ES2293141T3 - Procedimiento de deteccion de una molecula adn diana. - Google Patents

Procedimiento de deteccion de una molecula adn diana. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ADN diana específica que comprende: a) proporcionar: i) un ácido nucleico diana que tiene una región 3'' adyacente a y secuencia abajo de una región 5''; ii) un primer oligonucleótido que comprende una porción que es complementaria con dicha región 3'' de dicho ácido nucleico diana, y iii) un segundo oligonucleótido, que comprende una porción 3'' y una porción 5'', en el que dicha porción 3'' de dicho segundo oligonucleótido es complementaria con dicha región 5'' de dicho ácido nucleico diana, y en el que dicha porción 5'' de dicho segundo oligonucleótido no es complementaria con dicho ácido nucleico diana, proporcionando de esta manera un brazo de hebra única en el extremo 5'' de dicho segundo oligonucleótido; b) mezclar dicho ácido nucleico diana, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido bajo condiciones en las que dicho primer oligonucleótido y dicha porción 3'' de dicho segundo oligonucleótido se alineancon dicha secuencia de ADN diana para crear una primera estructura de escisión; c) proporcionar un medio de escisión bajo condiciones tales que la escisión de dicha primera estructura de escisión se produzca de preferencia en un sitio localizado dentro de dicho segundo oligonucleótido de una manera dependiente de la alineación de dichos primer y segundo oligonucleótidos sobre dicho ácido nucleico diana, liberando de esta manera el brazo de hebra única de dicho segundo oligonucleótido para generar un tercer oligonucleótido; d) proporcionar una primera estructura de horquilla que tiene un brazo 3'' de hebra única y un brazo 5'' de hebra única bajo condiciones en las que dicho tercer oligonucleótido se alinea con dicho brazo 3'' de hebra única de dicha primera horquilla, creando de esta manera una segunda estructura de escisión; e) proporcionar condiciones bajo las que la escisión de dicha segunda estructura de escisión se produzca por medio de dichos medios de escisión de una manera dependiente de la alineación de dicho tercer oligonucleótido, liberando de esta manera el brazo 5'' de hebra única de dicha segunda estructura de escisión para crear productos de reacción que comprenden un cuarto oligonucleótido y una primera molécula de detección de horquilla escindida, y f) detectar la presencia de dicho cuarto oligonucleótido o dicha primera molécula de detección de horquilla escindida.

Description

Procedimiento de detección de una molécula ADN diana.
Campo de la invención
La presente invención está definida en las reivindicaciones y se refiere a medios para escindir una estructura de escisión de ácido nucleico de una manera específica de sitio. En particular, la presente invención se refiere a una enzima de escisión que tiene actividad nucleasa 5' sin que interfiera con la capacidad sintética de ácido nucleico.
Antecedentes de la invención
La detección de secuencias específicas de ácido nucleico se ha utilizado para diagnosticar la presencia de secuencias de ácido nucleico viral o bacteriano indicadoras de una infección, la presencia de variantes o alelos de genes de mamíferos asociados con enfermedad y la identificación de la fuente de ácidos nucleicos hallados en muestras forenses y en determinaciones de paternidad.
La detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos se ha logrado típicamente por hibridación. Los procedimientos de hibridación incluyen la alineación de una secuencia complementaria con el ácido nucleico diana (la secuencia a detectar). La capacidad de dos polímeros de ácido nucleico que contienen secuencias complementarias para encontrarse el uno al otro y alinearse a través de la interacción de apareamiento de bases es un fenómeno bien reconocido. Las primeras observaciones del procedimiento de "hibridación" de Marmur y Lane, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:453 (1960) y Doty y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:461 (1960) han sido seguidas por el refinamiento de este procedimiento en una herramienta esencial de la biología moderna.
Los estudios iniciales de hibridación, tales como aquellos realizados por Hayashi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50:664 (1963), se llevaron a cabo en solución. Otro desarrollo llevó a la inmovilización del ADN o ARN diana en soportes sólidos. Con el descubrimiento de endonucleasas de restricción específicas de Smith y Wilcox, J. Mol. Biol. 51:379 (1970), fue posible aislar fragmentos discretos de ADN. La utilización de técnicas de inmovilización tales como aquellas descritas por Southern, J. Mol. Biol. 98:503 (1975), en combinación con enzimas de restricción, permitió la identificación por hibridación de copias únicas de genes entre una masa de ADN genómico, fraccionado.
A pesar de los progresos realizados en la metodología de hibridación, una serie de problemas ha impedido el uso de hibridación a gran escala como una herramienta en el diagnóstico en seres humanos. Entre los problemas más importantes están: 1) la ineficacia de la hibridación; 2) la baja concentración de las secuencias diana específicas en una mezcla de ADN genómico; y 3) la hibridación de sondas y dianas sólo parcialmente complementarias.
Los procedimientos para detectar la presencia de una molécula específica de ADN diana son conocidos de la técnica anterior. Lyamichev, V. y col.; Science 1993, vol. 260, páginas 778-783 describen polimerasas de ADN termoestables eubacterianas (DNAP); por ejemplo, DNAP-Taq que tienen una actividad exonucleasa 5' y por consiguiente la capacidad para escindir sustratos horquilla de ADN. El documento WO 92/02638 A describe un procedimiento para detectar una secuencia diana de ácido nucleico que comprende el uso de una polimerasa de ADN que tiene una actividad nucleasa 5', que finalmente da como resultado la liberación de fragmentos marcados. El documento WO 91/17264 A describe un procedimiento para detectar ácidos nucleicos que comprende el uso de sondas que hibridan con el ácido nucleico diana y un "agente nucleolítico" que degrada la sonda cuando está hibridada con la secuencia diana. El producto de degradación se detecta a continuación, por ejemplo por quimioluminiscencia, fluorescencia o radiactividad. El documento WO 89/10415 A describe un procedimiento para detectar un ácido nucleico diana que comprende formar un primer complejo diana-sonda y una posterior etapa de mellado que da como resultado que los fragmentos de las sondas se vuelvan de hebra única y sean capaces de hibridar con otra sonda que puede posteriormente detectarse. El documento WO 89/09284 A describe un procedimiento de detección para secuencias de ácidos nucleicos, que comprende el uso de secuencias diana como un cofactor para una reacción enzimática, en el que se usa una sonda marcada para formar un primer complejo sonda/diana que se escinde para liberar la secuencia diana
intacta.
1. Hibridación Ineficaz
Experimentalmente se observa que en una reacción de hibridación sólo se forma una fracción del número posible de complejos sonda-diana. Esto es particularmente cierto con sondas cortas de oligonucleótidos (menos de 100 bases de longitud). Hay tres causas fundamentales: a) la hibridación no puede producirse debido a interacciones de estructuras secundaria y terciaria; b) hebras de ADN que contienen la secuencia diana se han rehibridado (realineación) con su hebra complementaria; y c) se impide la hibridación de algunas moléculas diana cuando se usan en formatos de hibridación que inmovilizan los ácidos nucleicos diana a una superficie sólida.
Incluso donde la secuencia de una sonda es completamente complementaria con la secuencia de la diana, es decir, la estructura primaria de la diana, debe hacerse accesible la secuencia diana a la sonda por medio de rearreglos de estructura de orden superior. Estos rearreglos estructurales de orden superior pueden afectar a la estructura secundaria o a la estructura terciaria de la molécula. La estructura secundaria está determinada por enlaces intramoleculares. En el caso de dianas de ADN o ARN ésta está constituida por hibridación dentro de una hebra de bases única, continua (opuesta a la hibridación entre dos hebras diferentes). Dependiendo de la extensión y posición de los enlaces intramoleculares, la sonda puede desplazarse de la secuencia diana evitando la hibridación.
La hibridación de sondas de oligonucleótidos en solución con ADN de doble hebra desnaturalizado es además complicada por el hecho de que las hebras diana complementarias más largas pueden renaturalizar o realinearse. Otra vez, en este procedimiento se desplaza la sonda hibridada. Esto da como resultado un bajo rendimiento de hibridación (baja "cobertura") con relación a las concentraciones de partida de sonda y diana.
La inmovilización de ácidos nucleicos diana a superficies sólidas tales como nylon o nitrocelulosa es una práctica común en biología molecular. Los formatos de inmovilización eliminan el problema de reasociación que puede producirse entre hebras complementarias de moléculas diana, pero no elimina los problemas asociados con los efectos de la estructura secundaria. Sin embargo, estos formatos de fases mixtas (es decir, hibridación Southern o hibridación de transferencia de mancha) necesitan procedimientos de fijación que consumen tiempo. La reacción de hibridación por sí misma es cinéticamente más lenta que una reacción de hibridación en fase de solución. Juntos, los procedimientos de fijación e hibridación requieren un mínimo de varias horas hasta varios días para realizarse. Además, los procedimientos de inmovilización convencionales son a menudo ineficaces y dan como resultado la unión de muchas de las moléculas diana a múltiples porciones sobre la superficie sólida, convirtiéndolas en incapaces de hibridar posteriormente con las moléculas de sonda. Por lo general, estos efectos combinados dan como resultado un bajo porcentaje de las moléculas diana iniciales unidas por sondas en una reacción de hibridación.
2. Baja Concentración de la Secuencia Diana
En experimentos de laboratorio, se usan sondas y dianas purificadas. Las concentraciones de estas sondas y dianas pueden, más aún, ajustarse según la sensibilidad requerida. Por el contrario, el objetivo en la aplicación de hibridación a diagnósticos médicos es la detección de una secuencia diana a partir de una mezcla de ADN genómico. Usualmente el fragmento de ADN que contiene la secuencia diana está en cantidad relativamente baja en el ADN genómico. Esto presenta grandes dificultades técnicas; la mayoría de los procedimientos convencionales que usan sondas de oligonucleótidos carecen de la sensibilidad necesaria para detectar hibridación a niveles tan bajos.
Un intento para solucionar el problema de la concentración de la secuencia diana es la amplificación de la señal de detección. Más frecuentemente esto supone colocar una o más etiquetas en una sonda de oligonucleótidos. En el caso de etiquetas no radiactivas, se ha encontrado que incluso los reactivos de mayor afinidad son inadecuados para la detección de genes de copias únicas en ADN genómico con sondas de oligonucleótidos. Véase Wallace y col., Biochimie 67:755 (1985). En el caso de sondas de oligonucleótidos no radiactivas, se ha encontrado que sólo actividades altamente específicas muestran resultados satisfactorios. Véase Studencki y Wallace, DNA 3:1 (1984) y Studencki y col., Human Genetics 37:42 (1985).
La tecnología de reacción en cadena de polimerasa (PCR) proporciona un enfoque alternativo a los problemas de baja concentración de la secuencia diana. Puede usarse PCR para incrementar directamente la concentración de la diana previo a la hibridación. En las Patentes de EEUU Nº 4.683.195 y 4.683.202, Mullis y col. se describe un procedimiento para incrementar la concentración de un segmento de la secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación.
Este procedimiento para amplificar la secuencia diana está constituido por la introducción de un exceso molar de dos cebadores de oligonucleótidos a la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada. Los dos cebadores son complementarios con sus hebras respectivas de la secuencia de doble hebra. La mezcla se desnaturaliza y a continuación se deja hibridar. Tras la hibridación, se extienden los cebadores con polimerasa para formar hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión con polimerasas pueden repetirse las veces necesarias para obtener una concentración relativamente alta de un segmento de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento de la secuencia diana deseada está determinada por las posiciones relativas de los cebadores uno respecto del otro, y, por consiguiente, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del procedimiento, los inventores denominan al procedimiento como "Reacción en Cadena de Polimerasa" (o PCR). Dado que el segmento deseado de la secuencia diana se convierte en las secuencias dominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que son "amplificadas por PCR".
Sin embargo el procedimiento de PCR es susceptible de producir fragmentos no-diana durante el procedimiento de amplificación. La extensión espuria de cebadores en regiones parciales tiene lugar durante las reacciones de PCR. Los factores que influyen en la especificidad del procedimiento de amplificación incluyen: a) la concentración de la secuencia diana en el ADN a analizar; b) la concentración de Mg^{++}, enzima polimerasa y cebadores; c) el número de ciclos de amplificación realizados; y d) las temperaturas y tiempos usados en las diversas etapas en el procedimiento de amplificación [PCR Technology - Principles and Applications for DNA Amplification (H. A. Erlich, Ed.), Stockton Press, Nueva York, pág. 7-16 (1989)]. Cuando la secuencia diana específica está presente en baja concentración en el ADN de la muestra, se producen más fragmentos no-diana. La baja concentración de diana es frecuentemente la norma en muestras clínicas en las que la diana puede estar presente como una copia única en el genoma o en las que está presente muy poco ADN viral como en las infecciones por VIH.
Puesto que se obtienen productos de amplificación que no representan la secuencia diana específica a detectar, los productos de una reacción de PCR deben analizarse usando una sonda específica para el ADN diana. La detección de productos de amplificación específicos se ha logrado por medio de la hibridación de una sonda específica para la secuencia diana con los productos de reacción inmovilizados sobre un soporte sólido. Tal procedimiento de detección es engorroso y está sometido a los mismos problemas asociados con la detección de cualquier molécula diana por medio de hibridación como se discutió anteriormente.
Holland y col. han descrito un ensayo de detección no basado en hibridación para productos de PCR específicos en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276 (1991). En este sistema de detección, se usa la actividad nucleasa 5' de la polimerasa de ADN de tipo salvaje de Thermus aquaticus ("DNAPTaq") para generar un producto detectable específico concomitantemente con la amplificación. Se marca una sonda de oligonucleótidos específica para el ADN diana en el extremo 5' y se añade a la reacción de PCR junto con los cebadores sin marcar usados para extender la diana a amplificar. La actividad nucleasa 5' de DNAPTaq escinde la sonda marcada alineada con el ADN diana previo a que la extensión del cebador se complete, generando un fragmento más pequeño de la sonda. Este sistema de detección requiere que la amplificación se realice sobre la muestra para obtener el producto de detección específico. Esto es lento y requiere equipamiento engorroso.
En este sistema de detección se usó un mínimo de 100 copias de partida (es decir, número de copias previo a la amplificación) de ADN diana; no está claro si una cantidad menor de copias de partida de ADN diana darán resultados detectables usando este procedimiento. Un número muy bajo de copias puede resultar un problema para algunas muestras clínicas en las que se obtiene muy poca cantidad de ADN debido a restricciones en el tamaño de muestra (sangre de neonatos o fetos, muestras forenses, etc.).
Mientras que tal ensayo es una mejora sobre los procedimientos de detección de hibridación anteriores, aún necesita que se realice una reacción de PCR sobre la muestra y tiene ciertos problemas inherentes. Uno de tales problemas es que el sistema necesita que la sonda de detección se una al ADN diana previo a que se produzca la extensión del cebador. Si la extensión tiene lugar primero, el sitio de unión de la sonda no estará disponible y no se producirá digestión de la sonda y por consiguiente no se producirá señal detectable. Para solucionar este problema el usuario puede variar las cantidades relativas de cebador y sonda o manipular la secuencia y longitud de la sonda. La necesidad de tal optimización puede resultar onerosa para los laboratorios clínicos.
3. Complementariedad Parcial
La hibridación, sin tener en cuenta el procedimiento usado, necesita cierto grado de complementariedad entre la secuencia a ensayar (la secuencia diana) y el fragmento de ADN usado para realizar la prueba (la sonda). (Por supuesto, uno puede obtener unión sin ninguna complementariedad pero esta unión es inespecífica y debe evitarse). Para muchas aplicaciones diagnósticas, no es importante determinar si la hibridación representa complementariedad completa o parcial. Por ejemplo, donde se desea detectar simplemente la presencia o ausencia de ADN de patógeno (tal como de un virus, bacteria, hongo, micoplasma, protozoario) sólo es importante que es procedimiento de hibridación asegure la hibridación cuando la secuencia relevante esté presente; pueden seleccionarse condiciones en las que hibridarán tanto las sondas con complementariedad parcial como las que tienen complementariedad completa. Otras aplicaciones diagnósticas, sin embargo, pueden necesitar que el procedimiento de hibridación distinga entre secuencias diana variantes. Por ejemplo, puede ser de interés que esté presente una variante alélica particular de un patógeno. Estas secuencias normales y variantes pueden diferir en una o más bases.
Existen otras aplicaciones que pueden necesitar que el procedimiento de hibridación distinga entre complementariedad parcial y completa. Puede resultar de interés detectar polimorfismos genéticos. La hemoglobina humana está compuesta, en parte, de cuatro cadenas de polipéptidos. Dos de estas cadenas son cadenas idénticas de 141 aminoácidos (cadenas alfa) y dos de estas cadenas son cadenas idénticas de 146 aminoácidos (cadenas beta). Se conoce que el gen que codifica la cadena beta exhibe polimorfismo. El alelo normal codifica una cadena beta que tiene ácido glutámico en la sexta posición. El alelo mutante codifica una cadena beta que tiene valina en la sexta posición. Esta diferencia en aminoácidos tiene un impacto fisiológico profundo (más profundo cuando el individuo es homocigota para el alelo mutante) conocido clínicamente como anemia de células falciformes. Es bien conocido que la base genética del cambio de aminoácidos incluye la diferencia de una única base entre la secuencia de ADN del alelo normal y la secuencia de ADN del alelo mutante.
A menos que se combinen con otras técnicas (tales como análisis con enzimas de restricción), los procedimientos de hibridación que permiten el mismo nivel de hibridación en el caso de complementariedad parcial así como completa, son inadecuados para tales aplicaciones; la sonda hibridará con ambas secuencias diana, normal y variante.
Se han ideado procedimientos para permitir discriminar entre complementariedad parcial y completa. Un enfoque es aprovechar los requerimientos de temperaturas de la hibridación específica bajo estudio. En experimentos típicos de curva de fusión, tales como aquellos descritos por Wallace y col., Nucl. Acids Res. 6:3543 (1979) y Nucl. Acids Res. 9:879 (1981), se lava un complejo sonda-diana inmovilizado a temperaturas crecientes bajo condiciones de no-equilibrio. Se observa que los complejos sonda-diana parcialmente complementarios muestran una estabilidad térmica más baja en comparación con los complejos sonda-diana completamente complementarios. Esta diferencia puede usarse, por consiguiente, para determinar si la sonda ha hibridado con la secuencia diana parcialmente complementaria o con la secuencia diana completamente complementaria.
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Los procedimientos convencionales que usan la naturaleza dependiente de la temperatura de la hibridación son útiles. La aplicación de este procedimiento para discriminar mutaciones de bases únicas en dianas genómicas humanas está limitada al uso de sondas cortas de oligonucleótidos en las que la interacción de la hibridación con la secuencia diana está en el intervalo de tamaños desde 17 bases hasta 25 bases de longitud. El límite inferior de longitud está determinado por la probabilidad aleatoria de tener un complemento con la sonda en el genoma humano, que es mayor que 1 para una interacción aleatoria de 16 pares de bases, pero menor que 1 para interacciones de 17 bases o más de longitud. El límite superior es uno de practicidad. Es difícil diferenciar los acoplamientos erróneos de bases únicas en base a la estabilidad térmica para interacciones con longitud mayor a 25 bases. Estos procedimientos convencionales consumen desafortunadamente también mucho tiempo. La concentración de las sondas en estos experimentos es de aproximadamente 1-5 x 10^{-10} M. Estas concentraciones se obtienen empíricamente; minimizan el uso de sonda y simultáneamente proporcionan discriminación suficiente para distinguir genes de copia única usando sondas de longitud de aproximadamente 20 nucleótidos. Los tiempos de hibridación son de dos a diez horas con estas concentraciones. Tras la hibridación, se usan varios lavados de rigurosidad variable para eliminar el exceso de sonda, sonda unida inespecíficamente, y sonda unida a secuencias parcialmente complementarias en el genoma diana. Es necesario un control cuidadoso de estas etapas de lavado, ya que la proporción de señal (sonda unida específicamente) con respecto al ruido (sonda unida inespecíficamente) del experimento se determina finalmente por los procedimientos de lavado.
Ningún procedimiento descrito hasta el momento ha solucionado los tres problemas discutidos anteriormente. El procedimiento de PCR soluciona el problema de la baja concentración de diana. Sin embargo, la detección específica de productos de PCR por medio de cualquier procedimiento de hibridación está sometido a los mismos problemas asociados con la detección de cualquier molécula diana. La detección de diferencias de bases únicas entre dianas de PCR se logró inicialmente a través del uso de un análisis con enzimas de restricción de los productos completos de hibridación formados entre sondas de oligonucleótidos y dianas de PCR. Esta técnica está limitada por el hecho de que las enzimas de restricción no existen para todas las secuencias. Estudios más recientes han logrado la discriminación sin enzimas de restricción, sin embargo estos estudios han incluido la inmovilización ineficaz de ácidos nucleicos diana a superficies sólidas [hibridación de transferencia de mancha; Saiki y col., Nature 324:163 (1986)].
Otro procedimiento para la detección de variantes específicas de alelo está descrito por Kwok y col., Nucl. Acids Res. 18:999 (1990). Este procedimiento está basado en el hecho de que es difícil para una DNAP sintetizar una hebra de ADN cuando existe un acoplamiento erróneo entre la hebra modelo y el cebador. El acoplamiento erróneo impide la extensión impidiendo de esta manera la amplificación de un ADN diana que no es perfectamente complementario con el cebador usado en una reacción de PCR. Aunque puede detectarse una variante específica de alelo por medio del uso de un cebador que acopla perfectamente con sólo uno de los posibles alelos, este procedimiento de detección es ingenioso y tiene limitaciones. Resulta particularmente problemático el hecho de que la composición de bases del acoplamiento erróneo influye en la capacidad para impedir la extensión a lo largo de los acoplamientos erróneos. Ciertos acoplamientos erróneos no impiden la extensión o tienen sólo un mínimo efecto.
Un procedimiento ideal para detectar ADN diana específicos tendría que permitir la detección sin necesidad de amplificar el ADN de la muestra primero y tendría que permitir la detección de secuencias diana que están presentes en bajo número de copias en la muestra de ADN. El procedimiento ideal tendría que permitir también discriminar entre variantes de las secuencias diana de manera que puedan distinguirse variaciones de bases únicas entre alelos de genes de mamíferos.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos que soluciona los problemas mencionados anteriormente.
Resumen de la invención
La presente invención está definida en las reivindicaciones y se refiere a los medios para escindir una estructura de escisión de ácido nucleico de una manera específica de sitio. El medio para escindir es una enzima de escisión que comprende 5' nucleasas derivadas de polimerasas de ADN termoestables. Estas polimerasas forman la base de un nuevo procedimiento para detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos. La presente invención contempla el uso de un procedimiento de detección nuevo para, entre otros usos, utilidades de diagnóstico clínico.
En una forma de realización, la presente invención contemple una secuencia de ADN que codifica una polimerasa de ADN alterada en secuencia (es decir, una polimerasa "mutante" de ADN) relacionada con la secuencia nativa de manera que exhiba actividad sintética de ADN alterada con respecto a la polimerasa de ADN nativa (es decir, "tipo salvaje"). Resulta de preferencia que la polimerasa de ADN codificada esté alterada de manera que exhiba actividad sintética reducida con respecto a la polimerasa de ADN nativa. De esta manera, las enzimas usadas en el procedimiento de la invención son predominantemente 5' nucleasas y son capaces de escindir ácidos nucleicos de una manera específica de estructura en ausencia de actividad sintética interferente.
Es importante destacar que las 5' nucleasas de la presente invención son capaces de escindir estructuras lineales de doble hélice para crear productos de escisión discretos únicos. Estas estructuras lineales 1) no son escindidas por las enzimas de tipo salvaje (en cualquier grado significativo), o 2) son escindidas por las enzimas de tipo salvaje para crear productos múltiples. Se ha encontrado que esta característica de las 5' nucleasas es coherente de las enzimas derivadas de esta manera de polimerasas termoestables a través de especies eubacterianas termófilas.
No existe limitación por la naturaleza de la alteración necesaria para dar la síntesis de polimerasa deficiente ni la extensión de la deficiencia y se contempla la estructura alterada (primaria, secundaria, etc.) así como la estructura nativa inhibida por inhibidores de síntesis.
Donde la estructura está alterada, no existe limitación por los medios por medio de los que se altera la estructura de la polimerasa. La alteración de la secuencia de ADN nativa puede comprender un cambio en un único nucleótido. La alteración de la secuencia de ADN nativa puede comprender una deleción de uno o más nucleótidos. La alteración de la secuencia de ADN nativa puede comprender una inserción de uno o más nucleótidos. En cualquiera de estos casos, el cambio en la secuencia de ADN puede manifestarse por sí mismo en un cambio en la secuencia de aminoácidos.
En los procedimientos de la presente invención pueden usarse 5' nucleasas de una diversidad de fuentes. Las 5' nucleasas de preferencia son termoestables. Las 5' nucleasas termoestables están contempladas como particularmente útiles ya que funcionan a temperaturas en las que la hibridación de ácidos nucleicos es extremadamente específica, permitiendo la detección específica de alelos (incluyendo acoplamientos erróneos de bases únicas). En una forma de realización, las 5' nucleasas termoestables se seleccionan del grupo constituido por polimerasas alteradas derivadas de polimerasas nativas de Thermus aquaticus, de Thermus flavus y de Thermus thermophilus.
Según se indica anteriormente, la presente invención contempla el uso de polimerasas alteradas en un procedimiento de detección. La presente invención está definida en las reivindicaciones y se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de una molécula específica de ácido nucleico diana que comprende: a) proporcionar: i) los medios de escisión, ii) un ácido nucleico diana, iii) un primer oligonucleótido complementario con una primera porción de dicho ácido nucleico diana, iv) un primer soporte sólido que tiene un segundo oligonucleótido, una región del cual es complementaria con una segunda porción de dicho ácido nucleico diana, dicha región no complementaria de dicho segundo oligonucleótido proporcionando un brazo de hebra única en su extremo 5', una porción de dicho brazo 5' comprendiendo un primer oligonucleótido de señal, v) una pluralidad de segundos soportes sólidos "no escindidos" teniendo cada uno un tercer oligonucleótido, una región del cual es complementario con dicho primer oligonucleótido de señal, la región no complementaria de dicho tercer oligonucleótido proporcionando un brazo de hebra única en su extremo 5', una porción de dicho brazo 5' comprendiendo un segundo oligonucleótido de señal, y vi) una pluralidad de terceros soportes sólidos "no escindidos" que tienen cada uno un cuarto oligonucleótido, una región del cual es complementaria con dicho segundo oligonucleótido de señal, la región no complementaria de dicho cuarto oligonucleótido proporcionando un brazo de hebra única en su extremo 5', una porción de dicho brazo 5' comprendiendo dicho primer oligonucleótido de señal; b) mezclar dichos medios de escisión, dicho ácido nucleico diana, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido bajo condiciones en las que el primer oligonucleótido y el extremo 3' de dicho segundo oligonucleótido se alinean con dicha secuencia de ADN diana para crear una primera estructura de escisión y la escisión de dicha primera estructura de escisión da como resultado la liberación de dicho primer oligonucleótido de señal; d) hacer reaccionar dicho primer oligonucleótido de señal liberado con uno de dicha pluralidad de segundos soportes sólidos bajo condiciones tales que dicho primer oligonucleótido de señal hibrida con dicha región complementaria de dicho tercer oligonucleótido para crear una segunda estructura de escisión y la escisión de dicha segunda estructura de escisión da como resultado la liberación de dicho segundo oligonucleótido de señal y un segundo soporte sólido "escindido"; e) hacer reaccionar dicho segundo oligonucleótido de señal liberado con uno de dicha pluralidad de terceros soportes sólidos bajo condiciones tales que dicho segundo oligonucleótido de señal hibrida con dicha región complementaria de dicho cuarto oligonucleótido para crear una tercera estructura de escisión y la escisión de dicha tercera estructura de escisión da como resultado la liberación de una segunda molécula de dicho primer oligonucleótido de señal y un tercer soporte sólido "escindido"; y h) detectar la presencia de dicho primero y segundo oligonucleótidos de señal.
Resulta de preferencia que, tras la hibridación de dicho primer oligonucleótido de señal y de la liberación de dicho segundo oligonucleótido de señal, dicho primer oligonucleótido de señal sea liberado por sí mismo de dicho segundo soporte sólido "escindido" y se haga reaccionar con uno de dicha pluralidad de segundos soportes sólidos "no escindidos". De manera similar, resulta de preferencia que, tras la hibridación de dicho segundo oligonucleótido de señal y de la liberación de dicha segunda molécula de dicho primer oligonucleótido de señal, dicho segundo oligonucleótido sea liberado por sí mismo del tercer soporte sólido "escindido" y se haga reaccionar con uno de dicha pluralidad de terceros soportes sólidos "no escindidos". Por el término "escindido" o "no escindido" no se pretende indicar que el soporte sólido (por ejemplo, una perla) está físicamente escindido o no escindido. Más bien, se pretende indicar el estado del oligonucleótido unido al soporte sólido.
Un "soporte sólido" no está limitado a soportes separados o discretos. Por ejemplo, es posible un diseño en el que los oligos están en el mismo soporte sólido, aunque separados en diferentes regiones. El soporte sólido puede ser un pocillo de microvaloración en el que están unidos los oligos (por ejemplo, covalentemente) o recubriendo (por ejemplo, no covalentemente) en diferentes regiones del pocillo.
La presente invención está definida en las reivindicaciones y se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de una molécula específica de ácido nucleico diana que comprende: a) proporcionar: i) un ácido nucleico diana, ii) un primer oligonucleótido complementario con una, primera porción de dicho ácido nucleico diana, y iii) un segundo oligonucleótido, una región del cual es complementaria con una segunda porción de dicho ácido nucleico diana, dicha región no complementaria de dicho segundo oligonucleótido proporcionando un brazo de hebra única en su extremo 5'; b) mezclar dicho ácido nucleico diana, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido bajo condiciones en las que el primer oligonucleótido y el extremo 3' de dicho segundo oligonucleótido se alinean con dicha secuencia de ADN diana para crear una primera estructura de escisión; c) proporcionar un medio de escisión bajo condiciones tales que la escisión de la primera estructura de escisión se produzca de preferencia en un sitio localizado dentro de dicho segundo oligonucleótido de una manera dependiente de la alineación de dicho primer y segundo oligonucleótidos en dicho ácido nucleico diana, liberando de esta manera el brazo de hebra única de dicho segundo oligonucleótido generando un tercer oligonucleótido; d) proporcionar una primera estructura de horquilla con un brazo 3' de hebra única y un brazo 5' de hebra única bajo condiciones en las que dicho tercer oligonucleótido se alinea con dicho brazo 3' de hebra única de dicha primera horquilla creando de esta manera una segunda estructura de escisión; e) proporcionar condiciones bajo las que la escisión de dicha segunda estructura de escisión se produce por dichos medios de escisión liberando el brazo 5' de hebra única de dicha segunda estructura de escisión para crear productos de reacción que comprenden un cuarto oligonucleótido y una primera molécula de detección de horquilla escindida; f) proporcionar una segunda estructura de horquilla con un brazo 3' de hebra única y un brazo 5' de hebra única bajo condiciones en las que dicho cuarto oligonucleótido se alinea con el brazo 3' de hebra única de dicha segunda horquilla creando de esta manera una tercera estructura de escisión; g) proporcionar condiciones bajo las que la escisión de dicha tercera estructura de escisión se produce por los medios de escisión, liberando el brazo 5' de hebra única de dicha tercera estructura de escisión para crear productos de reacción que comprenden generar un quinto oligonucleótido idéntico en secuencia a dicho tercer oligonucleótido y una segunda molécula de detección de horquilla escindida; y h) detectar la presencia de dichas primera y segunda moléculas de detección de horquilla escindida.
El procedimiento de detección permite detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos diana presentes en una muestra sin la necesidad de amplificar el número de copias de diana previo a la detección. En este procedimiento, la etapas d) hasta g) del procedimiento se repiten al menos una vez.
Los medios de escisión comprenden una enzima de escisión que comprende una polimerasa termoestable de ADN alterada que tiene capacidad de síntesis reducida, es decir, una 5' nucleasa derivada de una polimerasa termoestable de ADN. Aunque no se requiere una ausencia completa de síntesis, resulta deseable que las reacciones de escisión se produzcan en ausencia de actividad polimerasa en un nivel en el que interfiera con la discriminación necesaria para la detección.
Aunque la escisión del procedimiento de detección puede ser independiente de la alineación de los oligonucleótidos, resulta de preferencia que la escisión sea dependiente del cebador. En otras palabras, resulta deseable que las reacciones de escisión de las etapas c), e) y g) no se produzcan en ausencia de alineación de dicho primer oligonucleótido, dicho tercer oligonucleótido y dicho cuarto oligonucleótido, respectivamente.
Aunque la escisión es específica de sitio, es posible la escisión en una diversidad de sitios. La reacción de escisión de la etapa c) puede tener lugar dentro de la porción alineada de dicho segundo oligonucleótido o dentro de la porción no alineada de dicho segundo oligonucleótido.
Descripción de los dibujos
La Figura 1A proporciona un diagrama esquemático de un procedimiento de detección.
La Figura 1B proporciona un diagrama esquemático de otro procedimiento de detección.
La Figura 2 es una comparación de la estructura del nucleótidos de los genes de DNAP aislados de Thermus aquaticus, Thermus flavus y Thermus thermophilus; la secuencia de consenso se muestra en la parte superior de cada fila.
La Figura 3 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de la DNAP aislada de Thermus aquaticus, Thermus flavus, y Thermus thermophilus; la secuencia de consenso se muestra en la parte superior de cada fila.
Las Figuras 4A-G son una serie de diagramas de genes de DNAPTaq de tipo salvaje y deficiente en síntesis.
La Figura 5A representa el gen de la polimerasa de Thermus flavus de tipo salvaje.
La Figura 5B representa un gen de la polimerasa de Thermus flavus deficiente en síntesis.
La Figura 6 representa una estructura que no puede amplificarse usando DNAPTaq.
La Figura 7 es un gel teñido con bromuro de etidio que demuestra intentos para amplificar una doble hélice bifurcada usando DNAPTaq o DNAPStf.
La Figura 8 es una autorradiografía de un gel que analiza la escisión de una doble hélice bifurcada por DNAPTaq y de la falta de escisión por DNAPStf.
Las Figuras 9A-B son una serie de autorradiografías de los geles que analizan la escisión o la falta de escisión tras la adición de diferentes componentes de reacción y cambio de la temperatura de incubación durante intentos para escindir una doble hélice bifurcada con DNAPTaq.
Las Figuras 10A-B son una autorradiografía que muestra reacciones de escisión en función del tiempo, con y sin cebador.
Las Figuras 11A-B son una serie de autorradiografías de los geles que demuestran intentos para escindir una doble hélice bifurcada (con y sin cebador) con diversas DNAP.
Las Figuras 12A muestra los sustratos y los oligonucleótidos usados para probar la escisión específica de los ADN sustrato marcados por medio de oligonucleótidos experimentales.
La Figura 12B muestra una autorradiografía de un gel que muestra los resultados de las reacciones de escisión usando los sustratos y los oligonucleótidos mostrados la Figura 12A.
La Figura 13A muestra el sustrato y el oligonucleótido usados para probar la escisión específica de un ARN substrato marcado por medio de un oligonucleótido experimental.
La Figura 13B muestra una autorradiografía de un gel que muestra los resultados de una reacción de escisión usando el sustrato y el oligonucleótido mostrados en la Figura 13A.
La Figura 14 es un diagrama del vector pTTQ18.
La Figura 15 es un diagrama del vector pET-3c.
La Figura 16A-E representa una serie de moléculas que son sustratos adecuados para la escisión por la actividad nucleasa 5' de las DNAP.
La Figura 17 es una autorradiografía de un gel que muestra los resultados de una reacción de escisión realizada con DNAP deficientes en síntesis.
La Figura 18 es una autorradiografía de una placa de cromatografía de PEI que resuelve los productos de un ensayo para la actividad sintética en clones de DNAPTaq deficientes en síntesis.
La Figura 19A representa la molécula de substrato usada para probar la capacidad de las DNAP deficientes en síntesis para escindir estructuras cortas de horquilla.
La Figura 19B muestra una autorradiografía de un gel que resuelve los productos de una reacción de escisión realizada usando el sustrato mostrado en la Figura 19A.
La Figura 20A muestra las moléculas de A- y T-horquilla usadas en el ensayo de activación/detección.
La Figura 20B muestra la secuencia del cebador alfa usado en el ensayo de activación/detección.
La Figura 20C muestra la estructura de las moléculas de A- y T-horquilla escindidas.
La Figura 20D representa la complementariedad entre las moléculas de A- y T-horquilla.
La Figura 21 proporciona la secuencia completa de la doble hélice de 206 residuos usada como sustrato para las 5' nucleasas de la presente invención.
Las Figuras 22A y B muestran la escisión de sustratos de ácidos nucleicos lineales (basados en 206 residuos de la Figura 21) por las DNAP de tipo salvaje y 5' nucleasas aisladas de Thermus aquaticus y de Thermus flavus.
La Figura 23 proporciona un diagrama esquemático detallado que corresponde a un procedimiento de detección.
La Figura 24 muestra la propagación de la escisión de las Estructuras de ácido nucleico de doble hélice lineales de la Figura 23 por 5' nucleasas de la presente invención.
La Figura 25A muestra el fenómeno "mordisqueo" (nibbling) detectado con las DNAP de la presente invención.
La Figura 25B muestra que el "mordisqueo" de la Figura 25A es escisión 5' nucleolítica y no escisión de fosfatasa.
La Figura 26 muestra que el fenómeno "mordisqueo" es dependiente de la doble hélice.
La Figura 27 es un diagrama esquemático que muestra cómo puede usarse el "mordisqueo" en un ensayo de detección.
La Figura 28 muestra que el "mordisqueo" puede dirigirse a dianas.
Descripción de la invención
La presente invención está definida en las reivindicaciones y se refiere a medios para escindir una estructura de escisión de ácido nucleico de una manera específica de sitio. En particular, la presente invención se refiere a una enzima de escisión que tiene actividad nucleasa 5' sin interferir en la capacidad sintética de ácido nucleico.
Esta invención proporciona procedimientos, en los que pueden usarse 5' nucleasas derivadas de polimerasas de ADN termoestables que exhiben actividad sintética de ADN alterada con respecto a la actividad de polimerasas de ADN termoestables nativas. La actividad nucleasa 5' de la polimerasa está conservada mientras que la actividad sintética está reducida o ausente. Tales 5' nucleasas son capaces de catalizar la escisión específica de estructura de ácidos nucleicos en ausencia de interferencia de la actividad sintética. La falta de actividad sintética durante la reacción de escisión da como resultado productos de escisión de ácidos nucleicos de tamaño uniforme.
Pueden usarse las polimerasas en un procedimiento para detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos. Este procedimiento se basa en la amplificación de la molécula de detección más que en la amplificación de la secuencia diana en sí misma como lo hacen los procedimientos existentes para detectar secuencias diana específicas.
Las polimerasas de ADN (DNAP), tales como aquellas aisladas de E. coli o de bacterias termófilas del género Thermus, son enzimas que sintetizan nuevas hebras de ADN. Varias de las DNAP conocidas contienen actividades nucleasa asociadas además de la actividad sintética de la enzima.
Algunas DNAP son conocidas por eliminar nucleótidos de extremos 5' y 3' de cadenas de ADN [Kornberg, DNA Replication, W. H. Freeman and Co., San Francisco, pág. 127-139 (1980)]. Estas actividades nucleasa se denominan usualmente como actividad exonucleasa 5' y exonucleasa 3', respectivamente. Por ejemplo, la actividad exonucleasa 5' localizada en el dominio N terminal de varias DNAP participa en la eliminación de cebadores de ARN durante la síntesis de revestimiento de hebras durante la replicación de ADN y la eliminación de nucleótidos dañados durante la reparación. Algunas DNAP, tales como la polimerasa de ADN de E. coli (DNAPEc1), tienen también una actividad exonucleasa 3' responsable de la lectura de prueba durante la síntesis de ADN (Kornberg, supra).
Una DNAP aislada de Thermus aquaticus, llamada polimerasa de ADN Taq (DNAPTaq), tiene una actividad exonucleasa 5', pero carece de un dominio funcional exonucleolítico 3' [Tindall y Kunkell, Biochem. 27:6008 (1988)]. Los derivados de DNAPEc1 y DNAPTaq, llamadas respectivamente fragmentos Klenow y Stoffel, carecen de dominios de exonucleasa 5' como resultado de manipulaciones enzimáticas o genéticas [Brutlag y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 37:982 (1969); Erlich y col., Science 252:1643 (1991); Setlow y Kornberg, J. Biol. Chem. 247:232 (1972)].
Se informó que la actividad exonucleasa 5' de DNAPTaq requiere síntesis simultánea [Gelfand, PCR Technology - Principles and Applications for DNA Amplification (H. A. Erlich, Ed.), Stockton Press, Nueva York, pág. 19 (1989)]. Aunque los mononucleótidos predominan entre los productos de digestión de las exonucleasas 5' de DNAPTaq y DNAPEc1, pueden también observarse oligonucleótidos cortos (\leq 12 nucleótidos) lo que implica que estas llamadas exonucleasas 5' pueden funcionar endonucleolíticamente [Setlow, supra; Holland y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276 (1991)].
En el documento WO 92/06200, Gelfand y col. muestran que el sustrato de preferencia de la actividad exonucleasa 5' de las polimerasas de ADN termoestables es ADN de hebra única desplazada. La hidrólisis del enlace fosfodiéster se produce entre el ADN de hélice simple desplazada y el ADN de doble hélice con un enlace fosfodiéster en la región de doble hélice como sitio de escisión de exonucleasa de preferencia. Por consiguiente, la actividad exonucleasa 5' usualmente asociada con DNAP es una endonucleasa de hebra única dependiente de la estructura y se denomina más adecuadamente nucleasa 5'. Las exonucleasas son enzimas que escinden moléculas de nucleótidos de los extremos de las moléculas de ácidos nucleicos. Las endonucleasas, por otro lado, son enzimas que escinden la molécula de ácido nucleico en sitios internos más que en sitios terminales. La actividad nucleasa asociada con algunas polimerasas de ADN termoestables escinde endonucleolíticamente pero esta escisión requiere contactar con el extremo 5' de la molécula a escindir. Por consiguiente, estas nucleasas se denominan nucleasas 5'.
Cuando una actividad nucleasa 5' está asociada con una polimerasa de ADN de Tipo A eubacteriana, se la encuentra en el primer tercio de la región N terminal de la proteína como un dominio funcional independiente. Los dos tercios C terminales de la molécula constituyen el dominio de polimerización que es responsable de la síntesis de ADN. Algunas polimerasas de ADN de Tipo A tienen también una actividad exonucleasa 3' asociada con la región C terminal de los dos tercios de la molécula.
La actividad exonucleasa 5' y la actividad de polimerización de las DNAP han sido separadas por escisión proteolítica o manipulación genética de la molécula de polimerasa. Hasta el momento se han modificado las DNAP termoestables para eliminar o reducir la cantidad de actividad nucleasa 5' dejando intacta la actividad polimerasa.
El fragmento Klenow o fragmento de escisión proteolítica grande de DNAPEc1 contiene la actividad polimerasa y exonucleasa 3' pero carece de actividad nucleasa 5'. El fragmento Stoffel de DNAPTaq carece de actividad nucleasa 5' debido a una manipulación genética que delecionó los 289 aminoácidos del extremo N terminal de la molécula de polimerasa [Erlich y col., Science 252:1643 (1991)]. El documento WO 92/06200 describe una DNAP termoestable con un nivel alterado de exonucleasa 5' hacia 3'. La Patente de EEUU Nº 5.108.892 describe una DNAP de Thermus aquaticus sin una exonucleasa 5' hacia 3'. Sin embargo, la técnica de biología molecular carece de una polimerasa termoestable de ADN con cantidad disminuida de actividad sintética.
Pueden usarse las nucleasas 5' derivadas de polimerasas de ADN de Tipo A termoestables que conservan actividad nucleasa 5' pero tienen actividad sintética reducida o ausente. La capacidad para desacoplar la actividad sintética de la enzima de la actividad nucleasa 5' prueba que la actividad nucleasa 5' no requiere la síntesis consecutiva de ADN como se informó previamente (Gelfand, PCR Technology, supra).
La descripción de la invención se divide en: I. Detección de Secuencias Específicas de Ácidos Nucleicos Usando Nucleasas 5'; II. Generación de Nucleasas 5' Derivadas de Polimerasas de ADN Termoestables; III. Usos Terapéuticos de Nucleasas 5'; y IV. Detección de Dianas Antigénicas o de Ácidos Nucleicos por un Ensayo de Captura Dual. Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se definen un número de términos.
El término "gen" se refiere a una secuencia de ADN que comprende secuencias de control y codificadoras necesarias para la producción de un polipéptido o precursor. El polipéptido puede estar codificado por una secuencia codificadora de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificadora siempre que se mantenga la actividad enzimática.
El término "tipo salvaje" se refiere a un gen o producto de un gen que tiene las características de ese gen o producto del gen cuando se lo aísla de una fuente que se presenta naturalmente. Por el contrario, el término "modificado" o "mutante" se refiere a un gen o producto de un gen que despliega características alteradas comparado con el gen o el producto del gen de tipo salvaje. Se advierte que pueden aislarse mutantes que se presentan naturalmente; estos se identifican por el hecho de tener características alteradas cuando se los compara con el gen o el producto del gen de tipo salvaje.
El término "vector de ADN recombinante" como se usa en este documento se refiere a secuencias de ADN que contienen una secuencia codificadora deseada y secuencias de ADN adecuadas necesarias para la expresión de la secuencia codificadora unida de manera operativa en un organismo huésped particular. Las secuencias de ADN necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosomas y posiblemente otras secuencias. Se conoce que las células eucariotas utilizan promotores, señales y potenciadores de poliadenilación.
El término "oligonucleótido" como se usa en este documento se define como una molécula que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, de preferencia más de tres, y usualmente más de diez. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función o uso final del oligonucleótido. El oligonucleótido puede generarse de cualquier manera, incluyendo síntesis química, replicación de ADN, transcripción inversa, o una combinación de las mismas.
Dado que los mononucleótidos se hacen reaccionar para generar oligonucleótidos de manera tal que el fosfato 5' de un anillo pentosa de un mononucleótido esté unido al oxígeno 3' de su vecino en una dirección por medio de un enlace fosfodiéster, se denomina "extremo 5'" a un extremo de un oligonucleótido si su fosfato 5' no está unido al oxígeno 3' de un anillo pentosa de un mononucleótido y como el "extremo 3'" si su oxígeno 3' no está unido a un fosfato 5' de un anillo pentosa del mononucleótido siguiente. Como se usa en este documento, también puede decirse que una secuencia de ácido nucleico, incluso en el interior de un oligonucleótido más grande, tiene extremos 5' y 3'.
Cuando dos oligonucleótidos diferentes, no solapados se alinean con regiones diferentes de la misma secuencia de ácido nucleico complementaria lineal, y el extremo 3' de un oligonucleótido apunta hacia el extremo 5' del otro, puede denominarse al primero como el oligonucleótido "secuencia arriba" y al último como oligonucleótido "secuencia abajo".
El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido que es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las que se inicia la extensión del cebador. Un "cebador" de oligonucleótido puede presentarse naturalmente, como en una digestión de restricción purificada o puede producirse sintéticamente.
Se selecciona un cebador para que sea "sustancialmente" complementario con una hebra de la secuencia específica del molde. Un cebador debe ser suficientemente complementario para hibridar con una hebra molde para que se produzca la elongación del cebador. La secuencia de un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, puede unirse un fragmento de nucleótidos no complementario al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador sustancialmente complementaria a la hebra. Las bases no complementarias o secuencias más largas pueden intercalarse dentro del cebador, a condición de que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia del molde a hibridar y formen por consiguiente un complejo del cebador molde para síntesis del producto del extensión del cebador.
El complemento de una secuencia de ácido nucleico como se usa en este documento se refiere a un oligonucleótido que, cuando está alineado con la secuencia de ácido nucleico de manera tal que el extremo 5' de una secuencia está apareado con el extremo 3' de la otra, está en "asociación antiparalela". Pueden incluirse ciertas bases que no se encuentran comúnmente en ácidos nucleicos naturales en los ácidos nucleicos de la presente invención e incluyen, por ejemplo, inosina y 7-deazaguanina. La complementariedad no debe ser necesariamente perfecta; dobles hélices estables pueden contener pares de bases acopladas erróneamente o bases no acopladas. Los expertos en la técnica de tecnología de ácidos nucleicos pueden determinar la estabilidad de dobles hélices empíricamente considerando un número de variables que incluyen, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición de bases y secuencia del oligonucleótido, la fuerza iónica y la incidencia de pares de bases acopladas erróneamente.
La estabilidad de una doble hélice de ácido nucleico se mide por la temperatura de fusión, o "T_{f}". La "T_{f}" de una doble hebra de ácido nucleico particular bajo condiciones especificadas es la temperatura a la que se han desasociado la mitad de las pares de bases.
El término "sonda" como se usa en este documento se refiere a un oligonucleótido marcado que forma una estructura de doble hélice con una secuencia en otro ácido nucleico, debido a la complementariedad de al menos una secuencia en la sonda con una secuencia en el otro ácido nucleico.
El término "marcador" como se usa en este documento se refiere a cualquier átomo o molécula que puede usarse para proporcionar una señal detectable (de preferencia cuantificable), y que puede unirse a un ácido nucleico o proteína. Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría, gravimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad enzimática, y similares.
El término "estructura de escisión" como se usa en este documento se refiere a una estructura de ácido nucleico que es un sustrato para escisión por la actividad nucleasa 5' de una DNAP.
El término "medios de escisión" como se usa en este documento se refiere a cualquier medio que sea capaz de escindir una estructura de escisión de una manera específica. El medio de escisión puede incluir DNAP nativas con actividad nucleasa 5', y, más específicamente, DNAP modificadas con actividad nucleasa 5' pero carentes de actividad sintética.
El término "liberación" como se usa en este documento se refiere a la liberación de un fragmento de ácido nucleico de un fragmento de ácido nucleico mayor, tal como un oligonucleótido, por la acción de una nucleasa 5' tal que el fragmento liberado no está más unido de manera covalente al resto del oligonucleótido.
El término "hebra sustrato" como se usa en este documento, significa aquella hebra de ácido nucleico en una estructura de escisión en la que se produce la escisión mediada por la actividad nucleasa 5'.
El término "hebra molde" como se usa en este documento, significa aquella hebra de ácido nucleico en una estructura de escisión que es al menos parcialmente complementaria con la hebra sustrato y que se alinea con la hebra de sustrato para formar la estructura de escisión.
El término "Km" como se usa en este documento se refiere a la constante de Michaelis-Menten para una enzima y está definida como la concentración del sustrato específico a la que una enzima dada rinde la mitad de su velocidad máxima en una reacción catalizada enzimáticamente.
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I. Detección de Secuencias Específicas de Ácidos Nucleicos Usando Nucleasas 5'
Pueden usarse nucleasas 5' en un ensayo de detección para la identificación de secuencias específicas de ácidos nucleicos. Este sistema de detección identifica la presencia de secuencias específicas de ácidos nucleicos requiriendo la alineación de dos sondas de oligonucleótidos o dos porciones de la secuencia diana. Como se usa en este documento, el término "secuencia diana" o "secuencia de ácido nucleico diana" se refiere a una secuencia específica de ácido nucleico dentro de una secuencia de polinucleótidos, tal como ADN o ARN genómico, que quiere detectarse o escindirse o ambos.
La Figura 1A proporciona un diagrama esquemático de un procedimiento de detección. La secuencia diana se reconoce por medio de dos oligonucleótidos distintos en la reacción activadora o de activación. Resulta de preferencia que uno de estos oligonucleótidos se proporcione sobre una superficie sólida. El otro puede proporcionarse libre. En la Figura 1A se indica el oligo libre como un "cebador" y se muestra al otro oligo unido a una perla denominada tipo 1. El ácido nucleico diana se alinea con los dos oligonucleótidos para la escisión específica del brazo 5' (del oligo en la perla 1) por las DNAP de la presente invención (no mostradas en la Figura 1A).
El sitio de escisión (indicado por una punta de flecha sólida grande) está controlado por la distancia entre el extremo 3' del "cebador" y la horquilla secuencia abajo del oligo en la perla 1. Se denomina al último con una región no escindible (indicada por medio de rayas). De esta manera ningún oligonucleótido está sometido a escisión cuando está desalineado o cuando no está unido al ácido nucleico diana.
La escisión exitosa libera una copia única de lo que se denomina el oligo de señal alfa. Este oligo puede contener un resto detectable (por ejemplo, fluoresceína). Por otro lado, puede no estar marcado.
Pueden proporcionarse otros dos oligonucleótidos sobre soportes sólidos. El oligonucleótido mostrado en la Figura 1A sobre la perla 2 tiene una región que es complementaria con el oligo de señal alfa (indicado como primera alfa) que permite la hibridación. Esta estructura puede ser escindida por las DNAP de la presente invención para liberar el oligo de señal beta. El oligo de señal beta puede a continuación hibridar con perlas de tipo 3 que tienen un oligo con una región complementaria (indicada como primera beta). Una vez más, esta estructura puede ser escindida por las DNAP de la presente invención para liberar un nuevo oligo alfa.
En este punto, la amplificación ha sido lineal. Para aumentar la potencia del procedimiento, resulta deseable que el oligo de señal alfa hibridado con la perla tipo 2 sea liberado tras la liberación del oligo beta de modo que pueda continuar hibridando con otros oligos en perlas tipo 2. De manera similar, tras la liberación de un oligo alfa de perlas tipo 3, resulta deseable que el oligo beta sea liberado.
La liberación de los oligos de señal "capturados" puede alcanzarse de varias maneras. Primero, se ha encontrado que las DNAP de la presente invención tienen una exonucleasa 5' verdadera capaz de "mordisquear" el extremo 5' de los oligo prima alfa (y beta) (discutidos a continuación con más detalle). Por consiguiente, bajo condiciones adecuadas, la hibridación es desestabilizada por el mordisqueo de la DNAP. Segundo, el complejo prima alfa - alfa (así como el complejo prima beta - beta) pueden ser desestabilizados por calor (por ejemplo, ciclos térmicos).
Con la liberación de los oligos de señal por medio de tales técnicas, cada escisión da como resultado la duplicación del número de oligos de señal. De esta manera, la señal detectable puede alcanzarse rápidamente.
La Figura 1B proporciona un diagrama esquemático de otro procedimiento de detección. Una vez más, la secuencia diana es reconocida por dos oligonucleótidos distintos en la reacción de activación o activadora y el ácido nucleico diana se alinea con los dos oligonucleótidos para la escisión específica del brazo 5' por las DNAP de la presente invención (no mostradas en la Figura 1B). El primer oligo es totalmente complementario con una porción de la secuencia diana. El segundo oligonucleótido es parcialmente complementario con la secuencia diana; el extremo 3' extremo del segundo oligonucleótido es completamente complementario con la secuencia diana mientras que el extremo 5' no es complementario y forma un brazo de hebra única. El extremo no complementario del segundo oligonucleótido puede ser una secuencia genérica que puede usarse con una serie de estructuras de horquilla convencionales (descritas a continuación). La detección de diferentes secuencias diana requeriría porciones únicas de dos oligonucleótidos: el primer oligonucleótido entero y el extremo 3' del segundo oligonucleótido. El brazo 5' del segundo oligonucleótido puede no ser variante o genérico en secuencia.
La alineación del primer y segundo oligonucleótido cerca el uno del otro a lo largo de la secuencia diana forma una estructura de escisión bifurcada que es un sustrato para la nucleasa 5' de las polimerasas de ADN. La localización aproximada del sitio de escisión se indica otra vez por medio de la punta de flecha sólida grande en la Figura 1B.
Las nucleasas 5' de la invención son capaces de escindir esta estructura pero no son capaces de polimerizar la extensión del extremo 3' del primer oligonucleótido. La carencia de actividad de polimerización es ventajosa ya que la extensión de los primeros oligonucleótidos da como resultado el desplazamiento de la región alineada del segundo oligonucleótido y da lugar al cambio de lugar del sitio de escisión a lo largo del segundo oligonucleótido. Si se permite que la polimerización tenga lugar hasta cualquier cantidad significativa, se generarán múltiples longitudes del producto de escisión. Resulta deseable un único producto de escisión de longitud uniforme ya que este producto de escisión inicia la reacción de la detección.
La reacción de activación puede llevarse a cabo bajo condiciones que permitan el termociclado. El termociclado de la reacción permite un aumento logarítmico en la cantidad del oligonucleótido disparador liberado en la reacción.
La segunda parte del procedimiento de detección permite la alineación del fragmento del segundo oligonucleótido liberado por la escisión de la primera estructura de escisión formada en la reacción de activación (llamado tercer oligonucleótido o disparador) con una primera estructura de horquilla. Esta primera estructura de horquilla tiene un brazo 5' de hebra única y un brazo 3' de de hebra única. El tercer oligonucleótido dispara la escisión de esta primera estructura de horquilla alineándose al brazo 3' de la horquilla formando de esa manera un sustrato para escisión por la nucleasa 5' de la presente invención. La escisión de esta primera estructura de horquilla genera dos productos de reacción: 1) el brazo 5' escindido de la horquilla llamado cuarto oligonucleótido, y 2) la estructura de horquilla escindida que ahora carece de brazo 5' y es de tamaño más pequeño que la horquilla no escindida. Esta primera horquilla escindida puede usarse como molécula de detección para indicar que se produjo la escisión dirigida por el tercer oligonucleótido o disparador. Por consiguiente, esto indica que los primeros dos oligonucleótidos encontraron y se alinearon con la secuencia diana indicando de esta manera la presencia de la secuencia diana en la muestra.
Los productos de detección se amplifican alineando el cuarto oligonucleótido con una segunda estructura de horquilla. Esta estructura de horquilla tiene un brazo 5' de hebra única y un brazo 3' de hebra única. El cuarto oligonucleótido generado por la escisión de la primera estructura de horquilla se alinea con el brazo 3' de la segunda estructura de horquilla creando de esta manera una tercera estructura de escisión reconocida por la nucleasa 5'. La escisión de esta segunda estructura de horquilla también genera dos productos de reacción: 1) el brazo 5' escindido de la horquilla llamado quinto oligonucleótido que es similar o idéntico en secuencia al tercer nucleótido, y 2) la segunda estructura de horquilla escindida que ahora carece del brazo 5' y es de tamaño más pequeño que la horquilla sin escindir. Esta segunda horquilla escindida puede estar como molécula de detección y amplifica la señal generada por la escisión de la primera estructura de horquilla. Simultáneamente con la alineación del cuarto oligonucleótido, el tercer oligonucleótido se disocia de la primera molécula de horquilla escindida de modo que está libre para alinear a una nueva copia de la primera estructura de horquilla. La desasociación de los oligonucleótidos de las estructuras de horquilla puede lograrse por calentamiento o por otros medios adecuados para interrumpir las interacciones de apareamiento de bases.
Se logra otra amplificación de la señal de detección alineando el quinto oligonucleótido (similar o idéntico en secuencia al tercer oligonucleótido) con otra molécula de la primera estructura de horquilla. Posteriormente se realiza la escisión y el oligonucleótido que liberado se alinea a continuación con otra molécula de la segunda estructura de horquilla. Se realizan sucesivos ciclos de alineación y escisión de la primera y segunda estructuras de horquilla, proporcionadas en exceso, para generar una cantidad suficiente de productos de horquilla escindidos a detectar. La temperatura de la reacción de detección se cicla justo por debajo y justo por encima de la temperatura de alineación para los oligonucleótidos usados para dirigir la escisión de las estructuras de horquilla, generalmente aproximadamente 55ºC hasta 70ºC. El número de escisiones se duplicará en cada ciclo hasta que la cantidad de estructuras de horquilla restantes esté por debajo de la K_{m}, para las estructuras de horquilla. Este punto se alcanza cuando las estructuras de horquilla están sustancialmente consumidas. Cuando se usa la reacción de detección de una manera cuantitativa, las reacciones cíclicas se detienen previo a que la acumulación de los productos de detección de horquilla escindidos alcance una meseta.
La detección de las estructuras de horquilla escindidas puede alcanzarse de varias maneras. En una forma de realización la detección se alcanza mediante la separación en geles de agarosa o de poliacrilamida seguida por la tinción con bromuro de etidio. En otra forma de realización, la detección se alcanza mediante separación de estructuras de horquilla escindidas y no escindidas en un gel seguida por la autorradiografía cuando las estructuras de horquilla se marcan en primer lugar con una sonda radiactiva y separación en columnas de cromatografía usando HPLC o FPLC seguida por detección de los fragmentos de tamaños diferentes por absorción a DO_{260}. Otros medios de detección incluyen la detección de cambios en la polarización de fluorescencia cuando se libera el brazo 5' de hebra única por la escisión, el aumento en la fluorescencia de un indicador fluorescente intercalado a medida que aumenta la cantidad de cebadores alineados con brazos 3' de las estructuras de horquilla. La formación de cantidades crecientes de ADN de doble hélice (entre el cebador y el brazo 3' de la horquilla) se produce si tienen lugar ciclos sucesivos de escisión.
Las estructuras de horquilla pueden estar unidas a un soporte sólido, tal como una perla magnética, de agarosa, o estireno, por medio del extremo 3' de la horquilla. Si se desea, puede colocarse una molécula espaciadora entre el extremo 3' de la horquilla y la perla. La ventaja de unir las estructuras de horquilla a un soporte sólido es que esto impide la hibridación de las dos estructuras de horquilla una con la otra sobre las regiones que son complementarias. Si las estructuras de horquilla se alinean una con la otra, esto reduciría la cantidad de horquillas disponibles para la hibridación con los cebadores liberados durante las reacciones de escisión. Si las estructuras de horquilla están unidas a un soporte sólido, pueden posteriormente usarse otros procedimientos de detección de los productos de la reacción de escisión. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, la medición del brazo 5' de hebra única liberado cuando el brazo 5' contiene un marcador en el extremo 5' terminal. Este marcador puede ser radiactivo, fluorescente, biotinilado, etc. Si la estructura de horquilla no está escindida, el marcador 5' seguirá unido al soporte sólido. Si se produce la escisión, el marcador 5' se liberará del soporte sólido.
Puede bloquearse el extremo 3' de la molécula de horquilla por medio del uso de dideoxinucleótidos. Un extremo 3' que contiene un dideoxinucleótido no está disponible para participar en reacciones con ciertas enzimas que modifican el ADN, tales como la transferasa terminal. La escisión de la horquilla que tiene un dideoxinucleótido en el extremo 3' terminal genera un nuevo extremo 3', desbloqueado en el sitio de escisión. Este nuevo extremo 3' tiene un grupo hidroxilo libre que puede interactuar con la transferasa terminal proporcionando así otros medios para detectar los productos de escisión.
Las estructuras de horquilla se diseñan para que sus propias regiones complementarias sean muy cortas (generalmente en el intervalo de 3-8 pares de bases). Por consiguiente, las estructuras de horquilla no son estables a temperaturas altas a las que se realiza esta reacción (generalmente en el intervalo de 50-75ºC) a menos que la horquilla esté estabilizada por la presencia del oligonucleótido alineado en el brazo 3' de la horquilla. Esta inestabilidad evita que la polimerasa escinda la estructura de horquilla en ausencia de un cebador asociado evitando así los resultados positivos falsos debidos a la escisión no dirigida a oligonucleótidos.
Según lo discutido anteriormente, el uso nucleasas 5' que tienen actividad de polimerización reducida es ventajoso en este procedimiento para detectar secuencias específicas de ácido nucleico. Las cantidades significativas de polimerización durante la reacción de escisión causarían el cambio del sitio de escisión de maneras imprevisibles dando por resultado la producción de una serie de estructuras de horquilla escindidas de diversos tamaños más que un solo producto fácilmente cuantificable. Además, los cebadores usados en un ciclo de escisión podrían, si fueron elongados, volverse inutilizables para el siguiente ciclo, al formar una estructura incorrecta o al ser demasiado largos para fundirse bajo condiciones de ciclado de temperaturas moderadas. En un sistema puro (es decir, que carece de la presencia de dNTP), podría usarse la polimerasa sin modificar, pero la presencia de nucleótidos (dNTP) puede disminuir la eficacia por ciclo lo suficiente como para dar un resultado negativo falso. Cuando se usa un extracto bruto (preparaciones de ADN genómico, lisados celulares brutos, etc.) o una muestra de ADN de una reacción de PCR, o cualquier otra muestra que pudiera estar contaminada con dNTP, son particularmente útiles las nucleasas 5' de la presente invención derivadas de polimerasas termoestables.
II. Generación de Nucleasas 5' a Partir de Polimerasas de ADN Termoestables
Los genes que codifican las polimerasas de ADN Tipo A comparten aproximadamente un 85% de similitud el uno con el otro a nivel de secuencia de ADN. Los ejemplos de preferencia de polimerasas termoestables incluyen aquellas aisladas de Thermus aquaticus, Thermus flavus, y Thermus thermophilus. Sin embargo, son también adecuadas otras polimerasas termoestable de Tipo A que tienen actividad nucleasa 5'. Las Figuras 2 y 3 comparan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las tres polimerasas mencionadas anteriormente. SEC ID Nº 1-3 representan las secuencias de nucleótidos y SEC ID Nº 4-6 representan las secuencias de aminoácidos de las tres polimerasas de tipo salvaje. SEC ID Nº 1 corresponde a la secuencia de ácido nucleico de gen de la polimerasa de ADN de tipo salvaje de Thermus aquaticus aislado de la cepa YT-1 [Lawyer y col., J. Biol. Chem. 264:6427 (1989)]. SEC ID Nº 2 corresponde a la secuencia de ácido nucleico del gen de la polimerasa de ADN de tipo salvaje de Thermus flavus [Akhmetzjanov y Vakhitov, Nucl. Acids Res. 20:5839 (1992)]. SEC ID Nº 3 corresponde a la secuencia de ácido nucleico de gen de la polimerasa de ADN de tipo salvaje de Thermus thermophilus [Gelfand y col., documento WO 91/09950 (1991)]. SEC ID Nº 7-8 representan las secuencias de consenso de nucleótidos y de aminoácidos, respectivamente para las tres DNAP anteriores (mostradas también en la fila superior en las Figuras 2 y 3).
Las nucleasas 5' derivadas de polimerasas termoestables pueden tener capacidad sintética reducida, pero conservan sustancialmente la misma actividad exonucleasa 5' que la polimerasa de ADN nativa. El término "sustancialmente la misma actividad nucleasa 5'" como se usa en este documento significa que la actividad nucleasa 5' de la enzima modificada conserva la capacidad para funcionar como una endonucleasa de hebra única dependiente de estructura pero no necesariamente en el mismo grado de escisión comparado con la enzima sin modificar. Las polimerasas de ADN Tipo A pueden también modificarse para producir una enzima que tiene actividad nucleasa 5' aumentada mientras que tiene un nivel reducido de actividad sintética. Las enzimas modificadas que tienen actividad sintética reducida y actividad nucleasa 5' aumentada también están previstas por la presente invención.
Por el término "actividad sintética reducida" como se usa en este documento se entiende que la enzima modificada tiene actividad sintética menor que el nivel hallado en la enzima no modificada o "nativa". La enzima modificada puede no tener ninguna actividad sintética restante o puede tener aquel nivel de actividad sintética que no interfiera con el uso de la enzima modificada en el ensayo de detección que se describe a continuación. Las nucleasas 5' son ventajosas en situaciones donde se desea la actividad de escisión de la polimerasa, pero no se desea la capacidad sintética (tal como en el ensayo de detección de la invención).
Como se indicó anteriormente, no se pretende que la invención esté limitada por la naturaleza de la alteración necesaria para hacer deficiente la síntesis de la polimerasa. La presente invención contempla una diversidad de procedimientos, que incluyen pero no se limitan a: 1) proteolisis; 2) construcciones recombinantes (incluyendo mutantes); y 3) modificación y/o inhibición física y/o química.
1. Proteolisis
Las polimerasas de ADN termoestables que tienen un nivel reducido de actividad sintética se producen por escisión física de la enzima sin modificar con enzimas proteolíticas para producir fragmentos de la enzima que son deficientes en actividad sintética pero conservan actividad nucleasa 5'. Tras la digestión proteolítica, se separan los fragmentos resultantes por medio de técnicas cromatográficas convencionales y se ensayan para analizar la capacidad para sintetizar ADN y actuar como nucleasa 5'. A continuación se describen los ensayos para determinar actividad sintética y actividad 5'.
2. Construcciones Recombinantes
Los ejemplos anteriores describen un procedimiento de preferencia para crear una construcción que codifica una nucleasa 5' derivada de una polimerasa termoestable de ADN. Como las polimerasas de ADN Tipo A son similares en secuencia de ADN, las estrategias de clonación usadas para las polimerasas de Thermus aquaticus y flavus son aplicables a otras polimerasas termoestable de Tipo A. Generalmente, una polimerasa termoestable de ADN se clona aislando ADN genómico usando procedimientos de biología molecular a partir de bacterias que contienen una polimerasa de ADN Tipo A termoestable. Se expone este ADN genómico a cebadores que son capaces de amplificar el gen de la polimerasa por PCR.
Posteriormente se somete esta secuencia amplificada de polimerasa a los procedimientos de deleción convencionales para delecionar la porción de polimerasa de gen. Los procedimientos de deleción adecuados se describen a continuación en los ejemplos.
El siguiente ejemplo discute la estrategia usada para determinar qué porciones del dominio de la polimerasa DNAPTaq podrían eliminarse sin eliminar la actividad nucleasa 5'. La deleción de aminoácidos de la proteína puede hacerse por deleción del material genético codificador, o por la introducción de un codón de detención de la traducción por mutación o cambio del marco. Además, puede realizarse el tratamiento proteolítico de la molécula de proteína para eliminar segmentos de la proteína.
En los siguientes ejemplos, las alteraciones específicas del gen Taq fueron: una deleción entre los nucleótidos 1601 y 2502 (el extremo de la región codificadora), una inserción de 4 nucleótido en posición 2043, y deleciones entre los nucleótidos 1614 y 1848 y entre los nucleótidos 875 y 1778 (la numeración está como en SEC ID Nº 1). Estas secuencias modificadas se describen a continuación en los ejemplos y en SEC ID Nº 9-12.
Los expertos en la técnica entienden que cambios únicos de pares de bases pueden ser inocuos en términos de estructura y función de la enzima. De manera similar, pueden estar presentes pequeñas adiciones y deleciones sin que cambie sustancialmente la función exonucleasa o polimerasa de estas enzimas.
Otras deleciones son también adecuadas para crear las nucleasas 5'. Resulta de preferencia que la deleción disminuya la actividad polimerasa de las nucleasas 5' hasta un nivel en el que la actividad sintética no interfiera con el uso de la nucleasa 5' en el ensayo de detección de la invención. De mayor preferencia, la capacidad sintética está ausente. Las polimerasas modificadas se prueban para analizar la presencia de actividad sintética y nucleasa 5' como en los ensayos que se describen a continuación. La consideración inteligente de estos análisis permite la selección de enzimas candidato cuya estructura es hasta el momento desconocida. En otras palabras, puede evaluarse la construcción "X" según el protocolo que se describe a continuación para determinar si es un miembro de género de nucleasas 5' de la presente invención según la definición funcional, más que estructural.
En el siguiente ejemplo, el producto de PCR del ADN genómico de Thermus aquaticus amplificado no tenía la estructura de nucleótidos idéntica del ADN genómico nativo y no tenía la misma capacidad sintética del clon original. Los cambios de pares de bases resultantes de la infidelidad de DNAPTaq durante la amplificación por PCR de un gen de polimerasa son también un procedimiento por medio del que puede inactivarse la capacidad sintética de un gen de polimerasa. Los siguientes ejemplos y las Figuras 4A y 5A indican regiones en las polimerasas de ADN nativas de Thermus aquaticus y flavus probablemente importantes para la capacidad sintética. Hay otros cambios y substituciones de pares de bases que probablemente también inactivarán la polimerasa.
No es necesario, sin embargo, comenzar el procedimiento de producción de una nucleasa 5' a partir de una polimerasa de ADN con tal producto mutado amplificado. Este es el procedimiento por el que se realizaron los siguientes ejemplos para generar los mutantes de DNAPTaq deficientes en síntesis, pero los expertos en la técnica entienden que puede usarse una secuencia de polimerasa de ADN de tipo salvaje como el material de partida para la introducción de deleciones, inserciones y sustituciones para producir una nucleasa 5'. Por ejemplo, para generar el mutante de DNAPTf1 deficiente en síntesis, se usaron los cebadores presentados en SEC ID Nº 13-14 para amplificar el gen de la polimerasa de ADN de tipo salvaje de la cepa AT-62 de Thermus flavus. A continuación se sometió el gen de polimerasa amplificado a la digestión con enzimas de restricción para delecionar una gran porción del dominio que codifica la actividad sintética.
La presente invención contempla que la construcción de ácido nucleico sea capaz de la expresarse en un huésped adecuado. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para unir diversos promotores y secuencias 3' a una estructura de un gen para alcanzar la expresión eficaz. Los ejemplos siguientes describen dos vectores adecuados y seis construcciones de vectores adecuadas. Por supuesto, hay otras combinaciones de promotor/vector que serían adecuadas. No es necesario el uso de un organismo huésped para la expresión de las construcciones de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, puede alcanzarse la expresión de la proteína codificada por una construcción del ácido nucleico por medio del uso de un sistema de transcripción/traducción in vitro libre de células. Un ejemplo de tal sistema libre de células es el disponible comercialmente TnT Coupled Reticulocyte Lysate System (Promega Corporation, Madison, WI).
Una vez que se haya generado una construcción de ácido nucleico adecuada, puede producirse la nucleasa 5' a partir de la construcción. Los siguientes ejemplos y las enseñanzas convencionales de biología molecular permiten manipular la construcción por medio de diferentes procedimientos adecuados.
Una vez expresada la nucleasa 5', se prueba la polimerasa tanto para la actividad sintética como nucleasa como se describe a continuación.
3. Modificación y/o Inhibición Química y/o Física
Puede reducirse la actividad sintética de una polimerasa termoestable de ADN por medios químicos y/o físicos. En una forma de realización, se lleva a cabo la reacción de escisión catalizada por la actividad nucleasa 5' de la polimerasa bajo condiciones que inhiben de preferencia la actividad sintética de la polimerasa. Resulta necesario inhibir el nivel de actividad sintética solamente hasta aquel nivel de actividad que no interfiera con las reacciones de escisión que no requieren actividad sintética significativa.
Como se muestra en los siguientes ejemplos, las concentraciones de Mg^{++} superiores a 5 mM inhiben la actividad de polimerización de la DNAPTaq nativa. La capacidad de la nucleasa 5' para funcionar bajo condiciones en las que se inhibe la actividad sintética se prueba realizando los ensayos para de la actividad sintética y nucleasa 5', que se describen a continuación, en presencia de una variedad de concentraciones de Mg^{++} (5 hasta 10 mM). El efecto de una concentración dada de Mg^{++} se determina por la cuantificación de la cantidad de síntesis y escisión en la reacción de prueba comparada con la reacción convencional para cada ensayo.
El efecto inhibidor de otros iones, poliaminas, desnaturalizantes, tales como urea, formamida, dimetilsulfóxido, glicerol y detergentes no iónicos (Tritón X-100 y Tween-20), productos químicos que se unen a ácidos nucleicos tales como, actinomicina D, bromuro de etidio y psoralenos, se prueba por medio de su adición a los tampones de reacción convencionales para los ensayos de síntesis y de nucleasa 5'. Aquellos compuestos que tienen un efecto inhibidor preferencial sobre la actividad sintética de una polimerasa termoestable se utilizan entonces para crear las condiciones de reacción bajo las que se conserva la actividad nucleasa 5' (escisión) mientras se reduce o se elimina la actividad sintética.
Pueden usarse medios físicos para inhibir de forma preferencial la actividad sintética de una polimerasa. Por ejemplo, se destruye la actividad sintética de polimerasas termoestables por la exposición de la polimerasa a calor extremo (típicamente 96 hasta 100ºC) durante períodos de tiempo prolongados (mayores o iguales a 20 minutos). Aunque que éstas son diferencias de importancia menor con respecto a la tolerancia específica al calor para cada una de las enzimas, éstas se determinan fácilmente. Las polimerasas se tratan con calor durante diversos períodos de tiempo y se determina el efecto del tratamiento por calor sobre las actividades sintética y nucleasa 5'.
III. Utilidad Terapéutica de Nucleasas 5'
Las nucleasas 5' usadas en los procedimientos de la invención tienen no sólo la utilidad de diagnóstico discutida anteriormente, sino además utilidad terapéutica para la escisión e inactivación de ARNm específicos dentro de células infectadas. Los ARNm de agentes patogénicos, tales como virus, bacterias, se marcan para escisión por medio de una polimerasa de ADN deficiente en síntesis por medio de la introducción de un oligonucleótido complementario con un ARNm dado producido por el agente patogénico en la célula infectada junto con la polimerasa deficiente en síntesis. Puede marcarse cualquier agente patogénico por medio de este procedimiento a condición de que esté disponible la información de la secuencia de nucleótidos para poder sintetizar un oligonucleótido adecuado. El oligonucleótido sintético se alinea con el ARNm complementario formando así la estructura de escisión reconocida por la enzima modificada. La capacidad de la actividad nucleasa 5' de polimerasas termoestables de ADN para escindir híbridos de ARN-ADN se muestra en este documento en el Ejemplo 1D.
Los liposomas proporcionan un sistema de administración adecuado. El oligonucleótido sintético puede conjugarse o unirse a la nucleasa para permitir la administración conjunta de estas moléculas. Pueden usarse otros sistemas de administración.
La inactivación de ARNm patogénicos se ha descrito usando regulación del gen antisentido y usando ribozimas (Rossi, Patente de EEUU Nº 5.144.019). Ambos procedimientos tienen limitaciones.
El uso de ARN antisentido para detener la expresión genética requiere cantidades estequiométricas y por consiguiente, grandes excesos molares de ARN antisentido relacionado con el ARN patogénico para ser eficaz. La terapia de ribozima, por otra parte, es catalítica y por consiguiente carece del problema de la necesidad de un gran exceso molar del compuesto terapéutico que se tienen los procedimientos de antisentido. Sin embargo, la escisión con ribozima de un ARN dado requiere la presencia de secuencias altamente conservadas para formar la estructura de escisión catalíticamente activa. Esto requiere que el ARNm patogénico diana contenga las secuencias conservadas (GAAAC (X)_{n} GU) limitando de esta manera el número de ARNm patogénicos que pueden escindirse por medio de este procedimiento. En cambio, la escisión catalítica del ARN por medio del uso de un oligonucleótido de ADN y una nucleasa 5' es dependiente de solamente de la estructura; por consiguiente, puede usarse virtualmente cualquier secuencia de ARN patogénico para diseñar una estructura de escisión adecuada.
IV. Detección de Dianas Antigénicas o de Ácido Nucleico por Ensayo de Captura Dual
La capacidad para generar nucleasas 5' de las polimerasas termoestables de ADN proporciona la base para detectar la presencia de dianas antigénicas o de ácido nucleico. En este ensayo de captura dual, los dominios de la polimerasa que codifican la actividad sintética y la actividad nucleasa se unen covalentemente a dos anticuerpos u oligonucleótidos separados y los distintos. Cuando ambos dominios, sintético y nucleasa están presentes en la misma reacción y se proporcionan dATP, dTTP y una pequeña cantidad de poli d(AT), se produce una cantidad enorme de poli d(AT). Las grandes cantidades de poli d(AT) se producen como resultado de la capacidad de la nucleasa 5' para escindir poli d(AT) nuevo para generar cebadores que, a su vez, son usados por el dominio sintético para catalizar la producción de aún más poli d(AT). La nucleasa 5' es capaz de escindir poli d(AT) porque poli d(AT) complementaria en si misma y forma fácilmente estructuras alternativas a temperaturas elevadas. Estas estructuras son reconocidas por la nucleasa 5' y a continuación se escinden para generar más cebador para la reacción de síntesis.
El siguiente es un ejemplo del ensayo de captura dual para detectar un antígeno(s): Se proporciona una muestra a analizar para un antígeno(s) dado(s). Esta muestra puede comprender una mezcla de células; por ejemplo, las células infectadas con virus despliegan antígenos codificados víricamente en su superficie. Si el(los) antígeno(s) a detectar está(n) presentes en solución, primero se unen a un soporte sólido tal como la pared de una placa de microvaloración o a una perla usando procedimientos convencionales. Posteriormente se mezcla la muestra con 1) el dominio sintético de una polimerasa termoestable de ADN conjugada con un anticuerpo que reconoce un primer antígeno o un primer epítopo en un antígeno, y 2) el dominio nucleasa 5' de una polimerasa termoestable de ADN conjugado con un segundo anticuerpo que reconoce un segundo antígeno distinto o un segundo epítopo en el mismo antígeno como lo reconoce el anticuerpo conjugado con el dominio sintético. Tras de un período de tiempo adecuado para permitir la interacción de los anticuerpos con sus antígenos reconocidos (las condiciones variarán dependiendo de los anticuerpos usados; las condiciones adecuadas son bien conocidas en la técnica), a continuación se lava la muestra para eliminar complejos dominio de enzima-anticuerpo no unido. Posteriormente se añade dATP, dTTP y una pequeña cantidad de poli d(AT) a la muestra lavada y se incuba la muestra a temperaturas elevadas (generalmente en el intervalo de 60-80ºC y de preferencia, 70-75ºC) para permitir que funcionen los dominios sintético y nucleasa 5' termoestables. Si la muestra contiene los antígenos reconocidos por ambos dominios por separado conjugados de la polimerasa, se produce entonces un aumento exponencial en la producción de poli d(AT). Si solamente en la muestra está presente sólo el anticuerpo conjugado con el dominio sintético de la polimerasa tal que no está presente el dominio nucleasa 5' en la muestra lavada, es posible entonces solamente un aumento aritmético de poli d(AT). Las condiciones de reacción pueden controlarse para un aumento aritmético de poli d(AT) esté por debajo del umbral de detección. Esto puede lograrse controlando la cantidad de tiempo en que se permite que la reacción tenga lugar o agregando tan poca cantidad de poli d(AT) para actuar como molde que en ausencia de actividad nucleasa para generar cebadores de poli d(AT) nuevos se sintetice muy poco poli d(AT).
No es necesario que ambos dominios de la enzima estén conjugados con un anticuerpo. Uno puede proporcionar el dominio sintético conjugado con un anticuerpo y proporcionar el dominio nucleasa 5' en solución o viceversa. En tal caso se añade el dominio de la enzima-anticuerpo conjugado a la muestra, se incuba, a continuación se lava. Posteriormente se añade dATP, dTTP, poli d(AT) y el dominio de la enzima restante en solución.
Además, los dos dominios de la enzima pueden conjugarse con los oligonucleótidos para que puedan detectarse las secuencias de ácido nucleico diana. Los oligonucleótidos conjugados con los dos dominios diferentes de la enzima pueden reconocer diferentes regiones en la mismo hebra del ácido nucleico diana o pueden reconocer dos ácidos nucleicos diana no relacionadas.
La producción de poli d(AT) puede detectarse de muchas maneras que incluyen: 1) el uso de un marcador radiactivo en el dATP o el dTTP proporcionados para la síntesis de poli d(AT), seguido por la separación por tamaño de los productos de reacción y autorradiografía; 2) el uso de una sonda fluorescente en el dATP y una sonda biotinilada en el dTTP proporcionado para la síntesis de poli d(AT), seguida por paso de los productos de reacción sobre una perla de avidina, tales como perlas magnéticas conjugadas con avidina; la presencia de la sonda fluorescente en la perla que contiene avidina indica que se ha formado poli d(AT) ya que la sonda fluorescente se pegará a la perla de avidina solamente si se incorpora dATP fluorescente en un enlace covalente con el dTTP biotinilado; y 3) los cambios de polarización de fluorescencia que indican un aumento de tamaño. Otros medios para detectar la presencia de poli d(AT) incluyen el uso de indicadores de fluorescencia intercalados para controlar el aumento en la formación de ADN de doble hélice.
Las ventajas del ensayo de captura dual anterior para detectar dianas antigénicas o de ácidos nucleicos incluyen:
1) No se requiere termociclado de la muestra. Los dominios de la polimerasa y el dATP y el dTTP se incuban a una temperatura fija (generalmente aproximadamente 70ºC). Tras 30 minutos de incubación hasta el 75% de los dNTP añadidos están incorporados en poli d(AT). La falta de termociclado hace que este ensayo sea adecuado en el contexto del laboratorio clínicos; no hay necesidad de adquirir un aparato termociclador y no hay necesidad de mantener el control muy exacto de la temperatura.
2) Las condiciones de reacción son simples. La incubación de los dominios enzimáticos unidos se realiza en un tampón que contiene MgCl_{2} 0,5 mM (pueden usarse concentraciones más altas), Tris-Cl 2-10 mM, pH 8,5, dATP y dTTP aproximadamente 50 \muM. El volumen de reacción es 10-20 \mul y los productos de reacción son detectables en el plazo de 10-20 minutos.
3) No se detecta ninguna reacción a menos que estén presentes ambas actividades, sintética y nucleasa. Por consiguiente, un resultado positivo indica que ambas sondas (anticuerpo u oligonucleótido) han reconocido sus dianas aumentando por consiguiente la especificidad del reconocimiento al tener dos sondas diferentes unidas a la diana.
La capacidad para separar las dos actividades enzimáticas de la DNAP permite aumentos exponenciales en la producción de poli d(AT). Si se usa una DNAP que carece de actividad nucleasa 5', tal como el fragmento Klenow de DNAPEc1, sólo es posible un aumento lineal o aritmético en la producción de poli d(AT) [Setlow y col., J. Biol. Chem. 247:224 (1972)]. La descripción de esta invención hace posible la capacidad para proporcionar una enzima que tiene actividad nucleasa 5' pero que carece de actividad sintética.
Fase experimental
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar ciertas formas de realización de preferencia y aspectos de la presente invención y no deben ser interpretados como limitación del alcance de la misma.
En la siguiente descripción, se aplican las siguientes abreviaturas: ºC (grados Centígrados); g (campo gravitacional); vol (volumen); p/v (peso sobre volumen); v/v (volumen sobre volumen); SAB (seroalbúmina de bovino); CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio; HPLC (cromatografía líquida de alta presión); ADN (ácido desoxirribonucleico); p (plásmido); \mul (microlitros); ml (mililitros); \mug (microgramos); pmol (picomoles); mg (miligramos); M (molar); mM (milimolar); \muM (micromolar); nm (manómetros); kdal (kilodaltons); DO (densidad óptica); EDTA (ácido etilendiamino tetra acético); FITC (isotiocianato de fluoresceína); SDS (dodecilsulfato de sodio); NaPO_{4} (fosfato de sodio); Tris (tris(hidroximetil)-aminometano; PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro); TBE (Tris-Borato-EDTA, es decir, tampón Tris valorado con ácido bórico y no con HCl y que contiene EDTA); PBS (solución salina tamponada con fosfato); PPBS (solución salina tamponada con fosfato que contiene PMSF 1 mM); PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida); Tween (polioxietilen-sorbitan); Dynal (Dynal A.S., Oslo, Noruega); Epicentre (Epicentre Technologies, Madison, WI); National Biosciences (Plymouth, MN); New England Biolabs (Beverly, MA); Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI); Perkin Elmer (Norwalk, CT); Promega Corp. (Madison, WI); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); USB (U.S. Biochemical, Cleveland, OH).
Ejemplo 1 Características de las Polimerasas Termoestables de ADN Nativas A. Actividad Nucleasa 5' de DNAPTaq
Durante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [Saiki y col., Science 239:487 (1988); Mullis y Faloona, Methods in Enzymology 155:335 (1987)], DNAPTaq es capaz de amplificar muchas secuencias de ADN, pero no todas. Una secuencia que no puede amplificarse usando DNAPTaq se muestra en la Figura 6 (la estructura de Horquilla es SEC ID Nº 15, los CEBADORES son las SEC ID Nº 16-17). Esta secuencia de ADN tiene la característica distintiva de ser capaz de plegarse para formar una horquilla con dos brazos de hebra única, que corresponden con los cebadores usados en PCR.
Para probar si este fallo para amplificar se debe a la actividad nucleasa 5' de la enzima, se compararon las capacidades de DNAPTaq y de DNAPStf para amplificar esta secuencia de ADN durante 30 ciclos de PCR. Los oligonucleótidos sintéticos se obtuvieron en el Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin-Madison. La DNAPTaq y la DNAPStf eran de Perkin Elmer (es decir, polimerasa de ADN Amplitaq^{TM} y el fragmento Stoffel de la polimerasa de ADN Amplitaq^{TM}). El ADN sustrato comprendió la estructura de horquilla mostrada en la Figura 6 clonada en una forma de doble hebra en pUC19. Los cebadores usados en la amplificación se presentan SEC ID Nº 16-17. El cebador SEC ID Nº 17 se muestra alineado con el brazo 3' de la estructura de horquilla en la Figura 6. El cebador SEC ID Nº 16 se muestra como los primeros 20 nucleótidos en negrita en el brazo 5' de la horquilla en la Figura 6.
Las reacciones en cadena de la polimerasa comprendieron 1 ng de ADN diana superenrollado del plásmido, 5 pmol de cada cebador, 40 \muM de cada dNTP, y 2,5 unidades de DNAPTaq o DNAPStf, en 50 \mul de una solución de Tris-Cl 10 mM, pH 8,3. Las reacciones de DNAPTaq incluyeron KCl 50 mM y MgCl_{2} 1,5 mM. El perfil de temperatura fue de 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, durante 30 ciclos. El diez por ciento de cada reacción se analizó por medio de electroforesis en gel a través de poliacrilamida al 6% (entrecruzada 29:1) en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM.
Los resultados se muestran en la Figura 7. El producto previsto se generó por medio de DNAPStf (indicado simplemente como "S") pero no por medio de DNAPTaq (indicado como "T"). La conclusión fue que la actividad nucleasa 5' de DNAPTaq es responsable de la falta de amplificación de esta secuencia de ADN.
Para probar si los nucleótidos 5' no apareados en la región del sustrato de este ADN estructurado son eliminados por DNAPTaq, se comparó el destino del brazo 5' marcado en el extremo durante cuatro ciclos de PCR usando las mismas dos polimerasas (Figura 8). Los moldes de horquilla, tales como el descrito en la Figura 6, se generaron usando DNAPStf y un cebador marcado en el extremo 5' con ^{32}P. El extremo 5' del ADN se liberó como unos pocos fragmentos grandes por DNAPTaq pero no por DNAPStf. Los tamaños de estos fragmentos (en base a su movilidad) muestran que contienen la mayoría o todos los brazos 5' no apareados del ADN. Por consiguiente, la escisión se produce en o cerca de la base de la doble hélice bifurcada. Estos fragmentos liberados terminan con grupos 3' OH, según lo evidenciado por análisis directos de secuencia, y la capacidad de los fragmentos para ser extendidos por la desoxinucleotidil transferasa terminal.
Las Figuras 9-11 muestran los resultados de experimentos diseñados para caracterizar la reacción de escisión catalizada por DNAPTaq. A menos que se especifique de otra manera, las reacciones de escisión comprendieron 0,01 pmol de ADN desnaturalizado por calor, marcado en el extremo de la horquilla (con la hebra complementaria no marcada también presente), 1 pmol del cebador (complementario con el brazo 3') y 0,5 unidades de DNAPTaq (estimado para ser 0,026 pmol) en un volumen total de 10 \mul de Tris-Cl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM y MgCl_{2} 1,5 mM. Según lo indicado, algunas reacciones tenían diferentes concentraciones del KCl, y los tiempos y las temperaturas exactos usados en cada experimento se indican en las figuras individuales. Las reacciones que incluyeron un cebador usaron el que se muestra en la Figura 6 (SEC ID Nº 17). En algunos casos, el cebador se extendió hacia el sitio de unión proporcionando la polimerasa y los nucleótidos seleccionados.
Las reacciones se iniciaron a la temperatura final de reacción adicionando el MgCl_{2} o la enzima. Las reacciones se detuvieron a sus temperaturas de incubación adicionando 8 \mul de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Los cálculos de Tm que se presentan se realizaron usando el programa de análisis de cebadores Oligo^{TM} de National Biosciences, Inc. Éstos se determinaron usando 0,25 \muM como la concentración de ADN, en sal total 15 ó 65 mM (se dio el valor de sal 15 mM al MgCl_{2} 1,5 mM en todas las reacciones para estos cálculos).
\newpage
La Figura 9 es una autorradiografía que contiene los resultados de una serie de experimentos y de condiciones en el sitio de escisión. La Figura 9A es una determinación de los componentes de reacción que permiten la escisión. La incubación de la horquilla de ADN marcada en el extremo 5' fue durante 30 minutos a 55ºC, con los componentes indicados. Los productos se resolvieron por desnaturalización por electroforesis en gel de poliacrilamida y se indican las longitudes de los productos, en nucleótidos. La Figura 9B describe el efecto de la temperatura sobre el sitio de escisión en ausencia del cebador añadido. Las reacciones se incubaron en ausencia de KCl durante 10 minutos a las temperaturas indicadas. Se indican las longitudes de los productos, en nucleótidos.
Sorpresivamente, la escisión por DNAPTaq no requiere ni un cebador ni dNTP (véase la Figura 9A). Por consiguiente, puede deasacoplarse la actividad nucleasa 5' de la polimerización. La actividad nucleasa requiere iones magnesio, aunque pueden sustituirse con iones manganeso, aunque con cambios potenciales en especificidad y actividad. Ni los iones de cinc ni de calcio son útiles en la reacción de escisión. La reacción se produce en un amplio intervalo de temperaturas, desde 25ºC hasta 85ºC, con un aumento de la tasa de escisión a temperaturas más altas.
Todavía en referencia a la Figura 9, el cebador no se alarga en ausencia de adición de dNTP. Sin embargo, el cebador ejerce influencia sobre el sitio y la tasa de escisión de la horquilla. El cambio en el sitio de escisión (Figura 9A) resulta aparentemente de la interrupción de una doble hélice corta formada entre los brazos del sustrato de ADN. En ausencia del cebador, podrían aparearse las secuencias indicadas por subrayado en la Figura 6, formando una doble hélice extendida. La escisión en el extremo de la doble hélice extendida podría liberar el fragmento de 11 nucleótidos que se observa en los carriles de la Figura 9A sin añadir cebador. La adición de exceso de cebador (Figura 9A, carriles 3 y 4) o la incubación a una temperatura elevada (Figura 9B) interrumpe la extensión corta de la doble hélice y da como resultado un brazo 5' más largo y, por lo tanto, productos de escisión más largos.
La localización del extremo 3' del cebador puede influir en el sitio exacto de escisión. El análisis electroforético reveló que en ausencia del cebador (Figura 9B), la escisión se produce en el extremo de la doble hélice del sustrato (ya sea la forma extendida o acortada, dependiendo de la temperatura) entre el primer y segundo par de bases. Cuando el cebador se extiende hacia la base de la doble hélice, se produce escisión también un nucleótido dentro de la doble hélice. Sin embargo, cuando existe un espacio de separación de cuatro o seis nucleótidos entre el extremo 3' del cebador y la doble hélice sustrato, el sitio de escisión cambia de cuatro a seis nucleótidos en dirección 5'.
La Figura 10 describe la cinética de la escisión en presencia (Figura 10A) o ausencia (Figura 10B) de un oligonucleótido cebador. Las reacciones se llevaron a cabo a 55ºC con KCl 50 mM (Figura 10A) o KCl 20 mM (Figura 10B). Los productos de reacción se resolvieron por desnaturalización por electroforesis en gel de poliacrilamida y se indican las longitudes de los productos, en nucleótidos. "M", que indica un marcador, es un oligonucleótido de 19-nt marcado en el extremo 5'. Bajo estas condiciones salinas, las Figuras 10A y 10B indican que la reacción parece ser aproximadamente veinte veces más rápida en presencia de cebador que en ausencia de cebador. Este efecto sobre la eficacia puede atribuirse a la alineación y estabilización adecuados de la enzima en el sustrato.
La influencia relativa del cebador en la tasa de escisión llega a ser mucho mayor cuando ambas reacciones se llevan a cabo en KCl 50 mM. En presencia del cebador, la tasa de escisión aumenta con la concentración de KCl, hasta aproximadamente 50 mM. Sin embargo, es evidente la inhibición de esta reacción en presencia del cebador a una concentración de KCl 100 mM y es completa a 150 mM. En cambio, en ausencia del cebador la tasa aumenta por la concentración de KCl hasta 20 mM, pero se reduce a concentraciones superiores a 30 mM. A una concentración 50 mM de KCl, la reacción se inhibe casi completamente. La inhibición de la escisión por KCl en ausencia de cebador está afectada por la temperatura, siendo más pronunciada a temperaturas más bajas.
El reconocimiento del extremo 5' del brazo a cortar parece ser una característica importante del reconocimiento del sustrato. Los sustratos que carecen de un extremo 5' libre, tal como el ADN M13 circular, no pueden escindirse bajo ninguna condición probada. Incluso con sustratos que tienen brazos 5' definidos, la tasa de escisión por DNAPTaq está influenciada por la longitud del brazo. En presencia del cebador y de KCl 50 mM, la escisión de una extensión 5' que tienen una longitud de 27 nucleótidos está esencialmente completa en el plazo de 2 minutos a 55ºC. En cambio, la escisión de moléculas con brazos 5' de 84 y 188 nucleótidos está sólo aproximadamente 90% y 40% completa tras 20 minutos. La incubación a temperaturas más altas reduce los efectos inhibidores de las extensiones largas, lo que indica que la estructura secundaria en el brazo 5' o una estructura en la enzima lábil frente al calor puede inhibir la reacción. Un experimento de mezcla, realizado bajo condiciones de exceso de sustrato, muestra que las moléculas con brazos unen de preferencia la enzima disponible en complejos no productivos. Estos resultados pueden indicar que el dominio de nucleasa 5' accede al sitio de escisión en el extremo de la doble hélice bifurcada bajando el brazo 5' de un extremo al otro. Se esperaría que brazos 5' más largos tuvieran estructuras secundarias más extrínsecas (particularmente cuando las concentraciones de KCl son altas), lo que podría impedir este movimiento.
La escisión no parece inhibirse por brazos 3' largos de la hebra de substrato de la molécula diana o ácido nucleico experimental, al menos hasta 2 kilobases. En el otro extremo, los brazos 3' del ácido nucleico experimental tan cortos como un nucleótido pueden soportar escisión en una reacción independiente del cebador, aunque de forma ineficaz. Los oligonucleótidos completamente apareados no provocan la escisión de moldes de ADN durante la extensión del cebador.
La capacidad de DNAPTaq para escindir las moléculas incluso cuando la hebra complementaria contiene solamente un nucleótido no apareado puede ser útil para optimizar la PCR específica de alelos. Los cebadores de PCR que tienen extremos 3' no apareados podrían actuar como oligonucleótidos experimentales para dirigir la escisión selectiva de moldes no deseados durante la preincubación de complejos molde-cebador potenciales con DNAPTaq en ausencia de trifosfatos de nucleósidos.
B. Actividades Nucleasa 5' de Otras DNAP
Para determinas si otras nucleasas 5' en otras DNAP podrían ser adecuadas para la presente invención, se examinaron una serie de enzimas, varias de las cuales se informaron en la bibliografía como libres de actividad nucleasa 5' aparente. La capacidad de estas otras enzimas para escindir ácidos nucleicos de una manera específica de estructura se probó usando el sustrato horquilla mostrado en la Figura 6 bajo condiciones informadas como óptimas para la síntesis por cada enzima.
Se obtuvieron DNAPEc1 y DNAP Klenow de Promega Corporation; la DNAP de Pyrococcus furious ["Pfu", Bargseid y col., Strategies 4:34 (1991)] era de Stratagene; la DNAP de Thermococcus litoralis ["Tli", Vent^{TM} (exo-),
Perler y col., Porc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5577 (1992)] era de New England Biolabs; la DNAP de Thermus flavus ["Tfl", Kaledin y col., Biokhimiya 46:1576 (1981)] era de Epicentre Technologies; y la DNAP de Thermus thermo- philus ["Tth", Carballeira y col., Biotechniques 9:276 (1990); Myers y col., Biochem. 30:7661 (1991)] era de U.S. Biochemicals.
Se ensayaron 0,5 unidades de cada polimerasa de ADN en una reacción de 20 \mul, usando los tampones proporcionados por los fabricantes para las reacciones dependientes del cebador, o Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, MgCl_{2} 1,5 mM, y KCl 20 mM. Las mezclas de reacción se mantuvieron a 72ºC previo al añadido de enzima.
La Figura 11 es una autorradiografía que registra los resultados de estas pruebas. La Figura 11A demuestra reacciones de endonucleasas de DNAP de varias bacterias termófilas. Las reacciones se incubaron a 55ºC durante 10 minutos en presencia de cebador o a 72ºC durante 30 minutos en ausencia de cebador, y los productos se resolvieron por desnaturalización por electroforesis en gel de poliacrilamida. Se indican las longitudes de los productos, en nucleótidos. La Figura 11B demuestra escisión endonucleolítica por la nucleasa 5' de DNAPEc1. Las reacciones de DNAPEc1 y DNAP Klenow se incubaron durante 5 minutos a 37ºC. Nótese la ligera banda de productos de escisión de 25 y 11 nucleótidos en los carriles de DNAPEc1 (obtenidos en presencia y ausencia de cebador, respectivamente). La Figura 7B también demuestra reacciones de DNAPTaq en presencia (+) o ausencia (-) de cebador. Estas reacciones se llevaron a cabo en KCl 50 mM y 20 mM, respectivamente, y se incubaron a 55ºC durante 10 minutos.
En referencia a la Figura 11A, las DNAP de eubacteria Thermus thermophilus y Thermus flavus escinden el sustrato en el mismo sitio que DNAPTaq, tanto en presencia como en ausencia de cebador. Por el contrario, las DNAP de archaebacteria Pyrococcus furious y Thermococcus litoralis fueron incapaces de escindir el sustrato endonucleolíticamente. Las DNAP de Pyrococcus furious y Thermococcus litoralis comparten poca similitud de secuencia con las enzimas de eubacterias (Ito y col., Nucl. Acids Res. 19:4045 (1991); Mathur y col., Nucl. Acids. Res. 19:6952 (1991); véase también Perler y col.). En referencia a la Figura 11B, DNAPEc1 también escinde el sustrato, pero los productos de escisión resultantes son difíciles de detectar a menos que se inhiba la exonucleasa 3'. Las secuencias de aminoácidos de los dominios de nucleasa 5' de DNAPEc1 y DNAPTaq tienen una similitud de aproximadamente 38% (Gelfand, supra).
El dominio nucleasa 5' de DNAPTaq también comparte aproximadamente 19% de similitud con la exonucleasa 5' codificada por el gen 6 del bacteriófago T7 [Dunn y col., J. Mol. Biol. 166:477 (1983)]. Esta nucleasa, que no está unida covalentemente al dominio de polimerización de DNAP, es también capaz de escindir ADN endonucleolíticamente, en un sitio similar o idéntico al sitio cortado por las nucleasas 5' descritas anteriormente, en ausencia de cebadores añadidos.
C. Transescisión
En el siguiente experimento se demostró la capacidad para dirigir una nucleasa 5' para escindir eficazmente en cualquier secuencia específica. Se hibridó un oligonucleótido parcialmente complementario denominado "oligonucleótido experimental" con secuencias en el punto deseado de escisión. La parte no complementaria del oligonucleótido experimental proporcionó una estructura análoga al brazo 3' del molde (véase la Figura 6), mientras que la región 5' de la hebra sustrato se convirtió en el brazo 5'. Se proporcionó un cebador diseñando la región 3' del experimental para que pudiera plegarse sobre sí misma creando una horquilla corta con un tetra bucle estabilizador [Antao y col., Nucl. Acids Res. 19:5901 (1991)]. En la Figura 12A se muestran dos oligonucleótidos experimentales. Los oligonucleótidos 19-12 (SEC ID Nº 18), 30-12 (SEC ID Nº 19) y 30-0 (SEC ID Nº 40) tienen una longitud de 31, 42 ó 30 nucleótidos, respectivamente. Sin embargo, los nucleótidos 19-12 (SEC ID Nº 18) y 34-19 (SEC ID Nº 19) tienen sólo 19 y 30 nucleótidos, respectivamente, que son complementarios con las secuencias diferentes en la hebra sustrato. Se calcularon los oligonucleótidos experimentales para fundirse de sus complementos aproximadamente a 50ºC (19-12) y aproximadamente a 75ºC (30-12). Ambos experimentales tienen 12 nucleótidos en sus extremos 3', que actúan como brazos 3' con cebadores de bases apareadas unidos.
Para demostrar que la escisión podría dirigirse por un oligonucleótido experimental, se incubó un ADN diana de hebra única con DNAPTaq en presencia de dos oligonucleótidos experimentales potenciales. Las reacciones de transescisión, en las que los ácidos nucleicos experimentales y diana no están unidos covalentemente, incluyen 0,01 pmol de ADN sustrato marcado en un único extremo, 1 unidad de DNAPTaq y 5 pmol de oligonucleótido experimental en un volumen de 20 \mul de los mismos tampones. Se combinaron estos componentes durante un minuto de incubación a 95ºC, para desnaturalizar el ADN sustrato de doble hebra generado por PCR, y las temperaturas de las reacciones se redujeron a continuación hasta las temperaturas de incubación finales. Los oligonucleótidos 30-12 y 19-12 pueden hibridar con regiones de los ADN sustrato que están a 85 y 27 nucleótidos desde el extremo 5' de la hebra
marcada.
La Figura 21 muestra la secuencia de 206 residuos completa (SEC ID Nº 32). La secuencia de 206 residuos se generó por PCR. Se usó el cebador de secuenciación inversa (-48) M13/pUC de 24 residuos y el cebador de secuenciación (-47) M13/pUC de New England Biolabs (Números de catálogo 1233 y 1244 respectivamente) (50 pmol de cada uno) con vector plasmídico pGEM3z (f+) (Promega Corp.) como molde (10 ng) que contenía secuencias diana. Las condiciones para la PCR fueron las siguientes: 50 \muM de cada dNTP y 2,5 unidades de polimerasa de ADN Taq en 100 \mul de Tris-Cl 20 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM con Tween-20 al 0,05% y NP-40 al 0,05%. Se ciclaron las reacciones 35 veces a través de 95ºC durante 45 segundos, 63ºC durante 45 segundos, a continuación 72ºC durante 75 segundos. Tras el ciclado, se finalizaron las reacciones con una incubación a 72ºC durante 5 minutos. Se purificó el fragmento resultante por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 6% (entrecruzado 29:1) en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM, se visualizó por medio de tinción con bromuro de etidio o se autorradiografió, se cortó y extrajo del gel, se eluyó por difusión pasiva y se concentró por precipitación con
etanol.
La escisión del ADN sustrato tuvo lugar en presencia del oligonucleótido experimental 19-12 a 50ºC (Figura 12B, carriles 1 y 7) pero no a 75ºC (carriles 4 y 10). En presencia del oligonucleótido 30-12 se observó escisión a ambas temperaturas. La escisión no tuvo lugar en ausencia de oligonucleótidos añadidos (carriles 3, 6 y 12) o aproximadamente a 80ºC aunque a 50ºC las estructuras extrínsecas en el sustrato permitieron la escisión independiente del cebador en ausencia de KCl (Figura 12B, carril 9). Un oligonucleótido no específico sin complementariedad con el ADN sustrato no condujo a escisión a 50ºC, ya sea en ausencia o presencia de KCl 50 mM (carriles 13 y 14). Por consiguiente, la especificidad de las reacciones de escisión puede controlarse por la extensión de complementariedad con el sustrato y por las condiciones de incubación.
D. Escisión de ARN
Se probó la capacidad de una versión acortada de ARN de la secuencia usada en los experimentos de transescisión discutidos anteriormente para servir como sustrato en la reacción. El ARN se escinde en el sitio esperado, en una reacción dependiente de la presencia del oligonucleótido experimental. El sustrato de ARN, generado por polimerasa de ARN T7 en presencia de [\alpha-^{32}P]UTP, corresponde con una versión truncada del sustrato de ADN usada en la Figura 12B. Las condiciones de reacción fueron similares a aquellas usadas para los sustratos de ADN descritas anteriormente, con KCl 50 mM; la incubación fue durante 40 minutos a 55ºC. El oligonucleótido usado se denomina 30-0 (SEC ID Nº 20) y se muestra en la Figura 13A.
Los resultados de la reacción de escisión se muestran en la Figura 13B. La reacción se lleva a cabo en presencia o en ausencia de DNAPTaq u oligonucleótido experimental como se indica en la Figura 13B.
Notablemente, en el caso de escisión de ARN, no se requiere un brazo 3' para el oligonucleótido experimental. Es muy poco probable que esta escisión sea debido a la RNasaH descrita anteriormente, con la que se esperaría el corte de ARN en varios sitios a lo largo de la doble hélice ARN-ADN de 30 pares de bases de longitud. La nucleasa 5' de DNAPTaq es una RNasaH específica de estructura que escinde el ARN en un sitio único cerca del extremo 5' de la región de la doble hélice heterogénea.
Resulta sorprendente que un oligonucleótido que carece de un brazo 3' sea capaz de actuar como experimental conduciendo una escisión eficaz de una diana de ARN porque tales oligonucleótidos son incapaces de conducir una escisión eficaz de dianas de ADN usando DNAP nativas. Sin embargo, algunas nucleasas 5' de la presente invención (por ejemplo, clones E, F y G de la Figura 4) pueden escindir ADN en ausencia de un brazo 3'. En otras palabras, no es necesaria una estructura de escisión no extensible para la escisión específica con algunas nucleasas 5' de la presente invención derivadas de polimerasas termoestables de ADN.
Se probó si la escisión de un molde de ARN por DNAPTaq en presencia de un cebador totalmente complementario podría ayudar a explicar por qué DNAPTaq no es capaz de extender un oligonucleótido de ADN en un molde de ARN, en una reacción que se parece a aquella de la transcriptasa inversa. Otra DNAP termófila, DNAPTth, es capaz de usar ARN como molde, pero sólo en presencia de Mn^{++}, por lo que se pronosticó que esta enzima no escindiría ARN en presencia de este catión. Por consiguiente, se incubó una molécula de ARN con un oligonucleótido experimental adecuado en presencia de DNAPTaq o DNAPTth, en tampón que contenía Mg^{++} o Mn^{++}. Como se esperaba, ambas enzimas escindieron el ARN en presencia de Mg^{++}. Sin embargo, DNAPTaq, pero no DNAPTth, degradaron el ARN en presencia de Mn^{++}. Puede concluirse que las actividades nucleasa 5' de muchas DNAP pueden contribuir con su capacidad para usar ARN como moldes.
Ejemplo 2 Generación de Nucleasas 5' a Partir de Polimerasas Termoestables de ADN
Se generaron polimerasas termoestables de ADN con actividad sintética reducida, una actividad que es una reacción lateral indeseable durante la escisión de ADN en el ensayo de detección de la invención, manteniendo aún la actividad nucleasa termoestable. El resultado es una polimerasa termoestable que escinde ADN de ácidos nucleicos con especificidad extrema.
Las polimerasas de ADN Tipo A de eubacterias del género Thermus comparten una extensa similitud de secuencia de proteína (90% en el dominio de polimerización, usando el método Lipman-Pearson en el programa informático de análisis de ADN de DNAStar, WI) y se comportan de manera similar tanto en el ensayo de polimerización como en el de nucleasa. Por consiguiente, se usaron los genes para la polimerasa de ADN de Thermus aquaticus (DNAPTaq) y Thermus flavus (DNAPTfI) como representativos de esta clase. Resultan también adecuados los genes de polimerasas de otros organismos eubacterianos, tales como Thermus thermophilus, Thermus sp., Thermotoga maritima, Thermosipho africanus y Bacillus stearothermophilus. Las polimerasas de ADN de estos organismos termófilos son capaces de sobrevivir y actuar a temperaturas elevadas, y por consiguiente pueden usarse en reacciones en las que se usa la temperatura como una selección frente a hibridación no específica de hebras de ácidos nucleicos.
Los sitios de restricción usados para mutagénesis por deleción, que se describe a continuación, se eligieron por conveniencia. En el gen de Thermus thermophilus están disponibles diferentes sitios situados con conveniencia similar y pueden usarse para generar construcciones similares con otros genes de polimerasas Tipo A de organismos relacionados.
A. Creación de Construcciones de Nucleasas 5' 1. Genes Modificados de DNAPTaq
La primera etapa fue colocar un gen modificado para la polimerasas de ADN Taq en un plásmido bajo el control de un promotor inducible. El gen modificado de polimerasa Taq se aisló de la siguiente manera: Se amplificó el gen de polimerasa de ADN Taq por reacción en cadena de polimerasa a partir de ADN genómico de Thermus aquaticus, cepa YT-1 (Lawyer y col., supra), usando como cebadores los oligonucleótidos descritos en SEC ID Nº 13-14. El fragmento de ADN resultante tiene una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción EcoRI en el extremo 5' de la secuencia codificadora y una secuencia de BgIII en el extremo 3'. La escisión con BgIII deja una proyección 5' o "extremo cohesivo" que es compatible con el extremo generado por BamHI. El ADN amplificado por PCR se digirió con EcoRI y BamHI. Se purificó el fragmento de 2512 pb que contenía la región codificadora para el gen de polimerasa con gel y a continuación se unió dentro de un plásmido que contenía un promotor inducible.
Se usó el vector pTTQ18, que contiene el promotor híbrido trp-lac (tac), [M. J. R. Stark, Gene 5:255 (1987)] y se muestra en la Figura 14. El promotor tac está bajo el control del represor lac de E. coli. La represión permite suprimir la síntesis del producto del gen una vez alcanzado el nivel deseado de crecimiento bacteriano, momento en el que se elimina la represión por adición de un inductor específico, isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Tal sistema permite la expresión de proteínas extrañas que pueden disminuir o evitar el crecimiento de transformantes.
Los promotores bacterianos, tales como tac, pueden no suprimirse adecuadamente cuando están presentes en un plásmido de copia múltiple. Si se coloca una proteína altamente tóxica bajo el control de tal promotor, la pequeña cantidad de expresión que se genera puede resultar perjudicial para la bacteria. Se usó también otra opción para reprimir la síntesis del producto de un gen clonado. Se usó el promotor no bacteriano, del bacteriófago T7, hallado en la serie del vector plasmídico pET-3 para expresar los genes clonados de polimerasa Taq mutante [Figura 15; Studier y Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113 (1986)]. Este promotor inicia la transcripción sólo por polimerasa de ARN T7. En una cepa adecuada, tal como BL21(DE3)pLYS, se transporta el gen para esta polimerasa de ADN en el genoma bacteriano bajo el control del operador lac. Este escenario tiene la ventaja de que la expresión del gen de copias múltiples (en el plásmido) es completamente dependiente de la expresión de polimerasa de ARN T7, que puede suprimirse fácilmente porque está presente en una copia única.
Para la unión dentro del vector pTTQ18 (Figura 14), se digirió el ADN producido por PCR que contenía la región codificadora de polimerasa Taq (mut Taq, clon 4B, SEC ID Nº 21) con EcoRI y BgIII y se unió este fragmento bajo condiciones convencionales de "extremo cohesivo" [Sambrook y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)] en los sitios de EcoRI y BamHI del vector plasmídico pTTQ18. La expresión de esta construcción da un producto de fusión traduccional en el que los dos primeros residuos de la proteína nativa (Met-Arg) están reemplazados por tres del vector (Met-Asn-Ser), pero el resto de la proteína natural no cambiará. La construcción se transformó dentro de la cepa JM109 de E. coli y se plaquearon los transformantes bajo condiciones de represión incompleta que no permiten el crecimiento de bacterias que expresan la proteína nativa. Estas condiciones de plaqueado permiten el aislamiento de genes que contienen mutaciones preexistentes, tales como aquellas que resultan de la falta de fidelidad de polimerasa Taq durante el procedimiento de amplificación.
Usando este protocolo de amplificación/selección, se aisló un clon (representado en la Figura 4B) que contenía un gen de polimerasa Taq mutado (mutTaq, clon 4B). El mutante se detectó en primer lugar por su fenotipo, en el que la actividad nucleasa 5' estable con la temperatura en un extracto bruto celular fue normal, pero la actividad de polimerización estaba prácticamente ausente (aproximadamente menos del 1% de la actividad de la polimerasa Taq de tipo salvaje).
El análisis de secuencia de ADN del gen recombinante mostró que tenía cambios en el dominio de polimerasa que resultaron en dos sustituciones de aminoácidos: un cambio de A por G en la posición de nucleótido 1394 causa un cambio de Glu por Gly en la posición del aminoácido 465 (enumerado según las secuencias de aminoácido y ácido nucleico naturales, SEC ID Nº 1 y 4) y otro cambio de A por G en la posición del nucleótido 2260 causa un cambio de Gln por Arg en la posición del aminoácido 754. Puesto que la mutación de Gln por Gly está en una posición no conservada y puesto que la mutación de Glu por Arg altera un aminoácido que está conservado en virtualmente todas las polimerasas Tipo A conocidas, esta última mutación es más probablemente la responsable de restringir la actividad de síntesis de esta proteína. La secuencia de nucleótidos para la construcción de la Figura 4B se presenta en SEC ID Nº 21.
Los derivados posteriores de las construcciones de DNAPTaq se generaron a partir del gen mutTaq, por consiguiente, todos llevan estas sustituciones de aminoácidos además de sus otras alteraciones, a menos que hayan delecionado estas regiones particulares. Estos sitios mutados se indican por cajas negras en estas localizaciones en los diagramas en la Figura 4. Todas las construcciones excepto los genes mostrados en las Figuras 4E, F y G se generaron en el vector pTTQ18.
El vector de clonación usado por los genes en las Figuras 4E y F fue de la serie pET-3 disponible comercialmente, descrito anteriormente. Aunque esta serie de vectores sólo tiene un sitio BamHI para clonar secuencia abajo del promotor T7, la serie contiene variantes que permiten clonar en cualquiera de los tres marcos de lectura. Para el clonado del producto de PCR descrito anteriormente, se usó la variante llamada pET-3c (Figura 15). El vector se digirió con BamHI, se desfosforiló con fosfatasa intestinal de ternero, y se llenaron los extremos cohesivos usando el fragmento Klenow de DNAPEc1 y dNTP. Se liberó el gen para la DNAP Taq mutante que se muestra en la Figura 4B (mut Taq, clon 4B) de pTTQ18 por digestión con EcoRI y SaII, y se llenaron los "extremos cohesivos" como se hizo con el vector. Se unió el fragmento al vector bajo condiciones convencionales de extremos romos (Sambrook y col., Molecular Cloning, supra), se transformó la construcción en la cepa BL21(DE3)pLYS de E. coli, y se seleccionaron los aislados para identificar aquellos que estaban unidos con el gen en orientación adecuada con relación al promotor. Esta construcción da otro producto de fusión traduccional, en el que los primeros dos aminoácidos de DNAPTaq (Met-Arg) están reemplazados por 13 del vector más dos del cebador de PCR (Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly-Arg-Ile-Asn-Ser) (SEC ID Nº 29).
El objetivo fue generar enzimas que carecieran de capacidad para sintetizar ADN, pero manteniendo la capacidad para escindir ácidos nucleicos con una actividad nucleasa 5'. El hecho de sintetizar ADN con moldes, con cebadores, es realmente una serie de acontecimientos, por lo que es posible deshabilitar la síntesis de ADN interrumpiendo un acontecimiento sin afectar los otros. Estas etapas incluyen, pero no se limitan a, reconocimiento y unión de cebadores, unión de dNTP y catálisis del enlace fosfodiéster internucleótidos. Para estas funciones se unieron algunos de los aminoácidos en el dominio de polimerización de DNAPEc1, pero los mecanismos exactos están mal definidos hasta el momento.
Una manera de destruir la capacidad de polimerización de una polimerasa de ADN es delecionar todo o parte del segmento del gen que codifica ese dominio para la proteína, o de otra manera convertir el gen en incapaz de generar un dominio de polimerización completo. Las enzimas mutantes individuales pueden diferir una de la otra en estabilidad y solubilidad dentro y fuera de las células. Por ejemplo, en contraste con el dominio de nucleasa 5' de DNAPEc1, que puede liberarse del dominio de forma activa por medio de proteolisis suave [Setlow y Kornberg, J. Biol. Chem. 247:232 (1972)], el dominio de nucleasa de Thermus, cuando se trata de manera similar, se vuelve menos soluble y frecuentemente se pierde la actividad de escisión.
Usando el gen mutante mostrado en la Figura 4B como material de partida, se crearon varias construcciones de deleción. Todas las tecnologías de clonación fueron convencionales (Sambrook y col., supra) y se resumen brevemente a continuación:
Figura 4C: La construcción mutTaq se digirió con PstI, que corta una vez dentro de la región de codificación de la polimerasa, según lo indicado, y corta inmediatamente secuencia abajo del gen en el sitio de clonación múltiple del vector. Tras liberar el fragmento entre estos dos sitios, se unió el vector nuevamente, creando una deleción de 894 nucleótidos, y trayendo hacia el marco un codón de parada 40 nucleótidos secuencia abajo del punto de unión. La secuencia de nucleótidos de esta nucleasa 5' (clon 4C) se presenta SEC ID Nº 9.
Figura 4D: La construcción mutTaq se digirió con NheI, que corta una vez en el gen en la posición 2047. Los extremos proyectados 5' de cuatro nucleótidos se completaron, como se describió anteriormente, y se unieron nuevamente los extremos romos. La inserción de cuatro nucleótidos resultantes cambia el marco de lectura y causa la terminación de la traducción de diez aminoácidos secuencia abajo de la mutación. La secuencia de nucleótidos de esta nucleasa 5' (clon 4D) se presenta en SEC ID Nº 10.
Figura 4E: El gene de mutTaq completo se cortó de pTTQ18 usando EcoRI y SalI y se clonó en pET-3c, como se describió anteriormente. Se digirió este clon con BstXI y XcmI, en sitios únicos situados según se muestra en la Figura 4E. Se trató el ADN con el fragmento Klenow de DNAPEc1 y dNTP, lo que dio lugar a proyecciones 3' de ambos sitios cortadas para dar extremos romos. Estos extremos romos se unieron juntos, dando como resultado una deleción fuera del marco de 1540 nucleótidos. Se produce un codón de terminación dentro del marco 18 tripletes más allá del sitio de unión. La secuencia de nucleótidos de esta nucleasa 5' (clon 4E) se presenta en SEC ID Nº 11, con la secuencia líder adecuada presentada en SEC ID Nº 30. También se la denomina Cleavase^{TM} BX.
Figura 4F: El gen de mutTaq completo se cortó de pTTQ18 usando EcoRI y SalI y se clonó en pET-3c, como se describió anteriormente. Se digirió este clon con BstXI y el amHI, en los sitios únicos situados según se muestra en el diagrama. Se trató el ADN con el fragmento Klenow de DNAPEc1 y dNTP, lo que dio lugar a proyecciones 3' del sitio de BstX I cortadas para dar extremos romos, mientras se completó la proyección 5' del sitio de Bam HI para generar un extremo romo. Estos extremos romos se unieron juntos, dando por resultado una deleción dentro del marco de 903 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos de la nucleasa 5' (clon 4F) se presenta en SEC ID Nº 12. También se la denomina Cleavase^{TM} BB.
Figura 4G: Esta polimerasa es una variante de la mostrada en la Figura 4E. Se clonó en el vector plasmídico pET-21 (Novagen). El promotor no bacteriano del bacteriófago T7, que se encuentra en este vector, inicia la transcripción solamente por la polimerasa de ARN T7. Véase Studier y Moffatt, supra. En una cepa adecuada, tal como (DES)pLYS, se transporta el gen para esta polimerasa de ARN en el genoma bacteriano bajo el control del operador lac. Este escenario tiene la ventaja de que la expresión del gen de copias múltiples (en el plásmido) es totalmente dependiente de la expresión de la polimerasa de ARN T7, que se suprime fácilmente porque está presente en una copia única. Puesto que la expresión de estos genes mutantes está bajo de este promotor rigurosamente controlado, los problemas potenciales de toxicidad para las células huésped de las proteínas expresadas no una preocupación.
El vector pET-21 tiene también una "etiqueta *His*", una extensión de seis residuos histidina consecutivos que se agregan en el extremo carboxi terminal de las proteínas expresadas. Las proteínas resultantes pueden purificarse posteriormente en una sola etapa por cromatografía de quelación por metales, usando una resina de columna disponible comercialmente (Novagen) con iones Ni^{++} inmovilizados. Las columnas de 2,5 ml son reutilizables, y pueden unir hasta 20 mg de la proteína diana bajo condiciones nativa o de desnaturalización (guanidina*HCl o urea).
Las células (DES)pLYS de E. coli se transforman con las construcciones descritas anteriormente usando técnicas de transformación convencionales, y se usan para inocular un medio de crecimiento convencional (por ejemplo, caldo de cultivo de Luria-Bertani). La producción de polimerasa de ARN T7 se induce durante la fase logarítmica de crecimiento por adición de IPTG y se incuba durante otras 12 a 17 horas. Se retiran alícuotas de cultivo antes y después de la inducción y se examinan las proteínas por SDS-PAGE. La tinción con Azul de Coomassie permite la visualización de las proteínas extrañas si explican aproximadamente el 3-5% de la proteína celular y no migran conjuntamente con cualquiera de las bandas principales de proteínas. Las proteínas que migran conjuntamente con las proteínas principales del huésped deben expresarse como más del 10% de la proteína total observable en esta etapa del análisis.
Algunas proteínas mutantes son secuestradas por las células dentro de los cuerpos de inclusión. Estos son gránulos que se forman en el citoplasma cuando se hacen que las bacterias expresen altos niveles de una proteína extraña, y pueden purificarse desde un lisado bruto, y analizarse por SDS-PAGE para determinar su contenido en proteínas. Si la proteína clonada se encuentra en los cuerpos de inclusión, debe liberarse para ensayar las actividades de escisión y de polimerasa. Diferentes procedimientos de solubilización pueden ser adecuados para diferentes proteínas, y se conoce una diversidad de procedimientos. Véase por ejemplo, Builder y Ogez, Patente de EEUU Nº 4.511.502 (1985); Olson, Patente de EEUU Nº 4.518.526 (1985); Olson y Pai, Patente de EEUU Nº 4.511.503 (1985); Jones y col., Patente de EEUU Nº 4.512.922 (1985).
La proteína solubilizada se purifica a continuación en la columna de Ni^{++} como se describió anteriormente, siguiendo las instrucciones de los fabricantes (Novagen). Las proteínas lavadas se eluyen de la columna por una combinación de competidor de imidazol (1 M) y sal elevada (NaCl 0,5 M), y se dializa para intercambiar el tampón y permitir que las proteínas desnaturalizadas vuelvan a plegarse. Las recuperaciones típicas dan como resultado aproximadamente 20 \mug de la proteína específica por ml de cultivo de partida. Se denomina Cleavase^{TM} BM al mutante de DNAP y la secuencia se presenta en SEC ID Nº 31.
2. Gen de DNAPTf1 Modificado
Se aisló el gen de polimerasa de ADN de Thermus flavus de la cepa AT-62 de "T. flavus" obtenida en la American Type Tissue Collection (ATCC 33923). Esta cepa tiene un mapa de restricción diferente del de la cepa de T. flavus usada para generar la secuencia publicada por Akhmetzjanov y Vakhitov, supra. La secuencia publicada se presenta como SEC ID Nº 2. No se ha publicado ningún dato de la secuencia para el gen de la polimerasa de ADN de la cepa AT-62 de T. flavus.
Se amplificó el ADN genómico de T. flavus usando los mismos cebadores usados para amplificar el gen de polimerasa de ADN de T. aquaticus (SEC ID Nº 13-14). Se digirió el fragmento de PCR de aproximadamente 2500 pares de bases con EcoRI y BamHI. Los extremos proyectados se hicieron romos con el fragmento Klenow de DNAPEc1 y dNTP. Se unió el fragmento resultante de aproximadamente 1800 pares de bases que contenía la región codificadora para el extremo N terminal en pET-3c, como se describió anteriormente. Esta construcción, clon 5B, está representada en la Figura 5B. El gen de la polimerasa de ADN de T. flavus de tipo salvaje está representado en la Figura 5A. El clon 5B tiene los mismos aminoácidos líder que los clones 4E y F de DNAPTaq que se clonaron en pET-3c; no se sabe exactamente donde se produce la terminación de la traducción, pero el vector tiene una fuerte señal de terminación de la transcripción inmediatamente secuencia abajo del sitio de clonación.
B. Crecimiento e Inducción de Células Transformadas
Se transformaron células bacterianas con las construcciones descritas anteriormente usando técnicas de transformación convencionales y se usaron para inocular 2 ml de medio de cultivo convencional (por ejemplo, caldo de cultivo de Luria-Bertani). Se incubaron los cultivos resultantes de manera adecuada para las cepas usadas particulares, y se indujeron de ser necesario para un sistema de expresión particular. Para todas las construcciones representadas en las Figuras 4 y 5, se dejaron crecer los cultivos hasta una densidad óptica (a 600 nm de longitud de onda) de D.O. 0,5.
Para inducir la expresión de los genes clonados, se llevaron los cultivos hasta una concentración final de IPTG 0,4 mM y continuaron las incubaciones durante 12 a 17 horas. Se retiraron alícuotas de 50 \mul de cada cultivo antes y después de la inducción y se combinaron con 20 \mul de un tampón de carga en gel convencional para la electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE). La posterior tinción con Azul de Coomassie (Sambrook y col., supra) permite la visualización de las proteínas extrañas si explican aproximadamente el 3-5% de la proteína celular y no migran conjuntamente con cualquiera de las bandas de proteínas principales de E. coli. Las proteínas que migran conjuntamente con una proteína principal del huésped deben expresarse como más del 10% de la proteína total observable en esta etapa del análisis.
C. Lisis por Calor y Fraccionamiento
Las proteínas termoestables expresadas, es decir, las nucleasas 5', se aislaron calentando extractos brutos de células bacterianas para causar la desnaturalización y precipitación de las proteínas menos estables de E. coli. Las proteínas precipitadas de E. coli se retiraron a continuación, junto con otros sedimentos celulares, por centrifugación. Se sedimentaron 1,7 ml de cultivo microcentrifugación a 12.000 hasta 14.000 rpm durante 30 a 60 segundos. Tras eliminar el sobrenadante, se resuspendieron las células en 400 \mul de tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,9, dextrosa 50 mM, EDTA 1 mM), se centrifugó nuevamente, a continuación se resuspendió en 80 \mul de tampón A con lisozima 4 mg/ml. Se incubaron las células a temperatura ambiente durante 15 minutos, posteriormente se combinaron con 80 \mul de tampón B (Tris-HCl 10 mM, pH 7,9, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, Tween-20 al 0,5%, Nonidet-P40 al 0,5%).
Se incubó esta mezcla a 75ºC durante 1 hora para desnaturalizar y precipitar las proteínas del huésped. Se centrifugó este extracto celular a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC, y se transfirió el sobrenadante en un tubo nuevo. Se usó una alícuota de 0,5 a 1 \mul de este sobrenadante directamente en cada reacción de prueba, y se determinó el contenido de proteínas del extracto sometiendo 7 \mul a análisis por electroforesis, como anteriormente. La polimerasa de ADN Taq recombinante nativa [Englke, Anal. Biochem. 191:396 (1990)], y la proteína de doble mutación puntual mostrada en la Figura 4B son solubles y activas en este punto.
La proteína extraña puede no detectarse tras los tratamientos por calor debido al secuestro de la proteína extraña por las células dentro de los cuerpos de inclusión. Estos son gránulos que se forman en el citoplasma cuando se hace que las bacterias expresen altos niveles de una proteína extraña, y pueden purificarse desde un lisado bruto, y analizarse por SDS PAGE para determinar su contenido en proteínas. En la bibliografía se han descrito muchos procedimientos, y a continuación se describe un enfoque.
D. Aislamiento y Solubilización de Cuerpos de Inclusión
Se dejó crecer un pequeño cultivo y se indujo como se describió anteriormente. Se sedimentó una alícuota de 1,7 ml por breve centrifugación, y se resuspendieron las células bacterianas en 100 \mul de tampón de Lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM). Se añadieron 2,5 \mul de PMSF 20 mM para una concentración final 0,5 mM, y se añadió lisozima a una concentración de 1,0 mg/ml. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, se añadió ácido desoxicólico hasta 1 mg/ml (1 \mul de una solución de 100 mg/ml), y se incubó la mezcla otra vez a 37ºC durante aproximadamente 15 minutos o hasta que se tornara viscosa. Se añadió DNAsa I a 10 \mug/ml y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos o hasta que dejara de ser viscosa.
De esta mezcla se recogieron los cuerpos de inclusión por centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC, y se descartó el sobrenadante. Se resuspendió el sedimento en 100 \mul de tampón de Lisis con EDTA 10 mM (pH 8,0) y Triton X-100 al 0,5%. Tras 5 minutos a temperatura ambiente, se sedimentaron los cuerpos de inclusión como anteriormente, y se conservó el sobrenadante para posterior análisis. Se resuspendieron los cuerpos de inclusión en 50 \mul de agua destilada, y se combinaron 5 \mul el tampón de carga en gel de SDS (que disuelve los cuerpos de inclusión) y se analizó por electroforesis, junto con una alícuota del sobrenadante.
Si la proteína clonada se encuentra en los cuerpos de inclusión, puede liberarse para ensayar las actividades de escisión y de polimerasa y el procedimiento de solubilización debe ser compatible con la actividad particular. Diferentes procedimientos de solubilización pueden ser adecuados para diferentes proteínas, y una diversidad de procedimientos se discuten en Molecular Cloning (Sambrook y col., supra). La siguiente es una adaptación usada para varios aislamientos.
Se sedimentaron 20 \mul de la suspensión de cuerpos de inclusión-agua por centrifugación a 14.000 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente, y se descartó el sobrenadante. Para lavar más los cuerpos de inclusión, se resuspendió el sedimento en 20 \mul de tampón de lisis con urea 2M, y se incubó a temperatura ambiente durante una hora. A continuación se resuspendieron los cuerpos de inclusión lavados en 2 \mul de tampón de lisis con urea 8M; la solución se aclaró visiblemente a medida que se disolvieron los cuerpos de inclusión. Se retiró el sedimento sin disolver por centrifugación a 14.000 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente, y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo.
Para reducir la concentración de urea, se diluyó el extracto en KH_{2}PO_{4}. Se preparó un tubo nuevo que contenía 180 \mul de KH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 9,5, EDTA 1 mM y NaCl 50 mM. Se añadió una alícuota del extracto de 2 \mul y se agitó mediante vórtex brevemente para mezclar. Esta etapa se repitió hasta que se añadió todo el extracto para un total de 10 adiciones. Se dejó reposar la mezcla a la temperatura ambiente durante 15 minutos, tiempo en el cual frecuentemente se forma alguna precipitación. Se eliminaron los precipitados por centrifugación a 14.000 rpm, durante 15 minutos a temperatura ambiente, y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. A los 200 \mul de proteína en la solución de KH_{2}PO_{4}, se le añadieron 140-200 \mul de (NH_{2})SO_{4} saturado, de manera que la mezcla resultante fue (NH_{4})_{2}SO_{4} saturado aproximadamente al 41% hasta 50%. Se enfrió la mezcla sobre hielo durante 30 minutos para permitir que la proteína precipite, y a continuación se recogió la proteína por centrifugación a 14.000 rpm, durante 4 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante, y se disolvió el sedimento en 20 \mul de Tampón C (HEPES 20 mM, pH 7,9, EDTA 1 mM, PMSF al 0,5%, KCl 25 mM y Tween-20 y Nonidet P 40 al 0,5% cada uno). Se centrifugó la solución proteica una vez más durante 4 minutos para sedimentar el material insoluble, y se retiró el sobrenadante transfiriéndolo a un tubo nuevo. El contenido en proteínas de los extractos preparados de esta manera se visualizó resolviendo 1-4 \mul por SDS-PAGE; se probaron 0,5 a 1 \mul del extracto en los ensayos de escisión y de polimerización según lo descrito.
E. Análisis de Proteínas para Presencia de Actividad Nucleasa y Sintética
Las nucleasas 5' descritas anteriormente y mostradas en las Figuras 4 y 5 se analizaron por los siguientes procedimientos.
1. Ensayo de Nucleasa Específico de Estructura
Se probó una polimerasa candidato modificada para actividad 5' examinando su capacidad para catalizar escisiones específicas de estructura. Por el término "estructura de escisión" como se usa en este documento, se entiende una estructura de ácido nucleico que es un sustrato para escisión por la actividad nucleasa 5' de una DNAP.
Se expone una polimerasa a complejos de prueba que tienen las estructuras que se muestran en la Figura 16. Las pruebas para actividad nucleasa 5' incluyen tres reacciones: 1) se realiza una escisión dirigida por cebadores (Figura 16B) porque es relativamente insensible a variaciones en la concentración de sal de la reacción y puede, por consiguiente, realizarse en cualquier condición de soluto que requiera la enzima para su actividad; estas son generalmente las mismas condiciones de preferencia para polimerasas sin modificar; 2) se realiza una escisión dirigida por cebadores similar en un tampón que permite la escisión independiente del cebador, es decir, un tampón bajo en sal, para demostrar que la enzima es viable bajo estas condiciones; y 3) se realiza una escisión independiente de cebadores (Figura 16A) en el mismo tampón bajo en sal.
Se realiza la doble hélice bifurcada entre una hebra de sustrato y una hebra molde como se muestra en la Figura 16. Por el término "hebra de sustrato" como se usa en este documento, se entiende a aquella hebra de ácido nucleico en la que se produce la escisión mediada por la actividad nucleasa 5'. La hebra de sustrato se representa siempre como la hebra superior en el complejo bifurcado que sirve como un sustrato para escisión de nucleasa 5' (Figura 16). Por el término "hebra molde" como se usa en este documento, se entiende a la hebra de ácido nucleico que es al menos parcialmente complementaria con la hebra de sustrato y que se alinea con la hebra de sustrato para formar la estructura de escisión. La hebra molde se representa siempre como la hebra inferior de la estructura de escisión bifurcada (Figura 16). Si se añade un cebador (un oligonucleótido corto de 19 hasta 30 nucleótidos de longitud) al complejo, como cuando se quiere probar la escisión dependiente de cebador, se diseña para alinear con el brazo 3' de la hebra molde (Figura 16B). Tal cebador se extenderá a lo largo del molde si la polimerasa usada en la reacción tiene actividad sintética.
La estructura de escisión puede crearse como una molécula de horquilla única, con el extremo 3' en la diana y el extremo 5' del oligonucleótido experimental unido como un bucle como se muestra en la Figura 16E. También se necesita un oligonucleótido cebador complementario con el brazo 3' para estas pruebas para probar la sensibilidad de la enzima a la presencia del cebador.
Los ácidos nucleicos a usar para formar estructuras de escisión de prueba pueden sintetizarse químicamente, o pueden generarse por técnicas de ADN recombinante convencionales. Por el último procedimiento, la porción de horquilla de la molécula puede crearse insertando en un vector de clonación copias por duplicado de un segmento corto de ADN, adyacentes una a la otra pero con orientación opuesta. El fragmento de doble hebra que abarca esta repetición invertida, y que incluye suficiente secuencia lateral para dar brazos 5' y 3' no apareados cortos (aproximadamente 20 nucleótidos), puede posteriormente liberarse del vector por medio de digestión con enzimas de restricción, o por PCR realizada con una enzima carente de una exonucleasa 5' (por ejemplo, el fragmente Stoffel de la polimerasa de ADN Amplitaq^{TM}, polimerasa de ADN Vent^{TM}).
El ADN de prueba puede marcarse en cualquier extremo, o internamente, con un radioisótopo, o con una etiqueta no isotópica. Si el ADN de horquilla es una hebra única sintética o una doble hebra clonada, el ADN se calienta previo a su uso para fundir todas las dobles hélices. Cuando se enfría sobre hielo, se forma la estructura representada en la Figura 16E, y es estable durante suficiente tiempo para llevar a cabo estos ensayos.
Para la prueba de escisión dirigida por cebadores (Reacción 1); se coloca una cantidad detectable de la molécula de prueba (típicamente 1-100 fmol de molécula de horquilla marcada con ^{32}P) y un exceso molar de 10 hasta 100 veces del cebador en un tampón compatible con la enzima de prueba. Para la Reacción 2, en la que la escisión dirigida por cebadores se realiza bajo condiciones que permiten la escisión independiente del cebador, se colocan las mismas cantidades de moléculas en una solución que es la misma que el tampón usado en la Reacción 1 observando el pH, estabilizantes de enzimas (por ejemplo, seroalbúmina de bovino, detergentes noiónicos, gelatina) y agentes reductores (por ejemplo, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol) pero que reemplaza cualquier sal de catión monovalente con KCl 20 mM; se demostró que KCl 20 mM es óptimo para la escisión independiente del cebador. Los tampones para enzimas, tales como DNAPEc1, que usualmente actúan en ausencia de sal no se suplementan para lograr esta concentración. Para probar la escisión independiente del cebador (Reacción 3) se combinan las mismas cantidades de molécula de prueba, pero no de cebador, bajo las mismas condiciones del tampón usadas en la Reacción 2.
Posteriormente se exponen las tres reacciones a suficiente cantidad de la enzima para que la proporción molar de enzima con respecto al complejo de prueba sea aproximadamente 1:1. Se incuban las reacciones a un intervalo de temperaturas hasta, pero no excediendo, la temperatura permitida por la estabilidad de cada enzima o la estabilidad del complejo, la que resulte inferior, hasta 80ºC para enzimas de termófilos, durante un tiempo suficiente para permitir la escisión (10 hasta 60 minutos). Los productos de las Reacciones 1, 2 y 3 se resuelven por desnaturalización por electroforesis en gel de poliacrilamida, y se visualizan por autorradiografía o por un procedimiento comparable adecuado para el sistema de marcado usado. Los otros sistemas de marcado incluyen detección por quimioluminiscencia, plata u otras tinciones, manchado y sondeo y similares. La presencia de productos de escisión se indica por la presencia de moléculas que migran a un peso molecular inferior a como lo hace la estructura de prueba no escindida. Estos productos de escisión indican que la polimerasa candidato tiene actividad nucleasa 5' específica de estructura.
Para determinar si la polimerasa de ADN modificada tiene sustancialmente la misma actividad nucleasa 5' que la polimerasa de ADN nativa, se comparan los resultados de las pruebas descritas anteriormente con los resultados obtenidos de estas pruebas realizadas con la polimerasa de ADN nativa. Por "sustancialmente la misma actividad nucleasa 5'" se entiende que la polimerasa modificada y la polimerasa nativa escinden las moléculas de prueba de la misma manera. No es necesario que la polimerasa modificada escinda a la misma velocidad que la polimerasa de ADN nativa.
Algunas enzimas o preparaciones de enzimas pueden tener otras actividades asociadas o contaminantes que pueden ser funcionales bajo las condiciones de escisión descritas anteriormente y que pueden interferir con la detección de nucleasa 5'. Las condiciones de reacción pueden modificarse en consideración de estas otras actividades, para evitar la destrucción del sustrato, u otro enmascaramiento de la escisión de nucleasa 5' y sus productos. Por ejemplo, la polimerasa de ADN I de E. coli (Pol I), además de sus actividades de polimerasa y nucleasa 5' tiene una actividad exonucleasa 3' que puede degradad ADN en una dirección 3' hacia 5'. Por consiguiente, cuando la molécula de la Figura 16E se expone a esta polimerasa bajo las condiciones descritas anteriormente, la exonucleasa 3' rápidamente elimina el brazo 3', destruyendo la estructura bifurcada necesaria para un sustrato para la escisión de exonucleasa 5' y no se detecta la escisión. La capacidad real de Pol I para escindir la estructura puede revelarse si se inhibe la exonucleasa 3' por medio de un cambio de condiciones (por ejemplo, pH), mutación, o por adición de un competidor para la actividad. La adición de 500 pmol de un oligonucleótido competidor de hebra única, no relacionado con la estructura de la Figura 16E, para la reacción de escisión con Pol I inhibe eficazmente la digestión del brazo 3' de la estructura de la Figura 16E sin interferir con la liberación del brazo 5' por exonucleasa 5'. La concentración del competidor no es crítica, pero podría ser suficientemente elevada para ocupar a la exonucleasa 3' durante el tiempo de la reacción.
Puede causarse una destrucción similar de la molécula de prueba por contaminantes en la preparación de polimerasa candidato. Pueden realizarse varias series de reacciones de nucleasa específicas de estructura para determinar la pureza de la nucleasa candidato y para encontrar la ventana entre la sobre y subexposición de la molécula de prueba para la preparación de polimerasa a investigar.
Las polimerasas modificadas descritas anteriormente se probaron para actividad nucleasa 5' de la siguiente manera: Se realizó la Reacción 1 en un tampón de Tris-Cl 10 mM, pH 8,5 a 20ºC, MgCl_{2} 1,5 mM y KCl 50 mM y en la Reacción 2 la concentración de KCl se redujo a 20 mM. En las Reacciones 1 y 2, se combinaron 10 fmol de la molécula del sustrato de prueba mostrada en la Figura 16E con 1 pmol del cebador indicado y 0,5 a 1,0 \mul del extracto que contenía la polimerasa modificada (preparada como se describió anteriormente). A continuación se incubó esta mezcla durante 10 minutos a 55ºC. Para todas las polimerasas mutantes probadas estas condiciones fueron suficientes para dar escisión completa. Cuando la molécula mostrada en la Figura 16E se marcó en el extremo 5', el fragmento 5' liberado, de 25 nucleótidos de longitud, se resolvió convenientemente en un gel de poliacrilamida al 20% (entrecruzado 19:1) con urea 7M en un tampón que contenía Tris-borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los clones 4C-F y 5B exhibieron escisión específica de estructura comparable con la de la polimerasa de ADN no modificada. Además, los clones 4E, 4F y 4G tienen la capacidad añadida para escindir ADN en ausencia de un brazo 3' como se discutió anteriormente. Las reacciones de escisión representativas se muestran en la Figura 17.
Para las reacciones mostradas en la Figura 17, se examinó la capacidad de los clones de polimerasa 4E (mutante de Taq) y 5B (mutante de Tfl) para escindir la molécula sustrato de horquilla mostrada en la Figura 16E. La molécula sustrato se marcó en extremo 5' terminal con ^{32}P. Se mezclaron juntos 10 fmol de ADN sustrato desnaturalizado por calor, marcado en el extremo y 0,5 unidades de DNAPTaq (carril 1) o 0,5 \mul del extracto de 4e o 5b (Figura 17, carriles 2-7, el extracto se preparó como se describió anteriormente) en un tampón que contenía Tris-Cl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM y MgCl_{2} 1,5 mM. El volumen final de reacción fue de 10 \mul. Las reacciones que se muestran en los carriles 4 y 7 contienen además cada dNTP 50 \muM. Las reacciones que se muestran en los carriles 3, 4, 6 y 7 contienen 0,2 \muM del oligonucleótido cebador (complementario con el brazo 3' del sustrato y mostrado en la Figura 16E). Las reacciones se incubaron a 55ºC durante 4 minutos. Las reacciones se detuvieron por la adición de 8 \mul de formamida al 95% que contenía EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05% por 10 \mul de volumen de reacción. A continuación se aplicaron las muestras a los geles desnaturalizadores de acrilamida al 12%. Tras la electroforesis, se realizaron autorradiografías de los geles. La Figura 17 muestra que los clones 4E y 5B exhiben actividad de escisión similar a la de la DNAPTaq nativa. Nótese que se produce algo de escisión en estas reacciones en ausencia del cebador. Cuando se usan estructuras de horquilla largas, tal como que se usó aquí (Figura 16E), en las reacciones de escisión realizadas en tampones que contienen KCl 50 mM se observa un bajo nivel de escisión independiente del cebador. Las concentraciones más altas de KCl suprimen, pero no eliminan, esta escisión independiente del cebador bajo estas condiciones.
2. Análisis para Actividad Sintética
La capacidad de la enzima modificada o de los fragmentos proteolíticos se ensaya añadiendo la enzima modificada a un sistema de ensayo en el que se alinea un cebador con un molde y se cataliza la síntesis de ADN por medio de la enzima adicionada. Muchas técnicas convencionales de laboratorio usan tal ensayo. Por ejemplo, la traducción de mellas y la secuenciación enzimática implican la extensión de un cebador a lo largo de un molde de ADN por una molécula de polimerasa.
En un análisis de preferencia para determinar la actividad sintética de una enzima modificada se alinea un cebador de oligonucleótidos con un molde de ADN de hebra única, por ejemplo, ADN del bacteriófago M13, y se incuba el cebador/doble hélice del molde en presencia de la polimerasa modificada en cuestión, los trifosfatos de desoxinucleósidos (dNTP) y el tampón y las sales adecuadas para la enzima sin modificar o nativa. La detección de extensión del cebador (desnaturalizando por electroforesis en gel) o la incorporación de dNTP (por precipitación ácida o cromatografía) es indicativa de una polimerasa activa. De preferencia se incluye un marcador, isotópico o no isotópico, en el cebador o como un dNTP para facilitar la detección de los productos de polimerización. Se cuantifica la actividad sintética como la cantidad de nucleótido libre incorporada en la cadena creciente de ADN y se expresa como la cantidad incorporada por unidad de tiempo bajo condiciones de reacción específicas.
En la Figura 18 se muestran resultados representativos de un ensayo para actividad sintética. Se probó la actividad sintética de los clones 4B-F mutantes de DNAPTaq de la siguiente manera: Se realizó una mezcla principal del siguiente tampón: tampón de PCR 1,2X (el tampón de PCR 1X contiene KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tris-Cl 10 mM, pH 8,5 y Tween 20 y Nonidet P40 al 0,05% cada uno), dGTP, dATP y dTTP 50 \muM, dCTP 5 \muM y \alpha-^{32}P-dCTP 0,125 \muM a 600 Ci/mmol. Previo a ajustar esta mezcla a su volumen final, se dividió en dos alícuotas iguales. Una recibió agua destilada hasta un volumen de 50 \mul para dar las concentraciones anteriores. La otra recibió 5 \mug de ADN de hebra única de M13mp18 (aproximadamente 2,5 pmol o concentración final 0,05 \muM) y 250 pmol de cebador de secuenciación de M13 (concentración final 5 \muM) y agua destilada hasta un volumen final de 50 \mul. Se calentó cada cóctel a 75ºC durante 5 minutos y a continuación se enfrió hasta temperatura ambiente. Esto permitió la alineación de los cebadores con el ADN en las mezclas que contenían ADN.
Para cada análisis, se combinaron 4 \mul del cóctel con el ADN con 1 \mul de la polimerasa mutante, preparada según se describió, o 1 unidad de DNAPTaq (Perkin Elmer) en 1 \mul de dH_{2}O. Se realizó un control "sin ADN" en presencia de la DNAPTaq (Figura 18, carril 1), y se realizó un control "sin enzima" usando agua en lugar de la enzima (carril 2). Se mezcló cada reacción, posteriormente se incubó a temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC) durante 5 minutos, a continuación a 55ºC durante 2 minutos, posteriormente a 72ºC durante 2 minutos. Esta etapa de incubación se llevó a cabo para detectar la polimerización en cualquiera de los mutantes que pudiera tener temperaturas óptimas inferiores a 72ºC. Tras la incubación final, se centrifugaron brevemente los tubos para recoger cualquier condensación y se colocaron sobre hielo. Se transfirió un \mul de cada reacción a un origen 1,5 centímetros desde el borde inferior de una placa de cromatografía en capa fina de polietilenimina celulosa (PEI) y se dejó secar. Se realizó la cromatografía en NaH_{2}PO_{4} 0,75M, pH 3,5, hasta que el frente del tampón migró aproximadamente 9 centímetros desde el origen. Se secó la placa, se envolvió con material plástico, se marcó con tinta luminiscente, y se expuso a una película de radiografía. La incorporación se detectó como cuentas pegadas en el sitio original de la transferencia de las manchas, mientras que los nucleótidos no incorporados fueron transportados por la solución salina desde el origen.
La comparación de las localizaciones de las cuentas con los dos carriles de control confirmó la carencia de actividad de polimerización en las preparaciones de mutantes. Entre los clones de la DNAPTaq modificada, sólo el clon 4B conserva alguna actividad sintética residual como se muestra en la Figura 18.
Ejemplo 3 Las Nucleasas 5' Derivadas de Polimerasas Termoestables de ADN Pueden Escindir Estructuras Cortas de Horquilla con Especificidad
Se examinó la capacidad de las nucleasas 5' para escindir estructuras de horquilla para generar una estructura de horquilla escindida adecuada como molécula de detección. La estructura y la secuencia de la molécula de horquilla de prueba se muestra en la Figura 19A (SEC ID Nº 15). El oligonucleótido (marcado "cebador" en la Figura 19A, SEC ID Nº 22) se muestra alineado con su secuencia complementaria en el brazo 3' de la molécula de horquilla de prueba. La molécula de horquilla de prueba se marcó en un solo extremo con ^{32}P usando un cebador del promotor T7 marcado en una reacción en cadena de polimerasa. El marcador está presente en el brazo 5' de la molécula de horquilla de prueba y está representada por la estrella en la Figura 19A.
La reacción de escisión se realizó añadiendo 10 fmol de la molécula de horquilla de prueba desnaturalizada por calor, marcada en el extremo, el oligonucleótido cebador 0,2 mM (complementario con el brazo 3' de la horquilla), cada dNTP 50 \muM y 0,5 unidades de DNAPTaq (Perkin Elmer) o 0,5 \mul de extracto que contenía una nucleasa 5' (preparada como se describió anteriormente) en un volumen total de 10 \mul en un tampón que contenía Tris-Cl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM y MgCl_{2} 1,5 mM. Las reacciones mostradas en los carriles 3, 5 y 7 se realizaron en ausencia de dNTP.
Las reacciones se incubaron a 55ºC durante 4 minutos. Las reacciones se detuvieron a 55ºC por la adición de 8 \mul de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorante marcador al 0,05% por 10 \mul de volumen de reacción. Las muestras no se calentaron previo a cargarlas sobre los geles de poliacrilamida para desnaturalizar (poliacrilamida al 10%, entrecruzamiento 19:1, urea 7M, Tris-borato 89 mM, pH 8,3, EDTA 2,8 mM). Las muestras no se calentaron para permitir la resolución de moléculas de horquilla no escindidas de hebra única y que formaron nuevamente doble hélice.
La Figura 19B muestra que las polimerasas alteradas que carecen de cualquier actividad sintética detectable escinden una estructura de horquilla cuando un oligonucleótido está alineado con brazo 3' de hebra única de la horquilla para dar una sola especie de producto escindido (Figura 19B, carriles 3 y 4). Las nucleasas 5', tales como el clon 4D, mostrada en los carriles 3 y 4, producen un solo producto escindido incluso en presencia de dNTP. Las nucleasas 5' que conservan una cantidad residual de actividad sintética (menos del 1% de la actividad del tipo salvaje) producen múltiples productos de escisión ya que la polimerasa puede extender el oligonucleótido alineado con el brazo 3' de la horquilla moviendo de esta manera el sitio de escisión (clon 4B, carriles 5 y 6). La DNATaq nativa produce aún más especies de productos de escisión que las polimerasas mutantes que conservan actividad sintética residual y convierte además la estructura de horquilla en una forma de doble hebra en presencia de los dNTP debido al nivel alto de actividad sintética en la polimerasa nativa (Figura 19B, carril 8).
Ejemplo 4 Prueba del Ensayo de Activación/Detección
Para probar la capacidad de detectar un oligonucleótido del tipo liberado en la reacción de activación del ensayo de activación/detección en la reacción de detección del ensayo, se sintetizaron las dos estructuras de horquilla mostradas en la Figura 20A usando técnicas convencionales. Las dos horquillas se denominan horquilla-A (SEC ID Nº 23) y horquilla-T (SEC ID Nº 24). Los sitios de escisión pronosticados en presencia de los cebadores alineados adecuados se indican con flechas. Las horquillas-A y -T se diseñaron para evitar la falta de plegado intrahebra omitiendo la mayoría de los residuos T en la horquilla-A y omitiendo la mayoría de los residuos A en la horquilla-T. Para evitar la falta y disminución de cebado, se diseñaron las horquillas con variaciones locales en los motivos de secuencia (por ejemplo, espaciando residuos T uno o dos nucleótidos aparte o en pares). Las horquillas-T y -A pueden alinearse juntas para formar una doble hélice que tiene extremos adecuados para clonación direccional en vectores de tipo pUC; los sitios de restricción están localizados en regiones de bucle de la doble hélice y pueden usarse para elongar las regiones originales si se desea.
La secuencia del oligonucleótido activador de prueba se muestra en la Figura 20B; este oligonucleótido se denomina cebador alfa (SEC ID Nº 25). El cebador alfa es complementario con el brazo 3' de la horquilla-T como se muestra en la Figura 20A. Cuando el cebador alfa está alineado con la horquilla-T, se forma una estructura de escisión que reconocen las polimerasas termoestables de ADN. La escisión de la horquilla-T libera el brazo 5' de hebra única de la horquilla-T, generando el cebador tau (SEC ID Nº 26) y una horquilla-T escindida (Figura 20B; SEC ID Nº 27). El cebador tau es complementario con el brazo 3' de la horquilla-A como se muestra en la Figura 20A. La alineación del cebador tau con una horquilla-A genera otra estructura de escisión; la escisión de esta segunda estructura de escisión libera el brazo 5' de hebra única de la horquilla-A, generando otra molécula del cebador alfa que a continuación se alinea con otra molécula de la horquilla-T. El termociclado libera los cebadores por lo que pueden funcionar el otras reacciones de escisión. Se realizan múltiples ciclos de alineación y escisión. Los productos de las reacciones de escisión son cebadores y las estructuras de horquilla acortadas mostradas en la Figura 20C. Las estructuras de horquilla escindidas o acortadas pueden resolverse de las horquillas sin escindir por electroforesis en geles desnaturalizadores de acrilamida.
Las reacciones de alineación y escisión se llevan a cabo de la siguiente manera: En un volumen de reacción de 50 \mul que contiene Tris-Cl 10 mM, pH 8,5, MgCl_{2} 1,0 mM, KCl 75 mM, y pmol de horquilla-A, 1 pmol de horquilla-T, se añade el cebador alfa en cantidad equimolar con relación a las estructuras de horquilla (1 pmol) o se añade en diluciones que varían desde 10 hasta 10^{6} veces y 0,5 \mul del extracto que contiene una nucleasa 5' (preparada como se describió anteriormente). La temperatura de fusión pronosticada para el cebador alfa o activador es de 60ºC en el tampón anterior. Se realiza la alineación justo por debajo de esta temperatura de fusión pronosticada a 55ºC. Usando un Termociclador de ADN Perkin Elmer, se alinean las reacciones a 55ºC durante 30 segundos. A continuación se eleva la temperatura lentamente durante un período de cinco minutos hasta 72ºC para permitir la escisión. Tras la escisión, se llevan las reacciones rápidamente a 55ºC (1ºC por segundo) para permitir que se produzca otro ciclo de alineación. Se realiza una serie de ciclos (20, 40 y 60 ciclos) y se analizan los productos de reacción en cada uno de esos números de ciclos. El número de ciclos que indica que la acumulación de productos de escisión de horquilla no ha llegado a una meseta se usa a continuación para posteriores determinaciones cuando se desea obtener un resultado cuantitativo.
Tras el número deseado de ciclos, se detienen las reacciones a 55ºC por la adición de 8 \mul de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes de marcado al 0,05% por 10 \mul de volumen de reacción. Las muestras no se calientan previo a cargarlas en los geles desnaturalizadores de poliacrilamida (poliacrilamida al 10%, entrecruzamiento 19:1, urea 7M, tris-borato 89 mM, pH 8,3, EDTA 2,8 mM). Las muestras no se calentaron para permitir la resolución de moléculas de horquilla no escindidas de hebra única y que formaron nuevamente doble hélice.
Las moléculas de horquilla pueden unirse a moléculas de soportes sólidos separadas, tales como agarosa, estireno o perlas magnéticas, a través del extremo 3' de cada horquilla. Puede colocarse una molécula espaciadora entre el extremo 3' de la horquilla y la perla si se desea. La ventaja de unir las horquillas a un soporte sólido es que evita la hibridación de las horquillas-A y -T una a la otra durante los ciclos de fusión y alineación. Las horquillas-A y -T son complementarias una con la otra (como se muestra en la Figura 20D) y si se dejan alinear entre sí en su longitud total podría reducirse la cantidad de horquillas disponibles para hibridación con los cebadores alfa y tau durante la reacción de detección.
Las nucleasas 5' se usan en este ensayo porque carecen de actividad sintética significativa. La carencia de actividad sintética da como resultado la producción de un producto de horquilla escindido único (como se muestra en la Figura 19B, carril 4). Pueden generarse múltiples productos de escisión por 1) la presencia de actividad sintética interferente (véase la Figura 19B, carriles 6 y 8) o 2) la presencia de escisión independiente de cebadores en la reacción. Se detecta la presencia de escisión independiente de cebadores en el ensayo de activación/detección por la presencia de productos de diferentes tamaños en la horquilla de la estructura de escisión. La escisión independiente de cebadores puede perderse o reprimirse, cuando está presente, por medio del uso de nucleótidos no escindibles en la región de la horquilla de la molécula de horquilla. Por ejemplo, pueden usarse nucleótidos tiolados para reemplazar varios nucleótidos en la región de horquilla para impedir la escisión independiente de cebadores.
Ejemplo 5 Escisión de Sustratos de Ácidos Nucleicos Lineales
De lo anterior, debería resultar claro que las polimerasas termoestables de ADN nativas (es decir, "tipo salvaje") son capaces de escindir estructuras de horquilla de una manera específica y que este descubrimiento puede aplicarse con éxito a un ensayo de detección. En este ejemplo, se prueban las DNAP mutantes de la presente invención frente a tres estructuras de escisión diferentes mostradas en la Figura 22A. La estructura 1 de la Figura 22A es simplemente 206 residuos de hebra única (cuya preparación e información de secuencia se discutió anteriormente). Las estructuras 2 y 3 son dobles hélices; la estructura 2 es la misma estructura de horquilla mostrada en la Figura 12A (inferior), mientras que la estructura 3 tiene eliminada la porción de horquilla de la estructura 2.
Las reacciones de escisión comprendieron 0,01 pmol del ADN sustrato resultante; y 1 pmol de oligonucleótido experimental en un volumen total de 10 \mul de Tris-Cl 10 mM, pH 8,3, KCl 100 mM, MgCl_{2} 1 mM. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 55ºC, y se detuvieron por la adición de 8 \mul de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron hasta 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis sobre un gel de poliacrilamida al 10% (entrecruzamiento 19:1), con urea 7M, en un tampón con Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM.
Los resultados se visualizan por autorradiografía y se muestran en la Figura 22B con las enzimas indicadas de la siguiente manera: I es DNAPTaq nativa; II es DNAP Tf1 nativa; III es Cleavase^{TM} BX mostrada en la Figura 4E; IV es Cleavase^{TM} BB mostrada en la Figura 4F; V es el mutante mostrado en la Figura 5B, y VI es Cleavase^{TM} BN mostrada en la Figura 4G.
La estructura 2 se usó para "normalizar" la comparación. Por ejemplo, se encontró que tomó 50 ng de DNAPTaq y 300 ng de Cleavase^{TM} BN para dar cantidades similares de escisión de Estructura 2 en treinta (30) minutos. Bajo estas condiciones DNAPTaq nativa es incapaz de escindir la Estructura 3 en un grado significativo. DNAPTf1 nativa escinde la Estructura 3 de una manera que crea múltiples productos.
\newpage
Por el contrario, todos los mutantes probados escindieron la doble hélice lineal de la Estructura 3. Estos hallazgos indican que esta característica de las polimerasas mutantes de ADN es coherente con polimerasas termoestables en las especies termófilas.
El hallazgo descrito en este documento de que las polimerasas mutantes de ADN son capaces de escindir estructuras de doble hélice lineal permite la aplicación en un diseño de ensayo más sencillo (Figura 1A). La Figura 23 proporciona un diagrama esquemático más detallado que corresponde al diseño del ensayo de la Figura 1A.
Los dos secuencias de 43 residuos representadas en la Figura 23 se sintetizaron por medio de procedimientos convencionales. Cada uno incluyó una fluoresceína en el extremo 5' para fines de detección y una biotina en el extremo 3' para permitir la unión a partículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina (la unión de biotina-avidina está indicada por 99).
Previo a eliminar los grupos tritilo, se purificaron los oligos por HPLC para eliminar subproductos truncados de la reacción de síntesis. Se unieron alícuotas de cada secuencia de 43 residuos a Dynabeads M-280 (Dynal) en una densidad de 100 pmol por mg de perlas. Se lavaron dos (2) mg de perlas (200 \mul) dos veces en lavado IX/tampón de unión (NaCl 1M, Tris-Cl 5 mM, pH 7,5, EDTA 0,5 mM) con SAB al 0,1%, 200 \mul por lavado. Se sedimentaron magnéticamente las perlas entre los lavados para permitir retirar el sobrenadante. Tras el segundo lavado, se resuspendieron las perlas en 200 \mul de lavado 2X/tampón de unión (NaCl 2M, Tris-Cl 10 mM, pH 7,5 con EDTA 1 mM), y se dividió en dos alícuotas de 100 \mul. Cada alícuota recibió 1 \mul de una solución 100 \muM de uno de los dos oligonucleótidos. Tras mezclar, se incubaron las perlas a temperatura ambiente durante 60 minutos con una mezcla suave ocasional. A continuación se sedimentaron las perlas y el análisis de los sobrenadantes mostró sólo cantidades traza de oligonucleótidos no unidos, indicando la unión exitosa. Se lavó cada alícuota de perlas tres veces, con 100 \mul por lavado, con lavado IX/tampón de unión, posteriormente dos veces en un tampón de Tris-Cl 10 mM, pH 8,3 y KCl 75 mM. Se resuspendieron las perlas en un volumen final de 100 \mul del Tris/KCl, para una concentración de 1 pmol de oligo unido a 10 \mug de perlas por \mul de suspensión. Las perlas se almacenaron a 4ºC entre usos.
Los tipos de perlas corresponden a la Figura 1A. Es decir, las perlas de tipo 2 contienen el oligo (SEC ID Nº 33) que comprende la secuencia complementaria (SEC ID Nº 34) para el oligo de señal alfa (SEC ID Nº 35) así como el oligo de señal beta (SEC ID Nº 36) que cuando se libera es una secuencia de 24 residuos. Este oligo no tiene "A" y es rico en "T". Las perlas de tipo 3 contienen el oligo (SEC ID Nº 37) que comprende la secuencia complementaria (SEC ID Nº 38) para el oligo de señal beta (SEC ID Nº 39) así como el oligo de señal alfa (SEC ID Nº 35) que cuando se libera es una secuencia de 20 residuos. Este oligo no tiene "T" y es rico en "A".
Las reacciones de escisión comprendieron 1 \mul de las perlas indicadas, 10 pmol de oligo de señal alfa sin marcar como "experimental" (si se indica) y 500 ng de Cleavase^{TM} BN en 20 \mul de KCl 75 mM, Tris-Cl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM y CTAB 10 \muM. Todos los componentes excepto la enzima se montaron, revestidos con aceite mineral ligero y se calentaron hasta 53ºC. Las reacciones se iniciaron por la adición de enzima previamente calentada y se incubaron a esa temperatura durante 30 minutos. Las reacciones se detuvieron a la temperatura por la adición de 16 \mul de formamida al 95% con EDTA 20 mM y 0,05% de azul de bromofenol y xilencianol. Esta adición detiene la actividad enzimática y, tras calentar, rompe el enlace biotina-avidina, liberando la mayoría (más del 95%) de los oligos de las perlas. Se calentaron las muestras hasta 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de realizar la electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% (entrecruzamiento 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los resultados se visualizaron por transferencia de contacto del ADN resuelto a membranas de nylon cargadas positivamente y sondeo de la membrana bloqueada con un anticuerpo antifluoresceína conjugado con fosfatasa alcalina. Tras lavar, se desarrolló la señal incubando la membrana en Western Blue (Promega) que deposita un precipitado color púrpura donde está unido el anticuerpo.
La Figura 24 muestra la propagación de escisión de las estructuras lineales de ácido nucleico de doble hélice de la Figura 23 por las DNAP mutantes. Los dos carriles centrales contienen ambos tipos de perlas. Como se informó anteriormente; el oligo de señal beta (SEC ID Nº 3) cuando se libera es una secuencia de 24 residuos y el oligo de señal alfa (SEC ID Nº 35) cuando se libera es una secuencia de 20 residuos. La formación de las dos bandas inferiores que corresponden a la secuencia de 24 y 20 residuos es claramente dependiente del "experimental".
Ejemplo 6 Escisión Exonucleolítica 5' ("Mordisqueo") por DNAP Termoestables
Se ha encontrado que las DNAP termoestables tienen una exonucleasa 5' real capaz de mordisquear el extremo 5' de estructuras lineales de ácido nucleico de doble hélice. En este ejemplo, se usa nuevamente el sustrato de ADN de doble hélice de 206 pares de bases (véase anteriormente). En este caso, se produjo usando un cebador marcado con ^{32}P y un cebador sin marcar en una reacción en cadena de polimerasa. Las reacciones de escisión comprendieron 0,01 pmol de ADN sustrato desnaturalizado por calor, marcado en el extremo (con la hebra sin marcar también presente), 5 pmol de oligonucleótido experimental (véase oligos experimentales en la Figura 12A) y 0,5 unidades de DNAPTaq o 0,5 \mug de Cleavase^{TM} BB en el extracto de E. coli (véase anteriormente), en un volumen total de 10 \mul de Tris-Cl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM.
\newpage
Las reacciones se iniciaron a 65ºC por la adición de enzima previamente calentada, a continuación se cambió a la temperatura final de incubación durante 30 minutos. Los resultados se muestran en la Figura 25A. Las muestras en los carriles 1-4 son los resultados con DNAPTaq nativa, los carriles 5-8 muestran los resultados con Cleavase^{TM} BB. Las reacciones para los carriles 1, 2, 5y 6 se realizaron a 65ºC y las reacciones para los carriles 3, 4, 7 y 8 se realizaron a 50ºC y todas se detuvieron a temperatura por la adición de 8 \mul de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron hasta 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de realizar la electroforesis en gel de acrilamida al 10% (entrecruzamiento 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. El producto esperado en las reacciones 1, 2, 5 y 6 tiene una longitud de 85 nucleótidos; en las reacciones 3 y 7, el producto esperado tiene una longitud de 27 nucleótidos. Las reacciones 4 y 8 se realizaron sin experimental, y se mantendrían en 206 nucleótidos. La banda tenue que se observa en 24 nucleótidos es cebador residual marcado en el extremo de la PCR.
El resultado sorpresivo es que Cleavase^{TM} BB bajo estas condiciones causa la aparición de todo el marcador en especies muy pequeñas, lo que sugiere la posibilidad de que la enzima hidroliza el sustrato por completo. Para determinar la composición de la banda de migración más rápida observada en los carriles 5-8 (reacciones realizadas con el mutante de deleción), se trataron las muestras de doble hélice de 206 pares de bases con exonucleasa 6 de gen T7 (USB) o con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (Promega), según las instrucciones del fabricante, para producir el mononucleótido marcado (carril a de la Figura 25B) o fosfato inorgánico libre marcado con ^{32}P (carril b de la Figura 25B), respectivamente. Estos productos, junto con los productos que se observan en el carril 7 del panel A se resolvieron por electroforesis breve en un gel de acrilamida al 20% (entrecruzamiento 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Cleavase^{TM} BB es por consiguiente capaz de convertir el sustrato en mononucleótidos.
Ejemplo 7 El Mordisqueo es Dependiente de la Doble Hélice
El mordisqueo por Cleavase^{TM} BB es dependiente de la doble hélice. En este ejemplo, se produjeron hebras únicas de 206 residuos por medio de 15 ciclos de extensión de cebador incorporando dCTP marcado con \alpha-^{32}P combinado con los cuatro dNTP no marcados, usando un fragmento de 206-pb no marcado como molde. Los productos de hebra única y doble se resolvieron por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida al 6% (entrecruzamiento 29:1) en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM, se visualizaron por autorradiografía, se cortaron del gel, se eluyeron por difusión pasiva y se concentraron por medio de precipitación con etanol.
Las reacciones de escisión comprendieron 0,04 pmol de ADN sustrato, y 2 \mul de Cleavase^{TM} BB (en un extracto de E. coli como se describió anteriormente) en un volumen total de 40 \mul de Tris\cdotCl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM. Las reacciones se iniciaron por medio de la adición de enzima calentada previamente; se retiraron alícuotas de 10 \mul a los 5, 10, 20, y 30 minutos, y se transfirieron a tubos preparados que contenían 8 \mul de formamida al 95% con EDTA 30 mM y colorantes de marcado al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de realizar la electroforesis a través de gel de acrilamida al 10% (entrecruzamiento 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los resultados se visualizaron por autorradiografía como se muestra en la Figura 26. Evidentemente, la escisión por Cleavase^{TM} BB depende de una estructura de doble hélice; no se detecta escisión de la estructura de hebra única mientras que la escisión de doble hélice de 206 residuos es completa.
Ejemplo 8 El Mordisqueo Puede Dirigirse a la Diana
La actividad de mordisqueo de las DNAP puede usarse con éxito en un ensayo de detección. Tal ensayo se muestra en la Figura 27. En este ensayo, se usa un oligo marcado que es específico para una secuencia diana. El oligo está en exceso de diana de manera que la hibridación es rápida. El oligo contiene dos marcadores de fluoresceína cuya proximidad en el oligo causa la extinción de su emisión. Cuando se permite el mordisqueo del oligo por la DNAP los marcadores separados son detectables. La doble hélice acortada se desestabiliza y se disocia. En gran medida, la diana está ahora libre para reaccionar con un oligo intacto marcado. La reacción puede continuar hasta alcanzar el nivel de detección deseado. Se ha descrito un tipo de ensayo de ciclado análogo, aunque diferente, usando exonucleasa lambda. Véase C. G. Copley y C. Boot, BioTechniques 13:888 (1992).
El éxito de tal ensayo depende de la especificidad. En otras palabras, el oligo debe hibridar con la diana específica. Resulta también de preferencia que el ensayo sea sensible; el oligo idealmente debería ser capaz de detectar pequeñas cantidades de diana. La Figura 28A muestra un cebador marcado en el extremo 5' con ^{32}P unido a una secuencia diana de plásmido. En este caso, el plásmido fue pUC19 (disponible comercialmente) que se desnaturalizó por calor hirviendo dos (2) minutos y enfriando rápidamente. El cebador es una secuencia de 21 residuos (SEC ID Nº 39). La enzima usada fue Cleavase^{TM} BX (una dilución equivalente a 5 x 10-3 \mul de extracto) en KCl 100 mM, Tris-Cl 10 mM, pH 8,3, MnCl_{2} 2 mM. La reacción se realizó a 55ºC durante dieciséis (16) horas con o sin ADN genómico de fondo (de sangre de pollo). La reacción se detuvo por la adición de 8 \mul de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes de marcado.
Los productos de la reacción se resolvieron por PAGE (poliacrilamida al 10%, entrecruzamiento 19:1, 1 x TBE) como se observa en la Figura 28B. El carril "M" contiene la secuencia de 21 residuos marcado. Los carriles 1-3 contienen diana no específica, aunque los carriles 2 y 3 contienen 100 ng y 200 ng de ADN genómico, respectivamente. Los carriles 4, 5 y 6 contienen todos diana específica con 0 ng, 100 ng o 200 ng de ADN genómico, respectivamente. Resulta claro que la conversión a mononucleótidos se produce en los carriles 4, 5 y 6 sin tener en cuenta la presencia o cantidad de ADN de fondo. Por consiguiente, el mordisqueo puede dirigirse a la diana y ser específico.
Ejemplo 9 Purificación de Cleavase
Como se informó anteriormente, las proteínas termoestables expresadas, es decir, las nucleasas 5', se aislaron de extractos brutos de células bacterianas. Posteriormente se eliminaron las proteínas de E. coli precipitadas, junto con otros sedimentos celulares, por centrifugación. En este ejemplo, se cultivaron y recogieron las células que expresan el clon BN (500 gramos). Por cada gramo (peso húmedo) de E. coli, se añadieron 3 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 100 \muM). Se lisaron las células con lisozima 200 \mug/ml a temperatura ambiente durante 20 minutos. A partir de entonces se añadió ácido desoxicólico para crear una concentración final de 0,2% y se incubó la mezcla 15 minutos a temperatura ambiente.
Se sonicó el lisado durante aproximadamente 6-8 minutos a 0ºC. Se eliminó el precipitado por centrifugación (39.000 g durante 20 minutos). Se añadió polietilenimina (al 0,5%) al sobrenadante y se incubó la mezcla sobre hielo durante 15 minutos. Se centrifugó la mezcla (5.000 g durante 15 minutos) y se conservó el sobrenadante. Se calentó este sobrenadante durante 30 minutos a 60ºC y a continuación se centrifugó nuevamente (5.000 g durante 15 minutos) y se conservó otra vez el sobrenadante.
Se precipitó el sobrenadante con sulfato de amonio al 35% a 4ºC durante 15 minutos. A continuación se centrifugó la mezcla (5.000 g durante 15 minutos) y se retiró el sobrenadante. Posteriormente se disolvió el precipitado en KCl 0,25M, Tris 20 mM, pH 7,6, Tween al 0,2% y EDTA 0,1%) y a continuación se dializó frente a Tampón de Unión (Tampón de Unión 8X comprende: imidazol 40 mM, NaCl 4M, Tris-HCl 160 mM, pH 7,9).
Posteriormente se purificó la proteína solubilizada en la columna de Ni^{++} (Novagen). Se permitió drenar el Tampón de Unión hasta la parte superior del lecho de la columna y se cargó la columna con el extracto preparado. Una velocidad de flujo de aproximadamente 10 volúmenes de columna por hora es óptima para la purificación eficaz. Si la velocidad es muy rápida, más impurezas contaminarán la fracción eluida.
Se lavó la columna con 25 ml (10 volúmenes) de Tampón de Unión 1X y a continuación se lavó con 15 ml (6 volúmenes) de Tampón de Lavado 1X (Tampón de Lavado 8X comprende: imidazol 480 mM, NaCl 4M, Tris-HCl 160 mM, pH 7,9). Se eluyó la proteína unida con 15 ml (6 volúmenes) de Tampón de Elución 1X (Tampón de Elución 4X comprende: imidazol 4 mM, NaCl 2M, Tris-HCl 80 mM, pH 7,9). A continuación se precipitó nuevamente la proteína con sulfato de amonio al 35% como anteriormente. Posteriormente se disolvió el precipitado y se dializó frente a: Tris 20 mM, KCl 100 mM, EDTA 1 mM. Se llevó la solución hasta 0,1% de cada uno de Tween 20 y NP-40 y se almacenó a 4ºC.
De lo anterior, debería resultar claro que la presente invención proporciona procedimientos nuevos. Estos procedimientos no requieren que la amplificación del ADN de muestra previo a la detección y por consiguiente ofrece una mejora en la tecnología de detección basada en ADN.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Dahlberg, James E.
\hskip3.93cm
Lyamichev, Victor I. 
\hskip3.93cm
Brow, Mary Ann D. 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nucleasas 5' Derivadas de Polimerasa Termoestable de ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 40
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Haverstock, Medlen y Carrol
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 220 Montgomery Street, Suite 2200
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 94104
\vskip0.800000\baselineskip
(V)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA INFORMÁTICO: Patent In Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOLICITUD NÚMERO: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-JUNIO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/073.384
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-JUNIO-1993
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/986.330
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-DICIEMBRE-1992
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Carroll, Peter G.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 32.837
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/AGENTE: FORS-01000
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (415) 705-8410
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (415) 397-8338
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2505 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2496 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2504 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 832 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
8
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 831 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
11
12
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 834 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
15
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2502 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
18
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 833 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
21
22
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1647 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 208A pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
25
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 962 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1600 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACGAATTCG GGGATGCTGC CCCTCTTTGA GCCCAA 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGAGATCTA TCACTCCTTG GCGGAGAGCC AGTC 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 91 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
1000 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATACGACT CACTATAGGG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAATTCGATT TAGGTGACAC TATAGAA 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAATCATGG TCATAGCTGG TAGCTTGCTA C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC CTACCTTGGT AG 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2502 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 21:
29
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATTTAGGTG ACACTATAG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
1001 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
1002 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACGAACAAG CGAGACAGCG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTTCTGCTG TGTCGTCTCT CTTG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCTTGTAC CATGTGTAC CTGTGTCGCT GTCTCGCTTG TTCGTC 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACACAGGTAC CACATGGTAC AAGAGGCAAG AGAGACGACA CAGCAGAAAC 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Ile Asn Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 969 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 30:
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 948 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 206 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTCTGGGTTC TCTGCTCTCT GGTCGCTGTC TCGCTTGTTC GTC 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGTCTCGC TTGTTCGTC 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACGAACAAG CGAGACAGCG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTCTGGGTTC TCTGCTCTCT GGTC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACGAACAAG CGAGACAGCG ACCAGAGAGC AGAGAACCCA GAA 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCAGAGAGC AGAGAACCCA GAA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACAGCTATG ACCATGATTA C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC 
\hfill
30

Claims (10)

1. Un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ADN diana específica que comprende:
a) proporcionar:
i)
un ácido nucleico diana que tiene una región 3' adyacente a y secuencia abajo de una región 5';
ii)
un primer oligonucleótido que comprende una porción que es complementaria con dicha región 3' de dicho ácido nucleico diana, y
iii)
un segundo oligonucleótido, que comprende una porción 3' y una porción 5', en el que dicha porción 3' de dicho segundo oligonucleótido es complementaria con dicha región 5' de dicho ácido nucleico diana, y en el que dicha porción 5' de dicho segundo oligonucleótido no es complementaria con dicho ácido nucleico diana, proporcionando de esta manera un brazo de hebra única en el extremo 5' de dicho segundo oligonucleótido;
b) mezclar dicho ácido nucleico diana, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido bajo condiciones en las que dicho primer oligonucleótido y dicha porción 3' de dicho segundo oligonucleótido se alinean con dicha secuencia de ADN diana para crear una primera estructura de escisión;
c) proporcionar un medio de escisión bajo condiciones tales que la escisión de dicha primera estructura de escisión se produzca de preferencia en un sitio localizado dentro de dicho segundo oligonucleótido de una manera dependiente de la alineación de dichos primer y segundo oligonucleótidos sobre dicho ácido nucleico diana, liberando de esta manera el brazo de hebra única de dicho segundo oligonucleótido para generar un tercer oligonucleótido;
d) proporcionar una primera estructura de horquilla que tiene un brazo 3' de hebra única y un brazo 5' de hebra única bajo condiciones en las que dicho tercer oligonucleótido se alinea con dicho brazo 3' de hebra única de dicha primera horquilla, creando de esta manera una segunda estructura de escisión;
e) proporcionar condiciones bajo las que la escisión de dicha segunda estructura de escisión se produzca por medio de dichos medios de escisión de una manera dependiente de la alineación de dicho tercer oligonucleótido, liberando de esta manera el brazo 5' de hebra única de dicha segunda estructura de escisión para crear productos de reacción que comprenden un cuarto oligonucleótido y una primera molécula de detección de horquilla escindida, y
f) detectar la presencia de dicho cuarto oligonucleótido o dicha primera molécula de detección de horquilla escindida.
2. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que la escisión de la etapa c) se produce dentro de la porción hibridada de dicho segundo oligonucleótido.
3. El procedimiento de la Reivindicación 1, que comprende además, tras la etapa e):
i) proporcionar una segunda estructura de horquilla que tiene un brazo 3' de hebra única y un brazo 5' de hebra única bajo condiciones en las que dicho cuarto oligonucleótido se alinea con dicho brazo 3' de hebra única de dicha segunda horquilla creando de esta manera una tercera estructura de escisión; y
b) proporcionar condiciones bajo las que la escisión de la tercera estructura de escisión se produzca por medio de dichos medios de escisión de una manera dependiente de la alineación de dicho cuarto oligonucleótido, liberando de esta manera el brazo 5' de hebra única de dicha tercera estructura de escisión para crear productos de reacción que comprenden un quinto oligonucleótido idéntico en secuencia a dicho tercer oligonucleótido y una segunda molécula de detección de horquilla escindida;
y en el que dicha etapa f) comprende además detectar la presencia de cualquiera de dichas primera y segunda moléculas de detección de horquilla escindida.
4. Un procedimiento para detectar la presencia de una molécula específica de ácido nucleico diana que comprende:
a) proporcionar:
i)
un medio de escisión;
ii)
un ácido nucleico diana que tiene una región 3' adyacente a y secuencia abajo de una región 5';
iii)
un primer oligonucleótido que comprende una porción que es complementaria con dicha región 3' de dicho ácido nucleico diana;
iv)
un primer soporte sólido que tiene un segundo oligonucleótido que comprende una porción 3' y una porción 5', en el que dicha porción 3' de dicho segundo oligonucleótido es complementaria con dicha región 5' de dicho ácido nucleico diana, y en el que dicha porción 5' de dicho segundo oligonucleótido no es complementaria con dicho ácido nucleico diana, proporcionando de esta manera un brazo de hebra única en el extremo 5' de dicho segundo oligonucleótido, comprendiendo una porción de dicho brazo 5' un primer oligonucleótido de señal;
v)
una pluralidad de segundos soportes sólidos que tienen cada uno un tercer oligonucleótido sin escindir que comprende una porción 3' y una porción 5', en los que dicha porción 5' de dicho tercer oligonucleótido no es complementaria con dicho primer oligonucleótido de señal, y en los que dicha porción 5' de dicho tercer oligonucleótido no es complementaria con dicho oligo de señal, proporcionando de esta manera un brazo de hebra única en el extremo 5' de dicho tercer oligonucleótido, comprendiendo una porción de dicho brazo 5' de dicho tercer oligonucleótido un segundo oligonucleótido de señal; y
vi)
una pluralidad de terceros soportes sólidos que tienen cada uno un cuarto oligonucleótido sin escindir que comprende una porción 3' y una porción 5', en los que dicha porción 3' de dicho cuarto oligonucleótido es complementaria con dicho segundo oligonucleótido de señal, y en los que dicha porción 5' de dicho tercer oligonucleótido no es complementaria con dicho oligonucleótido de señal, proporcionando de esta manera un brazo de hebra única en el extremo 5' de dicho cuarto oligonucleótido, comprendiendo una porción de dicho brazo 5' dicho primer oligonucleótido de señal;
b) mezclar dichos medios de escisión, dicho ácido nucleico diana, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido bajo condiciones en las que el primer oligonucleótido y el extremo 3' de dicho segundo oligonucleótido están alineados con dicha secuencia de ADN diana para crear una primera estructura de escisión y la escisión de dicha estructura de escisión da como resultado la liberación de dicho primer oligonucleótido de señal;
c) hacer reaccionar dicho primero oligonucleótido liberado con uno de dicha pluralidad de segundos soportes sólidos bajo condiciones tales que dicho primer oligonucleótido de señal hibride con dicha región complementaria de dicho tercer oligonucleótido para crear una segunda estructura de escisión y la escisión de dicha segunda estructura de escisión da como resultado la liberación de dicho segundo oligonucleótido de señal y un tercer oligonucleótido escindido;
d) hacer reaccionar dicho segundo oligonucleótido de señal liberado con uno de dicha pluralidad de terceros soportes sólidos bajo condiciones tales que dicho segundo oligonucleótido de señal hibride con dicha región complementaria de dicho cuarto oligonucleótido para crear una tercera estructura de escisión y la escisión de dicha tercera estructura de escisión da como resultado la liberación de una segunda molécula de dicho primer oligonucleótido de señal y un cuarto oligonucleótido escindido;
e) detectar la presencia de cualquiera de dichos primer o segundo oligonucleótidos de señal.
5. El procedimiento de la Reivindicación 4, en el que la escisión de las etapas c), y d) se produce dentro de la porción hibridada de dicho tercer oligonucleótido y dicho cuarto oligonucleótido, respectivamente.
6. El procedimiento de las Reivindicaciones 1 ó 4, en el que dichas reacciones de escisión se producen en ausencia de cualquier actividad polimerasa significativa.
7. El procedimiento de las Reivindicaciones 1 ó 4, en el que dicho medio de escisión comprende una polimerasa termoestable de ADN que tiene actividad nucleasa 5'.
8. El procedimiento de la Reivindicación 7, en el que dicha polimerasa termoestable de ADN deriva de un organismo seleccionado del grupo constituido por Thermus aquaticus, Thermus flavus y Thermus thermophilus.
9. El procedimiento de la Reivindicación 7, en el que dicha polimerasa termoestable de ADN está alterada de manera que exhibe actividad sintética reducida con respecto a la actividad sintética de la polimerasa de ADN nativa.
10. El procedimiento de la Reivindicación 9, en el que dicha polimerasa termoestable de ADN está codificada por una secuencia de ADN seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº 11, 30 y 31.
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