JPH0838198A - Ｐｃｒによる長鎖核酸配列の増幅 - Google Patents

Ｐｃｒによる長鎖核酸配列の増幅

Info

Publication number
JPH0838198A
JPH0838198A JP7036602A JP3660295A JPH0838198A JP H0838198 A JPH0838198 A JP H0838198A JP 7036602 A JP7036602 A JP 7036602A JP 3660295 A JP3660295 A JP 3660295A JP H0838198 A JPH0838198 A JP H0838198A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna polymerase
amplification
polymerase
dna
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP7036602A
Other languages
English (en)
Inventor
Suzanne Cheng
チェン スザンヌ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JPH0838198A publication Critical patent/JPH0838198A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明の目的は、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）による10キロ塩基より長い核酸配列（例えばＤＮ
Ａ配列）の増幅のための方法と試薬を提供することであ
る。 【構成】 本法は、テルムス・テルモフィラスからの第
一の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、テルモコッカス・リ
トラリス、ピロコッカス種ＧＢ−Ｄまたはテルモトガ・
マリチマからの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有
する少量の第二の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとの組合せ
から成る組成物を使用する。 【効果】 このＤＮＡポリメラーゼ組成物は、開示され
る反応緩衝液と共に使用すると、少なくとも長さ42.2キ
ロ塩基までのＤＮＡ配列の増幅を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般的には分子生物学
と核酸化学の分野に関する。より詳しくは、本発明はポ
リメラーゼ連鎖反応による長鎖核酸配列の増幅方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】核酸
配列の増幅のための有力な手段であるポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）は米国特許第 4,683,202号、同第 4,68
3,195号、同第 4,800,159号および同第 4,965,188号に
開示されている。ＰＣＲは、最も単純な形態では、相補
鎖にハイブリダイズし且つ標的ＤＮＡ中の着目の領域に
隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使って
特定のＤＮＡ配列の酵素的合成を行う試験管内法であ
る。反復性の一連の反応段階は鋳型の変性、プライマー
アニーリングおよびアニールしたプライマーのＤＮＡポ
リメラーゼによる伸長を含み、結果として末端がプライ
マーの５′末端により規定された特定断片の幾何数列的
蓄積をもたらす。ＰＣＲは109 倍の特定ＤＮＡ配列の選
択的増加を行うことができる。ＰＣＲ法はSaiki ら, 19
85, Science 230: 1350-1354にも記載されている。
【０００３】ＰＣＲは分子生物学、分子発生学、臨床遺
伝学、集団遺伝学、法生物学、並びにゲノム地図作成お
よび配列決定計画において広く応用されている。しかし
ながら、現行のＰＣＲは確実に増幅できるＤＮＡ領域の
サイズに限界がある。ＰＣＲの長さ制限を克服するため
の試みは、Glukhov ら, 1991, Molek. Biol.25:1602-16
10 ; Kainzら, 1992, Anal. Biochem. 202:46-49 ; Oh
ler およびRose, 1992, PCR Meth. Applic. 2:51-59 ;
Ponce およびMicol, 1992, Nucl. Acids Res. 20:623並
びにRychlik ら, 1990, Nucl. Acids Res. 18:6409-64
12に報告されている。５〜15 kb の配列の増幅が達成さ
れたが、報告された長鎖生成物の収率は低かった。
【０００４】長鎖核酸配列を増幅することのできるＰＣ
Ｒ法は、長鎖で低コピー数の挿入材料の増幅を通して、
またＰＣＲを使った突然変異誘発においてより大きな組
換え構成物の構築を可能にすることにより、ゲノム地図
作成や配列決定並びに分子クローニングを容易にするだ
ろう。少なくとも25 kb の標的の高収率でのＰＣＲ増幅
を可能にするような方法が要望される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、長鎖ＤＮＡ標
的のＰＣＲ増幅のための改善された方法と試薬を提供す
る。本発明の一観点は、本発明の方法において有用であ
る耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの組合せに関する。
【０００６】この組合せは、第一に３′→５′エキソヌ
クレアーゼ活性を示さない高活性の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼであるテルムス・テルモフィラス（Thermus ther
mophilus）ＤＮＡポリメラーゼと、第二にいずれも３′
→５′エキソヌクレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼであるテルモコッカス・リトラリス（Thermoco
ccus litoralis）ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス
（Pyrococcus）種ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼまたは
テルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）ＤＮＡ
ポリメラーゼのいずれかとから成る。
【０００７】本発明の別の観点は、長鎖標的の増幅を行
うのに有用な緩衝液に関する。本発明の別の観点は、上
述の耐熱性酵素の特定の組合せを使ったＰＣＲ増幅に関
する。反応条件は、長さ42キロ塩基までの核酸標的配列
の増幅を可能にするように特定される。本発明の別の観
点は、本発明の方法を実施する際に有用な試薬を含んで
成るキットに関する。そのようなキットは、上述の耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼの組合せと、所望により本発明の
方法において有用である追加の増幅試薬とを含んで成
る。
【０００８】
【具体的な説明】本発明の理解を助けるために、幾つか
の用語を下記に定義する。「増幅反応混合物」なる用語
は、本明細書中で使用する時、標的核酸を増幅するのに
使われる様々な増幅試薬を含んで成る水溶液を指す。そ
のような試薬は、プライマー、酵素、水性緩衝液、塩
類、標的核酸、およびデオキシヌクレオシド三リン酸
（通常のものと通常でないものの両方）を包含する。状
況に応じて、増幅反応混合物は完全な反応混合物または
不完全な反応混合物のいずれかであることができる。
【０００９】「核酸」および「オリゴヌクレオチド」な
る用語は、プライマー、プローブ、および検出しようと
するオリゴマー断片を指し、ポリデオキシリボヌクレオ
チド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボ
ヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、およびプリンも
しくはピリミジン塩基または修飾されたプリンもしくは
ピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他の任意の形の
ポリヌクレオチドを総称するものである。「核酸」およ
び「オリゴヌクレオチド」の用語の間には何ら意図する
区別はなく、それらの用語は互いに交換可能に用いられ
るだろう。それらの用語は分子の一次構造にのみ言及す
る。よって、それらの用語には二本鎖および一本鎖ＤＮ
Ａ、並びに二本鎖および一本鎖ＲＮＡが包まれる。
【００１０】モノヌクレオチドは１つのモノヌクレオチ
ドペントース環の５′リン酸がその隣の３′酸素にホス
ホジエステル結合によって一方向で結合するような形で
反応してオリゴヌクレオチドを形成するので、オリゴヌ
クレオチドの末端は、その５′リン酸がモノヌクレオチ
ドペントース環の３′酸素に結合していないならば
「５′末端」と称し、その３′酸素が次のモノヌクレオ
チドペントース環の５′リン酸に結合していないならば
「３′末端」と称する。
【００１１】オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様
々な要因並びに該オリゴヌクレオチドの最終機能または
最終用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば、
適当な配列のクローニングと制限酵素処理、並びにNara
ngら, 1979, Meth. Enzymol.68:90-99のホスホトリエス
テル法；Brown ら, 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151
のホスホジエステル法；Beaucageら, 1981, Tetrahedro
n Lett. 22:1859-1862のジエチルホスホルアミダイト
法；および米国特許第 4,458,066号の固体支持体法など
の方法による直接化学合成を包含する任意の適当な方法
により、調製することができる。
【００１２】本明細書中で使用する「ハイブリダイゼー
ション」なる用語は、相補的塩基対合によって生じる２
つの一本鎖核酸による二重型構造の形成を意味する。ハ
イブリダイゼーションは相補的核酸鎖間、または小領域
の不正対合を含む核酸鎖間で起こり得る。核酸二重鎖の
安定性は融解温度すなわち「Ｔm 」により評価される。
Ｔm は、塩基対の50％が解離される温度（限定されたイ
オン強度とpHの下で）である。核酸化学技術者は、例え
ばオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩
基組成と配列、イオン強度および不適正塩基対の発生率
を包含する多数の変数を経験的に考慮しながら、二重鎖
安定性を決定することができる。
【００１３】完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイ
ズするような条件を「緊縮ハイブリダイゼーション条
件」と称する。緊縮（stringent)ハイブリダイゼーショ
ン条件は当業界で公知である（例えば、Sambrookら, 19
85, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NewY
orkを参照のこと）。一般的に、緊縮条件は、限定され
たイオン強度とpHにおける特定配列のＴm よりも約５℃
低くなるように選択される。典型的には、緊縮条件は、
pH 7において塩濃度が少なくとも約0.2 モルであり且つ
温度が少なくとも約60℃であるような条件であろう。ハ
イブリダイゼーション条件の緊縮性（stringency) を緩
めると、配列の不正対合が寛容されるようになるだろ
う。寛容される不正対合の程度はハイブリダイゼーショ
ン条件の適当な調整により制御することができる。
【００１４】小領域の不正対合を除いて相補的である２
つの一本鎖核酸を、「実質上相補的」と称する。実質上
相補的な配列の適当な二重鎖は、低緊縮ハイブリダイゼ
ーション条件下で得ることができる。核酸化学技術者
は、例えばオリゴヌクレオチドの長さと塩基対濃度、イ
オン強度および不適正塩基対の発生率を包含する多数の
変数を経験的に考慮しながら、二重鎖安定性を決定する
ことができる。
【００１５】本明細書中で使用する「プライマー」なる
用語は、天然型であろうと合成型であろうと、核酸鎖に
相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件
下に置いた時に、すなわち適当な緩衝液中に且つ適当な
温度で４種の異なるヌクレオシド三リン酸と重合剤（す
なわちＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下
に置いた時にＤＮＡ合成の開始点として作用することが
できるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは好まし
くは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プ
ライマーの適切な長さは該プライマーの意図する用途に
依存するが、典型的には15〜35ヌクレオチドの範囲であ
る。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定な
ハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要
とする。
【００１６】プライマーは鋳型の配列を正確に反映する
必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分な程
に相補的でなければならない。プライマーは、該プライ
マーの検出または固定化を考慮に入れているがＤＮＡ合
成の開始点として作用するという該プライマーの基本的
性質を変えないような追加の特徴を含むことができる。
例えば、増幅された配列のクローニングに有用な制限酵
素開裂部位を提供するために該プライマーの末端に非相
補的配列を置くことができる。
【００１７】本明細書中で使用する「上流」および「下
流」なる用語は、標的配列に沿ったプライマー結合部位
の位置を指す。上流プライマーは標的配列の非コード鎖
にハイブリダイズし、従って標的配列のコード鎖の部分
配列である増幅された配列の５′末端を形成する。同様
に、下流プライマーは標的配列のコード鎖にハイブリダ
イズし、従って標的配列の非コード鎖の部分配列である
増幅された配列の５′末端を形成する。
【００１８】本明細書中で使用する「標的配列」および
「標的核酸配列」なる用語は、増幅、検出、またはその
両方を行おうとするオリゴヌクレオチドの領域を指す。
標的配列は増幅に用いる２つのプライマー配列の間にあ
る。本明細書中で使用する「耐熱性ポリメラーゼ」なる
用語は、例えばＥ．コリ（E. coli ）由来のヌクレオチ
ドポリメラーゼに比べて熱に対して比較的安定であり、
且つヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素をい
う。一般的に、該酵素は標的配列にアニールしたプライ
マーの３′末端のところで合成を開始し、そして合成が
終わるまで鋳型鎖に沿って５′方向に進行するだろう。
【００１９】本発明の方法は、テルムス・テルモフィラ
ス (Tth)からのＤＮＡポリメラーゼと、テルモトガ・マ
リチマ(Tma) 、ピロコッカス種ＧＢ−Ｄまたはテルモコ
ッカス・リトラリス (Tli)のいずれかからのＤＮＡポリ
メラーゼとの特定の組合せを使用する。本明細書中で使
用する「３′→５′ヌクレアーゼ活性」および「プルー
フリーディング活性」なる用語は、それによってオリゴ
ヌクレオチドの３′末端から順次にヌクレオチドが除去
される鋳型特異的核酸ポリメラーゼの活性をいう。
【００２０】ポリメラーゼ活性の単位（Ｕ）は、与えら
れた速度で核酸を合成するのに必要とされる酵素の量の
尺度である。本明細書に指摘される活性単位は、下記に
列挙されるように、各ポリメラーゼのそれぞれの供給者
によって定義された通りである。活性は異なる特定条件
下で評価され得るため、ある酵素の活性をそのまま別の
酵素の活性と比較することはできないだろう。
【００２１】テルムス・テルモフィラスからの組換えＤ
ＮＡポリメラーゼ(rTth)とテルモトガ・マリチマからの
組換えＤＮＡポリメラーゼ(UlTma) はPerkin Elmer社,
Norwalk, CT から市販されている。rTthまたは UlTmaTM
ＤＮＡポリメラーゼの１単位は、商品供給者のPerkin E
lmer社により、次のものから成る50μl の反応液中で10
分間のインキュベーションにおいて測定した時、74℃に
て30分間で10ナノモルのdNTPを酸不溶性材料中に取り込
むであろう酵素の量として定義されている：
【００２２】 200 μM 各dATP, dGTP, dTTP 100 μM 〔α−32Ｐ〕-dCTP （0.05〜0.1 Ci／ミリモ
ル） 活性型サケ精子ＤＮＡ 100 mM KCl 2.2 mM MgCl2 25 mM TAPS〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ
プロパンスルホン酸、ナトリウム塩〕, 25℃でpH 9.3 1 mM β−メルカプトエタノール
【００２３】テルモコッカス・リトラリスからの組換え
ＤＮＡポリメラーゼ (VentR ；登録商標) とピロコッカ
ス種ＧＢ−Ｄからの組換えＤＮＡポリメラーゼ(Deep Ve
ntR；登録商標) はNew England Biolabs 社, Beverly,
MA から市販されている。VentR または Deep VentR Ｄ
ＮＡポリメラーゼの１単位は、商品供給者New England
Biolabs 社により、次のものから成る反応液中で75℃に
て30分間で10ナノモルのdNTPを酸不溶性材料中に取り込
むであろう酵素の量として定義されている：
【００２４】 200 μM 各dNTP (dATP, dCTP, dGTPおよび3H-dTTP) 0.2 mg/ml 活性型ＤＮＡ 10 mM KCl 10 mM (NH4)2SO4 20 mM Tris-HCl, 25℃でpH 8.8 2 mM MgSO4 0.1% Triton X-100
【００２５】当業者の技術の範囲内である分子生物学、
微生物学および組換えＤＮＡ技術の常用技術は文献中に
詳細に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch お
よびManiatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manu
al, 第２版（1989）; Oligonucleotide Synthesis (M.
J. Gait編, 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B.
D. Hames & S.J. Higgins 編, 1984) ; A Practical Gu
ide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984) ;並びに
Methods in Enzymology (Academic Press Inc.)のシリ
ーズを参照のこと。
【００２６】本発明は、長鎖ＤＮＡ標的のＰＣＲ増幅の
ための改善された方法と試薬および提供する。短鎖核酸
配列の増幅のためのＰＣＲ増幅方法は当業界で公知であ
り、米国特許第 4,683,195号、同第 4,683,202号および
同第 4,965,188号に記載されている。Perkin Elmer社,
Norwalk, CT といった商品販売業者がＰＣＲ試薬を販売
しておりＰＣＲプロトコールを発表している。本発明に
より提供される利点を容易に理解するために、ＰＣＲの
要約を与える。
【００２７】ＰＣＲ増幅の各サイクルにおいて、二本鎖
の標的配列を変性させ、変性された標的の各鎖にプライ
マーをアニールさせ、そしてＤＮＡポリメラーゼの作用
によってプライマーを伸長させる。この工程を典型的に
は25〜40回繰り返す。２つのプライマーは標的核酸配列
の反対の末端にアニールし、そして各プライマーの伸長
生成物が標的配列の相補的コピーであり且つその相補体
から分離された時に他方のプライマーにハイブリダイズ
することができるような方向で標的核酸配列にアニール
する。各サイクルは、100 ％の効率であったとすれば、
存在する標的配列の数の倍増をもたらすだろう。
【００２８】長鎖標的の効率的ＰＣＲ増幅を達成するた
めには、幾つかの必要条件を満たさなければならない。
第一に、標的配列が完全に変性されなければならない。
標的が長くなれば、比較的高い融解温度のために不完全
な変性になりやすい高ＧＣ部分を益々多く含むようにな
る。不完全な鎖分離は標的ＤＮＡの迅速な復元を生み、
恐らくＰＣＲプライマーのアニーリングや伸長を妨げる
だろう。第二に、伸長時間が各ＰＣＲサイクルにおいて
鎖の合成を完結させるほど十分に長くなければならな
い。第三に、長鎖標的が増幅の間の分解に対して保護さ
れなければならない。
【００２９】長鎖標的はＰＣＲ条件下で分解や鎖切断を
より受けやすい。従って、最初の鋳型の完全性とその後
のＰＣＲ中の鎖の生き残りが重要な考慮すべき点であ
る。本発明の方法は、ゲノムＤＮＡからの単一コピー遺
伝子の増幅に必要な特異性やポリメラーゼ活性を傷つけ
ることなく、長鎖のＰＣＲのためのそれらの必要条件を
満たすように考案される。標的の鎖分離を改善し、伸長
時間を延長し、そして鋳型ＤＮＡを熱循環中の分解から
保護することは、増幅可能な最大標的長さを大きく増加
させるが、23〜42kb 範囲の標的の効率的増幅を達成す
るには不十分である。長鎖標的分子の増幅を達成する際
の制限要因は核酸合成の忠実度である。
【００３０】プライマー伸長生成物の合成の間のヌクレ
オチドの誤った取り込みは、効率的に増幅させることが
できる標的の長さを制限する。鋳型と不正対合している
３′末端塩基のプライマー伸長への影響は Huangら, 19
92, Nucl. Acids Res. 20:4567-4573において記載され
ている。誤って取り込まれたヌクレオチドの存在は、鎖
の合成を早々に終わらせ、次の回の増幅に向かう鋳型鎖
の数を減少させ、かくして長鎖標的の増幅の効率を低下
させてしまう。誤って取り込まれるヌクレオチドのレベ
ルが低くても、10 kb より長い配列では致命的となり得
る。
【００３１】ＤＮＡポリメラーゼ活性に加えて反応液中
に少量の耐熱性３′→５′エキソヌクレアーゼまたは
「プルーフリーディング」活性が存在すれば、ＤＮＡ合
成の忠実度は改善される。プルーフリーディング活性
は、誤って取り込まれたヌクレオチドを除去しなお且つ
優勢的なポリメラーゼ活性により完全な鎖合成を可能に
することにより、長鎖生成物の収率を明らかに改善す
る。本発明の重要な面は、３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性とポリメラーゼ活性の両方を提供することにより
増幅可能な最大標的長さを大きく増加させる、耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼの特定混合物に関連する。
【００３２】プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ
活性はTth ＤＮＡポリメラーゼ中には認められない（My
ers およびGelfand, 1991, Biochemistry 30:7661-766
6）が、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus li
toralis）、ピロコッカス（Pyrococcus）種ＧＢ−Ｄお
よびテルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）か
らのＤＮＡポリメラーゼには内在している。しかしなが
ら、VentR （登録商標）ＤＮＡポリメラーゼだけによる
長鎖標的の増幅は、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性
を示さないTth ＤＮＡポリメラーゼを使った時よりも低
効率である。増幅効率の低下はおそらく、少なくとも部
分的には、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性とポリメ
ラーゼ活性との競争から生じる正味処理能力の低下とプ
ライマー分解によるのであろう。
【００３３】３′→５′エキソヌクレアーゼ活性とポリ
メラーゼ活性の相対量はＤＮＡポリメラーゼを混合する
ことにより調節することができる。Tth ＤＮＡポリメラ
ーゼのような第一の活性ポリメラーゼと、Tli ＤＮＡポ
リメラーゼのようなプルーフリーディング活性を持つ少
量の第二のポリメラーゼとを組み合わせることにより、
第一のポリメラーゼ中に内在する活発なＤＮＡポリメラ
ーゼ活性とプルーフリーディング活性の利点を結び付け
ることができる。
【００３４】ＰＣＲプロトコールのほとんど全ての面が
長鎖標的分子の増幅効率に影響を及ぼす。伸長時間、補
助溶剤およびポリメラーゼ（３′→５′エキソヌクレア
ーゼ活性を持つものと持たないもの）が最も重要なパラ
メーターであるが、反応緩衝液のpHと組成、塩（Ｋ+ お
よびMg2+）、並びにプライマー設計もまた長鎖標的の増
幅の成功にとって重要な変数である。長鎖標的の増幅効
率に対するＰＣＲ増幅の個々の成分の影響を下記に記述
する。
【００３５】温度循環 本明細書中に例示される増幅反応は２段階の温度循環を
使用し、反応温度は標的核酸が変性される高温と、変性
された標的配列にプライマーがアニールしてプライマー
伸長が起こる低温とを交互に繰り返す。各サイクルにお
ける各段階の時間と温度が増幅効率に影響する。
【００３６】変性温度を高めることにより一層完全な標
的の変性を達成することができる。しかしながら、変性
温度の上昇は脱プリンなどの損傷の速度を増加させるこ
とになり、増幅効率を低下させると共にポリメラーゼ活
性の損失を増大させ得る。標的核酸の完全な変性を達成
することは重要だけれども、それと同時に標的の損傷速
度を最小にしなければならない。結果として、適度の変
性温度（ＧＣ含量に依存して、例えば約94℃）が好まし
く、後述のような補助溶剤の添加によって変性の完全性
が改善される。
【００３７】比較的高いアニーリング温度（例えば約68
℃）は一部相同の標的部位へのプライマーのハイブリダ
イゼーションを減らし、それによって二次的なプライミ
ング部位からの生成物の合成を最少にする。実施例に記
載されるようなλＤＮＡ標的を使った増幅では、68℃で
最低５〜６分が必要とされる。より緊縮な70〜75℃のア
ニーリング段階を加えても収率は有意に向上しない。同
様に、潜在的に問題となる高ＧＣまたは高ＡＴ部分を仲
裁するための温度スパイクを含む複雑な温度プロフィー
ルもあまり有益ではない。
【００３８】長鎖標的の増幅を達成するには、鎖合成を
完結させる伸長時間が重要である。20 kb よりも長い標
的の増幅には、どの各サイクルにおいても少なくとも12
分で且つ22分以下のアニーリングおよび伸長時間が好ま
しい。最少伸長時間は後述のような他の要因、例えば補
助溶剤濃度に依存する。使用する初期伸長時間が約12分
であってサイクル毎に15〜20秒ずつ伸長時間を増加させ
る増幅反応は、増幅の間ずっと15分以上の伸長時間を使
う反応よりも非特異的生成物の形成が少ない。Perkin E
lmer社, Norwalk, CT により販売されている熱循環器の
自動延長という特色は、増幅反応中の伸長時間を増加さ
せるのに便利な方法である。
【００３９】非特異的標的の増幅の減少 典型的には、ＰＣＲ試薬は最初の変性段階前に室温で混
合される。低緊縮条件の低温は、別のプライマーや一部
相同の標的配列へのプライマーの結合を引き起こし得
る。この非特異的プライマー結合からも伸長生成物が形
成され、非常に有能な標的競争相手として働く短鎖生成
物となり、それによって所望の長鎖生成物の増幅効率を
減少させ得る。
【００４０】「ホットスタート」法は、そのような非特
異的結合を防ぐのに十分な程に反応温度が上昇するまで
伸長反応を阻止することにより、非特異的プライマーハ
イブリダイゼーションからのプライマー伸長生成物の合
成を最小限にとどめる。ゲノム鋳型は標的プライマー配
列に対して一部相同の配列を含みそうなので、長鎖標的
の増幅効率を最大にするにはホットスタートプロトコー
ルが重要である。
【００４１】ホットスタートを達成する１つの方法は、
増幅混合物の温度が75〜80℃に上昇するまで必須のＰＣ
Ｒ反応成分を加えないでおくことを含む。その例として
は、ＤＮＡポリメラーゼかまたはＤＮＡポリメラーゼ活
性の必須触媒であるMg2+のいずれかを加えないでおくこ
とが挙げられる。１つのホットスタートプロトコールで
は、変性温度に到達した後で必須成分を手動で添加す
る。あるいは、熱感受性障壁、例えば反応温度で融解す
るワックスを使って、反応成分を試験管内で隔離するこ
とにより必須反応成分を加えないでおく。これは、反応
試験管を開封しなければならない回数を最少にし、それ
によって汚染の可能性を減らす。
【００４２】本発明の方法において有用かもしれない別
のホットスタートプロトコールは、ウラシル−Ｎ−グリ
コシラーゼを使用して増幅混合物温度を上昇させる前に
形成した非特異的生成物を分解する方法である（ＰＣＴ
特許公報WO 92/01814 を参照のこと）。
【００４３】ＰＣＲ試薬ＰＣＲでは、プライマー／鋳型
混合物を適当な重合条件下でＤＮＡポリメラー ゼと共にインキュベートした時にプライマー伸長反応が
起こる。それらの条件は、二価カチオン、一価カチオ
ン、４種全てのデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNT
Ps) および緩衝剤を含有する反応混合物により提供され
る。変性条件に影響を及ぼす補助溶剤を反応混合物に添
加してもよい。それらの成分の各々が伸長反応の効率に
影響を及ぼすので、それらを別々に下記に考察する。
【００４４】ＤＮＡポリメラーゼ 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの組合せとそれらの濃度の選
択は、標的の長さや配列の複雑さが増加するにつれて特
に重要になってくる。Tth ＤＮＡポリメラーゼとTli Ｄ
ＮＡポリメラーゼの組合せは、長鎖ＰＣＲ生成物の最も
効率的な増幅を提供し、且つ長さ40 kb を越える標的の
増幅を可能にする。
【００４５】ＰＣＲ増幅におけるＤＮＡポリメラーゼの
最適量は、試料中に存在する標的配列のコピー数を含む
多数の要因に依存する。高コピー数反応（標的コピー数
≧10 7 ）では、50μl 反応液あたり 2〜2.5 単位（Ｕ）
のTth ＤＮＡポリメラーゼを使うことによって高収率が
得られる。ポリメラーゼ濃度を更に増加させると、増幅
生成物をアガロースゲル電気泳動で検出する時に高いバ
ックグラウンドレベルが生じる。しかしながら、低コピ
ー数反応（標的コピー数≦104 ）では、50μl反応液あ
たり約0.8 〜１ＵのTth ＤＮＡポリメラーゼを使った時
に特異性が最大になる。中程度の標的コピー数では、中
程度のポリメラーゼ濃度を使った時に最大収率が達成さ
れる。最適ポリメラーゼ濃度は二価カチオン濃度にも依
存する。高いMg2+濃度では、非特異的生成物の蓄積を最
小にするためにポリメラーゼ濃度を減少させた。
【００４６】Tth ＤＮＡポリメラーゼのみを使ってＰＣ
Ｒを行うと、高コピー数ファージλＤＮＡ試料から増幅
可能な最大標的サイズは約23 kb に限られることがわか
った。同様に、低コピー数ファージλＤＮＡ試料から増
幅可能な最大標的サイズは約10〜12 kb に制限されるこ
とがわかった。少量の耐熱性３′→５′エキソヌクレア
ーゼを添加することにより、増幅可能な標的のサイズの
大幅な増加が達成される。
【００４７】上述したように、Tth ＤＮＡポリメラーゼ
には３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は認められな
い。Tth ＤＮＡポリメラーゼを、プルーフリーディング
活性を有する少量の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば
テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litorali
s）、ピロコッカス（Pyrococcus）種ＧＢ−Ｄまたはテ
ルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）からのＤ
ＮＡポリメラーゼと組み合わせることにより、プルーフ
リーディング活性が加えられる。それらのＤＮＡポリメ
ラーゼはいずれも低濃度で、Tth ＤＮＡポリメラーゼを
使ったＰＣＲにより増幅可能な標的サイズの範囲を拡大
するのに効果的である。しかしながら、TthＤＮＡポリ
メラーゼとTli ＤＮＡポリメラーゼの組合せが最も確実
で且つ効率的であることがわかった。
【００４８】最適濃度比は、高コピー数試料（50μl 反
応液中の標的コピー数≧107 ）からの増幅には、2 〜2.
5 ＵのTth ＤＮＡポリメラーゼにつき約0.015 〜0.15Ｕ
のTli ＤＮＡポリメラーゼである。低コピー数試料（50
μl 反応液中の標的コピー数≦104 ）からの増幅には、
最適濃度比は0.8 〜１ＵのTth ＤＮＡポリメラーゼにつ
き約0.015 〜0.15ＵのTli ＤＮＡポリメラーゼである。
より高濃度のTli ＤＮＡポリメラーゼは、おそらくプラ
イマー分解のため、収率を減少させる。
【００４９】補助溶剤 グリセロールのような補助溶剤は、長鎖標的の効率的増
幅に重要な反応成分である。多数の補助溶剤がＰＣＲを
促進させると報告されている。それらにはグリセロー
ル、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリエチレングリ
コールおよびホルムアミドが挙げられる。補助溶剤が長
鎖標的の増幅効率に影響を及ぼし得る１つの作用は、Ｄ
ＮＡポリメラーゼの耐熱性を増加させることによるもの
である。耐熱性の増加は、繰り返される高温変性段階の
間のＤＮＡポリメラーゼ活性の損失を遅らせる。
【００５０】もう１つの作用は、補助溶剤が融解および
鎖分離温度を効果的に低下させ、かくして鋳型の変性を
促進しそしてプライマーアニーリングの特異性を増大さ
せることである。例えば、10％グリセロールの添加によ
って融解温度を2.5 〜3 ℃下げることができる。従っ
て、補助溶剤の添加により、変性温度を上昇させる（こ
れは後述するように、同時に標的分子の分解を増加させ
るであろう）ことなく、標的変性の完全性を増大させる
ことができる。
【００５１】標準的Tth ＰＣＲ緩衝液は典型的には５％
(v/v) グリセロールを含有する。増幅反応液に添加され
るグリセロール量の増加は、長鎖標的配列の増幅を有意
に改善することができる。標準的Tth ＰＣＲ緩衝液に５
％(w/v) グリセロールを補足することから、9.4 kb標的
の収率の有意な増加が得られる。下記に記載する百分率
は、使用する様々な酵素原液からのグリセロール寄与を
含まない。
【００５２】DMSOは、好ましくは約５〜６％(v/v) の濃
度で単独で使用することもできる。しかしながら、長鎖
標的にはグリセロールとDMSOの併用がより効果的であ
る。好ましい濃度組合せは５〜14％(w/v) グリセロール
と0.5 〜５％(v/v) DMSOを含む。例えば、１〜３％(v/
v) DMSOと10％グリセロールの組合せにより、またはと
もに５％の両補助溶剤を使うことにより、長さ25〜34 k
b のファージλ標的の増幅が増強された。長さ35〜42 k
b のファージλ標的の増幅は、８〜９％グリセロールと
５％DMSOの組合せにより最も増強された。更に、３％DM
SOと10％グリセロールの組合せにより、34 kb までの標
的が10分の伸長時間で容易に増幅され；１％DMSOと10％
グリセロールの組合せでは、増幅は26 kb の標的に制限
された。好ましい組合せは10％グリセロールと2.25％DM
SOから成る。
【００５３】DMSOは、グリセロールとは異なり、ポリメ
ラーゼの耐熱性を減少させる。しかし、10％DMSOにつき
5.5 〜6 ℃の融解および鎖分離温度の低下は、長鎖ＰＣ
Ｒにおいて優勢な効果となることができる。DMSOの添加
はまた、脱プリンおよび／または鎖切断の速度を減少さ
せることによりＤＮＡの安定性も増大させ、そして鎖の
復元を加速させ得る。グリセロールとDMSOの組合せによ
る融解および鎖分離温度の減少は、通常、単独での各成
分の効果を加算することによって概算された全減少量と
一致する。上述したような補助溶剤の添加による融解お
よび鎖分離温度の効果的低下から生じる収率の増加は、
ＰＣＲ中の変性またはアニーリング温度を上昇させるこ
とにより容易に再現できるものではない。
【００５４】緩衝液 増幅混合物のpHは鋳型ＤＮＡの安定性に影響を与える。
反応液のpHを増加させると、熱サイクル中の鋳型ＤＮＡ
の分解を減少させることができる。ＰＣＲ増幅混合物は
pH緩衝化されるが、典型的なＰＣＲ反応のpHは、反応緩
衝液の温度依存性のために温度サイクル中で相当異な
る。典型的なＰＣＲで使われる緩衝剤はTrisであり、こ
れは１℃あたり-0.031のΔpKa を有する。より小さなΔ
pKa を有する緩衝剤を使うことによって温度サイクル中
のpHの変動を小さくすることができる。
【００５５】２つの適当な緩衝液は、１℃あたり-0.021
のΔpKa を有するトリス（ヒドロキシメチル）メチルグ
リシン〔トリシン〕と、１℃あたり-0.018のΔpKa を有
するＮ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）グリシン〔バイ
シン〕である。両数値は20℃と0.1 Ｍイオン強度にて測
定したものである（GoodおよびIzawa, 1972, Meth. Enz
ymol. 24, Part B: 53-68 を参照のこと）。トリシン緩
衝液とバイシン緩衝液のいずれか一方を使うと、典型的
なTris緩衝液を使った時よりも高温反応条件中でpHが高
いままであり、温度サイクルから生じるpHの変動が減少
する。
【００５６】最適の緩衝液およびpHは、中でも特に、使
用するＤＮＡポリメラーゼに依存する。Tth ＤＮＡポリ
メラーゼを使う場合、pH 8.5〜8.9 （25℃）において10
〜50mM 、好ましくは20〜50 mM のトリシンから成る緩
衝液が最も確実な結果を提供する。最適緩衝液条件は特
定の標的の増幅に対して経験的に決定することが必要か
もしれない。
【００５７】二価カチオン ＤＮＡの増幅に好ましい二価カチオンはMg2+である。
３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を添加しない時に
は、長鎖ＰＣＲは1.7 〜2 mMの全Mg2+濃度で増強され
る。しかしながら、プルーフリーディング活性の存在下
では、0.9 〜1.3 mMの全Mg2+において最大収率が得られ
る。Mg2+濃度を1.5 mMに増加させ、同時に全酵素濃度、
特に第一ポリメラーゼ濃度を減少させる（1.25〜2 Ｕの
Tth ＤＮＡポリメラーゼに）ことにより、幾つかの標的
の収率を増加させることができる。しかし、ある標的で
は、高いMg2+濃度で非特異的生成物の合成を減らすため
に全酵素濃度を減少させることは、生成物の収率を減少
させる場合がある。後述のＫ+ 濃度と同様に、各系での
最適Mg2+は経験的に決定することが必要かもしれない。
【００５８】一価カチオン 好ましい一価カチオンは、KOAc（酢酸カリウム）または
KCl として供給されるＫ+ である。長鎖標的分子の増幅
には、低いＫ+ 濃度が有益である。KCl としてよりもKO
AcとしてＫ+ が供給された方が非特異的バックグラウン
ドを減少させることができる。一般に、長鎖ＰＣＲには
標準レベル（Tth ＤＮＡポリメラーゼと共に使う場合10
0 mM KCl）よりも10〜40％下げたＫ+ 濃度が好ましい。
Tth ＤＮＡポリメラーゼと共に使う場合の好ましい濃度
は、60〜100 mM KOAc 、好ましくは65〜85 mM KOAcであ
る。最適濃度範囲は系に依存するだろう。
【００５９】トリシンまたはバイシン（bicine) 緩衝液
を使ったＰＣＲ増幅の効率は、一価カチオンとしてKCl
またはKOAcのいずれを使っても同様である。しかしなが
ら、トリシン／KOAc緩衝液を使うと改善された反応耐久
性が実現される。トリシン／KOAc緩衝液はトリシン／KC
l 緩衝液よりもわずかに低いイオン強度を有し、これが
高Ｇ＋Ｃ含量を有する鋳型の二次構造を不安定にするの
を助け、それにより標的変性の完全性を改善することが
できる。
【００６０】KCl とKOAcは好ましい一価塩であるけれど
も、他の一価塩も本発明の方法に有用かもしれない。そ
れらとしてはNaCl, (NH4)2SO4,グルタミン酸カリウムＫ
および酢酸アンモニウムが挙げられる。
【００６１】プライマー プライマー濃度は、各系やおよその出発鋳型コピー数ご
とに最適化する必要があるかもしれない。例えば、下記
実施例に記載のファージλ増幅反応では、高コピー数の
標的を含む試料を増幅させるには、低コピー数の標的を
含む試料を増幅させるのに最適であった濃度よりも高い
プライマー濃度が最適であった。高コピー数反応（標的
コピー数≧107 ）では、最適プライマー濃度は各プライ
マー0.4〜0.5 μＭであった。
【００６２】低コピー数増幅（標的コピー数≦104 ）で
は、プルーフリーディング活性の不在下では各プライマ
ー0.15〜0.2 μＭが最も効率的であり、そして３′→
５′エキソヌクレアーゼ活性の存在下では各プライマー
0.2 μＭが最善であった。中程度のコピー数の反応で
は、プライマー濃度を0.2 μＭ以上に増加させること
が、上述したようなＤＮＡポリメラーゼ濃度を増加させ
るのと少なくとも同じくらい収率の向上に効果的であっ
た。長さ42 kb までの標的核酸配列の増幅を可能にする
改善されたＰＣＲプロトコールを下の第１表に要約す
る。
【００６３】第１表：長鎖ＰＣＲ最適条件 温度プロフィール 25〜40の増幅サイクル（鋳型コピー数に依存） ２つの温度の循環： (a) 短い変性段階（例えば94℃で10〜15秒） (b) 長いアニーリング／伸長段階（例えば最初は68℃で
10〜14分、次いで少なくとも５〜８サイクルに渡りサイ
クル毎に15〜20秒ずつ増加させる） 72℃で少なくとも10分間最終保持する。
【００６４】ホットスタート 全ての試料が75〜80℃に達するまで、好ましくはワック
ス遮断膜を使って試薬（Mg2+, 酵素またはdNTPs ）を隔
離する。 第一ポリメラーゼ 高コピー数鋳型（≧107 コピー）には50μl につき2.5
単位のTth ＤＮＡポリメラーゼ 低コピー数鋳型（≦104 コピー）には50μl につき0.8
〜1.0 単位のTth ＤＮＡポリメラーゼ
【００６５】３′→５′エキソヌクレアーゼ（高または
低コピー数鋳型） 50μl につき0.015 〜0.15単位のTli ＤＮＡポリメラー
ゼ 補助溶剤 ５〜14％グリセロールと0.5 〜５％ DMSO 緩衝液 20〜50 mM トリシンまたはバイシン, pH 8.5〜8.9 二価カチオン 0.9 〜1.5 mMの全Mg2+ ; 0.2 mM の変化が重大となり得
る。 一価カチオン 65〜85 mM KOAc
【００６６】プライマー設計 比較的高いアニーリング温度の使用を可能にするため
に、50〜60％のＧＣ含量を有する20〜23 bp 、またはよ
り長い配列のいずれか。 プライマー濃度 高コピー数鋳型（≧107 コピー）には0.4 〜0.5 μＭ 低コピー数鋳型（≦104 コピー）には0.15〜0.2 μＭ dNTP濃度 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各0.2 mM
【００６７】一般に、試料中の核酸はＤＮＡであり、最
も普通にはゲノムＤＮＡであろう。しかしながら、本発
明は他の核酸、例えばＲＮＡまたはクローン化ＤＮＡを
使って実施することもでき、試料中の核酸は一本鎖であ
っても二本鎖であってもよく、いずれも本発明の目的に
適当である。当業者は核酸の性質が何であるにせよ、本
発明の方法の適当な変形を使って核酸を増幅することが
できる。
【００６８】ＰＣＲ法を使うと莫大な増幅が可能なた
め、高いＤＮＡレベルを有する試料から、正の制御の鋳
型からまたは以前の増幅からの低レベルのＤＮＡ持越物
は、目的をもって添加される鋳型ＤＮＡの不在下でさえ
も、ＰＣＲ生成物を生成し得る。可能なら、ＰＣＲ生成
物分析や試料調製から離れた領域で全反応混合物が用意
される。ＲＮＡ／ＤＮＡ調製、反応液の混合および試料
分析には専用のまたは使い捨ての容器、溶液およびピペ
ット（好ましくは容量ピペット）の使用が相互汚染を最
少にするだろう。Higuchi および Kwok, 1989, Nature
339:237-238 並びにKwokおよびOrrego（Innis 他編）,
1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applic
ations, Academic Press, Inc., San Diego, CA も参照
のこと。
【００６９】前の反応からの増幅された核酸によるＰＣ
Ｒの汚染の問題を削減するための酵素的方法はＰＣＴ特
許公報WO 92/01814 と米国特許第5,035,996 号に記載さ
れている。この方法は、前の反応からの増幅されたＤＮ
Ａの酵素的分解を可能にする。ＰＣＲ増幅がdTTPの代わ
りにdUTPの存在下で実施される。ウラシルを取り込んだ
生成した二本鎖増幅生成物はウラシル−Ｎ−グリコシラ
ーゼ（ＵＮＧ）による分解を受け、一方で通常のチミン
含有ＤＮＡはＵＮＧにより分解されない。
【００７０】増幅反応混合物は増幅前にＵＮＧで処理さ
れ、標的として働き得るウラシル含有ＤＮＡが全て分解
される。ウラシル含有ＤＮＡの唯一の源は前の反応の増
幅生成物であるため、この方法は前の反応からの汚染の
問題（持越し）を効果的に取り除く。ＵＮＧは熱により
一次的に不活性になるため、増幅手順の中の変性段階が
ＵＮＧを不活性化するためにも役立つ。従って、新しい
増幅生成物は、ウラシルを含んでいても、ＵＮＧ不活性
化環境の中で形成されるので分解されない。
【００７１】増幅生成物の分析は、所望する情報に依存
して様々な手法により達成することができる。増幅生成
物のヌクレオチド配列は、標準技術、例えばInnis ら,
1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9436-9440により記
載されたプロトコールを使って得ることができる。ＰＣ
Ｒ増幅生成物は直接的に（Saiki ら, 1988, Science23
9: 487-491）または該生成物をまずクローニングしそし
て適当な宿主細胞中でそれらを複製することにより間接
的に配列決定することができる。
【００７２】増幅された核酸配列は当業界で公知の方法
により検出・精製することができる（Sambrookら, 198
9, 前掲）。増幅された核酸を精製するのに、サイズに
従って分子を分離する方法、例えばゲル電気泳動法を使
うことができる。特に、アガロースおよび／またはアク
リルアミドゲル電気泳動が増幅生成物の分析手段として
好ましい（Scharfら, 1986, Science 233: 1076-1078を
参照のこと）。より大きなサイズ分離には、実施例に記
載するような、フィールドインバージョンゲル電気泳動
または低濃度（0.3 ％）アガロースゲル電気泳動を使う
ことができる。
【００７３】増幅生成物は、例えば臭化エチジウムで染
色することにより、電気泳動的にサイズ分画した生成物
の直接目視により検出することができる。あるいは、標
的配列に相補的であるオリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーションプローブを使って増幅生成物を検出すること
ができる。適当なハイブリダイゼーション条件下では、
プローブは標的核酸配列にのみハイブリダイズする。様
々な手段により検出することができるハイブリッド二重
鎖の存在が、増幅生成物の存在を示す。
【００７４】プローブと標的核酸配列との間で形成した
ハイブリッド二重鎖の検出を促進するために、プライマ
ーまたはプローブのいずれかを追加の分子、例えば検出
可能な標識または該プライマーもしくはプローブの固定
化を可能にする分子に結合させることができる。検出ま
たは固定化を可能にするためにプローブ中に組み込まれ
る標識は、該プローブのハイブリダイゼーション特性に
影響を与えてはならない。
【００７５】プローブは、分光学的、光化学的、生化学
的、免疫化学的または化学的手段により検出可能な標識
を含めることにより、標識することができる。有用な標
識としては、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素
（ELISA において汎用されるようなもの）、ビオチンま
たはハプテン、および、抗血清またはモノクローナル抗
体が入手できるタンパク質が挙げられる。プローブは該
プローブを固体支持体上に固定化するのに使われる追加
の化合物に結合させることもできる。
【００７６】標識プローブは、オリゴヌクレオチドを合
成するための上述の技術を使って合成しそして標識する
ことができる。例えば、プローブを32Ｐ−ＡＴＰおよび
キナーゼと共にインキュベートすることにより５′末端
で標識することができる。ＳＳＯプローブに適当な非放
射性標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であ
る。この標識を含むプローブの調製および検出方法は米
国特許第4,914,210 号および同第4,962,02号明細書中に
記載されている。そのような標識プローブの使用法も米
国特許第4,789,630 号明細書；Saiki ら, 1988, N. En
g. J. Med. 319:537-541およびBugawan ら, 1988, Bio/
Technology 6: 943-947に記載されている。ＨＲＰ標識
プローブの検出のための有用な色原体としては赤色ロイ
コ色素と３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ）が挙げられる。
【００７７】プローブの固定化を可能にするためにプロ
ーブ中に組み込まれる追加の化合物の例として、照射
（ＰＣＴ特許公報第89/11548号においてより詳細に記載
されている技術）によりナイロン支持体に固定させるこ
とができる長鎖ポリｄＴ「末尾」を挙げることができ
る。試料中の標的核酸とプローブとの間で形成されたハ
イブリッドを検出するための適当なアッセイ方法は当業
界で公知である（Sambrookら, 1985, 前掲を参照のこ
と）。その例としてドットブロットおよび逆ドットブロ
ットアッセイ方式が挙げられる。
【００７８】ドットブロット方式では、増幅された未標
識の標的ＤＮＡを固体支持体、例えばナイロン膜上に固
定化する。そして膜−標的複合体を適当なハイブリダイ
ゼーション条件下で標識プローブと共にインキュベート
し、適当に緊縮の条件下で洗浄することによりハイブリ
ダイズしなかったプローブを除去し、結合したプローブ
の存在について膜をモニタリングする。
【００７９】別の形式は「逆」ドットブロット方式であ
る。この方式では、増幅された標的ＤＮＡを標識し、そ
してプローブを固体支持体、例えばナイロン膜上に固定
化する。標的ＤＮＡは典型的には標識されたプライマー
の取り込みにより増幅の間に標識される。膜−プローブ
複合体を適当なハイブリダイゼーション条件下で標識さ
れた試料と共にインキュベートし、適当に緊縮の条件下
での洗浄によりハイブリダイズしなかった試料を除去
し、そして結合した標的ＤＮＡの存在について膜をモニ
タリングする。
【００８０】あるいは、複数のプローブハイブリダイゼ
ーション部位またはウエルを有する固体支持体を使って
逆ドットブロットアッセイを実施することができる。例
えば、本発明の方法の大規模臨床応用にはマイクロウエ
ルプレートが特に有用である。マイクロウエルプレート
を使った逆ドットブロットアッセイは Loeffelholz,199
2, J. Clin. Microbiol. 30(11):2847-2851中に記載さ
れている。プローブは受動結合によるかまたはまずマイ
クロウエルプレートに付着するウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）にプローブを結合させることにより、マイクロウ
エルプレートに固定化することができる。
【００８１】別の適当なアッセイ系は米国特許第 5,21
0,015号に記載されており、この場合にはＰＣＲ増幅工
程の最中に標識プローブが添加される。このプローブ
は、該プローブがＤＮＡ合成のプライマーとして作用し
ないようにするために変更されている。各合成段階の間
に標的ＤＮＡにハイブリダイズしたプローブは、ＤＮＡ
ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性によ
って分解される。次いで該プローブからの分解生成物が
検出される。かくしてプローブ分解生成物の存在は、プ
ローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションが起こ
ったことを示す。
【００８２】本発明は、本発明の方法を実施するための
有用な成分を含んで成る多容器ユニットであるキットに
関する。このキットは、本明細書中に記載の濃度比にお
いて好ましいポリメラーゼ酵素の組合せを含有するだろ
う。有用なキットの中に含めることができる追加の成分
としては、ＰＣＲ増幅用のプライマーおよび本発明のＰ
ＣＲ法を実施するための試薬がある。
【００８３】10〜40 kb の配列を増幅できることは、ゲ
ノム地図作成、配列決定および遺伝学などの領域におい
て多くの応用が可能である。分子クローニングに対して
目下抵抗すると思われるゲノム地図中の小さなギャップ
は、既知隣接配列の間の配列の増幅により接近すること
ができる。より長い標的の増幅は、問題となる配列、例
えば後述のβ−グロビン遺伝子系中に見つかる配列、を
避けるようにプライマーを選択することにおいてより大
きな融通性も与えるだろう。
【００８４】長鎖標的は、各配列決定段階によってカバ
ーされる距離を増加させることにより、ゲノム配列決定
工程の速度を早めることを約束する。既知の発現された
配列から、より長いイントロンに及ぶ増幅を実施するこ
とができ、また、より完全な遺伝子配列を一度で増幅さ
せることができる。従って、長鎖ＰＣＲは迅速な広範囲
の配列決定のための科学技術を補う。また、4 kb以上の
多数の医学上重要な挿入および欠失の同型接合体キャリ
ヤーと異型接合体キャリヤーの両方について、ＰＣＲに
基づいた特徴づけと診断が可能だろう。
【００８５】本明細書中に与えられる結果は、詳しく
は、それらのプロトコールをクローン化配列の特徴づけ
に応用できることを証明する。後述のＪおよびcro 遺伝
子プライマーであるCF1018（配列番号23）とCF1019（配
列番号24）は、λ系ベクターを使ってクローニングされ
たほぼ全ての挿入断片について、プラークからの増幅と
単離されたＤＮＡからの増幅の両方に有用であろう。Ｐ
ＣＲ生成物は制限消化により容易に分析することがで
き、配列決定に適するだろう。コスミド挿入断片もコロ
ニーから増幅させることが可能である。長鎖ＰＣＲは、
低コピー数挿入材料を増幅させることによって分子クロ
ーニングを促進し、ＰＣＲに基づいた突然変異誘発にお
ける大型の組換え構成物の構築を容易にするだろう。
【００８６】下記に与える本発明の実施例は例示目的で
のみ提供され、本発明の範囲を制限するためではない。実施例１：材料と方法 長鎖λファージおよびヒトβ−グロビン遺伝子クラスタ
ー配列のＰＣＲ増幅のための好ましいプロトコールと試
薬を下記に記載する。下記方法を使った増幅の結果はそ
の後の実施例に記載する。
【００８７】標的核酸配列 後述の増幅プライマーの設計のために２つの鋳型核酸配
列、すなわちλファージゲノムの配列（GenBank 呼出番
号M17233）とヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの配列
（GenBank 呼出番号J00179）を使った。後述の増幅には
λファージとヒトＤＮＡを使った。
【００８８】λＤＮＡ（１ng／μl ）はPerkin Elmer
社, Norwalk, CT から入手した。λＤＮＡのアリコート
（〜100 ng）を一度解凍し、次いで４℃で保存した。ヒ
ト胎盤からの全ゲノムＤＮＡはSigma Chemical社, St L
ouis, MOから入手した。全ての鋳型ＤＮＡ希釈液は 10
mM Tris-Cl (25℃でpH 8), 0.1 mM EDTAを使って作製し
た。
【００８９】λ FIX II 中のヒトゲノムクローンのライ
ブラリーをStratagene社, La Jolla, CAから入手し、そ
れを製造業者により推奨される通り、トップアガロース
を有するLuria ブロス寒天平板上で増殖させた。無作為
選択したプラークをシリコン処理済のパスツールピペッ
トを使って取り出し、30μl の25 mM Tris-Cl (pH 8.
3), 10 mM MgCl2 中に置き、４℃で保存した。１μl の
アリコートをＰＣＲに使った。
【００９０】リンパ芽球様細胞系(KAS011B）からの全ゲ
ノムＤＮＡを、10 mM Tris-Cl (pH8), 150 mM NaCl お
よび10 mM EDTA中50℃にて一晩、0.1 mg/ml のプロテイ
ナーゼＫと0.5 ％ＳＤＳを使って単離した。Tris飽和フ
ェノール(pH 8)での抽出およびNaOAc でのエタノール沈
澱後、試料をＲＮアーゼＡで処理し、次いでフェノール
−クロロホルムで抽出し、そして10 mM Tris-Cl (pH
8), 1 mM EDTA に対して透析した。
【００９１】プライマー サイズが長さ1.5 〜42.2キロ塩基に及ぶλゲノム標的配
列のＰＣＲ増幅を可能にするように１セットのプライマ
ーを設計した。上流プライマーは、１〜３キロ塩基の割
合で長さが増加する一連の標的配列をもたらす下流プラ
イマーの各々と共に使えるように設計した。
【００９２】このセットの各プライマーは、プライマー
と標的配列との間で形成されるハイブリッド二重鎖が12
個のＧ−Ｃ対と８〜11個のＡ−Ｔ対の全体組成を有する
ような長さ20〜23塩基対のプライマー配列を選択するこ
とにより、ほぼ同じ最適アニーリング温度（〜68℃）を
有するように設計した。最適アニーリング温度は、Wu
ら, 1991, DNA Cell Biol. 10:233-238の「ＴP 」アル
ゴリズムを使って評価した。
【００９３】追加のプライマー対としてのＪおよびcro
遺伝子プライマーは、プラークまたは単離されたＤＮＡ
のいずれかからの、λ系ベクターを使ってクローニング
されたほぼ全ての挿入断片の増幅を可能にするように設
計され、下記の第２表に示される。同様に、ヒトβ−グ
ロビン遺伝子クラスターの領域の増幅のためのプライマ
ーも設計した。これらのプライマーは、固定した下流プ
ライマーを一連の上流プライマーと共に使用して7.5 〜
22 kb の標的を増幅できるように設計した。これらのプ
ライマーは、δ−グロビン遺伝子を越えた上流からＡ−
γグロビン遺伝子の第二イントロン中までに及ぶ標的領
域を増幅させる。
【００９４】次の実施例において使用するプライマーの
ヌクレオチド配列を下記の第２表に示す（５′→３′方
向で）。融解温度（Ｔm ）は、本質的には Wetmur, 199
1, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259に記載
された通りに算出した。融解温度の計算は、２つの懸垂
末端、3.5 μg/ml（〜0.5 μM ）プライマー、80 mMNa
+ および 1.5 mM Mg2+を仮定して行った。算出された融
解温度は63〜70℃の範囲であった。10％グリセロールの
添加はＴm を2.5 ℃減少させる。鋳型ＤＮＡ配列の中の
潜在的な二次プライミング部位、並びにプライマー間お
よびプライマー内の配列相補性について、Oligo 4.0 ソ
フトウエア（National Biosciences社,Plymouth, MN）
を使ってプライマーヌクレオチド配列を評価した。
【００９５】
【表１】
【００９６】プライマーは、シアノエトキシホスホルア
ミダイト法（１μＭスケール）を使って394 ＤＮＡ合成
装置（Applied Biosystems社, Foster City, CA ）上で
合成した。該プライマーを29％ NH3／H2O 中で脱保護し
て樹脂から解離させ、次いでSephadex G25（Pharmacia
LKB 社, Piscataway, NJからのNAP-10カラム）を使って
脱塩した。各々の合成の結果をポリアクリルアミドゲル
電気泳動により評価した。全てのプライマー原液は 10
mM Tris-Cl（25℃でpH 8）, 0.1 mM EDTA を使って作製
した。
【００９７】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ 組換えTth ＤＮＡポリメラーゼ（rTth）はPerkin Elmer
社, Norwalk, CT から購入した。Tli ＤＮＡポリメラー
ゼは米国特許第 5,210,036号明細書中に記載されてい
る。Tli ＤＮＡポリメラーゼ（VentR ；登録商標）とピ
ロコッカス種ＧＢ−ＤからのＤＮＡポリメラーゼ（ Dee
p VentR ；登録商標）はNew England Biolabs 社, Beve
rly, MA から購入した。Tma ＤＮＡポリメラーゼは国際
特許公報WO92/03556 に記載されており、そこにはpTma1
2-3と命名されている。テルモトガ・マリチマからの変
形ＤＮＡポリメラーゼ(UlTma；商標）はPerkin Elmer
社, Norwalk, CT から市販されている。
【００９８】VentR および Deep VentR ＤＮＡポリメラ
ーゼの希釈液（1/5 および1/10）は、好ましくは各製造
業者により記載されたような保存緩衝液中に作製され
る。しかしながら、下記実施例で使用するVentR 希釈緩
衝液は、0.1 ％Triton X-100の代わりに1 mM EDTA と0.
05％Tween 20 (Sigma Chemical社, St Louis, MO) を含
んだ。この変更は増幅反応に何も影響を与えなかった。
VentR ポリメラーゼ希釈液は毎週新しく調製した。 Dee
p VentR ポリメラーゼは使用直前に希釈した。ポリメラ
ーゼは製造業者により供給される rTth ＤＮＡポリメラ
ーゼ保存緩衝液〔100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.
0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％ TweenR20, 50％(v/
v) グリセロール〕中で保存することもできる。
【００９９】追加の緩衝液成分 ＰＣＲ用の標準的Tth ポリメラーゼ緩衝液〔５％(v/v)
グリセロール, 10 mMTris-Cl (pH 8.3), 100 mM KCl,
0.75 mM EGTA, 0.05％Tween 20〕はPerkin Elmer社, No
rwalk, CT から入手した。1.0 Ｍのトリシン緩衝液原液
（Sigma Chemicals 社, St Louis, MO）は、KOH により
その最終pH（25℃での）に調整した。分子生物学用ジメ
チルスルホキシド（DMSO）とグリセロールは、それぞれ
Sigma Chemicals 社, St Louis, MOとJ.T. Baker Chemi
cals社, Phillipsburg, NJから入手した。酢酸カリウム
(KOAc)もJ.T. Baker Chemicals社から入手した。本明細
書中に記載のいずれのＰＣＲ緩衝液について与えたグリ
セロール濃度には、酵素保存緩衝液からのグリセロール
の寄与（典型的には≦１％）は含まれなかった。
【０１００】ＰＣＲ法 λゲノムＤＮＡ増幅はいずれも、個々に蓋が付いたMicr
oAmpTM管を使って、 GeneAmp（登録商標）PCR System 9
600 熱循環器中で行った（これらはPerkin Elmer社, No
rwalk, CT から販売されている）。反応容量は50μl か
100 μl であった。各dNTPの濃度は全反応について0.2
mMであったが、他の反応成分は明細書中に記載され第１
表に示される通り異なっていた。
【０１０１】非特異的配列の増幅やプライマー二量体の
形成を最少にするために、試料を熱循環器中で75〜80℃
で〜90秒間インキュベートし終わるまでMg2+を加えない
でおくという手動の「ホットスタート」を実施した。次
いで必要なMg2+を25 mM 原液から添加した（室温で）。
Mg2+の添加後、更に30〜60秒間試料をインキュベート
し、結果として最初の変性段階前に75〜80℃で合計４〜
７分間インキュベートした。この合計時間はMg2+の添加
に要する時間も含み、従って試験管の総数に依存する。
別の「ホットスタート」法は実施例６に記載される。
【０１０２】２段階の温度プロフィールを実行するよう
に熱循環器をプログラミングした。各増幅サイクルは、
94℃で10秒間の変性段階に続き68℃で５〜20分間のアニ
ーリングと伸長段階から成った。15秒の変性段階も使う
ことができる。12〜14分よりも長いアニーリングと伸長
時間については、熱循環器の自動延長特性を使ってサイ
クル毎に15〜20秒を追加し最終的に〜16〜22分までにし
た。反応は25〜40サイクル実施し、これは出発標的配列
のコピー数、標的の長さおよび反応条件に依存した。大
部分の反応には、94℃での最初の10秒間インキュベーシ
ョン段階と72℃での最後の10分間インキュベーション段
階が含まれた。
【０１０３】次の実施例に記載される、λ FIX II 中に
クローニングされたヒトゲノム挿入断片の増幅とヒトβ
−グロビン遺伝子クラスターの一領域の増幅は、本質的
には上述した通りに実施したが、下記に指摘する変形を
伴った。100 μl の反応容量におけるプラーク懸濁液か
らのλ FIX II 中にクローニングされたヒトゲノム挿入
断片の増幅のための特別条件は次の通りであった。
【０１０４】 25 mM トリシン（pH 8.7） 85 mM KOAc 12％(w/v) グリセロール 0.2 mM 各dNTP 0.4 μM 各プライマー 1.75Ｕ Tth ポリメラーゼ 0.02Ｕ Tli ポリメラーゼ 1.15 mM Mg(OAc)2
【０１０５】上述のような２段階熱循環プロフィールと
共に80℃ホットスタートを使用した。アニーリングと伸
長段階は最初は68℃で12分であり、次いで32サイクルに
渡りサイクル毎に15秒ずつ延長した。
【０１０６】50μl の反応容量における37 ng の KAS01
1 ＤＮＡからのヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの一
領域の増幅のための特別条件は次の通りであった。 20 mM トリシン（pH 8.7） 85 mM KOAc 10％(w/v) グリセロール ２％(v/v) DMSO 0.2 mM 各dNTP 0.2 μM 各プライマー 0.9 Ｕ Tth ポリメラーゼ 0.02Ｕ Tli ポリメラーゼ 1.1 mM Mg(OAc)2
【０１０７】上述のような２段階熱循環プロフィールと
共に78℃ホットスタートを使用した。アニーリングと伸
長段階は最初の12サイクルは68℃で12分であり、次いで
24サイクルに渡りサイクル毎に15秒ずつ延長した。増幅
反応に500 μg/mlの非アセチル化ＢＳＡを添加すること
により、増幅生成物の収率の増加を得ることができる。
【０１０８】ＰＣＲ生成物の分析 典型的には、各ＰＣＲ増幅からの５〜８μl を、0.5 μ
g/mlの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ（89 mM Tr
is塩基, 89 mM ホウ酸, １μM 〜2 mM EDTA ）または１
×ＴＡＥ（40 mM Tris酢酸塩, 2 mM EDTA, pH 8-8.5 ）
中の0.6 ％(w/v) SeaKem GTGアガロース（FMC BioProdu
cts 社, Rockland, ME）から成る標準的な水平ゲル上で
約４〜６Ｖ／cmで1.5 〜２時間分析した。より大きなサ
イズの分離には、２つの別法を使った：フィールドイン
バージョンゲル電気泳動と0.3 ％アガロースゲル電気泳
動。
【０１０９】フィールドインバージョンゲル電気泳動
（FIGE）は、Hoeferシステム（SuperSubゲル装置、Swit
chbackパルス制御装置および電源；いずれもHoefer社,
San Francisco, CA 製）と冷却装置（Pharmacia LKB 社
製の2219 Multitemp II ）を使って実施した。各ＰＣＲ
増幅からの３〜７μl を0.5 ×ＴＢＥ（１μM EDTAで）
中で0.95％アガロースのFIGEゲル上で分析した。FIGEゲ
ルは 110Ｖで15分間予備泳動しておき、次いで0.65〜1.
95秒または0.75〜2 秒のパルス時間を使って（正：逆＝
2.8:1 または 3:1）、140 〜145 Ｖにて22〜25時間泳動
した。
【０１１０】あるいは、１×ＴＡＥ中で0.3 ％Chromoso
mal Grade アガロース（Bio-Rad 社, Richmond, CA）ま
たはSeakem GTGもしくはGold（FMC BioProducts 社, Ro
ckland, ME）上に２〜５μl を負荷した。ゲルを４℃に
冷却してからコームを取り外した。５〜８μl の試料を
負荷し、0.5 ％臭化エチジウムを含む１×ＴＡＥ中で10
0 Ｖにて２分間泳動し、次いで1.5 Ｖ／cmで６時間かま
たは0.7 Ｖ／cmで16時間のいずれかで泳動した。
【０１１１】増幅生成物のサイズは、試料と同時に各ゲ
ル上で泳動した分子量マーカーとの比較により決定し
た。使用した分子量マーカーは、New England Biolabs
社またはGibco BRL 社のいずれかのλ／HindIII 、New
England Biolabs 社のλ／単切断混合物、およびGibco
BRL 社の1 kb梯子状分子であった。
【０１１２】制限分析用には、電気泳動前に、製造業者
の緩衝液を使って、λＤＮＡ増幅からのＰＣＲ増幅生成
物のアリコート（10〜16μl ）をBclI, BssHIIおよびMl
uI（New England Biolabs 社）；またはBamHI, EcoRIお
よびHindIII （Gibco BRL 社）で消化した。消化は30〜
36μl の反応液中で2.5 〜3 時間行った。試料は0.6〜8
％アガロースゲルを使って分析した。プラークＰＣＲ
試料のアリコート（10〜30μl アリコート）は、40μl
の反応液中でNotI（Stratagene社）で一晩消化した。
【０１１３】実施例２：ファージλゲノム配列の増幅 上記実施例１に記載した通りに、高コピー数（標的コピ
ー数107 〜108 ）ファージλＤＮＡ試料からの標的試料
を使って増幅を行った。上記第２表に列挙されたプライ
マーの様々な組合せにより、この〜50 kb 配列（GenBan
k M17233）内で1.5 〜42.2 kb の標的が限定された。
【０１１４】増幅生成物をフィールドインバージョンゲ
ル電気泳動（FIGE）により分析し、臭化エチジウム染色
によって可視化した。λ／HindIII 分子量マーカーとの
比較により見積もられる全収量（50μl あたり）は、2
2.8 kb 生成物が0.7 〜１μgと39 kb 生成物が0.2 〜0.
3 μg であった。プライマーSC1011（配列番号２）とSC
1024（配列番号22）を使って増幅させた42.2 kb 標的
は、より低収量で増幅された。
【０１１５】実施例３：プラークからのλクローンの増
幅 本発明の方法の１つの重要な利用法は、予備的な実験室
での時間集中的なＤＮＡ単離を行わずに、λクローンか
らの挿入断片を増幅させることである。そのような挿入
断片の増幅に対する本発明の効用を実証するために、λ
のＪおよびcro遺伝子内の配列からプライマーCF1018
（配列番号23）とCF1019（配列番号24）を設計した（第
２表参照）。
【０１１６】増幅は、実施例１に記載のλ FIX II 中の
ヒトゲノムライブラリーから無作為選択したプラークを
使って実施例１に記載の通り実施した。増幅生成物をNo
tIで消化して隣接ベクター配列から挿入断片を分離した
後、ゲル電気泳動により分析した。両方のベクター断片
の存在は、完全な挿入断片が増幅されたことを確証す
る。増幅された挿入断片のサイズは10 kb 未満から20 k
b 以上にまで及んだ。製造業者は、このλベクターによ
り9 〜23 kb の挿入断片サイズが収容されると見積もっ
ている。挿入断片はFIGEゲル中の分子量マーカーに対す
るそれらの移動度によりサイズ決定した。
【０１１７】実施例４：ヒトゲノム標的の増幅 反復配列を含み且つゲノム中のどこかに相同部位を含む
と思われるゲノム標的のモデルとして、ヒトβ−グロビ
ン遺伝子クラスターを選択した。ヒトβ−グロビン遺伝
子クラスター用に設計したプライマーは前記第２表に示
される。固定した下流プライマーを、δ−グロビン遺伝
子を越えた上流からＡ−γグロビン遺伝子の第二イント
ロン中までに及ぶ領域を増幅させる一連の上流プライマ
ーと組み合わせた。実施例１に記載の通りに37 ng （〜
104 コピー）の全ヒトゲノムＤＮＡから13.5, 17.7, 1
9.6および22 kb の標的を増幅させた。増幅生成物の12.
5μl のアリコートをFIGEゲルに負荷した。λ／HindIII
分子量マーカーを比較に使った。
【０１１８】比較のため、同条件下で、それぞれ〜3.7
ngまたは37 ng のヒト胎盤ゲノムＤＮＡバックグラウン
ド中の 0.05 pg（〜103 コピー）または 0.5 pg （〜10
4 コピー）のファージλＤＮＡから、16.5, 18.8, 20.8
および22.8 kb の標的を増幅させた。以前に高投入標的
数から増幅された標的を低投入標的数から増幅させるこ
とにより、投入標的コピー数の減少からくる効果を標的
配列の相違からくる効果と区別することができる。
【０１１９】β−グロビン遺伝子クラスターの長さ22 k
b までの標的配列が増幅された。β−グロビン標的は、
グロビン標的と同じ全体濃度または1/10の濃度のいずれ
かでヒト胎盤ＤＮＡのバックグラウンド中単一コピーレ
ベルで存在した同様な長さのλ配列よりも低効率で増幅
された。それらの効率の差は、たとえλ標的がヒトゲノ
ムバックグラウンド中にあったとしても、相対的な配列
の複雑さを反映するのかもしれない。長鎖標的が二次的
なプライマーアニーリング部位として作用するのに十分
な位相同な部位を含有するであろうという可能性、そし
てヒトゲノム配列中の反復配列の存在は、何故λ標的が
同等な長さのβ−グロビン遺伝子標的よりも効率的に増
幅されたかを説明することができる。
【０１２０】二次的なプライマーアニーリング部位の問
題は、β−グロビン遺伝子標的の増幅用の適当なプライ
マーの選択にも影響を与えた。β−グロビン遺伝子の
５′にハイブリダイズする下流プライマーRH1053（配列
番号32）を選択した。というのは、β−グロビン遺伝子
のエキソン２とハイブリダイズするプライマーRH1016
（配列番号31）は、14 kb よりも長い標的中の二次的部
位にもハイブリダイズして、多重生成物をもたらすから
である。上流プライマーRH1020（配列番号26）は多重の
二次生成物をもたらしたので、RH1020（配列番号26）の
100 塩基以内の他の２つのプライマー（示してない）を
使用した。３つのプライマーは全てAlu 反復配列内にあ
る。
【０１２１】ヒト神経繊維腫症−１遺伝子からの長さ16
kb までの配列の増幅の結果もまた、プライマー特異性
を保証する方法が長鎖標的配列の効率的ＰＣＲ増幅にと
って重要であることを示唆した。
【０１２２】実施例５：ＤＮＡポリメラーゼの組合せ 種々のＤＮＡポリメラーゼ組合せの相対効率を入手する
ために、本質的には上記実施例１に記載の通りに、長さ
22.8, 26.4, 29.9および33.9 kb の標的配列を増幅させ
るプライマーを使って増幅反応を実施した。比較するＤ
ＮＡポリメラーゼ組合せは次の通りであった：
【０１２３】2.5 Ｕ rTth ＤＮＡポリメラーゼ＋0.02Ｕ
VentR ＤＮＡポリメラーゼ 2.5 Ｕ rTth ＤＮＡポリメラーゼ＋0.06Ｕ Deep VentR
ＤＮＡポリメラーゼ 3.15Ｕ rTth ＤＮＡポリメラーゼ＋0.5 Ｕ Tma ＤＮＡ
ポリメラーゼ 全ての反応は50μl 中で、107 コピーのλＤＮＡ、0.45
μM の各プライマーおよび1.0 〜1.1 mM Mg(OAc)2 を使
って実施した。次の特別条件を使って増幅反応を実施し
た。
【０１２４】rTthとVentR （登録商標）ＤＮＡポリメラ
ーゼまたはrTthと Deep VentR （登録商標）ＤＮＡポリ
メラーゼを使う反応は、20 mM トリシン(pH 8.7), 85 m
M KOAc, 10％グリセロールおよび３％DMSO中で実施し
た。rTthとTma ＤＮＡポリメラーゼを使う反応は、20 m
M トリシン(pH 8.7), 85 mM KOAc, 10％グリセロールお
よび 2.5％DMSO中で実施した。
【０１２５】温度循環プロフィールは本質的には実施例
１に記載した通りであった。最初の９サイクルの間は初
期13分伸長時間を使った。次いで伸長時間を13.5分に増
加し、その後の各サイクルでは18サイクルに渡り20秒ず
つ延長した。各反応液の７μl アリコートを150 ngのλ
／HindIII 分子量マーカーと一緒に標準アガロースゲル
上に負荷した。全鋳型（33.9 kb まで）をrTthＤＮＡポ
リメラーゼとVentR , Deep Vent R およびTma ＤＮＡポ
リメラーゼとの組合せを使って増幅させた。2.5 Ｕ rTt
h ＤＮＡポリメラーゼと0.02Ｕ VentR ＤＮＡポリメラ
ーゼとの組合せが最大効率で全標的を増幅させた。
【０１２６】実施例６：ＰＣＲ増幅キット 本発明の試薬は、長鎖標的配列のＰＣＲ増幅を実施する
ためのキットの中に含めるのに適する。キットは少なく
とも本明細書に記載のＤＮＡポリメラーゼ混合物を含有
する。追加の任意の成分としては、後述するような反応
に使われる追加の試薬と反応容器が挙げられる。
【０１２７】高コピー数標的と低コピー数標的の両者を
増幅せしめるのに有用であるＤＮＡポリメラーゼの好ま
しい組合せは、２単位の rTth ＤＮＡポリメラーゼ対0.
08単位のVentR ＤＮＡポリメラーゼの比における rTth
ＤＮＡポリメラーゼとVentRＤＮＡポリメラーゼから成
る。下記に示すように、高コピー数標的の増幅に好まし
いポリメラーゼ濃度は低コピー数標的の増幅に好ましい
濃度の２倍であるけれども、第一ポリメラーゼ対第二ポ
リメラーゼの比は同じである。
【０１２８】キット中に含めるのに適当な反応緩衝液
は、およそ次のような濃度でのトリシン、KOAc、グリセ
ロールおよびDMSOから成る： 25 mM トリシン（pH 8.7） 80 mM KOAc 10％(w/v) グリセロール 2.25％(v/v) DMSO
【０１２９】「およそ」という用語は、標準的な±10％
の製造許容差を包含することを意味する。便宜上、反応
緩衝液を高濃度で保存し、使用前に希釈することができ
る。増幅は本質的には上述した通りの好ましいキット成
分を使って行われるが、ただし後述のような好ましい反
応条件を使用する。それらの試薬および条件を広範囲に
利用したが、長鎖標的配列の確実な増幅を提供すること
がわかった。
【０１３０】反応容量 100μl での低コピー数（例えば
ヒトゲノム）標的（2.0 ×104 コピー）の増加のための
好ましい条件は次の通りである： 25 mM トリシン (pH 8.7) 80 mM KOAc 10％(w/v) グリセロール 2.25％(v/v) DMSO 0.2 mM 各dNTP 0.2 μM 各プライマー ２Ｕ rTth ポリメラーゼ 0.08Ｕ VentR ポリメラーゼ 1.1 mM Mg(OAc)2
【０１３１】低コピー数標的（＞10 kb ）の増幅のため
の好ましい循環パラメーターは次の通りである： 変性 94℃ １分 20サイクル 94℃ 15秒 68℃ 12分 17サイクル 94℃ 15秒 68℃ 12分（15秒ずつの自動延長を伴う） 最終伸長 72℃ 10分 保持 ４℃ 不定
【０１３２】反応容量 100μl での高コピー数（例えば
クローン化ＤＮＡ）標的（2.0 ×10 7 コピー）の増幅の
ための好ましい条件は次の通りである： 25 mM トリシン (pH 8.7) 80 mM KOAc 10％(w/v) グリセロール 2.25％(v/v) DMSO 0.2 mM 各dNTP 0.4 μM 各プライマー ４Ｕ rTth ポリメラーゼ 0.16Ｕ VentR ポリメラーゼ 1.1 mM Mg(OAc)2
【０１３３】高コピー数標的（＞10 kb ）の増幅のため
の好ましい循環パラメーターは次の通りである： 変性 94℃ １分 20サイクル 94℃ 15秒 68℃ 10分 17サイクル 94℃ 15秒 68℃ 10分（15秒ずつの自動延長を伴う） 最終伸長 72℃ 10分 保持 ４℃ 不定
【０１３４】「ホットスタート」は、Hoffmann-La Roch
e 社により開発・製造されそしてPerkin Elmer社, Norw
alk, CT により販売されているAmpliwaxTM PCR Gem 100
ワックスを使って、反応試験管内で試薬を隔離すること
により達成される。緩衝液（トリシン、KOAc、グリセロ
ールおよびDMSO）、Mg(OAc)2およびdNTPを含有する40μ
l の下部試薬層を反応試験管に添加する。この下層の上
にAmpliwaxTM PCR Gem100を添加し、そして熱循環器中
でまず80℃で５分間、次に25℃で５分間インキュベート
することにより、ワックス層を形成させる。
【０１３５】次いで緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ混合
物、プライマーおよび標的ＤＮＡを含有する60μl の上
部試薬層を添加する。試料は上述したように１×ＴＡＥ
と0.5 μg/mlのEtBr中で７Ｖ／cmにて1.5 時間 0.6％ア
ガロースゲル上で分析する。
【０１３６】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GGTGCTTTAT GACTCTGCCG C 21
【０１３７】配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GCTGAAGTGG TGGAAACCGC 20
【０１３８】配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GCTCTTTCCG CTCTGCCATC 20
【０１３９】配列番号：４ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CGGCACTGGC AAGCAACTGA 20
【０１４０】配列番号：５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CCTCAACCGG ATCGAAGGCT 20
【０１４１】配列番号：６ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 AGCGTGACGG TCACACCGTT 20
【０１４２】配列番号：７ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GACTCTGGCC ATCTGCTCGT 20
【０１４３】配列番号：８ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GGACCTATCT GCCCGTTCGT 20
【０１４４】配列番号：９ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GCCACCAGTC ATCCTCACGA 20
【０１４５】配列番号：10 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GCAGCGTGAT TTCACGGTCG 20
【０１４６】配列番号：11 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GCTCACATAA CGTCCACGCA G 21
【０１４７】配列番号：12 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GCCTCGCATA TCAGGAAGCA C 21
【０１４８】配列番号：13 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GGGTGACGAT GTGATTTCGC C 21
【０１４９】配列番号：14 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GGCATTCCTA CGAGCAGATG GT 22
【０１５０】配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GGTCTGCCTG ATGCTCCACT 20
【０１５１】配列番号：16 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GTCGGACTTG TGCAAGTTGC C 21
【０１５２】配列番号：17 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GCATGGATTC TGTCGACCCA C 21
【０１５３】配列番号：18 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GAGAACCACC GAGCCTGATG 20
【０１５４】配列番号：19 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 AGCATTGGCC GTAAGTGCGA TT 22
【０１５５】配列番号：20 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GGCCTTGTTG ATCGCGCTTT GA 22
【０１５６】配列番号：21 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 TGTCACGCCT GCCTGTTGCT T 21
【０１５７】配列番号：22 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GCGTTCCGCA CGAGATACAT G 21
【０１５８】配列番号：23 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 AGAAACAGGC GCTGGGCATC 20
【０１５９】配列番号：24 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CGGGAAGGGC TTTACCTCTT C 21
【０１６０】配列番号：25 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CTGCTGAAAG AGATGCGGTG G 21
【０１６１】配列番号：26 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CTGCAGTCCC AGCTATTCAG G 21
【０１６２】配列番号：27 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CGAGTAAGAG ACCATTGTGG CAG 23
【０１６３】配列番号：28 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 TTGAGACGCA TGAGACGTGC AG 22
【０１６４】配列番号：29 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CCTCAGCCTC AGAATTTGGC AC 22
【０１６５】配列番号：30 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GAGGACTAAC TGGGCTGAGA CC 22
【０１６６】配列番号：31 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CAGCTCACTC AGTGTGGCAA AG 22
【０１６７】配列番号：32 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GCACTGGCTT AGGAGTTGGA CT 22
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年４月１３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正内容】

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 長鎖核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応
    （ＰＣＲ）増幅用のＤＮＡポリメラーゼ組成物であっ
    て、第一のＤＮＡポリメラーゼと、ポリメラーゼ活性単
    位で測定すると第一のＤＮＡポリメラーゼよりも少量の
    第二のＤＮＡポリメラーゼとの組合せから成り、前記第
    一のＤＮＡポリメラーゼがテルムス・テルモフィラス
    （Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼであり、
    そして前記第二のＤＮＡポリメラーゼがテルモコッカス
    ・リトラリス（Thermococcus litoralis）ＤＮＡポリメ
    ラーゼ、ピロコッカス（Pyrococcus）種ＧＢ−ＤのＤＮ
    Ａポリメラーゼおよびテルモトガ・マリチマ（Thermoto
    ga maritima）ＤＮＡポリメラーゼから成るＤＮＡポリ
    メラーゼ群より選択される、ＤＮＡポリメラーゼ組成
    物。
  2. 【請求項２】 前記第二のＤＮＡポリメラーゼがテルモ
    コッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）ＤＮ
    Ａポリメラーゼである、請求項１に記載のＤＮＡポリメ
    ラーゼ組成物。
  3. 【請求項３】 前記ＤＮＡポリメラーゼ組成物が第二の
    ＤＮＡポリメラーゼ各0.015 〜0.15単位につき第一のＤ
    ＮＡポリメラーゼ約0.8 〜2.5 単位から成る、請求項２
    に記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
  4. 【請求項４】 前記ＤＮＡポリメラーゼ組成物が第二の
    ＤＮＡポリメラーゼ各0.08単位につき第一のＤＮＡポリ
    メラーゼ約２単位から成る、請求項２に記載のＤＮＡポ
    リメラーゼ組成物。
  5. 【請求項５】 長鎖核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増
    幅用の反応緩衝液であって、約20〜50mMトリシンまたは
    バイシン、PH8.5 〜8.9 、65〜85mM KOAc 、８〜10％(w
    /v) グリセロールおよび2.25％(v/v) DMSOを含んで成る
    反応緩衝液。
  6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤ
    ＮＡポリメラーゼ組成物を使用する核酸の増幅方法。
  7. 【請求項７】 核酸を増幅するのに使われる請求項１〜
    ４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
  8. 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤ
    ＮＡポリメラーゼ組成物を含んで成るキット。
  9. 【請求項９】 長鎖核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増
    幅用の反応緩衝液を更に含んで成り、前記反応緩衝液が
    約25mMトリシン、80mM KOAc 、10％(w/v) グリセロール
    および2.25％(v/v) DMSOを含んで成る、請求項８に記載
    のキット。
JP7036602A 1994-02-25 1995-02-24 Ｐｃｒによる長鎖核酸配列の増幅 Withdrawn JPH0838198A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/203,198 US5512462A (en) 1994-02-25 1994-02-25 Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
US203198 1994-02-25

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002048319A Division JP2002315590A (ja) 1994-02-25 2002-02-25 Ｐｃｒによる長鎖核酸配列の増幅

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH0838198A true JPH0838198A (ja) 1996-02-13

Family

ID=22752923

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7036602A Withdrawn JPH0838198A (ja) 1994-02-25 1995-02-24 Ｐｃｒによる長鎖核酸配列の増幅
JP2002048319A Pending JP2002315590A (ja) 1994-02-25 2002-02-25 Ｐｃｒによる長鎖核酸配列の増幅

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002048319A Pending JP2002315590A (ja) 1994-02-25 2002-02-25 Ｐｃｒによる長鎖核酸配列の増幅

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5512462A (ja)
EP (2) EP0669401B1 (ja)
JP (2) JPH0838198A (ja)
AT (2) ATE211179T1 (ja)
CA (1) CA2143229A1 (ja)
DE (2) DE69524653T2 (ja)
DK (1) DK0669401T3 (ja)
ES (2) ES2256118T3 (ja)
PT (1) PT669401E (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003199592A (ja) * 2001-12-03 2003-07-15 F Hoffmann La Roche Ag インビトロｄｎａ合成および増幅のための可逆的に修飾された熱安定酵素
JP2007512020A (ja) * 2003-11-26 2007-05-17 エッペンドルフ アクチェンゲゼルシャフト 染色体外核酸のインビトロ増幅のための方法及び組成物

Families Citing this family (264)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756334A (en) * 1990-04-26 1998-05-26 New England Biolabs, Inc. Thermostable DNA polymerase from 9°N-7 and methods for producing the same
US5352778A (en) * 1990-04-26 1994-10-04 New England Biolabs, Inc. Recombinant thermostable DNA polymerase from archaebacteria
US7465539B1 (en) * 1993-02-19 2008-12-16 Takara Bio, Inc. DNA polymerases with enhanced length of primer extension
US6410277B1 (en) 1993-02-19 2002-06-25 Takara Shuzo Co., Ltd. DNA polymersases with enhanced length of primer extension
US7312052B1 (en) * 1993-12-08 2007-12-25 Stratagene California Polymerase compositions and uses thereof
US5545539A (en) * 1994-10-18 1996-08-13 Genzyme Corporation Method for nucleotide sequence amplification
US5629178A (en) * 1994-10-28 1997-05-13 Genetics & Ivf Institute Method for enhancing amplification in the polymerase chain reaction employing peptide nucleic acid (PNA)
AU5305296A (en) * 1995-03-07 1996-09-23 Biomolecular Assays, Inc. Pressure cycling reactor
FR2733515B1 (fr) * 1995-04-27 1997-09-05 Cis Bio Int Tampon, procede et methode d'evaluation des conditions optimales, d'amplification de sequences cibles d'acide nucleique, et leurs applications
US6114150A (en) * 1995-11-29 2000-09-05 Yale University Amplification of nucleic acids
JP3761197B2 (ja) * 1995-12-27 2006-03-29 タカラバイオ株式会社 新規ｄｎａポリメラーゼ
US5917031A (en) * 1996-04-19 1999-06-29 Taiko Pharmaceutical Co., Ltd. Method of synthesizing polydeoxyribonucleotides
US6150094A (en) * 1996-05-23 2000-11-21 Qiagen Gmbh Use of an osmolyte for reducing or abolishing no-covalent interactions of biological molecules to inert surfaces
DE69610410T2 (de) * 1996-05-23 2001-05-10 Qiagen Gmbh Verwendung eines Osmolyten zur Verringerung oder Aufhebung von nichtkovalenten Bindungen biologischer Moleküle an inerten Oberflächen
JP3415995B2 (ja) * 1996-06-10 2003-06-09 科学技術振興事業団 高分子マイクロ遺伝子重合体の作成方法
DE69725076T2 (de) * 1996-07-29 2004-04-15 Toyo Boseki K.K. Modifizierte thermostabile DNA Polymerase und eine DNA Polymerasezusammensetzung zur Amplifikation von Nukleinsäuren
WO1998006736A1 (en) 1996-08-14 1998-02-19 Life Technologies, Inc. Stable compositions for nucleic acid amplification and sequencing
US6291164B1 (en) 1996-11-22 2001-09-18 Invitrogen Corporation Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate
US6828094B2 (en) * 1996-12-20 2004-12-07 Roche Diagnostics Gmbh Method for the uncoupled, direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules with the addition of a second thermostable DNA polymerase and its application
DE19653439A1 (de) * 1996-12-20 1998-07-02 Svante Dr Paeaebo Verfahren zur direkten, exponentiellen Amplifikation und Sequenzierung von DNA Molekülen und dessen Anwendung
DE19653494A1 (de) 1996-12-20 1998-06-25 Svante Dr Paeaebo Verfahren zur entkoppelten, direkten, exponentiellen Amplifikation und Sequenzierung von DNA Molekülen unter Zugabe einer zweiten thermostabilen DNA Polymerase und dessen Anwendung
US6605428B2 (en) 1996-12-20 2003-08-12 Roche Diagnostics Gmbh Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application
US20030215857A1 (en) * 1996-12-20 2003-11-20 Roche Diagnostics Gmbh Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application
US6399304B1 (en) 1996-12-20 2002-06-04 Roche Diagnostics Gmbh Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules
CA2281205A1 (en) * 1997-02-12 1998-08-13 Eugene Y. Chan Methods and products for analyzing polymers
CA2283635A1 (en) 1997-03-21 1998-10-01 Stratagene Polymerase enhancing factor (pef) extracts, pef protein complexes, isolated pef protein, and methods for purifying and identifying
DE69841241D1 (de) 1997-04-22 2009-11-26 Life Technologies Corp Verfahren zur herstellung von aslv reverser transkriptase zusammengestellt aus mehreren untereinheiten
US6489455B2 (en) 1997-05-21 2002-12-03 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
US5994076A (en) * 1997-05-21 1999-11-30 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
EP1000175A1 (en) * 1997-07-22 2000-05-17 Rapigene, Inc. Amplification and other enzymatic reactions performed on nucleic acid arrays
US6140086A (en) * 1997-08-15 2000-10-31 Fox; Donna K. Methods and compositions for cloning nucleic acid molecules
DE69842183D1 (de) 1997-08-29 2011-04-28 Life Technologies Corp Hochempfindliche polymerasen und ihre verwendungen
US5976842A (en) * 1997-10-30 1999-11-02 Clontech Laboratories, Inc. Methods and compositions for use in high fidelity polymerase chain reaction
US5932451A (en) * 1997-11-19 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Method for unbiased mRNA amplification
US6787305B1 (en) 1998-03-13 2004-09-07 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced synthesis of nucleic acid molecules
US6696019B2 (en) 1998-06-15 2004-02-24 Bbi Bioseq, Inc. Rapid cryobaric sterilization and vaccine preparation
US6270723B1 (en) 1998-06-15 2001-08-07 Bbi Bioseq, Inc. Rapid cryobaric sterilization and vaccine preparation
JP4854853B2 (ja) 1998-11-12 2012-01-18 ライフ テクノロジーズ コーポレーション トランスフェクション薬剤
CA2374515A1 (en) * 1999-05-21 2000-11-30 Christian E. Gruber Compositions and methods for labeling of nucleic acid molecules
JP2003510017A (ja) 1999-06-22 2003-03-18 インビトロジェン コーポレイション 核酸の検出および識別のために改良されたプライマーおよび方法
US6830902B1 (en) * 1999-07-02 2004-12-14 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
US6225093B1 (en) 1999-09-07 2001-05-01 Decode Genetics Ehf. Detection of C4A deletion by long range PCR
ATE286981T1 (de) * 1999-09-28 2005-01-15 Roche Diagnostics Gmbh Thermostabiles enzym welches die genauigkeit thermostabiler dna polymerasen erhöht - zur verbesserung der nucleinsäuresynthese und in vitro amplifikation
GB9922971D0 (en) * 1999-09-29 1999-12-01 Secr Defence Reaction system
JP4729222B2 (ja) 1999-12-10 2011-07-20 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 組換えクローニングにおける独自の選択性を有する複数の組換え部位の使用
FR2803601A1 (fr) * 2000-01-11 2001-07-13 Inst Nat Sante Rech Med Utilisation de l'exonuclease iii dans des reactions d'amplification par polymerase de fragments d'adn
EP2295551B1 (en) 2000-05-26 2016-04-06 Life Technologies Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US20040209276A1 (en) 2002-09-13 2004-10-21 Smith Michael D. Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
JP2004513619A (ja) * 2000-07-07 2004-05-13 ヴィジゲン　バイオテクノロジーズ　インコーポレイテッド リアルタイム配列決定
US20070172866A1 (en) * 2000-07-07 2007-07-26 Susan Hardin Methods for sequence determination using depolymerizing agent
US6465219B1 (en) 2000-08-07 2002-10-15 Genemed Biotechnologies, Inc. Polynucleotide pools enriched in either high-abundance or low-abundance sequences
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
EP1334113A4 (en) * 2000-10-20 2007-08-08 Expression Diagnostics Inc EVALUATION OF LEUCOCYTAIRE EXPRESSION LEVEL
AU2002227156A1 (en) * 2000-12-01 2002-06-11 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
JP4394878B2 (ja) 2000-12-08 2010-01-06 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 複数の認識部位を用いた核酸分子合成のための方法および組成物
US6949368B2 (en) * 2001-01-30 2005-09-27 The Trustees Of Princeton University Compositions and methods for enhancing polynucleotide amplification reactions
AU785425B2 (en) * 2001-03-30 2007-05-17 Genetic Technologies Limited Methods of genomic analysis
GB0110476D0 (en) 2001-04-30 2001-06-20 Secr Defence Reagent delivery system
CA2448567C (en) 2001-05-25 2014-05-20 Duke University Modulators of nucleic acid ligands
US6905827B2 (en) * 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7026121B1 (en) * 2001-06-08 2006-04-11 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7668697B2 (en) * 2006-02-06 2010-02-23 Andrei Volkov Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level
EP1275735A1 (en) 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Composition and method for hot start nucleic acid amplification
EP1277841B1 (en) * 2001-07-11 2009-08-26 Roche Diagnostics GmbH New composition and method for hot start nucleic acid amplification
US20040006033A1 (en) * 2001-08-06 2004-01-08 Zhu York Yuan-Yuan Methods for identifying low-abundance polynucleotides and related compositions
US6898531B2 (en) 2001-09-05 2005-05-24 Perlegen Sciences, Inc. Algorithms for selection of primer pairs
WO2003021259A1 (en) * 2001-09-05 2003-03-13 Perlegen Sciences, Inc. Selection of primer pairs
US6740510B2 (en) 2001-09-05 2004-05-25 Perlegen Sciences, Inc. Methods for amplification of nucleic acids
US20060188875A1 (en) * 2001-09-18 2006-08-24 Perlegen Sciences, Inc. Human genomic polymorphisms
US20030165859A1 (en) * 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
JP4210769B2 (ja) * 2001-11-22 2009-01-21 独立行政法人産業技術総合研究所 Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法
EP1456394B2 (en) 2001-11-28 2011-04-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods of using improved polymerases
WO2003048392A1 (en) * 2001-12-04 2003-06-12 Bio3 Research S.R.L. Salts mixture for the preparation of pcr buffer solutions
AU2002217428A1 (en) * 2001-12-04 2003-06-17 Bio3 Research Srl Mixture of two partially denaturating agents for the preparation of pcr buffer solutions
US20030228589A1 (en) * 2002-02-12 2003-12-11 Bond-Nutter Diane R. Polymerase compositions
US7148049B2 (en) 2002-04-02 2006-12-12 Roche Molecular Systems, Inc. Thermostable or thermoactive DNA polymerase molecules with attenuated 3′-5′ exonuclease activity
US20040023275A1 (en) * 2002-04-29 2004-02-05 Perlegen Sciences, Inc. Methods for genomic analysis
US20040132133A1 (en) * 2002-07-08 2004-07-08 Invitrogen Corporation Methods and compositions for the production, identification and purification of fusion proteins
EP1572959B1 (en) 2002-07-25 2010-11-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Hybrid polymerase methods and compositions
US20040126789A1 (en) * 2002-09-05 2004-07-01 Invitrogen Corporation Compositions and methods for synthesizing nucleic acids
JP2006508662A (ja) 2002-12-04 2006-03-16 アプレラ コーポレイション ポリヌクレオチドの多重増幅
US20090186343A1 (en) * 2003-01-28 2009-07-23 Visigen Biotechnologies, Inc. Methods for preparing modified biomolecules, modified biomolecules and methods for using same
CA2457607A1 (en) * 2003-02-12 2004-08-12 Agroterra Biotech Inc. Method of mutagenic chain reaction
EP2194123B1 (en) 2003-03-25 2012-08-22 Stratagene California DNA polymerase fusions and uses thereof
US20040265870A1 (en) * 2003-04-09 2004-12-30 Invitrogen Corporation Methods of synthesizing and labeling nucleic acid molecules
WO2004094986A2 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 Handylab, Inc. System and method for electrochemical detection of biological compounds
US7892745B2 (en) * 2003-04-24 2011-02-22 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
CA2533910A1 (en) * 2003-07-29 2005-02-24 Sigma-Aldrich Co. Methods and compositions for amplification of dna
EP2311994A1 (en) * 2003-08-01 2011-04-20 Life Technologies Corporation Compositions and methods for preparing short RNA molecules and other nucleic acids
US20060024690A1 (en) * 2003-09-19 2006-02-02 Kao H P Normalization of data using controls
US20050112634A1 (en) * 2003-09-19 2005-05-26 Woudenberg Timothy M. High density sequence detection methods and apparatus
DE602004027538D1 (de) 2003-12-01 2010-07-15 Life Technologies Corp Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon
US20060099567A1 (en) * 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
CA2560513A1 (en) * 2004-04-08 2005-12-01 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
US20080176209A1 (en) * 2004-04-08 2008-07-24 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
US20050255485A1 (en) * 2004-05-14 2005-11-17 Livak Kenneth J Detection of gene duplications
US20060003337A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 John Brandis Detection of small RNAS
WO2006029184A2 (en) * 2004-09-08 2006-03-16 Expression Diagnostics, Inc. Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders
US20060105348A1 (en) * 2004-11-15 2006-05-18 Lee Jun E Compositions and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US20060275792A1 (en) * 2004-11-15 2006-12-07 Lee Jun E Enhancement of nucleic acid amplification using double-stranded DNA binding proteins
US9505846B2 (en) 2005-01-28 2016-11-29 Life Technologies Corporation Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases
EP1885889A4 (en) * 2005-05-11 2010-01-20 Expression Diagnostics Inc METHOD FOR MONITORING THE OPERATING STATUS OF TRANSPLANTS OVER GENLISTS
US20060292578A1 (en) 2005-06-28 2006-12-28 Weidong Zheng DNA polymerase blends and mutant DNA polymerases
US20070154892A1 (en) * 2005-12-30 2007-07-05 Simon Wain-Hobson Differential amplification of mutant nucleic acids by PCR in a mixure of nucleic acids
EP1989318B1 (en) 2006-01-06 2014-07-30 Agilent Technologies, Inc. Reaction buffer composition for nucleic acid replication with packed dna polymerases
GB0605584D0 (en) * 2006-03-20 2006-04-26 Olink Ab Method for analyte detection using proximity probes
EP2019687B1 (en) 2006-03-29 2014-03-19 Merial Limited Vaccine against streptococci
AU2007309726A1 (en) * 2006-04-07 2008-05-02 Xdx, Inc. Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity
US20080241951A1 (en) * 2006-07-20 2008-10-02 Visigen Biotechnologies, Inc. Method and apparatus for moving stage detection of single molecular events
US20080241938A1 (en) * 2006-07-20 2008-10-02 Visigen Biotechnologies, Inc. Automated synthesis or sequencing apparatus and method for making and using same
US20080091005A1 (en) * 2006-07-20 2008-04-17 Visigen Biotechnologies, Inc. Modified nucleotides, methods for making and using same
US7993832B2 (en) * 2006-08-14 2011-08-09 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders
WO2008140484A2 (en) * 2006-11-09 2008-11-20 Xdx, Inc. Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
US8120508B2 (en) * 2006-12-29 2012-02-21 Intelliserv, Llc Cable link for a wellbore telemetry system
EP1970440A1 (en) * 2007-03-06 2008-09-17 Qiagen GmbH Polymerase stabilization by ionic detergents
EP2118264A4 (en) * 2007-04-24 2010-12-01 Biomatrica Inc SAMPLE STORAGE FOR BIOLOGICAL SCIENCES
EP2231878B1 (en) 2007-12-27 2012-12-26 GE Healthcare Bio-Sciences Corp. A single enzyme system for fast, ultra long pcr
US20110020877A1 (en) * 2008-01-11 2011-01-27 Genesys Limited Cren7 chimeric protein
GB0803628D0 (en) * 2008-02-28 2008-04-02 Genesys Ltd Enzyme
GB0804721D0 (en) * 2008-03-14 2008-04-16 Genesys Ltd Enzyme
GB0804722D0 (en) * 2008-03-14 2008-04-16 Genesys Ltd Enzyme
RU2524115C9 (ru) * 2008-11-14 2014-12-10 Бакстер Интернэшнл Инк. Способ специфичной детекции малопредставленных фракций рнк в биологическом образце
US8859205B2 (en) 2009-01-08 2014-10-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for improving efficiency of nucleic acids amplification reactions
US20100330556A1 (en) * 2009-06-30 2010-12-30 Brian Jon Peter Genome analysis using a nicking endonuclease
GB201004292D0 (en) * 2010-03-15 2010-04-28 Olink Ab Assay for localised detection of analytes
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
CN105385756B (zh) 2010-04-05 2020-12-25 普罗格诺西斯生物科学公司 空间编码的生物学测定
EP2392680A1 (en) 2010-06-04 2011-12-07 Labor Diagnostik GmbH Leipzig Method for specific detection of classical swine fever virus
EP2582850B1 (en) 2010-06-21 2016-11-09 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for synthesis and/or detection of nucleic acids
GB201011971D0 (en) 2010-07-15 2010-09-01 Olink Ab Methods and product
JP5933544B2 (ja) 2010-07-26 2016-06-08 バイオマトリカ， インコーポレーテッド 外界温度で出荷および貯蔵中の血中ｄｎａ、ｒｎａおよびタンパク質ならびに他の生体試料を安定化させるための組成物
CA2806734A1 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
US20120058481A1 (en) 2010-08-20 2012-03-08 Life Technologies Corporation Quantitative Real Time PCR Assay Using FRET Dual-Labeled Primers
US10301674B2 (en) 2010-08-20 2019-05-28 Life Technologies Corporation Polymerase assay with a FRET substrate
WO2012032510A1 (en) 2010-09-07 2012-03-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. Primers for amplifying dna and methods of selecting same
WO2012038049A2 (en) 2010-09-22 2012-03-29 Roche Diagnostics Gmbh Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers
US10669569B2 (en) 2010-10-15 2020-06-02 Navinci Diagnostics Ab Dynamic range methods
CN104694628B (zh) 2010-12-13 2017-06-06 生命技术公司 利用通过多磷酸分解作用(app)反应的活化聚合核酸
GB201101621D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Olink Ab Method and product
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
US8715987B2 (en) 2011-05-02 2014-05-06 New England Biolabs, Inc. Solubilized phospholipids for stabilizing nucleic acid polymerases
GB201107863D0 (en) 2011-05-11 2011-06-22 Olink Ab Method and product
US8663919B2 (en) 2011-05-18 2014-03-04 Life Technologies Corporation Chromosome conformation analysis
EP2734621B1 (en) 2011-07-22 2019-09-04 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
GB201201547D0 (en) 2012-01-30 2012-03-14 Olink Ab Method and product
EP2909337B1 (en) 2012-10-17 2019-01-09 Spatial Transcriptomics AB Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
DK2914743T3 (da) 2012-11-02 2019-10-14 Life Technologies Corp Udvinding, detektering og kvantificering af lille rna
WO2014076214A1 (en) 2012-11-14 2014-05-22 Olink Ab Rca reporter probes and their use in detecting nucleic acid molecules
EP2934572A4 (en) 2012-12-20 2016-11-23 Biomatrica Inc FORMULATIONS AND METHODS FOR STABILIZING PCR REAGENTS
US11254977B2 (en) 2013-03-12 2022-02-22 Life Technologies Corporation Universal reporter-based genotyping methods and materials
DK3013984T3 (da) 2013-06-25 2023-06-06 Prognosys Biosciences Inc Metode til bestemmelse af spatiale mønstre i biologiske targets i en prøve
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
CN106572650B (zh) 2014-06-10 2021-08-31 生物马特里卡公司 在环境温度下稳定凝血细胞
WO2016011203A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
CA2956224A1 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
ES2890776T3 (es) 2015-03-13 2022-01-24 Life Technologies Corp Métodos, composiciones y kits para la captura, la detección y la cuantificación del ARN pequeño
ES2972835T3 (es) 2015-04-10 2024-06-17 10X Genomics Sweden Ab Análisis multiplex de especímenes biológicos de ácidos nucleicos espacialmente distinguidos
AU2016249392A1 (en) 2015-04-17 2017-11-16 The Regents Of The University Of California Methods for detecting agglutination and compositions for use in practicing the same
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
KR20230145258A (ko) 2015-12-08 2023-10-17 바이오매트리카 인코포레이티드 적혈구 침강 속도의 감소
US10550440B2 (en) 2016-02-26 2020-02-04 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Synthetic translation-sensing riboswitches and uses thereof
CN109477150B (zh) 2016-06-16 2023-03-31 生命技术公司 用于检测微生物的组合物、方法和试剂盒
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CN109804066A (zh) 2016-08-09 2019-05-24 哈佛大学的校长及成员们 可编程cas9-重组酶融合蛋白及其用途
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN118207299A (zh) 2016-08-26 2024-06-18 生命技术公司 核酸提取和扩增对照及其使用方法
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
GB201619458D0 (en) 2016-11-17 2017-01-04 Spatial Transcriptomics Ab Method for spatial tagging and analysing nucleic acids in a biological specimen
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
EP3601604A4 (en) 2017-03-30 2021-01-06 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University MULTIPLE DETECTION OF ISOTYPE-SPECIFIC ANTIBODIES
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
EP3658573A1 (en) 2017-07-28 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace)
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
JP2021502825A (ja) 2017-11-13 2021-02-04 ライフ テクノロジーズ コーポレイション 尿路微生物検出のための組成物、方法、およびキット
US11970786B2 (en) 2018-02-15 2024-04-30 Bioo Scientific Corporation Methods and kits for detecting contamination and sample misidentification
WO2020047005A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays
WO2020047010A2 (en) 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Increasing spatial array resolution
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
WO2020123311A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays using deconvolution
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
EP3931354A1 (en) 2019-02-28 2022-01-05 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
WO2020190509A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
BR112021018607A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Massachusetts Inst Technology Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos
EP3887542A1 (en) 2019-03-22 2021-10-06 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US20220389497A1 (en) 2019-11-04 2022-12-08 Mirnax Biosens, S.L. Bivalent reverse primer
EP3901286A1 (en) 2020-04-24 2021-10-27 Mirnax Biosens, S.L. Bivalent reverse primer
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
GB201919032D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Cartana Ab Method of detecting an analyte
GB201919029D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Cartana Ab Method of detecting an analyte
FI3891300T3 (fi) 2019-12-23 2023-05-10 10X Genomics Inc Menetelmät spatiaalista analyysiä varten rna-templatoitua ligaatiota käyttäen
EP4081656A1 (en) 2019-12-23 2022-11-02 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US12110548B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Bi-directional in situ analysis
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US12112833B2 (en) 2020-02-04 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Systems and methods for index hopping filtering
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US12129516B2 (en) 2020-02-07 2024-10-29 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US20210254140A1 (en) 2020-02-17 2021-08-19 10X Genomics, Inc. Situ analysis of chromatin interaction
CN115698324A (zh) 2020-02-21 2023-02-03 10X基因组学有限公司 用于整合原位空间测定的方法和组合物
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
EP4143333A1 (en) 2020-04-30 2023-03-08 Dimensiongen Devices and methods for macromolecular manipulation
JP2023525304A (ja) 2020-05-08 2023-06-15 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
EP4153775B1 (en) 2020-05-22 2024-07-24 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
WO2021247543A2 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
CN116249785A (zh) 2020-06-02 2023-06-09 10X基因组学有限公司 用于抗原-受体的空间转录组学
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
EP4421186A3 (en) 2020-06-08 2024-09-18 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
EP4172362B1 (en) 2020-06-25 2024-09-18 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2022067130A2 (en) 2020-09-24 2022-03-31 The Broad Institute, Inc. Prime editing guide rnas, compositions thereof, and methods of using the same
WO2022074058A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Keygene N.V. Targeted sequence addition
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4012046A1 (en) 2020-12-11 2022-06-15 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multimodal in situ analysis
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US20220195498A1 (en) 2020-12-23 2022-06-23 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyte detection
EP4274894A2 (en) 2021-01-11 2023-11-15 The Broad Institute, Inc. Prime editor variants, constructs, and methods for enhancing prime editing efficiency and precision
WO2022164809A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 10X Genomics, Inc. Nucleic acid analog probes for in situ analysis
WO2022178267A2 (en) 2021-02-19 2022-08-25 10X Genomics, Inc. Modular assay support devices
WO2022198068A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
US20220380838A1 (en) 2021-06-01 2022-12-01 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyte detection and probe resolution
EP4347879A1 (en) 2021-06-03 2024-04-10 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
US20230012607A1 (en) 2021-07-09 2023-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for detecting analytes using sparse labelling
EP4326900B1 (en) 2021-07-30 2024-09-04 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for synchronizing reactions in situ
CN118043476A (zh) 2021-08-03 2024-05-14 10X基因组学有限公司 核酸多联体及其稳定和/或压缩方法
EP4326898B1 (en) 2021-08-16 2024-07-31 10X Genomics, Inc. Probes comprising a split barcode region and methods of use
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023076898A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing a genome with prime editing and a recombinase
US20230242974A1 (en) 2021-12-27 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for rolling circle amplification
WO2023141588A1 (en) 2022-01-21 2023-07-27 10X Genomics, Inc. Multiple readout signals for analyzing a sample
AU2023243205A1 (en) 2022-04-01 2024-09-19 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence
WO2023196526A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 10X Genomics, Inc. Methods for multiplex cell analysis
US20240101978A1 (en) 2022-08-12 2024-03-28 10X Genomics, Inc. Puma1 polymerases and uses thereof
US12116626B2 (en) 2022-08-16 2024-10-15 10X Genomics, Inc. AP50 polymerases and uses thereof
WO2024108092A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 The Broad Institute, Inc. Prime editor delivery by aav
WO2024138087A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for modulating cellular factors to increase prime editing efficiencies
WO2024146937A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Dna Script Methods for obtaining correctly assembled nucleic acids
WO2024155741A1 (en) 2023-01-18 2024-07-25 The Broad Institute, Inc. Prime editing-mediated readthrough of premature termination codons (pert)
WO2024163542A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Principia Biopharma Inc. Methods of diagnosing and treating multiple sclerosis
WO2024216159A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Esbiolab Llc Methods and compositions for nucleic acid sequencing using labeled nucleotides

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5374553A (en) * 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
US5001050A (en) * 1989-03-24 1991-03-19 Consejo Superior Investigaciones Cientificas PHφ29 DNA polymerase
US5198543A (en) * 1989-03-24 1993-03-30 Consejo Superior Investigaciones Cientificas PHI29 DNA polymerase
US5210036A (en) * 1990-04-26 1993-05-11 New England Biolabs, Inc. Purified thermostable DNA polymerase obtainable from thermococcus litoralis
US5270163A (en) * 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5436149A (en) * 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003199592A (ja) * 2001-12-03 2003-07-15 F Hoffmann La Roche Ag インビトロｄｎａ合成および増幅のための可逆的に修飾された熱安定酵素
JP2007512020A (ja) * 2003-11-26 2007-05-17 エッペンドルフ アクチェンゲゼルシャフト 染色体外核酸のインビトロ増幅のための方法及び組成物

Also Published As

Publication number Publication date
EP1130118B1 (en) 2006-01-04
CA2143229A1 (en) 1995-08-26
ATE211179T1 (de) 2002-01-15
ES2256118T3 (es) 2006-07-16
PT669401E (pt) 2002-06-28
DE69534728T2 (de) 2006-11-09
ES2169736T3 (es) 2002-07-16
DK0669401T3 (da) 2002-04-02
EP0669401B1 (en) 2001-12-19
EP0669401A2 (en) 1995-08-30
DE69524653D1 (de) 2002-01-31
ATE315081T1 (de) 2006-02-15
EP0669401A3 (en) 1996-03-06
EP1130118A2 (en) 2001-09-05
DE69534728D1 (de) 2006-03-30
US5512462A (en) 1996-04-30
DE69524653T2 (de) 2002-08-08
JP2002315590A (ja) 2002-10-29
EP1130118A3 (en) 2001-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5512462A (en) Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
JP5020074B2 (ja) 新規ホットスタート核酸増幅法
US5646019A (en) Method for producing primed nucleic acid templates
US5449603A (en) Method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein
US5314809A (en) Methods for nucleic acid amplification
US6180338B1 (en) Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences
US5648211A (en) Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
EP1712618B1 (en) Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same
US10301675B2 (en) Compositions and methods for reducing inhibition of RT-PCR
EP0336731A2 (en) Method of amplifying and detecting nucleic acid sequences
US6294325B1 (en) Cloning and expression of thermostable multi genes and proteins and uses thereof
US8399197B2 (en) Methods for amplifying polymeric nucleic acids
US5605824A (en) Composition for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein
US20080044921A1 (en) Primers used in novel gene amplification method
WO1991006679A1 (en) An improved method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein
JP2001512301A (ja) 核酸増幅のための内部陽性対照
JPH09500539A (ja) 核酸のリンクされた線形増幅
EP0570371B1 (en) Genomic mapping method by direct haplotyping using intron sequence analysis
EP2738263A1 (en) Methods for DNA rearrengements analysis
EP0872561A2 (en) Neisseria gonorrhoae-specific oligonucleotides
JP2928992B2 (ja) Ｄｎａ及び／又はｒｎａを特異的に増幅し検出する方法
WO1995021270A9 (en) Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences
JPH0576399A (ja) イン ビトロで複製可能な核酸の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20050329

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20050629

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20051004

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060104

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20060228

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20060818

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20080317