果を表５に示す。
感度についての最初の試験は、Ｌ．ｇｒａｙｉおよびＬ． ｍｕｒｒａｙｉが検出されなかったので、不完全とみなした。試験したすべての他の種は合格し、１００％の陽性率が得られた。偽陽性は観察されなかった。Ｌ．ｇｒａｙｉおよびＬ． ｍｕｒｒａｙｉは、増幅領域が遺伝子型的に同一である。それらは、また、Ｔ７プロバイダーオリゴの特定の結合領域における１つの塩基ミスマッチのみが、試験した他の種と遺伝子型的に異なる。従って、再設計が必要であった（下の実施例５参照）。
特異性
ターゲット捕捉のためにＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ ９６機器をおよび検出のためにＢＭＧリーダーを使用して、反応あたり１Ｅ５コピー（おおよそ１００ＣＦＵ）で攻撃生物を試験した。すべての攻撃生物および陰性対照についての２０の反応を、陽性対照の８の反応と共に、それぞれのプレートにおいて試験した。それぞれの反応から１つの３０ｕＬ反復試験試料を増幅した。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ＡＴＣＣ ３５１５２、を陽性対照として１反応あたり１Ｅ５コピーで使用し、溶解溶液を陰性対照として使用した。陽性基準は、３０００ＲＦＵであった。
２００反応のうち１０（２０のうち１）以下という基準は、≦５％ 偽陽性率の目標を満たすだろう。１０種の生物にわたってあらゆる偽陽性の分布を考えることにした。クラスター化偽陽性率（≧４）を有する生物を再試験し、さらに調査した。特異性評価の結果を表６に要約する。
特異性評価は、試験した攻撃生物のいずれに対しても０％陽性率を示し、および陽性対照に関しては１００％陽性率を示した。
干渉
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ＡＴＣＣ ３５１５２、を反応あたり１Ｅ５コピー（おおよそ１００ＣＦＵ）でベースラインターゲットとして使用した。０濃度（溶解溶液のみ）または１Ｅ７コピー（おおよそ１０，０００ＣＦＵ）の攻撃生物でサンプルをスパイクした。ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ ９６プロセッサーおよびＢＭＧマイクロプレートリーダーを使用してアッセイを行った。すべての条件の１２反応を試験した。それぞれの反応から１つの３０ｕＬ反復試験試料を増幅した。陽性基準は、３０００ＲＦＵであった。
結果は、最近接生物の存在下での陽性率の再現性を報告するものであった。試験した生物にわたっての干渉の分布を考えることにした。干渉を呈示した生物を再試験し、さらに調査することにした。干渉評価の結果を表７に要約する。
干渉評価は、すべての攻撃サンプルの存在下で１００％Ｌｉｓｔｅｒｉａ陽性率および陽性対照での１００％陽性率を示した。
実施例５：Ｔ７プロバイダーの再設計
セット＃３（表３）の追加評価により、該オリゴヌクレオチドのセットが、ターゲット捕捉および内部対照をその系に組み込むと、Ｌ．ｇｒａｙｉおよびＬ．ｍｕｒｒａｙｉを検出しないことが明らかになった。追加のＴ７プロバイダーを設計し、評価した。この設計の目的は、他のＬｉｓｔｅｒｉａ種／株の検出に影響を及ぼさずに、試験するＬ．ｇｒａｙｉおよびＬ．ｍｕｒｒａｙｉ種において観察されたミスマッチの有害作用を克服することであった。再設計したオリゴを評価する方法を２つの逐次実験で行った。先ず、Ｌ．ｇｒａｙｉおよびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを使用して、再設計したＴ７プロバイダーオリゴを対照Ｔ７プロバイダーと比較した。それぞれのＴ７プロバイダーを単独で試験し、ならびに等モル混合物で一緒に試験した。再設計したＴ７プロバイダーが、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの検出を損なうことなくＬ．ｇｒａｙｉ種を検出できると判定されたら、感度試験をその全体で反復した。より遺伝的に類縁の生物、Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅとＢ．ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａ、についてのみ、特異性および干渉評価を行った。
実験１：対照Ｔ７プロバイダー（配列番号１３）または再設計Ｔ７プロバイダー（配列番号１４）のいずれかを含有する増幅試薬を調合した。加えて、両方のＴ７プロバイダーを等モル比で含有する第三の増幅試薬を調合した。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ ３５１５２）およびＬ．ｇｒａｙｉ（ＡＴＣＣ １９１２０）を、４回の反復試験で、反応あたり０、１Ｅ３、１Ｅ４および１Ｅ５コピーのレベルで、３つの増幅試薬それぞれに関して試験した。３０００ＲＦＵの陽性基準に基づいてすべてのサンプルを評価した。
実験２−−感度、特異性、および干渉評価：実験１に基づき、等モル比の対照Ｔ７プロバイダーと再設計Ｔ７プロバイダーを含有する増幅試薬を調合した。感度の評価は、Ｔ７プロバイダー（配列番号１３）について行ったものと同じであった。特異性試験のために、Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ（ＡＴＣＣ １９４１４）およびＢ．ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａ（ＡＴＣＣ １１５０９）を反応あたり１Ｅ５コピー（おおよそ１００ＣＦＵ）で試験した。同様に、反応あたり１Ｅ５コピーのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ ３５１５２）と併せた反応あたり１Ｅ７コピーの同じ攻撃生物を試験して、再設計Ｔ７プロバイダーオリゴの添加に起因する干渉の一切の変化を判定した。感度について評価したサンプルは、２０の反復試験反応で行ったのに対して、特異性および干渉について評価したサンプルは、１２の反復試験反応で行った。それぞれの反応から、１つの３０μＬ反復試験試料を増幅した。３０００ＲＦＵの陽性基準に基づいてすべてのサンプルを評価した。
結果
実験１：Ｔ７−プロバイダー設計についての感度の結果を表８および表９に示す。表９は、オリゴヌクレオチドのセット３と対照Ｔ７プロバイダー（配列番号１３）が、反応あたり１０３コピーのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ核酸検出感度を示したが、陽性反応をスコアリングするために反応あたり１０５コピーのＬ．ｇｒａｙｉ核酸を必要としたことを示している。対照Ｔ７プロバイダーの再設計Ｔ７プロバイダー（配列番号１４）での置換は、Ｌ．ｇｒａｙｉ核酸検出感度を強化し、対照Ｔ７プロバイダーと再設計Ｔ７プロバイダーの混合物は、さらに良好な感度を与えた。
実験２：感度、特異性および干渉評価についての、実験１からのＴ７プロバイダーの混合物での実施例２の結果を、表１０、表１１および表１２にそれぞれ要約する。
感度の評価（表１０）は、Ｔ７プロバイダーオリゴを用いて、より早く失われたＬ．ｇｒａｙｉおよびＬ．ｍｕｒｒａｙｉが１００％陽性度で検出されたことを明示した。これら２つの（遺伝的に）最も近縁の攻撃生物への特異性の喪失、または干渉の増加はなかった。
これらの結果は、リアルタイムＴＭＡデータの特徴（例えば、リアルタイムＴＭＡ反応から生成したＲＦＵ曲線のサイズおよび形）に基づいて、近縁生物の存在下においてさえ前記組成物および方法によってＬｉｓｔｅｒｉａ（全種）の検出を果たすことができることを示している。
実施例６：代替領域
大腸菌（アクセッション番号Ｊ０１８５９）参照ｒＲＮＡのｂｐ１１８０−１３７０に対応するヌクレオチド塩基領域、以後、「１２７５領域」と呼ぶ（図３）、をターゲットにする増幅および検出オリゴヌクレオチドを評価のために調製した。これらのオリゴヌクレオチドは、この領域においてＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｒＲＮＡに相補的または相同であって、他のＬｉｓｔｅｒｉａ種へも同じく相同であるように設計した。
表１３は、本発明によって１２７５領域について設計したＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチドおよび他の補助ヌクレオチド（例えば、ブロッカー、トーチ、およびターゲット捕捉オリゴヌクレオチド）の配列を提示するものである。
１６Ｓ ｒＲＮＡの４５０領域についてのスクリーニングと同じスクリーニングを行った。このスクリーニングにはＬ．ｇｒａｙｉを選択した。配列アラインメント、図３参照、は、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉおよびＬ．ｗｅｉｓｈｉｍｅｒｉが、１２７５領域において、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ配列と比較して同様の相同性およびミスマッチを有することを示したので、Ｌ．ｇｒａｙｉの検出が、関心のあるＬｉｓｔｅｒｉａ種から核酸を検出する能力の代表になると考えた。すべてのスクリーニングを０および１Ｅ５コピー／反応で行い、ＢＭＧリーダーをそれに利用した。表１４に示すオリゴヌクレオチドのセットは、Ｌ．ｇｒａｙｉについてのＴＴｉｍｅおよび蛍光シグナルに基づき、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種を見つけ出す最高の可能性を示した。
加えて、表１３のオリゴヌクレオチドの一部を、Ｌｉｓｔｅｒｉａ亜種の中の配列に存在するミスマッチに対してより寛容であるように再設計した。それらを表１５に示す。
実施例７
スパイクした牛ひき肉およびアイスクリームの食品試験
４５０領域セット＃３およびＴＣＯ２（実施例２および３参照）オリゴヌクレオチドを使用して食品マトリックスとしてアイスクリームおよび牛ひき肉を試験する小規模食品研究を行った。この研究は、２相で行った。第一は、希釈のタイミングとＣＦＵのタイミングが近い予備研究であった。この研究の第２相は、Ｌｉｓｔｅｒｉａでスパイクした食品を評価するものであった。１０〜２０ＣＦＵ／食品２５ｇでサンプルをスパイクした。このスパイキングについてのＣＦＵカウントは、ＭｃＦａｒｌａｎｄ １に基づいた。検査材料を０、４、６、８、１０および２４時間の時点でサンプリングした。この時間経過の中での各時点について、ＣＦＵカウントのためにサンプルをプレーティングし、保管用に処理し、ＬｉｓｔｅｒｉａリアルタイムＴＭＡアッセイで試験した。
この研究における後続の様々な段階を下で説明する。ＬｉｓｔｅｒｉａのＭｃＦａｒｌａｎｄ １を作製した。（滅菌ＰＢＳ中１Ｅ＋６に希釈した）ＴＳＡプレートにおいてＣＦＵカウント確認を行った。食品２５グラムを計量し、無菌でＳＴＯＭＡＣＨＥＲバッグの中に入れた。２０ＣＦＵを２２５ｍＬのＤｅｍｉ−Ｆｒａｚｅｒに直接接種した。そのスパイクした培地を、食品が入っているＳＴＯＭＡＣＨＥＲバッグに注入し、２分間、２００ｒｐｍで処理した。そのサンプルを３０℃でインキュベートした。０、４、６、８、１０および２４時間の時点で１ｍＬアリコート（プレートカウントに使用するために１アリコート）を取り出した。ＣＦＵカウントのために、サンプルを、選択寒天、ＭＯＸプレートに、３種類の希釈、１プレート／希釈で、プレーティングし、３５℃でインキュベートした。２４時間の期間中にサンプリングした残りの５つのアリコートを１２，０００×ｇで３０秒間、回転させた。上清を除去し、５００μＬの５０ｍＭコハク酸緩衝液（０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％ＬｉＬＳ、ｐＨ４．８）をペレットに添加し、その後、それを２０秒間、激しくボルテックス処理した。そのサンプルを＞９０℃で少なくとも１５分、加熱した。その後、１２，０００×ｇで１分間、回転させた。ラベルを貼った新しいチューブにその上清を移した。サンプルを−７０℃で凍結させた。食品対照は、牛ひき肉についての２つの陽性対照および２つの陰性対照、プレーンバニラアイスクリームについての２つの陽性対照および２つの陰性対照、ならびに培地のみの純粋系についての２つの陽性対照および１つの陰性対照を含んだ。
予備研究／ＣＦＵタイミング：
食品不在の状態で、スパイクしたＬｉｓｔｅｒｉａ（約１５ＣＦＵ開始接種物）は、ブロス中で６時間後、約２７０ＣＦＵ／ｍＬに増殖した。
培養結果：
約２４ＣＦＵの接種物を使用したとき、スパイクした牛ひき肉中のＬｉｓｔｅｒｉａは、Ｄｅｍｉ−Ｆｒａｚｅｒブロス中での８時間のインキュベーション後、約１５ＣＦＵ／ｍＬに増殖した。スパイクしたアイスクリームでは、Ｄｅｍｉ−Ｆｒａｚｅｒブロス中での１０時間のインキュベーション後に７０ＣＦＵ／ｍＬが観察された。スパイクしていない牛ひき肉をＬｉｓｔｅｒｉａ種、またはＬｉｓｔｅｒｉａと同様の培養特性を示す他の生物で汚染し、２４時間のインキュベーション後、それらは６Ｅ＋４ＣＦＵ／ｍＬより多くを有した。食品サンプルを一切伴わない、スパイクした培地は、１０時間のインキュベーション後、約１０ＣＦＵ／ｍＬを有した。２４時間までに、Ｄｅｍｉ−Ｆｒａｚｅｒブロス中のすべてのスパイクしたサンプルおよびスパイクしていない牛ひき肉サンプルが、＞２．８Ｅ＋４ＣＦＵ／ｍＬを有した。スパイクしていないアイスクリームおよび陰性培地対照は、Ｄｅｍｉ−Ｆｒａｚｅｒブロス中での２４時間のインキュベーション後でさえ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ増殖を一切示さなかった。ＣＦＵカウントを表１６に示す。
リステリアリアルタイム増幅結果：
リアルタイム増幅結果を下の表１７に要約する。
Ｌｉｓｔｅｒｉａは、２４時間の時点まで、いずれのサンプルにおいても検出されなかった。アッセイの全感度は、（理想増幅条件下で）１Ｅ３コピー／反応と１Ｅ４コピー／反応の間であると考えられる。培地より低い感度を生じさせることがある食品および培地マトリックスからの干渉の大きさは、この時点ではわからない。
要約
約３５０−５０５および約１１８０−１３７０の大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド塩基位置にそれぞれ対応する、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸の４５０および１２７５領域をターゲットにする増幅および検出オリゴヌクレオチドを、評価のために設計および合成した。
４５０領域Ｌｉｓｔｅｒｉａアッセイは、１Ｅ＋５コピー／反応（約１００ＣＦＵ）で７つすべてのＬｉｓｔｅｒｉａ種に対して感度１００％であった。このＬｉｓｔｅｒｉａアッセイは、１０の非Ｌｉｓｔｅｒｉａ生物ならびにＢｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘに対して特異性１００％であった。検出限界は、１〜１０ＣＦＵであった。高速リアルタイムＴＭＡアッセイを４時間未満でランすることができ、それにより、食品および製造施設での試験に必要な時間を数日から数時間に短縮できる。
１２７５領域をターゲットにするオリゴヌクレオチドは、４５０領域をターゲットにするものの代替として有望な結果も示した。
Ｌｉｓｔｅｒｉａの４５０領域のみを増幅および検出するようにまたは４５０ばかりでなく１２７５領域も増幅および検出するように設計した追加の増幅および／または検出オリゴヌクレオチドの使用により、アッセイ感度増加を達成することができた。
本明細書において述べるまたは引用する、論文、特許および特許出願ならびにすべての他の文献および電子的に入手可能な情報の内容は、それぞれの個々の掲載が具体的におよび個々に参照により組み込まれていると示されているのと同程度に、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている。出願人は、任意のそのような論文、特許、特許出願または他の物理的および電子的文献からの任意のおよびすべての材料および情報を本出願に物理的に組み込む権利を所有する。
本明細書に例証として記載する方法を、本明細書において具体的に開示していない任意の要素（単数または複数）、制限（単数または複数）のない状態で適切に実施することができる。従って、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、広範におよび制限なしで読み取るものとする。加えて、本明細書において用いる用語および表現は、説明の用語として用いており、制限の用語として用いておらず、ならびにそのような用語および表現の使用には、示したおよび記載した特徴またはその一部についてのいずれの等価物も排除する意図はない。従って、好ましい実施形態および自由選択の特徴によって本発明を具体的に開示したが、本明細書において開示する本発明のその中で実施される修飾および変形を当業者は用いることができること、ならびにそのような修飾および変形が本発明の範囲内であるとみなされることは、理解されるはずである。
本発明を本明細書に広くおよび一般的に記載した。本一般的開示の範囲内に入る、より狭い種および亜属グルーピングのそれぞれも本方法の一部を構成する。これは、削除される材料が本明細書に具体的に列挙されているか否かに関係なく、その属からの任意の主題を除去するという条件または負の制限で、本方法の一般的記載を含む。
他の実施形態は、後続の特許請求の範囲の範囲内である。加えて、本方法の特徴または態様がマーカッシュグループによって記載されている場合、それにより本発明が、そのマーカッシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループによっても記載されていることは、当業者には理解されるだろう。

Claims (29)

  1. 第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、
    前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの３９８−４１７のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、
    前記プライマーオリゴヌクレオチドが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの４３９−５０５のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにし、および
    前記増幅アッセイにおいて使用される前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅すべき前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸配列の逆ストランドをターゲットにする、オリゴヌクレオチドのセット。
  2. 第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドであって、その配列が、前記第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと一部重複するが、１つ以上のＬｉｓｔｅｒｉａ種の塩基配列間でミスマッチが存在する位置において１つ以上の塩基が異なるものである第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  3. 前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第一のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にアデニンを含み、および
    前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの第二のものが、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド位置４０７に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸配列内のヌクレオチド位置に相補的であるヌクレオチド位置にグアニンを含む、
    請求項２に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  4. 前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの塩基配列が、配列番号１３、１４の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項２〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  5. 前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの前記第一のものの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの前記第二のものの塩基配列が、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  6. 前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの４８０−５０１のヌクレオチド位置に対応するＬｉｓｔｅｒｉａ核酸領域内の配列をターゲットにする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  7. 前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  8. 前記第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含むかあるいは配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含み、および前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、請求項１または請求項２に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  9. 検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  10. 前記検出オリゴヌクレオチドが分子トーチオリゴヌクレオチドであり、前記トーチオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、２５、２６、２７、２８の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項９に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  11. ブロッカーオリゴヌクレオチド、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドのうちの１以上をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  12. 前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  13. 前記ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  14. 配列番号１３の塩基配列またはその相補配列を含む第一のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列またはその相補配列を含む第二のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドとを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するための請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  15. 検出オリゴヌクレオチドであって、前記検出オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２７の塩基配列またはその相補配列を含む検出オリゴヌクレオチド；あるいは
    ブロッカーオリゴヌクレオチドであって、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号６の塩基配列またはその相補配列を含む、ブロッカーオリゴヌクレオチド；
    あるいは
    ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドであって、前記ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号３１またはその相補配列である、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド；
    のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  16. ２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するための請求項１〜１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、
    Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ、およびＬ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉが、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下で増幅されるように、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドが構成および配列され；
    Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅが、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイ条件下で実質的に増幅されないように、前記２つ以上のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよび前記１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドが構成および配列される、オリゴヌクレオチドのセット。
  17. 前記プライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列を含む、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  18. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ核酸増幅アッセイにおいて使用するためのキット。
  19. 検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドまたはターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１以上をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
  20. 前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドであり、前記トーチオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、２５、２６、２７、２８の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項１９に記載のキット。
  21. 前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項１９に記載のキット。
  22. 前記ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項１９に記載のキット。
  23. 請求項１〜８および１０〜１７のいずれか一項に記載のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのセットを使用して核酸増幅アッセイを行うことおよび検出工程を行って、前記サンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａの存在または不在の指標として前記増幅アッセイからの産物の存在または不在を同定することを含む、サンプル中のＬｉｓｔｅｒｉａを検出するための方法。
  24. 前記オリゴヌクレオチドのセットが検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドであり、前記トーチオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、２５、２６、２７、２８の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記オリゴヌクレオチドのセットがブロッカーオリゴヌクレオチド、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドのうちの１以上をさらに含む、請求項２３または２５に記載の方法。
  27. 前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７の配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６の塩基配列およびそれらの相補配列から選択される塩基配列を含む、請求項２６に記載の方法。
  29. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、
    ａ）配列番号１３のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド；
    配列番号６のブロッカーオリゴヌクレオチド；
    配列番号２３もしくは配列番号２１のプライマーオリゴヌクレオチド；および
    配列番号２７の検出オリゴヌクレオチド；または
    ｂ）配列番号１３のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド；
    配列番号６のブロッカーオリゴヌクレオチド；
    配列番号２３もしくは配列番号１６のプライマーオリゴヌクレオチド；および
    配列番号２５の検出オリゴヌクレオチド
    を含む、オリゴヌクレオチドのセット。
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