ES2256118T3 - Amplificacion de secuencias lartgas de acido nucleico con pcr. - Google Patents

Abstract

Composición de polimerasas de DNA para la amplificación de reacción en cadena de la polimerasa de secuencias de ácido nucleico mayores de 10kb formadas por una combinación de una primera polimerasa de DNA y una segunda polimerasa de DNA; la primera es polimerasa de DNA Thermus thermophilus y la segunda es una polimerasa de DNA termoestable que incrementa la longitud máxima de la diana amplificable al proporcionar tanto actividad exonucleasa 3¿ a 5¿ como la actividad polimerasa. Dicha composición de polimerasa de DNA consiste en unas 0, 8 a 2, 5 unidades de la primera Polimerasa de DNA para cada 0, 015 a 0, 15 unidades de la segunda polimerasa de DNA.

Description

Amplificación de secuencias largas de ácido nucleico con PCR.

En general la presente invención está relacionada con los campos de la biología molecular y la química de los ácidos nucleicos. En concreto está relacionada con métodos de amplificación de secuencias largas de ácido nucleico mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una herramienta potente para la amplificación de secuencias de ácido nucleico, se encuentra desglosada en las Patentes Estadounidenses núm.: 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188. La forma más sencilla de PCR consiste en un método in vitro para la síntesis enzimática de secuencias de DNA específicas que utiliza dos cebadores oligonucleotídicos que hibridan con cadenas complementarias y se sitúan a ambos lados de la región de interés en el DNA diana. Una serie repetitiva de los pasos de reacción, que incluye la desnaturalización de los moldes, el apareamiento de los cebadores y la posterior prolongación de los mismos por una polimerasa de DNA, da como resultado la acumulación geométrica de un fragmento específico cuyos extremos terminales vienen definidos por los extremos 5' de los cebadores. La PCR es capaz de producir un enriquecimiento selectivo de una secuencia específica de DNA con un factor de 10^{9}. El método de la PCR también está descrito en Saiki et al., 1985, Science 230:1350-1354.

La PCR se ha utilizado ampliamente en biología molecular, evolución molecular, genética médica, genética de poblaciones, biología forense, mapeo genómico y proyectos de secuenciación. Sin embargo, las PCR que aquí se tratan están limitadas por el tamaño de la región de DNA que se pueda amplificar de manera fiable.

En los siguientes documentos aparecen descritos varios intentos de sobrepasar las limitaciones de las PCR en cuanto a la longitud: Glukhov et al., 1991, Molek. Biol. 25:1602-1610; Kainz et al., 1992, Anal. Biochem. 202:46-49; Ohler y Rose, 1992, PCR Meth. Applic. 2:51-59; Ponce y Micol, 1992, Nucl. Acids Res. 20:623 y Rychlik et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18:6409-6412. A pesar de que se consiguieron amplificaciones de secuencias de 5 a 15kb los rendimientos descritos en los casos de productos más largos fueron bajos.

Los métodos de PCR capaces de amplificar secuencias largas de ácido nucleico facilitarían el mapeo genómico y la secuenciación además de la clonación molecular a través de la amplificación de material de inserción de bajo número de copias largo, y al posibilitar el ensamblaje de construcciones recombinantes mayores en mutagénesis basadas en PCR. Todavía es necesario encontrar métodos que permitan la amplificación de la PCR de dianas de al menos 25kb con rendimientos altos.

La presente invención proporciona métodos mejorados y reactivos para la amplificación por PCR de DNA dianas largos.

Un aspecto de la invención está relacionado con combinaciones de polimerasa s de DNA termoestables útiles para los métodos de la presente invención. Las combinaciones están formadas principalmente por la polimerasa de DNA de Thermus thermophilus, una polimerasa de DNA altamente termoestable que no muestra actividad exonucleasa 3' a 5', y secundariamente por alguna de las polimerasas de DNA de Thermococcus litoralis, Pyrococcus sp. GB-D o Thermotoga maritima, siendo todas ellas polimerasas de DNA termoestables con actividad exonucleasa 3' a 5'.

Otro aspecto de la invención está relacionado con un tampón útil para llevar a cabo la amplificación de dianas largas.

Otro aspecto de la invención está relacionado con amplificaciones de las PCR que utilizan combinaciones específicas de las enzimas termoestables arriba descritas. Las condiciones de reacción están especificadas de manera que se consiga la amplificación de secuencias diana de ácido nucleico de hasta 42 kilobases de longitud.

Otro aspecto de la invención está relacionado con un equipo compuesto por reactivos útiles para llevar a cabo la presente invención. Este equipo comprende una combinación de polimerasas de DNA termoestables tal como se ha descrito antes y, de manera opcional, reactivos de amplificación opcionales útiles para los métodos de la presente invención.

A continuación se definen varios términos para ayudar a comprender la invención.

El término "mezcla de reacción de amplificación", tal como se utiliza aquí, se refiere a una solución acuosa compuesta por varios reactivos de amplificación utilizados para amplificar un ácido nucleico diana. Los reactivos incluyen cebadores, enzimas, tampones acuosos, sales, ácido nucleico diana y trifosfatos desoxinucleósidos (tanto convencionales como no convencionales). Dependiendo del contexto la mezcla puede ser una mezcla de reacción completa o incompleta.

Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido", tal como se utilizan aquí, se refieren a cebadores, sondas y fragmentos de oligómeros que han de ser detectados. Son genéricos para polidesoxiribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), para poliribonucleótidos (que contienen D-ribosa) y para cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glicósido de una base púrica o pirimidínica, o de bases púricas o pirimidínicas modificadas. No existe ninguna distinción intencionada en cuanto a la longitud entre los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" y ambos se utilizarán indistintamente. Solo se refieren a la estructura primaria de la molécula por lo que estos términos incluyen DNA de cadena simple o doble además de RNA de cadena simple o doble.

Debido al modo en que se hace reaccionar a los mononucleótidos para generar oligonucleótidos, el fosfato 5' de un anillo de pentosa de mononucleótido está unido al oxígeno 3' de su vecino en una dirección a través de un enlace fosfodiéster, se denomina "extremo 5'" a un extremo de un oligonucleótido si su fosfato 5' no está enlazado con el oxígeno 3' de un anillo de pentosa de mononucleótido y "extremo 3'" si su oxígeno 3' no está enlazado con un fosfato 5' de un anillo de pentosa de mononucleótido posterior.

El tamaño exacto de un oligonucleótido depende de muchos factores entre los que destaca la función o uso primordial de dicho oligonucleótido. Se pueden preparar mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias adecuadas y la síntesis química mediante un método como el método del fosfodiéster descrito por Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; el método del fosfodiéster descrito por Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; el método del dietilfosforoamidita descrito por Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 y el método de soporte sólido de la Patente Estadounidense núm. 4.458.066. Se puede encontrar una revisión de los métodos de síntesis en Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry, 1 (3):165-187.

El término "hibridación" tal como está utilizado aquí, se refiere a la formación de una estructura doblete por parte de dos ácidos nucleicos de cadena simple gracias al emparejamiento de bases complementarias. La hibridación puede tener lugar entre cadenas de ácido nucleico complementarias o entre cadenas de ácido nucleico que contengan regiones menores de malapareamiento. La estabilidad de un doblete de ácido nucleico se mide a través de la temperatura de fusión o "T_{m}", que es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual se ha disociado el 50% de los pares de bases. Los expertos en tecnología de los ácidos nucleicos pueden determinar la estabilidad del doblete empíricamente teniendo en cuenta un número de variables que incluyen, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición de las bases y la secuencia del oligonucleótido, la fuerza iónica y la incidencia de pares de bases mala-
pareadas.

Las "condiciones de astringencia de la hibridación" son aquellas bajo las cuales solo hibridarán las cadenas de ácido nucleico totalmente complementarias. Estas condiciones de astringencia son bien conocidas por los expertos (véase p. ej. Sambrook et al., 1985, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory, cold Spring Harbor, New York. En general las condiciones de astringencia se seleccionan sobre los 5ºC por debajo de la T_{m} para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Habitualmente las condiciones de astringencia serán aquellas en las que la concentración de sal sea por lo menos 0,2 molar aproximadamente a pH 7 y la temperatura sea por lo menos de 60ºC aproximadamente. Si se bajan las condiciones de astringencia se permite la tolerancia de malapearamientos de secuencia; el grado de malapareamiento se puede controlar con un ajuste adecuado de las condiciones de hibridación.

Se denomina como "sustancialmente complementarios" a aquellos ácidos nucleicos de cadena simple que son complementarios exceptuando regiones menores de malapareamiento. Es posible conseguir dobletes estables de secuencias sustancialmente complementarias bajo condiciones de hibridación de menor astringencia. Los expertos en la tecnología de los ácidos nucleicos pueden determinar empíricamente la estabilidad del doblete teniendo en cuenta una serie de variables que incluyen, por ejemplo, la longitud y la concentración de pares de bases de los oligonucleótidos, la fuerza iónica y la incidencia de pares de bases malapareadas.

El término "cebador", tal como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido, natural o sintético, capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis de DNA en unas condiciones bajo las que se induce la síntesis de un producto de prolongación del cebador complementario a una cadena de ácido nucleico, por ejemplo en presencia de cuatro trifosfatos nucleósidos diferentes y un agente de polimerización (p. ej. polimerasa de DNA o transcriptasa inversa) en un tampón y a una temperatura adecuados. Un cebador es preferiblemente un oligodesoxiribonucleótido de cadena simple cuya longitud adecuada depende del uso que se le quiera dar, aunque habitualmente oscila entre 15 y 35 nucleótidos. Las moléculas de cebadores cortos generalmente requieren temperaturas más bajas para poder formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde.

Un cebador no tiene porqué reflejar la secuencia exacta del molde pero sí debe ser suficientemente complementario para poder hibridar con él. Los cebadores pueden incorporar características adicionales que permiten su detección o inmovilización sin alterar su propiedad fundamental, que es actuar como punto de iniciación de la síntesis de DNA. Por ejemplo, se pueden situar secuencias no complementarias en los extremos del cebador para proporcionar sitios de escisión para enzimas de restricción de utilidad en la clonación de una secuencia amplificada.

Los términos "en dirección 5'" y "en dirección 3'", tal como se utilizan aquí, se refieren a la situación de los sitios de unión del cebador a lo largo de la secuencia diana. El cebador en dirección 5' hibrida con la cadena no codificante de la secuencia diana y, por lo tanto, forma el extremo 5' de la secuencia amplificada que es una consecuencia de la cadena codificante de la secuencia diana. De un modo similar, el cebador en dirección 3' hibrida con la cadena codificante de la secuencia diana y, por lo tanto, forma el extremo 5' de la secuencia amplificada que es una consecuencia de la cadena no codificante de la secuencia diana.

Los términos "secuencia diana" y "secuencia de ácido nucleico diana", tal como se utilizan aquí, se refieren a la región del oligonucleótido que debe ser amplificada, detectada o ambas cosas. La secuencia diana reside entre las dos secuencias del cebador utilizadas para la amplificación.

El término "polimerasa de ácido nucleico termoestable", tal como se utiliza aquí, se refiere a una enzima que es relativamente estable al calor cuando se compara con polimerasa s de nucleótidos de E. coli, por ejemplo, y que cataliza la polimerización de trifosfatos nucleósidos. En general, el enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del cebador fijado a la secuencia diana y continuará en dirección 5' a lo largo del molde hasta la finalización de la síntesis.

Los métodos de la presente invención utilizan combinaciones específicas de una polimerasa de DNA de Thermus thermophilus (Tth) con una polimerasa de DNA de entre Thermotoga maritima (Tma), Pyrococcus sp. GB-D o Thermococcus litoralis (Tli).

Los términos "actividad nucleasa 3' a 5'" y "actividad de corrección", tal como se utilizan aquí, se refieren a la actividad de una polimerasa de ácido nucleico con especificidad de molde durante la que se extraen nucleótidos del extremo 3' de un oligonucleótido de manera secuencial.

Una unidad (U) de la actividad de polimerasa es una medida de la cantidad de enzimas necesarios para la síntesis de ácido nucleico a una tasa dada. Las unidades de actividad especificadas aquí se corresponden con las definidas por los suministradores respectivos de cada polimerasa, tal como se describe en el siguiente punto. Debido a que el ensayo de las actividades se puede realizar bajo diferentes condiciones específicas la actividad de un enzima no tiene por qué ser comparable con la actividad de otro.

Las polimerasas de DNA recombinantes de Thermus thermophilus (_{r}Tth) y Thermotoga maritima (UITma) están comercialmente disponibles en Perkin Elmer, Norwalk, CT. Una unidad de polimerasa de DNA de _{r}Tth o UITma TM viene definida por el suministrador comercial, Perkin Elmer, como la cantidad de enzima que incorporará 14 nmoles de dNTP en material ácido insoluble a 74ºC en 30 minutos, tal como se ha medido en una incubación de 10 minutos en una reacción de 50 \mul que comprende lo siguiente:

200 \muM cada dATP, dGTP, dTTP

100 \muM [\alpha-^{32}P]-dCTP (0,05 a 0,1 Ci/mmol)

DNA de esperma activado de salmón

100 mM KCl

2,2 mM MgCl_{2}

25 mM TAPS [ácido tris-(hidroximetil)-metil-amino-propanosulfónico, sal sódica], pH 9,3 a 25ºC

1 nM beta-mercaptoetanol

Las polimerasa s de DNA de Thermococcus litoralis (Vent_{R}®) y de GB-D de la especie Pyrococcus (Deep Vent_{R}®) están disponibles a nivel comercial en New England Biolabs, Beverly, MA. El proveedor comercial, New England Biolabs, define una unidad de polimerasa de DNA de Vent_{R}® o de Deep Vent_{R}® como la cantidad de enzimas que incorporarán 10 nmoles de dNTP en un material ácido insoluble a 75ºC durante 30 minutos en una reacción formada por:

200 \muM cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP y 3H-dTTP)

0,2 mg/ml de DNA activado

10 mM KCl

10 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}

20 mM Tris-HCI, pH 8,8 a 25ºC

2 mM MgSO_{4}

0,1% Triton X-100

Las técnicas habituales de biología molecular y las técnicas de DNA recombinante y microbiología, que usan los expertos en el campo, están explicadas en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda edición (1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, ed., 1984); A practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984); y una serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).

La presente invención proporciona métodos mejorados y reactivos para la amplificación de las PCR de las largas dianas de DNA. En el campo se conoce bien el proceso de amplificación de las PCR para la amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos cortas y lo describen las patentes Estadounidenses números 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188. Los vendedores comerciales, como Perkin Elmer, Norwalk y CT comercializan los reactivos de PCR y publican los protocolos de PCR. Para facilitar la comprensión de las ventajas que proporciona la presente invención se proporciona un resumen de las PCR.

En cada ciclo de una amplificación de PCR se desnaturaliza una secuencia diana de doble cadena, los cebadores se aparean con cada una de las cadenas de la diana desnaturalizada y se extienden mediante la acción de la polimerasa de DNA. Normalmente, el proceso se repite entre 25 y 40 veces. Los dos cebadores se aparean a los cabos opuestos de la secuencia diana de ácidos nucleicos y con tal orientación que el producto de prolongación de cada cebador es una copia complementaria de la secuencia diana y, cuando está separada de sus complementos, puede hibridarse con el otro cebador. Cada ciclo, si tuviera una eficacia del 100%, daría como resultado un desdoblamiento de las secuencias diana presentes.

Para conseguir una amplificación de PCR eficiente de las dianas largas se deben reunir varios requisitos. En primer lugar, las secuencias diana deben estar completamente desnaturalizadas. Es mucho más fácil que las dianas más largas contengan tensiones de secuencias ricas de GC que son propensas a una desnaturalización incompleta a causa de sus temperaturas de fundido relativamente altas. La separación incompleta de cadenas permite una renaturalización rápida del DNA diana, quizás excluyendo el apareamiento y la prolongación de los cebadores de la PCR. En segundo lugar, los periodos de prolongación deben ser suficientemente largos para permitir la finalización de la síntesis de cadenas en cada ciclo de PCR. Y en tercer lugar, se deben proteger las dianas para evitar su degradación durante la amplificación. Las dianas largas son más susceptibles a la degradación y a la rotura de cadenas bajo las condiciones de PCR. Por lo tanto, la integridad inicial de los moldes y la subsiguiente supervivencia de las cadenas durante la PCR son consideraciones importantes. Los métodos de la presente invención están diseñados para reunir estos requisitos para las PCR largas sin comprometer o bien la actividad de la polimerasa o bien la especificidad necesaria para las amplificaciones de genes con solo una copia del DNA genómico.

Mejorar la separación diana de cadenas, alargar los periodos de prolongación y proteger el DNA molde de la degradación durante el ciclo térmico aumentan de forma importante la máxima longitud diana amplificable, pero no son suficientes para conseguir una amplificación eficiente de las dianas. La fidelidad de la síntesis de ácidos nucleicos es un factor que limita el hecho de conseguir la amplificación de las moléculas diana largas en el rango de 23 a
42kb.

Una mala incorporación de los nucleótidos durante la síntesis de los productos de prolongación de cebadores limita la longitud de la diana que puede ser amplificada de forma eficiente. El efecto de una prolongación de cebador de una base terminal 3' que no coincide con el molde se describe en Huang et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:4567-4573. La presencia de nucleótidos mal incorporados puede dar como resultado una síntesis de cadenas finalizada de forma prematura, reduciendo el número de cadenas molde para futuras series de amplificación y por lo tanto reduciendo la eficacia de la amplificación de dianas largas. Incluso la mala incorporación de nucleótidos a niveles bajos puede ser crítica para las secuencias de más de 10kb.

La fidelidad de la síntesis de DNA mejora si una cantidad pequeña de actividad exonucleasa termoestable de 3'a 5', o "corrección", está presente en la reacción además de la actividad de polimerasa de DNA. Aparentemente, la actividad de corrección mejora los rendimientos de los productos largos al quitar los nucleótidos mal incorporados y permitir la síntesis de cadenas completa mediante la actividad de polimerasa predominante. Un aspecto importante de la presente invención se refiere a las mezclas específicas de las polimerasa s de DNA termoestables que aumentan mucho la longitud diana máxima amplificable al proporcionar tanto la actividad exonucleasa 3' a 5' como la actividad polimerasa.

La actividad exonucleasa de corrección no se encuentra en la polimerasa de DNA Tth (Myers y Gelfand, 1991, Biochemistry 30:7661-7666), pero está intrínseca en las polimerasa s de DNA de los Thermococcus litoralis (el NEB Transcript (1991) vol. 3, núm. 1, XP000391405), las Pyrococus species GB-D y la Thermatoga maritima. Sin embargo, la amplificación de las dianas largas con solo las polimerasa s de DNA de Vent_{R}® es menos eficaz que con la polimerasa de DNA Tth que no exhibe la actividad exonucleasa 3' a 5'. La baja eficacia de la amplificación probablemente es debido a, al menos en parte, la degradación de los cebadores y a un descenso de la capacidad neta de procesamiento que resulta de la competencia entre las actividades exonucleasa 3' a 5' y la de polimerasa.

Las cantidades relativas de la actividad exonucleasa 3' a 5' y la actividad de polimerasa se pueden controlar al mezclar las polimerasa s de DNA. Mediante la combinación de una cantidad pequeña de polimerasa secundaria que tiene una actividad de corrección, como la polimerasa de DNA Tli, con una polimerasa primaria activa, como la polimerasa de DNA Tth, la ventaja de la actividad de corrección se puede combinar con la actividad de polimerasa de DNA activa intrínseca en la polimerasa primaria.

Casi todos los aspectos de los protocolos de las PCR afectan la eficacia de la amplificación de las moléculas diana largas. Los periodos de prolongación, los codisolventes y las polimerasa s (con o sin actividad exonucleasa 3'a 5') son los parámetros más importantes, pero el pH y la composición del tampón de reacción, las sales (K^{+} y Mg^{2+}) y el diseño de los cebadores también son variables importantes para el éxito de las amplificaciones de las dianas largas. Los efectos de los componentes individuales de una amplificación de PCR en la eficacia de amplificación de las dianas largas están comentados más adelante.

Ciclos de temperatura

Los ejemplos de reacciones de amplificación que se exponen aquí usan un ciclo de temperatura de dos pasos, en el que la temperatura de reacción se alterna entre una temperatura alta a la que el ácido nucleico diana se desnaturaliza, y una temperatura más baja a la que los cebadores se aparean a las secuencias diana desnaturalizadas y se da la prolongación de dichos cebadores. La duración y la temperatura de cada paso en cada ciclo afectan la eficacia de la amplificación.

Si se aumenta la temperatura de desnaturalización es posible conseguir una desnaturalización más completa de la diana. Sin embargo, este aumento puede causar mayores tasas de daños, como una depurinización, lo que provoca un descenso en la eficiencia de amplificación y una mayor pérdida de la actividad polimerasa. A pesar de la importancia de alcanzar la desnaturalización completa del ácido nucleico diana es necesario a su vez minimizar la tasa de daños de la diana. Por esa razón se prefieren temperaturas de desnaturalización moderadas (p. ej. unos 94ºC, dependiendo del contenido de GC) y se mejora la finalización de la desnaturalización mediante la adición de codisolventes, tal como se describe seguidamente.

Una temperatura de fijación (p. ej. unos 68ºC) reduce la hibridación de los cebadores a sitios diana parcialmente homólogos. De este modo se minimiza la síntesis de productos de sitios de cebado secundarios. En el caso de amplificaciones en las que se usa DNA de lambda diana, como se describe en los Ejemplos, se necesita un mínimo de 5 a 6 minutos a 68ºC. La adición de un paso de apareamiento más astringente de 70 a 73ºC no provoca ninguna mejora significativa en los rendimientos. De la misma forma, unos perfiles de temperatura más complejos con picos de temperatura para acomodar tramos ricos en GC o AT potencialmente problemáticos no reportan ningún beneficio significativo.

En la amplificación de dianas largas es crítico dar un tiempo prolongación que permita la finalización de la síntesis de cadenas. Para casos de amplificación de dianas de más de 20kb de longitud es preferible un tiempo de fijación y de prolongación de al menos 12 minutos, pero no más de 22 minutos en ninguno de los ciclos. Los tiempos mínimos de prolongación dependen de otros factores como, por ejemplo, los niveles de codisolvente descritos más adelante. En aquellas reacciones de amplificación en las que el tiempo inicial de prolongación utilizado es de unos 12 minutos y el tiempo de prolongación se aumenta de 15 a 20 segundos por ciclo dan un rendimiento con una menor formación de producto no específico que aquellas reacciones en las que se utiliza un tiempo de prolongación de más de 15 minutos a lo largo de la amplificación. La característica de autoprolongación del ciclo térmico comercializado por Perkin Elmer, Norwalk, CT, proporciona un sistema práctico para aumentar los tiempos de prolongación durante la reacción de amplificación.

Reducir la Amplificación de las dianas no específicas

Habitualmente los reactivos de PCR se combinan a temperatura ambiente antes del paso inicial de desnaturalización. La baja temperatura, menos astringente, puede provocar la unión de cebadores entre sí o a secuencias diana parcialmente homólogas. A partir de esta unión de cebadores no específica se pueden formar productos de prolongación cortos que actúan como competidores de las dianas de manera extremadamente eficiente lo que provoca una reducción de la eficiencia de la amplificación del producto largo deseado. El método "hot-start" supone una manera de minimizar la síntesis de producto de prolongación del cebador en hibridaciones con cebadores no específicos. Esto lo consigue inhibiendo las reacciones de prolongación hasta que la temperatura de reacción se ha aumentado suficientemente como para evitar dichas uniones no específicas. Debido a que los moldes genómicos difícilmente contengan secuencias de homología parcial con las secuencias del cebador diana es importante seguir un protocolo "hot-start" para maximizar la eficiencia de la amplificación de dianas largas.

Un método para conseguir un hot-start consiste en retener un componente esencial de la reacción de PCR hasta que la temperatura de la mezcla de amplificación se haya elevado hasta unos 75 a 80ºC. Algunos ejemplos incluyen por ejemplo la retención de la polimerasa de DNA o del Mg^{2+}, siendo este último un catalizador esencial en la actividad de la polimerasa de DNA. En un protocolo hot-start se añade el componente esencial a mano después de alcanzar la temperatura de desnaturalización. Alternativamente, se puede retener el componente esencial de la reacción mediante la separación de los componentes de reacción dentro de un tubo de reacción. Para esto se utiliza una barrera termolábil como, por ejemplo, una cera que se funde a las temperaturas de reacción. Esto minimiza el número de veces de apertura del tubo de reacción por lo que reduce las posibilidades de contaminación.

Existe otro protocolo hot-start que puede ser útil para los métodos de la presente invención. Utiliza uracil-N-glicosilasa para degradar cualquier producto no específico formado antes de que se eleve la temperatura de la mezcla de amplificación (véase PCT Núm. de Publicación de Patente: WO 92/01814).

Reactivos de PCR

En una PCR la reacción de prolongación del cebador tiene lugar cuando se incuba la mezcla cebador-molde con una Polimerasa de DNA bajo unas condiciones de polimerización adecuadas. Estas condiciones las proporciona una mezcla de reacción que contiene un catión bivalente, un catión monovalente, los cuatro desoxiribonucleótidos trifosfato (los dNTP) y un agente tampón. También es posible añadir a la mezcla de reacción codisolventes que afecten a las condiciones de desnaturalización. Cada uno de estos componentes tiene un efecto sobre la eficiencia de la reacción de prolongación y se discute a continuación.

Polimerasa de DNA

A medida que se aumenta la longitud de la diana o la complejidad de la secuencia, la elección de la combinación de polimerasas de DNA termoestables y de sus concentraciones va adquiriendo particular importancia. La combinación de polimerasa de DNA Tth y polimerasa de DNA Tli proporciona la amplificación más eficiente de productos de PCR largos, y admite una amplificación de las dianas por encima de los 40kb de longitud.

La cantidad óptima de polimerasa de DNA en una amplificación de PCR depende de una serie de factores incluido el número de copias de secuencias diana presentes en la muestra. En el caso de las reacciones de alto número de copias (10^{7} copias de diana) se obtienen rendimientos mayores al utilizar 2-2,5 unidades (U) de polimerasa de DNA Tth por cada 50 \mul de reacción. Aumentos posteriores de la concentración de polimerasa causan un aumento de la amplificación de moléculas diana no específicas lo que a su vez provocará unos niveles mayores de ruido de fondo cuando se detectan los productos amplificados con electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, en el caso de las reacciones de bajo número de copias (10^{4} copias de diana) se maximiza la especificidad al utilizar unas 0,8-1 U polimerasa de DNA Tth por cada 50 \mul de reacción. Para un número intermedio de copias de diana se consiguen rendimientos máximos utilizando concentraciones intermedias de polimerasa. La concentración de polimerasa óptima también depende de la concentración de catión bivalente. En concentraciones mayores de Mg2+ se redujeron los niveles de polimerasa para minimizar la acumulación de productos no específicos.

Al utilizar la PCR solo con la polimerasa de DNA Tth, se encontró que el tamaño máximo de diana amplificable a partir de muestras de DNA del fago lambda de alto número de copias estaba limitado a unas 23kb. De un modo similar, el tamaño máximo de diana amplificable a partir de muestras de DNA del fago lambda de bajo número de copias se encontró que estaba limitado a unas 10-12kb. Se consiguen aumentos considerables en el tamaño de la diana amplificable si se añade una pequeña cantidad de exonucleasa 3' a 5' termoestable.

Tal como se ha descrito antes, la actividad exonucleasa 3' a 5' no se encuentra en la polimerasa de DNA Tth. Se añade la actividad de corrección de errores mediante la combinación de la polimerasa de DNA Tth con una pequeña cantidad de polimerasa de DNA termoestable que sí presenta una actividad de corrección de errores; ejemplos de estas últimas son las polimerasas de DNA de Thermococcus litoralis, Pyrococcus sp. GB-D o Thermotoga maritima. Unas concentraciones bajas de cualquiera de estas Polimerasa s de DNA son efectivas para ampliar el rango de tamaños de las dianas amplificables con PCR utilizando cualquier polimerasa de DNA Tth; sin embargo, se ha encontrado que una la combinación de polimerasas de DNA Tth y Tli es más fiable y eficiente.

En el caso de amplificaciones de muestras de alto número de copias (10^{7} copias de diana en una reacción de 50 \mul) la proporción óptima de concentraciones es aproximadamente de 0,015 a 0,15 U de polimerasa de DNA Tli por 2-2,5 U de polimerasa de DNA Tth. En el caso de las amplificaciones de muestras de bajo número de copias (10^{4} copias de diana en una reacción de 50 \mul) el cociente óptimo de concentraciones es aproximadamente de 0,015 a 0,15 U polimerasa de DNA Tli por 0,8 a 1 U polimerasa de DNA Tth. Unas concentraciones mayores de polimerasa de DNA Tli reducen el rendimiento, posiblemente debido a la degradación del cebador.

Codisolventes

Un codisolvente, como el glicerol, es un componente de reacción clave para la amplificación eficiente de dianas largas. Se han descrito una serie de codisolventes que facilitan la PCR: glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), polietilenglicol y formamida. Una de las formas en que un codisolvente puede influir sobre la eficiencia de las amplificaciones de dianas largas es incrementando la estabilidad térmica de la polimerasa de DNA. Este incremento enlentece la pérdida de actividad de la polimerasa de DNA durante los pasos repetidos de desnaturalización a alta temperatura.

Otro efecto a destacar es que un codisolvente puede disminuir de manera efectiva las temperaturas de fusión y de separación de cadenas y así facilitar la desnaturalización del molde e incrementar la especificidad de la fijación del cebador. Por ejemplo, la temperatura de fusión se puede bajar hasta 2,5 a 3ºC añadiendo un 10% de glicerol. Por lo tanto, al añadir un codisolvente, es posible conseguir un aumento en el total de la desnaturalización de la diana sin necesidad de aumentar la temperatura de desnaturalización lo que, como se ha comentado antes, provocaría un aumento simultáneo de la degradación de las moléculas diana.

Un tampón de PCR Tth estándar normalmente contiene un 5% de glicerol. Un aumento en la cantidad de glicerol añadido a la reacción de amplificación puede mejorar significativamente la amplificación de secuencias diana largas. Por ejemplo, al suplementar un tampón de PCR Tth estándar con un 5% (w/v) de glicerol se obtienen aumentos significativos del rendimiento de una diana de 9,4kb. Los porcentajes aquí descritos no incluyen ninguna contribución de glicerol proveniente de los distintas cepas enzimáticas utilizadas.

El DMSO, preferentemente en una concentración de un 5 a un 6% (v/v), también se puede usar solo. Sin embargo, las combinaciones de glicerol y DMSO son más efectivas para las dianas de más longitud. Las combinaciones de concentraciones preferidas incluyen de un 5 a 14% (w/v) de glicerol con un 0,5 a 5% (v/v) de DMSO. Por ejemplo, las amplificaciones de las dianas de fago lambda de 25 a 34kb de longitud se potenciaron con una combinación de un 1 a un 3% (v/v) de DMSO con un 10% de glicerol, o usando el 5% de ambos codisolventes; la mayoría de las dianas del fago lambda de 35 a 42kb de longitud se potenciaron con la combinación de un 8 a un 9% de glicerol con un 5% de DMSO. Además, con una combinación de un 3% de DMSO y un 10% de glicerol, las dianas de más de 34kb se amplificaron fácilmente con un periodo de prolongación de 10 minutos; con una combinación de un 1% de DMSO y un 10% de glicerol, la amplificación se limitó a las dianas de 26kb. Una combinación preferida consta de un 10% de glicerol y un 2,25% de DMSO.

El DMSO, a diferencia del glicerol, reduce la estabilidad termal de la polimerasa. Sin embargo, el descenso efectivo de las temperaturas de fundido y de separación de cadenas de 5,5 a 6ºC por el 10% de DMSO puede ser el efecto dominante en las PCR largas. La adición de DMSO también puede aumentar la estabilidad del DNA al disminuir los campos de depuración y la escisión de la cadena y puede acelerar la renaturalización de las cadenas. La disminución de las temperaturas de fundido y de separación de cadenas mediante combinaciones de glicerol y DMSO generalmente es consistente con una reducción total que se estima al añadir los efectos de cada uno de los componentes individualmente. La potenciación de los rendimientos de la disminución efectiva de las temperaturas de fundido y de separación de cadenas mediante la adición de un codisolvente, tal y como se ha comentado anteriormente, no se duplica fácilmente al elevar la desnaturalización o al aparear la temperatura durante la PCR.

Tampones

El pH de una mezcla de amplificación afecta la estabilidad del DNA molde. Aumentar el pH de la reacción puede disminuir la degradación del DNA molde durante el ciclo térmico. Aunque las mezclas de amplificación de PCR tamponan con el pH, el pH de una reacción de PCR normal varía de forma considerable durante el ciclo térmico a causa de la dependencia térmica del tampón de reacción. El agente tamponador que se usa en una PCR normal es Tris, el cual tiene un pKa de -0.031 por ºC. La fluctuación en el pH durante el ciclo térmico se puede disminuir usando el agente tamponador con un pKa más pequeño.

Dos tampones que son útiles son Tris(hidroximetil)metilglicina (tricina), que tiene un pKa de -0,021 por ºC, y N,N-Bis(hidrosietil)glicina (bicina), que tiene un pKa de -0,018 por ºC; ambos valores medidos a 20ºC y a una fuerza iónica de 0,1M (véase Good and Izawa, 1972, Meth. Enzymol. 24, Parte B:53-68). Con un tampón de tricina o bien uno de bicina, el pH permanece más alto durante las condiciones de reacción con una temperatura alta, que con el tampón de Tris típico y las fluctuaciones en el pH descienden a causa del ciclo térmico.

Los tampones óptimos y el pH dependen de, entre otras cosas, la polimerasa de DNA que se utiliza. Usar una polimerasa de DNA Tth, un tampón formado por 10 a 35 mM, preferentemente 20 a 25 mM, de tricina a un pH de 8,5 a 8,7 (25ºC), proporciona unos resultados más fiables. Puede ser necesario determinar empíricamente las condiciones óptimas del tampón para la amplificación de las dianas específicas.

Catión bivalente

Mg^{2+} es el catión bivalente preferido para la amplificación de DNA. En ausencia de la actividad exonucleasa 3' a 5' añadida, la PCR larga se potencia hasta los niveles totales de Mg^{2+} de 1,7 a 2 mM. Sin embargo, en presencia de la actividad de corrección, los rendimientos más altos se obtienen de Mg^{2+} total de 0,9 a 1,3 mM. Los rendimientos elevados de algunas dianas se pueden obtener al aumentar la concentración de Mg^{2+} hasta 1,5 mM mientras se reduce la concentración total de enzimas, en concreto los niveles de polimerasa primarios (hasta 1,25 a 2U de polimerasa de DNA Tth). Sin embargo, para algunas dianas, reducir los niveles totales de enzimas para reducir la síntesis de los productos no específicos a niveles de Mg^{2+} más altos, también reduce los rendimientos de los productos. Del mismo modo que en los niveles K^{+} descritos abajo, el Mg^{2+} óptimo para cada sistema puede necesitar ser determinado de forma empírica.

Catión monovalente

El catión monovalente preferido es K^{+}, suministrado por KOAc (K-acetato) o KCl. Los niveles reducidos de K^{+} son benéficos para la amplificación de las moléculas diana largas. Se puede conseguir una disminución de los antecedentes no específicos si el K^{+} es suministrado como KOAc más que como KCl. En general, las concentraciones de K^{+} reducidas con un 10 a un 40% son más favorables para las PCR largas que los niveles estándar (100 mM KCl para usar con la polimerasa de DNA Tth). Las concentraciones preferidas para usar con la polimerasa de DNA Tth son de KOAc de 60 a 100 mM, preferiblemente KOAc de 80 a 85 mM. Los rangos de las concentraciones óptimas deben depender del sistema.

La eficacia de las amplificaciones de PCR usando tampones de tricina o de bicina es similar al usar o bien KCl o bien KOAc como catión monovalente. Sin embargo, la robustez mejorada de la reacción se lleva a cabo usando una un tampón de tricina/KOAc. Dicho tampón tiene una fuerza iónica ligeramente inferior a la de un tampón de tricina/KCl, que podría ayudar a desestabilizar las estructuras secundarias en un molde con un contenido alto de G+C, así mejorando la totalidad de la desnaturalización de la diana.

\newpage

Aunque KCl y KOAc son las sales monovalentes preferidas, existen otras sales monovalentes que podrían ser útiles en los métodos de la presente invención. Estas incluyen NaDl, (NH_{4})_{2}SO_{4}, glutamato-K y acetato-NH_{4}.

Cebadores

Las concentraciones de cebadores pueden necesitar ser optimizadas para cada sistema y aproximar su número de copias de moldes iniciales. Por ejemplo, para las reacciones de amplificación de fago lambda descritas en los ejemplos, abajo, una concentración más alta de cebador fue más óptima para amplificar las muestras con un número de copias más elevado de la diana que para amplificar muestras con un bajo número de copias de dianas. Para las reacciones de copias elevadas (10^{7} copias de dianas), la concentración óptima de cebadores era de 0,4 a 0,5 \muM de cada cebador. Para las amplificaciones de pocas copias (10^{4} copias de dianas), 0,15 a 0,2 \muM de cada cebador fue más eficaz en ausencia de la actividad de corrección, y 0,2 \muM de cada cebador fue mejor si la actividad exonucleolítica de 3' a 5' estaba presente. Para las reacciones de un número de copias intermedio, aumentar la concentración de cebadores por encima de 0,2 \muM fue por lo menos tan eficaz como aumentar los niveles de polimerasa de DNA, tal y como se comenta abajo, al potenciar los rendimientos. Los protocolos de PCR mejorados que permiten la amplificación de las secuencias diana de ácido nucleico hasta 42kb de longitud están resumidas en la tabla 1 de abajo.

TABLA 1 Condiciones óptimas de PCR larga

Perfil de temperatura

\hskip0.5cm 25 a 40 ciclos de amplificación (dependiente del número de copias de molde) Dos ciclos de temperatura:

(a) Paso corto de desnaturalización, (p. ej. 94ºC durante de 10 a 1 segundos)

(b) \begin{minipage}[t]{150mm} Paso de apareamiento/prolongación larga, (p. ej. 68^{o}C durante 10 a 14 minutos inicialmente, aumentado durante 15 a 20 segundos por ciclo para al menos de 5 a 8 ciclos) \end{minipage}

\hskip0.5cm Finalmente mantenido a 72ºC durante al menos 10 minutos.

Hot-start

\hskip0.5cm \begin{minipage}[t]{150mm} Separar el reactivo (Mg^{2+}, enzima o dNTPs) hasta que todas las muestras alcancen de 75 a 80^{o}C, preferiblemente usando una barrera de cera. \end{minipage}

Polimerasa primaria

\hskip0.5cm 2,5 unidades de polimerasa de DNA Tth por 50 \mul molde de muchas copias (10^{7} copias)

\hskip0.5cm 0.8 a 1,0 unidades de polimerasa de DNA Tth por 50 \mul molde de pocas copias (10^{4} copias)

\hskip0.5cm Exonucleasa 3' a 5' (molde de muchas- pocas- copias)

\hskip0.5cm 0,015 a 0,15 unidades de polimerasa de DNA Tli por 50 \mul

Codisolvente

\hskip0.5cm 5 a un 14% de glicerol con 0,5 a un 5% de DMSO

Tampón

\hskip0.5cm 20 a 25 mM de tricina o bicina, pH 8,5 a 8,7

Catión bivalente

\hskip0.5cm 0,9 a 1,5 mM de Mg^{2+} total; 0,2nM de cambios pueden ser importantes

Catión monovalente

\hskip0.5cm 80 a 85 mM de KOAc

Diseño del cebador

\hskip0.5cm \begin{minipage}[t]{150mm} O bien 20 a 23bp con un 50 a un 60% de contenido de GC, o bien secuencias más largas, para permitir el uso de temperaturas de apareamiento relativamente altas. \end{minipage}

Concentración de tampón

\hskip0.5cm 0,4 a 0,5 \muM para molde de muchas copias (10^{7} copias)

\hskip0.5cm 0,15 a 0,2 \muM para molde de pocas copias (10^{4} copias)

Concentración de dNTP

\hskip0.5cm 0,2 \muM cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP

\newpage

En general, el ácido nucleico de la muestra será DNA, normalmente DNA genómico. Sin embargo, la presente invención también se puede realizar con otros ácidos nucleicos como RNA o DNA clonado, y el ácido nucleico puede ser o bien de una cadena o bien de dos cadenas en la muestra y seguir siendo adecuados para el propósito de la presente invención. Los expertos en el tema reconocen que cualquiera que sea la naturaleza del ácido nucleico, este se puede amplificar usando las modificaciones apropiadas a los métodos presentes.

Debido a la gran amplificación posible con el proceso de PCR, los niveles bajos de DNA transferidos de las muestras con altos niveles de DNA de los moldes de control positivo o de amplificaciones anteriores, pueden resultar como productos de la PCR, incluso en ausencia del molde de DNA añadido de forma deliberada. Si es posible, todas las mezclas de reacción se establecen en una zona separada del análisis del producto de la PCR y de la preparación de la muestra. El uso de vasos dedicados o desechables, soluciones y pipetas (preferiblemente pipetas de desplazamiento positivo) para la preparación de DNA/RNA, mezclas de reacción y análisis de las muestras minimizará la contaminación por cruce. Véase también Higuchi y Kwok, 1989, Nature 339:237-238 y Kwok, y Orrego en Innis et al. ed., 1990 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA.

Los métodos enzimáticos para reducir el problema de la contaminación de una PCR con el ácido nucleico de reacciones anteriores están descritos en PCT Publicación de patentes núm. WO 92/01814 y en la Patente Estadounidense 5.035.996. Los métodos permiten la degradación enzimática de cualquier DNA amplificado de las reacciones anteriores. Las amplificaciones de la PCR se llevan a cabo en presencia de dUTP en lugar de dTTP. El producto de amplificación de doble cadena resultante que incorpora uracil está sujeto a la degradación con uracil-N-glicosilasa (UNG), mientras que el DNA normal con timina no se degrada con UNG. Las mezclas de reacción de amplificación son tratadas con UNG antes de la amplificación para degradar todo el uracil con reacción de DNA, este método elimina de forma eficaz el problema de contaminación de reacciones previas (transferir). El UNG se hace temporalmente inactivo mediante calor, por lo tanto los pasos de desnaturalización en el procedimiento de amplificación también sirve para inactivar el UNG. Los nuevos productos de amplificación, por lo tanto, aunque incorporan uracil, se forman en un entorno de UNG inactivado y no se degradan.

El análisis de los productos amplificados se puede llevar a cabo a partir de varios medios dependiendo de la información que se desee. La secuencia de nucleótidos de los productos amplificados se puede obtener usando las técnicas estándar, como el protocolo descrito por Innis et al., 1988, Proc. Natl, Acad, Sci. 85:9436-9440. Los productos de amplificación de PCR se pueden secuenciar de forma directa (véase Saiki et al., 1988, Science 239:487-491) o de forma indirecta clonando primero los productos y haciendo una réplica de ellos en una célula huésped
apropiada.

Las secuencias de ácido nucleico amplificadas se pueden detectar y purificar mediante métodos ampliamente conocidos (véase Sambrook, et al., 1986, supra). Para purificar el ácido nucleico amplificado se pueden usar métodos de separación de moléculas según el tamaño como, por ejemplo, una electroforesis en gel. Particularmente son preferibles las electroforesis en gel de agarosa o acrilamida (véase Scarf et al., 1986, Science 233:1076-1078). Para una mayor resolución del tamaño es posible utilizar o bien una electroforesis de inversión de campo en gel o bien una electroforesis en gel de agarosa de bajo porcentaje (0,3%), tal como se describe en los Ejemplos.

Los productos amplificados pueden ser detectados y purificados por visualización directa del producto fraccionado según el tamaño por electroforesis mediante, por ejemplo, una tinción con bromuro de etidio. Alternativamente, se pueden detectar los productos amplificados mediante sondas de hibridación oligonucleotídicas complementarias a la secuencia diana. Bajo las condiciones de hibridación adecuadas las sondas solamente hibridan con secuencias de ácido nucleico diana. La presencia de dobletes híbridos, detectables por distintos medios, indica la presencia de producto amplificado. Para facilitar la detección de dobletes híbridos formados entre sondas y secuencias de ácido nucleico diana, o los cebadores o las sondas pueden estar unidos a moléculas adicionales como un marcador detectable o una molécula que permita la inmovilización del cebador o la sonda. Los marcadores incorporados en las sondas para facilitar la detección o inmovilización no deberían afectar a las propiedades de hibridación de las
sondas.

Las sondas se pueden marcar incorporando un marcador detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Algunos marcadores útiles son ^{32}P, tintes fluorescentes, reactivos con densidad electrónica, enzimas (igual que las habitualmente empleadas en las ELISA), biotina o haptenos y proteínas para las que están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. Las sondas también pueden unirse a compuestos adicionales utilizados para inmovilizar la sonda en un soporte sólido.

Las sondas marcadas se pueden sintetizar y marcar mediante las técnicas antes descritas para la síntesis de oligonucleótidos. Por ejemplo, la sonda se puede marcar en el extremo 5' con ^{32}P incubando la sonda con ^{32}P-ATP y quinasa. La peroxidasa de rábano picante (HRP) constituye un marcador no radiactivo adecuado para sondas SSO. Los métodos de preparación y detección de sondas que contienen este marcador están descritas en las Patentes Estadounidenses núm. 4.914.210 y 4.962.029. También se describe el uso de dichas sondas en la Patente Estadounidense núm. 4.789.630; Saiki et al., 1988, N. Eng. J. Med. 319:537-541; y en Bugawan et al., 1988, Bio/Technology 6:943-947. El tinte leuco-rojo y la 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) son cromógenos útiles para la detección de sondas marcadas con HRP.

Un ejemplo de compuestos adicionales incorporados a sondas para permitir su inmovilización es la "cola" larga de poli-dT que puede fijarse a un soporte de nylon mediante irradiación, técnica descrita con más detalle en la Publicación de la Patente de PCT núm. WO 89/11548.

Son ampliamente conocidos los métodos de ensayo adecuados para la detección de híbridos formados entre sondas y secuencias de ácido nucleico diana de una muestra (Sambrook et al., 1985, supra). Algunos ejemplos son los formatos de ensayo transferencia de puntos y transferencia de puntos inversa.

En un formato de transferencia de puntos se inmoviliza el DNA diana amplificado no marcado en un soporte sólido como una membrana de nylon. Se incuba el complejo membrana-diana con una sonda marcada bajo unas condiciones de hibridación adecuadas, se extrae la sonda no hibridada mediante un lavado bajo condiciones de astringencia y se monitoriza la membrana en busca de sonda unida.

Otro formato alternativo es un formato de transferencia de puntos "inverso" en el cual el DNA diana amplificado es marcado y las sondas son inmovilizadas en un soporte sólido como una membrana de nylon. El marcaje del DNA diana se realiza habitualmente durante la amplificación mediante la incorporación de cebadores marcados. El complejo membrana-sonda es incubado con la muestra marcada bajo unas condiciones de hibridación adecuadas, se extrae la sonda no hibridada mediante un lavado bajo condiciones de astringencia y se monitoriza el filtro en busca de DNA diana unido.

Alternativamente, el ensayo de transferencia de puntos inverso puede llevarse a cabo utilizando un soporte sólido con una diversidad de sitios de hibridación de sonda o pocillos. Por ejemplo, una placa de micropocillos resulta muy útil en aplicaciones clínicas a gran escala de los presentes métodos. Se describe un ensayo de transferencia de puntos inverso con una placa de micropocillos en Loeffelholz et al., 1992, en J. Clin. Microbiol. 30(11):2847-2851. La inmovilización de las sondas en placas de micropocillos puede realizarse mediante unión pasiva o mediante la unión previa de las sondas con albúmina sérica bovina (BSA), que se adhiere a las placas de micro-
pocillos.

Otro sistema de ensayo apropiado aparece descrito en la Patente Estadounidense núm. 5.210.015, en la que durante el proceso de amplificación con PCR se añade una sonda marcada. Las sondas se modifican para evitar que actúen como cebadores en la síntesis de DNA. Cualquier sonda que hibride con el DNA diana durante cada paso de síntesis será degradada por la actividad exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa de DNA. Entonces se detecta el producto de degradación de la sonda. Por lo tanto, la presencia del producto de degradación de sonda indica que tubo lugar la hibridación entre la sonda y el DNA diana.

La presente invención también está relacionada con equipos, unidades de múltiples recipientes que contienen componentes útiles para la realización del presente método. Un equipo contiene una combinación de polimerasa de enzimas preferidas en las proporciones de concentración aquí descritas. Algunos componentes adicionales que puede contener un equipo práctico son cebadores para la amplificación con PCR y reactivos para llevar a cabo los métodos de PCR de la presente invención.

La capacidad de amplificar secuencias de 10 a 40 kb tiene una serie de aplicaciones en áreas como el mapeo genómico, la secuenciación y la genética. Los pequeños huecos en los mapas genómicos que ahora parecen resistentes a la clonación molecular quizás sean accesibles mediante la amplificación de una secuencia que esté flanqueada por secuencias conocidas. La amplificación de dianas más largas también permitiría una mayor flexibilidad en la elección de cebadores para evitar secuencias problemáticas como la vista en el sistema del gen beta-globina descrito más adelante. Unos moldes más largos también aseguran la aceleración del proceso de secuenciación genómica al incrementar la distancia cubierta con cada paso de secuenciación. A partir de secuencias expresadas conocidas es posible llevar a cabo amplificaciones prolongando intrones mayores, además de que se puede amplificar de una vez secuencias génicas más completas. Por lo tanto las PCR largas complementan las tecnologías de secuenciación rápida de amplio espectro. También sería posible la caracterización y el diagnóstico basados en PCR de portadores tanto homocigóticos como heterocigóticos de una cantidad de inserciones y deleciones de importancia médica de más de
4 kb.

Los resultados presentados aquí muestran específicamente la aplicación potencial de estos protocolos para la caracterización de secuencias clonadas. Los cebadores del gen J y del cro [CF1018 (Sec. de Id. núm.: 23) y CF1019 (Sec. de Id. núm.: 24)], descritos a continuación, deberían servir en casi todos los insertos clonados con vectores derivados del fago lambda para amplificaciones a partir tanto de calvas como de DNA aislado. Los productos de PCR se analizan fácilmente mediante una digestión de restricción y deberían estar disponibles para la secuenciación. Los insertos de cósmidos también pueden ser amplificables a partir de colonias. Una PCR larga facilitaría la clonación molecular por amplificación de material de inserción de bajo número de copias y facilitaría también el ensamblaje de formaciones mayores de recombinantes en mutagénesis basadas en PCR.

Los ejemplos de la presente invención que se presentan a continuación solo se proporcionan con una intención ilustrativa y no para limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Materiales y métodos

A continuación se describen los protocolos y los reactivos preferidos para la amplificación con PCR de secuencias de grupos de genes del fago lambda y de la beta-globina humana. Los resultados de las amplificaciones siguiendo los siguientes métodos se describen en los próximos ejemplos.

Secuencias de ácido nucleico diana

Se utilizaron dos secuencias de ácido nucleico molde para diseñar los cebadores de amplificación descritos más adelante, la secuencia del genoma del fago lambda (número de acceso a GenBank M17233) y la secuencia del grupo de genes de la beta-globina humana (número de acceso a GenBank J00179). En las amplificaciones abajo descritas se utilizaron el fago lambda y DNA humano.

El DNA de lambda (1ng/\mul) se obtuvo de Perkin Elmer, Norwalk, CT. Las alícuotas (\sim100 ng) de DNA de lambda fueron descongeladas una vez y después guardadas a 4ºC. Se obtuvo el DNA genómico total a partir de placenta humana de Sigma Chemicals, St. Louis, MO. Todas las diluciones de DNA molde se realizaron con 10 mM Tris\cdotCl (pH 8 a 25ºC), 0,1 mM EDTA.

Se obtuvo una biblioteca de clones genómicos humanos en lambda FIX II de Stratagene, La Jolla, CA, y se cultivó según las recomendaciones del fabricante sobre placas de agar Luria broth con agarosa superior. Las calvas seleccionadas aleatoriamente se eliminaron utilizando pipetas Pasteur siliconizadas y se situaron en 30 \mul de 25 mM Tris\cdotCl (pH 8,3), 10 mM MgCl_{2} para guardarlas a 4ºC. Se utilizaron alícuotas de 1 \mul para la PCR.

Se aisló el DNA genómico total a partir de una línea celular linfoblastoide (KAS011 B) utilizando 0,1 mg/ml de proteinasa K y SDS 0,5% en 10 mM Tris\cdotCl (pH 8), 150 mM NaCl y 10 mM EDTA, durante toda la noche a 50ºC. Tras la extracción con fenol saturado con Tris (pH 8) y la precipitación con NaOAc se trató la muestra con RNasa A, luego se extrajo con fenol-cloroformo y se dializó contra 10 mM Tris\cdotCl (pH 8), 1 mM EDTA.

Cebadores

Se diseñó un conjunto de cebadores para facilitar la amplificación con PCR de secuencias genómicas lambda diana que oscilan entre las 1,5 y 42,2 kilobases de longitud. Los cebadores en dirección 5' fueron diseñados para ser utilizados con cada uno de los cebadores en dirección 3' lo que da lugar a una serie de secuencias diana que aumentan su longitud entre 1 3 kilobases más.

Cada cebador del conjunto fue diseñado para tener aproximadamente la misma temperatura de fijación óptima (\sim68ºC) al seleccionar secuencias de cebado de entre 20 y 30 pares de bases de longitud de tal manera que el doblete híbrido formado entre el cebador y la secuencia diana tuviera una composición general de 12 pares G-C y de entre 8 y 11 pares de A-T. Se estimaron las temperaturas de fijación óptimas mediante el algoritmo "Tp" de Wu et al., 1991, DNA Cell Biol. 10:233-238.

Un par de cebadores adicionales, los de los genes J y cro, se diseñaron para permitir la amplificación de casi todos los insertos clonados con vectores derivados del fago lambda a partir tanto de calvas como de DNA aislado. Se muestran en la Tabla 2, más adelante.

Igualmente, los cebadores fueron diseñados para la amplificación de regiones del grupo del gen de la beta-globina humana. Esto se realizó de tal manera que un cebador en dirección 3' fijado podría utilizarse con una serie de cebadores en dirección 5' para amplificar dianas de 7,5 a 22kb. Los cebadores amplifican un región diana que se prolonga en dirección 5' a lo largo del gen de la delta-globina y en el segundo intrón del gen de la A-gammaglobina.

Las secuencias de nucleótidos de los cebadores que usan en los siguientes ejemplos (5' a 3') se muestran en la tabla 2, abajo. Las temperaturas de fundido (T_{m}) se calcularon básicamente en Vhetmur, 1991, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259. Los cálculos de la temperatura de fundido se llevaron a cabo tomando 2 cabos disponibles, cebador de 3,5 \mug/ml (\sim0,5 \muM), 80 mM Na^{+} y 1,5 mM Mg^{2+}. Las temperaturas de fundido que se calcularon oscilaron de 63 a 70ºC. La adición de un 10% de glicerol disminuye el T_{m} con 2,5ºC. Las secuencias de nucleótidos de cebador se evaluaron para posibles sitios de cebadura secundarios dentro de las secuencias de DNA molde y para la complementación de secuencias de intercebador e intracebador usando el programa Oligo 4.0 (National Biosciences, Plymouth, MN).

TABLA 2

2

Los cebadores se sintetizaron usando el método de cianoetoxifosfoforamidita (escala 1 \muM) en un sintetizador de DNA 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores se desprotegieron y se separaron de la resina en el 29% de NH_{3}/H_{2}O, entonces se desalaron con Sephadex G25 (NAP-10 columnas de Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Los resultados de cada síntesis fueron evaluados mediante la electroforesis de gel de policrilamida. Todas las cepas se realizaron con 10 mM Tris\cdotCl (pH 8 a 25ºC), 0,1 mM EDTA.

Polimerasa s de DNA termoestables

La polimerasa de DNA Tth recombinante (rTth) se compró en Perkin Elmer, Norwalk, CT. La polimerasa de DNA está Tli descrita en la Patente Estadounidense núm. 5.210.036. La polimerasa DNA Tli (Vent_{R}®) y la polimerasa de DNA de la especie Pyrococcus GB-D (Deep Vent_{R}®) se compraron en New England Biolabs, Beverly, MA. La polimerasa de DNA Tma está descrita en la publicación de patentes internacionales núm. WO 92/03556 donde aparece referida como pTma13-3. Una polimerasa de DNA modificada de la Thermatoga maritima está disponible a nivel comercial en Perkin Elmer, Norwalk, CT (UITma^{TM}).

Las diluciones (1/15 y 1/10) de las polimerasa s de DNA de Vent_{R}® y de Deep Vent_{R}® preferiblemente se harán en tampones para almacenar tal y como describe cada fabricante. En los ejemplos de abajo, sin embargo, los tampones de diluciones de Vent_{R}® que se utilizaron contenían 1 mM EDTA y 0,05% de Tween 20 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) en lugar de un 0,1% de Triton X-100. Esta modificación no tuvo ningún efecto en las reacciones de amplificación. Las diluciones de polimerasa Vent_{R}® se hacían nuevas semanalmente; La polimerasa de Deep Vent_{R}® se diluyó justo después de usarla. La polimerasa también se puede almacenar en el tampón de almacenamiento de polimerasa de DNA rTth que suministra el fabricante (100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Tween® 20, 50% (v/v) glicerol).

Componentes adicionales de tampones

El tampón estándar de polimerasa Tth de glicerol (5% (v/v), 10 mM Tris\cdotCl (pH 8,3), 100 mM KCl, 0,75 mM EGTA, 0,05% Tween 20) para la PCR se obtuvo en Perkin Elmer, Norwalk, CT. Las cepas de tampones de Tricina (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) a 1,0 M se ajustaron a su pH final (a 25ºC) con KOH. el Dimetilsulfóxido de grado de biología molecular (DMSO) y el glicerol eran de Sigma Chemicals, St. Louis, MO, y J.T. Baker Chemicals, Phillipsburg, NJ, respectivamente. El acetato potásico (KOAc) también se obtuvo en J.T. Baker Chemicals. La contribución de glicerol (normalmente un 1%) de los tampones de almacenamiento de enzimas no se incluyó en las concentraciones de glicerol dadas por cualquier tampón de PCR descrito aquí.

Métodos de la PCR

Todas las amplificaciones de DNA genómico lambda se realizaron en un ciclo térmico GeneAmp® PCR System 9600, usando probetas MicroAmp^{TM} con tapas individuales, todos comercializados por Perkin Elmer, Norwalk, CT. Los volúmenes de reacción fueron bien de 50 bien de 100 \mul. La concentración de cada dNTP fue de 0,2 mM para todas las reacciones, pero se variaron otros componentes de la reacción tal y como se comenta en el texto y están en la tabla 1.

Para minimizar la amplificación de las secuencias no específicas y la formación de los dímeros-cebadores, se realizaron "hot-starts" manuales en los que Mg^{2+} se retuvieron hasta que las muestras se hubieron incubado en el ciclo térmico a 75-80ºC durante \sim90 segundos. Entonces se añadió el Mg^{2+} necesario de una cepa de 25 mM (a temperatura ambiente). Después de la adición de Mg^{2+}, las muestras se incubaron durante unos 30-60 segundos más, para un total de 4 a 7 minutos a 75-80ºC antes del primer paso de desnaturalización. El tiempo total incluye el tiempo requerido para añadir el Mg^{2+} y por lo tanto depende del número total de probetas. En el ejemplo 6 se describe un procedimiento "hot-start" alternativo.

El ciclo térmico se programó para llevar a cabo dos perfiles de temperatura de dos pasos. Cada ciclo de amplificación consistía en la desnaturalización a 94ºC durante 10 segundos seguido de un apareamiento y una extensión a 68ºC durante 5 a 20 minutos. También se puede usar un paso de desnaturalización de 15 segundos. Para aparear y ampliar periodos de más de 12 a 14 minutos se usó la característica de autoprolongación del ciclo térmico para añadir de 15 a 20 segundos por ciclo, hasta unos \sim16 a 22 minutos finales. Las reacciones se llevaron a cabo para entre 25 y 40 ciclos, dependiendo del número de copia de la secuencia diana de inicio, la longitud de la diana y las condiciones de reacción. En la mayoría de las reacciones, se incluyeron un paso inicial de incubación de 10 segundos a 94ºC y un paso de incubación final de 10 minutos a 72ºC.

Las amplificaciones, descritas en los siguientes ejemplos, de insertos genómicos humanos clonados en lambda FIX II y de regiones de grupos génicos de beta-globina humanos se llevaron a cabo principalmente tal y como se ha descrito anteriormente, pero con las modificaciones que se detallan a continuación. Las condiciones específicas para la amplificación de los insertos genómicos humanos clonados en lambda FIX II de las suspensiones de placas en volúmenes de reacción de 100 \mul fueron las siguientes:

25 mM tricina (pH 8,7)

85 mM KOAc

12% (w/v) glicerol

0,2 mM cada dNTP

0,4 \muM cada cebador

1,75 U Tth polimerasa

0,02 U Tli polimerasa

1,15 mM Mg(OAc)_{2}

Se usó un hot-start de 80ºC con un perfil cíclico térmico de dos pasos, tal y como se ha descrito. El paso de apareamiento y de extensión fue inicialmente de 12 minutos a 68ºC y se amplió durante 15 segundos por ciclo para 32 ciclos.

Las condiciones específicas para la amplificación de la región del grupo génico de beta-globina humano de 37 ng de DNA KAS011 en volúmenes de reacción de 50 \mul fueron las siguientes:

20 mM tricina (pH 8,7)

85 mM KOAc

10% (w/v) glicerol

2% (v/v) DMSO

0,2 mM cada dNTP

0,2 \muM cada cebador

0,9 U Tth polimerasa

0,02 U Tli polimerasa

1,1 mM Mg(OAc)_{2}

Se utilizó un hot-start a 78ºC con un perfil cíclico térmico de dos pasos, tal y como se ha descrito arriba. El paso de apareamiento y extensión fue inicialmente de 12 minutos a 68ºC para 12 ciclos y entonces se amplió 12 segundos por ciclo para 24 ciclos.

Se pueden obtener rendimientos aumentados del producto amplificado mediante la adición de hasta 500 \mug/ml de BSA no acetilada a la reacción de amplificación.

Análisis de los productos de la PCR

Normalmente, se analizaban de 5 a 8 \mul de cada amplificación de la PCR en geles horizontales estándar formados de un 0,6% (w/v) Seakem GTG agarosa (FMC BioProducts, Rockland, ME) en 1X TBE (base de 89 mM Tris, ácido bórico 89 mM, 1 \muM a 2 mM EDTA) o en 1X TAE (40 mM Tris-acetato, 2 mM EDTA, pH 8 a 8,5) con 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio a unos 4 a 6V/cm durante 1,5 a 2 horas. Para una resolución de medida más amplia, se usaron dos alternativas: electroforesis de inversión campo en gel y electroforesis en gel de agarosa 0,3%.

La electroforesis de inversión campo en gel (FIGE) se realizó utilizando el sistema Hoefer (aparato de gel SuperSub, controlador de pulso Switchback y suministro de energía, todos de Hoefer, San Francisco, CA) con una unidad de enfriamiento (2219 Multitemp II de Pharmacia LKB). Entre 3 y 7 \mul de cada amplificación de PCR se analizaron en los geles FIGE de un 0,95% de agarosa en 0,5x TBE (a 1 \muM EDTA). Los geles FIGE se preejecutaron durante 15 minutos a 110 V, entonces se ejecutaron durante 22 a 25 horas a 140-145 V, con los tiempos de pulso de 0,65 a 1,95 o 0,75 a 2 segundos (frente:reverso = 2,8:1 o 3:1). Las temperaturas de ejecución se estimaron de a 12 a 15ºC.

De manera alternativa, cargar de 2 a 5 \mul en un 0,3% de agarosa de grado cromosómico (Bio.Rad, Richmond, CA) o GTG Seakem o Gold (FMC BioProducts, Rockland, MED) en 1X TAE. Enfriar el gel a 4ºC antes de quitar la cresta. Cargar de 5 a 8 \mul de la muestra y ejecutarlo en 1X TAE con un 0,5% de bromuro de etidio a 100V durante 2 minutos, y entonces o bien a 1,5V/cm durante 6 horas o bien a 0,7 V/cm durante 16 horas.

El tamaño de los productos amplificados se determinó por comparación con marcadores de peso molecular corridos en cada gel además de la muestra. Los marcadores de peso molecular utilizados fueron lambda/HindIII de New England Biolabs o bien de Gibco BRL, lambda/mono cut mix de New England Biolabs y escalera 1-kb de Gibco BRL.

Para realizar los análisis de restricción se digirieron alícuotas (10-16 \mul) de producto de amplificación por PCR de las amplificaciones de DNA lambda con BclI, BssHLL y MluI (New England Biolabs) o con BamHI, EcoRI y HindIII (Gibco BRL), y se utilizaron los tampones del fabricante previamente a la electroforesis. Las digestiones se llevaron a cabo durante 2,5 a 3 horas en reacciones de 30 a 36 \mul. Se analizaron muestras en geles de agarosa del 0,6 al 8%. Se digirieron alícuotas de muestras de PCR calvas (alícuotas de 10-30 \mul) con NotI (Stratagene) durante toda la noche en reacciones de 40 \mul.

Ejemplo 2 Amplificación de secuencias genómicas del fago Lambda

Las amplificaciones se llevaron a cabo mediante secuencias diana de muestras de DNA del fago lambda de alto número de copias (10^{7}-10^{8} copias de diana) tal como está descrito en el anterior Ejemplo 1. Se definieron dianas de 1,5 hasta 42,2 kb dentro de la secuencia (GenBank M 17233) mediante los diversos apareamientos de los cebadores enumerados en la anterior Tabla 2.

El producto amplificado fue analizado por electroforesis de inversión de campo en gel (FIGE) y visualizado mediante tinción de bromuro de etidio. Los rendimientos totales (por 50 \mul), estimados por comparación con el marcador de peso molecular lambda/HindIII, fueron estimados en entre 0,7 a 1 \mug de producto de 22,8 kb y 0,2 a 0,3 \mug de producto de 39 kb. Con rendimientos menores se amplificó una diana de 42,2 kb utilizando los cebadores SC1011 (Sec. Id. núm.:2) y SC1024 (Sec. Id. núm.:22).

Ejemplo 3 Amplificación de clones lambda a partir de calvas

Una utilidad importante de los métodos de la presente invención es la amplificación de insertos a partir de clones lambda sin aislamientos previos de DNA que requieran una intensa dedicación de trabajo y tiempo. Para demostrar la utilidad de los presentes métodos en la amplificación de dichos insertos se diseñaron los cebadores CF1018 ((Sec. Id. núm.:23) y SC1019 (Sec. Id. núm.:24) a partir de secuencias de los genes J y cro de lambda (véase la Tabla 2).

Las amplificaciones se llevaron a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 utilizando calvas seleccionadas aleatoriamente a partir de la biblioteca genómica humana en lambda FIX II descrita en el Ejemplo 1. Se analizaron los productos de amplificación mediante electroforesis en gel tras la digestión con NotlI para separar el inserto de las secuencias del vector flanqueantes. La presencia de ambos fragmentos del vector confirma que el inserto en su totalidad fue amplificado.

El tamaño de los insertos amplificados oscilaba entre menores de 10 kb hasta mayores de 20 kb. El fabricante estima que este vector lambda hospeda insertos de tamaños de entre 9 y 23 kb. Se determinó el tamaño de los insertos según su movilidad relativa a los marcadores de peso molecular en geles FIGE.

Ejemplo 4 Amplificación de dianas genómicas humanas

Se escogió el grupo de los genes de la betaglobina humana como modelo de dianas genómicas que tienen una gran probabilidad de contener secuencias repetitivas y sitios homólogos en otras partes del genoma. Los cebadores diseñados para el grupo de los genes de la betaglobina humana se muestran más arriba en la Tabla 2. Se apareó un cebador en dirección 3' con una serie de cebadores en dirección 5' que amplifican una región que se extiende en dirección 5' a lo largo del gen de la deltaglobina y dentro del segundo intrón del gen de la gamma globina-A. Se amplificaron dianas de 13,5; 17,7; 19,6 y 22 kb a partir de 37 ng (\sim10^{4} copias) de DNA genómico humano total, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las alícuotas de 12,5 \mul de los productos amplificados se cargaron en geles FIGE. Se utilizó un marcador de peso molecular lambda/HindIII para la comparación.

Para la comparación se amplificaron dianas de 16,5; 18,8; 20,8 y 22,8 kb a partir de 0,05 pg (\sim10^{3} copias) o 0,5 pg (\sim10^{4} copias) de DNA de fago lambda en un fondo de \sim3,7 ng o 37 ng, respectivamente, de DNA genómico placentario humano, bajo las mismas condiciones. También mediante la amplificación de un número diana de una entrada inferior que ya se había amplificado anteriormente de un número diana de entrada superior, los efectos atribuibles a un descenso de un número de copias diana de entrada se puede separar de los efectos atribuibles a una diferencia en la secuencia diana.

Se amplificaron secuencias diana de hasta 22 kb de longitud del grupo de los genes de la betaglobina humana. La amplificación de las dianas de betaglobina fue menos eficiente que la de las secuencias lambda de longitud similar que se encontraban en un nivel de copia única en un fondo de DNA placentario humano, a la misma concentración general que la diana de globina o bien a una concentración diez veces menor. Estas diferencias en eficiencia pueden reflejar la relativa complejidad de las secuencias aunque la diana lambda también se encontraba en un fondo genómico humano. La mayor probabilidad de que las dianas largas contengan sitios lo suficientemente homólogos como para funcionar como sitios de fijación de cebadores secundarios, y la presencia de secuencias repetitivas en secuencias genómicas humanas, pueden explicar por qué las dianas lambda eran amplificadas más eficientemente que las dianas del gen de la betaglobina de longitud comparable.

El problema de los sitios de cebado secundarios también afectaba a la elección de cebadores adecuados para la amplificación de dianas del gen de la betaglobina. El cebador inverso RH1053 (Sec. Id. núm.: 32), que hibrida 5' con el gen de la betaglobina, se escogió porque RH1016 (Sec. Id. núm.: 31), que hibrida en el exón 2 del gen de la betaglobina, también hibrida con un sitio secundario en el caso de dianas mayores de 14 kb lo que da como resultado múltiples productos. El cebador directo RH1020 (Sec. Id. núm.: 26) dio lugar a múltiples productos secundarios igual que el uso de otros dos cebadores (no mostrados) a 100 bases de RH1020 (Sec. Id. núm.: 26). Los tres se encuentran sobre una secuencia de repetición Alu.

Los resultados de amplificaciones de secuencias de hasta 16kb de longitud del gen humano de la neurofibromatosis-1 sugirió también que los métodos para asegurar la especificidad de los cebadores son cruciales para una amplificación con PCR de secuencias diana largas eficiente.

Ejemplo 5 Combinaciones de polimerasas de DNA

Para tener acceso a la eficiencia relativa de diversas combinaciones de polimerasas de DNA las reacciones de amplificación se llevaron a cabo básicamente tal como se describe en el Ejemplo 1, es decir, utilizando cebadores que amplifican secuencias diana de 22,8; 26,4; 29,9 y 33,9kb de longitud. Las combinaciones de polimerasas de DNA comparadas fueron las siguientes:

2,5 U Polimerasa de DNA rTth + 0,02 U Vent_{R}® Polimerasa de DNA

2,5 U Polimerasa de DNA rTth + 0,06 U Deep Vent_{R}® Polimerasa de DNA

3,15 U Polimerasa de DNA rTth + 0,5 U Tma Polimerasa de DNA

Todas las reacciones se llevaron a cabo en 50 \mul, con 10^{7} copias de DNA lambda, 0,45 \muM cada cebador y 1,0-1,1 mM Mg(OAc)_{2}. Se utilizaron las siguientes condiciones específicas.

Las reacciones que utilizaron rTth y Vent_{R}® o bien rTth y Deep Vent_{R}® polimerasas de DNA se llevaron a cabo en 20 mM de tricina (pH 8,7), 85 mM KOAc, 10% de glicerol y 3% DMSO. Las reacciones que utilizaron rTth y Tma Polimerasa s de DNA se llevaron a cabo en 20 mM de tricina (pH 8,7), 85 mM KOAc, 10% de glicerol y 2,5% DMSO.

El perfil del ciclo de temperatura fue básicamente como el descrito en el Ejemplo 1. Se utilizó una prolongación inicial de 13 minutos para los primeros 9 ciclos. Entonces se aumentó el tiempo de prolongación hasta 13,5 minutos y en 20 segundos cada ciclo siguiente durante 18 ciclos. Se cargaron alícuotas de 7 \mul de cada reacción en gel de agarosa estándar junto con 150ng del marcador de peso molecular lambda/HindIII.

Todos los moldes (hasta 33,9kb) se amplificaron mediante combinaciones de polimerasa de DNA rTth con Vent_{R}®, Deep Vent_{R}® y polimerasas de DNA Tma. La combinación de 2,5 U polimerasa de DNA rTth y 0,02 U Vent_{R}® polimerasa de DNA amplificó todas las dianas con una eficiencia máxima.

Ejemplo 6 Equipo de amplificación con PCR

Los reactivos de la invención son adecuados para ser incluidos en un equipo para llevar a cabo una amplificación con PCR de secuencias diana largas. Un equipo contiene por lo menos una mezcla de polimerasas de DNA como se describe aquí. Algunos componentes adicionales opcionales incluyen reactivos adicionales y recipientes de reacción utilizados en las reacciones abajo descritas.

Una combinación preferible de polimerasas de DNA que sea útil para amplificar dianas tanto de alto número de copias como de bajo número consiste en rTth y Vent_{R}® polimerasas de DNA en una proporción de 2 unidades de rTth polimerasa de DNA por 0,08 unidades de Vent_{R}® polimerasa de DNA. A pesar de que, como se muestra a continuación, la concentración de polimerasa s preferible para la amplificación de dianas de alto número de copias es el doble que la concentración preferible para la amplificación de dianas de bajo número de copias, la proporción de polimerasa s primarias respecto a las secundarias es la misma.

Un tampón de reacción adecuado para incluirlo en un equipo consiste en tricina, KOAc, glicerol y DMSO en las siguientes concentraciones aproximadamente:

2 mM tricina (pH 8,7)

80 mM KOAc

10% (w/v) glicerol

2,25 (v/v) DMSO

El término "aproximadamente" pretende englobar una tolerancia de fabricación estándar de más del 10% o de menos del 10%. Si es más práctico, el tampón de la reacción se puede guardar en una concentración mayor y después diluirse antes de utilizar.

Las amplificaciones se llevan a cabo utilizando los componentes del equipo preferibles básicamente de la manera antes descrita, pero bajo las condiciones de reacción descritas más abajo. Estos reactivos y condiciones han sido utilizados ampliamente y se ha encontrado que proporcionan una amplificación de secuencias diana largas fiable.

Las condiciones preferibles para la amplificación de dianas (p. ej. genómicas humanas) de bajo número de copias (2,0 x 10^{4} copias) en volúmenes de reacción de 100 \mul son las siguientes:

25 mM tricina (pH 8,7)

80 mM KOAc

10% (w/v) glicerol

2,25 (v/v) DMSO

0,2 mM cada dNTP

0,2 \muM cada cebador

2 U polimerasa rTth

0,08 U Vent_{R}® polimerasa

1,1 mM Mg(OAc)_{2}

Los parámetros del ciclo preferibles para la amplificación de dianas de bajo número de copias (>10kb) son los siguientes:

Desnaturalización	94ºC	1 minuto
20 ciclos	94ºC	15 segundos
	68ºC	12 minutos
17 ciclos	94ºC	15 segundos
	68ºC	12 minutos con 15
		segundos de autoprolongación
Prolongación final	72ºC	10 minutos
Mantenimiento	4ºC	indefinido

Las condiciones preferibles para la amplificación de dianas (p. ej. DNA clonado) de número elevado de copias (2,0 x 10^{7} copias) en volúmenes de reacción de 100 \mul son las siguientes:

25 mM tricina (pH 8,7)

80 mM KOAc

10% (w/v) glicerol

2,25 (v/v) DMSO

0,2 mM cada dNTP

0,4 \muM cada cebador

4 U polimerasa rTth

0,16 U Vent_{R}® polimerasa

1,1 mM Mg(OAc)_{2}

Los parámetros del ciclo preferibles para la amplificación de dianas de alto número de copias (>10 kb) son los siguientes:

\newpage

Desnaturalización	94ºC	1 minuto
16 ciclos	94ºC	15 segundos
	68ºC	10 minutos
12 ciclos	94ºC	15 segundos
	68ºC	10 minutos con 15
		segundos de autoprolongación
Prolongación final	72ºC	10 minutos
Mantenimiento	4ºC	indefinido

Se consigue un "hot-start" mediante la separación de reactivos en los tubos de reacción utilizando perlas de cera Ampliwax™ PCR Gem 100, desarrolladas y fabricadas por Hoffmann-La Roche y comercializadas por Perkin Elmer, Norwalk, CT. Se añade al tubo de reacción una capa inferior de 40 \mul que contiene tampón (tricina, KOAc, glicerol y DMSO), Mg(OAc)_{2} y los dNTP. Se asienta una capa de cera sobre la capa inferior añadiendo Ampliwax™ PCR Gem 100 y incubándolo en un ciclo térmico primero a 80ºC durante 5 minutos y luego a 25ºC durante 5 minutos. Entonces se añade una capa superior de reactivo de 60 \mul que contiene tampón, la mezcla de polimerasas de DNA , los cebadores y el DNA diana.

Las muestras se analizan tal como se ha descrito anteriormente sobre un gel de agarosa 0,6% en 1X TAE y 0,5 \mug/ml EtBr durante 1,5 horas a 7 V/cm.

Claims (7)

1. Composición de polimerasas de DNA para la amplificación de reacción en cadena de la polimerasa de secuencias de ácido nucleico mayores de 10kb formadas por una combinación de una primera polimerasa de DNA y una segunda polimerasa de DNA; la primera es polimerasa de DNA Thermus thermophilus y la segunda es una polimerasa de DNA termoestable que incrementa la longitud máxima de la diana amplificable al proporcionar tanto actividad exonucleasa 3' a 5' como la actividad polimerasa. Dicha composición de polimerasa de DNA consiste en unas 0,8 a 2,5 unidades de la primera Polimerasa de DNA para cada 0,015 a 0,15 unidades de la segunda polimerasa de DNA.

2. Una composición de polimerasa de DNA de la reivindicación 1 donde las secuencias de ácido nucleico que se pretenden amplificar están en el rango de 23 a 42kb.

3. La composición de la polimerasa de DNA de las reivindicaciones 1 y 2, donde dicha composición de polimerasa de DNA consiste en unas 2 unidades de la primera polimerasa de DNA para cada 0,08 unidades de la segunda polimerasa de DNA.

4. Un proceso para amplificar un ácido nucleico usando una composición de polimerasa de DNA tal y como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3.

5. Uso de una composición de polimerasa de DNA tal y como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 para amplificar un ácido nucleico.

6. Equipo que comprende una composición de polimerasa de DNA tal y como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3.

7. Equipo de la reivindicación 6 que además comprende un tampón de reacción para la amplificación de la reacción en cadena de polimerasa de las secuencias de ácido nucleico largas, donde dicho tampón de reacción preferiblemente comprende unos 25 mM de tricina, 80 mM de KOAc, 10% (w/v)de glicerol y un 2,25% (v/v) de DMSO.